(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000003269T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 003 269

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C12Q 1/68

(21) Magyar ügyszám: E 03 722673 (22) A bejelentés napja: 2003. 02. 25. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030722673 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1478780 A2 2003. 09. 04. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1478780 B1 2008. 01. 09.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 0202380 2002. 02. 25.

(73) Jogosult: ASSISTANCE PUBLIQUE, HOPITAUX DE PARIS, 75004 Paris (FR)

FR

(72) Feltalálók: GRANDCHAMP, Bernard, F-75017 Paris (FR); MENTRE, France, F-75006 Paris (FR)

(54)

(2006.01) G06F 19/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 03072823 PCT/FR 03/00609

(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest

Eljárás rákok in vitro detektálására allélikus egyensúlyhiányok inszerciós/deléciós markerekben történõ kimutatásával

(57) Kivonat

HU 003 269 T2

A találmány tárgyát képezi eljárás biológiai mintákban megtalálható tumorsejtek detektálására kromoszomális inszerciós/deléciós markerekben található allélikus egyensúlyhiányok kimutatásával, amely eljárás tartalmazza a fenti markerek hõdependens láncreakció ré-

vén történõ multiplex amplifikálását, az összes vizsgált markerre vonatkozó globális statisztikai pontérték kiszámítását, valamint ezen pontérték összehasonlítását egy rögzített normalitásküszöb-értékkel.

A leírás terjedelme 48 oldal (ezen belül 3 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 003 269 T2

A találmány orvosi területen valósítható meg, elõnyösen kórházi egységekben és szolgáltatások során, valamint onkológiai klinikákon és orvosi analitikai laboratóriumokban. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezi nem invazív diagnosztika és/vagy prognosztika, és/vagy rákellenes kezelés hatékonyságának a követése. Ebbõl a célból a találmány molekuláris biológiai eljárásokat alkalmaz biológiai minták in vitro vizsgálatára, amelyeket a vizsgálatból származó adatok feldolgozására alkalmas statisztikai eljárással kapcsol össze, amely molekuláris biológia és statisztika kombinációja lehetõvé teszi rákos betegek tumorjában jelen levõ genetikai anomáliák detektálását. A találmány tárgyát képezi eljárás biológiai mintákban található tumorsejtek detektálására kromoszomális inszerciós-deléciós markerekben található allélikus egyensúlyhiányok kimutatásával, amely eljárás tartalmazza a fenti markerek hõdependens láncreakció révén történõ multiplex amplifikálását, az összes vizsgált markerre vonatkozó globális statisztikai pontérték („score”) kiszámítását, valamint ezen pontérték összehasonlítását rögzített normalitásküszöb-értékkel.

2

Epidemiológiailag a húgyhólyagrákok („tumeurs de vessie”, TV) gyakori betegségek. A TV az ötödik leggyakoribb rák a nyugati világban, ahol a rákkal összefüggõ, összes elhalálozások 3%¹át teszik ki. Az Egye5 sült Államokban a TV férfiakban a negyedik, nõkben a nyolcadik leggyakrabban elõforduló rák, évente 53 000 új esettel, és évente mintegy 12 000 mortalitással (1, 2). Franciaországban, csakúgy mint az iparilag fejlett többi országban, a TV elõfordulása emelkedik. 10 1980 és 1994 között az évente és 100 000 lakosra jutó esetek száma 13¹ról 17,4¹re emelkedett (3). 1990-ben Franciaországban a 100 000 lakosra esõ, tv¹nek tulajdonítható halálesetek száma körülbelül 7 volt, azaz az összes rákoselhalálozások 5%¹a. 15 Szövettanilag a tv¹k 95%¹a átmeneti sejtes karcinómának felelnek meg. Franciaországban az epidermális karcinómák, valamint az adenokarcinómák egyenlõre ritkák. Az IUCC („Union Internationale Contre le Cancer”) 20 szerinti osztályozás a hólyagfal inváziójának különbözõ stádiumait és különbözõ citológiai differenciáltságát definiálja. Ezt az osztályozást mutatja az alábbi 1. és 2. táblázat.

1. táblázat Hisztológiai stádium Invázió

in situ karcinóma

pTa

PT1

PT2

PT3a

PT3b

PT4/b

Urothelium

+

+

+

+

+

+

+

Chorion

–

–

+

+

+

+

+

Felszíni izom

–

–

–

+

+

+

+

Mélyizom

–

–

–

–

+

+

+

Perivesicalis zsír

–

–

–

–

–

+

+

Szomszédos szervek

–

–

–

–

–

–

+

2. táblázat Hisztológiai differenciáltság

Nukleáris atypia

Mitotikus aktivitás

Differenciálódás

G1

+

+

jól differenciált sejt

G2

++

++

közepesen differenciált sejt

G3

+++

+++

hiányosan differenciált sejt

Tünetek szempontjából, hematuria és irritatív húgyúti funkció jelei (pollakiuria, sürgõsség, sürgõsségi szivárgás) jelentik a TV alapvetõ klinikai manifesztációját. Ritkábban, a léziókkal kapcsolatos szövõdmények (ureter obstrukció, medencei kompresszió jelei) vagy disszemináció (távoli metasztázis) tünetei figyelhetõk meg. A kezdeti diagnózis idõpontjában, a tumorok mintegy 70–80%¹át felszíniként osztályozzák (azaz nem támadja meg a hólyag izomzatát), és 20–30%¹át invazívnak. Ez utóbbiak több mint fele az elsõ diagnózistól kezdve ganglionáris vagy szisztémás inváziónak minõsül.

Trans-urethralis reszekciót követõen, amelyet adju50 váns kezelés követhet (immunterápia vagy endovesicalis kemoterápia), a felszíni léziók természetes lefolyását két kockázat jellemzi, a kiújulás (recidíva) és a progresszió. Jelentõségüket epidemiológia és progresszivitás 55 szempontjából tekintve, elengedhetetlennek tûnik a felszíni tv¹k éber követése. A követés különbözõ eljárásokkal végezhetõ, azok alkalmazhatósága többé-kevésbé az adott esetre történõ adaptálhatóságtól függ. Ezek néha nem felelnek 60 meg a célnak önmagukban, és csak kombinálva haté2

1

HU 003 269 T2

konyak, és minden esetben számos elõnyük és hátrányuk van, amint azt alább összefoglaljuk. Bár ritkán kontributív, a klinikai vizsgálat igen fontos a hematuria (makroszkópos vagy mikroszkópos, húgyúti tesztcsíkokkal meghatározva) és irritatív vizelési problémák (pollakiuria, sürgõsség) megállapításához. Végül a medence vizsgálata kimutathatja a medencefenék infiltrációját, ami a tumor infiltráló természetének a jele. Citoszkópia végezhetõ merev vagy flexibilis citoszkóppal. Bár hatékony, ez a vizsgálat invazív, a beteg néha rosszul tolerálja, valamint komplikációkat okozhat (ureter szûkületét, húgyúti fertõzéseket). Továbbá a citoszkópia nem mindig teszi lehetõvé a hólyag anterior felszínének és az intradivertikuláris régiók vizsgálatát. A húgyúti citodiagnosztika kettõs elõnye, hogy egyszerû és nem invazív. Általános érzékenysége, azaz a kapacitása, hogy jelen levõ anomáliát detektáljon, alacsony (40–60% közötti) (4, 5). Ez az érzékenység erõsen függ a vizsgálatot végzõ patológus személyétõl, mivel a végsõ interpretáció lényeges része szubjektív természetû. Ezen túlmenõen a húgyúti citodiagnosztika érzékenysége és specificitása jelentõsen változik a tumor differenciáltságától, a specificitás alatt az eljárás arra való alkalmasságát értve, hogy anomáliák hiányában helyes következtetésre jut. Ennek megfelelõen magas differenciáltságú léziók esetében (G3, lásd a fenti 2. táblázatot), az érzékenységet 90%-osnak és a specificitást 98%-osnak határozták meg. Ezzel szemben alacsony differenciáltságú tumorok esetében az érzékenység 11% és 25% közé csökken (G1, ugyanott) (6). A TV követésére alkalmas további eljárás a Nukleáris Mátrix Protein 22 („Protéine 22 de la Matrice Nucléaire”, NMP22) mérését tartalmazza. Ez a protein a mitotikus orsó szervezésében játszik szerepet. Valójában a vizeletbõl határozzák meg, kvantitatív immunenzimatikus eljárással. A választott pozitivitási határtól függõen, az érzékenység nagyon változó (7). Ettõl függetlenül a vizsgálatok többsége 60–70%¹os érzékenységrõl és specificitásról számol be (8). Ezen vizsgálat elõnye azon alapul, hogy az érzékenység nem függ a tumor differenciáltságától. A „BTA Trak Test” monoklonális ellenanyagokat alkalmaz a humán eredetû komplement H faktor ellen, amelyek húgyúti elõfordulása korrelál a TV jelenlétével. Ez egy kvantitatív teszt, amelynek érzékenysége 6277% közötti és erõsen függ a differenciáltságtól (G1:48%; G2:59% és G3:88%) (8, 9). Ezzel szemben, specificitása alacsonyabb: vizsgálattól függõen 48–65%. Ez azért van így, mivel a teszt nemcsak tumorléziókkal reagál, hanem hematuria (véres vizelés) esetén véreredetû H faktorral is. Ennek megfelelõen, minden olyan körülmény, amely hematuriát okozhat, téves pozitív eredmény forrása lehet (8). A hialuronsav („acide hyaluronique”, HA) egy glükózaminoglikán, amelyet a hialuronidáz (HAáz) bont le kis fragmensekre, amely fragmensek sejtek adhéziójában és az angiogenezisben játszanak szerepet. A HA¹HAáz teszt esetében ezt a két elemet mérik a vi-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

zeletben ENLISA-eljárással. A vizsgálat esetében 90% nagyságrendû (a tumor differenciáltságától és stádiumától független) érzékenységrõl és 84% specificitásról számoltak be (8, 10). Az „Immunocyt” klasszikus húgyúti citológiát és immunfluoreszcencia-vizsgálatot kombináló eljárás, amely vizsgálat két mucin és az angiotenzinkonvertáló enzim („enzyme de conversion de l’angiotensine”, ECA) egyik formája ellen irányuló, három monoklonális ellenanyagot alkalmaz. E kombinációs eljárás érzékenysége 90%¹os (tumor differenciáltságától függetlenül) és specificitása egészséges kontrollokban 98%¹os. A specificitása azonban jelentõsen csökken jóindulatú urológiai rendellenességek esetén: mikrohematuria esetében 85%¹os, cisztitisz esetében 60%¹os és prosztata adenoma esetében 50%¹os (8, 11). Eredetileg in vitro telomerázaktivitás (PCR-ELISA vizsgálókészlet) kimutatására kifejlesztve, a fenti aktivitás vizsgálatára alkalmas eljárás legújabb változatai telomerázt kódoló messenger-RNS (mRNS) RT¹PCR eljárással (reverz transzkripció összekapcsolva polimeráz-láncreakcióval) történõ mennyiségi meghatározásán alapulnak. Az eljárás érzékenysége 0 és 83% között változik; specificitása 70%¹os nagyságrendû (12, 13). A specificitás azonban csökkenhet a húgyúti szervekben meghúzódó gyulladásos folyamat esetében (telomeráz expresszálódása aktivált limfocitákban). Továbbá makroszkópos hematuria jelenléte téves negatív eredményt okozhat. Végül, az RT¹PCR eljárás a vizelet mintegy alkalmankénti kezelését igényli (12). Megjegyezzük, hogy TV detektálására alkalmas számos további marker áll fejlesztés alatt (citokeratin 20, CD44-variációk, BLCA–4 típusú NMP, uroplakin és mások). Jelenleg nem létezik azonban olyan eljárás TV detektálására és követésére, amely érzékenység és specificitás tekintetében kiemelkedõ „teljesítõképessége” lenne. Ebben a vonatkozásban, olyan genetikai anomáliák meghatározása, amelyek lehetõvé teszik TV megbízható és nem invazív detektálását, jelentõs elõrehaladást jelent. Tumorok olyan genetikai mutációk akkumulálódása révén alakulnak ki, amelyek specifikus gének, nevezetesen onkogének és tumorszuppresszáló gének funkcióját megváltoztatják. Ezt az akkumulációt meggyorsíthatja egy jelentõs mértékû kromoszomális instabilitás, amely egy vagy több teljes kromoszóma, vagy csak egy kromoszóma részének vagy részeinek elvesztését eredményezi, vagy akár kromoszómaduplikálódást vagy uniparentális diszomiát okoz (ami az egyik kromoszóma elvesztését és a maradék kromoszóma duplikálódását jelenti). Adott egyénben, normálszövetbõl származó nukleinsav (például leukocita-DNS) és tumorszövetbõl származó DNS összehasonlítása lehetõvé teheti kromoszomális anyag módosulásának vagy elvesztésének a meghatározását, és ezáltal tumoros folyamat felfedését. Adott egyén, aki egy polimorf kromoszomális markerre nézve heterozigóta, a marker minden egyes allél-

1

HU 003 269 T2

jának egy kópiáját hordozza. A két allél közötti teoretikus arány ennek megfelelõen 1 (azaz 1/1). Bizonyos genetikai anomáliák képesek ezt az arányt megváltoztatni. Definíció szerint, „allélikus egyensúlyhiány” („désequilibres alléliques”, „allelic disequilibrium”, AD) alatt adott marker allélikus kópiái közötti arány bármely módosulását értjük. A genetikai anomáliák különbözõ természetûek lehetnek, ilyenek pl.: (i) kromoszómák számának a megnövekedése (például triszómia, amely az 1/1 arányt 2/1 arányra változtatja; (ii) az allélt tartalmazó kromoszomális régió nagyobb vagy kisebb kiterjedésû deléciója; (iii) monoszómia (amely az 1/1 arányt 1/0 arányra változtatja); szerzett uniparentális diszómia (amely az 1/1 arányt 2/0 arányra változtatja). A mikroszatelliták mono¹, di¹, tri- vagy tetranukleotidokból álló, rövid DNS-szekvenciák, amelyek N¹szer ismétlõdnek (N 10¹tõl 60¹ig terjedhet). A humán genomban körülbelül 100 000 mikroszatellita van véletlenszerû és homogén módon elosztva (14). Ezek a szekvenciák általában nemkódoló szekvenciákban találhatók, bár jelen lehetnek gének intronjaiban és exonjaiban is. A mikroszatellitákat erõs egyedi stabilitás jellemzi, minden egyénben megvan a mikroszatelliták saját egyéni allélikus eloszlása. Az egyén szintjén mutatkozó stabilitás ellenére, a mikroszatelliták egyének közötti nagyfokú polimorfizmust mutatnak. Ebben a tekintetben a mikroszatelliták multiallélikusak, és az ismétlõdések száma függvényében nagyszámú különbözõ allél létezhet. Továbbá heterozigotizmusuk foka 70% és 95% között változik. Különösen TV esetében, szakirodalmi helyek nagyszámú olyan genetikai anomáliát azonosítottak, amely AD¹eredetû. Ennek megfelelõen, AD¹ket 1994 óta mutatnak ki tv¹ben mikroszatellitamarkerek alkalmazásával (15). Ezeket a markereket 1996 óta ajánlják diagnosztikai eszközként (16). Azóta számos munkacsoport ismertetett diagnosztizált (17, 18 és 19) vagy közvetett (20) tv¹esetekbõl származó, mikroszatellitamarkerek alkalmazásával elért eredményeket. Ezekben a vizsgálatokban, 10 és 20 közötti mikroszatellitamarkert alkalmazva, az érzékenység 84–91%¹os, és a specificitás 85–100%¹os volt. Az ilyen típusú marker TV detektálására történõ alkalmazásának azonban két lényeges hátránya van. Elõször is, technikai szempontból nézve, nagyon nehéz, vagy akár lehetetlen mikroszatellitaszekvenciák sokaságát ugyanabban a reakcióban koamplifikálni oly módon, hogy mindegyik egy adott markert képviseljen. Valójában, mint fentebb ismertettük, a mikroszatellitaszekvenciák nagyon sokszor ismétlõdnek identikusan, és eltérõ markerek esetében közösek lehetnek. Ez nehezíti vagy akár lehetetlenné teszi a markerek egyetlen PCR-reakció során történõ, egyidejû amplifikálását. A gyakorlatban nem tervezhetõk olyan primerek, amelyek úgy amplifikálják egy mikroszatellitaszekvencia egyetlen kópiáját, hogy egyidejûleg ne amplifikáljanak ugyanabban a markerben ismétlõdõ további kópiákat,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 4

2

valamint más markerekhez tartozó, azonos szekvenciák kópiáit. Következésképpen minden egyes mikroszatellitamarkert egyenként kell amplifikálni. Mivel egy adott egyén esetében legalább mintegy tíz mikroszatellitamarkert kell vizsgálni, a fenti markereket alkalmazó tesztek végzése az idõráfordítás és reagensek szempontjából nemcsak költségesek, hanem nagy mennyiségû DNS¹t igényelnek, ami olyan további korlátot jelent, amely ellentmond a rutinszerû alkalmazásnak. Másrészt az ilyen tesztek elve azon alapszik, hogy egy adott mikroszatellita két alléljából elõállított amplifikációs termékeknek megfelelõ szignálok felszíni területének arányában bekövetkezõ módosulást mutatják ki (1A. ábra). Röviden, a DNS¹t amplifikálják és a vizsgálandó mintában, TV esetében húgyúti eredetû mintában, és egy referenciamintában, például vérben, mérik a szignálok felszíni területének az arányát. Ahhoz, hogy AD jelenlétére következtessenek, a két mintához tartozó szignálok felszíni területének az arányában jelentõs különbséget kell kimutatni. Ahhoz, hogy ezt elérjék, a megfigyelt különbséget adott esetben a vizsgálati fluktuációnak kell tulajdonítani, és minden más esetben helyesen interpretálható úgy, hogy tükrözi AD jelenlétét vagy hiányát. A gyakorlatban, mikroszatelliták esetében, a vizsgálószemély nem képes kontrollálni az amplifikációs torzításokat, amelyek hibás interpretálás forrásai, mivel maga a referenciaminta is adhat 1¹nél (1/1) nagyobb arányt heterozigóta egyénben. Továbbá a kérdéses arányok egyénenként változnak, mivel, amint azt fentebb ismertettük, minden egyén adott mikroszatellita két egyedi allélját hordozza, nagyszámú lehetõségek közül. Ezenfelül a szignifikanciahatárok csak adott egyénre érvényesek, Ennek megfelelõen, azokat a vizsgálatot végzõ személy empirikusan választja meg, amit a szakirodalomban szerzõrõl szerzõre megfigyelt különbségek mutatnak. Schneider és munkatársai [Cancer Research 60, 4617–4622. (2000)] eljárást ismertetnek tumorsejtek biológiai mintából történõ detektálására mikroszatellitamarkerek AD¹jénak kimutatásával, amely tartalmazza a markerek kvantitatív PCR-eljárással történõ amplifikálását, az egyes markerek két alléljának megfelelõ két csúcs R arányának a kiszámítását, az R arány (Ub/Ua) összehasonlítását referenciaminta Rf (Bb/Ba) arányával abból a célból, hogy meghatározzák a AD intenzitását, és a AD intenzitásértékének összehasonlítását normalitásintervallum-értékkel. A kivitelezhetõség és interpretáció hátrányainak kiküszöbölése érdekében, a találmány szerint AD kimutatására a hagyományos mikroszatelliták helyett más markereket, nevezetesen biallélikus polimorf inszerciós markereket vagy SIDP markereket („short insertion-deletion polymorphism” markereket) alkalmaztunk. A SIDP markereket néhány nukleotid jelenléte vagy hiánya jellemzi. Ha például az alábbi szekvenciát tekintjük: …ATTTGCGCTAAGCTAGCTATTAT…, SIDP markernek felel meg, ha tartalmazza a rövid GCTA szekvencia egy vagy több kópiáját. Definíció szerint a SIDP markerek biallélikusak, mivel ugyanannak a markernek csak két különbözõ allélja

1

HU 003 269 T2

létezik. Ebbõl következik, hogy adott egyén lehet homozigóta vagy heterozigóta az allélok egyikére, és így két különbözõ lehetséges allélt hordozhat (1B. ábra). SIDP markerek esetében a heterozigotizmus foka alacsonyabb, mint mikroszatelliták esetében. Közelebbrõl, a tv¹k vizsgálatához alkalmazott markerek esetében a heterozigotizmus foka 40% nagyságrendbe esik (lásd az alább következõ példákat). A SIDP markereket Weber doktor és munkatársai azonosították a marshfieldi (Wis) „Center for Medical Genetics” központban. SIDP szekvenciák hozzáférhetõk a http://www.research.marshfieldclinic.org honlapon. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát képezi tumorok, elõnyösen húgyhólyagtumorok detektálására alkalmas új teszt, amely teszt AD jelenlétét mutatja ki biológiai mintákban, például vizeletmintákban található sejtekbõl, SIDP típusú biallélikus markerek alkalmazásával. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát képezi eljárás biológiai mintákban található tumorsejtek detektálására AD jelenlétének legalább tizenöt, elõnyösen legalább tizennyolc és még elõnyösebben legalább harminc-negyvennyolc kromoszomális inszerciós-deléciós markerben történõ kimutatásával, amely eljárás legalább az alábbi lépéseket tartalmazza: a) a markerek kvantitatív multiplex amplifikálását; b) minden egyes marker két alléljához tartozó amplifikációs szignálnak megfelelõ két csúcs magassága R arányának a kiszámítását; c) a markerek összességére vonatkozó globális statisztikai pontérték kiszámítását, amelyek khi-négyzet törvény szerint oszlanak el, ahol a szabadságfok megegyezik a vizsgált markerek számával, és amely globális pontértéket az alábbi képlet szerint számítjuk ki: Pontérték=Sdi2=S{[LnRi–m(LnRf)]¸(LnRf)}2, ahol: – di egy adott i markerre vonatkozó, kiszámított statisztikai távolságot jelöl; – Ri minden egyes marker esetében a két csúcs magasságának a biológiai mintából kiszámított arányát jelöli; – Rf minden egyes marker esetében a két csúcs magasságának referenciamintából kiszámított arányát jelöli; – m(LnRf) az LnRf értékek átlagának felel meg; és – s(LnRf) az LnRf értékek szórásának felel meg; és d) a pontérték összehasonlítását a rögzített normalitási küszöbbel, amely küszöb felett a biológiai mintát patológiás mintának tekintjük, és amely normalitási küszöb megfelel egy választott a elsõfajú kockázatértékhez tartozó khi-négyzet értéknek és a vizsgált markerek számának. A leírásban a „folyamat”, „eljárás” és „teszt” kifejezéseket azonos értelemben alkalmazzuk. A leírásban tumorsejtek „detektálása” alatt az ilyen sejtek jelenlétének a kimutatását értjük. Az ilyen „detektálást” tumorok nem invazív diagnosztizálására és/vagy tumorok azonosítását követõ prognosztizálásra, és/vagy rákellenes kezelés követésére alkalmazzuk.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

A leírásban a „rák” és „tumor” kifejezéseket az orvosi szóhasználatnak megfelelõen, azonos értelemben alkalmazzuk. Amint az orvosi szóhasználatban szokásos, a leírásban „biológiai minta” vagy „minta” alatt élõ szervezetbõl, elõnyösen emberi szervezetbõl kivett bármely alkotóelemet értünk, például vért, biopsziát, vizeletet és/vagy köpetet, amely alkotóelem diagnosztikai célra alkalmazható sejteket tartalmaz. A leírásban „marker” kifejezés alatt olyan adott nukleinsavszekvenciát értünk, amely lehetõvé teszi AD specifikus detektálását és követését sejteket tartalmazó mintában. A fenti marker a fenti sejtekben mintegy az AD nyomjelzõjéhez („traceur”) lehet hasonló. A markernek informatívnak kell lenni, azaz a lehetõ legmagasabb fokú heterozigotizmust kell mutatnia, hogy olyan összehasonlítási elemet biztosítson, amely kihasználható, például a marker két alléljának amplifikációs termékeit képviselõ szignálok közötti különbség tekintetében (1B. ábra). A fenti detektálási eljárás a) pontjára utalva, az „amplifikáció” kifejezést generikus értelemben alkalmazzuk, amennyiben az minden olyan molekuláris biológiai eljárást tartalmaz, amelynek elve célzott nukleinsavszekvencia amplifikálása vagy sokszorozása. Anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk, idesoroljuk például a PCR-eljárást, transzkripciómediálta amplifikációt („transcription-mediated amplification”, TMA), nukleinsavszekvencián alapuló amplifikációt („nucleic acid sequence based amplification”, NASBA), szekvencia autoreplikációját („self-sustained sequence replication” 3SR), szálhelyettesítõ amplifikációt („strand displacement amplification”, SDA) és a ligáz-láncreakciót (ligase chain reaction”, LCR). A fent ismertetett amplifikációs reakciók lehetnek izotermálisak, vagy igényelhetnek ciklikus expozíciót különbözõ hõmérsékleteken. Ez utóbbi konfigurációt elõnyösen „termodependens” amplifikációs reakciónak nevezzük, bár ez utóbbi elnevezés néha hallgatólagos elnevezés lehet, amely esetben szakember világosan következtethet az összefüggés kétértelmûsége nélkül. A PCR-eljárások szokásos szóhasználata szerint, az amplifikálandó nukleinsavszekvenciát „célnak” [„cible”, (target”)] vagy „mátrixnak” („matrices”) hívjuk. A találmány összefüggésében ezek a szekvenciák elõnyösen a fent definiált markereknek, elõnyösebben kromoszomális markereknek felelnek meg. A találmány szerinti eljárás szerint végzett vizsgálat „kvantitatív”, amennyiben lehetõvé teszi egyazon marker két alléljának megfelelõ amplifikációs termék kvantitatív meghatározását, és ezáltal alapot szolgáltat arra, hogy az allélokhoz tartozó csúcsok magasságának az arányát [az eljárás b) lépése], valamint az eljárás c) lépése szerinti, összehasonlítandó elemet kiszámítsuk. Például az a) lépésben alkalmazott primerpárok mindegyike esetében a primerpárok egyikét jelölhetjük fluorokrómmal. A találmány szerinti eljárás a) lépése „multiplex” amplifikációs reakciókat tartalmaz abban az értelemben, hogy egyedi primerpárok alkalmazása helyett, a

1

HU 003 269 T2

mintában található számos különbözõ célszekvencia több, elõnyösen három, egyidejû amplifikációs reakciója megy végbe, amely reakciók számos eltérõ primerpárt alkalmaznak, legalább tízet és elõnyösen legalább tizenötöt. Ennek megfelelõen, a találmány szerinti eljárás szerint, a cél-nukleinsavszekvenciákat specifikus nukleotidprimerek alkalmazásával amplifikáljuk, ahol a „specifikus primer” kifejezés olyan nukleotidszekvenciát jelöl, amely az amplifikációhoz primerként alkalmazható, és amely sztringens körülmények mellett a cél-nukleinsavszekvenciák 80%-ával képes hibridizálni. A „sztringens hibridizációs körülmények” kifejezés klasszikus definíciónak felel meg, és szakember számára jól ismert. A „primer”, „amplifikációs primer” és „nukleotidprimer” elnevezéseket és kifejezéseket a leírásban azonos értelemben alkalmazzuk. Nyilvánvaló, hogy a primerek szükségszerûen specifikusak akkor is, ha azt a leírásban explicit nem mindig emeljük ki. Az R aránynak a találmány szerinti eljárás b) lépése szerinti kiszámítása egyszerû arányt tartalmaz, amely szakember által elvégezhetõ, feltéve, hogy adott egy nyomjelzõ („tracé”), amint azt az 1B. és 3. ábra szemlélteti, és amelyet automata nukleinsavszekvenáló berendezés szolgáltat. Adott esetben, szekvenciaanalizáló vagy ABI PRISMS® (Perkin–Elmer, Wellesley, Mass.) típusú automata szekvenálóberendezés egy görbét határoz meg, amely az abszcissza mentén az amplifikációs termékek alaphosszát, míg az ordinátán a fluorokróm által emittált fluoreszcencia intenzitását mutatja. Egyrészt a termékek mérete, másrészt a termékekkel asszociált fluorokróm típusa, lehetõvé teszik a koamplifikált markerek azonosítását. Amint a 3. ábra mutatja, az így kapott szignálok vagy görbék különbözõ magasságú csúcsok formájában jelennek meg. Homozigotizmus esetén egyetlen csúcs figyelhetõ meg. Ezzel szemben heterozigotizmus esetén, a jelen levõ két allélnak megfelelõ két csúcs figyelhetõ meg, amelyeket a polimorfizmus mértékével (azaz, a két ismétlõdõ kópiát egymástól elválasztó szekvencia méretével) arányos távolság választ el egymástól. A találmány szerinti detektálási eljárás elõnyös megvalósítási módja szerint, egy adott vizsgálandó biológiai minta esetében, az a) lépés szerinti multiplex PCR-amplifikációt duplikátumban végezzük; és a b) lépés során, R arány kiszámítása helyett a két arány átlagát számítjuk ki, amely arányok egy-egy amplifikációs reakciónak felelnek meg. A találmány szerinti c) lépésben, utalást teszünk „globális statisztikai pontértékre”. Ez a pontérték standardizált statisztikai entitást jelent, amely lehetõvé teszi olyan szignifikanciaküszöb (vagy normalitásküszöb, vagy konfidenciaküszöb) létrehozását, amely nem empirikus, rögzített és minden vizsgált egyénre nézve érvényes. Ezáltal minden adott egyénre nézve kiszámított Ri arány esetében következtetni lehet arra, hogy egy adott minta normális vagy abnormális, az

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 6

2

érintett egyénre vonatkoztatott, rögzített, objektív és független kritériumok alapján. A globális érték kiszámítását, vagyis adott egyén esetében tesztelt markerekre vonatkozó Ri arányok summázását az a tény indokolta, hogy nem minden egyén hordozza ugyanazon informatív markereket, sem azok azonos számát. A találmány szempontjából ezt a hátrányt pontosan kompenzálja adott egyénre és nem adott markerre vonatkoztatott globális AD mennyiségi meghatározása. Ebben a lépésben, a „globális statisztikai pontérték” kiszámításához alkalmazott „Rf referenciaarány” adott marker két alléljához rendelt csúcsmagasság aránya átlagának felel meg, amely arányokat legalább húsz, és elõnyösen legalább harminc, egészséges DNS-bõl származó referenciamintából kaptuk. Ezek a referenciaminták származhatnak különbözõ egyénekbõl, az egyetlen követelmény, hogy azok egészséges mintáknak feleljenek meg. A „referenciaminták” olyan biológiai minták, amelyeket körültekintéssel kell kiválasztani, hogy azok olyan biológiai folyadékot vagy szövetet képviseljenek, amelyek a vizsgált genetikai anomáliákra nézve egészségesek. Ennek megfelelõen, TV esetében a „biológiai minta” vizeleteredetû, míg a „referenciaminta” például véreredetû mintát tartalmaz. Ennek megfelelõen megkülönböztetünk vizsgálandó „biológiai mintát”, amely tumorsejteket tartalmazhat, és normalitáskontrollként alkalmazott „referenciamintát”, azaz olyan mintát, amely egészséges és a vizsgált tumorokra jellemzõ genetikai anomáliáktól mentes. Az „globális statisztikai pontérték” az alábbi képlet szerint számítható ki: Pontérték=Sdi2=S{[LnRi–m(LnRf)]¸(LnRf)}2, ahol: di egy adott i markerre kiszámított statisztikai távolságot jelöl; Ri minden egyes marker esetében a két csúcs magasságának a biológiai mintából kiszámított arányát jelöli; Rf minden egyes marker esetében a két csúcs magasságának referenciamintából kiszámított arányát jelöli; m(LnRf) az LnRf értékek átlagának felel meg; és s(LnRf) az LnRf értékek szórásának felel meg; és A képlet szerint i marker két alléljának megfelelõ csúcsok magasságának Ri arányát a biológiai mintában található nukleinsavakból számítjuk ki és hasonlítjuk össze a referenciamintáknak megfelelõ Rf referenciaarányok átlagával. Nyilvánvaló, hogy a detektálási eljárás a) és b) lépését a biológiai mintán és a referenciamintán egyaránt elvégezzük, hogy az eljárás c) lépése szerinti összehasonlítás elvégezhetõ legyen. Abból a célból, hogy Ri és Rf arányok megjelenítését 1¹hez viszonyítva (egészséges heterozigóta egyén esetében az ideális arány 1/1) szimmetrikussá tegyük abban az értelemben, hogy lényegtelen, hogy az elsõ csúcs magasságát osztjuk el a másodikéval, vagy fordítva, feltéve, hogy a két esetben megjelenõ entitás az

1

HU 003 269 T2

1¹tõl való azonos eltérést jelenti (például az 1/2 és 2/1 arányok ugyanazt az eltérést jelölik 1/1¹tõl), a vizsgált változókat természetes alapú logaritmusukra transzformáltuk. Ez a transzformálás azt mutatta, hogy a fenti változók a statisztikusok által jól ismert normáleloszlás törvényét követik. A normáleloszlás törvényét, azaz „Gauss”-görbét vagy „harang” görbét szemléltetõ görbét mutat az alábbi 2. ábra. Ennek megfelelõen, kiszámíthattuk az LnRf változó által igazolt, normáleloszlásra jellemzõ átlagokat és szórásokat. Ezeket az átlagokat és szórásokat vizsgálati eredményekbõl becsültük. Továbbá ezeket az értékeket latin m és s betûkkel jelöltük, és nem a görög m és s betûkkel, amelyeket ugyanezen statisztikai entitások elméleti értékeire alkalmaznak. Az globális pontérték kiszámításának az elve az egyes markerekhez rendelt egyedi távolságokon és négyzeteik summázásán alapul. A fenti képlet szerint és szokásos statisztikai terminológiát alkalmazva, egy adott d „távolság” az átlagtól való eltérésnek felel meg. Valójában a di LnRi és m(LnRf) közötti távolságot jelöli. Normáleloszlások egymásból történõ kivonása szintén normáleloszlást eredményez. Ez a távolság nagyobb, ha (i) a biológiai mintában genetikai anomáliák vannak jelen; és ha (ii) a tumorsejtek és egészséges sejtek aránya nagyobb. Annak érdekében, hogy a kapott távolságot standardizálhassuk, azt arányosítottuk minden egyes markerhez rendelt referenciamérések szórásával, nevezetesen az s(LnRf) standard deviációval. A fenti képlet szerinti Sdi2 globális pontérték, mivel egy normáleloszlás négyzetének a summázását jelenti, khi-négyzet törvény (eloszlás) szerint oszlik el N szabadságfok mellett, ahol N az összes vizsgált informatív markerek számát jelöli. Statisztikai terminológia tekintetében a „khi-deux”, „khi-négyzet” és „c2” kifejezéseket azonos értelemben alkalmazzuk. Végül is a khi-négyzet törvényt alkalmaztuk nem empirikus szignifikanciaküszöb vagy normalitásküszöb vagy ¹határ rögzítésére. Ebbõl a célból, az a elsõfajú kockázatot választottuk a találmány szerinti detektálási eljárás várható specificitásának a meghatározásához. A leírásban „specificitás” alatt annak valószínûségét értjük, hogy a teszt negatív, ha az egyének egészségesek, és amely valószínûség ideális esetben 1¹gyel egyenlõ. Ezt követõen, amennyiben a választott a¹érték és N szabadságfok mellett a khi-négyzet-eloszlás Sd2max. határértéket ad ki, azon túl, szigorúan és objektíven következtethetünk arra, hogy a vizsgált biológiai minta kóros, és valóban tartalmaz tumorsejteket. Egy további megvalósítási mód szerint, a találmány szerinti detektálási eljárás legalább az alábbi lépéseket tartalmazza: a) a fenti markerek kvantitatív multiplex amplifikálását; b) az egyes markerek két alléljának megfelelõ két csúcs szerinti amplifikációs szignál magassága R arányának a kiszámítását;

5

10

15

20

25

30

35

40

2

c) az egyes i markereknek megfelelõ egyedi di távolságok kiszámítása az alábbi képlet szerint: di=[LnRi–m(LnRf)]¸s(LnRf) ahol: Ri minden egyes marker esetében a két csúcs magasságának a biológiai mintából kiszámított arányát jelöli; Rf minden egyes marker esetében a két csúcs magasságának referenciamintából kiszámított arányát jelöli; m(LnRf) az LnRf értékek átlagának felel meg; és s(LnRf) az LnRf értékek szórásának felel meg; és d) a di távolság értékének összehasonlítását a választott a elsõfajú hibának megfelelõ (1–a) konfidenciaintervallum-szinttel. Abból a célból, hogy a fenti eljárás d) lépése szerinti összehasonlítást elvégezzük, egy értéket rendelünk az a elsõfajú kockázathoz, ami lehetõvé teszi LnRi érték esetében egy normalitás- vagy konfidenciaintervallum meghatározását a nélkül. Ez az intervallum (1–a) értéknek felel meg; ez a¹hiba nélkül lett definiálva. Példaként, a normalitásintervallum egyenlõ lehet: m(Lnf)±[3×s(LnRf)], amely esetben a értéke 0,1%. E példa szerint, ha abszolút értékben 3 vagy annál nagyobb egyedi távolságot kapunk (|di|³3), levonható az a következtetés, hogy i genetikai markerben genetikai anomália van jelen, a hiba 0,1%¹os vagy annál kisebb kockázata mellett. Általánosságban a találmány szerinti detektálási eljárások alkalmazhatók tumorok adott biológiai mintában történõ vizsgálatára AD detektálása révén, feltéve hogy informatív és elegendõ számú biallélikus inszerciós-deléciós markert alkalmazunk ahhoz, hogy az anomáliák olyan széles körét detektálhassuk, amilyet csak lehetséges, és amely anomáliák a jelen lévõ vizsgált tumorsejtekben elõfordulhatnak. Elõnyösen a fenti eljárást húgyhólyagtumorok detektálására alkalmazzuk. Ebben az esetben a biológiai minta vizelet, a referenciaminta vér. Húgyhólyagtumorok detektálásakor a 3. táblázatban felsorolt markerek legalább egyikét alkalmazzuk. 3. táblázat

45 Lokalizáció

50

55

60 7

Marker

2q

919, 1559

3p

17, 752

4p

1983

4q

642

5q

714, 739, 787

6q

402, 440, 471, 627

8p

12

9p

18, 116, 476, 558, 1410, 1570, 1998, 2065, 2086, 2102

9q

118, 289, 475, 516, 682, 1370,1384, 1583, 1584,1654, 1921

1

HU 003 269 T2

3. táblázat (folytatás) Lokalizáció

Marker

10q

390, 671, 686, 1789

11p

1704

11q

1982

13q

22, 562, 894, 1363, 1698, 1792, 1979

14q

1319

16q

792, 1187

17p

272, 663, 1385, 1657, 1770

18q

1697, 1228

A táblázatban, amint az alábbi ismertetés is mutatja, a „lokalizáció” kifejezés a kromoszómakart jelenti, amely a kérdéses markert hordozza.

2

A 3. táblázatban felsorolt markereket a http://www.research/marshfieldclinic.org/ weblapon hozzáférhetõ SIDP szekvenciák közül választottuk, nemcsak azért, mert érdeklõdésre számot tartó géne5 ket hordozó régiókat fednek le, nevezetesen onkogéneket és tumorszuppresszáló géneket, hanem azért is, mert kevésbé célzott zónákban helyezkednek el, és ezáltal jobban képviselik a tv¹re jellemzõ általános kromoszomális instabilitást. A markerek amplifikálásának a szempontjából a 10 találmány szerinti eljárás specifikus amplifikálásra alkalmas primerek közül legalább egy olyan primerpárt alkalmaz, amelyeket az 1–134. azonosító számú szekvenciák alatt az alábbi 4. táblázat ismertet, vagy 15 olyan szekvenciákat, amelyek azokkal stringens körülmények mellett legalább 80%-ban hibridizálni képesek.

4. táblázat Marker

Szenszszekvencia

Azonosító számú szekvencia

Antiszenszszekvencia

116

AAGAGGTCTCTGGGCGTCACACACTT

1

AAGTACTGAGCATCAGGACTGTATGGGG

118

CCACAGGTGTGCCCATACAGACATT

3

17

TGTATCAGAGGCAATAATTTCCAAAGCAGA

18

Amplifikált termék mérete

Primerpár

2

169/173

A1

CAGGTGAACTGGGTACGCACACTCA

4

138/140

B1

5

CGATCCCAGACACTGAAGATGAAATAAGTC

6

136/140

C1

GGCTGTTGACTGCACTGGGATTTAGA

7

TCATTAACTCTCAGACTGACCTGGGAGC

8

141/144

D1

22

TATGTGTGGCAGTGAAGAGAACAGGTCTTT

9

GGGCTATCTTAAGAAATATGAATACTTTGGCT

10

186/192

E1

390

TAATGGTAAACAATATTTTCAGCCACTTTGGA

11

CGGATGGGTGGGTATATTTTATTTTCCA

12

171/175

F1

402

AAGAGCCTCTGTTTATGTGGATTGTGGC

13

TCTTGGTAAATTGCCATTTTTCATAAAACAA

14

187/191

G1

471

GCTTGCTATCACGGTGTATTGGGCAT

15

TGTCAGAAGGGGTTAGTGCTAGTGTTTGA

16

111/114

H1

516

AACTTGCCTGCATTGTACATCATTCCTA

17

GGGGATGTTATTATTTCTGAAGTTGGCG

18

97/100

I1

561

CATTGTGGTTACATTAGGGGAAGGCA

19

CCCCGACAGTTGTGATGTGTTCGT

20

153/156

J1

562

TGTTTGAGTGCCTTATAAGTTCTGGTTTTCA

21

CAGATGTAGCTTTAGGCATTCTTTTTTCTTGT

22

192/194

K1

663

ATATGTTCACTGGCTAAACTATGTGTATCCCA

23

CCTGTTTTTGTAGAGCCCTCAAGTTAAGAA

24

126/130

L1

671

ACCATTGGGAATATGTTAAAGAAATTGGCT

25

CAGAAAACATCTCATTTTTGACCAGCTACA

26

220/222

M1

682

AAGGTATGAGGAGAGCAGATGCAAAAAG

27

GCATGACAAAAATCACTGGGTGGTC

28

193/197

N1

686

AATGGAAAAGTATTTGGTGTTTTTTGAATGTC

29

GCCTGACAAAGGTGAAACTCAGTTGAAA

30

210/213

O1

714

GAAAAGCTACATCCCAGTGCTGAAGG

31

ATTTAAGGCCACCAGATTGTGAGGAAAC

32

87/89

P1

8


HU 003 269 T2

4. táblázat (folytatás) Marker

Szenszszekvencia





Primerpár

752

ACTTTCACTAACAAGCCCTTAAACCGAAAA

33

TGCCCCATTGTACACCAAAGAATGTTAATA

34

195/197

Q1

894

ATTTCTTTCATTAAGGCTGGGGAGGC

35

GGCCACCTCTGAGGATCTGAGCTTTA

36

136/138

R1

12

ACTTTTATTGGCACAGGCATTC

37

GAGTTGTTTCTGACCCACTGATCTC

38

129/131

S1

22

TCAAATAAGAGTTGTCATATCCTGCT

39

TGAATATGTGTGGCAGTGAAGA

40

128/134

T1

116

TGTATGGGGCTGGCTTTAG

41

GCCTCTGAAGAGGTCTCTGG

42

157/161

U1

273

TGTGATCAATTCCAACTGCTG

43

AAGGCTTAAAGGAAATCACGTC

44

143/147

V1

289

TTCTTGCAGGCATGAAGCTA

45

CTCAACCCCCTTCTCCATAG

46

152/155

W1

390

TTTTCGGATGGGTGGGTAT

47

AACAATATTTTCAGCCACTTTGG

48

167/171

X1

402

AGACACCAAAGAGCCTCTGTTTA

49

CTTCTCACTAAATTATGTCTTGGTAAATTG

50

208/212

Y1

440

CAATACCCAGCAAAGGATATGG

51

GCATCTGTACATAGTAAGCCTACCG

52

105/107

Z1

471

CTTTTTCAAATGCTGCTTGC

53

CAGAAGGGGTTAGTGCTAGTGTT

54

122/125

A2

475

GTGCCATTTTGATTCCCATT

55

GGCATTCCAGAACCAAAAG

56

215/218

B2

476

GACCTAAAATTGCGGTCATTTC

57

GAAAATGCAGGCCTTTCATCA

58

131/134

C2

516

AGTTGGCGCCAGAAATGA

59

ATACAAGAGTCCAAGGTAGCCAGT

60

140/143

D2

558

GGTAGGCATGTAGAAATACGGTTC

61

CCAGGATAGCATTCAACAGTTTG

62

145/149

E2

561

CCACTCACTTTCTTGCATGG

63

CCCGACAGTTGTGATGTGTT

64

122/125

F2

627

TGTGTTGTTGCTTTGCCTCT

65

CATTCCCACGGTTAGCTGTT

66

182/187

G2

642

TTGTGTCTGCCTGTAGTTCAATG

67

GTGATTAAACTTGTATTTCCTGAACA

68

114/116

H2

714

TCTTAGGAAAAGCTACATCCCAGT

69

TTTAAGGCCACCAGATTGTGA

70

92/94

I2

739

GCTATGTTCAGAAAATGCATCTCACTC

71

TGATGTGTGACAGCCAATGAA

72

212/216

J2

787

GCTAGATGGTCCTGTGTCATTG

73

GTGATTAATGTGAACTTCCAGTGC

74

137/141

K2

792

TTGCTGTGGCTCTAGGTTGC

75

TCGGCAGTTAATGACAGTGATG

76

176/180

L2

919

GGGGATGACAATGAATATGATG

77

TGGCATAACACTTAGCAAGCA

78

197/200

M2

1187

TCAGAGACAAGGTCGCTGCT

79

TTTCTTCATAGCTACTCCACCACTG

80

141/152

N2

1228

AGCTTCGGAGAATCTATCAAATAGC

81

GAACGGGTAAAATGGCAATG

82

204/206

O2

1319

AAACCAGCCAGTTTTCCTGA

83

GTACTGGGTAGGTAATACGCTGAGA

84

86/99

P2

9

HU 003 269 T2

4. táblázat (folytatás) Marker

Szenszszekvencia


1363

GCCAATTACTTTGCCTCTCC

85

1370

CAAAAGATGGAGGCTAATATGTTGA

1384




Primerpár

ACGGGACAAGTCTGTTTGGT

86

154/158

Q2

87

AATAGTCCATTAGCAAATCCTTCA

88

127/129

R2

GCAGCTTCCAACTGGTTCTT

89

GGCTAACCCAGTGAGTCCAA

90

200/204

S2

1385

CTGCTGCAGATTGAACCAA

91

AACAGCATCGCTTTAGATACTAGG

92

98/116

T2

1410

GCCCTGAGCCTTTCAAATC

93

TGGAACCTCAGTCACACCTAAG

94

86/89

U2

1559

TGTTTCAGGACTGAGCACGA

95

CAGGAGGTGTGGCCAGTTT

96

158/161

V2

1570

ATCCTCCCCACTGAACCTC

97

GCCCCTCTTCTGCTGGTTAT

98

219/224

W2

1583

CGGGGCGGACAACTAATG

99

CAAACAGGACTGAATGAAAACAACA

100

185/190

X2

1584

AGCCACTTGAATTACCTGGAA

101

TCTTGGGAAATCGCCTCTC

102

104/106

Y2

1654

CGTAAATGGAGGTTAAATGGCTTC

103

CTCCGCACTTATGCTGCAA

104

91/95

Z2

1657

CCCGTTTACACCTGCTGAGT

105

CCTGGGGAGTCTAGGTAAGATG

106

214/218

A3

1697

AGTGAGCCAAAATGGACTAAGG

107

TAGGGCCTGTCTGACTCCAA

108

223/227

B3

1698

ATTTCCCTCCCAACCCTGT

109

GATCAAATTGAAGGACATGAGAGA

110

186/188

C3

1704

CTTTCTCTTCCCATCTTCACTTG

111

GCATGCTTAAGGACTGTGAAA

112

221/225

D3

1770

AGAAGAGTGAACGTATTGACATGAG

113

GCTTACGGGTTTTCCTCCA

114

113/115

E3

1789

GGAATACAGCATACTCAAATAAAGG

115

CCCTGTGCTTAATGTCTGCAA

116

188/191

F3

1792

ATGATGTGGTACCTCTGTCACC

117

TACTCTTCCAGGCACTGATAGG

118

79/83

G3

1921

ATCACAGCGGTGAAGCAAAG

119

CTTTGGTCAGTAGGGATCCATTT

120

110/114

H3

1979

TGGGTGTCTGAAATGTTAATTGAGC

121

GGGTGAGTTCCAGCGTTTCT

122

173/177

I3

1982

GATATTAAACAAGTAGCATCAGACACAA

123

TAGTATGCAGTGGCTGTTGAGA

124

142/146

J3

1983

AGTGGCTCCCTGTGTCTGA

125

AATGAGCTTCGTTCTTTGGAC

126

99/101

K3

1998

CTCAACATCTGCACGGAGCA

127

AATGGAGTGTGTACTTGTAGAGAGTGA

128

209/213

L3

2065

ACGCCTGGCCTGAAAGTATT

129

GTCTGACATCGCCCTCGTAG

130

164/167

M3

2086

AGAAGCAGAATGGGGATGAA

131

GGAGTAATAGATTCTGGCATGTG

132

194/210

N3

2102

TGAACTAAAGGTGGGCAGTG

133

CAATGAAGCATTTGACAACGTC

134

115/119

O3

10

1

HU 003 269 T2

Az amplifikációhoz alkalmazott primereket az alábbi, kettõs specificitási kritérium, nevezetesen szekvencia- és méretspecificitás szerint választottuk ki. Egyrészt a szekvenciaspecificitás olyan, hogy (i) a fenti primerek a találmány szerinti eljárás szerint a multiplex amplifikáció során egyidejûleg alkalmazhatók anélkül, hogy kockáztatnánk olyan nem kívánt másodlagos amplifikációs termékek képzõdését, amelyek a vizsgálat téves eredményéhez vezetnének; (ii) nem hibridizálnak egymással, ami kizárja téves negatív eredmények elõfordulását; és (iii) olyan nukleotidszekvenciákra specifikusak, amelyek viszont adott markerekre specifikusak. Másfelõl a képzõdött amplifikációs termékek méretspecificitása lehetõvé teszi minden egyes termék hozzárendelését ahhoz a markerhez, amelybõl származtatott, szakember számára jól ismert, szokásos vizsgálati eljárásokkal, mint például gélelektroforézis alkalmazásával. Ez a kettõs specificitás esszenciális, és a találmány tárgyát képezõ eljárás szerinti megoldás feltételei közé tartozik. Megfelelõen kiválasztva az amplifikációs primerek mindegyike képes arra, hogy specifikusan és szelektív módon hibridizáljon hasonló hibridizálási hõmérsékleteken, hogy olyan méretû hibridizációs termékeket kapjunk, amelyek mérete szûk keretek között változik, például 80 és 200 bázispár (bp) között, hogy megkönnyítse a detektálási eljárás további lépéseit. A találmány egyik elõnyös megvalósítása szerint a találmány szerinti detektálási eljárás a) lépése, elõnyösen TV esetében, legalább az alábbi allépéseket tartalmazza: a1) kezdeti denaturáló lépés 95 °C¹on, 7 percen át; a2) denaturáló lépés 95 °C¹on, 30 másodpercen át; a3) hibridizációs lépés 61 °C¹on, 30 másodpercen át; a4) elongációs lépés 72 °C¹on, 30 másodpercen át; az a2)–a4) lépések ciklust képeznek, amely ciklus 35¹ször ismétlõdik; és a5) végsõ elongációs lépés 72 °C¹on, 10 percen át. Ezeket az allépéseket elõnyösen, de nem kizárólagosan akkor végezzük, amikor a fent ismertetett amplifikációs primereket alkalmazzuk. Az allépések alkalmazhatók továbbá multiplex SIDP amplifikáció során, a 4. táblázatban felsoroltaktól eltérõ primerek alkalmazásával, feltéve, hogy kielégítjük a primerek számára fent ismertetett hibridizálási hõmérsékleti kritériumokat. Anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk, a találmányt az alábbi ábrákkal illusztráljuk. 1. ábra: példa olyan teszt eredményeinek a konfigurációjára, amelyben genetikai anomáliákat detektáltunk heterozigóta egyén biológiai mintájában, miután azt nukleinsavszekvencia-analizáló berendezésen feldolgoztuk, amely nukleinsavakat fluorokrómmal jelöltük. A vonalkázott rész a marker két alléljának megfelelõ szignálterületet jelzi. 1A. ábra: mikroszatelliták esetében,

5

10

15

20

25

30

2

1B. ábra: SIDP esetében. 2. ábra: TV detektálásának összefüggésében vizsgált biallélikus inszerciós-deléciós markerek csoportjának Lnf változóit jelölõ hisztogram. Amit itt mutatunk, az valójában az Ln[Rf/m(Rf)] változó, abból a célból, hogy csökkentsük a PCR-amplifikációhoz kapcsolt torzulást. Az Ln[Rf/m(Rf)] eloszlása normáleloszlást mutat. 3. ábra: példa a GeneScan ® 2.1.1 (ABI PRISM@) szoftver által biztosított nyomjelzõre a találmány szerinti detektálási eljárás alkalmazása során. 3A. ábra: nyomjelzõ, kilenc SIDP marker alkalmazásával, ezek közül négy HEX¹, öt pedig FAM-fluorokrómokkal jelölve, valamint egy méretstandard. Az amplifikációs termékek méretét az abszcissza mentén tüntettük fel, a fluoreszcencia intenzitását az ordinátán. Ebben a példában mindössze két marker heterozigóta, és tette lehetõvé két csúcs detektálását. 3B. ábra: a táblázat minden egyes csúcs esetében jelöli a migrációs idõt a leolvasóablakig, a bázisok száma szerinti méretét, magasságát és területét. A találmány jobban érthetõvé válik az alábbi példák segítségével, amelyek kizárólag a találmány illusztrálását szolgálják. Nyilvánvaló, hogy a találmány oltalmi köre semmilyen módon nem korlátozódik az alábbi példákra.

Példák A találmány szerinti, tumorsejtekben hordozott genetikai anomáliák detektálására alkalmas eljárást alkalmaztuk TV vizsgálatára. Olyan kromoszomális régiók vizsgálatát választot40 tuk, amelyeket szakirodalmi helyek gyakran ismertetnek úgy, mint amelyek tv¹eredetû AD¹kat prezentálnak, abból a célból, hogy összehasonlításra alkalmas elemeket kapjunk. Ennek megfelelõen az alábbi kromoszómakarokat vizsgáltuk: 9p, 9q, 17p, 10q, 13q, 6q, 3p 45 és 5q. 35

I. Reagensek és eljárások I.1. Betegek A vizsgálatba történõ beválasztás kritériuma TV 50 megállapítása volt olyan egyénekben, akik korábban nem mutattak urogenitális rák elõzményét. A kontrollok olyan egyének voltak, akik különbözõ urológiai okokból kerültek kórházi kezelésre (kövek, húgyúti inkontinencia, prosztataadenoma és mások). Kizárólag urogenitális rák kórelõzményû betegeket 55 és kontrollokat zártunk ki a vizsgálatból. Nyolcvanhét egyént választottunk be, akiket 24 kontrollból és 63 esetbõl álló csoportba osztottunk. Az esetek szövettani jellemzõit az alábbi 5. táblázat 60 foglalja össze. 11

1

HU 003 269 T2

pTa

pT1

pT2–4

Összesen

G1

9

2

0

11

G2

18

6

3

27

G3

1

16

8

25

28

24

11

63

Összesen

I.2. Markerek A markerek SIDP markerek voltak, amelyek szekvenciái hozzáférhetõk a http://www.research/marshfieldclinic.org/ weblapon. I.2.1) Vizsgált markerek száma Mivel mikroszatellitákban a heterozigotizmus mértéke, ennek megfelelõen az informativitás nagyobb, mint a SIDP markereké, nagyszámú SIDP markert kellett alkalmazni ahhoz, hogy azonos szintû informativitást érjünk el. Ez okból számos markert választottunk ki az egyes vizsgált kromoszómakarokon. A 9q kart, amely a tv¹anomáliák fõ helye, részletesen tanulmányoztuk négy marker bevonásával. I.2.2) Lókuszok kiválasztása Ideális esetben, és amint azt fentebb ismertettük, a markereknek nemcsak az onkogéneket és tumorszuppresszor géneket hordozó régiókat kell lefedniük, hanem kevésbé specifikus zónákat, amelyek a TV általános kromoszomális instabilitása miatt AD¹ket hordozhatnak. A markerek által lefedett régiók kiválasztása szakirodalmi helyek szerint történt, (lásd a fenti 3. táblázatot). I.3. DNS-oldatok mennyiségi meghatározása Minden egyén esetében vizelet- és leukocitaeredetû DNS¹t vontunk ki a biológiai és referenciamintákban található sejtekbõl, szakember számára jól ismert eljárásokkal. Az elõzetesen 1/100 arányban hígított DNS-oldatokat PicoGreen fluorokrómmal jelöltük, amely szelektív módon kötõdik kettõs szálú DNS-hez. A fluoreszcenciát kalibrációs görbével összevetve olvastuk le 520 nm hullámhosszon, fluorimétert alkalmazva. Néhány vizeletminta esetében a koncentráció kisebb volt, mint 100 ng/ml. A végsõ oldatokat –20 °C¹on tároltuk. I.4. Amplifikáció PCR-eljárással Az elsõ lépés különbözõ markerek amplifikálását tartalmazta, három multiplex PCR-reakciót alkalmazva, amelyek mindegyike hat markert amplifikált. I.4.1) DNS A PCR-reakcióhoz 25 ng DNS¹t alkalmaztunk. A reakciókat azért végeztük 25 ng DNS-sel, hogy elkerüljük a vizeletüledékbõl kivont DNS mennyisége okozta bármely limitálást. I.4.2) Primerek Minden egyes primerpár inszerciós-deléciós polimorfizmust tartalmazott és csak az egyik primert jelöltük FAM vagy HEX fluorokrómmal.

5

2

I.4.3) A reakcióelegy A reakcióelegy az alábbiakat tartalmazta: polimerázt [Taq Polymerase Gold (Perkin–Elmer), 5 E/ml], puffert (10×puffer, Perkin–Elmer), MgCl2¹t (Perkin–Elmer, 25 mmol/l), dezoxinukleotid-trifoszfátokat (dATP, dTTP, dGTP és dCTP, egyenként 5 mmol/l) és vizet, 25 ml össztérfogatban. Az alábbi 6., 7. és 8. táblázatok a reakcióelegyek összetételét mutatják a primerpárok függvényében.

10

6. táblázat Összetevõ

15

Koncentráció

Mennyiség (ml)

MgCl2

25 mmol/l

2,5

Puffer

10×

2

dNTP Taq

20

25

5 mmol/l×4

1

5 E/ml

0,25

516

10 pmol/ml

0,9

116

10 pmol/ml

1,5

118

10 pmol/ml

1,5

18

10 pmol/ml

1

561

20 pmol/ml

1,75

682

50 pmol/ml

DNS

50 ng

kiegészítve 25 ml¹re

H2O

30

35

7. táblázat Összetevõ

Koncentráció

MgCl2

25 mmol/l

Puffer

10×

dNTP Taq

40

45

1 vö. [DNS]

Mennyiség (ml)

4 2,5

5 mmol/l×4

1

5 E/ml

0,25

894

10 pmol/ml

0,4

663

10 pmol/ml

2

402

10 pmol/ml

2

22

10 pmol/ml

2

562

10 pmol/ml

DNS

50 ng

4 vö. [DNS]


H2O

8. táblázat 50

55

Összetevõ

Koncentráció

MgCl2

25 mmol/l

Puffer

10×

dNTP Taq

60 12

Mennyiség (ml)

3 2,5

5 mmol/l×4

1

5 E/ml

0,25

714

10 pmol/ml

0,3

471

10 pmol/ml

0,4

17

10 pmol/ml

0,8

1

HU 003 269 T2

8. táblázat (folytatás) Összetevõ

Koncentráció

Mennyiség (ml)

390

10 pmol/ml

1,6

752

10 pmol/ml

1,8

686

20 pmol/ml

2

671

20 pmol/ml

2

DNS

50 ng

H2O

vö. [DNS]

5

10


I.4.4) PCR program Mindhárom reakcióra vonatkozóan, az alábbi lépéseket tartalmazta: 1. Denaturáló és polimerázt aktiváló fázis, 95 °C¹on, 7 percen át. 2. Denaturáló fázis, 95 °C¹on, 30 másodpercen át. 3. Hibridizációs fázis, 61 °C¹on, 30 másodpercen át. 4. Elongációs fázis, 72 °C¹on, 30 másodpercen át; a 2–4. fázisok 35¹ször ismételve. 5. Végsõ elongálás, 72 °C¹on, 10 percen át. I.4.5) Multiplex PCR elvégzése Minden egyes primerpárt egyedileg ellenõriztünk, hogy reaktivitásáról meggyõzõdjünk. Ezt követõen a primereket egyazon reakcióelegyben elegyítettük. Számos reakciót végeztünk úgy, hogy változtattuk a reakciót befolyásoló paramétereket (például hibridizálási hõmérsékletet, MgCl2 koncentrációját, polimeráz koncentrációját, amplifikációs ciklusok számát), hogy meghatározzuk az amplifikációs körülmények optimumát. Ezen túlmenõen, lényeges nehézséget okozott az a tény, hogy a különbözõ termékek amplifikációját viszonylag azonos módon végezzük, hogy a szekvenciaanalizáló berendezés leolvasásához alkalmazott körülmények a terméktõl függetlenül helytállóak maradjanak (azaz, az amplifikációs termékeket telítõdés nélkül detektáljuk). I.5. Az amplifikált fragmensek analízise Az amplifikációs termékeket méretük szerint szeparáltuk, majd ABI PRISM® analizálóberendezésen (1 kapillárisú, 310¹es modellen, vagy 16 kapillárisú, 3100¹as modellen) mennyiségileg meghatároztuk. A berendezés az alábbiak szerint mûködött. A fluoreszcens primerrel jelölt amplifikációs termékeket denaturáló pufferrel (formamid) és egy belsõ méretstandarddal elegyítettük. Ezt az elegyet denaturáltuk (három percen át történõ hõkezeléssel, 95 °C¹on), majd a berendezésbe vittük. A bevitt elegy 15 kV elektromos feszültséggel érintkezett 5 másodpercen át, majd erõs elektromos mezõnek (15 kV) kitett kapillárisban migrált. A kapillárist az ablaknál lézersugár világította be. A lézernyaláb hatására a fluoreszcens molekula által kibocsátott fényt CDD digitális kamera érzékelte, majd GeneScan® szoftver analizálta. Az elegyben jelen levõ termék mennyisége arányos a kibocsátott sugárzással. A termék mérete kiszámítható a kapilláriselektro-

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 13

2

forézis alatt a lézernyaláb ablakig eltelt migrációs idejébõl. Nyomkövetést példaképpen a 3. ábrán szemléltetünk. I.6. Allélikus egyensúlyhiány meghatározása Elméletileg az AD egy adott sejtben eredetileg jelen levõ két allél 1/1 arányának a módosulását eredményezi (egy allél eltûnését vagy duplikációját). Nehézséget támasztott az a tény, hogy a vizeletüledék tumorsejteket tartalmaz, azonban tartalmaz az egészséges urotheliumról leváló normálsejteket is. A kétféle sejtpopuláció aránya változó volt. Ilyen körülmények mellett, adott AD olyan módosulásokban nyilvánult meg, amelyek kevésbé érzékenyek a csúcsok magasságának az arányára, mint a két allélra. Ezen módosulások mértéke arányos volt a vizeletüledékben található tumoreredetû sejtek arányával, valamint függött a AD¹ért felelõs anomáliák típusától is. Ennek megfelelõen, szükség volt olyan kritériumok definiálására, amelyek lehetõvé tették annak eldöntését, hogy adott arány módosulása szignifikáns mértékû és valóban AD¹nak felel meg, vagy nem szignifikáns eltérést jelent, amely vizsgálati variációkhoz kapcsolt. Statisztikai számításokat végeztünk, és azokat az alábbi, „II. Eredmények” részben ismertetjük. Az eredmények feldolgozását és a számításokat ACCESS® szoftver (Microsoft) alkalmazásával végeztük. II. Eredmények II.1. Eljárás allélikus egyensúlyhiányok kiszámítására Két különbözõ számítási módot alkalmaztunk. II.1.1) Az egyes markerekre vonatkozó, megfelelõ kritériumok definiálása AD meghatározását a vérbõl és a vizeletbõl származó, vizsgált marker két alléljának megfelelõ két csúcs magasságának Rf és Ri arányának az összehasonlítására alapoztuk. Az alkalmazott arányokat természetes alapú logaritmusuk alkalmazásával 1¹hez viszonyítva szimmetrikussá tettük. Minden egyes marker esetében, az LnRf változók normáleloszlást mutattak. Ennek megfelelõen, minden egyes marker esetében LnRf értékhez rendelt vizsgálati átlagot és szórást határoztunk meg, amelyeket m(LnRf) és s(LnRf) jelölt. Ennek megfelelõen, 0,1% a elsõfajú hiba kockázatát választva, az LnRi értékhez rendelt normalitásintervallumot az LnRf±[3×s(LnRf)] értékkel definiáltuk. Mivel LnRf-vizsgálattal mért random egyedi változó, az m(LnRf) átlagot elõnyös alkalmazni a számítások során, hogy korlátozzuk a vizsgálati fluktuációkat. A 99,9%¹os normalitás intervallumdefiníciója tehát: LnRi értéke az [m(LnRf)±3×s(LnRf)| tartományban lehet. Az alábbi 9. táblázat az informatív DNS¹ek (azaz, a heterozigóta DNS¹ek) számát mutatja, amelyeket az egyes markerek esetében az LnRf, m(LnRf) és s(LnRf) eloszlások meghatározására alkalmaztunk.

1

HU 003 269 T2


Informatív DNS¹ek száma

m(LnRf)

s(LnRf)

17

34

0,0483

0,0193

18

38

0,0000

0,0521

22

55

0,0572

0,0351

116

39

0,1518

0,0347

118

39

–0,1009

0,0281

390

44

0,0668

0,0189

402

53

0,0742

0,0200

471

46

0,0418

0,0563

516

49

0,0460

0,0188

561

40

–0,0412

0,0257

562

42

0,0387

0,0355

663

43

0,0088

0,0212

671

36

0,0088

0,0130

682

22

0,0767

0,0220

686

30

–0,0289

0,0268

714

58

–0,0106

0,0172

752

41

0,0217

0,0150

894

35

–0,0093

0,0184

5

Amint azt a 9. táblázat mutatja, m(LnRf) nem mindig egyenlõ nullával (amely megfelel m(Rf)=1-nek), akkor sem, ha AD nem volt jelen. Ez amplifikációs torzításnak, azaz a PCR-reakció során az egyik allél rovására történt preferenciális amplifikációnak tulajdonítható. A AD meghatározásának ez az eljárása azzal a hátránnyal járt, hogy az elsõfajú kockázat akkumulációján alapul. Valójában, bár a kockázatot egy adott informatív marker esetében rögzítettük, az informatív markerek számával növekedett. Abból a célból, hogy ezt a hátrányt kiküszöböljük, az informatív markerek számával korreláló a kockázatot kellett meghatároznunk, hogy az a kumulatív kockázat egyik egyénrõl a másikra nézve azonos legyen. Ebbõl a szempontból, olyan egyedi pontérték kiszámítását végeztük el, amely adott egyén esetében a vizsgált markerek összességét figyelembe veszi. II.1.2) Globális pontérték kiszámítása Elve azon alapul, hogy minden marker esetében kiszámítjuk Ri távolságát az Rf átlagértékektõl, hogy logaritmusos transzformációt követõen négyzetek összegét kapjuk és khi-négyzet törvény alkalmazásával teszteljük a pontértéket. Ez esetben is, a vizsgálati fluktuációk miatt, a csúcsok magassága, amelyekbõl Ri és Rf értékeket számítottuk, random változóknak tekinthetõk, amelyek PCRreakcióból származó vizsgálati mérései becslések voltak. Adott Ri vizsgálati eredmény esetében, LnRi távolság négyzete az átlag m(LnRf) értéktõl s(LnRf) standard szóráshoz viszonyítva számítható ki: di2={[LnRi–m(LnRf)]/s(LnRf)}2.

10

15

20

25

30

35

40

45

2

N számú informatív marker esetében meghatároztuk a távolságok négyzetének az összegét, amelyet Sdi2 globális pontértéknek neveztünk. Ez a pontérték khi-négyzet törvény szerint oszlik el, N szabadságfok mellett. Annak a valószínûsége tehát, hogy Sdi2 nagyobb, mint egy adott érték, táblázatok segítségével könnyen meghatározható. Sdi2-hez felsõ határt rögzítettünk, amely a kockázatnak felelt meg, amely N informatív markerre vonatkoztatva meghatározta a teszt specificitását. Példaként a értékét 5%¹nak választva, N szabadságfok mellett a khi-négyzet-eloszlás lehetõvé tette, hogy Sdi2max. értéket úgy rögzítsük, hogy ha egy adott vizeletminta esetében olyan Sdi2 értéket kaptunk, amely meghaladta Sdi2max. értékét, objektív módon következtethetni lehetett arra, hogy a vizsgált vizelet patológiás, 5%¹os hiba kockázatával. II.2. Teszteredmények II.2.1) Globális eredmények A találmány szerinti detektálási eljárás tv¹esetek vizsgálatában mutatott „teljesítményének” jellemzése céljából az „érzékenység” és „specificitás” paramétereket az alábbiakban definiáltuk. „Érzékenység” alatt annak a valószínûségét értjük, hogy a teszt anomália esetén pozitív eredményt ad. Ideálisan ennek valószínûsége 1. A fentebb ismertetett definíció szerint, a „specificitás” annak valószínûségét jelenti, hogy a teszt anomália hiányában negatív eredményt ad. Az ideális valószínûség ez esetben is 1. A markerenként történõ számításokhoz 0,1% konfidenciaintervallumot határoztunk meg. Amennyibe egy vagy több markeren AD¹t figyeltünk meg, a tesztet pozitívnak tekintettük. Ez a számítási eljárás az alábbi eredményeket biztosította: 76,19%¹os érzékenységet (63 egyénbõl 48 mutatott legalább egy AD¹t) és 95%¹os specificitást (17 kontrollból egy mutatott legalább egy AD¹t). A AD pontérték alapján történõ meghatározása 68,25%¹os érzékenységet (63 egyénbõl 43 mutatott legalább egy AD¹t) és 95%¹os specificitást (17 kontrollból egy mutatott legalább egy AD¹t) biztosított. II.2.2) Az eredmények összehasonlítása a tumorok stádiumával és differenciáltságával Az alábbi 10. táblázat az érzékenységet mutatja a számítási eljárás, a stádium és a szöveti differenciáltság függvényében. 10. táblázat

50 n

Érzékenység (%) pontérték alapján számítva

Érzékenység (%) markerenként számítva

Globálisan

63

68,25

76,19

pTa

28

57,14

67,86

pT1

24

81,82

86,37

pT2–4

11

72,73

81,82

55

60 14

1

HU 003 269 T2

10. táblázat (folytatás) n

Érzékenység (%) pontérték alapján számítva

Érzékenység (%) markerenként számítva

G1

11

54,55

63,64

G2

27

66,67

74,07

G3

25

78,26

86,96

Ez a vizsgálat alacsonyabb érzékenységet mutatott ki pTa léziók esetében, mint pT1 léziók esetében

2

(p=0,02). A pT2–4 tumorok mintaszáma túl kevés volt ahhoz, hogy a pT1 tumorokkal összehasonlítsuk a khinégyzet-teszt alkalmazásával. Ugyanígy a teszt kevésbé volt érzékeny G1 léziók 5 esetében, mint G2 léziók esetében (p=0,001). A G2 és G3 tumorok között nem volt szignifikáns érzékenységbeli különbség (p>0,05). II.3 Különbözõ kromoszómakarok jelentõsége 10 II.3.1) Kromoszómakarok globális érzékenysége Az alábbi 11. táblázat az egyes kromoszómakarok szerinti érzékenységet mutatja.

Kar

10q

13q

3p

5q

6q

9p

9q

17p

Érzékenység

45%

40%

34%

37%

41%

42%

58%

33%

5q

6q

9p

9q

16%

19%

47%

48%

II.3.2) Érzékenység karok és szövettani kritériumok függvényében Az alábbi 12. táblázat az egyes karok érzékenységét mutatja a tumorok stádiuma és differenciáltsága függvényében.

20

12. táblázat n

10q

13q

3p

17p

pTa

28

33%

19%

18%

8%

pT1

24

53%

61%

38%

44%

47%

58%

50%

75%

pT2–4

11

50%

56%

29%

50%

100%

40%

0%

50%

G1

11

20%

9%

0%

0%

29%

38%

38%

50%

G2

27

41%

39%

25%

15%

12%

25%

50%

59%

G3

25

57%

58%

42%

50%

71%

52%

38%

60%

II.4. Különbözõ markerek jelentõsége Az egyes markerekre nézve kiszámítottuk az érzékenységet. Az eredményeket az alábbi 13. táblázat mutatja.

40


Érzékenység (%)

17

10,53

18

29,63

22

25

116

44

118

44,44

390

40

402

51,61

471

20

516

54,29

561

65,52

562

19,23

45

Marker

Érzékenység (%)

663

27,59

671

41,67

682

31,25

686

36,36

714

39,02

752

37,04

894

48,15

50 III. Következtetések III.1. A teszt specificitása A teszt specificitása megválasztható az a¹kockázathoz rendelt érték függvényében (95%¹os a pontér55 ték szerinti számítás esetében, a fent ismertetett vizsgálatokban, azaz 17 kontrollra 1 téves pozitív). A specificitás fokozható a PCR-amplifikálási reakció reprodukálhatóságának a fokozásával. Ebbõl a szempontból, elõnyös minden egyes PCR duplikátum60 ban történõ végzése. Amennyiben az eredmények 15

1

HU 003 269 T2

nem egyeznek, egy harmadik, megkülönböztetõ PCR végezhetõ. III.2. A teszt érzékenysége A AD meghatározási eljárás szerint, a teszt érzékenysége 68,25%¹os (globális pontérték) vagy 76,19%¹os (egyedi kritériumok szerinti AD) volt. Az érzékenység egyik korlátja az informatív markerek számán alapul. Eredetileg a tesztet harminc markerre terveztük, amelyekre nézve az informativitás foka 42,62% volt. Ezek a markerek kilenc kromoszómakaron oszlottak el. Ezek közül hetet egyenként három markerrel vizsgáltunk, ami azt jelentette, hogy a kar 81%¹os valószínûséggel legalább egy informatív markert hordozott. A másik két kart hét (9p kar), illetve két markerrel (11p kar) vizsgáltunk, ami azt jelentette, hogy 9p kar esetében 99,98%¹os valószínûséggel, míg 11p kar esetében 68%¹os valószínûséggel legalább egy informatív markert hordoztak. A teszt fejlesztésének az elején mindössze 18 markert alkalmaztunk, amelyek nyolc kromoszómakaron oszlottak el, és az informativitás átlagos foka 43% volt. Annak a valószínûsége, hogy az egyes vizsgált kromoszómakarokon legalább egy marker informatívnak bizonyul, átlagosan 69,5%¹os volt. A teszt fejlesztésének a végén 59 markert alkalmaztunk, amelyek 17 kromoszómakaron oszlottak el. Az érzékenységet további markerek alkalmazásával javítottuk. III.3. A találmány szerinti teszt elõnyei Az alkalmazott markerek biallélikus természete miatt, az amplifikációs termékek azonos méretûek (adott méret±polimorfizmus méret) és azonos megjelenésûek voltak, kivéve a mikroszatellitákat, amelyek számos olyan amplifikációs terméket képeztek, amelyek az ismétlõdések száma szerint egymástól különböztek (1A. és 1B. ábra). A találmány szerinti teszt esetében mindez könnyû leolvasást és interpretálást eredményezett, ami nem mondható el a mikroszatelliták esetében. Ugyanezen okból lehetõvé vált multiplex amplifikációprotokoll alkalmazása, amely mikroszatelliták esetében kettõnél vagy háromnál több marker mint abszolút maximum esetében nem mûködik. Ez a multiplex mûvelet lehetõvé tette a SIPD markerek informativitási fokának a kompenzálását (amely alacsonyabb, mint a mikroszatellitáké) azáltal, hogy lehetõvé tette a markerek számának a növelését anélkül, hogy a vizsgálatot idõtartam, reagensek és minták tekintetében túl költségessé tették volna. Végül ugyanazon profil megfigyelése minden egészséges heterozigóta egyénben lehetõvé tette standardok meghatározását, az egyes markerekre nézve és általánosságban, abból a célból, hogy AD jelenlétének vagy hiányának statisztikailag pontos és objektív meghatározását kapjuk. II.4. Következtetések A AD¹k elõnye, hogy tumorsejtekre specifikus anomáliák, szemben más ismert markerekkel (telomer-

2

ázok, fibrinogén degradációs faktorok, H¹faktor-protein és mások). A teszt optimalizálását követõen, elõnyösen a markerek számának a növelésével, a SIDP típusú marke5 rek alkalmazása körülbelül 95%¹os specificitást és 80–90%¹os érzékenységet eredményez. Következésképpen a találmány szerinti, tumorok, elõnyösen TV detektálására alkalmas teszt, mivel egyszerû, technikailag megbízható és olcsó, könnyen in10 tegrálható egy molekuláris biológiai laboratórium rutinszerû gyakorlatába. Ez a nem invazív teszt elõnyösen alkalmazható a felsõ húgyúti traktus urotheliális tumorjainak a detektálására, amelyeket nehezebb detektálni, mint a 15 tv¹t.

20

25

30

35

40

45

50

55

60 16

Referencialista – FABIA et al. Scand. J. Gastroenterol. 1993. vol. 28. 155–162. [0004] – HOLMA et al. Scand. J. Gastroenterol. 2001. vol. 36, 630–625. [0004] – MAO et al. Gastroenterology. 1996. vol. 111. 334–344. [0004] – GUSLANDI et al. Dig. Dis. Sci. 2000. vol. 45. 1462–1464. [0004] – KRUIS et al. Aliment. Pharmacol. Ther. 1997. vol. 11. 853–858. [0004] – REMBACKEN et al. Lancet, 1999. vol. 354. 635–639. [0004] – VENTURI et al. Aliment. Pharmacol. Ther. 1999. vol. 13. 1103–1108. [0004] – ISHIKAWA et al. Gastroenterology, 2300. vol. 118. 4171. [0004] – MAUPAS et al. Med. Chit. Dig. 1983. vol. 12. 77–79. [0005] – HENTSCHEL et al. Gastroenterology, 1997. vol. 112. (1). A146 [0005] – NOBAEK et al. Am. J. Gastroenterol. 2000. vol. 95. 1231–1238. [0005] – O’ SULLIVAN et al. Dig. Liver Dis. 2000. vol. 32. 294–301. [0005] – DE ROISSARD: LUQUET. Bactéries lactiques. Aspects fondamentaux et technologiques. 1998. vol. I [0008] – WOLF et al. Int. J. Food Microbiol. 1990. vol. 10. 323–329. [0008] – WITTHOFT et al. Am. J. Psysiol., 1998. vol. 275. G564–571. [0009] – ALICAN; KUBES. Am. J. Physiol., 1996. vol. 270. G225–237. [0009] – TEPPERMAN et al. J. Pharmacol Exp. Ther. 1994. vol. 271. 1477–1482. [0009] – MAC NAUGHTON et al. Life Sci. 1989. vol. 45. 1869–1876. [0010] – KITAGAWA et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1990. vol. 253, 1133–1137. [0010] – LOPEZ–BELMONTE et al. Br. J. Pharmacol., 1993. vol. 108, 73–78. [0010] – KORHONEH et al. Inflammotion. 2001. vol. 25. 223–232. [0011]

1

HU 003 269 T2

2

– WALLACE et al. Gastroenterology. 1992. vol. 102. 18–27. [0043] – MORTEAU et al. Dig. Dis. Sci. 1994. vol. 39. 1239–1248. [0059]

– MORRIS et al. Gastroenterology. 1989. vol. 96. 795–803. [0025] – BRADLEY el al. J. Invest. Dermatol. 1982. vol. 78. 206–209. [0031]

SZEKVENCIALISTA <110> ASSISTANCE PUBLIQUE/HOPITAUX DE PARIS <120> PROCEDE DE DETECTION IN VITRO DES CANCERS PAR LA MISE EN EVIDENCE DE DESEQUILIBRES ALLELIQUES DE MARQUEURS D’INSERTION-DELETION. <130> B5162A_AD/DBE/CAL <140> PCT/FR03/00609 <141> 2003–02–25 <150> FR 0202380 <151> 2002–02–25 <160> 134 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 25 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> A mesterséges szekvencia leírása: primer <400> 1

aagaggtctc tgggcgctca cactt

25

<210> 2 <211> 28 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> A mesterséges szekvencia leírása: primer <400> 2

aagtactgag catcaggact gtatgggg

28


ccacaggtgt gcccatacag acatt

25

17

HU 003 269 T2


caggtgaact gggtacgcac actca

25


tgtatcagag gcaataattt ccaaagcaga

30


cgatcccaga cactgaagat gaaataagtc

30


ggctgttgac tgcactggga tttaga

26


tcattaactc tcagactgac ctgggagc

28

18

HU 003 269 T2


tatgtgtggc agtgaagaga acaggtcttt

30


gggctatctt aagaaatatg aatactttgg ct

32


taatggtaaa caatattttc agccactttg ga

32


cggatgggtg ggtatatttt attttcca

28


aagagcctct gtttatgtgg attgtggc

28

19

HU 003 269 T2


tcttggtaaa ttgccatttt tcataaaaca a

31


gcttgctatc acggtgtatt gggcat

26


tgtcagaagg ggttagtgct agtgtttga

29


aacttgcctg cattgtacat cattccta

28


ggggatgtta ttatttctga agttggcg

28

20

HU 003 269 T2


cattgtggtt acattagggg aaggca

26


ccccgacagt tgtgatgtgt tcgt

24


tgtttgagtg ccttataagt tctggttttc a

31


cagatgtagc tttaggcatt cttttttctt gt

32


atatgttcac tggctaaact atgtgtatcc ca

32

21

HU 003 269 T2


cctgtttttg tagagccctc aagttaagaa

30


accattggga atatgttaaa gaaattggct

30


cagaaaacat ctcatttttg accagctaca

30


aaggtatgag gagagcagat gcaaaaag

28


gcatgacaaa aatcactggg tggtc

25

22

HU 003 269 T2


aatggaaaag tatttggtgt tttttgaatg tc

32


gcctgacaaa ggtgaaactc agttgaaa

28


gaaaagctac atcccagtgc tgaagg

26


atttaaggcc accagattgt gaggaaac

28


actttcacta acaagccctt aaaccgaaaa

30

23

HU 003 269 T2


tgccccattg tacaccaaag aatgttaata

30


atttctttca ttaaggctgg ggaggc

26


ggccacctct gaggatctga gcttta

26


acttttattg gcacaggcat tc

22


gagttgtttc tgacccactg atctc

25

24

HU 003 269 T2


tcaaataaga gttgtcatat cctgct

26


tgaatatgtg tggcagtgaa ga

22


tgtatggggc tggctttag

19


gcctctgaag aggtctctgg

20


tgtgatcaat tccaactgct g

21

25

HU 003 269 T2


aaggcttaaa ggaaatcacg tc

22


ttcttgcagg catgaagcta

20


ctcaaccccc ttctccatag

20


ttttcggatg ggtgggtat

19


aacaatattt tcagccactt tgg

23

26

HU 003 269 T2


agacaccaaa gagcctctgt tta

23


cttctcacta aattatgtct tggtaaattg

30


caatacccag caaaggatat gg

22


gcatctgtac atagtaagcc taccg

25


ctttttcaaa tgctgcttgc

20

27

HU 003 269 T2


cagaaggggt tagtgctagt gtt

23


gtgccatttt gattcccatt

20


ggcattccag aaccaaaag

19


gacctaaaat tgcggtcatt tc

22


gaaaatgcag gcctttcatc a

21

28

HU 003 269 T2


agttggcgcc agaaatga

18


atacaagagt ccaaggtagc cagt

24


ggtaggcatg tagaaatacg gttc

24


ccaggatagc attcaacagt ttg

23


ccactcactt tcttgcatgg

20

29

HU 003 269 T2


cccgacagtt gtgatgtgtt

20


tgtgttgttg ctttgcctct

20


cattcccacg gttagctgtt

20


ttgtgtctgc ctgtagttca atg

23

<210> 68 <211> 26 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Description de la séquence artificielle: armoce <400> 68

gtgattaaac ttgtatttcc tgaaca

26

30

HU 003 269 T2

<210> 69 <211> 24 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Description de la séquence artificielle: armoce <400> 69

tcttaggaaa agctacatcc cagt

24


tttaaggcca ccagattgtg a

21


gctatgttca gaaaatgcat ctcactc

27


tgatgtgtga cagccaatga a

21


gctagatggt cctgtgtcat tg

22

31

HU 003 269 T2


gtgattaatg tgaacttcca gtgc

24


ttgctgtggc tctaggttgc

20


tcggcagtta atgacagtga tg

22


ggggatgaca atgaatatga tg

22


tggcataaca cttagcaagc a

21

32

HU 003 269 T2


tcagagacaa ggtcgctgct

20


tttcttcata gctactccac cactg

25


agcttcggag aatctatcaa atagc

25


gaacgggtaa aatggcaatg

20


aaaccagcca gttttcctga

20

33

HU 003 269 T2


gtactgggta ggtaatacgc tgaga

25


gccaattact ttgcctctcc

20


acgggacaag tctgtttggt

20


caaaagatgg aggctaatat gttga

25


aatagtccat tagcaaatcc ttca

24

34

HU 003 269 T2


gcagcttcca actggttctt

20


ggctaaccca gtgagtccaa

20


ctgctgcaga ttgaaccaa

19


aacagcatcg ctttagatac tagg

24


gccctgagcc tttcaaatc

19

35

HU 003 269 T2


tggaacctca gtcacaccta ag

22


tgtttcagga ctgagcacga

20


caggaggtgt ggccagttt

19


atcctcccca ctgaacctc

19


gcccctcttc tgctggttat

20

36

HU 003 269 T2


cggggcggac aactaatg

18


caaacaggac tgaatgaaaa caaca

25


agccacttga attacctgga a

21


tcttgggaaa tcgcctctc

19


cgtaaatgga ggttaaatgg cttc

24

37

HU 003 269 T2


ctccgcactt atgctgcaa

19


cccgtttaca cctgctgagt

20


cctggggagt ctaggtaaga tg

22


agtgagccaa aatggactaa gg

22


tagggcctgt ctgactccaa

20

38

HU 003 269 T2


atttccctcc caaccctgt

19


gatcaaattg aaggacatga gaga

24


ctttctcttc ccatcttcac ttg

23


gcatgcttaa ggactgtgaa a

21


agaagagtga acgtattgac atgag

25

39

HU 003 269 T2


gcttacgggt tttcctcca

19


ggaatacagc atactcaaat aaagg

25


ccctgtgctt aatgtctgca a

21


atgatgtggt acctctgtca cc

22


tactcttcca ggcactgata gg

22

40

HU 003 269 T2


atcacagcgg tgaagcaaag

20


ctttggtcag tagggatcca ttt

23


tgggtgtctg aaatgttaat tgagc

25


gggtgagttc cagcgtttct

20


gatattaaac aagtagcatc agacacaa

28

41

HU 003 269 T2


tagtatgcag tggctgttga ga

22


agtggctccc tgtgtctga

19


aatgagcttc gttctttgga c

21


ctcaacatct ggacggagca

20


aatggagtgt gtacttgtag agagtga

27

42

HU 003 269 T2


acgcctggcc tgaaagtatt

20


gtctgacatc gccctcgtag

20


agaagcagaa tggggatgaa

20


ggagtaatag attctggcat gtg

23


tgaactaaag gtgggcagtg

20

43

1

HU 003 269 T2

2


caatgaagca tttgacaacg tc

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás biológiai mintákban található tumorsejtek detektálására allélikus egyensúlyhiány jelenlétének legalább tizenöt, elõnyösen legalább harminc kromoszomális inszerciós/deléciós markerben történõ kimutatásával, amely eljárás legalább az alábbi lépéseket tartalmazza: a) a markerek kvantitatív multiplex amplifikálását; b) minden egyes marker két alléljához tartozó amplifikációs szignálnak megfelelõ két csúcs magassága R arányának a kiszámítását; c) a markerek összességére vonatkozó globális statisztikai pontérték kiszámítását, amelyek khi-négyzet törvény szerint oszlanak el, ahol a szabadságfok megegyezik a vizsgált markerek számával, és amely globális pontértéket az alábbi képlet szerint számítjuk ki: Pontérték=Sdi2=S{[LnRi–m(LnRf)]¸(LnRf)}2, ahol: – di egy adott i markerre vonatkozó, kiszámított statisztikai távolságot jelöl; – Ri minden egyes marker esetében a két csúcs magasságának a biológiai mintából kiszámított arányát jelöli; – Rf minden egyes marker esetében a két csúcs magasságának referenciamintából kiszámított arányát jelöli; – m(LnRf) az LnRf értékek átlagának felel meg; és – s(LnRf) az LnRf értékek szórásának felel meg; és d) a pontérték összehasonlítását a rögzített normalitási küszöbbel, amely küszöb felett a biológiai mintát patológiás mintának tekintjük, és amely normalitási küszöb megfelel egy választott a elsõfajú kockázatértékhez tartozó khi-négyzet-értéknek és a vizsgált markerek számának. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, amelyben az Rf referenciaarány adott markerek két alléljához tartozó csúcsok magassága arányának az átlaga, amely arányokat legalább harminc egészséges referenciamintából kaptunk. 3. Eljárás tumorsejtek detektálására biológiai mintából legalább tizenöt, elõnyösen legalább harminc biallélikus kromoszomális inszerciós/deléciós marker allélikus egyensúlyhiányának a kimutatásával, amely eljárás legalább az alábbi lépéseket tartalmazza:

22

15 a) a markerek kvantitatív multiplex amplifikálását; b) minden egyes marker két alléljához tartozó amplifikációs szignálnak megfelelõ két csúcs magassága R arányának a kiszámítását; c) minden egyes i marker esetében di egyedi távolság 20 kiszámítását, az alábbi képlet alkalmazásával: di=[LnRi–m(LnRf)]¸(LnRf), ahol: Ri minden egyes marker esetében a két csúcs magasságának a biológiai mintából kiszámított arányát 25 jelöli; Rf minden egyes marker esetében a két csúcs magasságának referenciamintából kiszámított arányát jelöli; m(LnRf) az LnRf értékek átlagának felel meg; és 30 s(LnRf) az LnRf értékek szórásának felel meg; és d) di távolság értékének összehasonlítását a választott a elsõfajú hibának megfelelõ (1–a) konfidenciaintervallummal. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 35 hogy a konfidenciaintervallumot az alábbi képlet határozza meg: m(LnRf)±[3×s(LnRf)], ahol: Rf minden egyes marker esetében a két csúcs ma40 gasságának referenciamintából kiszámított arányát jelöli; m(LnRf) az LnRf értékek átlagának felel meg; és s(LnRf) az LnRf értékek szórásának felel meg. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 45 azzal jellemezve, hogy az a) amplifikációs lépést két párhuzamossal végezzük. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, amelyben a b) lépés két R arány kiszámítását tartalmazza, amely arányok megfelelnek az a) lépésben végzett amplifikációs 50 reakciónak. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tumorsejtek detektálásának a specificitását a választott értéke határozza meg. 8. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 55 amely alkalmazható húgyhólyag tumorjainak detektálására, ahol a biológiai minta a vizeletbõl származik és a referenciaminta a vérbõl származik. 9. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépésben specifikus amp60 lifikálásra alkalmazott legalább egy primerpár az 44

1

HU 003 269 T2

1–134. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciák közül kettesével választott primerekbõl áll olyan módon, hogy minden pár egy n azonosító számú szekvencia szerinti és egy n+1 azonosító számú szekvencia szerinti primerbõl áll, ahol n 1 és 133 közötti páratlan egész számot jelent.

5

45

2

10. Az 1–134. azonosító számú szekvenciák szerinti kromoszomális inszerciós/deléciós markerek közül választott specifikus amplifikációs primerek alkalmazása az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás elvégzéséhez.

HU 003 269 T2 Int. Cl.: C12Q 1/68

46

HU 003 269 T2 Int. Cl.: C12Q 1/68

47

HU 003 269 T2 Int. Cl.: C12Q 1/68

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Törõcsik Zsuzsanna fõosztályvezetõ-helyettes Windor Bt., Budapest

(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Recommend Documents