!HU000003012T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 003 012
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 36/25
(21) Magyar ügyszám: E 04 724580 (22) A bejelentés napja: 2004. 03. 31. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040724580 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1608388 A1 2004. 10. 14. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1608388 B1 2007. 10. 10.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 20031015931 2003. 04. 02.
(73) Jogosult: Engelhard Arzneimittel GmbH & Co. KG, Niederdorfelden (DE)
DE
(72) Feltalálók: Runkel, Frank, Buseck (DE); Engelhard, Karl-Michael, Friedrichsdorf (DE); Engelhard, Georg Maximilian, Kronberg (DE) (54)
(2006.01) A61P 11/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04087183 PCT/EP 04/03420
(74) Képviselõ: Schläfer László, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Eljárás extraktum elõállítására borostyánlevelekbõl
(57) Kivonat
HU 003 012 T2
A találmány tárgya eljárás extraktum elõállítására borostyánlevelekbõl egy extrahálószer alkalmazásával, ahol az extraktum a¹hederint tartalmaz, mely eljárás a következõ lépéseket tartalmazza: a) szárított borostyánlevelek egy mennyiségét aprítják, b) víz hozzáadásával fermentálják, melynek során a hederakozid C komponenst a¹hederinné alakítják,
c) az extrahálószer hozzáadásával extrahálják, és d) az extraktumot adott esetben szárítják. A találmány kiterjed az így elõállított extraktumra, annak alkalmazására és azt tartalmazó gyógyszerkészítményre.
A leírás terjedelme 8 oldal (ezen belül 1 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 003 012 T2
A jelen találmány tárgya eljárás extraktum elõállítására borostyánlevelekbõl egy extrahálószer alkalmazásával, ahol a száraz extraktum a¹hederint tartalmaz. A borostyánlevelekbõl elõállított extraktumot manapság sikeresen alkalmazzák elsõsorban légúti betegségek terápiájában, mivel az extraktum spazmolitikus, expektoráló és antiobstruktív hatást mutat. Ezek a hatások elsõsorban a borostyánlevél-extraktum terápiásan fontos hatóanyagaira vezethetõk vissza, amelyek a triterpén-szaponinok osztályába tartoznak. Itt a fõ szaponin a biszdezmozidos hederakozid C és az abból észterhidrolízissel keletkezõ a¹hederin. További szaponinként a hederagenin mutatható ki. Mivel extraktumok a borostyánlevelekbõl különbözõ eljárásokkal elõállíthatók, ezek az extraktumok gyakran eltérõ hatásfokkal rendelkeznek. Ez abból ered, hogy a hatóanyagok mennyisége az extraktum elõállításához alkalmazott mindenkori módszertõl függ. A bejelentõ vizsgálatok alapján megállapította, hogy az a¹hederin jelentõs mértékben hozzájárul a bronchospazmolízishez. Megállapítottuk, hogy az a¹hederin a b¹adrenerg receptorok internalizálási folyamatait specifikus módon gátolja. Egy ligandumnak a b¹adrenerg receptorokhoz történõ kötõdésével elõször az adenilátcikláz-rendszer aktiválódik, melynek egyik következménye például, hogy elernyed a bronchiális rendszer simaizomzata. A hatás túlzott mértékû kialakulása ellen hat többek között a membránon található receptorok alulszabályozása a sejtekben bekövetkezõ internalizálás hatására. Ebben az összefüggésben kimutatható, hogy az a¹hederin nem közvetlenül támadja a b¹adrenerg receptort, hanem sokkal inkább a sejtben lejátszódó receptor-ligandum internalizálást gátolja. A receptor-ligandum komplex internalizálásának gátlásával folytatódik az adenilátcikláz-rendszer aktiválása, ami a hörgõkben kiváltja a simaizmok elernyedését (spazmolízis). A hederakozid C vagy hederageninanyagok azonban az internalizálás folyamatát nem gátolják. Ezért gyógyszerként elsõsorban a nagy mennyiségû a¹hederint tartalmazó extraktumok alkalmazhatók. Száraz extraktumoknak növényi anyagokból történõ elõállítására alkalmas eljárásokat a gyógyszerészet, és elsõsorban a gyógyszer-elõállítás területén sokoldalúan leírtak. Száraz extraktumoknak növényi anyagokból történõ elõállítására alkalmas eljárást ismertet például a DE 101 12 168 A1. Az ott ismertetett eljárással beállítható a lipofil és hidrofil anyagok mennyisége. Itt a növényi anyagot legalább kétszer extrahálják eltérõ lipofilitással rendelkezõ oldószerekkel, és így az extraktumokat elkülönítve nyerik ki. Az extraktumokat egymástól külön megszárítják, és a kívánt arányban keverik. Így a lipofil és hidrofil anyagok mennyisége beállítható. Az eljárás alkalmas lehet száraz extraktumnak borostyánból (Hedera helix) történõ elõállítására is. Az ilyen eljárás hátránya azonban az a körülmény, hogy két külön extrahálást kell megvalósítani, és ezért az eljárás összességében nagyon körülményes.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
Emellett a DE 30 25 223 A1 ismertet egy gyógyszerkészítményt borostyánextraktum alapján, és egy eljárást ennek elõállítására, melynek során aceton és metanol alkalmazásával 60, illetve 90% hederaszaponin C¹tartalmat mutató borostyánextraktum nyerhetõ. A hederaszaponin C, illetve hederakozid C a¹hederinné történõ átalakításához, és ezáltal csupán a¹hederint tartalmazó extraktum elõállításához az említett bejelentésben a 90%¹os extraktumot nátrium-hidroxiddal vagy kálium-hidroxiddal elszappanosítják. Az ilyen eljárás hátránya azonban a nagy ráfordítás, amit az olyan további lépések váltanak ki, amelyek a Hederarosid C kinyerése után a hederakozid, illetve a hederaszaponin a¹hederinné történõ átalakításához szükséges. G. Wulff: „Neuere Entwicklungen auf dem Saponingebiet”, Deutsche Apotheker Zeitung, 108 (23), 797–808 (1968) azt ismerteti, hogy friss borostyánleveleket aprítva és egy éjszakán keresztül vízben áztatva végül csak a¹hederin található. Ezért azokat az enzimeket teszik felelõssé, amelyek megtalálhatók a friss levelekben. A gyógyszeriparban azonban szárított drogokat alkalmaznak, mivel ezek eltarthatók és jobban kezelhetõk. Enzimatikus aktivitás az ilyen szárított drogokban nem várható. A jelen találmány feladata ezért olyan eljárás kidolgozása, amellyel kevés lépésben és nagy idõráfordítás nélkül extraktum, elsõsorban száraz extraktum nyerhetõ, amelyben az a¹hederin legalábbis erõsen feldúsított mennyiségben fordul elõ. A korábban említett eljárással a találmány alapját képezõ feladat úgy oldható meg, hogy az eljárás a következõ lépéseket tartalmazza: a) szárított borostyánlevelek egy mennyiségét aprítjuk, b) víz hozzáadásával fermentáljuk, melynek során a hederakozid C komponenst a¹hederinné alakítjuk, c) az extrahálószer hozzáadásával extraháljuk, és d) az extraktumot adott esetben szárítjuk. A találmány alapját képezõ feladat ily módon teljesen megoldható. A találmány szerinti eljárással ugyanis egy olyan extraktum nyerhetõ, amely hatóanyagként alfa-hederint tartalmaz dúsított formában, illetve melynek elõállítása során a borostyánlevélben eredetileg jelen lévõ hederakozid C nagy része, vagy adott esetben teljesen a¹hederinné lett átalakítva. A feltalálók saját kísérleteikkel kimutatták, hogy a fermentációs lépéssel a szárított borostyánlevélnél a hederakozid C közel teljesen a¹hederinné alakítható. Ezért az extrahálás után nincs szükség további lépésekre a kinyert hatóanyag további átalakításához. Sokkal inkább érvényes, hogy a teljes eljárás pont a köztes fermentációs lépés miatt – mind az idõráfordítás, mind az alkalmazott anyagok vonatkozásában – gazdaságosan megvalósítható, ami egy nagy elõny a technika állása szerint ismert eljárásokhoz képest. A „fermentálás” jelen esetben az eredeti anyagban jelen lévõ hatóanyag lebontását, illetve más anyaggá
1
HU 003 012 T2
történõ átalakítását jelenti egy fermentálóközegnek, például folyadéknak az eredeti anyaghoz történõ hozzáadásával, melynek során adott esetben meghatározott paramétereket, például az idõt és a hõmérsékletet a fermentációs folyamat szempontjából összehangolunk. A feltalálók felismerték, hogy a fermentációs lépéshez különösen elõnyösen alkalmazható a víz. A víz hozzáadásával megindul a hederakozid C a¹hederinné történõ átalakulásának folyamata. A találmány szerinti eljárással ezáltal egy különösen nagy a¹hederintartalommal rendelkezõ extraktum állítható elõ. A nagy a¹hederintartalmat mutató extraktum elsõsorban a légúti betegségek kezelésénél szükséges, mivel a bejelentõ által végzett kísérletek megállapították, hogy ezért az a¹hederin felelõs. Mint említettük, a borostyánban elõforduló szaponinok közül elsõsorban az a¹hederin felelõs a hörgõkben kifejtett spazmolitikus hatásért. Ezért ez az extraktum a nagy a¹hederintartalmával lényegesen javított hatékonyságot mutat az olyan extraktumokkal szemben, amelyekben viszonylag nagy mennyiségû hederakozid C található. A gyógyszerkészítmények elõállítása során a szárított drogok elõnye, hogy jobban eltarthatók és jobban kezelhetõk, mint a friss drogok. A szárított gyógynövényeket és gyógynövényrészeket a gyógyszerészet területén érvényes meghatározás értelmében „drog” néven ismerik. Az ilyen drogként elõforduló gyógynövények felhasználását vagy változatlan formában, vagy aprított formában végzik. Szakember számára meglepõnek minõsül, hogy a szárított borostyánlevélnél, ahogy ezt a gyógyszeriparban alkalmazzák, az a¹hederinné történõ átalakítás csupán víz hozzáadásával elérhetõ. A bevezetõben említett DE 30 25 223 A1 szerint az elszappanosításhoz alkálifém-hidroxidot kell adagolni a kémiai folyamat kiváltásához. Elõnyös továbbá, ha az a) lépésben a borostyánlevelek aprítását £5×5 mm, különösen elõnyösen £2×2 mm méretig végezzük. A borostyánleveleknek a megadott méretre történõ aprítása különösen elõnyös a találmány szerint elõállított extraktum a¹hederintartalmának befolyásolása szempontjából. Megállapítottuk, hogy növekvõ részecskemérettel együttesen a hatóanyagok rosszabb extrahálása és fermentálása következik be. A találmány szerinti eljárásnál elõnyös továbbá, ha az extrahálószer alkohol- és vízrészbõl álló elegy. Különösen elõnyös, ha alkoholként C2–C10 alkoholt, elsõsorban etanolt alkalmazunk. Az etanol egy jól bevált gyógyszerészeti oldószer, és a gyógyszer-technológia területén kiterjedten alkalmazzák extrahálószerként. Természetesen azonban alkalmazhatók más alkoholok is, például propanol, izopropanol és hasonlók, vagyis minden olyan alkohol, amely víz/alkohol elegy formájában gyógyszerkészítmények elõállításánál extraháláshoz felhasználható. Elõnyös továbbá, ha az extrahálószer víz/alkohol részének aránya (t/t) 10/90 és 90/10 tartományba esik, elsõsorban, ha a víz/alkohol arány 70/30.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
A jelen találmány keretei között különbözõ alkohol/víz arányok alkalmasak a találmány szerinti eljárás sikeres megvalósításához. Ennek során különösen elõnyösnek bizonyult az olyan extrahálószer alkalmazása, melynek alkoholrésze 30%. Elõnyös továbbá, ha a borostyánlevelek aránya az extrahálószerhez 1:1–1:50 tartományba esik, elsõsorban 1:12 értékû. A feldolgozandó borostyánlevelek és az extrahálószer meghatározott mennyiségi arányának kiválasztásával a találmány szerinti eljárásban befolyásolható az a¹hederin mennyisége az extraktumban. A mennyiségi arány meghatározásánál figyelembe kell venni, hogy egyrészt a hederakozid C komponenst adott esetben teljesen át kell alakítani. Másrészt az alkalmazott extrahálószer-mennyiséget úgy kell az eljáráshoz igazítani, hogy optimálisan alacsony mennyiségek alkalmazásával sikeres extrahálást érjünk el. Szakember számára nyilvánvaló, hogy ehhez különbözõ mennyiségi arányok alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásban. A találmány szerinti eljárás egyik megvalósítási módjánál elõnyös, ha a b) lépésben az extrahálószer egyik vízrészét adagoljuk, és különösen, ha elõször csupán az extrahálószer fele mennyiségének vízrészét adagoljuk. Ennél a megvalósítási módnál az extrahálószer alkoholrészét, és adott esetben a további extrahálószert csak a fermentálás után adagoljuk. Az a tény, hogy az extrahálószer alkoholrészét a vízrésszel végzett fermentálás után adagoljuk, eljárástechnikailag elõnyös, mivel így az extrahálószer adagolandó mennyisége a különbözõ tételeknél egyenként elõre, pontosan és egyszerûen számolható és beállítható. A víz és az alkohol külön térfogatrészei egymástól elkülönítve, illetve a b) és c) lépésben kiegészítõleg adagolhatók. Ennél különösen elõnyös, ha a fermentáláshoz az extrahálószer fele mennyiségének megfelelõ vízrészt adagoljuk, ami az eljárást még elõnyösebbé teszi. Nem zárható ki azonban az sem, hogy a fermentálás céljára más vízmennyiségeket adagolunk a hederakozid C a¹hederinné történõ átalakítási folyamatának befolyásolásához. Elõnyös továbbá, ha a b) lépést 1 perc és 120 perc tartományba esõ idõtartam alatt, elsõsorban 60 perc idõtartam alatt végezzük. A fermentáció idõtartamának változtatásával az extraktum a¹hederintartalma a találmány szerinti eljárásban tovább szabályozható. Itt különösen elõnyös, ha a fermentálást 10–40 °C, elsõsorban 30 °C hõmérsékleten végezzük. A találmány szerinti eljárás egy további megvalósítási módjánál elõnyös, ha az extrahálást a c) lépésben elõduzzasztással és perkolálással végezzük. Mindkét mûvelet a technika állásához tartozik, és elsõsorban gyógyszerkészítmények növényekbõl történõ elõállításának területén szokásos módszerek. Az elõduzzasztás és perkolálás lépéseivel biztosítható a borostyánlevelek teljes extrahálása. A vízrésszel végzett fermentálás után ennek megfelelõen az elegyhez hozzáadagoljuk a megfelelõ alkoholrészt, majd végre-
1
HU 003 012 T2
hajtjuk az elõduzzasztást. A perkoláláshoz elõnyösen adagoljuk az extrahálószer maradék mennyiségét, amelybõl meghatározott részeket elõzetesen a fermentáláshoz és más extrakciós lépésekhez használtunk. Itt elõnyös, ha az elõduzzasztást 1 óra és 30 óra tartományba esõ idõtartam alatt, elsõsorban 6 óra idõtartam alatt végezzük. A találmány szerinti eljárás továbbvitelében elõnyös, ha a szárítást a d) lépésben vékonyfilmes bepárlással és ezt követõ permetezve szárítással végezzük. Mindkét eljárás szokásos szárítási eljárás, ahol a vékonyfilmes bepárlás gyógyszerkészítmények elõállításánál kíméletes bepárlási eljárásnak bizonyult, ugyanúgy, mint a permetezve szárítás, melyekkel a tapasztalatok szerint folyékony készítmények por alakú végsõ termékekké száríthatók, amelyekre különösen jellemzõ, hogy például vízzel ismét könnyen felhasználható készítményekké keverhetõk el. Elõnyös továbbá, ha a találmány szerinti eljárást az a¹hederin- és hederakozidtartalom szabályozására alkalmazzuk egy borostyánlevelekbõl készített extraktumban. A találmány szerinti eljárással ezenkívül lehetõvé válik az a¹hederintartalom célzott szabályozása az extraktumban. Ennek értelmében a találmány szerinti eljárás felhasználható a hederakozid teljes átalakítására a¹hederinné egy borostyánlevelekbõl készített extraktumban, vagy akár a hederakozid részleges átalakítására a¹hederinné. Ennek megfelelõen lehetséges például, hogy elõször a drognak csak meghatározott részét fermentáljuk vízzel, és a fermentálás lejátszódása után a drog maradék részét extraháljuk. Ily módon célzott száraz extraktum állítható elõ, amelyben nincs a teljes hederakozid C¹tartalom a¹hederinné átalakítva. Emellett ily módon lehetõvé válik az is, hogy az a¹hederintartalmat az extraktumban pontosan szabályozzuk. Ez például akkor szükséges, ha azt akarjuk, hogy az a¹hederintartalom az extraktumban ne legyen túl magas, hanem egy meghatározott mennyiségû hederakozid C még jelen legyen. A találmány tárgya kiterjed a borostyánlevelekbõl találmány szerinti eljárással elõállított extraktumra. A nagy mennyiségû a¹hederint tartalmazó extraktumok elõnyösek például a légúti betegségek kezelésénél, mivel a koncentrált formában jelen lévõ a¹hederinnel a levelek legaktívabb hatóanyaga van koncentrált formában. A találmány tárgya kiterjed továbbá a találmány szerint elõállított extraktum, elsõsorban a száraz extraktum alkalmazására, gyógyszerkészítmények elõállítására és elsõsorban légúti betegségek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények elõállítására. A találmány tárgya kiterjed továbbá az olyan gyógyszerkészítményre, amely találmány szerinti eljárással elõállított extraktumot tartalmaz. Itt a gyógyszerkészítmény lehet kapszula, tabletta, drazsé, kúp, granulátum, por, oldat, krém, emulzió, aeroszol, kenõcs és olaj formájában. Különösen elõnyösek az orálisan adagolható formák. A gyógyszerkészít-
2
mény tartalmazhat gyógyszerek elõállításánál szokásos segédanyagokat. A megfelelõ anyagok felsorolása megtalálható például: A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. kiadás, 2000, American Pharma5 ceutical Association and pharmaceutical Press. A további elõnyök megismerhetõk a leírásból és a csatolt ábrákból. Ezek a következõk: 1a. ábra fermentálás nélküli próba kromatogramja, és 1b. ábra fermentálásnak alávetett próba kromato10 gramja. Megjegyezzük, hogy a fent megadott és a késõbb ismertetett jellemzõk nemcsak a mindenkor megadott kombinációkban, hanem más kombinációkban és ön15 magukban is alkalmazhatók anélkül, hogy eltérnénk a találmány lényegétõl.
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
Példák A technika állása szerint eddig alkalmazott extrakciós eljárások egy többlépéses extrakciós eljárásból állnak, amelyeknél a szárított drogot az aprítás után közvetlenül 30%¹os etanollal (t/t) elegyítik. A száraz extraktumban a hederakozid C/a-hederin arány ezért megfelel a drogban jelen lévõ aránynak. Az utóbbi években elõállított extraktumok analízise szerint a hederakozid C¹tartalom mintegy 5–20% a teljes extraktumra vonatkoztatva, míg az a¹hederin mennyisége mintegy 1–5% a teljes extraktumra vonatkoztatva. A technika állása szerint ismert módszerek alapján ezért olyan eljárást kellett kidolgozni, amellyel a hederakozid C átalakítása a¹hederinné bevonható az extrakciós eljárásba. Ehhez elõször néhány elõkísérletet végeztünk. 1. Friss, még nem szárított levelek erõs és intenzív aprítása a drog ezt követõ szárításával A „post harvesting processing” mûveletnek a drogra és a késõbbi extraktumra gyakorolt hatásának vizsgálatához kézzel frissen és gondosan betakarítjuk a borostyánleveleket. Valamennyi levelet ugyanabban az idõpontban és ugyanazon a helyen gyûjtjük, és betakarítás után különbözõ eljárási folyamatokban vetjük alá. Ezután a próbákat az alábbiak szerint analizáljuk: egy próbamennyiséget, ami mintegy 200 mg szárított drognak felel meg, malomban porítunk és 30 ml 45% etanollal (v/v) 1 órán keresztül rázzuk. Egy kromatografálócsõbe történõ betöltés után friss 45% etanollal (v/v) 100 ml térfogatra perkoláljuk. Különbözõ próbák elõállításához az aprítás és a szárítás idõpontjait változtatjuk: 1. próba: A friss leveleket 3×3 mm nagyságú darabokra vágjuk, és csak 12 órás tárolás után szárítjuk. 2. próba: A friss leveleket 3×3 mm nagyságú darabokra vágjuk, és ezután azonnal szárítjuk. 3. próba: A vágatlan leveleket betakarítás után 50 °C hõmérsékleten szárítjuk, és csak röviddel az extrahálási folyamat elõtt mintegy 3×3 mm nagyságú darabokra aprítjuk. A kromatográfiás vizsgálatokat az a¹hederin- és hederakozid C¹tartalomra vonatkozóan a következõ táblázatban adjuk meg.
1
HU 003 012 T2
1. táblázat a-Hederin
Hederakozid C (%)
Teljes szaponin mennyisége hederakozid C alapján számolva
1. próba
1,25
6,05
8,08
2. próba
1,40
5,45
7,73
3. próba
1,13
5,75
7,59
Az eredmények egymással összehasonlíthatók, és szignifikáns eltérést nem mutatnak, bár a friss állapotban aprított leveleknél a hederakozid C/a-hederin arány kismértékben eltolódni látszik az a¹hederin irányába. A további vizsgálatokban a borostyánlevelek aprításának mértékét és a tartalommeghatározás idõpontját változtatjuk: 1. próba: A friss leveleket finoman eldörzsöljük, és azonnal 45% etanollal (v/v) extraháljuk. 2. próba: A friss leveleket finoman eldörzsöljük, és 45 perc várakozás után 45% etanollal (v/v) extraháljuk. 3. próba: A vágatlan leveleket betakarítás után 50 °C hõmérsékleten szárítjuk, és röviddel az extrahálási mûvelet elõtt aprítjuk. A kromatográfiás vizsgálatok eredményeit az a¹hederin- és hederakozid C¹tartalomra vonatkozóan a következõ 2. táblázat mutatja. 2. táblázat a-Hederin
Hederakozid C (%)
Teljes szaponin mennyisége hederakozid C alapján számolva
1. próba
3,74
0,37
6,45
2. próba
3,17
0,19
5,34
3. próba
1,13
5,75
7,59
Mint a táblázatból látható, az intenzív aprítással közel a teljes hederakozid C a¹hederinné alakítható. 2. Szárított és aprított drog fermentálása az extrahálás elõtt A sejtek épségének szétroncsolásához erõs aprítással és víz hozzáadásával megkezdjük a hederakozid C átalakítását a¹hederinné. Ezt a következõ kísérletek szerint végezzük. Egész, szárított borostyánleveleket, melyek elõzetesen meghatározott hatóanyag-tartalma 7,94% hederakozid C és 0,59% a¹hederin, az alábbiak szerint kezelünk: 1. próba: 200 mg erõsen aprított levelet 20 ml vízzel elegyítünk. A vizet vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot a szokásos módon 45% etanollal (v/v) extraháljuk.
5
2
2. próba: A drogot az 1. próbánál leírt módon kezeljük, de víz helyett 30% etanolt (t/t) alkalmazunk. A kromatográfiás eredményeket az a¹hederin- és hederakozid C¹tartalomra vonatkozóan a 3. táblázatban adjuk meg. 3. táblázat a-Hederin
10
15
Hederakozid C (%)
Teljes szaponin mennyisége hederakozid C alapján számolva
1. próba
4,40
0
7,15
2. próba
1,12
6,51
8,33
Kiindulás
0,59
7,94
8,90
Mint az adatokból látható, ha az aprított droghoz vi20 zet adagolunk, a hederakozid C teljesen a¹hederinné bomlik le. Az 1. ábra HPLC eljárással nyert kromatogramot mutat az 1. próba (1b. ábra) és a 2. próba (1a. ábra) esetében. Az ábrákon a hederakozid C anyag által 25 adott csúcsot „HC” jelöli, az a¹hederin által adott csúcsot mindenkor „a¹H” jelöli. Mint az 1a. és 1b. ábrán található csúcsok összehasonlításából adódik, a hederakozid C mennyisége az a¹hederin javára szinte teljesen lecsökken, ami arra utal, hogy a teljes hederakozid C 30 átalakult. A 30%¹os etanollal (t/t) végzett fermentálás szintén a hederakozid C lebomlásához vezet, azonban lényegesen kisebb mértékben. További vizsgálatokkal kimutatható, hogy a drog 35 aprításának mértéke és a víz adagolt mennyisége döntõ jelentõségû az átalakulás mértéke szempontjából: a mintegy 5×5 mm nagyságú levélfragmensekkel végzett extrakciós kísérletek, amiket az ismertetett módon vízzel fermentáltunk, azt mutatják, hogy az a¹hederin a 40 hederakozid C rovására feldúsul, de az átalakulás nem teljes, mert sok sejt ép maradt. Abban a kísérletben, ahol finoman aprított leveleket a vízzel csak enyhén megpermeteztünk, azt találtuk, hogy a hederakozid C átalakulása nem teljes. 45 Ahhoz, hogy a hederakozid C komponensnek a¹hederinné történõ átalakulásáról a fent megadott eddig ismert ismereteket eredményesen egy hatásos extrakciós eljárásba tudjuk építeni, az extrakciós eljárás következõ változatait végeztük el: 50 1. extraktum: 3,0 g aprított borostyánlevelet (5×5 mm) 12¹szeres mennyiségû 30% etanollal (t/t) extrahálunk (normálextrakció). 2. extraktum: 3,0 g aprított borostyánlevelet (5×5 mm) egy kromatografálóoszlopban vízzel lefe55 dünk. 1 óra elteltével a vizet egy leeresztõcsapon keresztül leeresztjük, majd 12¹szeres mennyiségû 30% etanollal (t/t) extrahálunk. 3. extraktum: 3,0 g aprított borostyánlevélhez 60 (5×5 mm) 12 rész extrahálószer [30% 5
1
HU 003 012 T2
etanol (t/t)] vízrészét adagoljuk. 1 óra fermentációs idõ után hozzáadjuk a 12 rész extrahálószer etanolrészét az extraháláshoz. A kromatográfiás kiértékeléssel a következõ 4. táblázatban megadott eredményeket kaptuk.
raháljuk] és egyszer az új módszerrel. A kromatográfiás eredményeket az a¹hederin- és hederakozidtartalomra vonatkozóan a következõ 5. táblázatban adjuk meg. 5
5. táblázat
4. táblázat a-Hederin
Hederakozid C (%)
Teljes szaponin mennyisége hederakozid C alapján számolva
1. extraktum
0,48
19,80
20,58
2. extraktum
4,11
1,38
8,06
3. extraktum
8,38
5,88
19,51
a-Hederin (%)
Hederakozid C (%)
Teljes szaponin mennyisége hederakozid C alapján számolva (%)
Szokásos
0,53
8,68
9,54
Új
4,74
0
7,71
10
15
Mivel a drogot ezeknél az extrahálásoknál csak 5×5 mm méretre aprítottuk, az átalakulás nem teljes mértékû. A táblázatból egyértelmûen felismerhetõ, hogy a fermentációs víz levezetése (2. extraktum) hatóanyag-veszteséghez vezet. A fent ismertetett elõkísérletek kombinálásával egy további extrakciós eljárást fejlesztettünk ki, amellyel szabályozható a borostyánlevél száraz extraktum a¹hederintartalma. 3. Extrakciós eljárás borostyánlevelekbõl szabályozott a¹hederintartalommal rendelkezõ száraz extraktum elõállítására A minõség és felszabadulás minõség-ellenõrzéssel történõ vizsgálata után a drog (borostyánlevelek, DAC) egy részét egy malomban erõsen aprítjuk, ahol a fragmensek nagyságát egy védõszitával legfeljebb 2×2 mm értéken biztosítjuk. Ezután a szitáit anyagot optikailag nagyobb szemcseméret és szennyezõdések alapján vizsgáljuk. Az aprított próbához 6 rész extrahálószer [30% etanol (t/t)] vízrészét adjuk. Ezt az elegyet 30 °C hõmérsékleten esetenkénti kevertetés mellett 60 percen keresztül fermentáljuk. Ezután hozzáadjuk a 6 rész extrahálószer 96% etanolrészét, és az elegyet kevertetéssel homogenizáljuk. Egy 6 órás duzzasztási fázis után az eluátumot elválasztjuk, és a visszamaradó drogot a maradék 6 rész extrahálószerrel perkoláljuk. Az egyesített eluátumokat kis drogszemcsék kizárása érdekében ismét szûrjük és homogenizáljuk, majd vékonyfilmes bepárlással 55 °C hõmérsékleten és 150 mbar nyomáson szárítjuk. A maradékot homogenizáljuk, és ezután permetezve szárítjuk 45–60 °C hõmérsékleten borostyánlevelekbõl készült száraz extraktum kialakulásáig. A fenti elõállítási eljárás vizsgálatához a következõ extraktumokat állítottuk elõ: 3,91% hederakozid C¹ és 0,20% a¹hederintartalommal rendelkezõ borostyánlevelekbõl kiindulva extraktumot készítünk egyszer a szokásos módszerrel [a szárított próbát aprítjuk és közvetlenül 30% etanollal (t/t) elegyítjük és ext-
2
20
25
30
35
40
Mint a táblázatból látható, az új extrakciós eljárással a levelekben található hederakozid C teljesen a¹hederinné alakítható. Mivel a hederakozid C alapján számolt teljes szaponintartalom is ugyanabban a nagyságrendben mozog, lehetõvé válik – a drogban mért megfelelõ szaponinkoncentráció ismeretében és a mintegy 2–3-szoros dúsítási faktor figyelembevételével – az extraktum végsõ a¹hederintartalmának becslése. Ahhoz, hogy a drogban elõforduló hederakozid C komponensnek csak egy részét alakítsuk át a¹hederinné, ennek megfelelõen a drognak csak meghatározott részét fermentáljuk vízzel, melynek során minden más paramétert állandó értéken tartunk. A 60 perces fermentálás lejátszódása után a 6 órás duzzasztáshoz hozzáadjuk a maradék drogot és az etanolt. A találmány szerinti eljárással lehetõvé vált, hogy a borostyánlevelekbõl készült száraz extraktum hatóanyagspektrumát egy fermentálás beiktatásával jelentõsen megváltoztassuk túl nagy idõ és forrásfelhasználás ráfordítása nélkül. Az a¹hederin hatékonyságáról szóló számos publikáció ismeretében az a¹hederintartalom célzott befolyásolása egy száraz extraktumban, illetve gyógyszerkészítményben pozitív hatást gyakorol az extraktum hatékonyságára.
45 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás extraktum elõállítására borostyánlevelekbõl egy extrahálószer alkalmazásával, ahol az extrak50 tum a¹hederint tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a következõ lépéseket tartalmazza: a) szárított borostyánlevelek egy mennyiségét aprítjuk, b) víz hozzáadásával fermentáljuk, melynek során a hederakozid C komponenst a¹hederinné alakítjuk, 55 c) az extrahálószer hozzáadásával extraháljuk, és d) az extraktumot adott esetben szárítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépésben a borostyánlevelek aprítását 60 £5×5 mm méretre végezzük. 6
1
HU 003 012 T2
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a borostyánlevelek aprítását £2×2 mm méretre végezzük. 4. Az 1–3. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy extrahálószerként alkohol- és vízrészbõl álló elegyet alkalmazunk. 5. Az 1–4. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az extrahálószerben alkoholként egy C2–C10 alkoholt alkalmazunk. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkoholként 96%¹os etanolt alkalmazunk. 7. Az 1–6. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az extrahálószer víz/alkohol részének aránya (t/t) 10/90–90/10. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a víz/alkohol arány 70/30. 9. Az 1–8. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a borostyánlevelek aránya az extrahálószerhez 1:1–1:50. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a borostyánlevelek aránya az extrahálószerhez 1:12. 11. Az 1–9. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben az extrahálószer egyik vízrészét alkalmazzuk. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben a teljes extrahálószer fele mennyiségének vízrészét adagoljuk. 13. A 10–12. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az extrahálószer 6 részének vízrészét adagoljuk. 14. Az 1–13. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépést 1 perc és 120 perc tartományba esõ idõtartam alatt végezzük.
5
10
15
20
25
30
7
2
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépést 60 perc idõtartam alatt végezzük. 16. Az 1–15. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépést 10–40 °C tartományba esõ hõmérsékleten végezzük. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépést 30 °C hõmérsékleten végezzük. 18. Az 1–17. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben az extrahálást elõduzzasztással és perkolálással végezzük. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elõduzzasztást 1 óra és 30 óra tartományba esõ idõtartam alatt végezzük. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elõduzzasztást 6 óra idõtartam alatt végezzük. 21. Az 1–20. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a d) lépésben a szárítást vékonyfilmes bepárlással, és ezt követõen permetezve szárítással végezzük. 22. Az 1–21. igénypontok egyike szerinti eljárás az a¹hederin- és hederakozidtartalom szabályozására egy borostyánlevél-extraktumban. 23. Borostyánlevelekbõl készített extraktum, azzal jellemezve, hogy az 1–22. igénypontok egyike szerinti eljárással van elõállítva. 24. A 23. igénypont szerinti extraktum alkalmazása gyógyszerkészítmény elõállítására. 25. A 24. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszerkészítményt légúti betegségek kezelésére alkalmazzuk. 26. Gyógyszerkészítmény, amely 25. igénypont szerinti extraktumot tartalmaz.
HU 003 012 T2 Int. Cl.: A61K 36/25
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Törõcsik Zsuzsanna fõosztályvezetõ-helyettes Windor Bt., Budapest
