!HU000003191T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 003 191
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 819263 (22) A bejelentés napja: 2004. 11. 26. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040819263 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1699916 A1 2005. 06. 09. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1699916 B1 2008. 01. 16.
(51) Int. Cl.: C12N 5/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05052136 PCT/EP 04/053133
(30) Elsõbbségi adatok: 20030104440 2003. 11. 28. 20030526414P 2003. 12. 02.
(73) Jogosult: Ares Trading S. A., Aubonne (CH)
EP US
(72) Feltalálók: Bernard, Alain, Ville-la-Grand (FR); Papp, Frédéric, Les Evouettes (CH) (54)
(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest
Eljárás lehorganyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozók újrahasznosítására
(57) Kivonat
HU 003 191 T2
Elõnyösen a találmány tárgya eljárás lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozók, mint például mikrohordozók és Fibra–Cel® korongok újrahasznosítására. A találmány szerinti eljárással újrahasznosított szilárd hordozók a nem újrahasznosított
szilárd hordozókkal elért termelési szinttel összehasonlítható fehérjetermelési szint elérését teszik lehetõvé. Az eljárás tartalmazza a következõ lépéseket: öblítés vízzel, öblítés nátrium-hidroxid-oldattal és második öblítés vízzel.
A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 3 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 003 191 T2
A találmány tárgyát ipari fehérjetermelésre szolgáló eljárás képezi. Elõnyösen a találmány tárgya eljárás lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozók, mint például mikrohordozók és Fibra–Cel® korongok újrahasznosítására. A találmány szerinti eljárással újrahasznosított szilárd hordozók a nem újrahasznosított szilárd hordozókkal elért termelési szinttel összehasonlítható fehérjetermelési szint elérését teszik lehetõvé. Az emlõseredetû expressziós rendszerekben termelt terápiás fehérjék iránt egyre növekvõ kereslet az utóbbi 30 évben az in vitro sejttenyésztés, léptéknövelés, expressziós vektorok és tápközegfejlesztés terén jelentõs elõrehaladáshoz vezetett. Míg a közönséges szuszpenziós tenyészetek bizonyos emlõseredetû sejtvonalak szaporítására alkalmasak, léteznek olyan sejtek is, amelyek lehorgonyzástól függenek, és szilárd felszínre van szükségük a proliferációhoz, tápanyaglebontáshoz és biomolekulák termeléséhez. E sejtek kis léptékû szaporításának hagyományos módjában Petri-csészéket, flaskákat és forgóedényeket alkalmaznak. A hely és mûködtetési hatékonyságot illetõen a terület/térfogat arányt tekintve nagy felületû, töltött ágyas („packed bed”) bioreaktorok kifejlesztésére már eddig is számos megközelítés történt. Egy másik megközelítésben sejteket tenyésztenek bioreaktorhoz csatlakoztatott, oszlop alakú tartály belsejében lévõ töltõanyagon [Wang és munkatársai (1992)]. A bioreaktorrendszerekben a szilárd hordozók, mint például mikrohordozók vagy Fibra–Cel® korongok alkalmazása megnöveli a lehorgonyzástól függõ sejtek számára elérhetõ, egy térfogategységre esõ szaporodási területet, és kielégítõ fehérjeproduktivitást eredményez. Így a mikrohordozókat és Fibra–Cel® korongokat rutinszerûen alkalmazzák állati sejtek tenyésztésében a lehorgonyzástól függõ sejtek szaporítására, és ezek a hordozók a fehérjék ipari termelésében bevett technológiai felületek között vannak számon tartva [lásd például Buck és Loh (1985); Bohak és munkatársai (1987); Petti és munkatársai (1994); Ikonomou és munkatársai (2002)]. A mikrohordozók olyan, kisméretû szilárd részecskék, amelyeken a fehérjék szuszpenziós tenyészetben szaporíthatók. A mikrohordozók felszínén a sejtek képesek megtapadni és szaporodni. A mikrohordozók jellemzõen 90 mm és 300 mm közötti átmérõjû gyöngyökbõl állnak. Mikrohordozók különféle, sejtkitapadás és ¹szaporodás szempontjából alkalmasnak bizonyult anyagokból – mint amilyen például az üveg, polisztirol, polietilén, dextrán, zselatin és cellulóz – készülhetnek. Ezenfelül a mikrohordozók felszíne bevonható a sejtek kitapadását és szaporodását elõsegítõ anyaggal, mint például N,N-dietil-amino-etil, üveg, kollagén vagy rekombináns fehérjék. Makroporózus és nem porózus mikrohordozók egyaránt léteznek. A makroporózus felszínek lehetõvé teszik, hogy inokulációt követõen a sejtek könnyen elérjék a mikrohordozók belsejét, és a mikrohordozó belsejébe jutva a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
sejtek a bioreaktorban generált mechanikai keverés és a légbevezetés okozta nyíróerõktõl védve vannak. Az EP–A–0097907 számú európai közzétételi irat mikrohordozók újrahasznosítására szolgáló eljárást ismertet, amelyben (i) kollagénoldat alkalmazásával neutralizálást végeznek; (ii) sóoldattal intenzív mosást; és (iii) hõkezelést végeznek. A Fibra–Cel® korongok 6 mm átmérõjû, polipropilénszitához kötött, nemszõtt, poliészterrostból álló korongok [lásd például US 5.266.476 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; és az nbsc.com/products/miscellaneous/fibracel/, illetve nbsc.com/support/faqs/#fibra oldalakat a világhálón]. A Fibra–Cel® korongokat rendszerint elektrosztatikusan kezelik azért, hogy elõsegítsék a szuszpenziós sejteknek a korongokhoz való kitapadását és a rostrendszeren belüli csapdába esését (ahol azután a sejtek a tenyésztési eljárás során ott is maradnak). A mikrohordozókon szaporított sejtekkel összehasonlítva a Fibra–Cel® korongokon szaporított sejtekkel elért sejtsûrûség és produktivitás akár tízszer magasabb is lehet. Jelenleg a Fibra–Cel® korongokat nem alkalmazzák újra. Azonban az egyes fehérjetermelési fázisok esetében az új szilárd hordozók alkalmazása igen költséges. Ezenfelül az egyes fehérjetermelési fázisokat követõen a szilárd hordozó cseréje idõigényes folyamat. Eszerint szükség van a lehorgonyzást igénylõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozók in situ újrahasznosítására szolgáló eljárásra, amely eljárás az újra nem hasznosított hordozókkal elért fehérjeproduktivitási szinttel összevethetõ fehérjeproduktivitás fenntartását teszi lehetõvé. Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást. A találmány tárgyát lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozók in situ újrahasznosítására irányuló eljárások képezik. A találmány szerinti eljárások az újra nem hasznosított hordozókkal elért fehérjeproduktivitási szinttel összevethetõ fehérjeproduktivitás fenntartását teszik lehetõvé. A találmány szerinti eljárások költség és általános hatékonyság tekintetében egyaránt javítják a fehérje-elõállítás folyamatát. Eszerint a találmány elsõ szempontja egy sejttenyésztõ rendszeren belül, a lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozó újrahasznosítására szolgáló eljárásra irányul, amely a következõ lépésekbõl áll: a) a rendszerbõl a folyadékot kiürítjük; b) a rendszert vizes oldattal öblítjük; c) a rendszert nátrium-hidroxid-oldattal öblítjük; és b) a rendszert vizes oldattal öblítjük. A találmány második szempontja szerint a találmány tárgyát a találmány szerinti eljárással újrahasznosított, a lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozó képezi. A találmány harmadik szempontja szerint a találmány tárgya a találmány szerinti eljárás szerint újra-
1
HU 003 191 T2
hasznosított szilárd hordozó alkalmazása sejtek tenyésztésére. Az alábbiakban röviden ismertetjük a találmányhoz tartozó ábrákat. A 1. ábra a nem újrahasznosított Fibra–Cel®-lel (szürke pontok), illetve a találmány szerinti eljárással újrahasznosított Fibra–Cel® alkalmazásával tenyésztett sejtek esetében kapott fehérjeproduktivitási méréseket (fekete háromszögek) hasonlítja össze. A 2. ábra a nem újrahasznosított Fibra–Cel®-lel (szürke pontok), illetve a találmány szerinti eljárással újrahasznosított Fibra–Cel® alkalmazásával tenyésztett sejtek esetében kapott glükózfelhasználási rátákat (fekete háromszögek) hasonlítja össze. A 3. ábra a találmány szerinti eljárás elvégzésére alkalmas sejttenyésztõ rendszert mutat be. Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmány szerinti megoldást. A találmány a lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozók in situ újrahasznosítására szolgáló eljárás felismerésén alapul. Ahogyan a 3. példa bemutatja, az eljárás lehetõvé teszi, hogy az újrahasznosított hordozókkal a nem újrahasznosított szilárd hordozókkal elért termelési szinttel összehasonlítható fehérjetermelési szintet lehessen fenntartani. A találmány a sejttenyésztõ rendszeren belül, a lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozó újrahasznosítására szolgáló eljárásra irányul, amely a következõ lépésekbõl áll: a) a folyadékot kiürítjük a rendszerbõl; b) a rendszert vizes oldattal öblítjük; c) a rendszert nátrium-hidroxid-oldattal öblítjük; és b) a rendszert vizes oldattal öblítjük. A leírás szerinti értelemben az „ismételt alkalmazás” és „újrahasznosítás” kifejezéseket szinonimnak tekintjük, és a leírásban egymással felcserélhetõen alkalmazhatók. A leírás szerinti értelemben az „öblítés” kifejezés a következõ lépésekbõl álló eljárást jelenti: (i) folyadékkal töltünk fel egy eszközt; (ii) a folyadékot az eszközben inkubáljuk; és (iii) az eszközbõl kiürítjük a folyadékot. Elõnyös, ha a (ii) lépés során a folyadék az eszközben kering. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja olyan, a lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozó újrahasznosítására szolgáló eljárásra irányul, amelyben a vizes oldat víz. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módja olyan, a lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozó újrahasznosítására szolgáló eljárásra irányul, amelyben a nátrium-hidroxid-oldat nátrium-hidroxid-koncentrációja körülbelül 1%¹tól a körülbelül 3%¹ig terjedõ tartományba esik. Elõnyös, ha a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
koncentráció nátrium-hidroxidra nézve a körülbelül 1,5%-tól a körülbelül 2,5%¹ig terjed. Legelõnyösebben a koncentráció nátrium-hidroxidra nézve körülbelül 2%. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módjában a találmány olyan, a lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozó újrahasznosítására szolgáló eljárásra irányul, amelyben a (c) lépést úgy végezzük el, hogy a rendszert a kívánt nátrium-hidroxid-koncentrációjú nátrium-hidroxid-oldattal töltjük fel. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módjában a (c) lépést úgy végezzük el, hogy a rendszert vízzel töltjük fel, és a rendszeren belül kívánatos nátrium-hidroxid-koncentráció eléréséhez koncentrált nátrium-hidroxid-oldatot adunk hozzá. Elõnyösen a kívánt nátrium-hidroxid-koncentráció a körülbelül 1%¹tól körülbelül 3%¹ig terjedõ tartományba esik. Elõnyösebben a kívánt nátrium-hidroxid-koncentráció a körülbelül 1,5%-tól a körülbelül 2,5%¹ig terjedõ tartományba esik. Legelõnyösebben a kívánt nátrium-hidroxid-koncentráció körülbelül 2%¹os nátrium-hidroxid. Egy másik elõnyös megvalósítási mód a találmány szerinti, lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozók újrahasznosítására szolgáló eljárásra irányul, amelyben a (d) lépést legalább kétszer végezzük el. Elõnyösen a (d) lépést legalább háromszor végezzük el. Elõnyösebben a (d) lépést háromszor végezzük el. Legelõnyösebben a (d) lépést ötször végezzük el. A találmány egyik megvalósítási módja a lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozók újrahasznosításának fenti eljárására irányul, amelyben a (b) lépés szerinti vizes oldat injektálásra szolgáló víz [Water For Injection (WFI)]. Alternatív lehetõségként a (b) lépést akár tisztított vízzel is végezhetjük. A találmány egy másik megvalósítási módja a lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozók újrahasznosításának fenti eljárására irányul, amelyben a (d) lépés szerinti vizes oldat injektálásra szolgáló víz [Water For Injection (WFI)]. Alternatív lehetõségként a (d) lépést tisztított vízzel végezzük. Legelõnyösebb, ha a (d) lépést legalább kétszer végezzük el, akkor az utolsó öblítés kivételével minden öblítést tisztított vízzel végzünk, az utolsó öblítést pedig injektálásra szolgáló vízzel hajtjuk végre. A leírás szerinti értelemben a „tisztított víz [Purified Water (PW)]” és az „injektálásra szolgáló víz [Water For Injection (WFI)]” kifejezéseket a szakember jól ismeri. Például az US Pharmacopeia (USP, Amerikai Gyógyszerészeti Kézikönyv) és a European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (EMEA, A Gyógyászati Termékeket Értékelõ Európai Ügynökség) ismerteti a PW és WFI standardjait, bakteriológiai tisztaságukra és kémiai minõségükre vonatkozó ajánlásait. A leírás szerinti értelemben a „lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozó” kifejezés a hatékony proliferáció, tápanyaglebontás és/vagy fehérjetermelés céljából valamilyen szilárd felszínhez történõ kitapadást igénylõ sejtek tenyésztésére szolgáló anyagot jelent.
1
HU 003 191 T2
A találmány egyik megvalósítási módjában a lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozó például porózus hordozólaphoz kötött, nemszõtt, szálas mátrixból készül. Ilyen hordozók készülhetnek az US 5.266.476 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban leírtak szerint. Elõnyösen a kérdéses hordozók fiziológiailag elfogadható szálak háromdimenziós hálózatából álló, lap formájú mátrixot tartalmaznak, amelynek pórustérfogata a teljes térfogat 40–95%¹a, pórusmérete 10–100 mikron, a mátrix teljes magassága pedig 50–500 mikron közötti. A mátrix készülhet például a következõk közül választottakból: lapos, nem hengeres és üres szálakból, és azok keverékébõl, a szálak átmérõje vagy szélessége 0,5–50 mikron közötti. Alternatív lehetõségként a mátrixanyaga készülhet a következõk közül választottakból: poliészterek, polialkilének, polifluorokloroetilének, poli(vinilklorid), polisztirol, poliszulfon, cellulóz-acetát, üvegszálak és inert fémszálak. A hordozó alakja lehet például a következõk közül választott: négyzetek, gyûrûk, korongok, és lehet kereszt alakú is. Elõnyösebben a mátrix nemszõtt poliészterbõl áll, a hordozó pedig olyan, polipropilénbõl készült lap alakú szita, amelyen körülbelül egy négyzetmilliméter területû, lényegében négyzet alakú szitanyílások vannak. A találmány egy igen elõnyös megvalósítási módjában a szilárd hordozó polipropilén szitalaphoz kötött, nemszõtt poliészterbõl készült korong. Ilyen hordozók Fibra–Cel® korongok néven (New Brunswick Scientific) kerültek forgalomba. A találmány egy másik megvalósítási módjában a lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozó valamilyen mikrohordozó. A technikában számos mikrohordozó ismert, és ezek kereskedelmi forgalomban elérhetõk. A mikrohordozók készülhetnek például a következõ anyagok bármelyikébõl: poliészter (például BioNOCII™), polisztirén (például Biosilon®, Nunc; 2D MicroHex®. Nunc; SoloHill’s mikrohordozók), szilikával nehezített polietilén (például Cytoline®, Amersham), üveg (például G–2892, Sigma), zselatin (például Cultispher®, Hyclone), cellulóz (például Cytopore®, Amersham) és dextrán (például Cytodex®, Amersham). Ezenfelül a mikrohordozót bevonattal is el lehet látni. A mikrohordozót például be lehet vonni a következõ anyagok bármelyikével: üveg (például SoloHill üvegbevonatú mikrohordozók), N,N-dietil-aminoetil (például Cytodex®1, Amersham), kollagén (például Cytodex®3, Amersham) és rekombináns fehérjék (például ProNectin®, SoloHill). A találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában a mikrohordozó makroporózus mikrohordozó, mint például Cytopore® vagy Cultispher®. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módjában a mikrohordozó nem porózus hordozó, mint például üveggyöngyök, Cytodex®, Biosilon® vagy 2D MicroHex®. A leírás szerinti értelemben a „sejttenyésztésre szolgáló rendszer” kifejezés azt az eszközt vagy több összekapcsolt eszközt jelenti, amelyben a sejtek tenyésztése folyik. A találmány egyik megvalósítási módjában az ilyen rendszer bioreaktorból áll. A „bioreaktor” kifejezés
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
olyan berendezést vagy zárt tartályt jelent, amelyet egy adott sejt szintetikus vagy kémiai átalakító kapacitásának felhasználásával biomolekulák – mint például szekretált fehérjék – elõállítására alkalmazunk. Bioreaktorok közé tartoznak klasszikus fermentorok és perfúziós sejttenyésztõ rendszerek. A bioreaktorok lehetõvé teszik, hogy a sejttenyésztõ folyamat során különféle paramétereket – mint például a cirkulációs hurok áramlását, a hõmérsékletet, a túlnyomást és/vagy a tápoldat perfúziós rátáját – szabályozni lehessen. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában a sejt tenyésztésére szolgáló rendszert úgy terveztük, hogy az a bioreaktorban töltött ágyas mikrohordozókat vagy Fibra–Cel® korongokat tartalmazzon. Jellemzõen az ilyen bioreaktorok belsõ oszlopot tartalmaznak, és ebben található a lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozó. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában a sejt tenyésztésére szolgáló rendszer a bioreaktorhoz csatlakoztatott külsõ oszlopot is tartalmaz. A találmány e megvalósítási módjában a bioreaktort tápoldatot kondicionáló tartályként alkalmazzuk, míg a sejtek a külsõ oszlopban növekednek és szaporodnak. Ilyen, külsõ oszlopot tartalmazó rendszereket például az 1.1 példában és/vagy a Wang és munkatársai közleményében (1992) leírtak szerint lehet tervezni. Elõnyös, ha a külsõ oszlop és a bioreaktor közötti csatlakozás keringetõpumpát tartalmaz. A lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozó lehet a bioreaktoron belül vagy a külsõ oszlop belsejében. Amennyiben külsõ oszlopot tartalmazó sejttenyésztõ rendszer alkalmazására kerül sor, elõnyös, ha a szilárd hordozó a külsõ oszlopon belül helyezkedik el. Amennyiben külsõ oszlop nélküli sejttenyésztõ rendszer alkalmazására kerül sor, elõnyös, ha a rendszerben van belsõ oszlopot tartalmazó reaktor, amely oszlopon belül helyezkedik el a szilárd hordozó. A találmány legelõnyösebb megvalósítási módjában a sejttenyésztõ rendszer tartalmaz bioreaktorhoz kapcsolt külsõ oszlopot, ahol a lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozó a külsõ oszlopban van, és ahol a külsõ oszlop és a bioreaktor közötti csatlakozás keringetõpumpát tartalmaz. Ilyen rendszert ábrázol a 3. ábra. A találmány oltalmi körén belül az ilyen rendszerek különösen elõnyösek, mivel az ilyen rendszerek alkalmazása lehetõvé teszi a mosófolyadék hatékony keringetését a töltött ágyas („packed bed”) külsõ oszlopon keresztül. A találmány egy másik legelõnyösebb megvalósítási módjában a sejttenyésztõ rendszer belsõ oszlopot tartalmazó bioreaktort tartalmaz, amelyben a lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozó a belsõ oszlopban van. A találmány egyik megvalósítási módjában a sejttenyésztõ rendszer sterilizálása a (d) lépés elvégzése után történik. Amennyiben külsõ oszlopot tartalmazó sejttenyésztõ rendszer alkalmazására kerül sor, a (d) lépés elvégzése után a külsõ oszlop eltávolítható a rendszerbõl.
1
HU 003 191 T2
Eszerint a találmány egy másik megvalósítási módjában a külsõ oszlopot a (d) lépés elvégzése után sterilizáljuk. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a (d) lépést a körülbelül 500 l. h–1.kg–1 és körülbelül 700 l. h–1.kg–1 közötti tartományba esõ keringetési hurokáramlással („circulation loop flow”) végezzük. Elõnyös, ha a keringetési hurokáramlás a körülbelül 550 l. h–1.kg–1 és a körülbelül 650 l. h–1.kg–1 közötti tartományba esik. A legelõnyösebb keringetési hurokáramlás körülbelül 583 l. h–1.kg–1. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módjában a (d) lépést szobahõmérsékleten végezzük. Jellemzõ, hogy a szobahõmérséklet a körülbelül 15 °C és a körülbelül 30 °C közötti tartományba esik. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módjában a (d) lépést a következõ csoportból választott tartományba esõ túlnyomás alatt végezzük: (i) körülbelül 100 millibartól körülbelül 900 millibarig, (ii) körülbelül 200 millibartól körülbelül 800 millibarig, (iii) körülbelül 300 millibartól körülbelül 700 millibarig, és (iv) körülbelül 400 millibartól körülbelül 600 millibarig. Elõnyös a körülbelül 500 millibaros túlnyomás. Alternatív lehetõségként a (d) lépést körülbelül 100 millibartól körülbelül 300 millibarig, vagy körülbelül 150 millibartól körülbelül 250 millibarig terjedõ tartományba esõ túlnyomás alatt végezhetjük. A (d) lépés például körülbelül 200 millibaros túlnyomás alatt végezhetõ. A találmány további elõnyös megvalósítási módjában a (d) lépést körülbelül 5 perctõl körülbelül 30 percig terjedõ idõtartamig végezzük. Elõnyös, ha az idõtartam hossza a körülbelül 5 perctõl körülbelül 20 percig terjedõ tartományba esik. Legelõnyösebb, ha az idõtartam körülbelül 10 perc. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módjában a (c) lépést a körülbelül 500 l. h–1.kg–1 és a körülbelül 700 l. h–1.kg–1 közötti tartományba esõ keringetési hurokáramlással végezzük. Elõnyös, ha a keringetési hurokáramlás a körülbelül 550 l. h–1.kg–1 és a körülbelül 650 l. h–1.kg–1 közötti tartományba esik. A legelõnyösebb keringetési hurokáramlás körülbelül 583 l. h–1.kg–1. Elõnyös, ha a (c) lépést körülbelül 20 perctõl körülbelül 40 percig terjedõ idõtartamig végezzük. Elõnyösebb, ha az idõtartam hossza a körülbelül 25 perctõl körülbelül 35 percig terjedõ tartományba esik. Legelõnyösebb idõtartam körülbelül 30 perc. Alternatív lehetõségként a (c) lépést úgy is el lehet végezni, hogy a keringetési hurokáramlást beállítjuk egy körülbelül 100 l. h–1.kg–1 és körülbelül 300 l. h–1.kg–1 közötti tartományba esõ vagy körülbelül 150 l. h–1.kg–1 és körülbelül 250 l. h–1.kg–1 közötti tartományba esõ kiindulási értékre, és a keringetési hurokáramlást progresszíven növeljük egy körülbelül 500 l. h–1.kg–1 és körülbelül 700 l. h–1.kg–1 közötti tartományba esõ vagy körülbelül 550 l. h–1.kg–1 és körülbelül 650 l. h–1.kg–1 közötti tartományba esõ végsõ értékre
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
vagy 583 l. h–1.kg–1 végsõ értékre. Azután a keringetési hurokáramlást körülbelül 20 perctõl körülbelül 40 percig terjedõ idõtartamig a végsõ értéken tartjuk. Elõnyösebb, ha az idõtartam hossza a körülbelül 25 perctõl körülbelül 35 percig terjedõ tartományba esik. Legelõnyösebb idõtartam körülbelül 30 perc. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módjában a (c) lépést körülbelül 50 °C és körülbelül 70 °C közé esõ hõmérséklet-tartományban végezzük. Elõnyös, ha a hõmérséklet a körülbelül 55 °C és körülbelül 65 °C közötti tartományba esik. Legelõnyösebb a körülbelül 60 °C¹os hõmérséklet. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozó újrahasznosítására irányul, amelyben a (b) lépést körülbelül 50 °C és körülbelül 70 °C közé esõ hõmérséklet-tartományban végezzük. Elõnyös, ha a hõmérséklet a körülbelül 55 °C és körülbelül 65 °C közötti tartományba esik. Legelõnyösebb a körülbelül 60 °C¹os hõmérséklet. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módjában a (b) lépést a következõ csoportból választott tartományba esõ túlnyomás alatt végezzük: (i) körülbelül 100 millibartól a körülbelül 900 millibarig, (ii) körülbelül 200 millibartól a körülbelül 800 millibarig, (iii) körülbelül 300 millibartól a körülbelül 700 millibarig, és (iv) körülbelül 400 millibartól a körülbelül 600 millibarig. Elõnyös a körülbelül 500 millibaros túlnyomás. Alternatív lehetõségként a (b) lépést körülbelül 200 millibartól körülbelül 400 millibarig, vagy körülbelül 250 millibartól körülbelül 350 millibarig terjedõ tartományba esõ túlnyomás alatt végezzük. A túlnyomás lehet például körülbelül 300 millibaros. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módjában a (b) lépést körülbelül 5 perctõl körülbelül 30 percig terjedõ idõtartamig végezzük. Elõnyös, ha az idõtartam hossza a körülbelül 5 perctõl körülbelül 20 percig terjedõ tartományba esik. Legelõnyösebb a körülbelül 10 perces idõtartam. A szakember számos változtatást és/vagy adaptálást végezhet a (b)-tõl a (d)¹ig terjedõ lépésekben említett hõmérsékleten, a túlnyomáson, a keringetési hurokáramláson és az idõtartamon. Például az áramlási sebesség változhat a (i) lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére alkalmazott szilárd hordozó típusától és (ii) a szilárd hordozó porózusságától. Továbbá a (b) és (d) lépéseket nem feltétlenül kötelezõ túlnyomás alatt végezni. Azonban ez egy jó gyakorlati eljárás a kontamináció elkerülésére. Alternatív lehetõségként lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló szilárd hordozók ex situ is újrahasznosíthatók a következõ lépéseket tartalmazó eljárás alkalmazásával: a) eltávolítjuk a szilárd hordozót a sejttenyésztõ rendszerbõl; b) a szilárd hordozót vizes oldattal öblítjük;
1
HU 003 191 T2
c) a szilárd hordozót nátrium-hidroxid-oldattal öblítjük; és b) a szilárd hordozót vizes oldattal öblítjük. A leírásban ismertetünk továbbá a találmány szerinti eljárással újrahasznosított szilárd hordozót, amelyet lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére alkalmazunk. A leírásban ismertetjük továbbá a találmány szerinti eljárással újrahasznosított szilárd hordozó alkalmazását lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére. A sejt lehet például állati, rovar- vagy mikrobiális eredetû. A leírás szerinti értelemben az „állati sejt” kifejezésbe tartoznak emberi és nem emberi emlõseredetû sejtek, nem emlõseredetû sejtek, rekombináns sejtek és hibridómák. A találmány szerinti szilárd hordozó alkalmazásával tenyészthetõ állati sejtek közé tartoznak például 3T3-sejtek, COS-sejtek, emberi osteosarcomasejtek, MRC–5-sejtek, BHK-sejtek, VERO-sejtek, CHO-sejtek, rCHO-tPA-sejtek, rCHO–Hep B felszíni antigénsejtek, HEK293-sejtek, rHEK293-sejtek, rC127Hep B felszíni antigénsejtek, normális emberi fibroblasztsejtek, sztrómasejtek, hepatociták és PER.C6-sejtek. A találmány szerinti szilárd hordozó alkalmazásával tenyészthetõ hibridómák közé tartoznak például DA4.4-sejtek, 123A-sejtek, 127A-sejtek, GAMMA-sejtek és 67–9-B-sejtek. A találmány szerinti szilárd hordozó alkalmazásával tenyészthetõ rovarsejtek közé tartoznak például Lepidopterákból származó sejtek, Tn–368-sejtek, SF9-sejtek, rSF9-sejtek és Hi¹5 sejtek [lásd például Ikonomou és munkatársai (2002)]. A találmány szerinti szilárd hordozó alkalmazásával tenyészthetõ nem emlõseredetû sejtek közé tartoznak például „brown bullhead” sejtvonalak [lásd például Buck és munkatársai (1985)]. A találmány szerinti szilárd hordozó alkalmazásával tenyészthetõ mikroorganizmusok közé tartozik például a Coniothyrium minitans, Kluyveromyces lactis, Phanerochaete chrysosporium, Scedosporium apiospermum, Cephalosporium acremonium és Beauveria bassiapa [lásd Sabu és munkatársai (2002)]. A sejt elõnyösen emlõssejt. Az emlõssejtek tenyésztése a terápiás fehérjék elõállításának jól ismert módja. A találmány szerinti újrahasznosított szilárd hordozó alkalmazásával elõállítható terápiás fehérjék közé tartozik például a choriogonadotropin, follikulusokat serkentõ hormon, lutropin-choriogonadotrop hormon, pajzsmirigyet serkentõ hormon, emberi növekedési hormon, interferonok (például b¹1a interferon, b¹1b interferon), interferonreceptorok (például g¹interferon receptora), p55 és p75 TNF-receptorok, TACI¹Fc fúziós fehérjék, interleukinok (például interleukin–2, interleukin–11), interleukint kötõ fehérjék (például interleukin–18¹at kötõ fehérje), CD11a elleni antitestek, eritropoietin, granulocita kolóniát serkentõ faktor, granulocita-makrofág kolóniát serkentõ faktor, az agyalapi mirigy peptidhormonjai, menopauzális gonadotropin, inzulinszerû növekedési faktorok (például szomatomedin–C), keratinocitaeredetû növekedési faktor, gliasejtvonalból származó neurotróf faktor, thrombomodulin, bázikus fibroblaszteredetû növekedési faktor, inzulin,
2
VIII. Faktor, szomatropin, csonteredetû morfogenetikus protein-2, vérlemezkébõl származó növekedési faktor, hirudin, epoietin, rekombináns LFA–3/lgG1 fúziós fehérje, glükocerebrozidáz és ezek muteinjei, fragmentu5 mai, oldható formái, funkcionális származékai, fúziós fehérjéi. A sejtek lehetnek lehorgonyzástól függõ vagy lehorgonyzástól nem függõ sejtek. Tulajdonképpen a szuszpenziós sejtek is szaporíthatók mikrohordozókon és 10 porózus hordozólaphoz kötött, nemszõtt szálas mátrixból készült hordozókon, mint amilyen például a Fibra–Cel®. Az ilyen hordozón szaporított szuszpenziós sejtek sûrûsége még a szuszpenziós tenyészetekben elérhetõ sûrûségnél is nagyobb. A találmány teljes leírása után a szakember számá15 ra egyértelmû, hogy egyenértékû paraméterek széles tartományában a találmány megvalósítható annak alapgondolatától és oltalmi körétõl való eltérés nélkül, illetve el nem várható mértékû kísérletezés nélkül. 20 Példák 1. példa: Sejttenyésztési eljárás 1.1. Felszerelés Minden kísérletet külsõ oszlophoz csatlakoztatott 25 bioreaktorból álló rendszerrel végeztünk. A bioreaktorok konfigurációja hasonlított a New MBR által gyártott, 40 literes szabadonálló laboratóriumi bioreaktorokhoz (Free-Standing Laboratory Bioreactors). Az alkalma30 zott bioreaktorok és oszlopok térfogatát az alábbi 1. táblázat összegzi. 1. táblázat 35
40
Bioreaktor térfogata
Oszloptérfogat
Fibra–Cel korongok tömege
15 liter
5,5 liter
0,6 kg
40 liter
60–120 liter
6,6–13,2 kg
350 liter
120–240 liter
13,2–26,4 kg
A külsõ oszlopok 316L jelzésû rozsdamentes acélból készültek (Ra=0,6 mm). Az Ra az átlagos felszíni egyenetlenséget írja le, és egy meghatározott értékelé45 si hosszon végzett egyenetlenségi profil abszolút értékének integrálját jelenti: Ra =
1 z (x ) dx l ò0
A külsõ oszlopot Fibra–Cel® korongokkal (New Brunswick Scientific) töltöttük meg a hordozók 1. táblázatban megadott tömegeinek megfelelõen. 1.2. Sejtvonalak és tápoldatok 1.2.1. Sejtvonalak Minden kísérletet a p55 TNF-receptor oldható ext55 racelluláris részének megfelelõ fehérjét (SwissProt katalógusszám: P19438) termelõ CHO-sejtvonallal végeztünk. A termelt, r¹hTBP–1-nek elnevezett fehérje a P19438 SwissProt katalógusszámú fehérje 41–201. 60 aminosavait tartalmazza. 50
6
1
HU 003 191 T2
Az r¹hTBP–1¹et termelõ sejtvonalat úgy állítottuk elõ, hogy CHO-DUKX sejteket r¹hTBP–1¹et kódoló cDNS¹t és megfelelõ expressziós elemeket tartalmazó vektorral transzfektáltunk. Transzfektált klónokat szelektáltunk, és r¹hTBP–1¹et stabilan expresszáló sejtvonalat hoztunk létre. 1.2.2. Tápoldatok A sejttenyésztésre alkalmazott tápoldat Sigma C1850 tápoldat volt. 1.3. Inokulációs, szaporítási és termelési körülmények A tenyésztési folyamat, amelyet „futtatás” néven is említünk, inokulációs lépésbõl, szaporítási fázisból és termelõfázisból áll. 1.3.1. Inokulációs körülmények A 3. példa kivitelezésekor a Fibra–Cel® korongok tömegére számítva kilogrammonként 1,6×108, a 4. példa teljesítésekor pedig kilogrammonként 2,7×109 életképes, r¹hTBP–1¹et termelõ sejtet transzferáltunk a bioreaktorba. A keringetõpumpa bekapcsolva volt az inokuláció alatt, a sejtek természetesen tapadtak a Fibra–Cel® korongokra. A kondicionálótartályt szabályozóegység indulóbeállításai a következõk voltak: – Hõmérséklet: 37,0 °C – Oldott oxigén [Dissolved oxygen (DO)]: 50% levegõtelítettség – pH: 7,00 – Túlnyomás a bioreaktorban: 0,2 bar – A 3. példa teljesítésekor: Keverés: 20 rpm 1.3.2. Szaporítási körülmények A szaporítási fázisban a bioreaktort a második napig szakaszos üzemmódban mûködtettük, és ekkor a hígítási rátát progresszíven addig növeltük, amíg el nem értük a maximális 100 liter átáramoltatott tápoldat/nap/kilogramm Fibra–Cel® korong (100 L×nap–1×kg–1 Fibra–Cel®) értéket. A pumpa által keltett keringetési áramlást a 3. példa kivitelezésekor 150 L. h–1 értékrõl progresszíven 350 L. h–1 értékre, a 4. példa végrehajtásakor pedig 150 L. h–1.kg–1 értékrõl 800 L. h–1.kg–1 értékre növeltük. A 11. napon az oldott oxigén beállítási pontját 70%¹os légtelítettségre fokoztuk. 1.3.3. Termelési körülmények Amikor a glükózfogyasztási ráta [Glucose Consumption Rate (GCR)] meghaladta a 150 g.nap–1. Fibra–Cel® kg–1 értéket, az átáramoltatás szintjét a 3. példa teljesítésekor Fibra–Cel® kilogrammonként napi 18 liter átáramoltatott tápoldatra (30 L. nap–1. Fibra–Cel® kg–1), a 4. példa végrehajtásakor pedig legalább napi 10 liter átáramoltatott tápoldatra (legalább 10 L. nap–1. Fibra–Cel® kg–1) csökkentettük. A termelési fázis 60 napig tartott. 2. példa: Analitikai eljárások 2.1. Az összes szerves szén [total organic carbon (TOC)] mérése Az összes szerves szén (TOC) a gyógyászati vízben jelen lévõ, szénként mért szerves molekulák közvetett mértéke. A TOC-értéket általában folyamatszabályozási jellemzõként alkalmazzák a tisztítási és el-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
oszlási rendszert tartalmazó egység mûködési teljesítményének nyomon követésére. A TOC lehetõvé teszi annak meghatározását, hogy tisztítást követõen minden szerves molekulát eltávolítottak¹e. A TOC analízisére számos eljárás létezik [lásd például European Pharmacopeia, 4. kiadás, 2.2.44 fejezet (2002)]. A TOC-értéket Phoenix 8000 berendezés (Dohrmann) alkalmazásával mértük a gyártó utasításaiból származó protokoll szerint. A TOC-értéket part per million (ppm, milliomodrész) mértékegységben fejeztük ki. 2.2. A Limulus amebocyte lizátum (LAL) mérése A Limulus amebocyte lizátum (LAL) teszt a tesztelendõ mintában vagy mintán jelen lévõ bakteriális endotoxinok kimutatása mennyiségi mérésére szolgáló vizsgálat. A teszt alapja a patkósrák (Limulus polyphemus vagy Tachypleus tridentatus) vérében keringõ amõboid sejtekbõl nyert vizes kivonataiból nyert, LAL reagensként elõállított és jellemzett Limulus amebocyte lizátum [lásd például Pharmacopeia of the United States of America, 26. átdolgozott kiadás, 85. fejezet]. A LAL¹t WinKQCL® szoftvert (Biowhittaker) tartalmazó LAL Kinetic System (LAL kinetikai rendszer) alkalmazásával mértük a gyártó utasításaiból származó protokoll szerint. A LAL¹t endotoxinegység/milliliter (EU.ml–1) mértékegységben fejeztük ki. 2.3. A biológiai terhelés („Bio Burden”) mérése A biológiai terhelés („Bio Burden”) egy adott mintában vagy mintán lévõ életképes mikroorganizmusok szintjének mértéke. A biológiai terhelést „összes életképes aerob szám”-nak is nevezik. A biológiai terhelés mérésére számos eljárás létezik [lásd például European Pharmacopeia, 4. kiadás, 2.6.12. fejezet, (2002)]. A biológiai terhelést membránszûréssel vizsgáltuk [lásd a European Pharmacopeia, 4. kiadás, 2.6.12. fejezet, (2002)]. A membránszûrõket az alábbi tápoldatot tartalmazó Petri-csészéken inkubáltuk: – Trypcase-szója agar; – Trypcase-szója agar+0,07% lecitin+0,5% Tween 80; vagy – Trypcase-szója agar+5% birkavér. A lemezeket 5 napon át 32,5 °C¹on inkubáltuk. A biológiai terhelést telepképzõegység-szám/milliliter (CFU.ml–1) mértékegységben fejeztük ki. 2.4. Az r¹hTBP–1 kumulatív produktivitásának mérése Az r¹hTBP–1 g/Fibra–Cel® kg¹ként kifejezett kumulatív produktivitást [Cumulative Productivity (CP)] a következõk szerint számoltuk ki: CP=(az elõzõ napi CP)+((a napi r¹hTBP–1 titer×átáramoltatás/a Fibra–Cel® kg¹okban kifejezett tömege)/1000×(az elõzõ napi idõ és az aktuális napi idõ között eltelt idõ órákban kifejezve)). Az átáramoltatást liter/24 óra mértékegységben fejeztük ki. Az r¹hTBP–1 titert mg/L mértékegységben fejeztük ki. Az r¹hTBP–1 titerét a BioChem ImmunoSystemstõl (Németország) származó Serozyme készlettel és r¹hTBP–1 elleni monoklonális antitestekkel végzett immunenzimatikus vizsgálattal (IEMA) mértük.
1
HU 003 191 T2
2.5. A glükózfogyasztási arány [„glucose consumption rate” (GCR)] mérése Az egy kilogramm Fibra–Cel®¹re esõ napi glükózfogyasztásként kifejezett glükózfogyasztási arányt a következõk szerint számítottuk ki: GCR=(((G In – –Gbioreaktor×átáramoltatás)+(az elõzõ napi Gbioreaktor–az adott napi Gbioreaktor)×((munkatérfogat literekben/az elõzõ napi idõ és az aktuális napi idõ között eltelt idõ órákban kifejezve)/a Fibra–Cel®tömege)). A GIn a rendszerbe beáramoltatott tápoldatban lévõ glükóz g/L¹ben kifejezett koncentrációjának felel meg. A Gbioreaktor a bioreaktorban lévõ tápoldat glükózkoncentrációjának felel meg. Az átáramoltatást liter/24 óra mértékegységben fejeztük ki. A munkatérfogat a rendszerben lévõ tenyészet literekben megadott térfogatának felel meg. A Fibra–Cel® tömegét kilogrammokban fejeztük ki. 3. példa: Újrahasznosítási protokoll és eredmények 3.1. Újrahasznosítás A rendszer egy 5,5 literes külsõ oszlophoz csatlakoztatott 15 literes bioreaktorból állt az 1.1. példában leírtaknak megfelelõen. Az újra nem hasznosított Fibra–Cel® korongokkal végzett futtatás végén minden folyadékot leürítettünk a teljes rendszerbõl, és azután forró, injektálásra szolgáló vízzel (WFI) újra feltöltöttük. A WFI hõmérséklete meghaladta a 70 °C¹ot. A keringetési hurokáramlást 10 percre 583 l. h–1.kg–1 értékre állítottuk be (5 perces fentrõl le és 5 perces lentrõl fel irá-
5
10
15
20
25
2
nyuló áramlás). A túlnyomás 300 mbar¹os volt. Ezután a WFI¹t leeresztettük. A rendszert WFI-vel újra feltöltöttük, és ehhez tömény (10%¹os) nátrium-hidroxid-oldatot adtunk a 2%¹os végkoncentráció eléréséhez a rendszerben. Ekkor a perisztaltikus pumpa („rotary lobe pump”) áramoltatási sebességét 215-rõl 583 l. h–1.kg–1¹re növeltük progresszíven, és ez utóbbi keringetési hurokáramlást 30 percig (15 perces fentrõl le és 15 perces lentrõl fel irányuló áramlás) 60 °C¹on tartottuk fenn. Ezután 1–4 mosást végeztünk szoba-hõmérsékletû WFI-vel 583 l. h–1.kg–1 áramlási sebesség és 200 mbar¹os túlnyomás mellett. Ez egyes mosások minimum 10 percig (5 perces fentrõl le és 5 perces lentrõl fel irányuló áramlás) tartottak. Az egyes mosási fázisok után mintákat vittünk át pH, Limulus amebocyte lizátum (LAL), összes szerves szén (TOC) és biológiai terhelési analízisekre. A LAL, TOC és Bio Burden vizsgálatokat a fentiekben leírtak szerint végeztük, a pH¹t pedig pH¹papírral teszteltük. A LAL, TOC, biológiai terhelési érték és pH jelzi, hogy a rendszer tiszta¹e, vagy sem. Elõnyösen egy új futtatás elõtt a pH meg kell hogy haladja a 8¹as értéket, a LALnak 0,5 EU.ml–1-nél, a biológiai terhelési értéknek 5 CFU.ml–1-nél, a TOC-nak pedig 10 ppm-nél alacsonyabbnak kell lennie. Az egyes mosási fázisokból átvitt mintákon végzett LAL¹, TOC¹, biológiai terhelési és pH¹analízisek eredményeit a 2. táblázat mutatja be.
2. táblázat pH
LAL
TOC
1. mosás
>10
0,44
nem mértük
2. mosás
<10
0,0526
4
nem mértük
3. mosás
<8
0,1837
5
nem mértük
4. mosás
<8
0,2168
3
0,4
Az egyes mosási fázisok után végzett különbözõ analízisek kimutatták, hogy három mosás elegendõ ahhoz, hogy elérjük a <8 pH¹értéket, a <0,5 EU.ml–1 LALértéket és a <5 CFU.ml–1 biológiai terhelési értéket. Eszerint három mosási fázis lehetõvé teszi, hogy elérjük a rendszerben az új futtatáshoz szükséges LAL¹, TOC¹, biológiai terhelési és pH¹értékeket. 3.2. Nem újrahasznosított és újrahasznosított Fibra–Cel® korongokkal végzett futtatások során kapott kumulatív produktivitás és glükózfogyasztási ráta Ezt követõen futtatást végeztünk háromszor mosott újrahasznosított Fibra–Cel® korongokkal. A tisztítást követõ napon az újrahasznosított Fibra–Cel® korongokat tartalmazó oszlopot sterilizáltuk, és az újabb futtatás kezdetéig sterilen tartottuk. Az ezt követõ futtatáskor mért kumulatív produktivitási adatokat az 1. ábra, a glükózfogyasztási rátát pedig a 2. ábra mutatja be. A nem újrahasznosított Fibra–Cel® korongokkal végzett futtatáskor mért kumulatív produktivitást és glükózfogyasztási rátát is megadtuk.
>2,5
Biol. terhelés
40
Ahogyan az az 1. és 2. ábrán látható, a futtatás végéig az újrahasznosított Fibra–Cel® korongokkal létesített tenyészet ugyanúgy viselkedett, mint a nem újrahasznosított Fibra–Cel® korongokkal létesített tenyészet. A produktivitás és metabolizmus hasonló volt. 45 Specifikusan az újrahasznosított Fibra–Cel® korongokkal elért r¹hTBP–1 produktivitás szintje összevethetõ a nem újrahasznosított Fibra–Cel® korongokkal kapott r¹hTBP–1 produktivitás szintjével. 50
4. példa: Újrahasznosítási protokoll és a különféle méretû berendezésekkel kapott eredmények A rendszerek külsõ oszlophoz csatlakoztatott 40 literes vagy 350 literes bioreaktorokat tartalmaztak (lásd 55 1.1. példa). Az újra nem hasznosított Fibra–Cel® korongokkal végzett futtatás végén minden folyadékot leürítettünk a teljes rendszerbõl, és azután forró, injektálásra szolgáló vízzel (WFI) újra feltöltöttük. A WFI hõmérséklete 60 meghaladta a 60 °C¹ot. A keringetési hurokáramlást 8
1
HU 003 191 T2
10 percre 583 l. h–1.kg–1 értékre állítottuk be. A túlnyomás 500 mbar¹os volt. Ezután a WFI¹t leeresztettük. A rendszert 2%¹os nátrium-hidroxid-oldatot tartalmazó tisztított vízzel [Purified Water (PW)] töltöttük fel ismét. A keringetési hurokáramlást 30 percre 583 l. h–1.kg–1 értékre állítottuk be, a hõmérséklet pedig 60 °C volt. Ezután szoba-hõmérsékletû PW¹vel 1–4 mosást végeztünk 583 l. h–1.kg–1 áramoltatás és 500 mbar túlnyomás mellett. Az egyes mosások minimum 10 percig tartottak. Az utolsó mosást forró WFI-vel végeztük ugyanezen üzemeltetési körülmények között.
2
Az egyes mosási fázisok után a mintákat pH, Limulus amebocyte lizátum (LAL), összes szerves szén (TOC) és biológiai terhelési analíziseknek vetettük alá. A LAL, TOC és biológiai terhelési vizsgálatokat a fen5 tiekben leírtak szerint végeztük, a pH¹t pedig pH¹papírral teszteltük. A LAL, TOC, biológiai terhelési érték és pH jelzi, hogy a rendszer tiszta¹e, vagy sem. Elõnyösen egy új futtatás elõtt a pH meg kell hogy haladja a 8¹as értéket, a LAL-nak 0,5 EU.ml–1-nél, a biológiai ter10 helésnek 5 CFU.ml–1-nél, a TOC-nak pedig 10 ppm-nél alacsonyabbnak kell lennie. Az egyes mosási fázisokból átvitt mintákon végzett LAL¹, TOC¹, biológiai terhelési és pH¹analízisek eredményeit a 3. táblázat mutatja be.
3. táblázat Oszloptérfogat (liter)
Mosási ciklusok (–)
pH (–)
LAL (EU/ml)
Biol. terhelés (CFU/100 ml)
60
3
7,5
–
–
–
4
7,0
–
–
0,3
5
7,0
0,25
0
0,3
3
7,5
–
–
1,7
4
7,0
–
–
1,1
5
7,0
0,25
0
0–2
3
7,0
–
–
0,3
4
7,0
–
–
0,8
5
7,0
<0,25
0
0,8
120
240
Az egyes mosási fázisok után végzett különbözõ analízisek kimutatták, hogy 3–5 mosás elegendõ ahhoz, hogy elérjük a <8 pH¹értéket, a <0,25 EU.ml–1 LAL-értéket és a <10 CFU.ml–1 biológiai terhelési értéket. Eszerint három mosási fázis lehetõvé teszi, hogy elérjük a rendszerben az új futtatáshoz szükséges LAL¹, TOC¹, biológiai terhelési és pH¹értékeket. Hivatkozások 1. Bohak Z., Kadouri A. et al. (1987) „Novel anchorage matrices for suspension culture of mammalian cells” Biopolymers. 26 Suppl: S205–213. 2. Buck CD and Loh PC (1985) „Growth of brown bullhead (BB) and other fish cell lines on microcarriers and the production of channel catfish virus (CCV)” J. Virol. Methods. 10 (2): 171–184. 3. European Pharmacopeia, 4th Edition, 2002. On¹line edition. 4. Ikonomou L., Drugmand JC et al. (2002) „Microcarrier culture of lepidopteran cell lines: implications for growth and recombinant protein production” Biotechnol Prog. 18 (6): 1345–1355 5. Petti SA, Lages AC et al. (1994) „Three-dimensional mammalian cell growth on nonwoven polyester fabric disks” Biotechnol Prog. 10 (5): 548–550. 6. Pharmacopeia of the United States of America, Twenty-Sixth Revision. On¹line edition.
TOC (ppm)
7. Sabu A., Kumar SR et al. (2002) „Continuous 35 production of extracellular L¹glutaminase by Ca¹alginate-immobilized marine Beauveria bassiana BTMF S¹10 in packed-bed reactor” Appl. Biochem. Biotechnol. 102–103 (1–6): 71–9. 8. Wang G., Zhang W. et al. (1992) „Modified Celli40 Gen-packed bed bioreactors for hybridoma cell cultures. Cytotechnology” 9 (1–3): 41–49.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 45 1. Eljárás a sejttenyésztõ rendszeren belül, lehorgonyzástól függõ sejtek tenyésztésére szolgáló, szilárd hordozó újrahasznosítására, amely a következõ lépésekbõl áll: 50 a) a rendszerbõl kiürítjük a folyadékot; b) a rendszert vizes oldattal öblítjük; c) a rendszert nátrium-hidroxid-oldattal öblítjük; és b) a rendszert vizes oldattal öblítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, amelyben a vizes 55 oldat víz. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, amelyben a nátrium-hidroxid-oldat koncentrációját a következõkbõl választjuk ki: a) a körülbelül 1%¹tól körülbelül 3%¹ig terjedõ tar60 tományon belüli nátrium-hidroxid-koncentráció; 9
1
HU 003 191 T2
b) a körülbelül 1,5%-tól körülbelül 2,5%¹ig terjedõ tartományon belüli nátrium-hidroxid-koncentráció; és c) körülbelül 2%¹os nátrium-hidroxid-koncentráció. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (d) lépést legalább háromszor végezzük el. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, amelyben a (d) lépést háromszor végezzük el 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, amelyben a (d) lépést ötször végezzük el. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (b) lépés vizes oldata injektálásra szolgáló víz [Water For Injection (WFI)]. 8. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (d) lépés vizes oldata injektálásra szolgáló víz (WFI). 9. A 4–7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (d) lépést tisztított vízzel [Purified Water (PW)] végezzük a (d) lépés utolsó ismétlése kivételével, amelyet injektálásra szolgáló vízzel (WFI) hajtunk végre. 10. Az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a szilárd hordozó porózus hordozólaphoz kötött, nemszõtt, szálas mátrixból készült. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, amelyben a szilárd hordozó polipropilén szitalaphoz kötött, nemszõtt poliészterbõl készült korong. 12. Az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a szilárd hordozó mikrohordozó. 13. Az 1–12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a rendszer bioreaktort foglal magában. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, amelyben a rendszer a bioreaktorhoz csatlakoztatott külsõ oszlopot is tartalmaz. 15. A 13. igénypont szerinti eljárás, amelyben a bioreaktor belsõ oszlopot tartalmaz. 16. A 14. vagy 15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a szilárd hordozó az oszlopon belül helyezkedik el. 17. Az 1–16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (d) lépés végrehajtása után a rendszert sterilizáljuk. 18. A 14. vagy 16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (d) lépés végrehajtása után a külsõ oszlopot sterilizáljuk. 19. Az 1–16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (d) lépést a következõkbõl választott keringetési hurokáramlással hajtjuk végre: a) körülbelül 500 l. h–1.kg–1 és körülbelül 700 l. h–1.kg–1 közötti tartományon belüli értékek; b) körülbelül 550 l. h–1.kg–1 és körülbelül 650 l. h–1.kg–1 közötti tartományon belüli értékek; és c) körülbelül 583 l. h–1.kg–1. 20. Az 1–19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (d) lépést a környezet hõmérsékletén hajtjuk végre. 21. Az 1–20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (d) lépést túlnyomás alatt hajtjuk végre, amelynek értéke a következõk közül választott: a) körülbelül 100 millibartól a körülbelül 900 millibarig terjedõ tartományon belüli értékek;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 10
2
b) körülbelül 300 millibartól a körülbelül 700 millibarig terjedõ tartományon belüli értékek; és c) körülbelül 500 millibar. 22. Az 1–21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (d) lépést a következõkbõl választott idõtartam alatt hajtjuk végre: a) körülbelül 5 perctõl körülbelül 30 percig terjedõ idõtartam-tartomány; b) körülbelül 5 perctõl körülbelül 20 percig terjedõ idõtartam-tartomány; és c) körülbelül 10 perc. 23. Az 1–22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (c) lépést a következõkbõl választott keringetési hurokáramlással hajtjuk végre: a) körülbelül 500 l. h–1.kg–1 és körülbelül 700 l. h–1.kg–1 közötti tartományon belüli értékek; b) körülbelül 550 l. h–1.kg–1 és körülbelül 650 l. h–1.kg–1 közötti tartományon belüli értékek; és c) körülbelül 583 l. h–1.kg–1. 24. Az 1–23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (c) lépést a következõkbõl választott idõtartam alatt hajtjuk végre: a) körülbelül 20 perctõl körülbelül 40 percig terjedõ idõtartam-tartomány; b) körülbelül 25 perctõl körülbelül 35 percig terjedõ idõtartam-tartomány; és c) körülbelül 30 perc. 25. Az 1–25. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (c) lépést a következõkbõl választott hõmérsékleten hajtjuk végre: a) a körülbelül 59 °C¹tól körülbelül 70 °C¹ig terjedõ tartományon belüli értékek; b) a körülbelül 55 °C¹tól körülbelül 70 °C¹ig terjedõ tartományon belüli értékek; és c) körülbelül 60 °C. 26. Az 1–25. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (b) lépést a következõkbõl választott hõmérsékleten hajtjuk végre: a) a körülbelül 50 °C¹tól körülbelül 70 °C¹ig terjedõ tartományon belüli értékek; b) a körülbelül 55 °C¹tól körülbelül 70 °C¹ig terjedõ tartományon belüli értékek; és c) körülbelül 60 °C. 27. Az 1–26. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (b) lépést túlnyomás alatt hajtjuk végre, amelynek értéke a következõkbõl választott: a) körülbelül 100 millibartól a körülbelül 900 millibarig terjedõ értékek; b) körülbelül 300 millibartól a körülbelül 700 millibarig terjedõ értékek; és c) körülbelül 500 millibar. 28. Az 1–27. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a (b) lépést a következõkbõl választott idõtartam alatt hajtjuk végre: a) körülbelül 5 perctõl körülbelül 30 percig terjedõ idõtartam-tartomány; b) körülbelül 5 perctõl körülbelül 20 percig terjedõ idõtartam-tartomány; és c) körülbelül 10 perc.
HU 003 191 T2 Int. Cl.: C12N 5/00
11
HU 003 191 T2 Int. Cl.: C12N 5/00
12
HU 003 191 T2 Int. Cl.: C12N 5/00
13
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Törõcsik Zsuzsanna fõosztályvezetõ-helyettes Windor Bt., Budapest
