!HU000005673T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 005 673
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 39/02
(21) Magyar ügyszám: E 03 759205 (22) A bejelentés napja: 2003. 08. 27. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030759205 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1551451 A2 2004. 03. 11. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1551451 B1 2009. 02. 25.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 406359 P 2002. 08. 27.
(73) Jogosult: Dow AgroSciences LLC, Indianapolis, Indiana 46268-1054 (US)
US
(72) Feltalálók: MILLER, Timothy, J., Lincoln, NE 68510 (US); FANTON, Matthew, J., Lincoln, NE 68516 (US)
(54)
(2006.01) A61K 39/00 (2006.01) A61K 39/108 (2006.01) A61K 39/116 (2006.01) A61K 39/12 (2006.01) A61K 45/00 (2006.01) C12N 15/82 (2006.01) C12P 21/04 (2006.01) A61K 39/295 (2006.01) C12N 15/09 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04020585 PCT/US 03/026721
(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest
Escherichia coliból származó, hõlabilis toxin alkalmazása adjuvánsként madarakban és baromfiban
(57) Kivonat
HU 005 673 T2
A találmány tárgyát képezik adjuváns készítmények és eljárások brojlercsirkék vakcinációjára nyálkahártyapatogének ellen, amelyben E. coliból származó, hõlabilis toxint (LT) és ismert analógjait alkalmazzák adjuvánsként madarakban. A találmány tárgyát képezik to-
vábbá készítmények és eljárások géntechnológiailag módosított növények által termeltetett LT és analógjai, valamint védettséget biztosító immunogének alkalmazására vakcinaként madarakban.
A leírás terjedelme 18 oldal (ezen belül 1 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 005 673 T2
A találmány általánosságban az immunológia szakterületére vonatkozik, és a találmány tárgyát képezik adjuváns készítmények és eljárások brojlercsirkék vakcinációjára nyálkahártya-patogének ellen. A találmány tárgyát különösen géntechnológiailag módosított növények alkalmazása képezi, amelyek immunogén peptideket, fehérjéket és adjuvánsokat termelnek. Az orális vakcinációt hosszú ideje kényelmes és nem traumás módszernek tekintették vakcinák beadása céljából. Fogyasztható vakcinák különösen vonzó megoldásnak számítanak az állategészségügyi ipar számára, mert ideálisan kombinálják az orvosság beadását kialakult etetési szokásokkal állatokban. Orális poliovakcina 1960¹as évek óta tartó sikere ellenére nagyon kevés orális vakcina került kereskedelmi forgalomba, különösen olyan vakcinák, amelyekben nem életképes antigéneket alkalmaznak immunválasz stimulálására. Transzgenikus növények egy eszközt biztosítanak fogyasztható vakcinákban alkalmazható antigének gazdaságos gyártására. Az elsõ munka, amit ezen a területen közöltek, megtalálható az 5,654,184; 5,679,880 és 5,686,079 számú USA-beli szabadalmi leírásokban. Ilyen transzgenikus növények olyan eszközt biztosítanak, ami kombinálja állatok elfogadottan alkalmazott etetési gyakorlatát azokkal a kényelmi szempontokkal, amit antigén orális bevitele jelent nyálkahártyaszövetekhez, vakcináció céljából. Hogy egy fogyasztható vakcina sikeres legyen, az emésztõrendszer komplex környezetét kell navigálni. A nyálkahártyával társult limfoid szövet (MALT), ami gerincesek emésztõ¹, légzõ- és reprodukciós szervrendszereiben található, az egyik legkülönfélébb, de mégis univerzális immunrendszerek közé tartozik a természetben. Bármilyen, a béllel társult limfoid szöveten (GALT) keresztül az emésztõtraktusban immunválaszt stimulálni képes antigén összetett környezettel találkozik, ha bejut az emésztõtraktusba. A szájüregben és más emésztõszervekben tág tartományban változhat a pH, enzimek, detergensek és kommenzális (más szervezetekkel együttélõ) mikroorganizmusok, amelyek hozzájárulnak a táplálék emésztéséhez. Kommenzális mikroorganizmusok száma gyakran több, mint ahány sejtbõl maga az emésztõrendszer felépül [Savage, D., „Mucosal Microbiota. Mucosal Immunity”, szerk. P. Orga, J. Mestecky, M. Lamm, W. Strober, J. Biennenstock, J. McGhee, Academic Press Inc., 19–30. oldal (1999)]. Ennek ellenére ezek a kommenzális mikroorganizmusok hasznos funkciót látnak el, és egy állandó „tolerancia” állapotban vannak a GALT immunrendszere által. Az antigének kompetícióba lépnek a táplálék komponenseivel és más környezeti komponensekkel, amelyek az emésztõrendszerbe kerültek, és különbözõ emésztési állapotban vannak. Az immunrendszernek folyamatosan felügyelnie kell az emésztõ¹, valamint a légzõ- és a reproduktív traktust idegen antigénekre, a saját, beleértve a tápanyag antigénjeivel szemben, amelyek „saját” tulajdonságokkal rendelkeznek annyiban, hogy immunológiailag toleráltak. Végül, a nyálkával borított bélbolyhos és follikuláris epitélium veleszületett immunológiai gát állandó mozgásban van,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
hogy elhelyezze a tápanyagkomponenseket, és szükséges kiválasztást biztosítson a mukozális felszínre. Az emésztõrendszer komplex környezete ellenére nagyon kis mennyiségû biológiailag aktív (bélben aktív) anyag képes immunválaszt indukálni. A nyálkahártyarendszer leghatásosabb stimulátorai közül kettõ, Escherichia coliból (E. coli) származó hõlabilis toxin, és Vibrio choleraból (V. cholera) származó kolera toxin (CT) már néhány mikrogramm mennyiségben szerológiai választ képes stimulálni, ha orálisan gyomorszondával (töméssel) adjuk be [Isaka, M. és munkatársai, Vaccine 16, 1620–1626 (1998); Rappuoli, R. és munkatársai, Immunol. Today 20, 493–499 (1999); és Isaka, M. és munkatársai, Vaccine 18, 743–751 (2000)]. Tehát a nyálkahártyafelszínen sikeresen át lehet hatolni, és kis mennyiségû biológiailag aktív fehérjével, például LT¹vel és CT¹vel. Azonban enteropátiás toxigén aktivitásuk miatt, LT és CT natív formáikban nem ajánlott orális adjuvánsként történõ, biztonságos alkalmazásra emberekben vagy állatokban. Mukozálisan aktív fehérjék, mint például CT és LT fontos jellegzetessége egy nem életképes antigénnel szemben, hogy CT és LT ligandumai egy gyomorban lévõ receptornak (GM1-gangliozidnak), ami lehetõvé teszi az említett toxinok bejutását kis koncentrációkban (behatolásra való képesség). Ez eltér egy nem életképes antigéntõl, amely nem képes behatolni és felhígul, és ki van téve a belek emésztõ környezetének. Általánosan elfogadott, hogy nem invazív antigént magas dózisokban (milligramm-mennyiségekben), több alkalommal kell beadni, hogy stimulálja az immunrendszert a bélnyálkahártya felszínén keresztül. Azonban valószínûleg magas antigéndózis és többszörös beadás szükséges az emésztõ környezetet telítéséhez. Mivel az antigén nagyobb része lebomlik vagy felszívódik, nagyon kis mennyiségû antigén szûrõdik át és stimulál kívánt immunválaszt. Mivel LT és CT annyira patogén, hogy lényegi biokémiai és genetikai kutatás tárgya volt, hogy patogén tulajdonságaikat csökkentsék vagy megszüntessék úgy, hogy közben megmaradjon adjuváns aktivitásuk. LT és CT analóg tercier fehérjestruktúrával rendelkezik annyiban, hogy mindkettõ egy oligomer „B” alegységbõl (LT¹B és CT¹A, sorrendben), amely G1 jelû gangliozidreceptorokra specifikus, és egyetlen „A” alegységbõl (LT¹A és CT¹A, sorrendben) áll, amelynek ADP-riboziltranszferáz-aktivitása van. LT¹vel kapcsolatos kutatásokban számos analógot állítottak elõ, amelyeket immunogén és adjuváns tulajdonságaikra teszteltek emlõsszervezetekben. Az LT¹toxin számos analógját elõállították az „A” alegységben végrehajtott aminosavszubsztitúciókkal és ¹deléciókkal, az enteropátiás aktivitás gyengítése céljából, anélkül, hogy a toxin adjuváns tulajdonságai csökkentek volna [Ghiara és munkatársai, Infect. Immun. 65, 4996–5002 (1997)]. Azonban kevés információ van ilyen toxinok madarakban történõ alkalmazásáról, akár adjuvánsként, akár immunogénként. Hoshi és munkatársai [Vaccine 13, 245–252 (1995)], valamint Meinersmann és munkatársai [Avian
1
HU 005 673 T2
Dis. 37, 427–432 (1993)] leírták, hogy CT orális beadása madárfajokba nem növelte szisztémás és mukozális humorális válaszok mértékét orálisan beadott tetanusztoxoid vagy inaktivált fertõzõ burzális betegség vírusával szemben. Takeda és munkatársai [Vet. Microbiol. 50, 17–25 (1996)] kimutatták, hogy CT¹B intranazális és szubkután beadása képes volt Newcastle-betegség vírusa ellen humorális választ fokozni. Vervelde és munkatársai [Vet. Immunol. Immunopath. 62, 261–272 (1998)] is leírták, hogy CT intraintesztinális, sebészi úton történõ alkalmazása csirkékben növelte az Eimeria-antigén intraintesztinális, sebészi úton történõ bevitelével szemben kialakult, humorális válasz mértékét. Tehát azt a következtetést vonhatjuk le, hogy CT nem fejtett ki adjuváns hatásokat madarakban orális beadás esetén, bár ha CT¹t sebészi úton juttattak a belekbe, kimutatták kötõdését az intesztinális epitéliumhoz. Emlõsszervezetben vizsgált, LT és CT adjuváns hatásaira vonatkozó, nagy mennyiségû irodalom alapján elõre látható volt, hogy hasonló hatásokat tapasztalhatunk madarakban is. Egészen váratlanul felismertük, hogy brojlercsirkék nem mutattak hasmenéses tüneteket és más enteropátiás hatásokat, miközben immunológiai választ adtak orálisan beadott, natív LT¹ és CT¹toxinra, amit különbözõ formátumokban állítottak elõ a tisztított toxintól a növény által in situ termelt toxinig. Enteropatogén, hõlabilis toxint expresszáló E. colit még nem írtak le baromfira, sem LT alkalmazását mukozális immunogénként vagy adjuvánsként. Baromfit fiatal korban lehet immunizálni, részben a B¹sejtek differenciálására szolgáló szerv mûködése következtében (Fabricius tömlõ, bursa Fabricii), amely kikelés elõtt aktív [Dibner, J. J. és munkatársai, Applied Poultry Research 7, 427–436 (1998)]. Egynapos korukban immunizált madarak belében így kevés a táplálék, mikroorganizmusok és emésztõenzimek mennyisége, ami kompetícióba léphetne nem életképes antigénnel vagy lebonthatná azt. A leírásban közölt vizsgálatokban bemutatjuk, hogy natív LT és LT¹B szerológiai válaszokat indukál, amit szérum-IgG-ben akár már 21 nappal lehet detektálni a toxin beoltása után, ami történhet intranazálisan (IN), szubkután, in ovo vagy orálisan. Hasonló módon, LT¹B és legyengített LT¹A-analóg natív szekvenciáit expresszáló, NT–1 jelû transzgenikus dohánysejtek szerológiai válaszokat indukálnak orálisan és IN¹módon beadva egyaránt, a toxin vagy a növényi anyag okozta bármilyen mellékhatás nélkül. Továbbá váratlanul azt találtuk, hogy orálisan vagy szubkután beadott, natív LT nem patogén brojlercsirkékre, ha nagyobb dózisokban adjuk be annál, mint ami más közleményekben leírtak szerint egerekben letális és emberekben enteropatogén. A találmány szerinti megoldás röviden összefoglalva egy készítmény, amely adjuváns hatást kifejteni képes mennyiségû fehérjét tartalmaz az alábbiak által alkotott csoportból kiválasztva: E. coliból származó hõlabilis toxin (LT) és E. coliból származó hõlabilis toxinanalógok (LT-analógok), adjuvánsként történõ alkal-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
mazásra, brojlercsirkék vakcinációja esetén. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások brojlercsirkék vakcinációjára, amelyben brojlercsirkéknek beadunk az igényelt készítmények bármelyikébõl adjuváns hatást kifejteni képes mennyiséget, különösen úgy, hogy az ilyen készítmények transzgenikus növényekben lettek elõállítva és/vagy transzgenikus növényi anyagot feldolgozott vagy feldolgozatlan formában adunk be. 1. ábra. NT–1-sejtek transzformálására alkalmazott pSLT107 térképe. A T¹DNS bal és jobb határa határozza meg a DNS¹t, amit növényi sejtekbe szándékozunk bevinni, és alábbi transzkripciós kazettákat szegélyez: LT¹A-R72, amelyben a transzkripciót duplán fokozott („enhanced”) CaMV 35S-promoter vezérli, és burgonyából származó pin2 3’¹végi régiója terminálja; LT¹B, amelyben a transzkripciót duplán fokozott („enhanced”) CaMV 35S-promoter vezérli, és szójababból származó vspN 3’¹végi régiója terminálja; és npt2 kanamicinrezisztens növények szelektálására. Azt is megjegyezzük, hogy NT–1-sejtek transzformálására alkalmazott, a példákban leírt pSLT101, pSLT102 és pSLT105 minden vonatkozásában azonos pSLT107-tel, kivéve az LT¹A¹t kódoló régiót. A pSLT102-vektor a K63 LT¹Amutánst kódolja, a pSLT105-vektor a G192 LT¹A-mutánst kódolja, és a pSLT107-vektor az R72 LT¹A-mutánst kódolja [Rappuoli és munkatársai, Immunol. Today 20, 493–500 (1999)]. A pSLT101-vektor a teljes mértékben natív LT¹t kódolja, ami biológiailag ekvivalens az E. coliból származó LT¹vel. Egy immunogén olyan nem önálló anyag, amely humorális és/vagy celluláris immunválaszt képes kiváltani egészséges állatokban, ezáltal az állat védett lesz az immunogén jövõbeli támadása ellen. Immunogének tipikusan patogének, például vírusok, baktériumok és gombák, amelyek bizonyos alakban nem patogéneknek tekinthetõk. Immunogének lehetnek patogének antigenikus részletei, például sejtfalkomponensei, vírusok burokfehérjéi és szekretált fehérjék, például toxinok és enzimek, csak hogy néhányat említsünk. Immunogének lehetnek rekombináns sejtek is, például növényi sejtek és ilyen sejtek extraktumai, amelyeket úgy terveztek, hogy immunoprotektív antigéneket expresszáljanak és mutassanak be. A vakcináció és vakcinálás kifejezéseket a leírással összefüggésben úgy definiáljuk, mint egy eszközt patogénnel szembeni védettség biztosítására úgy, hogy egy gazdaszervezetet beoltunk egy patogén ágenst, vagy nem virulens formáját vagy részét tartalmazó immunogén készítménnyel, hogy ezzel a gazdaszervezet immunrendszerét stimuláljuk, és megelõzzük vagy legyengítsük a gazdaszervezet bekövetkezõ reakcióit, amit a patogén ágens késõbbi jelenléte esetén ad. A beadás vagy bead kifejezéseket a leírásban úgy definiáljuk, mint egy anyag bevitelét egy állat testébe, és történhet orális, nazális, okuláris, rektális, in ovo és parenterális (intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután) úton. A találmány szerinti megoldással összhangban lévõ, elõnyösebb beadási mód orális és/vagy nazális beadás, mindkettõvel elérhetõ a bélnyálkahártya, és in ovo. Az orális beadás a legelõnyösebb.
1
HU 005 673 T2
Hatásos és immunológiailag védettséget biztosító mennyiséget a leírásban egy anyag olyan mennyiségeként vagy tömegeként definiálunk, amely elõidézi a kívánt eredményt egy betegség fertõzésével szemben. Hatásos mennyiségek szakember számára nyilvánvalóak a leírásban közölt adatok és információk alapján. A találmány szerinti megoldás céljaira egy adjuváns olyan anyag, amely érvényre juttat, növel vagy fokoz egy immunogénre vagy antigénre adott immunválaszt. Adjuvánsok tipikusan humorális és celluláris immunválaszt egyaránt képesek fokozni, de ha bármelyik válasz fokozódik a másik nélkül, akkor ez is adjuvánst határoz meg. Továbbá, adjuvánsok és alkalmazásaik jól ismertek az immunológusok számára, és tipikusan arra alkalmazzák ezeket, hogy immunválaszt fokozzanak, ha az immunogén dózisa korlátozott, vagy ha az immunogénnek gyenge immunogén tulajdonságai vannak, vagy a beadás módja szuboptimális. Az „adjuváns hatást kifejteni képes mennyiség” kifejezésen a leírásban egy adjuváns olyan mennyiségét értjük, amely képes immunválaszt fokozni egy adott immunogén vagy antigén ellen. A tömeg, ami ekvivalens egy adjuváns hatást kifejteni képes mennyiséggel, változhat, és sokféle faktortól függ, például, de ezekre nem korlátozva, az immunogén tulajdonságaitól, a beadott immunogén mennyiségétõl, a gazdaszervezetfajtól, a beadás módjától, és az immunogén beadására szolgáló technológiai elõírástól. Az adjuváns hatást kifejteni képes mennyiséget rutinkísérletekkel könnyen meg lehet határozni, adott konkrét körülményeket feltételezve. Ez szakember köteles tudásának körébe tartozik, és tipikusan rutin dózis-válasz meghatározásokat foglal magában, amelyben a beadott immunogén és adjuváns mennyiségét változtatják. A válaszokat az immunogén ellen képzõdött szérumban lévõ ellenanyagtiterek mérésével mérik, enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálati eljárások, radioaktív immonológiai vizsgálati eljárások, hemagglutinációs vizsgálati eljárások és hasonlók alkalmazásával. LT esetén tekintélyes mennyiségû vizsgálatot végeztek emlõsszervezetekben, amelyek szerint testtömegkilogrammonként szubmikrogrammok nemcsak erõs immunválaszt, hanem patológiás elváltozásokat is kiváltanak. A legmeglepõbb, hogy ezt brojlercsirkék esetén nem mutatták ki, mert orálisan beadott natív LT 10 mg/kg¹ig nem váltott ki semmilyen patológiás tünetet, míg lényegi immunválaszt idézett elõ magas IgG-titerek formájában. Ez ellentétben van azokkal a vizsgálatokkal, amelyekben kimutatták, hogy sebészileg beültetett CT és antigén immunválaszt váltott ki patológiás elváltozások nélkül [Vervelde és munkatársai, mint fent (1998)], miközben CT¹B immunválaszt váltott ki, de patológiás elváltozások nélkül [Takeda és munkatársai, mint fent (1996)]. E. coliból származó hõlabilis toxint (LT) jól jellemezték röntgenkrisztallográfiával, és multimer fehérjébõl áll. A holotoxin 27 000 dalton molekulatömegû „A” alegységet (LT¹A) tartalmaz, ami LT¹A1¹re és LT¹A2¹re hasítanak proteázok a vékonybélben. A holotoxin öt, egyenként 11 600 dalton molekulatömegû „B” alegysé-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
get is tartalmaz, amelyek nem kovalensen kapcsolódnak egy nagyon stabil, fánkszerû pentamer struktúrában. Bármilyen forrásból származó natív LT elõnyös a találmány szerinti megoldásban. E. coliból származó labilis toxinanalógokat (LT-analógokat) úgy definiáljuk, mint bármilyen natív LT¹t, amelyben egy vagy több aminosav szubsztituálva van, és leírták az irodalomban. Számos jól ismert LT¹analóg olyan, amelyekben az alfa-alegységben, a 63, 72. és 192. helyzetben természetes körülmények között található aminosavak szubsztituálva vannak lizinre, argininre és glicinre, sorrendben (K63, R72 és G192) [Rappuoli és munkatársai, Immunol. Today 20, 493–500 (1999)]. Biológiailag aktív LT és LT¹analógok GM1gangliozidhoz képesek kötõdni ELISA-formában, és toxikusak Y1 jelû adrenalis (mellékvese¹) sejtekre in vitro sejttoxicitási tesztekben. A madarak sokféle betegségre érzékenyek, amelyekre a találmány szerinti megoldás védõ hatású vakcinációt biztosít. Az alábbi listában sok gazdaságilag jelentõs madárbetegség közül felsorolunk néhányat, amelyeket okozó ágensek bemutatnak olyan immunogéneket, amelyek kompatibilisek a találmány szerinti megoldással. Ez a lista semmiképpen sem egy kimerítõ lista azokról a madárbetegségekrõl, amelyekre a találmány szerinti megoldás alkalmazható. Newcastlebetegség, madárinfluenza, fertõzõ burzális betegség, coccidiosis, nekrotikus enteritisz, légzsákgyulladás, cellulitisz, csirkeanémia, gége¹, orr- és légcsõgyulladás (laryngorhinotracheitis), fertõzõ bronchitis és Marek-féle betegség. Immunogének elõnyös csoportja, amelyek védelmet biztosítanak madárbetegségek ellen, és a találmány szerinti megoldás ezekre alkalmazható, Newcastle-betegség vírusának antigéndeterminánsai, Newcastle-betegség vírusából származó hemagglutininneuraminidáz fehérje, madárinfluenza vírusának antigéndeterminánsai, madárinfluenza vírusából származó hemagglutinin fehérje. Szakember számos módszert ismer viszonylag tiszta polipeptid- és fehérjemennyiségek, például LT¹A, LT¹B és LT¹analógok elõállítására. A gyakorlatban évtizedek óta alkalmaznak bakteriális és élesztõrendszereket rekombináns polipeptidek és fehérjék elõállítására. A közelmúltban olyan transzgenikus fehérjetermelõ rendszereket fejlesztettek ki, amelyekben a termelés rovarból, gerinces szervezetbõl, emlõsszervezetbõl vagy növénybõl származó sejtekre épül. Egy adjuváns, például LT elõállítása, és adott esetben egy kiválasztott immunogénnel való együtt-expresszálás egy transzgenikus növényben különösen illik a találmány szerinti megoldáshoz, mert a transzgenikus növényi anyagot közvetlenül fel lehet dolgozni, és vakcinaként madaraknak lehet adni vagy intranazálisan be lehet adni. Transzgenikus növényt a leírásban úgy definiáljuk, mint egy olyan növényi sejttenyészetet, növényi sejtvonalat, növényt, vagy transzformált növényi sejtbõl, szövetbõl vagy protoplasztból származó utódot, ahol a transzformált növény genomja exogén, idegen DNS¹t tartalmaz, amit laboratóriumi technikákkal vit-
1
HU 005 673 T2
tek be, és eredetileg nincs jelen ugyanehhez a törzshöz tartozó, natív, nem transzgenikus növényben. A „transzgenikus növény” és „transzformált növény” kifejezéseket a szakirodalomban néha szinonim kifejezésként használják egy olyan növény meghatározására, amit tranziensen transzformáltak heterológ DNS-sel olyan virális vektorrendszeren keresztül, amely nem idéz elõ integrált transzgenikus eseményeket. Ez a technológia szakember számára jól ismert, az 5,846,795 számú és 5,500,360 számú USAbeli szabadalmi leírásokból. A találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezésében elõnyösen alkalmazható növénycsoportok lehetnek növényi sejttenyészetek, burgonya, paradicsom, alfalfa és békalencse (Lemnaceae család). Elõnyösebb növénycsoport lehet növényi sejttenyészetek és paradicsom, a legelõnyösebben növényi sejttenyészetek. Elõnyösen alkalmazható növényi sejttenyészetek közé egyszikû és kétszikû növénybõl származó tenyészetek tartoznak. Különösen elõnyös növényi sejttenyészetek az NT–1 és BY–2 jelû dohánysejttenyészetek, melyeket Toshiyuki és munkatársai írtak le [Int’1 Rev. of Cytology 132, 1–30 (1992)]. Sok módszer jól ismert szakember számára transzformáló DNS-szegmensek sejtekbe történõ bevitelére, de nem mindegyik alkalmas DNS bevitelére növényi sejtekbe. Alkalmas módszerek közé tartozhat tulajdonképpen bármilyen módszer, amellyel DNS¹t lehet egy sejtbe bejuttatni, például Agrobacterium-fertõzéssel, DNS közvetlen bejuttatásával, például protoplasztok PEG-közvetített transzformációjával [Omirulleh és munkatársai, Plant Molecular Biology 21, 415–428 (1993)], kiszárításos inhibícióval közvetített DNS-felvétellel, elektroporációval, szilikon-karbin-rostokkal történõ kevertetéssel, DNS-sel burkolt részecskék felgyorsításával stb. A találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint, a felgyorsítást alkalmazó módszert részesítjük elõnyben, és idetartozik például a mikrorészecske-bombázás és hasonlók. DNS sejtekbe történõ bevitelére szolgáló technológia szakember számára jól ismert. Négy alapvetõ módszert írtak le idegen DNS bevitelére növényi sejtekbe. Kémiai módszereket [Graham and van der Eb, Virology 54, 536–539 (1973); Zatloukal, Wagner, Cotten, Philips, Plank, Steinlein, Curiel, Birnstiel, Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 136–153 (1992)]; fizikai módszereket, idetartozik a mikroinjektálás [Capecchi, Cell 22, 479–488 (1980)], elektroporáció [Wong és Neumann, Biochim. Biophys. Res. Commun. 107, 584–587 (1982); Fromm, Taylor, Walbot, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824–5828 (1985); 5,384,253 számú USA-beli szabadalmi leírás] és a génágyú [Johnston és Tang, Methods Cell. Biol. 43, 353–365 (1994); Fynan, Webster, Fuller, Haynes, Santoro, Robinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11 478–11 482 (1993)]; virális módszereket [Clapp, Clin. Perinatal. 20, 155–168 (1993); Lu, Xiao, Clapp, Li, Broxmeyer, J. Exp. Med. 178, 2089–2096 (1993); Eglitis és Anderson, Biotechniques 6, 608–614 (1988)]; és receptorközvetített módszereket [Curiel, Agarwal, Wagner, Cotten, Proc. Natl. Acad.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
Sci. USA 88, 8850–8854 (1991); Curiel, Wagner, Cotten, Birnstiel, Agarwal, Li, Loechel, Hu, Hum. Gen. Ther. 3, 147–154 (1992); Wagner és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6099–6103 (1992)]. DNS növényi sejtekbe történõ bevitele elektroporáció alkalmazásával szakember számára jól ismert. Növényi sejtfalbontó enzimeket, például pektint lebontó enzimeket alkalmaznak, hogy a fogadó sejtek érzékenyebbek legyenek az elektroporációval végzett transzformációra, mint a kezeletlen sejtek. A transzformáció elektroporációval történõ elvégzéséhez alkalmazhatunk fagyasztható szöveteket, például sejtek szuszpenziós tenyészetét, vagy embriogén kalluszt, vagy éretlen embriókat vagy közvetlenül más szervezett szövetet. Általában szükség van a növényi célanyag sejtfalainak részleges lebontására pektinlebontó enzimekkel vagy mechanikai feltárással, szabályozott módon. Ilyen kezelt növényi anyag kész idegen DNS befogadására elektroporációval. Idegen transzformáló DNS növényi sejtekbe való bevitelére szolgáló másik módszer a mikrorészecskebombázás. Ebben a módszerben idegen DNS-sel burkolnak mikrorészecskéket, és mozgató erõvel viszik be sejtekbe. Ilyen mikrorészecskék tipikusan volfrámból, aranyból, platinából és hasonló fémekbõl készülnek. A mikrorészecskebombázás elõnye, hogy nincs szükség sem protoplasztok izolálására [Cristou és munkatársai, Plant Physiol. 87, 671–674 (1988)], sem Agrobacterium-fertõzésre való érzékenységre. A módszer szemléltetés célját szolgáló megvalósítási módja szerint, DNS¹t visznek be kukoricasejtekbe „Biolistics Particle Delivery System” gyorsítással, amelyet DNS-sel burkolt részecskék vagy sejtek mozgatására lehet alkalmazni egy ernyõn keresztül, amelyen egy szûrõ felszíne szuszpenzióban tenyésztett kukoricasejtekkel van burkolva. A szûrõ úgy szórja a sejteket, hogy azok nem nagy aggregátumok formájában jutnak a fogadósejtekhez. A bombázáshoz a szuszpenzióban lévõ sejtek elõnyösen szûrõkön vagy szilárd tenyésztési tápközegen vannak koncentrálva. Alternatív módszer szerint, éretlen embriókat vagy más célsejteket lehet elrendezni szilárd tenyésztési tápközegen. A bombázandó sejteket alkalmas távolságra helyezik el a makrorészecskefékezõ lemez alatt. A bombázásos transzformációban optimalizálni lehet a bombázás elõtti tenyésztési körülményeket és a bombázási paramétereket, hogy maximális számú, stabil transzformánst kapjunk. A bombázáshoz szükséges fizikai és biológiai paraméterek fontosak ebben a technológiában. Fizikai faktorokon olyanokat értünk, amelyek a DNS/mikrorészecske-kicsapási tevékenységben játszanak szerepet, vagy olyanokat, amelyek bármelyik mikrorészecske repülését és sebességét befolyásolják. Biológiai faktorok közé tartozik minden lépés, ami a sejtek bombázás elõtti és közvetlenül bombázás utáni kezelésében szerepet játszik, célsejtek ozmotikus beállítása a bombázással társult trauma mértékének csökkentése céljából; és a transzformáló DNS természete is, például linearizált DNS¹e vagy intakt cirkuláris („supercoiled”) plazmidok¹e.
1
HU 005 673 T2
Az Agrobacterium-közvetített transzfer széles körben alkalmazott módszer idegen DNS bevitelére növényi sejtekbe, mert a DNS¹t egész növényi szövetekbe lehet bevinni, ami szükségtelenné teszi intakt növény regenerálását egy protoplasztból. Agrobacterium-közvetített növényi integrálóvektorok alkalmazása DNS bevitelére növényi sejtekbe szakember számára jól ismert. Lásd például Fraley és munkatársai [Biotechnology 3, 629 (1985)]; Rogers és munkatársai [Meth. in Enzymol. 153, 253–277 (1987)] által leírtak módszereket. Továbbá a Ti¹DNS integrálása egy viszonylag precíz folyamat, ami néhány újraátrendezõdést eredményez. A transzferálandó DNS-régiót a határolószekvenciák határozzák meg, és a közbeékelõdõ DNS rendszerint a növényi genomba integrálódik, Spielmann és munkatársai [Mol. Gen. Genet. 205, 34 (1986)]; Jorgensen és munkatársai [Mol. Gen Genet. 207, 471 (1987)] által leírtak szerint. Modern Agrobacterium transzformációs vektorok E. coliban, valamint Agrobacteriumban képesek replikációra, ami kényelmes manipulációkat tesz lehetõvé, az irodalomban leírtak szerint [Klee és munkatársai (1985)]. Továbbá Agrobacterium-közvetített géntranszferre alkalmazott vektorok területén a közelmúltban bekövetkezett technológiai elõrehaladás javította gének és restrikciós hasítóhelyek átrendezését a vektorokban, olyan vektorok elõállítása céljából, amelyek képesek különbözõ fehérjék vagy polipeptidek expresszálására. A leírt vektorok [Rogers és munkatársai, (1987)] a célnak megfelelõ multilinkerrégiókkal rendelkeznek, amelyeket egy promoter és egy poliadenilálási hely szegélyez az inszertált, polipeptidet kódoló gének expresszálására, és alkalmasak a találmány céljaira. Továbbá, karral rendelkezõ („armed”) és kar nélküli („disarmed”) Ti¹géneket egyaránt tartalmazó Agrobacterium alkalmazható a transzformációkra. Növényi protoplasztok transzformációját olyan eljárások alkalmazásával lehet elérni, amelyek kalciumfoszfátos kicsapásra, polietilénglikolos kezelésre, elektroporációra és ilyen kezelések kombinációira alapulnak [lásd például Potrykus és munkatársai, Mol. Gen. Genet. 199, 183 (1985); és Marotte és munkatársai, Nature és munkatársai, 335, 454 (1988)]. Az ilyen rendszerek alkalmazása különbözõ növényi fajokban függ az adott faj protoplasztokból való regenerálódási képességétõl. 1. példa Anyagok E. coli H10407-törzsbõl származó LT¹B¹t kódoló gén növényoptimalizált szekvenciája a szakirodalomból ismert [Mason és munkatársai, Vaccine 16, 1336–1343 (1998)]. E. coli H10407-törzsbõl származó LT¹A¹t kódoló gén növényoptimalizált szekvenciáját leírták a WO/2003/37609 számú nemzetközi közzétételi iratban, amit eredetileg a 60/113,507 ideiglenes bejelentési számon nyújtottak be. A WO/2003/37609 számú nemzetközi közzétételi iratban leírnak három bináris T¹DNS-vektor (pSLT102, pSLT105, pSLT107) elõállítását, amit Agrobacterium tumefaciens közvetített mó-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
don, Nicotiana tabacum NT–1 növényi sejtek transzformációjára alkalmaztunk a 2. példában leírtak szerint. Az eredményül kapott, transzformált NT–1-sejtvonalak (SLT102, SLT105 és SLT107) teljesen szervezõdött LT¹t és LT¹analógokat expresszáltak és halmoztak fel, amelyek LT¹B¹t és az LT¹A-alegység módosított formáit tartalmazták. Az 1. ábrán bemutatjuk a pSLT107¹et, amely olyan módosított LT¹A-gént tartalmaz, amelyben Ala72 helyettesítve van Arg72-vel. Az SLT102 és SLT105 expressziós termékek azonosak, kivéve azt, hogy különbözõ változtatásokat tartalmaznak az LT¹A-génben (Ser63-ról Lys63¹ra pSLT102ben; Arg192-rõl Gly192¹re pSLT105-ben). Ezek a vonalak nem meghatározott kópiaszámú T¹DNS-régiót tartalmaznak a plazmidokban, stabilan integrálva a nukleáris kromoszomális DNS¹be. A transzgenikus NT1-sejtek LT¹B-alegységeket halmoznak fel, amelyek gangliozidkötõ pentamerekbe szervezõdnek, az összes oldható fehérje 0,4%¹os mennyiségéig, gangliozidfüggõ ELISA-val meghatározva. A transzgenikus NT1-sejtek szintén módosított LT¹A-alegységeket halmoznak fel, amelyek közül néhány LT¹B-pentamerekkel szervezõdik, gangliozidfüggõ ELISA-val, LT¹A-specifikus ellenanyagokkal meghatározva. Elõállítottuk a pQETHK¹, pJC217- és pCS96-plazmidokat is. A pQETHK egy növényoptimalizált, LTB¹t kódoló szekvencia, Quiagens pQE60®-vektorba klónozva; pJC217 [Cardenas és munkatársai, Inf. and Immun. 61, 4629–4636 (1993)] E. coliból származó LTB-szekvenciát és LTA nem kódoló régióját tartalmazza pUC8¹ba klónozva. A pCS96 E. coliból származó LTB- és LTA-alegységet kódoló géneket egyaránt expresszál. Az egyes plazmidokat E. coli DH5a vagy JM83 gazdatörzsben növesztettük LB¹tápközegben (Gibco/BRL), 500 mg/ml ampicillint alkalmaztunk szelekcióra. Natív LT¹t izoláltunk úgy, hogy 1¹2 liter, pCS96¹ot tartalmazó DH5a¹t növesztettünk egy éjszakán át 50 mg/ml ampicillint tartalmazó LB¹tápközegben. A sejteket lecentrifugáltuk Meraeus Megafuge (20 percig, 4000 rpm¹en) alkalmazásával, felszuszpendáltuk 200 ml TE¹pufferben (50 mM Tris, pH=7,2, 1 mM EDTA), 20 percig centrifugáltuk 4000 rpm¹en, és felszuszpendáltuk 100 ml TE¹pufferben, és –80 °C¹on tároltuk. A felszuszpendált csapadékot Branson 450 ultrahangos feltáróban roncsoltuk szét, lapos cserélhetõ fej alkalmazásával, 8. kimeneti fokozaton, 60 ciklusban, 10 percig jégben. A preparátumokat azután 10 000 rpm¹en centrifugáltuk 30 percig, 2–7 °C¹on, J2–21 Beckman centrifugában, és JA¹20 Beckman-rotorban. A felülúszót átvittük új centrifugacsövekbe, és 20 000 RPM¹en centrifugáltuk 1 óra hosszáig. A 20 000 RPM¹es centrifugálás után átvittük dialízistasakba (6000–8000 MWCO), és 2 liter TEN-ben dializáltuk 4 napig (TEN¹t naponta cseréltük). Dialízis után a mintát felvittük TEN-nel ekvilibrált, immobilizált galaktózt tartalmazó affinitásoszlopra körülbelül 10 ml/óra áramlási sebességgel. Az oszlopot néhány oszloptérfogat TEN-pufferrel mostuk, és a kötõdött LT¹t 1 M D(+)galaktózzal eluáltuk. Az LT¹t tartalmazó frakciókat poli-
1
HU 005 673 T2
akrilamid-gélelektroforézissel igazoltuk, egyesítettük és –80 °C¹on tároltuk. 2. példa LT¹t expresszáló, transzgenikus Nicotiana tabacum elõállítása Három-négy nappal a transzformáció elõtt, 1 hetes NT–1-tenyészetet szubkultúrába vittünk friss tápközegben úgy, hogy 40 ml NT–1-tápközeghez 2 ml NT–1-tenyészetet adtunk. A szubkultúrát sötétben tartottuk 25±1 °C¹on, rázógépen, 100 rpm¹en.
Reagens
5
10
NT–1 tápközeg Reagens
MS-sók
Per liter
15
4,3 g
MES-törzsoldat (20 X)
50,ml
B1 inozitol törzsoldat (100 X)
10,ml
Miller-féle I törzsoldat
3,ml
2,4¹D (1 mg/ml)
2,21 ml
Szacharóz
20
30,g
pH=5,7±0,03
25 B1 inozitol törzsoldat (100×) (1 liter) Tiamin-HCl (B1-vitamin) – 0,1 g MES (20×) (1 liter) MES (2¹N-morfolino-etánszulfonsav) – 10 g Mioinozitol – 10 g Miller-féle I (1 liter) KH2PO4 – 60 g A kérdéses expressziós vektort tartalmazó Agrobacterium tumefacienst glicerin-törzsoldatból 50 mg/l spektinomicint tartalmazó LB¹táptalajt tartalmazó tálcákra szélesztettük. A bakteriális tenyészetet sötétben inkubáltuk 30 °C¹on, 24–48 óra hosszáig. Kiválasztottunk egy jól kialakult kolóniát, és átvittük 3 ml, 50 mg/l spektinomicint tartalmazó YM¹tápközegbe. A folyékony tenyészetet sötétben inkubáltuk 30 °C¹on, inkubátorrázógépen, 250 rpm¹en, amíg az OD600 0,5–0,6 lett. Ez körülbelül 24 órát vett igénybe.
Reagens
Bactotyptone
40
Per liter
5g
NaCl
10 g
Difco Bacto Agar
15 g
YM-tápközeg Reagens
Mannit
35
10 g
Élesztõkivonat
Élesztõkivonat
30
45
LB-tápközeg
50
55 Per liter
400 mg 10 g
2
60 7
Per liter
NaCl
100 mg
MgSO4×7 H2O
200 mg
KH2PO4
500 mg
(Alternatív módon, YM¹et por formájában lehet beszerezni a Gibco BRL cégtõl; katalógusszáma #10090–011. Folyékony tenyésztési tápközeg elõállítása céljából 11,1 g¹ot adagolunk 1 liter vízhez.) A transzformáció napján ml¹enként 1 ml, 20 mM acetosziringont adtunk az NT–1-tenyészethez. Az acetosziringon-törzsoldatot etanolban készítettük el a transzformáció napján. Az NT–1-sejteket kismértékben roncsoltuk a transzformációs hatékonyság fokozása céljából. A roncsoláshoz a szuszpenziós tenyészetet többször (20-szor) fel¹le vettük egy 5 ml¹es, széles nyílású, steril pipettán keresztül. Egyenként négy milliliter szuszpenziót vittünk át 10, 60×15 mm¹es Petri-csészékbe. Egy tálcát félretettünk, amit nem transzformált kontrollként alkalmaztunk. Körülbelül 50–100 ml Agrobacterium-szuszpenziót adagoltunk a maradék 9 csészéhez. A csészéket parafilmmel fedtük, azután sötétben inkubáltuk rázógépen, 100 rpm¹en, 25×1 °C¹on, 3 napig. A sejteket átvittük egy steril, 50 ml¹es, kúpos centrifugacsõbe, és feltöltöttük 45 ml végtérfogatra NTC-tápközeggel (autoklávozás után hozzáadott, 500 mg/l karbenicillint tartalmazó NT–1-tápközeg). Összekevertük azokat, majd 1000 rpm¹en, 10 percig centrifugáltuk lengõfejes rotorral felszerelt centrifugában. A felülúszót eltávolítottuk, és a maradék üledéket felszuszpendáltuk 45 ml NTC-ben. A mosást megismételtük. A szuszpenziót lecentrifugáltuk, és a felülúszót kidobtuk, és az üledéket újra felszuszpendáltuk 40 ml NTC-ben. 5 ml¹es aliquotokat szélesztettünk az egyes Petri-csészékre (150×15 mm), amelyek NTCB10-táptalajt (NTC-tápközeg 8 g/l agar-agarral szilárdítva; 10 mg/l bialaphossal kiegészítve, amit autoklávozás után adtunk hozzá) tartalmaztak. A tálcákat parafilmmel fedtük, és sötétben, 25±1 °C¹on tartottuk. A tenyésztõhelyiségbe való átvitel elõtt a tálcákat nyitva hagytuk lamináris áramlást biztosító fülke alatt, hogy a feleslegben maradt folyadék elpárologjon. 6–8 hét múlva feltételezett transzformánsok jelentek meg. Ezeket kiválogattuk, és átvittük friss NTCB5¹be (NTC-tápközeg 8 g/l agar-agarral szilárdítva; 5 mg/l bialaphossal kiegészítve, amit autoklávozás után adtunk hozzá). A tálcákat parafilmmel fedtük, és sötétben, 25×1 °C¹on tartottuk. Feltételezett transzformánsok kis kalluszklaszterek formájában jelentek meg az elpusztult, nem transzformálódott sejtek hátterében. Ezeket a kalluszokat átvittük NTCB5-táptalajra, és hagytuk néhány növekedni. Az egyes feltételezett transzformánsok egy részletét kivettük ELISA-analízishez. Legalább két futtatás ELISA után kiválasztottuk a legtöbb antigént tartalmazó vonalakat. A legjobb vonalakra kapott kalluszanyag mennyiségét azután felszaporítottuk tálcás tenyészetekben, és adott esetben folyékony tenyészetekben.
1
HU 005 673 T2
Az eredményül kapott, SLT102, SLT105 és SLT107 jelû, transzformált NT–1-sejtvonalak E. coli eredetû, hõlabilis enterotoxin B¹alegységét (LT¹B) és az LT¹A-alegység módosított formáját expresszálták és akkumulálták. Az SLT102¹, SLT105- és SLT107-bõl származó expressziós termékeket azonosítottuk, kivéve, ha az LT¹A-gén különbözõ változatait tartalmazták. Egy másik NT–1-vonal, SLT101 a natív LT¹A- és LT¹Bgéneket expresszálta, és minden vonatkozásában ekvivalens volt az E. coliból származó LT¹vel. Ezek a vonalak nem meghatározott kópiaszámú T¹DNS-plazmidrégiót tartalmaztak stabilan integrálva a sejtmagban lévõ (nukleáris) kromoszomális DNS¹be. Valamennyi transzgenikus NT–1-sejt LT¹B-alegységet akkumulált, ami gangliozidkötõ pentamerekké szervezõdött, az oldható összfehérje akár 0,4%-áig is, gangliozid- ELISAval meghatározva. Valamennyi transzgenikus NT–1sejt natív (SLT101) vagy módosított LT¹A (SLT102, SLT105 és SLT107) alegységeket is expresszált, amik LT¹B-pentamerekkel szervezõdtek, gangliozidfüggõ ELISA-val, LT¹A-specifikus ellenanyagokkal meghatározva. 3. példa Oltóanyag elõállítása Pufferek és reagensek: ampicillint a Sigma cégtõl szereztük be (Lot No. 14H0041), és 100 mg/ml¹es törzsoldatot készítettünk steril vízben. Tryptont a Fisher Biotech cégtõl szereztünk be (Lot No. 109756JE). Élesztõkivonatot a Difco cégtõl szereztünk be (Lot No. 132384JD). Nátrium-kloridot (Lot NO. 49H0265), D(+)galaktózt (Lot No. 46HO3561), MES (2¹[morfolino]etánszulfonsav) (Lot No. 29H54281) és nátrium-hidroxid (Lot No. 30K0229) a Sigma cégtõl szereztünk be. Coomassie Brillant Blue G–250¹et a Bio-Rad cégtõl szereztük be. Metanolt a VWR-tõl (Lot No. 38274842) jégecetet az EM Sciences cégtõl (Lot No. K27260700) és etil-alkoholt (Lot No. DUO9723BU) az Aldrich Chemical cégtõl szereztünk be. Foszfátpufferelt nátriumklorid-oldatot az alábbiak szerint állítottunk elõ: 0,14 M nátrium-klorid, 1,5 mM kálium-dihidrogén-foszfát, 2,5 mL kálium-klorid és 6 mM dinátrium-hidrogén-klorid, pH=7,2 (BRL/Gibco). Transzformált NT–1-sejteket kalluszként állítottuk elõ agartálcákon, melyet 0,8% agart tartalmazó NT–1táptalajból preparáltunk. A táptalaj összetétele az alábbi volt: 2,5 mM MES, 1,2 mM dikálium-hidrogén-foszfát (Lot No. 47HO811), 0,1 vegyes% mioinozitol (Lot No. 49H039025), 0,001 vegyes% tiamin-HCl (Lot No. 107H02785), 0,4 vegyes% MS¹sók (Lot No. 470803), 3 vegyes% szacharóz (Lot No. 476H0803) és 0,8 vegyes% agar-agar (L#390906), valamennyit a Sigma cégtõl szereztük be, és 0,22 térfogat% 2,4¹D (Lot No. 107091) a Gibco cégtõl. A szuszpenziós sejtek, valamint az agartálcák is 50 mg/ml kanamicint tartalmaztak (L#129H08941, Sigma), ami szükséges a rekombináns DNS-sel transzformált NT–1 szelekciójának értékeléséhez. A kalluszt átvittük úgy, hogy egy steril pipettával szétroncsoltuk a kalluszt, és kis mennyiségû kalluszt (0,5 cm3) átvittünk friss tálcára. NT–1-sejtek szuszpen-
5
10
15
20
25
30
35
40
2
ziós tenyészetének elõállítása céljából a kalluszt egy pipettával szétroncsoltuk, és néhány darab kalluszt átvittünk agar nélküli NT–1-tápközegbe egy Erlenmeyerlombikba, és forgóinkubátorba helyeztük 28–30 °C¹ra. A sejteket passzálás után 6–12 nappal számos módszerrel elkülönítettük. Teljes, nedves sejtekhez úgy jutottunk, hogy a rázólombikot nyugalomban tartottuk, hogy a sejtek leülepedjenek, azután a tápközeget dekantáltuk. Ultrahanggal feltárt (szonikált) teljes, nedves sejtekhez a fentebb leírtak szerint jutottunk úgy, hogy a nedves sejteket felszuszpendáltuk extrakciós pufferben, amit foszfátpufferelt nátrium-kloridban (pH=7,2) készítettünk el, és 50 nM nátrium-aszkorbátot, 1 mM EDTA¹t, 1 mM PMSF¹et és 0,1% Triton X–100¹at (mindet a Sigma cégtõl szereztük be) tartalmazott. A sejteket Branson 450 ultrahangos feltáróban roncsoltuk, lapos cserélhetõ fej alkalmazásával, 8. kimeneti fokozaton, 60 ciklusban, 10 percig jégben. Szonikált, nedves sejtekbõl származó felülúszót és az üledéket 20–30 perces, 3400 rpm¹en végzett centrifugálással állítottunk elõ, Beckman GPR centrifugában. Teljes, szárított sejteket úgy preparáltunk, hogy a teljes, nedves sejteket Büchner-tölcsér és Spectramesh alkalmazásával szûrtük; az összegyûjtött sejteket Spectramesh-lapokon szétterítettük egy lapos mûanyag tálcára, azután élelmiszer-szárítóba helyeztük egy éjszakára. A táplálékkal beadott kezelésekhez a teljes sejtekben, szárított sejteket vagy szonikált nedves sejtekben elõzõleg meghatároztuk a célantigén mennyiségét, majd azt közvetlenül az etetõedényekbe helyeztük. A célantigén fogyasztása azonban brojlercsirkék esetén sokkal hatékonyabb volt, ha a teljes, nedves sejteket, szárított sejteket vagy szonikált sejteket elõször összekevertük a táplálékkal (6 gramm 1 napos brojlercsirkéknek), és „X” madarat tartalmazó boxonként egyetlen etetõtálba helyeztük. Intranazális (IN) oltáshoz a nedves sejteket, szárított sejteket vagy szonikált sejteket PBS-ben szuszpendáltuk, amíg konzisztens állapotot el nem értünk, ami lehetõvé tett 25 ml pipettázását a madár orrnyílásába. A sejtek tömeg/térfogat aránya, ami tipikusan szükséges IN¹oltáshoz, 1 rész sejt 2 rész extrakciós pufferben.
4. példa Vakcina beadása és kezelések Brojlercsirkéket a Stover Hatchery (Stover MO) cégtõl szereztünk be. Ezek a csirkék hím vagy vegyes nemû csirkék voltak, amiket kis tenyész-brojler mûveletekhez keltettek. A csirkék elsõbbségi, expressz postá50 val érkeztek, és azonnal csirkekeltetõ Petersime-ketrecekbe helyeztük azokat (7¹et ketrecenként). Egy kezelésbe bevont csirkék számát teljesen véletlenszerû tervezésre alapoztuk, megismételt méréseket alkalmazva. Feleslegben maradt csirkéket random helyeztük el 55 egyedi ketrecekben, és olyan csirkék helyettesítésére használtuk ezeket, amelyek elpusztultak a szállítási vagy az elhelyezési stressz miatt. Víz korlátlanul (ad libitum) rendelkezésre állt közvetlenül attól kezdve, hogy a madarak a ketrecekbe kerültek. A madarak koplalta60 tása céljából, a táplálékot egy éjszakán át megvontuk, 45
8
1
HU 005 673 T2
és a következõ reggel adtuk be az oltást, vagy a táplálék egy éjszakán át korlátlanul (ad libitum) rendelkezésre állt, és azután reggel 5 óra hosszáig megvontuk, és délután végeztük az oltást. A táplálékkal beadott oltások esetén a növénybõl származó antigénbõl egy vizes zagyos készítettünk minimális mennyiségû vízzel, és azután a táplálékhoz kevertük csomós pasztát elõállítva. A táplálékot etetõtálba helyeztük, és az etetõtálat a ketrecbe helyeztük, hogy minden madár hozzáférjen. Töméssel végzett kezeléshez egy fecskendõre rögzített, 2,5 cm¹es tömõtût alkalmaztunk közvetlenül a nyelõcsõbe vagy begybe történõ oltáshoz. Az intranazális beadáshoz 25 ml¹t oltottunk közvetlenül az orrlyukakba. A csirkék általában 18 és 30 órásak voltak oltáskor, tehát valamennyi klinikai kísérlet a csirkék 1 napos életkorában kezdõdött, a kísérlet 0. napján. 5. példa Kvantitatív ELISA Nunc Maxisorp 96 mérõhelyet tartalmazó ELISAtálcákat 5 mg/mérõhely kevert GM1-ganglioziddal burkoltunk 0,01 M borátpufferben, 100 ml/mérõhely alkalmazásával; a tálcákat szobahõmérsékleten inkubáltuk egy éjszakán át. A tálcákat 3¹szor mostuk PBSTween®-nel (1×¹es 0,05% Tween 20¹at tartalmaz, Sigma Lot No. 120K0248). Az egyes mérõhelyeket azután egy óra hosszáig inkubáltuk 37 °C¹on 200 ml blokkolópufferrel, ami 5 vegyes% zsírmentes tejport tartalmazott PBS–0,05% Tween20-ban. A mérõhelyeket 1× mostuk 250 ml/mérõhely PBS-Tween20-szal. A referenciaantigént és a mintaantigéneket összekevertük a blokkolópufferrel, mielõtt a tálcára adagoltuk. LT referenciaantigént és LT¹B referenciaantigént 50 ng/ml¹re hígítottuk az elsõ mérõhelyen, míg a mintákból elõzetesen hígításokat készítettünk néhány különbözõ kiindulási hígításban. A mintákat úgy adtuk a tálcára, hogy 200 ml mintát mértünk az A sorba, és 100 ml blokkolópuffert a többi sorba. Mérõhelyenként 100 ml összekeverésével és átvitelével felezõ hígítási sort készítettünk. A tálcákat azután 1 óra hosszáig inkubáltuk 37 °C¹on, 3× mostuk PBS-Tweenben, és hozzáadtunk mérõhelyenként 100 ml, blokkolópufferben hígított antiszérumokat, és 1 óra hosszáig inkubáltuk 37 °C¹on. A tálcákat 3× mostuk PBS-Tweenben, és azután hozzáadtunk 100 ml ellenanyag-konjugátumot, és 1 óra hosszáig inkubáltuk 37 °C¹on. A tálcákat 3× mostuk PBS-Tweenben, és azután hozzáadtunk 50 ml TMBszubsztrátot az egyes mérõhelyekre, és a szubsztrát hozzáadása után 20 perccel hozzáadtunk TMB-stopoldatot. Az optikai denzitást 450 nm hullámhosszon mértük Tecan Sunrise tálcaleolvasóban. Az adatokat átvittük és ábrázoltuk Tecan Magellan szoftver alkalmazásával. Lineáris regressziót és kvantitatív kiértékelést végeztünk Microsoft Excel 200 9.0.3821 SR–1 verziójú szoftverrel. 6. példa Szérum ELISA Vért vettünk 0–7 napos madaraktól a fej eltávolításával (dekaptációval) vénaszúrással a szárnyba vagy a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
jugularis (nyaki) vénába. A madarakat cervikális diszlokációval pusztítottuk el vagy szén-dioxid-atmoszférában tartottuk azokat 1–5 percig a dekapitáció elõtt. A vért az állatházból átvittük a laboratóriumba, és 2–7 °C¹ra helyeztük 45 percig, hogy vérrögök képzõdjenek és tömörödjenek. A vérmintákat áthelyezzük 37 °C¹os vízfürdõbe 10 percig, azután lecentrifugáltuk 20 percig, 2500 rpm¹en, Beckman GPR centrifugában, 2–7 °C¹on. A szérumot aszeptikusan eltávolítottuk az egyes csövekbõl, 0,5–1,5 ml aliquotot helyeztünk fagyasztócsövekbe („cryotube”, Nunc), és –18 °C¹on tároltuk azokat felhasználásig. Szérum ELISA-hoz, a gangliozidadszorpciós lépésben 1,5 mg/ml¹t alkalmaztunk egy éjszakás inkubálással, 2–7 °C¹on. A tálcákat 3× mostuk PBS-Tweennel, és 200 ml/mérõhely, 3% zsírmentes tejport tartalmazó PBS-Tweenben blokkoltuk. A szérummintában lévõ ellenanyagtiter meghatározása céljából a gangliozid adszorbeálása után, 100 ml LT¹B¹t vagy LT¹t 2,5 mg/ml koncentrációban, blokkolópufferben adtunk a mérõhelyekre, és 1 óra hosszáig inkubáltuk 37 °C¹on. A tálcákat 3× mostuk PBS-Tweennel, és azután 200 ml, blokkolópufferben hígított szérummintát adtunk az A sorhoz, és 100 ml blokkolópuffert adtunk a többi sorhoz. A szérum kiindulási hígítása 1:10 volt, hacsak másképpen nem specifikáljuk. A szérummintákból felezõ hígítási sort készítettünk, a tálcákat 1 óra hosszáig, 37 °C¹on inkubáltuk, és azután 3× mostuk PBS-Tweennel. Kecskében, csirke ellen termeltetett, az optimális kötéshez elõzetesen titrált ellenanyagot, és kromogént adtunk hozzá, és 1 óra hosszáig, 37 °C¹on inkubáltuk. A tálcákat mostuk, és hozzáadtunk 100 ml ABTS¹t, és addig inkubáltuk, amíg a pozitív kontroll kezdeti hígításának abszorbanciája 405/492 nm kettõs hullámhosszon 0,7–1,0 lett, Tecan Sunrise™ tálcaleolvasóban. Az adatokat átvittük és ábrázoltuk Tecan Magellan szoftver alkalmazásával. Lineáris regressziót és kvantitatív kiértékelést végeztünk Microsoft Excel 200 9.0.3821 SR–1 verziójú szoftverrel. Az egyes kezelt csoportokra meghatároztuk a szérum titerének geometriai középértékét Microsoft Excel 200 9.0.3821 SR–1 verziójú szoftverrel. A 10¹nél kisebb ELISA háttértitereknek 1 értéket adtunk ezekben a számításokban. Azokat a kezeléseket tekintettük hatékonynak, amelyekben szignifikáns különbség volt a kezelt csoport és vakcinát nem kapott, és a nem fertõzött, kontrollcsoport között.
7. példa Y1 jelû adrenalis sejtekkel végzett vizsgálati eljárás Egerekbõl származó, Y1 jelû adrenalis (mellékvese¹) sejteket az ATCC-tõl szereztünk be (CCL–79, L#1353400). A sejteket tartalmazó edényt felolvasztottuk 37 °C¹on, és 25 cm2¹es T¹edénybe (Corning) he55 lyeztük, amelyben 10 ml tenyésztési tápközeg 15% donor lószérumot (Quad¹5 L# 2212), 2,5% magzati marhaszérumot (JRH L# 7N2326), 1% glutamax-1¹et (Gibco L# 1080323) tartalmazott F–12K-tápközegben (Gibco L# 1089716). A sejteket 37 °C¹on inkubáltuk 60 5% szén-dioxidban. A sejteket ebben a tenyésztési 50
9
1
HU 005 673 T2
tápközegben tartottuk minden passzáláskor, és LT és CT citotoxicitási vizsgálati eljárásokhoz. A vizsgálathoz a sejteket 96 mérõhelyet tartalmazó, sejttenyésztõ tálcákba (Nunc) passzáltuk, és hagytuk, hogy 80%¹os konfluenciát érjenek el. LT¹ vagy CT¹toxint 1 mg/ml¹re hígítottunk F–12K növesztési tápközegekben. A toxint tovább hígítottuk felezõ hígítási sorban, 96 mérõhelyet tartalmazó, mikrotitertálcában úgy, hogy 100 ml elõzõleg hígított mintát adtunk a tálca A sorába. Azután felezõ hígítási sort készítettünk úgy, hogy az A sorból 50 ml mintát átvittünk a következõ mérõhelyre, amely 50 ml növesztési tápközeget tartalmazott. Minden hígított mintát 1–4, Y1 jelû adrenalis sejteket tartalmazó mérõhelyhez adtunk, attól függõen, mennyi minta vagy sejt állt rendelkezésre. A CT¹ vagy LT¹toxin végponttitere az mg/ml érték, ami 50%¹os citotoxicitáshoz (sejtpusztuláshoz) szükséges [Guidry, J. J. és munkatársai, Inf. and Immun. 65, 4943–4950 (1993)].
5
10
15
20 8. példa Brojlermadarak fertõzése natív LT¹vel Brojlercsirkéket tartottunk 10 vagy 21 napos korukig, 5¹6 madarat ketrecenként. Egy pilot vizsgálatban 16 napos csirkéket elosztottunk 3 csoportra (5 madár oltás nélkül, 5 madarat 100 mg/madár mennyiséggel, 5 madarat 200 mg/madár mennyiséggel kezeltünk), és szubkután beoltottunk E. coliból származó natív LT¹vel. Az LT¹toxinról elõzõleg meghatároztuk, hogy aktív formában van¹e, egéreredetû Y1 jelû adrenalis sejteken történõ titrálással, a fentebb leírtak szerint. A madarakon óránként figyeltük a klinikai jeleket, 8 óra hosszáig az oltás után. Az oltás utáni 1., 2., 4., 8., 24. és 26. órában a madarakat elpusztítottuk, és makroszkopikus (szabad szemmel végzett vizsgálat) nekropsziát végeztünk. Feljegyeztük a kritikus szervek, ideértve a belek, máj, vese, lép és mellékvese tömegét és elváltozásait, valamint a testtömeget. A második vizsgálathoz 84, 21 napos madarat elosztottunk 6 csoportba, ahol egy csoportban 16 madár volt, és szubkután oltottuk 0, 10, 50, 100, 200 vagy 400 mg natív LT¹holotoxonnal madaranként. Oltás után 10, 24 és 48 órával az egyes csoportokból 5 madárnak vizsgáltuk a testtömegét, szabad szemmel látható patológiát, a széklet konzisztenciáját és az általános egészségi állapotot. Valamennyi madárnak táplálék és víz korlátozás nélkül (ad libitum) rendelkezésre állt a vizsgálat alatt. 9. példa Szerológiai válasz orálisan beadott CT¹B¹re brojlercsirkékben Kolera-toxin B alegységet (CT¹B) adagoltunk a táplálékhoz, vagy közvetlenül oltottuk csirkékbe különbözõ formák alkalmazásával. Ehhez a vizsgálathoz három oltást végeztünk 1, 14 és 28 napos korukban; vért vettünk az ellenanyag-analízishez az 1, 14, 28 és 35 napos korban. Az adatok számos olyan megfigyelést tükröztek, amit elõzõleg már leírtak emlõsökre, azonban nem írtak le csirkékre. Mérhetõ szerológiai
25
30
35
40
45
50
55
60 10
2
választ könnyen detektáltunk 28 napos korban vagy két héttel a második vakcináció után 14 napos korban. Tehát csak két dózis volt szükséges detektálható válasz indukálásához. Azonban egy harmadik dózis beadása 28 napos korban fokozta a választ. Az intranazális (IN) és a táplálékkal beadott (OF) oltások egyaránt szerológiai válaszokat indukáltak; a legmagasabb titer (5407) 20 mg CT¹B-oltással alakult ki, amit 25 ml vizes oldatként adtunk a csõr egyes orrlyukaiba. CT¹B orális beadása szintén jó választ biztosított, akár 20 mg dózis baromfitöméssel (titer 1790), vagy 40 mg közvetlenül a táplálékra (fedõrétegként) sprayzve (titer 365). Ahogyan emlõsszervezeteken megfigyelték, az IN¹út CT¹B alkalmazásával jó szerológiai választ ad [Verweiji és munkatársai, Vaccine 16, 2069–2076 (1998); és Isaka és munkatársai, Vaccine 16, 1620–1626 (1998)]. Azonban a szükséges dózis térfogata kicsi, hogy bejuthasson az orrlyukakon keresztül. Ebben az esetben tisztított CT¹B-toxint lehet elõállítani 2 mg/ml¹es törzsoldatként, ami lehetõvé tesz alkalmas 20 mg dózist, 25 ml-ben történõ bevitelét. A spray-vel történõ beadáskor 20 mg¹ot alkalmazunk 6 gramm táplálékban, vagy körülbelül 0,3 ppm¹et, ami jó titert biztosít. A CT¹B hígítását a táplálékon és az eredményül kapott válasz mértékét tekintve, az orálisan beadott dózisok jó GALT-stimulálást biztosítottak, akár közvetlenül a nyelõcsõbe adva, vagy ad libitum 6 gramm oltóanyagot fogyasztva. Összehasonlításképpen: 2 mg CT¹Bdózis IN¹beadva vagy 40 mg orálisan táplálékkal beadva csirkékben nagyon hasonló ahhoz a dózishoz, ami mukozális választ stimulál egerekben. CT¹B¹re ebben a vizsgálatban kimutatott hatásos dózis összehasonlítható azzal az antigénmennyiséggel is, amit állatokban szokásosan alkalmaznak intramuszkuláris (IM) vagy szubkután (SC) módszerekben. Továbbá nem figyeltük meg CT¹B által kifejtett mellékhatásokat ezekben a madarakban; a tömeggyarapodás és a táplálék fogyása normális volt, ami alátámasztja növényi eredetû, transzgenikus antigének orális vakcinaként való biztonságos alkalmazását. 10. példa Szerológiai válasz dohányból származó LT¹re csirkékben CT-B¹re meghatározott, hatásos dózis alkalmazásával egy második vizsgálatot végeztünk annak értékelésére, hogy vajon natív, E. coliból származó hõlabilis toxin (LT) vagy LT¹B, valamint módosított, hõlabilis toxint kódoló gén hasonló válasz képes¹e elõidézni. Ebben a vizsgálatban 40 mg toxint adtunk be három dózisban, hasonló idõbeosztásban, mint a fentebb leírt CT¹B-vizsgálatban, ahol az LT¹B mennyiségét kvantitatív ELISA-val határoztuk meg. Az 1. táblázatban bemutatjuk az eredményeket, amiket dohányból származó LT (SLT) és natív toxin beadásával kaptunk táplálékhoz adagolt módszerrel vagy orális vakcinációval. Valamennyi kezelt csoport adott választ, kivéve az SLTfelülúszó. Az „SLT teljes” minták (titer 844) és az „SLT szonikált” (titer 557) adták a legerõsebb választ ebben a vizsgálatban.
1
HU 005 673 T2
2
1. táblázat Növényi eredetû LT bakteriális eredetû LT¹, LT¹B- és CT¹B-hez viszonyítva GMT: titer geometriai középértéke Kezelt csoport
0. nap GMT
14. nap GMT
28. nap GMT
34. nap GMT
10a
<10a
<10
<10
NT szonikált
<10a
<10a
<10
<10
NT szárított – kevert
<10
<10
<10
<10
CT¹B – spray-zett
<10
<10
77
266
LT¹B – spray-zett
<10
<10
30
171
LT – spray-zett
<10
<10
32/53
133/226
SLT teljes – kevert
<10
<10
260
844
SLT szonikált – kevert
<10
<10
130
577
SLT üledék – kevert
<10
<10
30
272
80
<10
<10
<10
SLT szárított – kevert
<10
<10
20
96
SLT szonikált – kevert O/N
<10
<10
12
72
PBS
SLT felülúszó – kevert
Az „SLT egész” kifejezésen egész, nedves sejteket értünk, melyeket úgy izoláltunk, hogy egyszerûen hagytuk leülepedni a sejteket az NT–1-termelõ edényben, a tápközeget dekantáltuk és a megmaradt egész sejteket a maradék tápközeggel összekevertük, és a táplálékhoz adtuk. Az „SLT szonikált” kifejezésen olyan egész sejteket értünk, amiket elõször ultrahanggal kezeltünk a sejtfal szétroncsolása céljából, és azután összekevertük a táplálékkal. Mindkét dohányból származó SLT-minta jobb szerológiai választ indukált, mint a natív LT vagy CT¹B, ha közvetlenül a táplálékhoz adtuk. Ezek az eredmények alátámasztják, hogy a dohánysejtekbõl származó LT (SLT) és a natív LT egyaránt jó mukozális antigén csirkékben. A 2. táblázatban továbbá bemutatjuk, hogy dohányból szárma-
zó SLT nem rendelkezik káros mellékhatásokkal, a testtömeg-növekedés mérése alapján, amelyek adatokat biztosítanak annak alátámasztására, hogy csirkék25 nek biztonságosan lehet vakcinát beadni orálisan, növényi eredetû vagy natív LT¹t alkalmazva. Továbbá 40 mg natív LT¹toxin 1, 14 és 28 napos korban történõ beadása után nem tapasztaltunk látható enteropatogén hatásokat (hasmenés, nyugtalanság, kiszáradás) 30 kezelt madarakban, semmilyen életkorban. Az LT tömege testtömeg-kg-onként 0,6 mg/LT/kg-testtömegnek becsülhetõ, ami jóval az egerekre megfigyelt letális dózis felett van [Gill, M. D., Microbiol. Reviews 46, 86–94 (1982)], és alátámasztja azt a feltételezést, 35 hogy natív LT¹t biztonságosan lehet alkalmazni csirkékben.
2. táblázat Átlagos össztesttömeg madaranként, kezelésenként Kezelés
Átlagos tömeg 0. nap (kg)
Átlagos tömeg 14. nap (kg)
Átlagos tömeg 28. nap (kg)
Átlagos tömeg 34. nap (kg)
PBS-kontroll
0,038
0,29
1,06
1,34
NT szonikált-kevert
0,040
0,30
1,06
1,39
NT szárított-kevert
0,039
0,32
1,04
1,36
CT-B-spray-zett
0,040
0,30
1,04
1,36
LT-B-spray-zett
0,038
0,29
0,98
1,3
LT-spray-zett
0,040
0,30
1,02
1,32
SLT teljes-kevert
0,040
0,29
0,94
1,28
SLT szonikált-kevert
0,040
0,30
1,00
1,3
SLT üledék-kevert
0,038
0,30
1,04
1,38
SLT felülúszó-kevert
0,040
0,33
0,92
1,32
SLT szárított-kevert
0,040
0,32
1,08
1,42
SLT szonikált-kevert és szárított egy éjszakán át
0,038
0,33
1,12
1,41
11
1
HU 005 673 T2
11. példa SLT¹re adott szerológiai válasz kialakulása és a szerológiai válasz idõtartama Az elõzõ két vizsgálatban kimutattuk, hogy a natív, E. coliból származó vagy dohányból származó, hõlabilis toxin erõs szerológiai választ indukál brojlercsirkékben. Egy kísérletben azt a legkorábbi életkort vizsgáltuk, amelyben már mérhetõ a válasz brojlercsirkékben, és a válasz idõtartamát. Ebben a kísérletben a dózist és a madarak életkorát változtattuk SLT¹re adott válasz vizsgálatára. A 3. táblázatban bemutatjuk a kezelt csoportokat, a madarak életkorát a dózis beadásakor és az alkalmazott antigén mennyiségét az egyes dózisonként ebben a vizsgálatban. A második dózis alacso-
2
nyabb volt az antigén alacsony hozama miatt, ami alacsonyabb antigéndózist jelent, ha szétosztjuk a csoportok között. Az IN¹dózis körülbelül 100 ng volt; az alacsony dózis amiatt volt, mert az SLT-antigént a do5 hánysejttömeg meghígítja, és az SLT-sejtek felszuszpendálását elegendõen homogénné kell tenni, hogy lehetõvé tegye az egynapos madarak orrlyukába juttatást. NT–1-sejtek szuszpenziója olyan mértékben van felhígítva, hogy egy pipettával nagy kis mennyiségû ol10 tás bevihetõ legyen az elsõ dózisban. Mindezek ellenére, ha egy második, ismétlõ oltást táplálékban adunk be, ezek a madarak választ adnak, ami arra utal, hogy kis dózis is elég, hogy a madarakban kezdeti immunválasz alakuljon ki IN beadott LT¹antigénnel szemben.
3. táblázat Kezelés
1° dózis (mg)
2° dózis (mg)
3° dózis (mg)
1. IN/orálisan NT kontrollsejtek (0., 14., 28. nap)
0
0
0
2. Táplálékban NT kontrollsejtek (0., 14., 28. nap)
0
0
0
3. Táplálékban SLT102-sejtek (0., 14., 28. nap)
5
3
3
4. Táplálékban SLT102-sejtek (0., 14. nap)
5
3
N/A
5. Táplálékban SLT102-sejtek (0., 7. nap)
5
3
N/A
6. Táplálékban SLT102-sejtek (0., 7., 14. nap)
5
3
3
7. Táplálékban SLT102-sejtek (0., 14., 28. nap)
40
25
25
8. Táplálékban SLT102-sejtek (0., 14. nap)
40
25
N/A
9. Táplálékban SLT102-sejtek (0., 7. nap)
40
25
N/A
10. Táplálékban SLT102-sejtek (0., 7., 14. nap)
25
25
11. IN/orálisan SLT102-sejtek (0., 14., 28. nap)
100,(ng)
40
25
25
12. IN/orálisan SLT102-sejtek (0., 7., 14. nap)
100,(ng)
25
25
A legjobb szerológiai választ akkor figyeltük meg, A 3A. táblázatban bemutatjuk a szerológiai válaszoamikor csak két dózist adtunk a madárnak, és mindkét kat. A legkorábbi életkor, amelyben szerológiai választ esetben az elsõ oltás 1 napos korban történt, és a málehetett detektálni, 21 napos kor volt, függetlenül attól, sodik oltás 7 napos korban történt. Mivel a csirkéket tihogy a dózist a 0, 7 vagy 14 napos korban adtuk be. A 3., 7. és 11. csoportban egy harmadik dózist is adtunk 40 pikusan in ovo oltják a kikelés elõtti harmadik napon vagy egynapos korban a keltetõben, kezdeti im28 napos korban, de ez nem volt szükséges kimutatható munválasz kialakításának lehetõsége a madarak egytiterhez. A 21 napos korban detektált válasz 42 napos napos korában adaptálható a csirketenyésztés gyakoréletkorig tartott, ami összhangban volt azzal az életkorral, latába. amikor a brojlercsirkéket értékesítik (35–65 naposak). 3A. táblázat Szerológiai válasz kialakulása és a válasz idõtartama Kezelés
0. nap GMT
7. nap GMT
14. nap GMT
18. nap GMT
21. nap GMT
28. nap GMT
35. nap GMT
42. nap GMT
1.
14
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
2.
40
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
3.
20
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
4.
28
<10
<10
<10
<10
17
<10
<10
5.
20
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
6.
20
<10
<10
<10
<10
13
<10
<10
7.
20
<10
<10
<10
<10
22
65
49
12
1
HU 005 673 T2
2
3A. táblázat (folytatás) Kezelés
0. nap GMT
7. nap GMT
14. nap GMT
18. nap GMT
21. nap GMT
8.
20
<10
<10
<10
26
61
78
68
9.
28
<10
<10
15
36
116
335
453
10.
28
<10
<10
<10
26
160
394
292
11.
14
<10
<10
<10
<10
<10
16
21
12.
20
<10
<10
<10
19
90
143
108
12. példa Brojlermadarak kezelése E. coliból származó natív LT¹vel A 4. és 5. táblázatban bemutatjuk két vizsgálat eredményeit, amelyekben 10 napos és 21 napos brojlermadarakat kezeltünk szubkután natív LT¹vel. Szubkután oltást alkalmaztunk, mivel leírták, hogy ez legalább olyan hatásos, ha nem hatásosabb eljárás, mint egerek letális fertõzése [Isaka és munkatársai, (1998)]. 16 madár és három kezelt csoport alkalmazásával nem lehetett látni számottevõ különbséget a kezeletlen és kezelt madarak között. Bár néhány madár esetén enyhe hasmenést és enyhe vérzést tapasztaltunk, a hisztológiai metszeteken nem tapasztaltunk különbséget a kezelt madarak és a kezeletlen kontrollok között. Hasmenésre érzékeny állatok egyik jellemzõje a vízvisszatartás mértéke a belekben, teljes testtömegre vonatkoztatva. Azonban ebben a vizsgálatban a belek testtömegre vonatkoztatott átlagos tömege ténylegesen alacsonyabb volt a kontrollokban, mint a 100 mg-mal kezelt csoportban. Ezekre az eredményekre alapozva kijelenthetjük, hogy nem voltak intenzív patológiai válaszok madarakban, ha LT¹t ilyen módszerrel beadtunk. Egy második vizsgálatban, ugyanebbõl a fészekaljból származó, 84 db, huszonegy napos brojlermadarat pilotkísérletként kezeltünk tágabb tartományban natív LT¹vel. Mivel nem láttunk különbségeket a minták kö-
15
20
25
30
35
28. nap GMT
35. nap GMT
42. nap GMT
zött hisztokémiai szinten, vagy szabad szemmel látható patológiában, és a madarak össztömegében a pilotvizsgálatban, csak szabad szemmel látható patológiai és általános egészségi állapotra vonatkozó megfigyeléseket végeztünk a második vizsgálatban. Az 5. táblázatban bemutatott adatok azt mutatják, hogy a kezelt csoporttól függetlenül, nem volt patológia vagy az általános egészségi állapotot átfogóan érintõ változás a madarakban, függetlenül az LT¹koncentrációjától vagy a megfigyelés idõpontjától. Bár néhány vérzõ sérülést láttunk néhány kezelt mintában, ezeket megfigyeltük a kontrollokban is, és így tehát úgy tekintjük, hogy ez nem a kezeléssel társult. A vizsgált átlagos tömeg madaranként ebben a pilotkísérletben 162 g volt, míg a madarak átlagos tömege a fertõzési vizsgálatban 636 g volt. Ezért az LT¹tömeg a madarak testtömegére vonatkoztatva mindkét vizsgálatban 0,2 mg/kg és 1,2 mg/kg között volt. A közölt tömeg/testtömeg arány az irodalomban leírtak szerint letális egerekre 1 mg/kg testtömegig CT¹re (IN beadva) és 0,25 mg/kg¹ig LT¹re (IV beadva) [Glenn és munkatársai, J. Immunol. 161, 3211–3214 (1998); és Gill (1983)]. Emberekben akár 0,1 mg/kg is elegendõ, ami súlyos, több literes folyadékveszteséget okoz. Az itt tesztelt arány, ami elfogadott és érzékeny módszer LT¹fertõzésre, nem okozott semmilyen hasmenéses indikációt kontrollhoz viszonyítva.
4. táblázat Natív LT szubkután oltásának vizsgálata 10 napos madarakban Kezelés
Szabad szemmel látható patológia
Szerv tömege
Madár tömege
bél
máj
vese
lép
mellékvese
bél
máj
vese
lép
mellékvese
G1 1. madár
N
N
N
N
nd
18,5
8,1
1,0
0,2
nd
166,8
2. madár
N
N
N
N
nd
19,4
9,95
1,15
0,36
nd
174,4
3. madár
N
N
N
N
nd
19,1
1,95
0,16
nd
178,3
4. madár
N
N
N
N
N
22,4
9,12
1,54
0,21
nd
204,4
5. madár
N
N
N
N
N
16,2
5,6
1,4
0,16
nd
156,8
G2 6. madár
N
N
N
N
nd
19,5
12,9
1,3
0,2
nd
178,4
7. madár
N
N
s. h.
N
nd
17,8
12,3
1,3
0,17
nd
191,1
13
11,7
HU 005 673 T2
4. táblázat (folytatás) Kezelés
Szabad szemmel látható patológia
Szerv tömege
Madár tömege
bél
máj
vese
lép
mellékvese
bél
máj
8. madár
N
s. h.
N
N
N
15,6
9,2
1,92
0,18
nd
167,6
9. madár
D
s. h.
N
N
N
11,4
8,1
1,51
0,5
nd
166,6
10. madár
D1
N
N
N
N
14,82
10,8
2,3
0,09
nd
170,6
G3 11. madár
N
N
N
N
nd
21,4
14,9
0,99
0,17
nd
186,9
12. madár
N
N
N
N
nd
18,0
8,0
1,2
0,2
nd
167,2
13. madár
N1
s. h.
nd
N
N
19,09
12,4
2,5
0,13
nd
196,1
14. madár
N1
N
N
N
N
13,5
7,2
1,8
0,27
nd
142,7
15. madár
D
N
N
N
N
13,1
7,4
1,9
0,11
nd
144,1
16. madár
D
N
N
N
N
7,6
6,7
1,4
0,14
nd
110,3
vese
lép
mellékvese
G1-csoport, 1 nem oltott kontroll; nd=nincs meghatározva; D¹vízmentes; s. h.=kismértékû vérzés; G2-csoport 2100 mg/madár; G3¹csoport 3200 mg/madár; 1 Némi hasmenést jegyeztünk fel a pusztulás után.
5. táblázat Brojlermadarak kezelése natív LT alkalmazásával szubkután úton Kezelés1
Madár tömege (átlagos tömeg, gramm)
Bél
Máj
Vese
Lép
G1–0 mg kontroll 10 h1
695
N
N
N
N
G1–0 mg kontroll 24
h1
666
N
N
N
N
G1–0 mg kontroll 48
h2
741
m. h. 1 madár
s. he. 2 madár
N
N
G2–10 mg kezelés 10
h1
627
N
N
N
N
G2–10 mg kezelés 24
h1
662
s. h. 1 madár
N
N
N
G2–10 mg kezelés 48
h3
756
N
N
N
N
G3–50 mg kezelés 10
h1
683
N
N
N
N
G3–50 mg kezelés 24 h1
641
N
N
N
N
G3–50 mg kezelés 48 h2
728
N
N
N
N
G4–100 mg kezelés 10 h1
755
m. h. 2 madár
s. he. 2 madár
N
N
G4–100 mg kezelés 24 h1
690
N
N
N
N
G4–100 mg kezelés 48 h
665
m. h. 1 madár
N
m. h. 1 madár
G5–200 mg kezelés 10 h1
686
N
N
N
N
G5–200 mg kezelés 24 h1
700
N
N
N
N
G5–200 mg kezelés 48 h2
670
N
N
N
N
G6–400 mg kezelés 10
hr1
625
N
s. h.
N
N
G6–400 mg kezelés 24
hr1
534
N
N
N
N
605
N
N
N
N
G6–400 mg trt 48
hr3
1
4 madár idõpontonként, kezelt csoportonként. 6 madár idõpontonként, kezelt csoportonként.. 3 5 madár idõpontonként, kezelt csoportonként m. h.=enyhén vérzéses; s. he.=kis hematóma; s. h.=kismértékben vérzéses. 2
14
1
HU 005 673 T2
15. példa SLT és LT alkalmazása adjuvánsválaszhoz intranazális/okuláris oltással Ezt a kísérletet olyan LT¹dózis vizsgálatára terveztük, amely adjuvánsként történõ alkalmazásához szükséges más antigén intranazális/okuláris beadásával. Ebben a vizsgálatban a célantigén Newcastle-betegség vírusából származó hemagglutinin-neuraminidáz (HN) fehérje volt, melyet az 5,310,678 számú USA-beli szabadalmi leírásban közöltek. NT–1-sejteket transzformáltunk lényegében a 2. példában leírtak szerint, transzformációs vektorként pCHN18 alkalmazásával, ezzel olyan transzformált NT–1-vonalat állítottunk elõ (CHN18), ami natív HN¹gént expresszált. Immunogéneket az alábbiak szerint, külön-külön preparáltunk a transzformált sejtek szétroncsolásával és SLT¹t, HN¹t expresszáló és nulla-kontroll NT–1-sejtek extraktumainak liofilizálásával. Körülbelül 1 gramm szûrt sejteket 2 ml pufferbe (DPBS és 1 mM EDTA) helyeztünk, és ultrahanggal kezeltük (szonikáltuk) 15–20 másodpercig jégben. Az ultrahangos kezelést Branson 450 ultrahangos feltáróban végeztük, cserélhetõ mikrotip alkalmazásával, 8. kimeneti fokozaton, 60 ciklusban, 20 másodpercig. Az ultrahanggal kezelt anyagot azután 16 000 g¹n, 10 percig centrifugáltuk a sejttörmelékek eltávolítása céljából, és a felülúszót dekantáltuk. Az extraktumot üveg szérumtároló edényekbe helyeztük, liofilizáltuk és felhasználásig 2–7 °C¹on tartottuk. A liofilizált sejtextraktumokat oltóanyagként használtuk növényi eredetû kezelésekre. E. coliból származó LT¹holotoxint (5,92 mg/ml DPBS-ben szuszpendálva) alkalmaztunk pozitív kontrollként. A vakcinaoltásokat a vizsgálat 0. és 14. napján végeztük. CHN18-ból származó extraktumokat adtunk 7 mg mennyiségben a 0. napon, és 18 mg¹ot a 14. napon. E. coliból származó LT¹t összekevertük a CHN18extraktummal, amelybõl 8 mg¹ot adtunk a 0. napon, és 20 mg¹ot a 14. napon, és a növényi eredetû, hõlabilis toxinból (SLT 102) 0,5 mg¹ot adtunk a 0. napon, és 1,5 mg¹ot a 14. napon. LT¹vel vagy SLT-vel kezelt mintákat olyan kezelt csoportokhoz hasonlítottuk, amelyek elterjedtebben alkalmazott „víz az olajban” adjuvánst kaptak, amit úgy készítettünk el, hogy a liofilizált antigénpreparátumot 2,5% végkoncentrációig felszuszpendáltuk olyan „Drakeol Oil”-ban, ami 0,165% Span 80¹at
2
DPBS-ben és 0,5% Tween 80¹at tartalmazott. A mintákat két fecskendõ és egy háromutas csap alkalmazásával kevertük össze, ami lehetõvé tette az antigén szuszpendálását a vízbõl és olajból álló keverékben. Intranazális/okuláris oltás céljából 25 ml¹t adtunk az egyes orrlyukakba, és az egyes szemekbe 10 napos életkornál fiatalabb madaraknak, és 50 ml¹t orrlyukanként szemenként a 10 napos életkornál idõsebb madaraknak. Vért vettünk a 21., 35. és 42. napon. A 35. napon a madarakat szubkután oltottuk inaktivált natív vírussal fertõzõ dózis szimulálása céljából, 7 nappal a szimulált fertõzés után (42. napon) vért vettünk szerológiai analízis céljából. A 6. táblázatban látható eredmények azt mutatják, hogy mind LT¹re, mind SLT¹re adott szerológiai választ könnyen detektáltuk a vizsgálat 21. napján, vagy 7 nappal a második vakcináció után. Az LT¹re adott szerológiai válasz ELISA-val kimutatva sokkal nagyobb volt, mint növényi eredetû SLT¹re adott válasz, azonban az elsõ immunizáláskor alkalmazott dózis több, mint 10¹szer kisebb volt SLT¹re, mint LT¹re. A 35. és 42. napon az LT¹re és SLT¹re adott szerológiai válasz elég magas volt, ami azt mutatja, hogy intranazálisan és okulárisan kiváltott mukozális válasz akkor is hatékony, ha az elsõ immunizáláskor adott dózis csak 0,5 mg. Ezzel ellentétben, CHN18 jelû transzgenikus NT1-sejtvonalakból származó HN¹fehérjére adott válasz nem adott detektálható titert a 21. napon, ELISA-val vagy HAI-vel detektálva. Azonban a 42. napon, ami 7 nappal volt a natív NDV-vel végzett, szimulált fertõzés után, az 1. és 2. számú kezelés jelentõs mértékû HAI szerológiai válaszokat mutatott, amit nem figyeltünk meg a többi kezelésben. A többi kezelésben LT¹ és SLT¹t (7. és 8. számú kezelés) adtunk be az 1. és 2. számú kezelésben alkalmazottakhoz hasonló dózisokban, kivéve azt, hogy olajban és vízben emulgeáltuk. Az eredmények alapján feltételezzük, hogy HN¹re adott memóriaválasz mértéke növelhetõ natív antigénnek való érintkezés után, szimulált fertõzési dózisban. HN¹re adott szerológiai választ tipikusan nem lehet detektálni az antigénre adott válasz után 7 nappal. Továbbá HN¹antigén önmagában vagy kombinációban más keverékekkel nem indukált választ bármelyik más kezelésben sem, tehát az 1. és 2. számú kezelésben a HN¹titerek kialakulása HN és LT/SLT-vel való érintkezés következménye volt.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
6. táblázat LT- és SLT-fehérjék intranazális/okuláris beadásának adjuváns hatása madarakban Kezelt csoport
Kezelés leírása
NDV ELISA GMT
NUV HI GMT
LT ELISA GMT
21. nap
35. nap
42. nap
21. nap
35. nap
42. nap
21. nap
35. nap
42. nap
1.
pHN+SLT102
5
nem teszt.
nem teszt.
3
1
45
133
2 229
2 560
2.
pHN+E. coli LT
1
nem teszt.
nem teszt.
2
1
28
4457
17 829
27 024
3.
pHN Corixában (MPL/TDM emulzió)
2
nem teszt.
nem teszt.
1
1
3
4
17
67
15
1
HU 005 673 T2
2
6. táblázat (folytatás) Kezelt csoport
Kezelés leírása
NDV ELISA GMT
NUV HI GMT
LT ELISA GMT
21. nap
35. nap
42. nap
21. nap
35. nap
42. nap
21. nap
35. nap
42. nap
4.
pHN 1. emulzióban
1
nem teszt.
nem teszt.
1
1
4
1
9
13
5.
pHN 2. emulzióban
1
nem teszt.
nem teszt.
1
1
1
3
3
14
6.
pHN 3. emulzióban
1
nem teszt.
nem teszt.
1
1
3
1
3
14
7.
pHN+SLT 1. emulzióban
1
nem teszt.
nem teszt.
2
1
1
352
2 560
3 880
8.
pHN+E. coli LT 1. emulzióban
5
nem teszt.
nem teszt.
5
1
4
844
8 914
8 914
9.
NT kontroll+SLT 1. emulzióban
1
nem teszt.
nem teszt.
2
1
1
1114
5 881
3 880
10.
NT kontroll+E. coli LT 1. emulzióban
1
nem teszt.
nem teszt.
1
1
2
3378
17 829
23 525
Minõségellenõrzés még nem vizsgálta NDV ELISA-titer <50: háttér NDV HI¹titer <8: háttér LT ELISA-titer <10: háttér
A 7. táblázatban bemutatott eredményeket úgy kaptuk, hogy LT¹t szubkután (SQ) oltottunk HN¹el kombinációban. A vakcina preparálása a 6. táblázatban feltüntetett módon történt. Vakcinát ebben a vizsgálatban a combszövetbe adtuk be. Két oltást alkalmaztunk, a 0. napon és a 14. napon. A 35. napon beadtunk egy szimulált fertõzési dózist in-
aktivált NDV-vel. A 7. táblázatban bemutatott eredmé30 nyek alátámasztják, hogy LT SQ¹oltással beadva szintén szerológiai választ eredményez, és azt, hogy megfigyelhetõ HN¹re adott szerológiai válasz fokozódása, ha együtt adjuk be. 35
7. táblázat Csirkék szubkután oltása LT¹vel és növényi eredetû HN¹nel Kezelt csoport
Kezelt csoport leírása
NDV HI GMT 21. nap
35. nap
LT ELISA GMT 42. nap
21. nap
35. nap
42. nap
7.
pHN (20 mg)+SLT (2,5 mg) 1. emulzióban
24
7
38
24
17
16
8.
pHN (20 mg)+E. coli LT (20 mg) 1. emulzióban
239
120
128
557
735
1114
9.
NT kontroll+SLT (2,5 mg) 1. emulzióban
1
1
19
27
190
190
10.
NT kontroll+E. coli LT (20 mg) 1. emulzióban
1
2
20
1613
2032
3225
LT in ovo oltással is választ stimulált. A 8. táblázatban bemutatottak szerint, E. coliból származó LT¹t légzsákon keresztül és az amnionüregbe oltottunk. Termékeny tojásokat átvilágítottunk a keltetés 18. napján, és csak egészséges embriókat azonosítottunk oltásra. Az injektálás helyét letöröltük alkohollal közvetlenül a tojás légzsákja fölött. Az üreget óvatosan megszúrtuk tojásszúróval, és egy 22 gauge méretû, körülbelül
3,8 cm hosszú tût illesztettünk be a lyukon keresztül. Maximum 0,3 ml oltóanyagot juttattunk az amnion55 üregbe, közvetlenül a légzsák membránja alá. A tojásokat azután a 18–21. napig átvittük a keltetõbe. Tizennégy nappal azután, hogy kikeltek a madarak, ismétlõ immunizálási adtunk LT¹vel, és a vért szerológiai válaszra analizáltuk a 21. napon. Szerológiai vá60 laszt nem figyeltünk meg egyetlen oltással 7 napon 16
1
HU 005 673 T2
belül, kivéve, ha elõzõleg egy elsõ immunizáló („priming”) dózist kaptak. Az eredmények azt mutatják,
2
hogy in ovo oltott LT hatékony volt elsõ immunizálásra 18 napos embrióban.
8. táblázat In ovo immunizálás Kezelt csoport leírása
21. nap szerológia GMT # kikelt
LT ELISA
NT kontroll 2. emulzióban
5
1
NT kontroll+E. coli LT (10 mg)
3
1016
Szakember könnyen felismeri vagy kideríti a találmány leírásban ismertetett és szemléltetett, konkrét elõnyös megvalósítási módjainak ekvivalenseit a leírás, a technika állása és némi rutin kísérletek elvégzése alapján.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Készítmény – amely natív, E. coliból származó hõlabilis toxin (LT) adjuvánst tartalmaz – brojlercsirke vakcinációjára történõ alkalmazásra, ahol a készítmény orális vagy szubkután úton történõ beadásra van adaptálva. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely továbbá brojlercsirkékben hatásos immunoprotektív antigént is tartalmaz. 3. A 2. igénypont szerinti készítmény, ahol az immunoprotektív antigén virális, bakteriális vagy gombaeredetû patogének által alkotott csoportból van kiválasztva. 4. A 3. igénypont szerinti készítmény, ahol az immunoprotektív antigén az alábbi ismert immunoprotektív antigének által alkotott csoportból van kiválasztva: Newcastle-betegség, madárinfluenza, fertõzõ burzális betegség, coccidiosis, nekrotikus enteritisz, légzsákgyulladás, cellulitisz, csirkeanémia, laryngorhinotracheitis, fertõzõ bronchitis és Marek-féle betegség. 5. A 4. igénypont szerinti készítmény, ahol az immunoprotektív antigén az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: Newcastle-betegség vírus hemagglutinin-neuraminidáz fehérje és madárinfluenzavírus hemagglutinin fehérje. 6. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol az adjuváns E. coli baktérium által van termeltetve.
7. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol az ad15 juváns transzgenikus növény által van termeltetve. 8. A 2. igénypont szerinti készítmény, ahol az immunoprotektív antigén transzgenikus növényben van termeltetve. 9. A 2. igénypont szerinti készítmény, ahol az adju20 váns és az immunoprotektív antigén transzgenikus növényben van termeltetve. 10. A 2. igénypont szerinti készítmény, ahol az adjuváns és az immunoprotektív antigén egyetlen transzgenikus növényben van termeltetve. 25 11. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása brojlercsirkék madárbetegség elleni vakcinációjára szolgáló gyógyszer gyártására. 12. Eljárás brojlercsirkék madárbetegség elleni védelmére szolgáló vakcina elõállítására, amelyben natív 30 LT hatásos mennyiségét összekeverjük olyan immunoprotektív antigén hatásos mennyiségével, amelyrõl ismert, hogy immunválaszt képes elõidézni egy madárban, ahol a vakcina orális vagy szubkután úton történõ beadásra van adaptálva. 35 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol az immunoprotektív antigén az alábbi ismert immunoprotektív antigének által alkotott csoportból van kiválasztva: Newcastle-betegség, madárinfluenza, fertõzõ burzális betegség, coccidiosis, nekrotikus enteritisz, légzsák40 gyulladás, cellulitisz, csirkeanémia, laryngorhinotracheitis, fertõzõ bronchitis és Marek-féle betegség. 14. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol az immunoprotektív antigén az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: Newcastle-betegség vírus hemaggluti45 nin-neuraminidáz fehérje és madárinfluenza-vírus hemagglutinin fehérje. 15. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol az immunoprotektív antigén a Newcastle-betegség vírus hemagglutinin-neuraminidáz fehérje.
17
HU 005 673 T2 Int. Cl.: A61K 39/02
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
