!HU000006754T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 006 754
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 212006 2006. 01. 31.
(73) Jogosult: CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA, Ciudad de La Habana 10600 (CU)
CU
(72) Feltalálók: BETANCOURT RODRIGUEZ, Blas Yamir, Ciudad de La Habana 10600 (CU); SÁEZ MARTÍNEZ, Vivian María, 14 000 Ciudad De La Habana (CU); PÁEZ MEIRELES, Rolando, 11 600 Ciudad De La Habana (CU); BERLANGA ACOSTA, Jorge Amador, 11 600 Ciudad De La Habana (CU); RAMÓN HERNÁNDEZ, José Ángel, 72 500 Camagüey (CU) (54)
HU 006 754 T2
A61K 9/16
(21) Magyar ügyszám: E 07 702319 (22) A bejelentés napja: 2007. 01. 29. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20070702319 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1987817 A2 2007. 08. 09. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1987817 B1 2009. 07. 29.
(2006.01) A61K 38/18 (2006.01) A61K 9/00 (2006.01) A61P 17/02 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 07087759 PCT/CU 07/000002
(74) Képviselõ: dr. Fehérvári Flóra, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Mikrogömb gyógyászati kompozíciók diabéteszes végtag-amputáció megelõzésére
A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 3 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 006 754 T2
A találmány mûszaki területe A találmány olyan gyógyászati kompozícióra vonatkozik, amely epidermális növekedési faktort [epidermal growth factor (EGF)] tartalmazó polimer mikrogömböket tartalmaz bõrükön krónikus ischaemiás fekélyes sebekkel bíró diabéteszes betegek alsó végtagjaiba parenterális úton való alkalmazásra diabéteszes végtag-amputáció megelõzésére. A technika állása A diabetes mellitus az alsó végtagok amputálásának fõ nem traumás kockázati tényezõje. A láb fekélyesedése a diabétesz jelentõs szövõdménye, amelynek évenkénti elõfordulása enyhén meghaladja a 2%¹ot [(Abbott C. A. és munkatársai (2002) The North-West Diabetes Foot Care Study: incidence of, and risk factors for, new diabetic foot ulceration in a communitybased patient cohort. Diabet. Med. 19(5):377–84]. A diabéteszes betegeknek legalább 15%-ában életük során lábukon krónikus fekélyek alakulnak ki [Reiber G. E. (1996) The epidemiology of diabetic foot problems. Diabet. Med. 13 Suppl. 1:S6–11], és ezen betegek mintegy 10–30%-ára becsülhetõ az alsó végtag amputálásának szükségessége [Lipsky B. A. (2004) Medical treatment of diabetic foot infections. Clin. Infect. Dis. 39 Suppl. 2:S104–14]. Az alsó végtagok amputálását elszenvedõ betegek között az 5 éven belüli elhalálozás mintegy 50–60% [Reiber G. E. (1996) The epidemiology of diabetic foot problems. Diabet. Med. 13 Suppl. 1:S6–11]. Több módszert alkalmaztak bõr krónikus ischaemiás fekélyes sebeivel bíró diabéteszes betegek kezelésére. Ezek közé tartozik az igen szigorú anyagcsere-szabályozás, a módosítható kockázati tényezõk megelõzése, a sebészeti sebtisztítás, kötözések alkalmazása, az infekciók mikróbaellenes kezelése, a sérült területen a nyomás kiküszöbölése, bõrgraftok alkalmazása, növekedési faktorok alkalmazása, valamint érújraképzési módszerek alkalmazása indikáció esetén. Az anyagcsere szabályozását követõen a diabéteszes fekélyek gyógyításának legfontosabb kezelési módja a sebészeti sebtisztítás, és ezt bármely más helyi terápiás módszert megelõzõen végre kell hajtani. A sebészeti sebtisztítás minden elhalt és fertõzött szövet (beleértve a csontszöveteket) sérült területrõl való eltávolítását, valamint a környezõ heges szövetek eltávolítását foglalja magában. Diabéteszes lábfekélyek esetén kötözések alkalmazása jól ismert, és bár a kötözések néhány fajtáját tanulmányozták, nem ismeretes mindenféle kötözés elõnye a többivel szemben. Emellett, mivel a kötözések alkalmazására vonatkozó tanulmányok száma kevés, és ezek fõleg enyhe stádiumú fekélyekre vonatkoznak, több, klinikai vizsgálatokból származó bizonyosság szükséges hatékonyságuk kimutatására. A klinikai vizsgálatokban tanulmányozott újfajta kötszerek közé tartoznak azok, amelyek szemipermeábilis polimer membránokon, promogramon (egy kollagén mátrix), algináton, karboxi-metil-cellulózon, hialuronánon alapulnak, és azok, amelyek légkörinél alacsonyabb nyomást
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
alkalmaznak [Eldor R. és munkatársai (2004) New and experimental approaches to treatment of diabetic foot ulcers: a comprehensive review of emerging treatment strategies. Diabet. Med. 21(11):1161–73]. Kifejlesztettek néhány olyan módszert, amelyek a fekély helyére helyezendõ bõrhelyettesítõk létrehozására vonatkoznak. Például a Dermagraftot humán bõrfibroblasztok biológiailag felszívódó anyagból készült szintetikus vázra való ráoltásával hozzák létre. Ez az eszköz hatékonynak bizonyult enyhe stádiumú fekélyek esetén, alkalmazásakor nagyobb a gyógyulási arány rövidebb gyógyulási idõ alatt [Marston W. A. és munkatársai. (2003) Dermagraft Diabetic Foot Ulcer Study Group. The efficacy and safety of Dermagraft in improving the healing of chronic diabetic foot ulcers: results of a prospective randomized trial. Diabetes Care 26:1701–5]. Az Apligraf I típusú marha kollagén mátrixban lévõ humán fibroblasztokból álló dermis és egy humán keratinocitákból létrehozott epidermiszrétegbõl áll. Hasonló módon, ez a bõrhelyettesítõ sérülésekben jelentõsen nagyobb mértékû és gyorsabb gyógyulást váltott ki, amennyiben neuropátiás enyhe stádiumú és nem fertõzött fekélyekre alkalmazták [Veves A. és munkatársai (2001) Graftskin, a human skin equivalent, is effective in the management of non-infected neuropathic diabetic foot ulcers: a prospective randomized multicenter clinical trial. Diabetes Care 24:290–5]. III fázisú randomizált, kettõs vak, placebóval ellenõrzött klinikai vizsgálatban egy vérlemezke-eredetû növekedési faktor [Platelet Derived Growth Factor (PDGF)] készítmény hatékonynak és biztonságosnak bizonyult olyan diabéteszes betegek kezelésére, akik jó vérátáramlással bíró neuropátiás fekélyekkel bírtak [Wieman T. J. és munkatársai (1998) Clinical efficacy of beclapermin (rh PDGF¹BB) gel. Diabetes Care 21(5):822–7]. Az ebbe a vizsgálatba bevont betegek többsége (95%) planimetriás értékelés szerint 10 cm2 vagy ennél kisebb felületû fekéllyel bírt. 100 mg/g becaplermingél placebóhoz hasonlítva szignifikánsan növelte a sérülések teljes gyógyulását a betegek 43%-ában (50 vs. 35%, p=0,007), és ennek a hatásnak az eléréséhez szükséges idõt 32%-nál (86 vs. 127 nap, p=0,013). A PDGF o becaplermin (Regranex) alkalmazásával elért megfelelõ eredmények diabéteszes betegek alsó végtagjain elhelyezkedõ olyan neuropátiás fekélyek kezelésére való elfogadásához vezettek, amelyek a bõr alatti szövetekig vagy mélyebbre terjednek, és megfelelõ vérellátással bírnak [Brem H., Sheehan P., Boulton A. J. (2004) Protocol for treatment of diabetic foot ulcers. Am. J. Surg. 187(5A):1S–10S]. A közelmúltban egy epidermális növekedési faktorhoz [Epidermal Growth Factor (EGF)] hasonló gyógyító anyag alkalmazását ismertették, amely alkalmazás egy EGF-oldatnak a sérülésbe néhány injekció révén való infiltrációjában állt (WO 03/053458). Ez az alkalmazás azonban egy nyilvánvaló hátránnyal jár: a beteg számára nagy traumát jelent, mivel az injekcióknak a sérülésbe való beadása rendkívül fájdalmas. Minden keze-
1
HU 006 754 T2
lésnél több injekciót kell beadni, és a betegnek a kezelést néhány héten át másnaponként kell kapnia. Ennek a módszernek a hiányosságát figyelembe véve, egy tartósan szabaddá váló EGF-készítmény csökkenthetné a gyógyszer adagolásának gyakoriságát, ami nagymértékben fokozná a beteg kényelmét és együttmûködési készségét. Van egy olyan szabadalom (US 6 086 863), amely szerint szabályozó- és növekedési faktorok (azaz epidermális növekedési faktor, EGF) vihetõ be polisztirol vagy más nem lebomló polimer mikrogömböket tartalmazó profilaktikus vagy terápiás kompozíciókba sebek, így diabéteszes lábfekélyek gyógyulási folyamatának jobbítására, ezeket a mikrogömböket megfelelõ vivõanyagban készült szuszpenzió formájában helyileg alkalmazzák. A hatóanyagok helyi alkalmazása korlátozást jelent abban a tekintetben, hogy nehéz annak a dózisnak az ellenõrzése, amely a hatás helyét eléri, mivel a hatóanyag felszívódásával néhány tényezõ kölcsönhatásba lép, köztük említhetõ az elhalt szövetek és helyi exudátumok jelenléte, a véráramlás romlása és az EGF¹et bontó enzimek jelenléte. Ezért a diabéteszes lábfekélyek kezelésében fontos probléma annak a hatásos hatóanyagdózisnak a meghatározása, amely az ischaemiás szövetek regenerálódását kiváltja, és megelõzi a diabéteszes végtag amputálását. Számos más szabadalom irányul más olyan eljárásokra, amelyek a gyógyulási sebesség gyorsítását célozzák meg. Azonban ezen eljárások egyike sem bizonyult széleskörûen hatásosnak. A találmány részletes leírása A találmány általában egy olyan gyógyászati kompozícióra vonatkozik, amely epidermális növekedési faktorral megrakott mikrogömböket tartalmaz parenterális úton való adagolásra olyan diabéteszes betegek alsó végtagjaiba, akik bõrükön krónikus ischaemiás sebekkel bírnak, azzal a céllal, hogy megelõzzük ezen végtagok amputálását. A találmány körében a mikrogömb megjelölésen mikrogömböket és nanogömböket értünk. Az EGF mikrogömbökbe való kapszulázása lehetõvé teszi: (i) a hatóanyag lassú szabaddá válását és (ii) az EGF védelmét lebomlási folyamatokkal szemben, mint például a hatás helyén lévõ proteázok által történõ fehérjeemésztéssel szemben. A találmány körében a mikrogömböket, mint olyan polimer gömböket írhatjuk le, amelyek teljes térfogatában homogénen diszpergált a hatóanyag, és ez a hatóanyag szabályozott formában válik szabaddá. A találmány körében a „szabályozottan szabaddá váló” megjelölésen a hatóanyagnak folytonos, szakaszos, lineáris vagy nem lineáris formáját értjük. Ez azzal jár, hogy a polimer mátrix különféle kompozícióit alkalmazzuk, beleértve olyan segédanyagokat, amelyek módosítják a szabaddá válási profilokat és/vagy olyan polimer lebomlást fokozókat vagy más módosítókat, amelyek önmagukban vagy kombinálva a kompozíció tulajdonságaiban a kívánt hatást hozzák létre.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
A mikrogömböket kettõs emulzió/oldószer lepárlási eljárással nyerjük az Okada és munkatársai által leírt módon (US 4 652 441). A találmány szerinti fejlesztéshez elõnyös polimerek azok, amelyek tulajdonságaik folytán biológiailag kompatibilisek és biológiailag lebomlóak. Az utóbbi feltétel különösen fontos, mivel ez lehetõvé teszi a készítmény sérülésbe való infiltrálásával történõ parenterális alkalmazását. Különösen elõnyösek a glikolsav vagy tejsav homopolimerjei és a mindkettõbõl nyert poli(laktid-koglikolid) kopolimerek (rövidítésük PLGA). Ezek a polimerek olyan jellemzõkkel bírnak, amelyek kiváló biológiai anyagokká teszik õket varratcérnák, ortopéd eszközöket rögzítõ anyagok és hatóanyag-szállító rendszerek polimer mátrixai gyártására [Ashammakhi N. és munkatársai (2001) Developments in Craniomaxillofacial Surgery: Use of Self-Reinforced Bioabsorbable Osteofixation Devices. Plast. Reconstr. Surg. Special Topic: 167–80; Eppley B. L. (2005) Use of resorbable plates and screws in pediatric facial fractures. J. Oral Maxillofac. Surg. 63(3):385–91]. Tulajdonságaik figyelembevételével ezek biológiailag kompatibilisek és biológiailag lebomlóak, emellett lehetõséget nyújtanak a hatóanyag szabaddá válási profiljának változtatására a polimer mátrix kompozíciójától, a polimer molekulatömegétõl és más segédanyagok részecskékhez való adagolásától függõen. A PLGA¹k mellett más, hasonló tulajdonságokkal, például biológiai kompatibilitással és biológiai lebomlással bíró polimerek is használhatók. Ezek közé tartoznak a polikaprolakton, a polihidroxi-butirát–polihidroxi-valerát kopolimerek, a politejsav-polikaprolakton kopolimerek, poliortoészterek és polianhidridek. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a gyógyászati kompozíció mikrogömbjei 1 és 100 mm közötti átmérõvel bírnak, és az EGF a mikrogömbök össztömegének 1,6–2,4%¹át teszi ki. Egy másik elõnyös megvalósítási mód szerint a mikrogömbökbe kapszulázott EGF infiltrációja utáni elsõ napon 5 és 10 mg/nap közötti mennyiségben válik szabaddá, és fizikokémiai és biológiai jellemzõit 14 napon át megõrzi. A találmány egy másik szempontja szerint diabéteszes beteg ischaemiás sérüléseinek kezelésére vonatkozik a fent említett gyógyászati kompozíció azon helyi szövetekbe helyi infiltrációval való adagolásával, amelyek magukban foglalják a sérülés széleit és alját. A fehérje típusú hatóanyagok mikrokapszulázásánál különös figyelmet kell fordítani ezen biológiai molekulák mikrokapszulázási folyamatot követõ aktivitására. Ez annak a ténynek a következménye, hogy a fehérjék többségükben érzékenyek azokra a magas hõmérsékletekre, amelyek a kapszulázási folyamatokban gyakran létrejönnek, és azokra a szerves oldószerekre, amelyek a polimerek oldására használatosak. Másrészt, minden fehérje saját viselkedésmódot fejt ki a mikrokapszulázási folyamatban. Ezeket a szempontokat figyelembe véve a fehérjékkel megrakott mikrogömbök elkészítési módszerének megállapításához annak érdekében, hogy azok biológiai aktivitása válto-
1
HU 006 754 T2
zatlan maradjon, a megfelelõ eljárás, polimer, oldószer, adalékok stb. megválasztására kimerítõ tanulmányok szükségesek. Hatóanyagként a gyógyászati kompozíció tartalmazhat természetes forrásból származó, kémiai szintézissel elõállított vagy rekombináns DNS-eljárással nyert EGF¹t. A gyógyászati kompozíció tartalmazhat még – vivõanyagának részeként – további, a következõ csoportokba tartozó hatóanyagokat is: mikróbaellenes szerek (penicillinek, cefalosporinok, kinolon, metronidazol, klindamicin, vankomicin, makrolidok, tetraciklinek, aztreonam és imipenem), anesztetikumok, analgetikumok, amelyek a nem szteroid gyulladásgátlók körébe tartoznak, angiogén hatású hatóanyagok (ér endoteliális növekedési faktor, fibroblaszt növekedési faktor), más növekedési faktorok (granulocita telepstimuláló faktor) vagy eritropoietin. Diabéteszes betegek alsó végtagjainak bõrén lévõ krónikus ischaemiás fekélyes sebe az a patológiás állapot, amelyet a találmány tárgyát képezõ gyógyászati kompozícióval kezelünk. A gyógyászati kompozícióban lévõ mikrogömbök más molekulákkal való együttes kapszulázása lehet szükséges mind a sérülés körülményeitõl, mind a kezelendõ beteg jellemzõitõl függõen. Ezek a további terápiás szerek a mikróbaellenes szerek, anesztetikumok, nem szteroid gyulladásgátló hatóanyagok körébe tartozó analgetikumok, érképzõ hatású hatóanyagok és más növekedési faktorok körébe tartozóak. A gyógyászati kompozíciót a betegnek történõ adagolást megelõzõen megfelelõ vivõanyagban kell szuszpendálni, amely lehet viszkozitásnövelõket, például karboxi-metil-cellulózt, hidroxi-propil-metil-cellulózt és detergenseket, például poliszorbátokat tartalmazó sóoldat vagy egy hõmérsékletre érzékeny PEG-PLGA-PEG típusú hidrogél vagy dextrán vagy citozánszármazék. A találmány tárgyát képezõ gyógyászati kompozíció lehetõvé tette az adagolási gyakoriság csökkentését a kezelés során, és nem várt módon növelte a terápia hasznosságát azáltal, hogy csökkenti a teljes kezelési idõt, mivel a sérülések gyógyulása gyorsabb, mint az azonos mennyiségû, nem kapszulázott EGF-fel kezelt sérülések gyógyulása. Készítményünk javult terápiás hatása nem volt várható, minthogy az elért lassú szabaddá válási profil alacsony EGF-koncentrációkat hozott létre. Ugyancsak nem várt módon egy olyan másik készítmény, amelyben bizonyos segédanyagokat használtunk az EGF szabaddá válásának gyorsítása érdekében, és így nagyobb hatóanyag-koncentrációk elérésére, nem bírt a találmány szerinti készítmény terápiás hatásával. Az ábrák rövid leírása Az 1. ábra egy vázlat, amely bemutatja az állatmodellben kiváltott fekélyek elhelyezkedését. A 2. ábra az EGF-vel megrakott mikrogömbök kettõs emulziós – oldószeres bepárlási eljárással való elõállítási eljárásának diagramja.
2
A 3. ábra
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
EGF-vel megrakott mikrogömbök pásztázó elektronmikroszkópos képe. A 4. ábra EGF szabaddá válási profilja PLGA mikrogömbökbõl. Az X tengelyen az idõt adjuk meg napokban, az Y tengelyen a szabaddá vált EGF mennyisége szerepel a vizsgálatban alkalmazott mikrogömbökben lévõ össz-EGF %¹ában, ( ) gyorsan szabaddá váló készítmény, továbbá ( ) lassan szabaddá váló készítmény. Az 5. ábrán különbözõ körülmények mellett tripszinnel emésztett EGF fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás képét mutatjuk be. A: kontroll, B: szabad EGF, C: PLGA mikrogömbökbe kapszulázott EGF, D: üres PLGA mikrogömbökkel kevert EGF.
Példák A találmány teljesebb leírása érdekében ismertetjük az alábbi példákat: 1. példa: EGF-tartalmú PLGA mikrogömböket tartalmazó gyógyászati kompozíció elõállítására EGF-fel megrakott mikrogömbök elõállítása Polimer oldatot [PLGA 50:50 (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) 10% (tömeg/térfogat)] készítünk 1 g polimer diklór-metánban (DCM) való oldásával. 1 ml PLGA-oldatot üvegedénybe viszünk, és 200 ml 20 mg/ml¹es vizes EGF-oldatot adunk hozzá. Ezt az elegyet 30 s idõtartamon át ultrahanggal kezeljük ultrahangos szonda [IKASONIC U 200 S control (IKA Labortechnik, Németország)] alkalmazásával. Az elsõ emulziót 40 ml 1%¹os poli(vinil-alkohol)-hoz adjuk, és a fázisok 14 000 fordulat/perces erõteljes keverésével, amelyet T8 Ultraturrax berendezéssel (IKA Labortechnik, Németország) végzünk, egy második emulziót nyerünk. A kettõs emulziót 140 ml 0,1%¹os 30 000–70 000 poli(vinil-alkohol)-hoz (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) adjuk, és homogenizálóban (IKA Labortechnik, Németország) 300 fordulat/perc sebességgel keverjük 1 órán át a diklór-metán elpárologtatására. Végül a mikrogömböket szûréssel gyûjtjük, ötször mossuk 50 ml desztillált vízzel, és liofilizálóban (Edwards, UK) fagyasztva szárítjuk. A szárított mikrogömböket 4 °C hõmérsékleten tároljuk felhasználásig (2. ábra). A segédanyagokkal kiegészített EGF mikrogömböket ugyanezzel az eljárással nyerjük, de a belsõ vizes fázisba 10 mg Pluronic F–127¹et (10 mg) és 0,5 mg NaCl¹ot adunk.
Az EGF-tartalmú mikrogömbök jellemzése A mikrokapszulázási eljárás és a részecskék fehérjével való megrakásának hatékonyságát az EGF koncentrációjának mikroBCA vizsgálattal való meghatározása révén számítjuk olyan oldatból, amely a részecskéknek 1 n NaOH-dal történõ emésztésébõl, majd 1 n 60 HCl-oldattal való semlegesítésébõl származik. 55
4
1
HU 006 754 T2
A mikrokapszulázási eljárás eredményeként gömbalakú mikrorészecskéket nyerünk. Ezek szabályos felülettel és pórusokkal bírnak (3. ábra). Ezeket a mikrogömböket mintegy 85%¹os hozammal kapjuk. A gömbökbe a kapszulázási eljárásba bevitt összfehérje tömegnek 40–60%¹át sikerült beépíteni. A részecskék fehérjeterhelése (megrakása) 1,6–2,4%. A mikrogömbök mérete 25 mm alatti. 1. táblázat Az EGF-tartalmú mikrogömbök jellemzõi EGF-tartalmú mikrogömbök
EGF és F127 és NaCl-tartalmú mikrogömbök
Hozam (%)
83±2
83±3
Kapszulázási hatékonyság (%)
54±3
48±4
1,98±0,05
1,72±0,06
19±3
24±4
Fehérjemegrakottság (%) Részecskeméret (mm)
A segédanyagok beépítése nem változtatta meg szignifikáns módon az EGF-tartalmú mikrogömbök jellemzõit. A kapszulázott EGF in vitro szabaddá válása 50 mg EGF-vel megrakott mikrogömböt 1 ml felvevõ folyadékban [0,001% Tween 80 és 0,1% nátrium-azid pH=7,2¹es PBS-ben (foszfáttal pufferolt sóoldat)]. A szuszpenziót enyhe keverés mellett 37 °C hõmérsékleten inkubáljuk. Meghatározott idõközökben vett mintá-
2
kat [0,25 (6h), 0,5 (12h), 1, 3, 7 és 14 nap] 5 percig 5000 fordulat/perc sebességgel centrifugálunk Hettich asztali centrifugában (Tuttlingen, Németország), a felülúszót gyûjtjük, és azonos térfogatú friss felvevõfolyadé5 kot adunk hozzá. Minden egyes vett mintából mikroBCA vizsgálattal meghatározzuk az EGF koncentrációját. A PLGA mikrogömbökbe kapszulázott EGF szabaddá válási profilja hirtelen szabaddá válást mutat, amely az elsõ napon történik, és egy másik szakaszt, amely10 ben az EGF szabaddá válása folyamatosan történik meg a következõ 14 nap során. Az elsõ szakasz folyamán a teljes kapszulázott fehérjének mintegy 20% mennyisége válik szabaddá mindkét készítményben, míg az értékelési idõszak további részében a szabaddá válási profilok 15 különböznek: a segédanyagot tartalmazó mikrogömbökbõl az EGF szabaddá válása mintegy 65% (mintegy 28 mg/nap szabaddá válási sebességgel), és 30%¹ig terjedõ a szabaddá válás a segédanyag nélküli részecskékbõl (mintegy 7 mg/nap sebességgel) (4. ábra). 20 Az in vitro szabaddá vált EGF jellemzése A vizsgálat célja annak kimutatása, hogy a kapszulázott EGF megõrzi fizikai-kémiai és biológiai jellemzõit. Az inkubációs idõszak (14 nap) alatt szabaddá 25 vált EGF tulajdonságait értékeltük. Az 1. nap, a 7. napig és a 14. napig szabaddá vált EGF¹t jellemeztük néhány analitikai eljárással: fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárás (RP-HPLC), lemezen végzett nátrium-dodecil-szulfát30 poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE), enzimkötött immunoszorbens vizsgálat (ELISA) és in vitro vírusellenes aktivitás biológiai vizsgálata. Eredményeinket a 2. táblázatban mutatjuk be.
2. táblázat Az in vitro szabaddá vált EGF fizikai-kémiai és biológiai jellemzõi Elemzés
ELISA (%)a SDS-PAGE
(%)b
RP-HPLC (%)c Fajlagos aktivitás (NE/mg)
Referenciad
Szabaddá vált EGF 1 nap
7 nap
14 nap
89
83
87
88
98
100
99
100
95
94
94
95
7,0×105
7,1×105
6,8×105
7,2×105
a
Az immunológiailag felismert EGF százalékos mennyisége a mikroBCA vizsgálattal mennyiségileg meghatározott tömegre vonatkoztatva. b A 6000 Da¹nál kimutatott fõ sávnak megfelelõ százalékos mennyiség. c A fõ mintának megfelelõ százalék. d A mikrogömbök készítésére alkalmazott EGF.
Az eredmények megerõsítik, hogy a szabaddá vált EGF hasonló fizikai-kémiai és biológiai jellemzõkkel bír, mint a mikrogömbök készítéséhez alkalmazott EGF. A mikrokapszulázás hatása EGF stabilitására proteázok hatásával szemben 1 mg EGF¹t készítünk egymástól függetlenül három különbözõ körülmény mellett: (i) 1 ml 4%¹os nátrium-
hidrogén-karbonátban (NaHCO3) oldva, (ii) PLGA mikrogömbökbe kapszulázva (2 tömeg%) és 1 ml 4%¹os 55 NaHCO3-ban szuszpendálva, és (iii) 50 mg üres PLGA mikrogömbökkel elegyítve és 1 ml 4%¹os NaHCO3-ban szuszpendálva. Ezt követõen minden készítményhez 100 ml 200 mg/ml¹es, 4%¹os NaHCO3-ban lévõ tripszint adunk, és az elegyet 37 °C hõmérsékleten enyhe keve60 rés mellett 4 órán át inkubáljuk, kontrollként. 1 mg 5
1
HU 006 754 T2
EGF¹t 1,1 ml 4%¹os NaHCO3-ban oldva alkalmazunk. A reakciót 10 ml trifluor-ecetsav beadagolásával állítjuk le. A mikrogömböket tartalmazó mintákat 10 percig 6000 g mellett centrifugáljuk, és a felülúszót az üledéktõl elkülönítjük. A mikrokapszulázott vagy mikrogömbökön adszorbeált EGF¹t a polimertõl diklór-metán/ecetsav elegyben való extrahálással elválasztjuk [Ruiz J. M. és munkatársai (1989) Mikroencapsulation peptide: a study of the phase separation of poly (D,L-lactic acidco-glycolic acid) copolymers 50/50 by silicone oil. J. Pham. Sci. 49:69–77]. Minden mintát RP¹HPLC eljárással elemzünk a Han és munkatársai által leírt eljárást követve [Han K. és munkatársai (1998) Site-specific degradation and transport of recombinant human epidermal growth factor (rhEGF) in the rat gastrointestinal mucosa. Int. J. Pharm. 168:189–197)]. Eredményeink (5. ábra) azt mutatják, hogy mind a nem kapszulázott EGF, mind az üres mikrogömbökkel elegyített EGF teljesen lebomlott. Azonban a kapszulázott EGF védett volt a proteolízissel szemben, kromatográfiás profilja hasonló volt a kontrolléhoz. 2. példa: Kapszulázott EGF in vivo hatása (állatmodellben) szabad EGF-hez hasonlítva Szabályozott akut sérülések kísérleti modellje Az itt leírt kísérlet célja az infiltrációval vagy parenterálisan, a sebszélekbe és a seb aljába való beinjektálással alkalmazandó új, EGF-tartalmú mikrogömb gyógyászati készítmény gyógyító hatásának értékelése akut, kielégítõ prognózissal bíró sérülésekben. Kísérleti biológiai modell: 225–250 g testtömegû hím Wistar-patkányokat alkalmaztunk. Az állatokat 12×12 órás állandó megvilágítási rend mellett, levegõcsere ciklusokkal és a táplálékhoz való szabad hozzáféréssel a CIGB állattartó berendezésében tartottuk ellenõrzött területen. A patkányokat egyedileg szállásoltuk el T3 dobozokban az (elõzetesen sterilezett) alom 48 óránkénti cseréjével. Fekélyek kiváltása: Az állatokat ketamin/xilazin intraperitoneális beinjektálásával anesztetizáltuk. A patkányok hátát, beleértve a lapocka mögötti tértõl a keresztcsontig terjedõ területet, mechanikusan és kémiailag szõrtelenítettük. Ezt a régiót povidon-jód- és izopropil-alkohol-oldattal fertõtlenítettük. A fekélyek kiváltására kiválasztott bõr fölötti területet kínai tintával jelöltük meg annak érdekében, hogy 9 mm átmérõjû biotomokkal (AcuDrem, FI, USA) kör alakú teljes szélességû sérüléseket hozzunk létre. Amint azt az 1. ábrán bemutatjuk, minden állaton hat szimmetrikus és egymástól egyenlõ távolságra lévõ sérülést hoztunk létre. A sérüléseket steril sóoldattal mostuk, és belsõ határukat tartós tintával körülrajzoltuk, hogy késõbb a 0 idõponthoz tartozó seb területét számolni tudjuk. Minden állat sérüléseit naponta fertõtlenítettük 70%¹os etanollal és steril sóoldattal bármely kezelést megelõzõen. Kísérleti csoportok Az állatokban létrehozott fekélyeket véletlenszerûen osztottuk a következõ kísérleti csoportokba beke-
5
10
15
20
25
2
rülési sorrend/csoport kereszttársítási táblázat alkalmazásával: I. csoport kezelés nélküli. Ez egy kontroll csoport a spontán fejlõdés követéséhez. II. csoport: placebo (a mikrogömbök szuszpendálására használt vivõanyagot alkalmazzuk: 0,3% karboximetil-cellulóz, 0,1% Tween 20 és 0,9% nátrium-klorid, ezt a vivõanyagot helyileg infiltráljuk). III. csoport: 675 mg EGF-tartalmú mikrogömböket (segédanyagok nélkül) infiltrálunk 1 ml ehhez a készítményhez összeállított vivõanyagban szuszpendálva. Az infiltrálást a sebek széleinél és aljánál hajtjuk végre. IV. csoport: 675 mg EGF-tartalmú mikrogömböket (segédanyagokkal) infiltrálunk 1 ml ehhez a készítményhez összeállított vivõanyagban szuszpendálva. Az infiltrálást a sebek széleinél és aljánál hajtjuk végre. V. csoport: szabad EGF (75 mg/ml) 0,9%¹os sóoldatban. Minden csoportba 10 patkányt vontunk be, ezért csoportonként 60 sebet tanulmányoztunk. A kezeléseket naponta hajtottuk végre, azoknál az állatoknál, amelyeket mikrogömbök nélküli készítményekkel kezeltünk a tût (271/2) a sérülések széleihez és aljához helyeztük. Az állatokat minden egyes kezelés elõtt intraperitoneális úton diazepammal szedáltuk. A vivõanyaggal vagy az EGF-fel megrakott mikrogömböket tartalmazó készítményekkel kezelt állatokat csak egyszer infiltráltuk.
30
35
40
45
50
55
60 6
A sebzáródás szintjének meghatározása. Szövettani feldolgozás A sérüléseket transzparens lapokra helyeztük a sebösszehúzódások kinetikájának a következõ idõpontokban való számításához: 0 idõpont – a 100%-osan nyitott sérülés területét jelenti, itt 0% a sebösszehúzódás. 1. idõpont a sérülés kiváltását követõ 72. óra, 2. idõpont a sérülés kiváltását követõ 5. nap, 3. idõpont a sérülés kiváltását követõ 7. nap, 4. idõpont a sérülés kiváltását követõ 9. nap. A 9. napon a vizsgálatnak véget vetettünk, ezen a napon az állatokat leöltük ezen sérülések spontán gyógyulásának kinetikájára vonatkozó korábbi tapasztalataink alapján. A sérülések határait tartalmazó képeket digitalizáltuk. A sérülések területét és az összehúzódás százalékos értékét DIGIPAT képelemzõ szoftver alkalmazásával számítottuk. Minden paraméterre statisztikai analízist végeztünk SPSS csomag és nem paraméteres Mann–Whitney U teszt alkalmazásával, p<0,05 szignifikanciaszintet állapítottunk meg. Az állatokat túladagolt nátrium-pentobarbital (250 mg/kg) intraperitoneális beinjektálásával öltük le. A sérüléseket a húsos hártyákból (panniculus carnosus) szárítottuk és 10%¹os semleges formaimban fixáltuk paraffinba történõ késõbbi beágyazáshoz. A hematoxilin/eozin, van Giesson’s and Masson’s háromszínû színezékeket alkalmaztuk. Minden egyes csoportnál meghatároztuk azon állatok számát, amelyeknél a sérülés 100%-osan hámosodott, és rétegezett és differenciálódott epidermisz jött létre.
1
HU 006 754 T2
A sebösszehúzódás kinetikájának értékeit a 3. táblázatban mutatjuk be (a mm¹ben kifejezett összehúzó-
2
dási értékeket a sebméret 0 idõpontban mért sebméretre vonatkoztatott százalékos változásában adjuk meg).
3. táblázat A fekélyösszehúzódás értékei Csoport
Ellenõrzött akut fekélyek összehúzódási kinetikája (%) 0. idõpont
1. idõpont
2. idõpont
3. idõpont
4. idõpont
I. csoport
0
II. csoport
0
6,1±2,1
9,3±2,2
37,6±3,3
56,7±3,8
8,3±2,2
11,4±2,4
41,5±2,7
67,4±4,5
III. csoport
0
11,4±3,3*
22,5±3,8*
69,8±4,8*
86,8±3,5*
IV. csoport
0
9,9±1,1
12,8±1,4
52,4±3,1
69,6±4,9
V. csoport
0
9,6±1,2
11,6±1,5
51,5±2,7
67,4±4,5
(*) A többi csoporthoz viszonyított p<0,05 értékû statisztikai különbséget jelent. Mann–Whitney U teszt.
Nem várt módon a lassabb szabaddá válási profillal bíró EGF mikrogömböket tartalmazó készítmény (együtt kapszulázott segédanyagok nélküli) fejtette ki a sebszélek összehúzódására a legerõteljesebb hatást, ami más szóval azt jelenti, hogy ez gyakorolja a legkedvezõbb hatást a teljes gyógyulás meggyorsítására. Az összehúzódás néhány olyan összevont hatás egybeesését jelenti, amely a sebet közelíti az átalakuló szakaszhoz. A 4. táblázatban minden egyes kísérleti csoportban bemutatjuk a fekélyek területének érett és szervezõdött sarjadzó szövetek által elfoglalt százalékos értékét. A számításokat a 4. idõpontban gyûjtött minták alapján végeztük mennyiségileg kifejezve azon pozitív mikroszkópos mezõk számát, amelyek az egyes mintákban egybeesnek a van Giesson és Masson-féle háromszínû reakciókkal. Két patológus értékelte az eredményeket egymástól függetlenül és vak formában. 4. táblázat A sarjadzó területek százalékos értéke a 4. idõpontban az egyes vizsgálati csoportokban. Vizsgálati csoportonként 60 sebet vizsgáltunk kollagén rostokra gyakorolt pozitív reakcióik révén Érett sarjszövettel borított felület (%)
I. csoport
48,7±5,7
II. csoport
62,4±3,9
III. csoport
84,5±4,3
IV. csoport
64,7±2,7
V. csoport
61,3±2,6
Nem várt módon a lassabb szabaddá válási profillal bíró EGF mikrogömbökön alapuló készítmény (együtt kapszulázott segédanyagok nélküli) gyakorolta a legerõteljesebb hatást a sarjszövetek létrejöttére és érésére, ez megfelel a leírás elõbbi részében a sebösszehúzódás folyamatára vonatkozóan említetteknek. A kezelések hatását tanulmányoztuk a sérülések hámosodási folyamatának vonatkozásában is. A hám-
szövet (epithelium) mikroszkópos képét értékeltük fi20 gyelembe véve a fekélyek újrahámosodását, réteges epitélium jelenlétét és egy össz keratinréteg meglétét. A mikroszkópos vizsgálatokhoz a sérüléseket centrálisan hosszanti irányban félbevágtuk, és a kapott darabokat azonos paraffinblokkba vittük be. Vizsgálati cso25 portonként összesen 120 szövetmetszetet vizsgáltunk, amelyek 60 sérülést képviselnek. Eredményeinket az 5. táblázatban mutatjuk be.
30
35
40
5. táblázat A kezelések hatása a sebek hámosodására 100%-osan hámosodott sebek száma
Érett epitheliummal bíró sebek száma
I. csoport
32
28
II. csoport
56
45
III. csoport
81*
73*
IV. csoport
64
56
V. csoport
60
51
* jelentése a többi csoporthoz viszonyított p<0,05 statisztikai differencia. Mann–Whitney U teszt.
45
A lassan szabaddá váló profillal bíró EGF mikrogömbökön alapuló készítménnyel (együtt kapszulázott segédanyagok nélküli) kezelt III. csoport meglepõ módon a hámosodási válasz legjobb indikátorait mutatta, amit az összújrahámosodás és az epithelium érettsége 50 alátámaszt. Krónikus bõrfekélyek kísérleti modellje A következõ vizsgálatok célja a gyógyító hatás értékelése rossz prognózisú krónikus sérülések esetén, 55 amelyben diabéteszes betegek sérüléseit az infiltrációs alkalmazással használandó EGF-tartalmú mikrogömbökön alapuló új gyógyászati készítmény stimulálja. Kísérleti biológiai modell: 225–250 g testtömegû hím Wistar-patkányokat alkalmaztunk. Az állatokat 60 12×12 órás állandó megvilágítási rend mellett, levegõ7
1
HU 006 754 T2
csere ciklusokkal és a táplálékhoz való szabad hozzáféréssel a CIGB állattartó berendezésében tartottuk ellenõrzött területen. A patkányokat egyedileg szállásoltuk el T3 dobozokban az (elõzetesen sterilezett) alom 48 óránkénti cseréjével. Az állatokat elõzetesen két hónapon át 0,01% metil-glioxál-oldattal kezeltük, hogy ahhoz hasonló glikozilezési környezetet teremtsünk, mint amely a hosszú tartamú kifejlõdés során egy diabéteszes betegben elõfordul. Más szervkárosodások mellett ez a sarjadzás és a sebek átalakulásának lelassulásához vezet [Berlanga J., Cibrian D. és munkatársai. (2005) Methylglyoxal administration induces diabetes-like mikrovascular changes and perturbs the healing process of cutaneous wounds. Clin Sci (Lond). 109(1):83–95]. Fekélyek kiváltása: Az állatokat ketamin/xilazin intraperitoneális beinjektálásával anesztetizáltuk. A patkányok hátát, beleértve a lapocka mögötti tértõl a keresztcsontig terjedõ területet, mechanikusan és kémiailag szõrtelenítettük. Ezt a régiót povidon-jód- és izopropil-alkohol-oldattal fertõtlenítettük. A fekélyek kiváltására kiválasztott bõr fölötti területet kínai tintával jelöltük meg annak érdekében, hogy 9 mm átmérõjû biotomokkal (AcuDrem, FI, USA) kör alakú teljes szélességû sérüléseket hozzunk létre. Minden állaton hat szimmetrikus és egymástól egyenlõ távolságra lévõ sérülést hoztunk létre. A sérüléseket steril sóoldattal mostuk, és belsõ határukat tartós tintával körülrajzoltuk, hogy késõbb a 0 idõponthoz tartozó seb területét számolni tudjuk. Minden állat sérüléseit naponta fertõtlenítettük 70%¹os etanollal és steril sóoldattal bármely kezelést megelõzõen. Kísérleti csoportok Az állatokban létrehozott fekélyeket véletlenszerûen osztottuk a következõ kísérleti csoportokba bekerülési sorrend/csoport kereszttársítási táblázat alkalmazásával: I. csoport kezelés nélküli. Ez egy kontrollcsoport a spontán fejlõdés követéséhez. II. csoport: placebo (a mikrogömbök szuszpendálására használt vivõanyagot alkalmazzuk: 0,3% karboximetil-cellulóz, 0,1% Tween 20 és 0,9% nátrium-klorid, ezt a vivõanyagot helyileg infiltráljuk). III. csoport: 1 mg EGF-tartalmú mikrogömböket (segédanyagok nélkül) infiltrálunk 1 ml ehhez a készítményhez összeállított vivõanyagban szuszpendálva. Az infiltrálást a sebek széleinél és aljánál hajtjuk végre.
2
IV. csoport: 1 mg EGF-tartalmú mikrogömböket (segédanyagokkal) infiltrálunk 1 ml ehhez a készítményhez összeállított vivõanyagban szuszpendálva. Az infiltrálást a sebek széleinél és aljánál hajtjuk végre. V. csoport: szabad EGF (75 mg/ml) 0,9%¹os sóol5 datban. Minden csoportba 10 patkányt vontunk be, ezért csoportonként 60 sebet tanulmányoztunk. A kezeléseket naponta hajtottuk végre, azoknál az állatoknál, 10 amelyeket mikrogömbök nélküli készítményekkel kezeltünk. Az állatokat minden egyes kezelés elõtt intraperitoneális úton diazepammal szedáltuk. A vivõanyaggal vagy az EGF-fel megrakott mikrogömböket tartalmazó készítményekkel kezelt állatokat csak egyszer 15 infiltráltuk.
20
25
30
35
40
45
A sebzáródás szintjének meghatározása. Szövettani feldolgozás A sérüléseket transzparens lapokra helyeztük a sebösszehúzódások kinetikájának a következõ idõpontokban való számításához: 0 idõpont – a 100%-osan nyitott sérülés területet jelenti, itt 0% a sebösszehúzódás. 1. idõpont a sérülés kiváltását követõ 72. óra, 2. idõpont a sérülés kiváltását követõ 5. nap, 3. idõpont a sérülés kiváltását követõ 7. nap, 4. idõpont a sérülés kiváltását követõ 9. nap és 5. idõpont a sérülés kiváltását követõ 14. nap. A 14. napon a vizsgálatnak véget vetettünk, ezen a napon az állatokat leöltük ezen sérülések spontán gyógyulásának kinetikájára vonatkozó korábbi tapasztalataink alapján. A sérülések határait tartalmazó képeket digitalizáltuk. A sérülések területét és az összehúzódás százalékos értékét DIGIPAT képelemzõ szoftver alkalmazásával számítottuk. Minden paraméterre statisztikai analízist végeztünk SPSS csomag és nem paraméteres Mann–Whitney U teszt alkalmazásával, p<0,05 szignifikanciaszintet állapítottunk meg. Az állatokat túladagolt nátrium-pentobarbital (250 mg/kg) intraperitoneális beinjektálásával öltük le. A sérüléseket a húsos hártyákból (panniculus carnosus) szárítottuk és 10%¹os semleges formaimban fixáltuk paraffinba történõ késõbbi beágyazáshoz. A hematoxilin/eozin, van Giesson’s and Masson’s háromszínû színezékeket alkalmaztuk. Minden egyes csoportnál meghatároztuk azon állatok számát, amelyeknél a sérülés 100%-osan hámosodott, és rétegezett és differenciálódott epidermisz jött létre. A sebösszehúzódás kinetikájának értékeit a 6. táblázatban mutatjuk be.
6. táblázat Sebek összehúzódási kinetikájának értékei a kiértékelési idõszak során Csoport
Krónikus fekélyek összehúzódási kinetikája (%) 1. idõpont
2. idõpont
3. idõpont
I. csoport
3,18±1,1
5,31±1,15
II. csoport
4,14±2,2
7,63±1,12
III. csoport
6,55±1,14*
25,33±4,1**
8
4. idõpont
5. idõpont
15,8±1,37
21,8±1,54
40,82±4,41
17,3±1,81
23,81±1,53
39,75±3,63
35±3,51**
43,15±3,66**
67,2±3,44**
1
HU 006 754 T2
2
6. táblázat (folytatás) Csoport
Krónikus fekélyek összehúzódási kinetikája (%) 1. idõpont
2. idõpont
3. idõpont
4. idõpont
5. idõpont
IV. csoport
6,25±1,5
17,3±1,51
19,7±2,1
29,9±2,85
48,16±3,14
V. csoport
6,67±1,8
15,4±1,63
16,8±3,8
28,1±3,31
45,72±3,55
(*) Ez a többi csoporthoz viszonyítva p<0,05 statisztikai differenciát jelent. (**) Ez a többi csoporthoz viszonyítva p<0,01 statisztikai differenciát jelent. Mann–Whitney U teszt.
A mm¹ben kifejezett összehúzódási értékeket a sebméret 0 idõpontban mért sebméretre vonatkoztatott százalékos változásában adjuk meg. Nem várt módon a lassabb szabaddá válási profillal bíró FCE mikrogömböket tartalmazó készítmény (együtt kapszulázott segédanyagok nélküli) fejtette ki a sebszélek összehúzódására a legerõteljesebb hatást, ami más szóval azt jelenti, hogy ez gyakorolja a legkedvezõbb hatást a teljes gyógyulás meggyorsítására. Az összehúzódás néhány olyan összevont hatás egybeesését jelenti, amely a sebet közelíti az átalakuló szakaszhoz. Említésre méltó, hogy ezek a sebek a diabéteszes seb biokémiai mikrokörnyezetét oly módon stimulálják, mimellett az összehúzódási mechanizmus részben vagy teljesen patológiásan megszûnik. A 7. táblázatban minden egyes kísérleti csoportban bemutatjuk a krónikus fekélyek területének érett és szervezõdött sarjadzó szövetek által elfoglalt százalékos értékét. A számításokat az 5. idõpontban gyûjtött minták alapján végeztük mennyiségileg kifejezve azon pozitív mikroszkópos mezõk számát, amelyek az egyes mintákban egybeesnek a van Giesson és Masson-féle háromszínû reakciókkal. Néhány patológus és egy konzultáns egymástól függetlenül vak formában végezték a kiértékeléseket. 7. táblázat A sarjadzó területek százalékos aránya az 5. idõpontban az egyes vizsgálati csoportokban. Vizsgálati csoportonként 60 sebet tanulmányoztunk kollagén rostokra adott pozitív reakciójuk révén Érett sarjadó szövetekkel fedett terület (%)
I. csoport
31,78±3,25
II. csoport
29,85±2,28
III. csoport
81,6±3,55**
IV. csoport
68,12±2,55
V. csoport
65,72±2,98
(**) A többi csoporthoz viszonyítva p<0,01 szinten statisztikai különbséget jelent. Mann–Whitney U teszt.
Nem várt módon a lassabb szabaddá válási profillal bíró EGF mikrogömbökön alapuló készítmény (együtt kapszulázott segédanyagok nélküli) gyakorolta a legerõteljesebb hatást a sarjszövetek létrejöttére és éré-
sére, ez megfelel a leírás elõbbi részében a sebösszehúzódás folyamatára vonatkozóan említetteknek. 15 A kezelések hatását tanulmányoztuk a sérülések hámosodási folyamatának vonatkozásában is. A hámszövet (epithelium) mikroszkópos képét értékeltük figyelembe véve a krónikus fekélyek újrahámosodását, réteges epitélium jelenlétét és egy összkeratinréteg 20 meglétét. A mikroszkópos vizsgálatokhoz a sérüléseket centrálisan hosszanti irányban félbevágtuk, és a kapott darabokat azonos paraffin blokkba vittük be. Vizsgálati csoportonként összesen 120 szövetmetszetet vizsgáltunk, amelyek 60 sérülést képviselnek. 25 Egyetlen sérülést sem zártunk ki bakteriális fertõzés miatt. Eredményeinket a 8. táblázatban mutatjuk be. 8. táblázat A kezelések hatása krónikus fekélyek hámosodására 30
35
40
100%-osan hámosodott sebek száma
Érett epitheliummal bíró sebek száma
I. csoport
18
13
II. csoport
16
12
III. csoport
74
69
IV. csoport
62
44
V. csoport
59
42
A lassan szabaddá váló profillal bíró EGF mikrogömbökön alapuló készítménnyel (segédanyagok nélküli) kezelt III. csoport meglepõ módon a hámosodási válasz legjobb indikátorait mutatta, amit az összújrahá45 mosodás és az epithelium érettsége alátámaszt. 3. példa: Kapszulázott EGF in vivo hatása szabad EGF-hez hasonlítva (bõr krónikus ischaemiás fekélyes sebeivel bíró betegeknél) Lassan szabaddá váló profilú (segédanyag nélküli) 50 EGF mikrogömböket tartalmazó készítményt adagoltunk diabéteszes lábfekéllyel bíró, nagy amputációs kockázatú betegeknek. Egy 58 éves nõbeteg a jobb lábán 30,5 cm2 területû krónikus fekéllyel bírt, és az érintett lábán az ischaemia nyilvánvaló volt, ennek a beteg55 nek az érintett végtagját kezeltük a találmány tárgyát képezõ készítménnyel. A sérülés sebtisztítását követõen adagoltuk a lassan szabaddá váló profilú EGF mikrogömböket tartalmazó készítményt 15 naponként egy60 szer, 1 hónapon át a sebszélekbe és a seb aljára való 9
1
HU 006 754 T2
infiltrálással. Hasznos sarjadzó szövetek gyors képzõdését észleltük a kezelés kezdetét követõ elsõ héttõl, a harmadik héten értük el az érintett terület 100%¹os borítottságát. A beteg kielégítõ elõrehaladást mutatott a sérülés teljes záródásáig, és elkerülte az amputáció indikációjának szükségességét. A gyógyászati készítményt jól tolerálta, semmiféle káros hatást nem mutattunk ki. E készítmény seb körüli és sebbe való adagolása kedvezett a sarjadzó szövetek képzõdésének és a sebzáródásnak, nem várt módon elõsegítette a fekély gyógyulási folyamatát, így az a korábbi kezelésekhez viszonyítva rövidebb idõszak alatt következett be, és az amputáció szükségessége elkerülhetõvé vált. A kezelésnek ez a módja jobban elviselhetõnek bizonyult annak folytán, hogy lényegesen csökkent az injekciók száma.
5
10
15
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Gyógyászati kompozíció, amely epidermális növekedési faktor mikrogyöngyeit tartalmazza diabéteszes lábfekélyek vagy diabéteszes betegek alsó végtagjainak krónikus bõr ischaemiás sebei kezelésében való alkalmazásra és az említett alsó végtagok amputációjának megelõzésére, ahol az említett kompozíció parenterális úton kerül beadásra. 2. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, ahol az epidermális növekedési faktor polimer mikrogömbökbe vagy nanogömbökbe kapszulázott.
20
25
10
2
3. A 2. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, ahol a mikrogömbök glikolsav vagy tejsav homopolimereket és mindkettõt tartalmazó kopolimereket, [poli(laktid-koglikolid)], polikaprolaktont, polihidroxi-butirát-polihidroxi-valerát kopolimereket, politejsav-polikaprolakton kopolimereket, poliortoésztereket és polianhidrideket tartalmazó csoportból választott polimer anyagból készültek. 4. A 2. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, ahol az említett mikrogömbök átmérõje 1 mm és 100 mm közötti. 5. A 2. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, ahol az epidermális növekedési faktor a mikrogömbök össztömegének 1,6–2,4%¹át teszi ki. 6. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, ahol az epidermális növekedési faktor szabaddá válási sebessége az 1. nap után 5 és 10 mg/nap közötti. 7. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, ahol a 14 nap során szabaddá vált epidermális növekedési faktor megõrzi fizikai-kémiai és biológiai jellemzõit. 8. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, ahol a kompozíciót a szövetbe, amely magában foglalja a sérülések széleit és alját, helyi infiltrálással adagoljuk. 9. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati kompozíció, ahol a mikrogömbök hõre érzékeny PEG-PLGA-PEG típusú hidrogélben vagy kitozánvagy dextránszármazékban szuszpendáltak.
HU 006 754 T2 Int. Cl.: A61K 9/16
11
HU 006 754 T2 Int. Cl.: A61K 9/16
12
HU 006 754 T2 Int. Cl.: A61K 9/16
13
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
