!HU000007797T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 797
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A23L 2/02
(21) Magyar ügyszám: E 05 738083 (22) A bejelentés napja: 2005. 03. 09. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050738083 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1722647 A1 2005. 10. 06. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1722647 B1 2009. 04. 22.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 0405540 2004. 03. 11.
(73) Jogosult: GLAXO GROUP LIMITED, Greenford, Middlesex UB6 ONN (GB)
GB
(72) Feltalálók: CLIFFORD, Mike, Guildford Surrey GU2 7XH (GB); GIBSON, Glenn, University of Reading, Reading Berkshire RG6 6AP (GB); HU, Henglong, GlaxoSmithKline, Coleford Gloucestershire GL16 8JB (GB); RODIG-PENMAN, Andrea, Gloucestershire GL16 8 JB (GB) (54)
(2006.01) A23L 2/84 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05092127 PCT/EP 05/002701
(74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Gyümölcsök és gyümölcslevek prebiotikus alkalmazása elõnyös bélmikroflóra elõsegítésére
(57) Kivonat
HU 007 797 T2
A találmány tárgya sötét gyümölcsök és gyümölcslevek, mint például feketeribiszke¹, vörösáfonya- és gránátalma-gyümölcslevek prebiotikus hatásai. A találmány tárgya továbbá sötét gyümölcs vagy sötét gyümölcs levének alkalmazása orálisan bevihetõ készítmények elõállítására az egészség elõsegítésére az
elõnyös emésztõrendszeri mikroflóra növekedésének elõsegítésével. Az ital elkészíthetõ egy vagy több sötét gyümölcsbõl vagy gyümölcslébõl, kombinációban egyéb prebiotikumokkal vagy probiotikumokkal és egyéb különbözõ összetevõkkel.
A leírás terjedelme 8 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 797 T2
A jelen találmány tárgya sötét gyümölcsök és sötét gyümölcsök levének prebiotikus hatása és az alkalmazásuk elõnyös bélmikroflóra növekedésének elõsegítésére. A humán bélmikroflóra több mint 500 különbözõ baktériumfajt tartalmaz, amelyeknek nagy metabolikus hatásuk van az emberi egészségre (Roberfroid és munkatársai, Nutrition Reviews 53: 127–130, 1995; Steer és munkatársai, Nutrition Research Reviews 13: 229–254, 2000). A bélmikroflóra egy fontos funkciója a gazda szemszögébõl a potenciálisan patogén mikroorganizmusok kolonizálásának megakadályozása a behatoló patogénekkel az ökológiai résekért és metabolikus szubsztrátokért történõ versengés révén. A bélben történõ mikrobiológiai metabolizmus fontos energiaforrásként is szolgál a kolonociták számára és B¹vitaminok és K¹vitamin forrása. A bélmikroflóra az immunrendszer fontos modulátoraként hat, nemcsak a naiv csecsemõimmunrendszer betanításával, hanem az egészséges egyének teljes életén keresztül a nem gyulladásos immunstimulálás egy fontos forrásaként is. A bélmikroflóra potenciálisan káros és potenciálisan egészségmegõrzõ fajokra osztható. Például egyes Clostridium fajok, és proteolitikus Bacteroides fajok tekinthetõek potenciálisan károsnak, mivel bizonyos akut és krónikus emésztõrendszeri panaszokhoz kapcsolódnak. A metabolikus végtermékeik mérgezõek és a bélben sejtes pusztulást válthatnak ki. Továbbá egyes termékek bejuthatnak a véráramba és szisztémásan fejtenek ki negatív hatásokat. Másrészrõl Bifidobacterium fajok, és a tejsavbaktériumok, különösen a Lactobacillus fajok tekinthetõek olyannak, mint amelyek fontos szerepet játszanak az egészséges bélökoszisztémában a potenciális patogénekkel szembeni antagonisztikus hatásuk, immunmoduláló hatásaik, rövid láncú zsírsavak elõállítása és karcinogének és genotoxinok termelésében érintett mikroflórához kapcsolódó enzimatikus aktivitások csökkentése révén (Gibson és Roberfroid, Journal of Nutrition 125, 1401–1412 1995; Yaeshima International Journal of Food Microbiology 30: 303–31 1996). Jelenleg nagy érdeklõdés tapasztalható a vastagbél-mikroflóra aktív menedzselésére a gazda egészségének javítása céljából. Ezt hagyományosan élõ mikrobiális táplálékkiegészítõk, amelyek ismertek probiotikumként, fogyasztásával próbálták elérni. A probiotikumot a következõ módon definiálták: élõ mikrobiális táplálék-összetevõ, amely elõnyös az egészségre (Diplock és munkatársai, British Journal of Nutrition, 1999). A legjobban tanulmányozott és kereskedelmileg alkalmazott probiotikumok a laktobacillusok és a bifidobaktériumok. Az ilyen probiotikumokat tartalmazó termékek példái a joghurtok és a tejtermékalapú italok, mint például az Actimel™ (kereskedelemben beszerezhetõ Nagy-Britanniában). Egy alternatív megközelítés az egyéb típusú élelmiszer-összetevõk fogyasztása, amelyek prebiotikumként ismertek. A prebiotikumot a következõ módon definiálták: emészthetetlen élelmiszer-összetevõ, amely elõnyös a gazda számára a vastagbélben lévõ egy vagy korlátozott számú baktérium növekedésének és
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
aktivitásának szelektív serkentése révén (Gibson és Roberfroid, Journal of Nutrition 125, 1401–1412 1995). Collins és Gibson szerint [American Journal of Clinical Nutrition 1999; 69 (melléklet)], egy élelmiszerösszetevõ akkor sorolható prebiotikumnak, ha 1. nem hidrolizálódik és nem abszorbeálódik az emésztõrendszer felsõ részében; 2. a vastagbélben lévõ potenciálisan elõnyös kommenzalista baktériumok közül egynek vagy korlátozott számúnak egy szelektív szubsztrátja, ezáltal serkenti a baktériumok növekedését, metabolikusan aktiválttá válik, vagy mindkettõ; és 3. következésképpen a vastagbél-mikroflórát egy egészségesebb összetétel felé befolyásolja. (Collins & Gibson). Önmagukban erõsítik a belsõ bélflóra-összetevõket, amelyet elõnyösnek gondolnak. Ismert prebiotikumok az oldható táplálék rostok, mint például az inulin, laktulóz, fruktooligoszacharidok és galaktooligoszacharidok, amelyek képesek túlélni az emésztést és szelektíven stimulálni a bélmikroflóra elõnyös tagjait, mint például a bifidobaktériumokat a vastagbélben (Gibson és munkatársai, New Developments in Functional Foods. Oxford: Chandos Publishing Limited 2000). A JPA 2005–013197 közzétételi számú japán szabadalmi bejelentés tárgya elsõsorban aloe verát és olyan gyümölcsök, mint például a papaya és a sárkánygyümölcs levét tartalmazó dzsúszok, amelyeknek prebiotikus hatásuk van. A US 2003/0060445 közzétételi számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés táplálék tápszereket ismertet, amelyek prebiotikus anyagokat tartalmaznak, ahol az anyag oligofruktóz és szialillaktóz kombinációja. A WO 02/091833 számú nemzetközi közzétételi irat gyógyszerészeti készítményeket ismertet, amelyek tartalmaznak probiotikumot, prebiotikumot és ammóniafil, karbamidet lebontó mikroorganizmust, nagy alkáli pH¹stabilitással és nagy ureázaktivitással. Az ismertetett prebiotikumok oligoszacharidok, inulin, laktulóz és egyéb zöldségrostok. A sötét gyümölcsök, mint például a fekete ribiszke, a vörös áfonya és a gránátalma számos országban közönségesen fogyasztott gyümölcsök. Epidemológiai vizsgálatok azt mutatják, hogy a magas gyümölcs- és zöldségbevitel csökkentheti egyes krónikus betegségek kockázatát (Kant és munkatársai, American Journal of Clinical Nutrition, 1993; Hertog és munkatársai, Lancet 342: 1007–1011, 1993; Lampe és munkatársai, American Journal of Clinical Nutrition, 1999). A gyümölcs gazdag természetes antioxidáns polifenolvegyületekben, mint például antocianinok, proantocianinok és flavonolok. Tartalmaznak egyszerû fenolokat is, mint például cinnamátokat és hidroxi-benzoátokat és tanninokat, mint például ellagitanninokat, gallagitanninokat és kondenzált tanninokat. Néhány bogyós gyümölcsrõl és a bogyókban lévõ fenolos vegyületekrõl azt közölték, hogy antimikrobiális hatásaik vannak (Puupponen-Pimia és munkatársai, Journal of Applied Microbiology 90: 494–507, 2001).
1
HU 007 797 T2
A fekete ribiszke leve gazdag C¹vitaminban, és gazdag antocianinokban, mint például cianidin-rutinozid, cianidin-glükozid, delfinidin-rutinozid és delfinidinglükozid. A feketeribiszke-antocianinokról azt találták, hogy az ember számára biológiailag elérhetõ, de a bevitelnek csak egy kis százaléka abszorbeálható a vérbe és választódik ki a vizelettel (Rechner és munkatársai, Free Radical Research 36: 1229–1241, 2002). Tehát az elfogyasztott antocianin legnagyobb része visszamarad a vékony- és a vastagbelekben az emésztési és a kiválasztási folyamatok során. A vörösáfonya-levélrõl azt javasolták, hogy elõnyös a vizeletrendszer fertõzéseinek megelõzésére és kezelésére (Kontiokari és munkatársai, British Medical Journal 322: 1–5, 2001) a vizeletet savanyító hatásának, valamint antimikrobiális tulajdonságainak köszönhetõen. A gránátalma levének fogyasztásának a kardiovaszkuláris egészségre gyakorolt kedvezõ hatásáról számoltak be egy humán vizsgálatban (Aviram és munkatársai, American Journal of Clinical Nutrition 71:1062–1076, 2000). Korábban nem ismertették a sötét gyümölcsök egyéb egészséget elõsegítõ hatásait. A fekete ribiszke, vörös áfonya, gránátalma és ezek keverékei közül választott sötét gyümölcsrõl azt találtuk, hogy prebiotikus hatású. Továbbá a kiválasztott sötét gyümölcsökrõl azt találtuk, hogy befolyásolják az emésztõrendszer mikroflóráját az „elõnyös” baktériumok növekedésének preferenciális elõsegítésével és ezzel egyidejûleg a „káros” baktériumok növekedésének csökkentésével. A megfigyelt prebiotikus hatás tehát különbözik a tradicionális prebiotikumok, mint például az inulin hatásától, mivel a sötét gyümölcs nemcsak elõsegíti az elõnyös baktériumok növekedését, hanem elnyomja a káros baktériumok növekedését is. A találmány szerint a találmány tárgya ribiszke, vörös áfonya, gránátalma és ezek közül kettõ vagy több keveréke közül választott sötét gyümölcs alkalmazása emlõs egészségének elõsegítésére, azzal jellemezve, hogy a sötét gyümölcsnek prebiotikus hatása van. Ismertettünk eljárásokat emlõs, elõnyösen ember egészségének javítására a kiválasztott sötét gyümölcs elfogyasztásával. Az eljárások javítják az emberi egészséget a sötét gyümölcs orális elfogyasztása révén. A kétségek elkerülése végett a sötét gyümölcs kifejezés tartalmazza az egész gyümölcsöt, gyümölcsvelõt és gyümölcs levét és ezek keverékeit. A kiválasztott sötét gyümölcs prebiotikus hatása megfelelõen megjelenik a sötét gyümölcs lé formájában történõ elfogyasztásával. A találmány egy szempontja szerint a kiválasztott sötét gyümölcs orális fogyasztása elõsegíti az elõnyös emésztõrendszeri baktériumok növekedését. A találmány egy további szempontja szerint a kiválasztott sötét gyümölcs orális fogyasztása elõsegíti az elõnyös emésztõrendszeri baktériumok növekedését és csökkenti a káros baktériumok növekedését. A találmány szerinti értelemben a sötét gyümölcs jelentése fekete ribiszke, vörös áfonya, gránátalma és
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
ezek közül kettõ vagy több keveréke közül választott fekete, piros vagy kék héjú gyümölcs. A találmány szerinti értelemben az elõnyös baktériumok azok, amelyek nem választanak ki az egészségre káros metabolikus termékeket. Néhány elõnyös baktérium termelhet az egészségre elõnyös vegyületeket, mint például vitaminokat. Képesek lehetnek patogének gátlására és valószínûleg szacharolitikusak. A találmány szerinti értelemben a káros baktériumok azok, amelyek toxikus termékeket állítanak elõ és invazív képességek révén sejtpusztulást is okozhatnak. Egyes káros baktériumok által elõállított toxikus termékek lokálisan hathatnak az emésztõrendszerben és/vagy szisztémás hatásuk is lehet. A találmány alkalmazható a kiválasztott sötét gyümölcsöt tartalmazó sokféle készítmény esetén. A készítmények lehetnek folyékonyak, félig szilárdak vagy szilárdak. A készítmények lehetnek tejtermékalapúak, mint például joghurtok. A készítmények alkalmasan italok formájában vannak. A találmány szerinti értelemben az ital magában foglalja a következõket: fogyasztásra kész folyékony készítmények, valamint koncentrátumok és feloldásra szánt porkészítmények. A fogyasztásra kész italok lehetnek szénsavasak vagy szénsavmentesek. A jelen találmány különösen megfelelõ fogyasztásra kész, körülbelül 1–40 térfogat% egyszeres töménységû (azaz a tiszta gyümölcslével egyezõ töménységû) sötétgyümölcslé-tartalmú, elõnyösen körülbelül 1–30 térfogat%, még elõnyösebben körülbelül 1–15 térfogat% sötétgyümölcslé-tartalmú italokban történõ alkalmazásra. Jelen feltalálók azt találták, hogy a kiválasztott sötét gyümölcsök prebiotikus hatása különösen hangsúlyos alacsony koncentrációkban, 1–20 térfogat% egyszeres töménységû sötétgyümölcs¹lé esetén. A jelen találmány különösen megfelelõ fermentált és nem fermentált tejtermékalapú termékek, mint például joghurtok, fromage frais (friss sajt) és tejalapú italok esetén is. A joghurtok jellemzõen körülbelül 1–20 térfogat% gyümölcsöt vagy gyümölcslevet tartalmaznak, elõnyösen körülbelül 1–20 térfogat% gyümölcsöt vagy gyümölcslevet tartalmaznak. A tejtermékalapú italok jellemzõen körülbelül 1–40 térfogat% gyümölcslevet tartalmaznak. A kétségek elkerülése végett az egyszeres töménységû gyümölcslé azt a gyümölcslevet jelöli, amely érett gyümölcsbõl lett kipréselve víz hozzáadása vagy elvétele nélkül. Számos gyümölcs- és zöldségeredetû levekre határoz meg standardokat az Európai Unió Gyümölcslé- és Nektáripari Szövetsége („Association of the Industry of Juices and Nectars, AIJN”). A találmány szerinti készítmények lehetnek édesítetlenek vagy cukorral vagy intenzív édesítõszerrel, mint például szacharinnal, aszpartil-fenil-alanil-metilészterrel vagy egyéb nemcukor édesítõszerrel édesítettek. A készítmények tartalmazhatnak egyéb hagyományos adalékot is, mint például ízesítõszereket, színezékeket, stabilizátorokat stb.
1
HU 007 797 T2
A találmány szerinti készítmények probiotikus és prebiotikus keverékeket is tartalmazhatnak. A találmány szerinti készítmények elõállíthatóak az összetevõk hagyományos eljárással történõ összekeverésével. A szilárd anyagok feloldhatóak vízben az egyéb összetevõkkel történõ összekeverés elõtt. Jellemzõen az italkészítmények pasztõrözve vannak az üvegekbe vagy dobozokba vagy egyéb csomagolásokba történõ töltés elõtt vagy a csomagolásban vannak pasztõrözve a betöltés után. Prebiotikus hatások vizsgálata fekáliás szakaszos tenyésztésû fermentációval Statikus szakaszos tenyészeteket készítettünk el 100 ml¹es steril üvegekben, amelyek 40 ml elõredukált steril tápközeggel voltak töltve, amely tápközeg a következõket tartalmazta (g/l): Összetevõk g/l Pepton víz 2 Élesztõkivonat 2 NaCl 0,1 K2HPO4 0,04 KH2PO4 0,04 MgSO4.7H2O 0,01 CaCl2.2H2O 0,01 NaHCO3 2 L-cisztein HCl 0,5 Epesók 0,5 Resazurin 4,ml K1-vitamin 10,ml Tween 80 2,ml Hemin 10,ml 10 vegyes%¹os, egészséges donoroktól származó, fekáliás iszapot állítottunk elõ elõredukált
5
10
15
20
25
30
2
0,1 mol/l foszfáttal pufferezett sóoldat (pH=7,0) alkalmazásával és ezt követõen stomacher készülékben kevertük 120 másodpercig. Minden egyes szakaszos tenyészetet 5 ml fekáliás iszappal inokuláltunk, hogy 1 térfogat% végsõ koncentrációt kapjunk. 1 ml L¹cisztein-HCl¹t adtunk minden egyes szakaszos tenyészethez a tápközeg további redukálására. A szakaszos tenyészeteket O2-mentes N2 fejtér alatt tartottuk és 37 °C hõmérsékleten inkubáltuk. Háromszoros mintát (1 ml) vettünk 0, 5, 10 és 24 óra múlva a baktériumok FISH alkalmazásával történõ megszámolására FISH (Wang és Gibson, Journal of Applied Bacteriology 75: 373–380, 1993). A tenyészet kezdeti pH¹értéke a fekáliás iszap hozzáadását követõen 6,0 volt. A pH értékét nem szabályoztuk az inkubációs szakasz során. Statikus szakaszos fermentációt végeztünk háromszorosan gyümölcslevek prebiotikus képességeinek meghatározására. Minden egyes gyümölcslé esetén négy különbözõ koncentrációt vizsgáltunk, amint azt az 1., 2. és 3. táblázatokban mutatjuk. A végsõ koncentrációkat a gyümölcslé-koncentrátumok kihígításával állítottuk elõ, hogy figyelembe vegyük a koncentrátumokat (a feketeribiszke¹lé 7,30-szorosan volt betöményítve, míg a vörösáfonya- és a gránátalma-gyümölcslevek rendre 8,82-szorosan és 6,98-szorosan voltak betöményítve). A Bifidobacterium növekedését a tenyésztés 0., 10. és 24. órájában határoztuk meg. A vizsgálati modell pozitív kontrolljaként 1 vegyes% fruktooligoszacharidot vizsgáltunk a gyümölcslevek mellett. A kísérletes körülményeket pH=6¹ra állítottuk. A Bifidobacterium elõsegítését tekintettük a prebiotikus hatás indikációjának az egyszerû, de hatásos tenyésztési modellben.
Eredmények 1. táblázat Feketeribiszke-gyümölcslé hatása bifidobaktériumok növekedésére szakaszos tenyészetben Feketeribiszke-gyümölcslé (egyszeres töménységû)
N
0 óra
10 óra
24 óra
3,65%
3
7,47±0,32
8,17±0,49*
8,24±0,44*
7,30%
3
7,51±0,36
8,23±0,55*
8,37±0,44**
14,60%
3
7,60±0,41
7,91±0,48*
7,77±0,42*
29,20%
3
7,40±0,23
7,58±0,37
7,43±0,68
* p<0,05; ** p<0,01 a 0 órás mérésekhez képest. N a három esetben vett minták száma.
2. táblázat Vörösáfonya-gyümölcslé hatása bifidobaktériumok növekedésére szakaszos tenyészetben Vörösáfonya-gyümölcslé (egyszeres töménységû)
N
0 óra
10 óra
24 óra
4,41%
3
7,78±0,19
8,16±0,23
8,06±0,27
8,82%
3
7,64±0,13
8,26±0,28*
8,34±0,35*
4
1
HU 007 797 T2
2
2. táblázat (folytatás) Vörösáfonya-gyümölcslé (egyszeres töménységû)
N
0 óra
10 óra
24 óra
17,64%
3
7,35±0,28
7,71±0,53
7,95±0,39*
35,28%
3
7,34±0,25
7,26±0,21
7,12±0,25
* p<0,05 a 0 órás mérésekhez képest.
3. táblázat Gránátalma-gyümölcslé hatása bifidobaktériumok növekedésére szakaszos tenyészetben Gránátalma-gyümölcslé (egyszeres töménységû)
N
0 óra
10 óra
24 óra
3,49%
3
7,49±0,24
8,11±0,37*
8,04±0,38*
6,98%
3
7,50±0,29
8,42±0,36*
8,28±0,51
13,96%
3
7,68±0,16
8,38±0,40*
8,32±0,55
27,92%
3
7,44±0,28
8,19±0,30*
8,09±0,56
* p<0,05 a 0 órás mérésekhez képest.
Prebiotikus hatás vizsgálata humán vastagbélmikroflóra modellel (emésztõrendszeri modell) A folytonos rendszer három edénybõl állt, V1, V2 és V3. A V1 mûködési térfogata 280 ml volt és a másik két edényé 300 ml volt. Ez az in vitro modell úgy lett megtervezve, hogy utánozza a humán vastagbél három fõ szakaszát: rendre proximális, transzverz és disztális vastagbél. A hõmérsékletet (37 °C) és a pH értékét automatikusan szabályoztuk. A tenyésztési pH értéke 5,5 volt a V1 edényben, 6,2 volt a V2 edényben és 6,8 volt a V3 edényben. Mindegyik fermentor mágnesesen kevertettük és a növekedési tápközeghez folytonosan kevertünk oxigénmentes nitrogént (15 ml/perc) és üveg tápközeg-tárolóból vezettük be perisztaltikus pumpával a V1¹be. A V1 sorban táplálta V2¹t és V3¹at túlfolyóval és vezetékek sorozatával. A V3 túlfolyóját szeméttárolóba vezettük. A tenyésztési tápközeg a következõ összetevõket tartalmazta desztillált vízben feloldva (Macfarlane és munkatársai, FEMS Microbiology Ecology 26: 231–243, 1998): Összetevõ g/l Keményítõ (Sigma, Poole, Dorset, Nagy-Britannia) 5,0 Pektin (citrus) 2,0 Guargumi 1,0 Mucin (sertés gasztrikus III¹as típusú) 4,0 Xilán (zabtönköly) 2,0 Arabinogalaktán (vörösfenyõfa) 2,0 Inulin 1,0 Kazein (Sigma, Poole, Dorset, Nagy-Britannia) 3,0 Pepton víz 5,0 Tripton 5,0 Epesók No3 0,4 Élesztõkivonat 4,5 NaCl 4,5 KCl 4,5
25
30
35
40
45
50
55
60 5
FeSO4.7H2O 0,005 KH2PO4 0,5 MgSO4.7H2O 1,25 CaCl2.6H2O 0,1 NaHCO3 1,5 L-cisztein-HCl 0,8 Hemin 0,05 Tween 80 1,0 K-vitamin 10,ml Resazurin 4,ml A tápközeget 121 °C hõmérsékleten autoklávoztuk 15 percet, és míg meleg volt, nitrogénlégkör alá helyeztük. A rendszer inokulálásához friss fekáliamintákat vettünk egészséges humán alanyoktól, akik nem számoltak be a megelõzõ 6 hónapban történt antibiotikumos kezelésrõl és kórelõzményükben nem volt gasztrointesztinális rendellenesség. 20 vegyes%¹os iszapot állítottunk elõ anaerob foszfáttal pufferezett sóoldat alkalmazásával és körülbelül 100 ml¹t adtunk minden egyes tenyésztési edényhez. A rendszert 43 órás retenciós idõvel (R) mûködtettük, amelyet a hígítási sebesség reciprokaként számoltunk ki. A fermentációs rendszert éjszakán át hagytuk egyensúlyi állapotot felvenni a pumpa elindítása elõtt. Emésztõrendszeri modell dózis és minta rezsim Mintákat vettünk a –10. napon (az egyensúlyi állapot elõtt, tíz nappal a gyümölcslevekkel történõ kezelés elõtt), a –2., –1. és 0. napon (hogy alapvonalként megkapjuk a kontrollidõszak utolsó három napjának átlagát). Ezt a 10 napos idõszakot követõen a tápközeget 0,814 vegyes% szénhidrátra (0,407% keményítõ, 0,1628% xilán, 0,1628% arabinogalaktán, és 0,0814% inulin, mind vegyes%) cseréltük és kétszer adtunk hozzá gyümölcslevet (minden 12 órában – a tartályból történõ 20 ml/órás áramlási sebességen alapulva) napon-
1
HU 007 797 T2
ta. 5%¹os egyszeres töménységû gyümölcslé-koncentrációt tartottunk fenn az áramban a rendszerben, hogy a koncentrátum kezdeti dózisa a V1¹be enyhén magasabb volt. Újra vettünk mintákat a 10., 11., 12. és ezután a 20., 21. és 22. napokon.
5
Eredmények Az elõnyös baktériumok, mint például bifidobaktériumok és laktobacillusok növekedésének elõsegítése
2
és/vagy a káros baktériumok, mint például bakteroidok és clostridia növekedésének gátlása tekinthetõ prebiotikus hatásnak. A 4–6. táblázatokból ezek a hatások egyértelmûen be vannak mutatva. A gyümölcslével kezelt emésztõrendszeri modellben lévõ baktériumok számát a következõ módon adtuk meg: Log10 sejt/ml emésztõrendszeri modell +/– standard deviáció. Az átlagokat három egymást követõ napon vett mintákból állítottuk elõ.
4. táblázat Baktériumszámok az emésztõrendszeri modellben, amelyhez feketeribiszke-gyümölcslé lett adva Edény
Összes baktérium
Bacteroides fajok
Bifidobacteria
C. histolyticum
Lactobacilli
E. rectale
E. limnosum
T0
9,62±0,08
8,90±0,15
8,20±0,06
7,49±0,07
7,63±0,10
8,89±0,10
6,98±0,08
T10
9,77±0,07**
7,72±0,03**
8,68±0,05*
7,13±0,08*
7,65±0,12
9,18±0,04*
7,31±0,05
T20
9,98±0,16++
6,98±0,10**++
8,44±0,02*+
7,10±0,11*
7,78±0,04
9,17±0,08
7,64±0,20
T0
9,54±0,07
8,46±0,07
8,03±0,09*
7,23±0,10
7,62±0,05
8,73±0,09
7,33±0,13
T10
9,54±0,08
8,47±0,08
8,48±0,03
6,93±0,07*
7,62±0,11
9,02±0,03*
7,78±0,06
T20
9,76±0,11
8,45±0,09
8,36±0,09*
6,69±0,11
7,84±0,05
9,12±0,10
7,55±0,01*
T0
9,59±0,07
8,51±0,06
8,34±0,04
7,26±0,20
7,45±0,05
8,77±0,06
7,07±0,06
T10
9,64±0,07
8,31±0,09
8,57±0,13
7,11±0,20
7,56±0,11
8,98±0,06
7,42±0,12
T20
9,64±0,07
8,13±0,15*
8,45±0,02
6,36±0,09*+
7,84±0,16
9,10±0,22
7,23±0,04
V1
V2
V3
* P<0,05, ** P<0,01 a T10 és T20 értékeket a T0¹hoz hasonlítva + P<0,05, ++ P<0,01 a T20 értékeket a T10-hez hasonlítva
5. táblázat Baktériumszámok az emésztõrendszeri modellben, amelyhez vörösáfonya-gyümölcslé lett adva Edény
Összes baktérium
Bacteroides fajok
Bifidobacteria
C. histolyticum
Lactobacilli
E. rectale
E. limnosum
T0
9,64±0,08
9,06±0,28
8,31±4,02
7,56±0,16
6,09±0,04
9,13±0,01
7,43±0,12
T10
9,66±0,03
6,42±0,04**
8,39±0,11
7,27±0,36
6,14±0,17
9,22±0,04
7,62±0,15
T20
9,75±0,06*
6,57±0,28**
8,52±0,05*
7,23±0,56
6,11±0,22
9,18±0,06
7,88±0,08+
T0
9,50±0,08
8,86±0,06
8,12±0,18
7,58±0,07
6,39±0,07
9,08±0,06
7,36±0,15
T10
9,67±0,05
8,45±0,04**
8,41±0,09
6,87±0,37
6,12±0,37
9,13±0,24
7,55±0,19
T20
9,71±0,05
8,60±0,04*
8,47±0,05
7,08±0,31
6,40±0,31
9,14±0,15*
7,80±0,12
T0
9,32±0,07
8,54±0,09
8,02±0,1
7,56±0,04
6,64±0,13
8,97±0,07
7,19±0,20
T10
9,73±0,06**
8,43±0,10
8,41±0,113**
6,74±0,18*
6,40±0,15
9,09±0,05
7,61±0,07
T20
9,64±0,05*
8,50±0,09
8,53±0,04*
6,83±0,18*
6,76±0,14
9,11±0,06
7,79±0,09
V1
V2
V3
* P<0,05, ** P<0,01 a T10 és T20 értékeket a T0¹hoz hasonlítva + P<0,05, ++ P<0,01 a T20 értékeket a T10-hez hasonlítva
6
1
HU 007 797 T2
2
6. táblázat Baktériumszámok az emésztõrendszeri modellben, amelyhez gránátalma-gyümölcslé lett adva Összes baktérium
Bacteroides fajok
Bifidobacteria
C. histolyticum
Lactobacilli
E. rectale
E. limnosum
T0
9,72±0,04
9,03±0,05
8,32±0,06
7,17±0,06
6,09±0,04
9,07±0,10
7,25±0,06
T10
9,63±0,05
8,92±0,05*
8,35±0,12
6,98±0,35
6,45±0,07*
8,99±0,02
7,48±0,10
T20
9,67±0,10
8,72±0,09
8,45±0,05**
6,63±0,09*
6,40±0,15
9,25±0,02++
7,76±0,13+
T0
9,39±0,02
8,85±0,04
8,32±0,05
6,96±0,14
6,37±0,01
8,97±0,14
7,25±0,06
T10
9,50±0,07
8,80±0,11
8,34±0,12
6,72±0,25
6,41±0,13
9,13±0,03
7,62±0,12*
T20
9,56±0,05+
8,67±0,11
8,70±0,05*+
6,78±0,06
6,32±0,14
9,18±0,04
7,80±0,10*+
T0
9,60±0,03
8,67±0,04
8,37±0,02
6,95±0,07
6,30±0,08
9,01±0,09
7,22±0,06
T10
9,49±0,15
8,76±0,02
8,42±0,07
6,61±0,19
6,48±0,09*
8,98±0,07
7,58±0,10*
T20
9,58±0,03
8,67±0,04
8,77±0,05*+
6,58±0,05**
6,69±0,10*
9,08±0,08
7,77±0,08**
Edény
V1
V2
V3
* P<0,05, ** P<0,01 a T10 és T20 értékeket a T0¹hoz hasonlítva + P<0,05, ++ P<0,01 a T20 értékeket a T10-hez hasonlítva
A feketeribiszke¹, vörösáfonya- és gránátalma-gyümölcslevek esetén megfigyelt pozitív prebiotikus hatások jellemzõek azokra a hatásokra, amelyek valószínûleg elérhetõek további sötét gyümölcsökkel. A találmányt a következõ nem korlátozó példákkal jellemezzük. 1. példa – Feketeribiszke-gyümölcslé alapú ital 1–30 térfogat% egyszeres töménységû feketeribiszke-gyümölcslevet, adott esetben egyéb gyümölcslevekkel, mint például alma¹, grapefruit- vagy narancsgyümölcslé, kombináltan tartalmazó ital. Az ital tartalmazhat továbbá hozzáadott, 0,27 tömeg% aszkorbinsavat, 0,24 tömeg% kalcium-karbonátot, 0,17 tömeg% aszpartámot, 0,12 tömeg% feketeribiszke-ízt, 0,08 tömeg% kálium-szorbátot, 0,06 tömeg% aceszulfám K¹t, 0,14 tömeg% nátrium-biszulfitot, 0,00002 tömeg% szõlõszembõl származó színezõanyagot, és vizet, amennyiben ez egy nem 100%¹os gyümölcsléital. Az ital tartalmazhat hozzáadott szénhidrátot is, például glükózszirupot. Az ital lehet szénsavas vagy szénsavmentes. 2. példa – Vörösáfonya-gyümölcslé alapú ital 1–40 térfogat% egyszeres töménységû vörösáfonya-gyümölcslevet, adott esetben egyéb gyümölcslevekkel, mint például alma- vagy narancsgyümölcslé, kombináltan tartalmazó ital. Az ital tartalmazhat továbbá hozzáadott szénhidrátot, például 10 tömeg% répacukrot, 0,05 tömeg% aszkorbinsavat, 0,02 tömeg% vörösáfonya-ízt, és tartósítószereket, például káliumszorbátot vagy nátrium-benzoátot és vizet. A termék lehet szénsavas vagy szénsavmentes.
30
35
40
45
3. példa – Gránátalma-gyümölcslé alapú ital 1–100 térfogat% egyszeres töménységû gránátalma-gyümölcslevet, adott esetben egyéb gyümölcslevekkel, mint például alma- vagy narancsgyümölcslé, kombináltan tartalmazó ital. Az ital tartalmazhat továbbá hozzáadott 0,05 tömeg% aszkorbinsavat, szénhidrátot, például glükózt vagy répacukrot, aszpartámot vagy aceszulfám K¹t és vizet. Az ital lehet szénsavas vagy szénsavmentes. 4. példa – Feketeribiszke-gyümölcslé és tejtermékalapú ital 1–20 térfogat% egyszeres töménységû feketeribiszke-gyümölcslevet, adott esetben egyéb gyümölcslevekkel, mint például alma- vagy szõlõgyümölcslé, kombináltan tartalmazó ital. Az ital tartalmaz tejtermék összetevõket, 5 tömeg% joghurtot és 2 tömeg% tejszínt. Az ital tartalmazhat továbbá hozzáadott szénhidrátot, például 10 tömeg% répacukrot, 0,05 tömeg% aszkorbinsavat, 0,02 tömeg% feketeribiszke-ízt, kálium-szorbát tartósítószert és vizet.
50 SZABADALMI IGÉNYPONTOK
55
60 7
1. Fekete ribiszke, vörös áfonya, gránátalma és ezek közül kettõ vagy több keveréke közül választott sötét gyümölcs alkalmazása orálisan fogyasztható készítmény elõállítására egészség elõsegítésére emlõsben, azzal jellemezve, hogy a sötét gyümölcsnek prebiotikus hatása van. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a sötét gyümölcs gyümölcslé formájában van.
1
HU 007 797 T2
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a készítmény ital. 4. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a készítmény italkoncentrátum, amely 1–40 térfogat% egyszeres töménységû gyümölcslevet tartalmaz.
5
2
5. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a készítmény italkoncentrátum, amely 1–20 térfogat% egyszeres töménységû gyümölcslevet tartalmaz. 6. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a készítmény tartalmaz probiotikumot is.
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
