!HU000008599T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 599
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 787576 (22) A bejelentés napja: 2004. 09. 08. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040787576 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1667517 A1 2005. 03. 17. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1667517 B1 2010. 03. 31.
(51) Int. Cl.: A01N 1/02 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05022996 PCT/IB 04/051711
(30) Elsõbbségi adatok: 0302888 2003. 09. 09. 0304124 2003. 12. 31.
(73) Jogosult: Cryo-Innovation Kft., 6726 Szeged (HU)
HU HU
(72) Feltalálók: PRIBENSZKY, Csaba, H-8000 Székesfehérvár (HU); MOLNAR, Miklós, H-1023 Budapest (HU) (54)
(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Krioprezervált biológiai anyag felolvasztás utáni túlélésének javítása hidrosztatikus nyomáskezeléssel
(57) Kivonat
HU 008 599 T2
A találmány tárgyát eljárás képezi krioprezervált biológiai anyag felolvasztás utáni túlélésének javítására, amely eljárás magában foglalja hidrosztatikus nyomás biológiai anyagon történõ alkalmazását; a biológiai anyag hidrosztatikus nyomáson történõ tartását elõre meghatározott idõtartamig; a hidrosztatikus nyomás felengedését; és a biológiai anyag fagyasztását arra alkalmas bármilyen
protokoll alkalmazásával. A találmány tárgyát képezi nyomást kialakító készülék alkalmazása is krioprezerválandó biológiai anyag elõkezelésére, valamint nyomást biztosító készülék krioprezerválandó biológiai anyag elõkezelésére, amely eszköz a biológiai anyagot befogadó nyomáskamrát, nyomást létrehozó eszközt, és a kamrában a nyomást fenntartó eszközt tartalmaz.
A leírás terjedelme 20 oldal (ezen belül 4 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.
1
HU 008 599 T2
A találmány tárgyát eljárás képezi krioprezervált biológiai anyag felolvasztás utáni túlélésének javítására, amely eljárás magában foglalja hidrosztatikus nyomás biológiai anyagon történõ alkalmazását; a biológiai anyag hidrosztatikus nyomáson történõ tartását elõre meghatározott idõtartamig; a hidrosztatikus nyomás felengedését; és a biológiai anyag fagyasztását arra alkalmas bármilyen protokoll alkalmazásával. A találmány tárgyát képezi nyomást kialakító készülék alkalmazása is krioprezerválandó biológiai anyag elõkezelésére, valamint nyomást biztosító készülék krioprezerválandó biológiai anyag elõkezelésére, amely eszköz a biológiai anyagot befogadó nyomáskamrát, nyomást létrehozó eszközt, és a kamrában a nyomást fenntartó eszközt tartalmaz. A krioprezervációt széles körben alkalmazzák a modern biológia és biotechnológia különbözõ területein biológiai anyagok széles körének tárolása céljából. A módszerek alapvetõ lépései igen hasonlók: 1. A biológiai anyag kezelése krioprotektív anyagot tartalmazó oldattal. 2. A következõ lépés a biológiai anyag 0 °C alatti hõmérsékletre való fagyasztása. 3. Az így elkészített biológiai anyagot alacsony hõmérsékleten, például folyékony nitrogénben tárolják, hosszú tárolási idõ esetén is. 4. A biológiai anyagot felhasználás elõtt visszamelegítik. 5. A krioprotektív anyagot eltávolítják a biológiai anyagról. Ezenkívül a biológiai anyag eredeti életképességének visszaállítása további lépéseket tehet szükségessé. Számos megközelítéssel próbálták a fent ismertetett alapprotokollt javítani, mivel a krioprezerváció folyamata káros a biológiai anyagra nézve. A jégképzõdés elkerülését célzó megközelítések, mint az ultra gyors hûtési és melegítési sebesség vagy a hûtés során az egyensúlyi fagyáspont fokozatos, –80 °C¹ra való csökkentése nem hoztak megfelelõ megoldást a kriobiológia minden területe számára. A fagyasztás utáni túlélés javítására vonatkozóan az alábbi kísérleteket tették: vitrifikációval a krioprotektív anyagok magas koncentrációjú vizes oldatai rendkívül alacsony hõmérsékletre hûlnek, ami lehetõvé teszi az intracelluláris vitrifikációt (Rall és Fahy, 1985). Fahy és munkatársai (1984) ugyan megemlítették a jelentõsen megnövelt hidrosztatikus nyomás alkalmazásának lehetõségét a vitrifikációt potenciálisan elõsegítõ egy további tényezõként, úgy ítélték meg, hogy a módszer kevés gyakorlati következménnyel jár a reproduktív biológiára nézve. Más vizsgálatok fagyásgátló fehérjék (antifreeze proteins, AFPs) alkalmazásáról számolnak be; a fehérjék nem kolligatív módon csökkentik a vizes oldatok fagyáspontját, gátoljak a membrán ioncsatornáit, és így bizonyos fokú védelmet biztosítanak hûtés alatt (Baguisi és munkatársai, 1987). A krioprotektív anyagok toxikus hatásai és az ozmotikus változások káros következményei nem elhanyagolhatók a bemutatott eljárások egyikének esetében sem.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
Jelenleg ezen eljárások hatékonysága a különbözõ alkalmazások esetében igen eltérõ. Például embrióprezerváció esetében a krioprezerváció hatékonysága 0–80 százalékos az adott fajtól, fagyasztási eljárástól, embrionális fejlõdési fázistól függõen (Ishwar, 1996; Van Wagtendonk¹De Leeuw, 1995, 1997; Medeiro, 2002; Reubinoff, 2001; Hammitta, 2003; Archer, 2003; Stachecki, 2002, Leibo és Songsasen, 2002). A mostanában népszerû humán petesejt-krioprezerváció tekintetében a sikerarány korántsem kielégítõ. 1912 óta ismert tény, hogy a víz különbözõ fázisokon megy át különbözõ hõmérsékleten kialakított hidrosztatikus nyomás mellett (Bridgman, 1911) (7. ábra). Az oldatok 0 °C alatti hõmérsékleten sem fagynak meg, ha bizonyos nyomás alatt állnak (Bridgeman, 1970). Nakahashi és munkatársai (2000, 2001) magas hidrosztatikus nyomást (HHP) alkalmaztak korábban patkánymájak transzplantációs célú, 0 °C alatti prezervációja esetében, valamint Tinneberg és munkatársai (1980) spermiumok tárolása a hideggel kapcsolatos sérülések csökkentése érdekében. E megközelítés esetében a HHP¹t a célból alkalmazzák, hogy a tenyésztõközeg fagyáspontját lényegesen csökkentsék, és így a biológiai anyag a krioprezerváció negatív hatásait kizárva legyen 0 °C alatt tárolható. E megközelítést a feltalálók nem találták megbízhatónak az egérembriók prezentációjának vonatkozásában, ahogy az az alábbi, 2. és 3. példából kitûnik. A 30–50 MPa közötti hidrosztatikus nyomás általában számos organizmus növekedését gátolja: a DNS replikáció megindítása az egyik leginkább nyomásérzékeny intracelluláris folyamat (Abe és munkatársai, 1999). A hatások súlyossága a kompresszió nagyságától és idõtartamától függ (Murakami és Zimmerman, 1973). Beszámoltak arról, hogy a 200–400 Pa tartományba esõ magas hidrosztatikus nyomás alkalmazása hûtött fagyasztott húsra egy nagyságrenddel csökkenteni képes a teljes aerób sejtszámot (Tuboly és munkatársai, 2003). A sejtmembrán a nyomás okozta károsodás által elsõdlegesen érintett struktúrák egyike (Palou és munkatársai, 1997). A magas hidrosztatikus nyomással való kezelés módosíthatja a membrán olyan funkcióit, mint az aktív transzport vagy a passzív permeabilitás, és ezáltal felboríthatja a sejtek fizikokémiai egyensúlyát (Yager és Chang, 1983; Aldridge és Bruner, 1985; Macdonald, 1987; Schuster és Sleytr, 2002). A Routray és munkatársai által a közelmúltban végzett vizsgálat (2002) eredményei szerint a hidrosztatikus nyomás (5 MPa) elõsegítette a DMSO-felvételt a medaka (Oryzias latipes) tojásokkal és embriókkal végzett kísérlet során, de az életképesség mégis gyorsan csökkent. A sejtek fizikai és biokémiai folyamatai megváltozott nyomás mellett a Le Chatelier-elv szerint módosulnak: minden olyan reakció jelentõsen felgyorsul, amelyet térfogatcsökkenés kísér (Murakami és Zimmerman, 1973; Welch és munkatársai, 1993; Palou és munkatársai, 1997). A nyomás alkalmazása részlegesen vagy teljesen szétnyílt konformációjú fehérjepopuláció kialakulásához vezethet. A nyomás a fehérjén belüli kötések felbomlása és az üregek vízkö-
1
HU 008 599 T2
tés általi megszûnése miatt okozza a fehérjék denaturációját (Schmid és munkatársai, 1975; Weber és Drickamer, 1983; Jaenicke, 1991; Gross és Jaenicke, 1994; Silva és munkatársai, 2001). Újabb eredmények szerint a hidrosztatikus nyomás fokozza a sokkfehérjék termelését (Welch és munkatársai, 1993; Wemekamp-Kamphuis és munkatársai, 2002). A vizsgálatok szerint baktériumokban a fehérjeszintézis szubletális hidegsokk által okozott instabilitását az úgynevezett hidegsokk fehérjék (CSP¹k) szintézise védi ki (Phadtare és munkatársai, 1999). A CSP¹k és a HSP¹k számos feltételezett módon, mint például RNS dajkafehérjeként (Graumann és Marahiel, 1999) vagy transzkripciós aktivátorként (LaTena és munkatársai, 1991) mûködhetnek; és feltételezték, hogy a fagyás elleni védelemben is szerepük van (Wouters és munkatársai, 1991). További vizsgálatok eredménye alapján a CSP¹k és a HSP¹k termelõdését nem csupán a hideg általi sokk, hanem a környezet által okozott stressz is kiválthatja. E. coli baktériumokban például a tápanyag-kiváltotta stressz CSP¹k egy típusának termelõdéséhez vezet (Yamanaka és munkatársai, 1998). Egy másik vizsgálat kimutatta, hogy a magas hidrosztatikus nyomású kezelés adott típusú hidegsokk és hõsokk fehérjék termelését okozta (Welch és munkatársai, 1993). Más eredmények szerint a hidrosztatikus nyomás fokozza a sokkfehérjék termelését (Wemekamp-Kamphuis és munkatársai, 2002). Mivel a hidegsokk és a magas nyomású kezelés egyaránt növeli a CSP¹k és HSP¹k szintjét, több tanulmányban vizsgálták az esetleges keresztvédelem lehetõségét. Wemekamp-Kamphuis és munkatársai (2002) kimutatták, hogy a hidegsokknak kitett Listeria monocytogenes nyomás alá helyezését követõen a túlélési arány százszor magasabb volt, mint a 37 °C¹os sejttenyésztés mellett. Míg az élelmiszer-mikrobiológusok a fenti folyamatot a káros mikroorganizmusok kiirtása miatt vizsgálják ((Butz és Ludwig, 1986; Wemekamp-Kamphuis és munkatársai, 2002; Spilimbergo és munkatársai, 2002), jelen találmány célja a krioprezervált biológiai anyagok túlélésének javítása. Az utóbbi idõszakban több figyelem irányult a sokkfehérjék krioprezervációban betöltött szerepére. Huang és munkatársai (1999) közleménye alapján a HSP90 sokkfehérje jelentõs csökkenése összefügghet a kan sertésekbõl nyert spermiumok hûtés alatt tapasztalt csökkent motilitásával. Wen-Lei és munkatársai (2003) kimutatták, hogy krioprezerváció után humán spermiumokban a HSP90 szint jelentõsen csökkent, ami a fehérjelebontás következménye lehet. Összefoglalásként a magas hidrosztatikus nyomás által indukált HSP90: – Citoszolfehérje – Molekuláris dajkafehérje, amely alapvetõ szerepet játszik a stressztoleranciában, a fehérjeszerkezet kialakulásában, a szignáltranszdukcióban stb. – Kimutatták, hogy egy olyan ATPázt tartalmaz, amelynek kulcsszerepe van az eredeti kliensfe-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
hérjék aktivációjában in vivo (Pearl és Prodromou, 2000). – Szerepe van az ondósejtek motilitásában: – Aktiválja a nitrogén-oxid-szintázt (NOS) (Garcia-Gardena és munkatársai, 1998) – Védi a sejteket a reaktív oxigéngyököktõl (ROS) (Fukuda és munkatársai, 1996), ami szignifikáns mértékben megnövekszik a fagyasztás alatt és jelentõsen javítja a spermiumok motilitását – Szerepet játszik az ATP metabolizmusában (Prodromou és munkatársai, 1997) Az ATP szintje lecsökken hidegsokk után, és késõbb nem áll vissza (Watson, 1981). – Kan sertések ondójának lefagyasztását követõen a spermiumok motilitásának csökkenésével párhuzamosan a HSP90 szintje is jelentõsen csökken. A vizsgálat következtetéséül levonták, hogy a HSP90 alapvetõ szerepet játszhat a sertésspermiumok motilitásának szabályozásában (Huang és munkatársai, 1999). – A glendamicin, amely egy specifikus HSP90 inhibitor, dózis- és idõfüggõ módon, szignifikáns mértékben csökkentette a kan sertések spermiumainak motilitását (Huang és munkatársai, 2000). A HSP90 szintje a spermiumok motilitásával egyetemben szignifikáns mértékben csökkent krioprezervációt követõen humán spermiumokban; a csökkenést nem kiszivárgás, hanem a fehérjelebontás okozta (Wen-Lei CAO és munkatársai, 2003). A nyomás által okozott hatások egy adott szint felett letálisak lehetnek: míg egyes biomolekulák irreverzíbilis változása nagy nyomás alatt jön létre, 300 MPa¹on a legtöbb baktérium és többsejtes organizmus elpusztul. Bár a medveállatkák aktív állapotukban 100 és 200 MPa között elpusztulnak, dehidratált (úgynevezett „tun”) állapotban 600 MPa¹ig életben maradhatnak (Seki és Toyoshima, 1998). A feltalálók újabb vizsgálatok alapján meglepõ módon azt találták, hogy a hidrosztatikus nyomást követõen, a technika állása szerinti krioprezervációs protokollban a biológiai anyagok túlélése szignifikáns mértékben javult. Jelen találmány ismertetése során a „túlélés” kifejezés többek között az alábbiakat foglalja magában: javuló, folyamatos in vitro és in vivo fejõdés, magasabb kikelési, implantációs és születési arány (embriók esetében), jobb felengedés utáni motilitás és/vagy javuló megtermékenyítési kapacitás (spermiumok esetében), javuló, folyamatos in vitro és in vivo fejlõdés, javuló megtermékenyülési kapacitás, javuló kikelési, implantációs vagy születési arány (petesejtek esetében). Nyilvánvaló, hogy a kezelt biológiai anyagtól függõen, a „túlélés” kifejezés egyéb funkcionális jellemzõket is magában foglalhat. E célból a különbözõ típusú biológiai anyagok nyomási toleranciáját meghatároztuk (lásd 1., 5. és 6. példa), amit számos technika állása szerinti eljárás vizsgálata követett annak céljából, hogy javítani tudjuk a nyomás alá helyezett biológiai anyagok túlélését (lásd
1
HU 008 599 T2
2. és 3. példa). Ezt követõen, a feltalálók tovább vizsgálták a nyomáskezelés különbözõ biológiai anyagokra kifejtett hatásait, és váratlanul rátaláltak a nyomáskezelés azon módjára, amely teljesítette elvárásaikat. Hangsúlyozzuk, hogy a jelen találmány egyaránt alkalmazható számos krioprezervációs protokollra, és a találmány nem korlátozza az ezek közüli választást. A továbbfejlesztett protokolloknak egyedül a hidrosztatikus nyomás kivitelezését kell egyedül beépítenie, amely paramétereit a szakember a találmányban leírtak alapján könnyen optimalizálhatja. A találmány összefoglalása A találmány tárgya eljárás életképes krioprezervált biológiai anyag felolvasztás utáni túlélésének javítására, amely eljárás magában foglalja (a) hidrosztatikus nyomás életképes biológiai anyagon történõ alkalmazását, adott esetben elõre meghatározott nyomás-idõ profil szerint; (b) az életképes biológiai anyag hidrosztatikus nyomáson történõ tartását elõre meghatározott idõtartamig; (c) a hidrosztatikus nyomás felengedését; (d) az életképes biológiai anyag fagyasztását arra alkalmas bármilyen protokoll alkalmazásával. Egy megvalósítási mód szerint a találmány szerint alkalmazott nyomás az 1–250 MPa tartományba esik. Elõnyös megvalósítási módokban az alkalmazott nyomás a 10–100 MPa, elõnyösebben a 20–75 MPa és még elõnyösebben a 30–60 MPa tartományba esik. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti eljárásban alkalmazott nyomást 1 másodperc és 300 perc közötti idõtartamig alkalmazzuk. Elõnyös megvalósítási módokban a nyomást 1 másodperc és 150 perc közötti, elõnyösebben 1 másodperc és 90 perc, és még elõnyösebben 1 másodperc és 60 perc közötti idõtartamig alkalmazzuk. Más megvalósítási módok szerint a nyomást 1 másodperc és 4 óra közötti idõtartam alatt engedjük fel. Más megvalósítási módokban a nyomás megszüntetésére alkalmazott idõtartam 10 másodperc és 2 óra közötti, vagy 1 perc és 1 óra közötti, vagy más esetekben 10 perc és 30 perc közötti. A nyomás felengedése pillanatszerû is lehet. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti eljárást a gerinces állat petesejtjei, spermiumai, zigotái, morulái, blasztocisztái, õssejtjei, sejtjei és szövetei által alkotott csoportból kiválasztott életképes biológiai anyaggal kapcsolatosan alkalmazzuk. Más elõnyös megvalósítási módok tárgya olyan eljárás, ahol a gerinces állat hal, madár vagy emlõs, elõnyösen szarvasmarha, ló, kecske, juh, sertés, más háziállat, házikedvenc, fõemlõs, beleértve ember. A találmány tárgyát képezi nyomást kialakító eszköz alkalmazása életképes biológiai anyag krioprezervációjára. Elõnyös megvalósítási módokban a nyomást kialakító eszköz alkalmazása bármelyik találmány szerinti krioprezervációs eljárást magában foglalhatja.
5
10
15
20
25
30
2
Elõnyös megvalósítási módokban a találmány szerinti alkalmazás olyan nyomást kialakító készüléket foglal magában, amely a biológiai anyag befogadására alkalmas nyomáskamrát és az 1–250 MPa, elõnyösen 10–100 MPa, elõnyösebben 20–75 MPa, és még elõnyösebben 30–60 MPa tartományba esõ szabályozott nyomás biztosítására alkalmas eszközt tartalmaz. Más elõnyös megvalósítási módokban a találmány szerinti alkalmazás olyan nyomást kialakító készüléket foglal magában, amely a nyomás 1 másodperc és 300 perc közötti, elõnyösen 1 másodperc és 150 perc közötti, elõnyösebben 1 másodperc és 90 perc, és még elõnyösebben 1 másodperc és 60 perc közötti idõtartamig történõ fenntartására alkalmas eszközt tartalmaz. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti alkalmazás magában foglalja a nyomást kialakító készülékkel kapcsolatos szabályozórendszer alkalmazását a nyomáskamra 1 másodperc és 4 óra közötti idõtartam alatt történõ dekompresszálásának szabályozására. A találmány specifikus megvalósítási módjainak tárgya nyomást kialakító készülék alkalmazása, ahol a nyomást biztosító készülékben hidrosztatikus nyomást valósítunk meg. Egy másik elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány tárgya nyomást kialakító készülék alkalmazása, ahol a biológiai anyag a gerinces állat petesejtjei, spermiumai, zigotái, morulái, blasztocisztái, õssejtjei, sejtjei és szövetei által alkotott csoportból van kiválasztva. A találmány tárgyát képezi továbbá találmány szerinti nyomást kialakító eszköz alkalmazása is biológiai anyag nyomáskezelésére.
35
40
45
50
55
60 4
Részletes leírás A találmány részletes leírását és a találmányi gondolat demonstrálását egérembriók alkalmazásával leírásával mutatjuk be. Nyilvánvaló, hogy a feltárt eljárások az összes rutinszerûen krioprezerváción átesett biológiai anyagon egyaránt alkalmazhatók. A könnyû hozzáférés és manipulálhatóság miatt egérembriókat választottunk a részletes leíráshoz. Szükségtelen hangsúlyoznunk, hogy az embriók krioprezervációja az ipari és egészségügyi alkalmazások miatt a krioprezervációkutatás középpontjában áll. A találmány szerinti eljárás során és a jelen leírásban az „egérembrió” kifejezést a „biológiai anyag” kifejezéssel felváltva használjuk, azok egymással felcserélhetõek. A jelen leírásban mesterségesen megtermékenyített marhaembriók és bikaspermiumok váratlan kiolvadás utáni túlélést mutató kísérletes eredményei is bemutatásra kerülnek. A példaként alkalmazott biológiai anyag eltérõ emlõsfajokból nyert, implantáció elõtti vagy utáni embrió, gerinces állatokból származó vagy emberi petesejt, spermium, õssejt, szövet vagy szerv vagy egész szervezet lehet. Gerinces állat bármilyen faj, például hal, madár vagy emlõs, elõnyösen marha, ló, kecske, juh, sertés vagy egyéb haszonállat, háziállat, fõemlõs (beleértve az embert) lehet.
1
HU 008 599 T2
A többi igen fejlett eukarióta szervezethez hasonlóan, az egérembriók érzékenyebbek a hidrosztatikus nyomás hatásaira, mint a medveállatkák és a baktériumok. Az elsõ cél tehát annak megállapítása volt, hogy a nyomás milyen alapvetõ változásokat okoz az egérembriókban, és hogyan befolyásolja azok túlélését. A jelen találmányban leírt módszer alapos vizsgálatának céljából megalkottunk egy leírt készülékprototípust. A 8. ábrán bemutatott, 1. nyomást kialakító készülék az alábbi példákban ismertetett kísérletek során használtuk. A 1 nyomást kialakító készülék két 3 nyílást tartalmazó 2 hengeres nyomáskamrát tartalmaz, amelyek egyike a tetején, a másik az 4 alján helyezkedik el, a 5 nyomásmérõ a 3 felsõ nyíláshoz csatlakozik, és a 6 dugattyú az 4 alsó nyíláson keresztül van beillesztve. A 5 nyomásmérõ bármilyen, a célnak megfelelõ mérõeszköz lehet, feltéve, hogy alkalmas a céltartományon belül, azaz 1–250 MPa, elõnyösen 10–100 MPa, elõnyösebben 20–75 MPa, még elõnyösebben 30–60 MPa közötti nyomás mérésére. A 2 nyomáskamra belsõ magassága körülbelül 60 mm, belsõ szélessége körülbelül 20 mm. A 2 kamra 7 fala úgy van kialakítva, hogy elbírjon legalább 250 MPa, elõnyösebben legalább 75 Mpa, még elõnyösebben legalább 60 MPa nyomást. A 2 kamra 7 fala elõnyösen korróziónak ellenálló anyagból van kialakítva, amely elõnyösen mûanyag vagy rozsdamentes acél. A 7 fal belsõ oldalán, az 4 alsó nyílás és a 6 dugattyú közötti szoros illeszkedés javítása céljából, az utóbbi 8 körkörös nyomástömítéssel van ellátva, mint amilyen például a teflongyûrû-tömítés. Ilyen, vagy egyéb 8 típusú nyomástömítés elõnyösen a 3 felsõ nyílásnál, a 5 nyomásmérõ illeszkedésénél is használandó. A 7 fal alsó nyílás körüli része egy 9 peremet képezõ perifériás kiemelkedést tartalmaz. A 2 nyomáskamra továbbá egy 10 vastag kupakkal van ellátva, amely a 6 dugattyú megtartására és a 2 kamrába való beillesztésre alkalmas. A 10 kupak a 9 peremhez kapcsolható rögzítõeszközök, például 11 csavarok segítségével. Az egyes csavarok szakítószilárdsága megfelelõen magas kell hogy legyen ahhoz, hogy ellenálljon a 2 kamrában kialakuló magas nyomás által okozott erõknek. A 2 nyomáskamra egy viszonylag alacsony kompresszió mellett nagy nyomás létrehozására alkalmas 12 anyagot tartalmaz, és a kompressziót a 6 dugattyú 2 nyomáskamrába való további behatolása hozza létre. Ilyen anyag bármilyen, 12 nem szilárd anyag lehet (elõnyösen 12 folyadék vagy gélszerû közeg), amit a magas nyomású technológiában alkalmaznak, de a vizsgálathoz vizet használtunk. Az 12 anyag kompresszió alatti felmelegedését elkerülendõ, a 2 nyomáskamra elõnyösen hõvezetõ anyagból van kialakítva. Nyilvánvaló, hogy a fent leírt 1 nyomást kialakító készülék olyan átmérõvel készülhet, amely a jelen találmány tárgyát képezõ jobb krioprezervációs módszert hordozható formában is biztosítani tudja. Az alábbi méretek csupán például szolgálnak, és a szakember mind nagyobb, mind kisebb kiviteli alakot létrehozhat. A 2 nyomáskamra belsõ magassága (Hi) 60 mm, míg
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
belsõ átmérõje (Di) 20 mm, ami egyben a 6 dugattyú átmérõjének felel meg. A 6 dugattyú magassága (Hp) a Hi-értékhez arányosan választható, például a rövid tesztkészüléknél 20 mm volt. A 2 kamra 7 falának vastagsága (Dw) körülbelül 10 mm. A 6 dugattyú körüli 8 nyomástömítés magassága (Hs) 5 mm, vastagsága (Ds) 2 mm. A 10 kupak 9 peremhez való illesztéséhez használt 11 csavarok átmérõje (D) 8 mm. Az ilyen méretû, kereskedelmi forgalomban lévõ 11 csavarok szakítószilárdsága 800 MPa lehet, ami elegendõ 200 MPa nyomásnak ellenállni. A készülék aktuális méretét a kezelendõ biológiai anyag és a biológiai anyag készülékbe való behelyezését biztosító eszközöknek megfelelõen tervezhetõ meg. A krioprezerválandó (megfelelõ embriótároló oldatot tartalmazó mûanyag szalmába felszívott) egérembriók elõkezelése során az embriókat a 2 kamrában lévõ 12 folyékony közegbe (ami közönséges víz volt) helyeztük; a 6 dugattyút külön erõkifejtés nélkül az 4 alsó nyílásba helyeztük, és a 10 kupakot a 11 csavarokkal a 2 kamra 9 pereméhez csatlakoztattuk úgy, hogy hozzáérjen a 6 dugattyúhoz, amely a nyomás alatt nem álló 12 közeg esetén a 2 kamrából részben kiáll. Ezt követõen a kupakot az 4 alsó nyíláshoz közelítettük, ami által a 6 dugattyút a szorítócsavarok (kézi erõ vagy a csavarok automatizmusa révén) tovább a 2 kamrába nyomták olyan sebességgel és mértékkel, hogy az adott kísérlethez szükséges nyomást elérjék. A 2 kamrában ezáltal kialakuló nyomást az 5 nyomásmérõ ellenõrizte. A kívánt idõ eltelte után a kamra nyomástalanítása vagy a 11 csavarok fokozatos meglazítása, vagy a 5 nyomásmérõ felsõ nyíláson keresztüli eltávolítása, és így a 12 folyékony közeg majdnem azonnali térfogatnövekedése által valósult meg. Az embriók kamrába való helyezése nem korlátozódik a mûanyag szalmára. Az alkalmazás módjától és a biológiai anyagtól függõen a kezelendõ minta különféle tartóstruktúrákba helyezhetõ. Például az embriók vagy a sejtek cryoloopra vagy elektronmikroszkópos rácsokra helyezhetõk. Egy ettõl eltérõ kiviteli alaknál a biológiai anyagot tartalmazó tárolóoldat egy cseppjét 12 folyékony közegként egyszerûen ásványolajjal fedhetjük be. Ebben az esetben az egész nyomást kialakító készülék sokkal kisebb lehet, ami lehetõvé teszi, hogy az könnyen a mikroszkóp alá legyen helyezhetõ a könnyû visszanyerés céljából. Makroszkópos biológiai anyag esetén nincs szükség speciális elhelyezési eszközökre, a mintát kamrába helyezhetjük, és a 12 folyékony közeg egyben a tárolóoldat szerepét is betöltheti. Bármilyen olyan eszköz, amely a biológiai anyag oly módon történõ kamrába helyezését és/vagy tartását teszi lehetõvé, amely biztosítja a magas hidrosztatikus nyomás kialakulását, a találmány oltalmi körébe tartozik. Az 1. nyomáskialakító készülék egy programozható vezérlõrendszer segítségével teljesen automata mûködésû lehet. Egy ilyen vezérlõrendszer az alábbi betáplálási paraméterekkel rendelkezhet: nyomásnövelõ sebesség, a maximális nyomás kialakulásának idõpontja és a nyomás leengedésének sebessége. Hõmérséklet-
1
HU 008 599 T2
szabályozó eszközök szintén alkalmazhatóak, bár a 2 kamra 7 falának jó hõvezetõ-képességgel rendelkezõ anyagból való kialakítása elegendõ lehet a káros hõmérséklet-ingadozások kiküszöbölésére. A hõmérséklet-szabályozó eszközök integrált, nyomást kialakítófagyasztó eszközként is elképzelhetõk, amely így egy lépéses megoldása lehet a krioprezervációs eljárásnak. Ilyen esetben mind a nyomást kialakító, mint a fagyasztó komponensek automatizáltak lehetnek olyan eszköz által, amely lehetõvé teszi a nyomáskezelés és a fagyasztás eltérõ biológiai anyagok elõírásai szerinti programozását. Egy olyan hordozható készülék is elképzelhetõ, amely nagyon hasonló lehet a fent leírt tesztegységhez, és a biológiai anyagok egyszerû kezelését tenné lehetõvé, majd e lépést követõen, a nevezett biológiai anyag tartósítása korábban kialakított technológia szerint történne. Ez a megközelítés segítené a távoli helyeken lévõ felhasználókat, vagy lehetõvé tenné a készülék olyan különféle projektekben való felhasználását, mint például a vadvilág megõrzését. A különféle biológiai anyagok nyomástoleranciájának vizsgálatára körültekintõen megtervezett kísérleteket végeztünk. Az alkalmazott nyomás- és idõintervallumot úgy választottuk meg, hogy az a lehetõ legjobban megfeleljen a késõbbi gyakorlati felhasználási módoknak. Például amint azt a 7. ábra is mutatja, a víz fázisváltási hõmérséklete a 0,1 MPa értéken tapasztalt 0 °C¹ról 210 MPa¹on –21 °C¹ra csökken, míg ezen érték fölötti nyomáson ez a hatás megfordul. Ebbõl kifolyólag, a találmány szerinti eljárás során alkalmazott nyomást 1 és 250 MPa között határoztuk meg, vagy még inkább addig a nyomásértékig, amin a tápoldat a készülék mûködési hõmérséklete mellett megfagy. A kiterjedt blasztociszta állapotú embriók esetében alkalmazható nyomásértékek 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200 vagy 250 MPa lehetnek, vagy ezen köztes értékek közti bármely érték is. Az adott biológiai anyagnál alkalmazható hidrosztatikus nyomás elõre meghatározott nyomás-idõ profillal alkalmazható. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a biológiai anyagtól függõen az anyagra gyakorolt nyomás az idõ elõrehaladtával fokozatosan növekedhet. Az adott biológiai anyag szempontjából legalkalmasabb profilt tapasztalati úton is határozhatjuk meg, és lehet lineáris, lépcsõzetes, vagy más hagyományosan alkalmazott idõprofil szerinti. Ehhez hasonlóan, a kiválasztott, magas nyomáson tárolandó biológiai anyag esetében széles idõskálából lehet választani. Közelebbrõl az egérembriók a kiválasztott nyomáson 1 másodperc és 6 óra közötti, pontosabban 1 mp, 5 mp, 10 mp, 20 mp, 30 mp, 40 mp, 50 mp, 1 perc, 2 perc, 3 perc, 4 perc, 5 perc, 6 perc, 8 perc, 10 perc, 15 perc, 20 perc, 30 perc, 40 perc, 50 perc, 60 perc, 70 perc, 80 perc, 90 perc, 120 perc, 150 perc, 180 perc, 210 perc, 240 perc, 300 perc vagy 360 perc ideig tárolhatók. A nyomás alatt álló embriók túlélési ideje a nyomás növekedésével csökken.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
A szakember számára nyilvánvaló, hogy a nyomásos elõkezelés vége és a krioprezerváció kezdete közötti idõ a különféle kiviteli alakok esetében számottevõen eltérõ lehet. Az adott protokolltól függõen a biológiai anyag állapota ezen idõtartományon belül változhat. Ez az idõszak, amennyiben elég hosszú, lehetõvé teheti a sejtek fizikai regenerációját, vagy ellenkezõ esetben sejtélettani folyamatok indulhatnak be, mint például sokkfehérjék szintézise és felszaporodása. Ezen hatások a különféle körülményektõl függõen hatásosak vagy károsak is lehetnek; emiatt a protokoll kísérlet alatti optimalizációja szükséges lehet. Az 1. ábra szerint az embriók túlélhetik a jelentõs nyomást szemmel látható morfológiai károsodások nélkül (például 90 MPa 1 mp¹ig vagy 30 MPa 2 órán át). Az embriók az alkalmazott nyomás erõsségétõl és idejétõl függõen összeestek. Anélkül, hogy a találmány oltalmi körét elméletileg korlátoznánk, feltételezzük, hogy a nyomás közvetlenül nem okozhatta a víz kilépését a blasztocisztákból. A hivatkozott dokumentumok alapján, az embriók összeesése inkább a különféle fehérjék (hidegsokk-fehérjék, CSP¹k) nyomásindukálta termelõdésének, fehérjestruktúra reverzíbilis változásnak és metabolikus folyamatoknak tulajdonítható. Az összeesett embriók in vitro tenyészetben 4¹5 óra múlva érték el eredeti alakjukat, és a kontrollokhoz hasonlóan, folytatták fejlõdésüket (például 90 MPa¹on 30 percen át, vagy 30 MPa¹on 3 órán át kezelt embriók). Anélkül, hogy a találmány oltalmi körét elméletileg korlátoznánk, a mesterségesen megtermékenyített marhaembriókkal végzett vizsgálatok alapján megállapítható, hogy az összeesés nem képezi az optimális nyomáselõkezelés kritériumát. Az összeesés a nyomás általi megváltozott membránpermeabilitásnak, a megváltozott sejtmembránon keresztüli diffúziónak és aktív transzportnak tulajdonítható. A morfológiában bekövetkezõ ezen reverzíbilis változás egy olyan morfológiai „jelnek” tekinthetõ, amely jelzi, hogy az embriót „szubletális” kezelés érte. Az irodalmi adatok szerint a „szubletális” sokk egy olyan hatás, amely az úgynevezett „sokkfehérjék” termelõdését indukálja, és ezen fehérjék gyaníthatóan hozzájárulnak a krioprezerváció javuló mutatóihoz. Azonban bizonyos alkalmazásokban az összeesett embriókat elõnyösen kiválogathatjuk krioprezervációra. Nyomás alá helyezést követõen a kiterjedt blasztociszták összeesnek, és ebben az állapotban maradnak 3¹4 órán át, majd újra felveszik eredeti alakjukat. E jelenség alapján a fagyasztás elõtt nyomással kezelt embriók kiválaszthatók. Mivel az embriók morfológiai változásait és a nyomásos elõkezelés jótékony hatásait a megváltozott fehérjestruktúra és/vagy fehérjejellemzõk és/vagy a különféle nyomásindukálta fehérjék fokozott termelõdése okozza, ezen fehérjék vizsgálata jelezheti a krioprezerváció elõtt a biológiai anyagnál alkalmazott magas nyomást. A nyomásos elõkezelés bizonyos fokig korrelál továbbá azzal az idõtartammal, amely alatt az embriók visszanyerik normál fejlõdésüket a krioprezerváció után. E folyamat megfigyelése utalhat az elõkezelés
1
HU 008 599 T2
módjára, mivel a magas hidrosztatikus nyomás jelentõsen megrövidítheti a regenerációhoz szükséges idõt. Minél nagyobb az alkalmazott nyomás, annál kevesebb ideig élik túl az embriók a kezelést. Egy adott erõsséget és idõtartamot meghaladó nyomás irreverzíbilis változásokat idézett elõ: 2 órás in vitro tenyésztést követõen az embriók szétestek vagy a dekompresszió (például 90 MPa¹on 2 óra vagy 30 MPa¹on 5 óra) után eleve szétesett állapotban voltak. A szakembernek meg kell tudni állapítani ezen nyomás- és idõértékeket az adott, alkalmazott biológiai anyaggal szerzett rutin kísérletezés alapján. Nyilvánvaló, hogy a nyomás alatt lévõ embriók fokozatos dekompressziójával az embriók túlélési aránya megnövelhetõ. Vizsgálatok alapján a nyomás alatt lévõ embriók túlélési aránya lényegesen megnõtt, ha azokat fokozatosan nyertük vissza. Míg 60 percig tartó, 90 MPa nyomás minden embrióra halálos volt, addig az embriók 80%¹a túlélte a 120 perces fokozatos dekompressziót. A dekompressziós idõ a jelen találmány jellemzõje, amelyet a szakember határozhat meg a speciális alkalmazástól függõen. Közelebbrõl a kiválasztott nyomáson tárolt egérembriók dekompressziója 1 másodperc és 4 óra közötti, pontosabban 1 mp, 5 mp, 10 mp, 20 mp, 30 mp, 40 mp, 50 mp, 1 perc, 2 perc, 3 perc, 4 perc, 5 perc, 6 perc, 8 perc, 10 perc, 15 perc, 20 perc, 30 perc, 40 perc, 50 perc, 60 perc, 70 perc, 80 perc, 90 perc, 120 perc, 150 perc, 180 perc, 210 perc vagy 240 perc alatt következhet be. A nyomásértékekhez hasonlóan, a dekompresszió is történhet elõre beállított nyomás-idõ profil szerint. Elméleti korlátok nélkül, e jelenség egy lehetséges magyarázata lehet, hogy nyomás alatt jelentõs mennyiségû CO2 képzõdik (Abe és Horikoshi, 1995). A CO2 hidrációját és ionizációját (HCO3– és H+) fokozza a magas nyomás, mivel a reakció az alkalmazott nyomás mértékétõl függõ térfogatcsökkenéssel (–0,26 ml/mol) jár (Palou és munkatársai, 1997; Welch és munkatársai, 1993). A sejten belül keletkezett szén-dioxid azonnal oldódik majd disszociációjával HCO3– és H+ keletkezik, ami így csökkenti az intracelluláris pH¹értéket (Abe és Horikoshi, 1995, 1997, 1998; Abe és munkatársai, 1999). Feltételezhetõ, hogy a megnõtt nyomás által fenntartott egyensúly atmoszferikus nyomáson halálos az embriókra. Feltételezhetõ továbbá, hogy a nyomás azonnali csökkenése a citoplazmában lévõ hidratált és ionizált formákból képzõdõ, emelkedett CO2 szintet eredményez, ami az embriók azonnali elpusztulását okozza. Egyes dekompressziós idõk esetén, a megnõtt hidrosztatikus nyomás által reverzíbilisen inaktivált plazma membránfehérjék (H+-ATPáz) (Schmid és munkatársai, 1975; Péqueux és Gilles 1978) újra mûködni kezdenek, ami a (passzív diffúzióval egyetemben) fokozatosan az élettani állapot felé tolja el az egyensúlyi állapotot. Magas hidrosztatikus nyomást (HHP) alkalmazott korábban Nakahashi és munkatársai (2000, 2001) patkánymájak transzplantációs célú, 0 °C alatti prezervációja esetében a hideggel kapcsolatos sérülések csök-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
kentése érdekében. E megközelítés esetében a HHP¹t a célból alkalmazzák, hogy a tenyésztõközeg fagyáspontját lényegesen csökkentsék, és így a biológiai anyag a krioprezerváció negatív hatásait kizárva legyen 0 °C alatt tárolható. E krioprezervációs módszer egérembriókon való vizsgálatának céljából olyan vizsgálatokat terveztünk, amelyek során az embriókat 0 °C¹on helyezzük nyomás alá. Az embriók túlélése szignifikáns mértékben lecsökkent. Míg szobahõmérsékleten az embriók átlagos túlélési aránya 45 percig tartó 30 MPa nyomáson 90% volt, addig e hatást 0 °C¹on egy embrió sem élte túl. 10 vagy 5 percig tartó, 0 °C¹on kivitelezett, 60 MPa vagy 90 MPa nyomáson azonban az embriók túlélték a kezelést. Ezzel ellentétben, szobahõmérsékleten a túlélési arány 90% volt mindkét esetben. Az embriókat 0 °C¹on is nyomás alá helyeztük, majd fokozatos dekompresszión estek át. Az alacsony hõmérsékleten alkalmazott fokozatos dekompresszió nem befolyásolta elõnyösen az embriók túlélését. Ezen eredmények alapján e jelenség nem alkalmazható ilyen formában, mivel a nyomás és az alacsony hõmérséklet együttes alkalmazása halálosnak bizonyult az embriókra nézve. A találmány tárgya a hidrosztatikus nyomásnak kitett, krioprezervált egér blasztociszták felengedést követõ túlélésének javítása. Ez a nyomás alá helyezett, majd bármilyen krioprezervációs protokollon és felengedésen átesett embriók tápoldatba és/vagy pszeudoterhes recipiensekbe való áthelyezés révén vizsgálható. Az egészséges utódok in vitro fejlõdése, implantációja, és további méhen belüli fejlõdése, valamint megszületése egyértelmûen bizonyítja azok biológiai és genetikai potenciálját. Amint az fentebb részletesen leírtuk, a kiterjedt egérblasztociszták krioprezervációt követõ túlélési arányát a fagyasztási eljárás elõtt alkalmazott, bizonyos nyomáskezelési protokollok javíthatják. A 30 percig tartó 60 MPa¹os nyomás a blasztociszták 80–90%-ának összeesését okozta, és a túlélés nem különbözött a kezeletlen kontrollnál tapasztalttól. Az in vitro vizsgálatok eredményei alapján, az alkalmazott nyomáskezelés javítja az embriók in vitro fejlõdését fagyasztás után. In vitro vizsgálatok kimutatták, hogy a hidrosztatikus nyomás nem csupán a kezelt blasztociszták túlélési arányát javítja, hanem az embriók természetes állapotának kialakulásához szükséges idõt is megrövidítette. Példavizsgálatainkban 6 óra elteltével a nyomáskezelésnek alávetett blasztociszták 90%¹a morfológiailag (átmérõ, strukturális integritás és általános morfológia) teljesen megegyezett a kontroll embriókkal, és az embriók 95%¹a a kontrollokkal egyidejûleg, 20 órán belül teljesen kikelt. A nyomás nélkül fagyasztott embriók csupán a felengedést követõ 20 órán túl nyerték vissza eredeti alakjukat. Az alakjukat visszanyert blasztociszták szignifikánsan kevesebben voltak, mint a nyomáskezelt blasztociszták (46% kontra 98%). Ezenfelül, e csoportból egy embrió sem kelt ki. Ebbõl nyilvánvalóvá, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmas igen életképes egérembriók elõállítására további implantáció céljából.
1
HU 008 599 T2
Az ábrák leírása Az 1. ábra az embriók túlélési arányát mutatja eltérõ nyomásértékek (10 MPa–150 MPa között, 10 MPa¹os léptékkel) és idõértékek (1 mp, 5 perc, 15 perc és 30 perctõl 300 percig, 30 perces léptékkel) mellett, szobahõmérsékleten. Minden csoportban 14–16 embriót alkalmaztunk; minden kísérletet 3¹szor ismételtünk meg. Az „a” és „b” betûkkel jelzett területek embrióinak túlélési aránya nem különbözött a nem kezelt kontrollokétól (p<0,05). A 2. ábrán a 90 MPa¹on 30, 60, 120 percig tartott, majd 30–180 percig dekompressziós eljáráson átesett embriók túlélési aránya látható (30, 60 és 120 perces dekompresszió mellett az azonnali túlélési arány sorrendben 50%, 0% és 0% volt). Az ábrán eltérõ felsõ indexszel jelölt túlélési arányok szignifikáns mértékben (p<0,05) különböztek egymástól. A 3a. ábra a 30, 60 és 90 MPa¹on, 1 mp és 45 perc között, szobahõmérsékleten nyomáskezelt embriók túlélési arányát mutatja. A 3b. ábra a 30, 60 és 90 MPa¹on, 1 mp és 45 perc között, 0 °C¹on nyomáskezelt embriók túlélési arányát mutatja. Minden csoportban 12–15 embriót használtunk, minden kísérletet 3¹szor ismételtünk meg. A szobahõmérsékleten és a 0 °C¹on nyomáskezelt csoportok között szignifikáns eltéréseket találtunk (p<0,01). A 4. ábra a (nyomáskezelt és kontroll) spermiumok átlagos motilitási értékeit ábrázolja. Az 5. ábra az I. bika spermiumainak átlagos motilitását ábrázolja nyomáskezelést és fagyasztást-felengedést követõen. A 6. ábra az II. bika spermiumainak átlagos motilitását ábrázolja nyomáskezelést és fagyasztást-felengedést követõen. A 7. ábra a víz fagyáspontjait mutatja eltérõ nyomásértékek mellett. A 8. ábra egy jelen találmány szerinti, lehetséges nyomást kialakító készülék vázlatos keresztmetszeti rajzát mutatja. Példák Az 1–4. példák anyagai és módszerei Kísérleti állatok és embrió elõállítás CB6F1 (Charles River, Németország) egereket standard körülmények között tartottunk (22 +/– 2 °C; 12 óra sötét/12 óra fény; víz és táplálék ad libitum). A nõstényekben szuperovulációt idéztünk elõ 10 NE PMSG (Sigma, USA) majd 46 óra múlva 10 NE hCG (Sigma, USA) intraperitoneális injekcióval. A hCG beadását kõvetõen 6 órával a nõstények monogám párokban termékeny hímekkel szaporodtak. Az egy vagy kétsejtes embriókat (0. és 1. nap) a petevezeték FertiCult öblítõoldattal (FertiPro N. V., Belgium) történõ át-
2
öblítésével nyertük ki. Az embriókat termosztátban, 37 °C¹on, 5% CO2 tartalmú és maximális páratartalmú levegõn tenyésztettük. Az egysejtes és kompakt morula állapot között lévõ embriókat G 1.2 tápoldatban (Vit5 rolife, Svédország) tenyésztettük Ovoil ásványi olaj (Vitrolife, Svédország) alatt. Ezután az embriókat G 2.2 (Vitrolife, Svédország) oldatba helyeztük és Ovoil alatt tenyésztettük a kiterjedt blasztociszta állapot eléréséig. Az eljárásokat az egyetem Állatgondozási és felhasz10 nálási bizottsága jóváhagyta.
15
20
25
30
Nyomáskezelés A blasztocisztákat levegõbuborékok nélkül, mûanyag szalmába szívtuk (7–9 embrió/szalma) M2¹ben (Sigma, USA), amiket ezt követõen hõvel lezártunk. A szalmákat nyomásközegként vizet tartalmazó nyomáskamrába helyeztük. A célra készített nyomást kialakító készülék alkalmas volt pontosan szabályozott nyomás kialakítására 1 és 150 MPa között, rozsdamentes acélból készült, belsõ átmérõje 2 cm volt, és egy nyomásmérõhöz volt csatlakoztatva. A hidrosztatikus nyomást a dugattyú kézi irányítású csavarok általi, nyomáskamrába való benyomása hozta létre. A kívánt mértékû nyomás elérése 20 másodperc és 5 perc közötti ideig tartott (10 MPa és 150 MPa esetén); a nyomáskiengedés ideje 3 másodperc volt. Azon kísérleteknél, ahol a fokozatos dekompresszió hatását vizsgáltuk, a kiengedés ideje 30–210 perc között változott. A 0 °C¹on végzett kísérleteknél a nyomáskamrát egy Bio-cool (FTS¹Systems, NY, USA) hûtõfürdõbe helyeztük.
Krioprezerváció megelõzõ nyomáskezeléssel Az embriókat random módon három csoportba 35 osztottuk. Az I. csoport blasztocisztáit az alábbi módon krioprezervációnak vetettük alá egy 7 M etilénglikolt tartalmazó vitrifikációs oldatban Nowshari és Brem (1998) szerint. A II. csoport embrióit 60 MPa nyomással kezeltük 30 percig, majd azonos módon fa40 gyasztottuk le õket. A III. csoport kezeletlen kontroll volt. Felengedés után az embriókat 24 órán át tenyésztettük in vitro. Krioprezerváció Az embriókat 5 percig 1,5 M etilénglikolt (EG, Sigma, USA) és 0,25 M szukrózt tartalmazó oldatban M2¹ben (Sigma, USA) kiegyensúlyoztuk, amit 10%¹os magzati borjúszérummal (Fetal Calf Serum (FCS), Sigma, USA) egészítettünk ki, majd vitrifikációs oldattal 50 (7 M EG, 0,5 M szukróz M2¹ben 10%¹os FCS-sel) elõtöltött 0,25 ml¹es mûanyag szalmába helyeztük (7–9 embrió/szalma). Végül a szalmákat hõvel lezártuk. 1 perces vitrifikációs oldattal való kezelést követõen a szalmákat lassan folyékony nitrogénbe merítet55 tük. A szalmák felengedéséhez azokat 30 másodpercig 30 °C¹os vízbe helyeztük, majd az embriókat visszanyertük, és rehidrációs oldatba (0,5 M szukróz M2¹ben 10%¹os FCS-sel) helyeztük 5 percre. A fent ismertetett módon az embriókat ezután G 2.2 oldatban tenyésztet60 tük (Nowshari és Brem, 1998). 45
8
1
HU 008 599 T2
Embriók áthelyezése Az embriókat a fentiek szerint G 2.2-ben 2 órán át tenyésztettük. Ezt követõen, kísérleti csoportonként az embriókat „elhalt” és „túlélt” embriókra választottuk szét, majd egyenként (állatonként 7–12 embrió) 3. napos pszeudoterhes recipiensekbe helyeztük õket. A kontrollként kezeletlen blasztocisztákat helyeztük át. Kiértékelés és statisztikai elemzés Az embriók minõségét a nyomáskiengedés, illetve a felengedés után azonnal, valamint 2, 3, 4, 6, 12, 20 és 24 óra elteltével mértük fel. Az embriók túlélését morfológiai elemzéssel állapítottuk meg: a blasztomerek intakt állapotát, a blasztociszta üregének visszaállását és a zona pellucidából való kikelést tekintettük a túlélés jelének. Kontrollként kezeletlen blasztocisztákat használtuk. Az in vivo értékeléshez a nyomáskezelt embriókat G 2.2-ben tenyésztettük 2 órán keresztül a fentiek szerint. Ezután állatonként 7–12 embriót helyeztünk át 3. napos pszeudoterhes recipiensekbe. Kontrollként a kezeletlen blasztocisztákat helyeztük át. Az egészséges utódok megszületése az embriók in vivo túlélését bizonyította. A túlélési arányokat a kontrollnál tapasztalt értékkel khi-négyzet próbával hasonlítottuk össze. 1. példa. Az egérembriók túlélése különbözõ nyomásértékek mellett, szobahõmérsékleten Jelen kísérletekben azt embriókat 10 és 150 MPa közötti (10 MPa¹os léptékkel), eltérõ hidrosztatikus nyomásértékeknek tettük ki eltérõ ideig, 1 másodperc és 300 perc között, szobahõmérsékleten. Adott mértékû és idejû nyomáskezelést meghaladó paraméterekkel való kezelés (1. ábra) reverzíbilis morfológiai változásokat okozott. A kiterjedt blasztociszták összeestek a zona pellucidán belül: a blasztociszta ürege eltûnt, a blasztomerek mérete lecsökkent, de struktúrájuk nem mutatott változást. 4¹5 órán át tartó in vitro tenyésztést követõen ezen blasztociszták visszanyerték alakjukat, és 24 óra múlva kikeltek a zona pelucidából (a). A kisebb behatást elszenvedõ embriók nem mutattak morfológiai változásokat, és in vitro tenyésztés során 24 órán belül kikeltek (b), míg a nagyobb behatást elszenvedõ embriók nem nyerték vissza alakjukat az összeesett állapotból, és 2 órán belül vagy dekompressziót követõen szétestek (c) (1. ábra). Az in vivo felmérés során a dekompressziót követõ 2 órás in vitro tenyésztés után az embriókat „túlélõnek” (a & b) vagy „elhaltnak” (c) nyilvánítottuk, majd egyenként a recipiensekbe helyeztük õket. Az áthelyezett 170 „a” vagy „b” embrióból 145 egészséges utód született (85%), de egy sem az áthelyezett 49 „c” embrióból (0%). Nem volt szignifikáns különbség a kikelési arány (in vitro) és a születési arány (in vivo) tekintetében a nem nyomáskezelt kontroll, az összeesett és a nem összeesett, nyomáskezelt „a” és „b” embriók között (p<0,05). Ezen eredmények alátámasztják, hogy az embriók jelentõs nyomást is ki túlélhetnek anélkül, hogy a túl-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
élési arányban jelentõs változás állna be, bár minél nagyobb mértékû a nyomás, annál kevesebb ideig éhek túl az embriók (1. ábra). A 2 órás in vitro tenyésztés alatt szét nem esett embriók azonos in vitro és in vivo túlélési arányt mutattak, mint a nem kezelt kontrollok. 2. példa. Egérembriók túlélése különbözõ dekompressziós profil használatát követõen Ebben a kísérletben azt vizsgáltuk, hogy javítható¹e a nyomás alatt álló embriók túlélési aránya fokozatos dekompresszióval. A kiterjedt balsztocisztákat 90 MPa nyomás alatt tartottuk 30, 60 és 120 percen keresztül (amely során a szobahõmérsékleten mért, gyors dekompressziót követõ túlélési arány sorrendben 50%, 0% és 0% volt), majd a nyomást fokozatosan, 9 lépésben csökkentettük 30, 60, 90, 120 és 150 perc alatt. Az eredmények alapján a fokozatos dekompresszió szignifikáns mértékben javíthatja a túlélést, amely egy, az embriók nyomás alatt töltött idejétõl függõ optimális tartománnyal rendelkezik. Minél több idõt töltöttek az embriók nyomás alatt, annál inkább megnyúlt az optimális felengedési idõ. A dekompresszió által elérhetõ maximális túlélési arány csökkent a nyomás alatt eltöltött idõ növekedésével (2. ábra). In vitro értékelés során 54 „túlélõ” és 35 „elhalt” embriót vittünk át 9 recipiensbe. A 18. napi számolásnál az 54 „túlélt” embrió közül 47 (87%) tapadt meg, míg a 35 „elhalt” embrió közül 0. Az implantációs arány a „túlélt” csoportnál nem különbözött a kontrolltól (p<0,05). 3. példa. Az egérembriók túlélése különbözõ nyomásértékek mellett, alacsony hõmérsékleten Ebben a kísérletben a hõmérséklet nyomás alatt álló embriók túlélésére gyakorolt hatását vizsgáltuk. Az embriók 30, 60 és 90 MPa nyomásnak voltak kitéve 1 mp, 5, 10, 15, 30 és 60 percen keresztül alacsony hõmérséklet (0 °C) mellett. Míg a nyomás alatt nem álló embriók 0 °C¹on jelentõs ideig, a túlélési idõ szignifikáns változása nélkül túlélhetnek, az egyidejû, 30, 60 vagy 90 MPa értékû, 45, 10 és 5 perces nyomáskezelés az embriók 100%-ára letális volt. Az alacsony hõmérséklet mellett nyomáskezelt embriók túlélési aránya szignifikáns mértékben csökkent a szobahõmérsékleten kezelt csoporthoz viszonyítva (p<0,01) (3a. és 3b. ábra). Az in vitro értékelés során a 40 „túlélt” és a 28 „elhalt” embriót 7 recipiensbe vittük át. A 18. napi értékelésnél a 40 „túlélt” embrió közül 34 (85%) megtapadt, míg a 28 „elhalt” embrió közül egy sem. Az implantációs arány a „túlélt” csoportnál nem különbözött a kontrolltól (p<0,05). A 0 °C¹on, 90 MPa nyomáson 30 percig kezelt embrióknál ugyancsak fokozatos dekompressziót alkalmaztunk. Egy embrió sem élt túl az általunk alkalmazott visszanyerési idõk (30, 60, 90, 120, 150, 180 perc) mellett. Minden csoportban 8–12 embriót alkalmaztunk, a kísérleteket háromszor ismételtük meg.
1
HU 008 599 T2
2
arányát a fagyasztási eljárás elõtt alkalmazott nyomáskezelés javítja¹e. Az eredményeket az 1. táblázat mutatja be.
4. példa. Az egérembriók túlélése nyomáskezelést, fagyasztást és felengedést követõen Ebben a kísérletben azt vizsgáltuk, hogy a kiterjedt egérblasztociszták krioprezervációt követõ túlélési
1. táblázat A fagyasztott-felengedett krioprezervált embriók túlélése elõzetes nyomáskezelés mellett és anélkül n
I. csoport II. csoport (nyomáskezelt) Nem kezelt kontroll
A túlélés jelei 6 óra után
A túlélés jelei 20 óra után
1/2 kiterjedt
teljesen kiterjedt
1/2 kiterjedt
2/3 kiterjedt
teljesen kiterjedt
kikelt
115
9%
0%b
17%
10%
19%
0%b
95
–
98%a
–
–
3%
95%a
107
–
99%a
–
–
5%
94%a
A különféle felsõ indexekkel jelölt értékek szignifikánsan különböznek egymástól (p<0,01)
A nyomáskezelt és a nyomással nem kezelt cso- 20 portok túlélési arányai között szignifikáns különbségeket észleltünk (p<0,01). Az alakok visszanyerése gyorsabb (4–6 óra kontra 20 óra) és a túlélési arány magasabb (98% kontra 46%) volt azoknál az embrióknál, akik a krioprezervációt megelõzõen nyomáskezelés- 25 ben részesültek (1. táblázat). Nem volt szignifikáns különbség a kontroll és a nyomáskezelt csoportok között a túlélési és a kikelési arány tekintetében. 5. példa. A marhaembriók túlélése nyomáskezelést, fagyasztást és felengedést követõen Anyagok és módszerek Petesejtek gyûjtése és in vitro érés (IVM) A külön fel nem tüntetett vegyszereket az EMBRAPA (Brazíliaváros, Brazília) cégtõl vásároltuk. A petefészkeket vágóhídról szereztük be, és fiziológiás vízben tartottuk 35–37 °C¹on. A kumulusz-oocita komplexeket (COC) a 2–10 mm¹es tüszõk 20 ml¹es fecskendõvel és 18 G tûvel történõ aspirációjával szívtuk ki, majd 50 ml¹es centrifugacsövekbe gyûjtöttük. 10 perces ülepedést követõen a COC-kat TCM-199 Hank tápközeghez (Gibco) adott magzati borjúszérumot (FCS), penicillint, sztreptomicint és heparint (Sigma H3149) tartalmazó Petri-csészékbe aspiráltuk. A gyûjtést követõen a COC-kat érési tápoldatban [TCM199 Earl tápközeghez adott FCS, LH (Sigma), FSH (Sigma), L¹glutamin, penicillin és sztreptomicin] háromszor megmostuk, majd 2 ml érési tápoldatba helyeztük (körülbelül 100 COC Petri-csészénként), amit ásványolajjal fedtünk le. A petesejteket 38 °C¹on, 5%¹os CO2 tartalom és maximális páratartalom mellett érleltük 22 órán keresztül.
30
35
oldatot (TALP BSA-val, penicilaminnal – Sigma P4875, hipotaurinnal – Sigma H1384, epinefrinnel – Sigma E4250 és heparinnal – Sigma H3149 kiegészítve) tartalmazó Petri-csészékbe helyeztük. A motilis spermiumokat a fagyasztott-felengedett spermiumok (Gentec, Cuiaba, Brazília) Percoll nem folyamatos denzitásgrádiensen (2 ml 45%¹os Percoll 2 ml 90%¹os Percollon) történõ, 20 perces, 700 g centrifugálásával nyertük ki szobahõmérsékleten. A 90%¹os frakció aljáról összegyûjtött spermiumcsapadékot HEPES pufferelt Tyrodeban mostuk, majd 700 g mellett 5 percig centrifugáltuk. A spermiumokat ezután hemocitométerrel megszámoltuk, és TALP alkalmazásával a megfelelõ térfogatra hígítottuk ahhoz, hogy 2×106 spermium/ml koncentrációt kapjunk; minden fertilizációs csepphez e szuszpenzió 200 ml¹es cseppjeit adtuk. A tálcákat 19 órán át 5%¹os CO2-tartalmú, párásított, 39 °C¹os levegõn inkubáltuk. A feltételezett zigótákat ezután ásványolaj alatt lévõ SOF cseppekben in vitro tenyésztettük párásított levegõn, 5%¹os CO2 tartalom mellett, 39 °C¹on.
40
45
50
55 A spermiumok preparálása, in vitro megtermékenyítés (IVF) és in vitro tenyésztés (IVC) Az IVF során a COC-kat fertilizációs oldatban háromszor megmostuk, mielõtt a 20–25 komplexbõl álló csoportokat ásványolajjal lefedett, 200 ml-nyi fertilizációs 60 10
Nyomáskezelés A kiterjed blasztocisztákat embriótároló folyadékot (Emcare Holding, Emcare, Új¹Zéland) tartalmazó, 0,25 ml¹es mûanyag szalmákba szívtuk levegõbuborékok nélkül (7–9 embrió/szalma), majd a szalmákat PVC-vel lezártuk. A szalmákat nyomásközegként vizet tartalmazó nyomáskamrába helyeztük. Az embriókat a fent ismertetett módon, különbözõ erõsségû hidrosztatikus nyomással kezeltük 60 és 90 MPa között (10 MPa¹os emelkedõ léptékkel) különbözõ ideig (15, 30, 45, 50, 60, 90, 100 perc), szobahõmérsékleten. Krioprezerváció megelõzõ nyomáskezeléssel Az embriókat random módon három csoportba osztottuk. Az I. csoport blasztocisztái az alább ismertetett módon krioprezerváltak voltak, 1,5 M etilénglikol fagyasztófolyadékban, A II. csoport embrióit 80 MPa nyomással kezeltük 50 percig, majd azonos módon fagyasztottuk le õket. A fagyasztás kezdete és a nyomáskezelés között eltelt idõ 4¹5 perc volt. A III. csoport
1
HU 008 599 T2
kezeletlen kontroll volt. Felengedés után az embriókat 24 órán át tenyésztettük in vitro. Krioprezerváció A blasztocisztákat 8 perces kiegyensúlyozásra 1,5 M etilénglikolt (Emcare, Új¹Zéland) tartalmazó, 0,25 ml¹es mûanyag szalmába (7–9 embrió/szalma) szívtuk. A szalmákat PVC-vel lezártuk. A szalmákat –5,2 °C¹ra elõhûtött programozott hûtõbe helyeztük (Bio-cool, FTS¹Systems, NY, USA). 3 perc elteltével beindítottuk a jégkristály képzõdést (seeding). További 10 perc után a szalmák –0,5 °C/perc sebességgel –32 °C¹ra hûltek, majd folyékony nitrogénbe merítettük õket. A szalmák felengedését 10 másodpercig tartó enyhe levegõvel kezdtük meg, majd 35 °C¹os vízbe helyeztük õket addig, amíg a szalmákban meg nem indult a jég felolvadása. A balsztocisztákat visszanyertük a szalmákból, SOF-fal háromszor megmostuk õket, majd ásványolaj alatt lévõ SOF¹ba helyeztük õket, és 24 órára visszahelyeztük az inkubátorba.
5
10
15
20
2
Kiértékelés és statisztikai elemzés Az embriók minõségét a nyomáskiengedés, illetve a felengedés után azonnal, valamint 2, 3, 4, 6, 12 és 24 óra elteltével mértük fel. Az embriók túlélését morfológiai megjelenés és folyamatos in vitro fejlõdés alapján mértük fel: a blasztociszták intakt állapotát, a blasztociszta üregének visszaállását és a zona pellucidából való kikelést tekintettük a túlélés jelének. A nem kezelt blasztocisztákat kontrollként használtuk. A túlélési arányokat a kontrollnál tapasztalt értékkel khi-négyzet próbával hasonlítottuk össze. Statisztikailag szignifikáns értéknek a p<0,05¹ös valószínûséget tekintettünk. Eredmények Az embriók túlélése és folytatódó fejlõdése a nyomáskezelés után Az elsõ kísérletsorozat során az embriók különbözõ erõsségû nyomásnak voltak kitéve különbözõ ideig. Az eredményeket a 2. táblázat mutatja:
2. táblázat A fagyasztott-felengedett krioprezervált marhaembriók túlélése elõzetes nyomáskezelés mellett és anélkül Nyomás
Idõ
n (dekompresszió után összeesett/nem esett össze)
Folytatódó fejlõdés 6 óra után
I–II.
Folytatódó fejlõdés 24 óra után (kikelt)
III–IV.
I–II.
III–IV.
80 MPa
45 perc
8 (5/3)
8
8 (4)
60 MPa
60 perc
8 (3/5)
8
8 (5)
90 MPa
45 perc
7 (7/0)
4
3
4 (1)
3
90 MPa
30 perc
7 (3/4)
6
1
6 (6)
1
8
7
1
6 (2)
2
Kontroll
I–II. teljesen vagy 2/3 részt kiterjedt elsõ vagy másodosztályú embriók III–IV. harmadosztályú vagy elhalt embriók
A vitrifikált blasztociszták folytatódó fejlõdése 40 nyomás elõkezeléssel vagy anélkül A második vizsgálatban azt mértük fel, hogy az in vitro ért/megtermékenyített/tenyésztett, krioprezervált, kiterjedt marhablasztociszták folytatódó in vitro fejlõdése javítható¹e a fagyasztási eljárás elõtt alkalmazott nyomáskezeléssel. Minden csoportban 8–12 embriót 45 alkalmaztunk; minden kísérletet 6¹szor ismételtünk meg. Az eredményeket a 3. táblázat mutatja be.
A nyomáskezelt és a nyomással nem kezelt in vitro csoportok túlélési arányai között szignifikáns különbségeket észleltünk (p<0,01). Az alakok visszanyerése gyorsabb (1–2 óra kontra 4–6 óra) és a túlélési arány magasabb (81% kontra 41%) volt azoknál az embrióknál, akik a krioprezervációt megelõzõen nyomáskezelésben részesültek (3. táblázat). Nem volt szignifikáns különbség a kontroll és a nyomáskezelt csoportok között a túlélési és a kikelési arány tekintetében.
3. táblázat Az IVMFV marhablasztociszták folytatódó fejlõdése nyomásos elõkezeléssel vagy anélküli fagyasztás utáni felengedést követõen n
1 óra I+II.
4 óra IV.
I+II.
12 óra
24 óra
IV.
kikelt
I+II.
IV.
kikelt
I+II.
IV.
Elõkezeléssel fagyasztva
59
88%
12%
81%
19%
12%
81%
19%
17%
81%
19%
Nem kezelt
61
46%
54%
41%
59%
0%
41%
59%
0%
41%
59%
I–II. teljesen vagy 2/3 részt kiterjedt elsõ vagy másodosztályú embriók IV. elhalt embriók
11
1
HU 008 599 T2
Következtetések Eredményeink alátámasztották, hogy a fagyasztás elõtt alkalmazott nyomáskezelés javíthatja az IVMFC (petesejtek in vitro érése, in vitro fertilizáció, embriók in vitro tenyésztése) marhaembriók in vitro fejlõdési sebességét, túlélését és kikelési arányát. A vizsgálat további bizonyítékokkal szolgál arra vonatkozóan, hogy a nyomáshatás jelentõsen elõsegítheti a krioprezerváció sikerességét. Nyilvánvaló, hogy a fenti kísérletekben ismertetett eljárások könnyen alkalmazhatóak számos biológiai anyag esetében, fõként eltérõ eredetû, például ló, kecske, sertés vagy fõemlõs, beleértve az emberi embriók esetében is. 6. példa. A spermiumok túlélése nyomáskezelést, fagyasztást és felengedést követõen Jelen vizsgálat elsõ részében azt próbáltuk vizsgálni, hogy a HHP miként befolyásolja a friss bikaondó mozgékony sejtjeinek arányát. Jelen vizsgálat második részében a felrajzolt nyomás-idõ-spermium motilitás görbébõl kiválasztottunk négy paraméterpárt, és összehasonlítottuk a kiválasztott paraméterek szerint elõkezelt fagyasztott bikaondó felengedés utáni motilitását azokéval, amelyek nem részesültek elõkezelésben. Az ondómintákat az ausztriai Klessheimben található mesterséges megtermékenyítési központból kaptuk. A mintákat 8×107spermium/ml koncentrációjúra hígítottuk AndroMed (MiniTub, Németország) segítségével az elõírások szerint. A hígított spermiumokat 0,25 ml¹es szalmákba szívtuk, majd szobahõmérsékleten tároltuk. A nyomáskezelés elõtt az ondómintát tartalmazó szalmát két részre vágtuk: Az egyik felét hõvel lezártuk, majd speciális nyomás/idõ paraméterekkel nyomáskezeltük, míg a másik felét a felengedés utáni motilitás összehasonlítása céljából használtuk. Minden nyomás/idõ paraméterrel kivitelezett kísérletet hét alkalommal ismételtünk meg, a progresszív motilitás felmérését egyenként, két asszisztens által végzett fénymikroszkópos elemzéssel végeztük. A kezelési csoportoknál az alábbi paramétereket alkalmaztuk: 10 MPa 30, 60, 90 és 120 percen át; 30 MPa 30, 60, 90, 120 és 510 percen át; 50 MPa 30, 60 és 90 percen át; 70 MPa 30,60 és 90 percen át; 90 MPa 30, 60, 90, 120 és 510 percen át. A nyomást kialakító készüléket e célra készítettük rozsdamentes acélból, és nyomásközegként vizet tartalmazó nyomáskamrából és hatóságok által jóváhagyott nyomásmérõbõl állt. Az elérni kívánt nyomás kialakulásához szükséges idõ 1 és 5 perc között volt, a nyomástalanítás 2¹3 másodpercet vett igénybe. A kontrollminta átlagos motilitása 75–90% között volt, míg a nyomáskezelt minta átlagos motilitása 55% (90 MPa/120 perc) és 84% (10 MPa/30 perc) közötti volt. A 30 MPa/510 perc és a 90 MPa/510 perc csoportokban szignifikáns mértékben lecsökkent a motilitás a többi nyomáskezelt csoporthoz képest (27% és 33% csökkenés; p<0,05). Lásd a 4. ábrát. A vizsgálati minták másik felénél az ondót két bikától nyertük (amelyek közül az egyik anamnézisében na-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2
gyon gyenge fagyaszthatóság szerepelt). A mintákat a fentiek szerint hígítottuk, majd négy kezelési csoportra osztottuk. A kezelési csoportokat szétbontottuk: az egyik felet hõvel lezártuk, majd nyomáskezeltük I: 90 MPa/30 perc; II: 90 MPa/90 perc; III: 30 MPa/30 perc; IV: 30 MPa/90 perc protokollal a fagyasztás elõtt, míg a másik felet elõkezelés nélkül, az azonos fagyasztási protokoll szerint fagyasztottuk le (60 perc kiegyensúlyozás 5 °C¹on, majd 10 percig 110 °C¹on, majd folyékony nitrogénbe merítés). A felengedést 30 másodperces, 35 °C¹os vízfürdõvel végeztük. Minden csoportban a nyomáskezeléses és nyomáskezelés nélküli kezdeti motilitást is felmértük. Minden vizsgálatot nyolc alkalommal megismételtünk. Mindkét bika átlagos kiindulási motilitása 65–80% között volt, míg nyomáskezelés után ez 45–75%¹ra csökkent. Mindkét bika felengedés utáni átlagos motilitása szignifikáns mértékben jobb volt nyomásos elõkezeléssel, mint ugyanazon, nyomással nem kezelt mintát értékei (p<0,001) (I. bika: 2–3% nyomáskezelés nélkül kontra 17–33% nyomáskezeléssel; II. bika: 0% nyomáskezelés nélkül kontra 21–35% nyomáskezeléssel). Az alkalmazott paraméterek közül a 30 MPa/90 perc szignifikáns mértékben jobb volt (33 és 35%; p<0,05). Jelen vizsgálat egyértelmûen bemutatja a korábbi nyomáskezelés felengedés utáni motilitásra gyakorolt jótékony hatását krioprezervált bikaondó esetében. A vizsgálat további bizonyítékokkal szolgál arra vonatkozóan, hogy a nyomáshatás jelentõsen elõsegítheti a krioprezerváció sikerességét. Nyilvánvaló, hogy a fenti kísérletekben ismertetett eljárások könnyen alkalmazhatóak számos biológiai anyag esetében, fõként eltérõ eredetû, például ló, kecske, sertés vagy fõemlõs, beleértve az emberi spermiumok esetében is. A fenti példákban ismertetett eredmények alátámasztják, hogy a krioprezerváció elõtt alkalmazott nyomáskezelés egyértelmûen javítja az embriók fejlõdési sebességét, valamint túlélési és kikelési arányát in vitro. Ebbõl kifolyólag minden ilyen jellegû törekvés célja elérhetõ: több utód létrehozása. Ezenfelül, a bemutatott, marhaembriókkal és bikaondóval nyert adatok arra utalnak, hogy a biológiai anyagok krioprezervációja során a találmányi gondolat széleskörûen alkalmazható. A jelen találmány szerinti eljárás alkalmazása hasznos lehet minden típusú embrió-krioprezerváció és embriómanipuláció – beleértve egyéb emlõsfajokat az ember sem kizárva – sikerességének javításához, valamint petesejteken, embrionális õssejteken, szöveteken és hasonló anyagokon való alkalmazáshoz. A jelen módszer egyéb olyan területek számos új lehetõségét tárja fel, ahol a biológiai anyagok krioprezervációja alkalmazható.
55 Hivatkozások Abe, F., and Horikoshi, K. (1995). Hydrostatic pressure promotes the acidification of vacuoles in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Lett 130, 60 307–312. 12
1
HU 008 599 T2
Abe, F., and Horikoshi, K. (1997). Vacuolar acidification in Saccharomyces cerevisiae induced by elevated hydrostatic pressure is transient and is mediated by vacuolar H+¹ATPase. Extremophiles 1, 89–93. Abe, F., and Horikoshi, K. (1998). Analysis of intracellular pH in the yeast Saccharomyces cerevisiae under elevated hydrostatic pressure: a study in baro- (piezo¹) physiology. Extremophiles 2, 223–228. Abe, F., Kato, C., and Horikoshi, K. (1999). Pressure-regulated metabolism in microorganisms. Trends Microbiol 7, 447–453. Aldridge, B. E., Bruner, L. J. (1985). Pressure effects on mechanisms of charge transport across bilayer membranes. Biochim Biophys Acta 817, 343–354. Archer, J., Gook, D. A., Edgar, D. H. (2003). Blastocyst formation and cell numbers in human frozen-thawed embryos following extended culture. Human Reproduction (Oxford, England) 18, 1669–1673. Baguisi, A., Arav, A., Crosby, T. F., Roche, J. F., and Boland, M. P. (1987). Hypothermic storage of sheep embryos with antifreeze proteins: development in vitro and in vivo. Theriogenology 48, 1017–1024. Bridgman, P. W. (1911). Water in the liquid and five solid forms under pressure. Proceedings of the American Academy of Arts and Science 47, 441–558. Bridgeman, P. E. (1970). The physics of high pressure. New York: Dover Butz P, Ludwig H. (1986). Pressure inactivation of microorganisms at moderate temperatures. Physica B+C 139–140, 875–877. Fahy, G. M., MacFarane, D. R., Angell, C. A. and Meryman, H. T. (1984). Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology 21. 407–426. Fukuda, A., Osawa, T., Oda, H., Tanaka, T., Toyokuni, S. and Uchida, K. Oxidative stress response in iron induced acute nephrotoxicity: enhanced expression of heat shock protein 90. Biochem Biophys Res Commun 1996; 219:76–81. Garcia-Gardena, G., Fan, R., Shah, V., Sorrentino, R., Cirino, G., Papapetropoulos. Dynamic activation of endothelialnitric oxide synthase by HSP90. Nature 1998; 392: 821–4. Graumann, P. L., Marahiel M. A. (1999). Cold shock proteins CspB and CspC are major stationaryphase-induced proteins in Bacillus subtilis. Arch Microbiol 171, 135–138. Gross, M., Jaenicke, R. (1994). Proteins under pressure. The influence of high hydrostatic pressure on structure, function and assembly of proteins and protein complexes. Eur J Biochem 221, 617–630. Huang, S. Y., Kuo, Y. H., Lee, W. C., Tsou, H. L., Lee, Y. P., Chang, H. L. et al. Substantial decrease of heatshock protein 90 precedes the decline of sperm motility during cooling of boar spermatozoa. Theriogenology 1999; 51:1007–16. Huang, S. Y., Kuo, Y. H., Tsou, H. L., Lee, W. C., King, Y. T., Huang, H. C. et al. The decline of porcine sperm motility by geldanamycin, a specific inhibitor of heat shock protein 90 (HSP90). Theriogenology 2000; 53:1117–84.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 13
2
Ishwar, A. K., Memon, M. A. (1996). Embryo transfer in sheep and goats: a review. Small Ruminant Research 19, 35–43. Jaenicke, R. (1991). Protein stability and molecular adaptation to extreme conditions. Eur J Biochem 202, 715–728. LaTena, A., Brandi, A., Falconi, M., Spurio, R., Pon, C. L., Gualerzi, C. O. (1991). Identification of a coldshock transcriptional enhancer of the Escherichia coli major cold shock gene encoding nucleotide protein H¹NS. Proc Natl Acad Sci USA 88, 10907–10911. Leibo, S. P. and Songsasen, N. (2002). Cryopreservation of gamets and embryos of non-domestic species. Theriogenology 57. 303–326. Macdonald, A. G. (1987). The role of membrane fluidity in complex processes under high pressure. In: Jonnasch, H. W., Marquis, R. E., Zimmerman, A. M., editors. Current Perspectives in High Pressure Biology. London: Academic Press pp. 207–223. Medeiro, C. M. O., Forell, F., Oliveira, A. T. D., and Rodrigues, 2002. J. L. Current Status Of Sperm Cryopreservation: Why Isn’t It Better? Theriogenology 57:327–344. Murakami, T. H., Zimmerman, A. M. (1973). DNA syntheseis in Tetrahymena: a pressure study. Cytobios l, 171–181. Nowshari, M. A., Brem, G. (1998). Effect of cryoprotectants and their concentration on post-thaw survival and development of expanded mouse blastocysts frozen by a simple rapid-freezing procedure. Theriogenology 50, 1001–1013. Palou, E., Lopez–Malo, A., Barbosa–Canovas, G. V., Welti–Chanes, J., and Swanson, B.G. (1997). Kinetic analysis of Zygosaccharomyces bailii inactivation by high hydrostatic pressure. Lebensm.¹Wiss. U. Technol. 30, 703–708. Pearl, L. H. and Prodromou, C. Structure and in vivo function of Hsp 90. Curr. Opin Struct Biol 2000; 10:46–51. Péqueux, A., and Gilles, R. (1978). Effects of high hydrostatic pressures on the activity of the membrane ATPases of some organs implicated in hydromineral regulation. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 59, 207–212. Phadtare, S¹, Alasina, J., Inouye, M. (1999). Coldshock response and cold-shock proteins. Curr Opin Microbiol 2, 175–180. Phadtare S., Alasina J. and Inouye M. (1999). Coldshock response and cold-shock proteins. Curr Opin Microbiol 2, 175–180 Graumann, P. L. and Marahiel, M. A. (1999). Cold shock proteins CspB and CspC are major stationary-phase-induced proteins in Bacillus subtilis. Arch Microbiol 171. 135–138. Prodromou, C., Roe, S. M., O’Brian, R., Ladbury, J. E., Piper, P. W. and Pearl, L. H. Identification and structural characterization of the ATP/ADP-binding site in the HSP90 molecular chaperone. Cell 1997; 90:65–75. Rali, W. F., and Fahy, G. M. (1985). Ice-free cryopreservation of mouse embryos at –196 °C by vitrification. Nature 313, 573–575.
1
HU 008 599 T2
Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Vajta, G., and Trounson, A. O. (2001). Effective cryopreservation of human embryonic stem cells by the open pulled straw vitrification method. Human Reproduction 16, 2187–2194. Routray, P., Suzuki, T., Strüssmann, C. A. and Takai, R. (2002). Factors affecting the uptake of DMSO by the eggs and embryos of medaka, Oryzias latipes. Theriogenology 58. 1483–1496. Schmid, G., Lüdemann, H. D., and Jaenicke, R. (1975) High pressure effects on the activity of glycolytic enzymes. Biophys Chem 3, 90–98. Schuster, B., Sleytr, U. B. (2002). The effect of hydrostatic pressure on S¹layer-supported lipíd membranes. Biochim Biophys Acta 1563, 29–34. Seki, K., Toyoshíma, M. (1998). Preserving tardigrades under pressure. Nature 395, 853–854. Silva, J. L., Foguel, D., Royer, C. A. (2001). Pressure provides new insights into protein folding, dynamics and structure. Trends Biochem Sci 26, 612–618. Spilimbergo, S., Elvassore, N., Bertucco, A. (2002). Microbial inactivation by high-pressure. The Journal of Supercritical Fluids 22, 55–63. Stachecki, J. J., Cohen, J., Schimmel, T., Willadsen, S. M. (2002). Fetal development of mouse oocytes and zygotes cryopreserved in a nonconventional freezing medium. Cryobiology 44, 5–13. Takahashi, T., Kakita, A., Takahashi, Y., Sakamoto, I., Yokoyama, K., Fujiu, T., Yamashina, S., Tamaki, T., Takazawa, Y., Muratsubaki, R. (2000). Functional integrity of the rat liver after subzero preservation under high pressure. Transplantation Proceedings 32, 1634–1636. Takahashi, T., Kakita, A., Takahashi, Y., Yokoyama, K., Sakanioto, L, Yamashina, S. (2001). Preservation of rat livers by supercooling under high pressure. Transplatation Proceedings 3, 916–919. Tinneberg, H.¹R., Roberts, T. K., Cheng, C. Y. and Mettler, L. (1980). High hydrostatic pressure as an irnprovement for sperm-cryopreservatíon. Archives of Andrology 5, 42–43. Tuboly, E., Lebovics, V. K., Gaál. Ö., Mészáros, L. and Farkas, J. (2003). Microbiological and lipid oxidation studies on mechanically deboned turkey meat treated by high hydrostatic pressure. Journal of Food Engineering 56, 241–244. Van Wagtendonk¹De Leeuw, A. M., Den Daas, J. H., Kruip, T. A., Rali, W. F. (1995). Comparison of the efficacy of conventional slow freezing and rapid cryopreservation methods for bovine embryos. Cryobiology 32, 157–167. Van Wagtendonk¹De Leeuw, A. M., Den Haas, J. H. G., and Rali, W. F. 1997. Field trials to compare pregnancy rates of bovine embryo cryopreservation methods: vitrification and one-step dilution versus slow freezing and three-step dilution. Theriogenology 48, 1071–1084. Watson, P. F. The effect of cold shock on sperm cell membranes. In: Morris, G. J. and Clarke, A. eds. Effects of low temperature on biological membranes. London: Academic Press; 1981. p.189–218.
5
10
15
20
25
2
Weber, G., Drickamer, H. G. (1983). The effect of high pressure upon proteins and other biomolecules. Q Rev Biophys 16, 89–112. Welch, T. J., Farewell, A., Neidhardt, F. C., Bartlett, D. H. (1993). Stress response of Escherichia coli to elevated hydrostatic pressure. J Bacteriol 175, 7170–7177. Wemekamp-Kamphuis, H. H., Karatzas, A. K., Wouters, J. A., Abee, T. (2002). Enhanced levels of cold shock proteins in Listeria monocytogenes LO28 upon exposure to low temperature and high hydrostatic pressure. Appl Environ Microbiol 68, 456–63. Wen-Lei CAO et al. Cryopreservation-induced decrease in heat-shock protein 90 in human spermatozoa and its mechanism. Asian J Androl 2003; 5:43–46. Wouters, J. A., Jeynov, B., Rombouts, F. M., de Vos, W. M., Kuipers, O. P., Abee, T. (1999). Analysis of the role of 7 kDa cold-shock proteins of Lactobacillus lactis MG1363 in cryoprotection. Microbiology 145, 3185–3194. Yager, P., Chang, E. L. (1983). Destabilization of a lipid non-bilayer phase by high pressure. Biochim BiophysActa 731, 491–494. Yamanaka, K., Fang, L., Inouye, M. (1998). The CspA family in Escherichia coli: multiple gene duplication for stress adaptation. Mol Microbiol 27, 247–255.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 30
35
40
45
50
55
60 14
1. Eljárás krioprezervált életképes biológiai anyag felolvasztás utáni túlélésének javítására, amely eljárás magában foglalja (a) hidrosztatikus nyomás alkalmazását az életképes biológiai anyagra; (b) az életképes biológiai anyag hidrosztatikus nyomáson történõ tartását elõre meghatározott idõtartamig; (c) a hidrosztatikus nyomás felengedését; (d) az életképes biológiai anyag fagyasztását arra alkalmas bármilyen protokoll alkalmazásával. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a hidrosztatikus nyomás az 1–200 MPa tartományba esik. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a hidrosztatikus nyomás az 10–100 MPa tartományba esik. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a hidrosztatikus nyomás 1 másodperc és 300 perc közötti idõtartamig van alkalmazva. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a hidrosztatikus nyomás 1 másodperc és 150 perc közötti idõtartamig van alkalmazva. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a nyomás fokozatosan, legalább 1 másodperc és legfeljebb 4 óra idõtartam alatt vagy pillanatszerûen van felengedve. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az életképes anyag gerinces állat petesejtjei, spermiumai, zigotái, morulái, blasztocisztái, õssejtjei, sejtjei és szövetei által alkotott csoportból van kiválasztva.
1
HU 008 599 T2
8. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a gerinces állat hal, madár vagy emlõs. 9. Az 1–8. igénypontok szerinti eljárás, ahol az emlõs szarvasmarha, ló, kecske, juh, sertés, más háziállat, házikedvenc, fõemlõs, beleértve ember. 10. Nyomást kialakító készülék alkalmazása az 1–9. igénypontok bármelyike szerint történõ krioprezervációra. 11. A 10. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a nyomást kialakító készülék a biológiai anyag befogadására alkalmas nyomáskamrát és 1–200 MPa tartományba esõ szabályozott nyomás biztosítására alkalmas eszközt tartalmaz. 12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a nyomást kialakító készülék a hidrosztatikus nyo-
2
mást 1 másodperc és 300 perc közötti idõtartamig fenntartani képes eszközt tartalmaz. 13. A 10–12. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol szabályozórendszer van biztosítva a nyo5 máskamra legalább 1 másodperc és legfeljebb 4 óra idõtartam alatt vagy pillanatszerûen történõ dekompresszálásának szabályozására. 14. A 10–13. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a nyomást biztosító készülékben hidro10 sztatikus nyomás jön létre. 15. Az 10–14. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az életképes anyag a gerinces állat petesejtjei, spermiumai, zigotái, morulái, blasztocisztái, õssejtjei, sejtjei és szövetei által alkotott csoportból van 15 kiválasztva.
15
HU 008 599 T2 Int. Cl.: A01N 1/02
16
HU 008 599 T2 Int. Cl.: A01N 1/02
17
HU 008 599 T2 Int. Cl.: A01N 1/02
18
HU 008 599 T2 Int. Cl.: A01N 1/02
19
Kiadja a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
