!HU000007356T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 356
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: PCT/NL2004/000444 2004. 06. 22. WO 05103257 2005. 04. 21. EP 05103260 2005. 04. 21. EP
(73) Jogosult: N. V. Nutricia, 2712 HM Zoetermeer (NL)
(72) Feltalálók: VAN TOL, Eric, Alexander, Franciscus, NL-6824 MZ Arnhem (NL); WILLEMSEN, Linette, Eustachia, Maria, NL-3522 AJ Utrecht (NL); KOETSIER, Marleen, Antoinette, NL-8161 DW EPE (NL); BEERMANN, Christopher, 61267 Neu-Anspach (DE); STAHL, Bernd, 61191 Rosbach (DE) (54)
HU 007 356 T2
A23L 1/30
(21) Magyar ügyszám: E 05 755280 (22) A bejelentés napja: 2005. 06. 22. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050755280 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1758469 A2 2005. 12. 29. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1758469 B1 2009. 10. 28.
(2006.01) A23L 1/308 (2006.01) A61K 31/201 (2006.01) A61K 31/202 (2006.01) A61K 31/702 (2006.01) A61K 45/06 (2006.01) A61P 31/18 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05122791 PCT/NL 05/000451
(74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Az intestinalis gát integritásának javítása
A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 4 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 356 T2
A találmány területe A találmány tárgya HIV-páciensek intestinalis gátja („intestinal barrier”) integritásának javítására szolgáló készítmény alkalmazása gyógyszer elõállítására és az ilyen eljárásban történõ alkalmazásra megfelelõ készítmény. A találmány háttere A gastrointestinalis epithelium normálisan szelektív gátként mûködik, lehetõvé teszi a tápanyagok, elektrolitok és víz abszorpcióját és meggátolja az élelmezési és mikrobiális antigéneknek, ideértve a táplálék allergéneket, való kitettséget. A gastrointestinalis epithelium korlátozza az olyan antigének átjutását a szisztémás keringésbe, amelyek gyulladásos reakciókat, pl. allergiás reakciókat válthatnak ki. Ahogy az allergia, különösen a táplálékallergia elõfordulása növekszik, számos kutatócsoport keres (megelõzõ) gyógymódokat ezen betegségekre. A 1272058 számú európai szabadalom egy készítményt ismertet, amely emészthetetlen oligoszacharidokat tartalmaz, a szoros sejtkapcsolat javítására, hogy ezzel csökkentsék az intestinalis permeabilitást és csökkentsék az allergiás reakciókat. A készítmény tartalmazhat LC¹PUFA-kat („long chain-polyunsaturated faty acids”, hosszláncú többszörösen telítetlen zsírsavak). A 745001 számú európai szabadalom emészthetetlen oligoszacharidok kombinációját ismerteti és n–3 és n–6 zsírsavakat az ulcerativ colitis kezelésére. Usami és munkatársai [Clinical Nutrition 2001, 20(4): 351–359] ismertették az eikozapentaén-sav (EPA) hatását a szoros sejtkapcsolatok permeabilitására az intestinalis egysejtrétegben. Az õ kezükben az EPA-ról azt találták, hogy növeli a permeabilitást, ami azt jelezte, hogy az EPA nem megfelelõ az intestinalis gát integritásának javítására. A technika állása szerinti készítmények nem optimálisan megfelelõek a gátegység javítására. A találmány összefoglalása A találmány tárgya válogatott hosszú láncú többszörösen telítetlen zsírsavak (LC-PUFA¹k) és válogatott oligoszacharidok kombinációja. A találmány szerinti LC¹PUFA és oligoszacharid kombináció hatásosan javítja a gát integritását az inestinalis permeabilitás és a nyálkatermelés szinergisztikus javítása révén és az intestinalis gát épségét sértõ gyulladásos mediátorok nyálkahártya általi termelésének csökkentése révén. Ezen vegyületek kombinációja egy táplálék vagy gyógyászati készítményben különösen alkalmas a gát integritásának javítására HIV és AIDS páciensekben. Meglepetésre azt találtuk, hogy egyes LC¹PUFA¹k hatásosan csökkentették az epithelialis paracelluláris permeabilitást. Szemben azzal, amirõl Usami és munkatársai [Clinical Nutrition 20(4) 351–359 (2001)] számoltak be, azt találtuk, hogy a C18 és C20 többszörösen telítetlen zsírsavak, különösen az eikozapentaénsav (EPA), dokozahexaénsav (DHA) és arachidonsav (ARA) képes hatásosan csökkenteni az intestinalis szoros sejtkapcsolat permeabilitását.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
Az LC¹PUFA-kon kívül a találmány szerinti készítmény tartalmaz oligoszacharidokat. A kiválasztott oligoszacharidok javítják a gát integritását a nyálkatermelés serkentése révén, amely megnövelt nyálkarétegvastagságot eredményez. Úgy gondoljuk, hogy ezt a hatást a különbözõ oligoszacharidoknak a rövid láncú zsírsav (SCFA) termelésre kifejtett hatása okozza. Ennek megfelelõen, amennyiben jelen LC¹PUFA és emészthetetlen oligoszacharidok kombinációja enterálisan kerül beadásra emlõsnek, akkor szinergisztikusan javítja a gát integritását és/vagy szinergisztikusan csökkenti az intestinalis permeabilitást, a szoros sejtkapcsolat permeabilitásra és a nyálkatermelés serkentésére kifejtett szimultán hatása révén. A találmány egy további szempontja szerint a készítmény javítja az intestinalis nyálkaréteg minõségét. A nyálkaréteg mucinokat tartalmaz. A mucinok nagy molekulatömegû glikoproteinek, amelyeket kehelysejtek szintetizálnak és választanak ki. Gélszerû réteget alakítanak ki a nyálkás felületen, ezzel javítják a gát integritását. A nyálkaréteg különbözõ típusú mucinokat tartalmaz, például savas, semleges és szulfonált mucinokat. A nyálkaréteg megnövekedett heterogenitásáról azt gondoljuk, hogy javítja a gát mûködését. A találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább kettõ különbözõ oligoszacharidot tartalmaz, amely befolyásolja a nyálka felépítését és elõnyös módon befolyásolja a mucinheterogenitást a nyálkarétegben, vagy közvetlenül vagy a bélflóra megváltoztatásával. Véleményünk szerint minden egyes különbözõ kiválasztott oligoszacharid a nyálka mennyiségére különbözõ hatást gyakorol. Továbbá két különbözõ oligoszacharid szintén képes a nyalka minõségének javítására, ahogy ez a szulfonálás mértékében tükrözõdik, az SCFA-termelés szinergisztikus stimulálásával. Meglepetésünkre azt találtuk, hogy a találmány szerinti két különbözõ oligoszacharid keveréke szinergisztikusan serkenti az acetáttermelést. Azt is felismertük, hogy a nyálkatermelés függ az acetáttermeléstõl. Azt találtuk továbbá, hogy az ARA prekurzora, a gamma-linolénsav (GLA), elõnyösen kombinálható a jelen készítményben HIV-páciensek kezelésére. Az HIV-páciensek gyakran szenvednek intestinalis gyulladásos rendellenességektõl, amely elõnytelenné teszi nagy mennyiségû ARA bevitelét, mivel az ARA növeli a gyulladásos választ. Azt találtuk, hogy az ARA egy része helyettesíthetõ GLA alkalmazásával anélkül, hogy negatív hatása lenne a zsírkeverék hatásosságára. Ezért egy további szempont szerint a találmány tárgya EPA, DHA, ARA és GLA oligoszacharidokat tartalmazó készítmény és alkalmazásuk HIV vagy AIDS kezelésére és/vagy megelõzésére. Jelen készítményt elõnyösen tovább javítjuk mind hosszú, mind rövid láncú oligoszacharidok hozzáadásával. A különbözõ lánchosszok hozzáadása az ileum (csipõbél) és a vastagbél különbözõ részein eredményezi a nyálkahártya serkentését. A rövid láncú oligoszacharidok [jellemzõen a 2, 3, 4 vagy 5 polimerizációs fokúak (DP)] a proximális vastagbélben és/vagy a disztális ileumban serkentik a mucintermelést, míg a
1
HU 007 356 T2
2
Többszörösen telítetlen zsírsavak hosszabb láncú oligoszacharidokról [elõnyösen Meglepetésünkre azt találtuk, hogy az eikozapen5–60¹as polimerizációs fokú (DP)] azt gondoljuk, hogy taénsav (EPA, n–3), dokozahexaénsav (DHA, n–3) és a vastagbél („colon”) disztálisabb részén serkentik a arachidonsav (ARA, n–6) hatásosan csökkentik az inmucintermelést. Még további javítások érhetõek el legalább kettõ 5 testinalis szoros sejtkapcsolat permeabilitását. A GLA (n–6) szintén hatásosan csökkenti a gát permeabilitákülönbözõ oligoszacharid mind rövid láncú, mind sát. Ennek megfelelõen a találmány szerinti készíthosszú láncú oligoszacharid hozzáadásával. Ezen elõmény, amely különösen alkalmas az intestinalis gát innyös megvalósítási módok mind hozzájárulnak a gát tegritásának javítására, tartalmaz EPA¹t, DHA¹t és integritásának további javításához az ileum és/vagy a vastagbél teljes hosszában. 10 ARA¹t adott esetben GLA-val kombinációban. Azt találtuk, hogy LC¹PUFA¹k alacsonyabb koncentTovábbá meglepetésre azt találtuk, hogy az EPA, rációja, hatásos volt a szoros sejtkapcsolat permeabiliDHA és ARA képes volt csökkenteni az interleukin–4 tás csökkentésére (lásd a Példákat az Usami és mun(IL–4) káros hatását az intestinalis permeabilitásra. Az katársai közleményével szemben). Ennek megfelelõen IL–4 egy citokin, amelyet bizonyos betegekben a nyálkahártya T¹sejtjei megnövekedett mennyiségben választa- 15 a 20 és 22 szénatomos LC¹PUFA-tartalom a találmány szerinti készítményben, elõnyösen nem haladja meg a nak ki, és amely kiváltja az intestinalis permeabilitást. Enteljes zsírtartalom 85 tömeg%¹át, elõnyösen nem haladnek megfelelõen a találmány tárgya eljárás olyan betegja meg a 35 tömeg%¹át a teljes zsírtartalomnak. A találségek kezelésére és/vagy megelõzésére, amelyekben mány szerinti készítmény legalább 15 tömeg% és legaz intestinalis IL–4-koncentráció megemelkedett, mint amilyen az allergia, különösen az atopiás dermatitis. 20 elõnyösebben legalább 25 tömeg% 20 és 22 szénatomos LC¹PUFA¹t tartalmaz a teljes zsírtartalomban. A találmány részletes ismertetése Ugyanezen okból az EPA-tartalom elõnyösen nem haA találmány tárgya táplálékkészítmény, amely tarladja meg a teljes zsírtartalom 55 tömeg%¹át, még elõtalmaz nyösebben nem haladja meg a teljes zsírtartalom 25 töa) eikozapentaénsavat (EPA), dokozahexaénsavat 25 meg%¹át, de elõnyösen a teljes zsírtartalomnak leg(DHA) és arachidonsavat (ARA), ahol a 20 és alább 0,05 tömeg%¹a, még elõnyösebben legalább 22 szénatomos hosszú láncú többszörösen telítet0,1 tömeg%¹a és legelõnyösebben legalább 1 tölen zsírsavak aránya a teljes zsírtartalom legalább meg%¹a. A DHA-tartalom elõnyösen nem haladja meg 15 tömeg%¹a és legfeljebb 85 tömeg%¹a; és a teljes zsírtartalom 15 tömeg%¹át, még elõnyösebben b) legalább két különbözõ oligoszacharidot, ahol a két 30 nem haladja meg a 10 tömeg%¹át, de legalább 0,1 tökülönbözõ oligoszacharid homológiája monoszameg%¹a. Mivel az ARA¹t különösen hatásosnak találtuk charidegységekben kifejezve 90% alatti. a szoros sejtkapcsolat permeabilitásának csökkentéséEzen készítményt elõnyösen lehet alkalmazni inre, ezért a találmány szerinti készítmény viszonylag testinalis gát integritását javító eljárásban, amely eljánagy mennyiségben tartalmazza, elõnyösen a teljes rás tartalmazza a készítmény beadását emlõsnek. 35 zsírtartalomnak legalább 0,1 tömeg%-ában, elõnyösebEgy további szempont szerint a találmány tárgya ben legalább 0,25 tömeg%-ában, legelõnyösebben legtöbbszörösen telítetlen zsírsavak alkalmazása Humán alább 0,5 tömeg%-ában. Az ARA-tartalom elõnyösen Immunhiány Vírus (HIV) fertõzött páciensek kezelésénem haladja meg a teljes zsírtartalom 15 tömeg%¹át, re szolgáló eljárásban történõ alkalmazásra szolgáló elõnyösebben nem haladja meg az 5 tömeg%¹át, még készítmény elõállítására, amely eljárás tartalmazza a 40 elõnyösebben nem haladja meg az 1 tömeg%¹át. A jeHumán Immunhiány Vírus (HIV) fertõzött páciensek a len ARA-tartalmú enterális készítményhez elõnyösen következõket tartalmazó készítmény beadását: EPA¹t és DHA¹t adtunk, hogy kiegyensúlyozzuk az ARA a) eikozapentaénsavat (EPA), dokozahexaénsavat hatását, például hogy csökkentsük az ARA metabolitok (DHA) és arachidonsavat (ARA), ahol a 20 és lehetséges gyulladáskeltõ hatását. Az ARA metabolitok 22 szénatomos hosszú láncú többszörösen telítet- 45 túlzott mennyisége gyulladást okozhat. A találmány len zsírsavak aránya a teljes zsírtartalom legalább szerinti táplálék készítmény elõnyösen tartalmaz gam15 tömeg%¹a és legfeljebb 85 tömeg%¹a; és ma-linolénsavat (GLA, C18) is. A GLA az ARA prekurb) legalább két különbözõ oligoszacharidot, ahol a két zoraként hat, hogy helyettesítse legalább részben a kékülönbözõ oligoszacharid homológiája monoszaszítmény ARA-tartalmát annak érdekében, hogy tovább charidegységekben kifejezve 90% alatti. 50 csökkentse az ARA gyulladásserkentõ hatását. A HIV-fertõzött páciens kezelésének egy egyedi Ennek megfelelõen a találmány szerinti készítmény megvalósítási módja a táplálékkal történõ kezelés. elõnyösen tartalmaz ARA¹t, GLA¹t, EPA¹t és DHA¹t, A találmány további megvalósítási módjai a fent defiamelyben az (ARA+GLA)/DHA tömegarány elõnyösen niált készítmény alkalmazása HIV-fertõzött páciensnek 0,1 feletti, elõnyösebben 0,25 feletti, és még elõnyötörténõ táplálék szolgáltatásra, amely a HIV-fertõzött 55 sebben 0,5 feletti. Az arány elõnyösen 25 alatt van és páciensnek a készítmény beadásával történik továbbá legelõnyösebben 3 alatt van. a fent definiált készítmény alkalmazását is HIV-fertõA találmány szerinti készítmény elõnyösen a teljes zött páciens intestinalis gátja épségének serkentésére, zsírtartalomra vetítve 15 és 75 tömeg% közötti mennyiamely a HIV-fertõzött páciensnek a készítmény beadáségben tartalmaz többszörösen telítetlen zsírsavakat, sával történik. 60 elõnyösen 15 és 50 tömeg% között. 3
1
HU 007 356 T2
A 20 és 22 szénatomos LC¹PUFA lehet szabad zsírsavakként, triglicerid formában, foszfolipid formában jelen, vagy az elõzõk valamelyikének vagy többjének a keveréke formájában. A találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább az ARA vagy DHA egyikét foszfolipid formában tartalmazza. A találmány szerinti táplálékkészítmény elõnyösen tartalmaz omega¹9 (n–9) zsírsavat (elõnyösen oleinsavat, 18:1) a megfelelõ táplálás nyújtása érdekében. Elõnyösen a találmány szerinti készítmény a teljes zsírtartalomra vetítve legalább 1 tömeg% n–9 zsírsavat ad, elõnyösebben legalább 5 tömeg%¹ot ad. Az n–9 zsírsavtartalom elõnyösen 80 tömeg% alatti. Megfelelõ napi mennyiség lehet legalább 0,1 gramm EPA és 0,05 gramm ARA vagy ARA+GLA, vagy 0,1 gramm és 5 gramm közötti EPA és 0,05 gramm és 2,5 gramm közötti ARA vagy ARA+GLA, vagy 0,5 gramm és 2,5 gramm közötti EPA és 0,25 gramm és 1,25 gramm közötti ARA vagy ARA+GLA, vagy 0,75 gramm és 1,5 gramm közötti EPA és 0,37 gramm és 0,75 gramm közötti ARA vagy ARA+GLA. A megfelelõ DHA napi mennyiségek kiszámolhatóak a fent megadott (ARA+GLA)/DHA arányból. Oligoszacharidok A találmány szerinti megfelelõ oligoszacharidok az olyan szacharidok, amelyek polimerizációs foka (DP) legalább 2 monoszacharidegység, amelyek nem vagy csak részlegesen emésztõdnek meg a belekben az emberi felsõ emésztési szakaszban (vékonybél és gyomor) jelen lévõ savak vagy emésztõenzimek hatására, de amelyeket az emberi bélflóra képes fermentálni. A monoszacharidegység kifejezés olyan egységeket jelöl, amelyek zárt gyûrûszerkezettel bírnak, elõnyösen hexóz, pl. piranóz vagy furanóz formájúak. Az oligoszacharid polimerizációs foka jellemzõen 60 monoszacharidegység alatti, elõnyösen 40 alatti, még elõnyösebben 20 alatti. A találmány szerinti készítmény legalább két különbözõ oligoszacharidot tartalmaz, ahol az oligoszacharidok homológiája a monoszacharidegységekben körülbelül 90% alatti, elõnyösen 50% alatti, még elõnyösebben 25% alatti, még elõnyösebben 5% alatt. A „homológia” kifejezés, a találmány szerinti értelemben a különbözõ oligoszacharidokban az azonos monoszacharidegységek százalékának kumulatív értéke. Például az 1¹es oligoszacharid (OL1) szerkezete a következõ: fruktóz-fruktóz-glukóz-galaktóz, és így 50% fruktózt, 25% galaktózt és 25% glukózt tartalmaz. A 2¹es oligoszacharid (OL2) szerkezete a következõ: fruktóz-fruktóz-glukóz, és így 66% fruktózt és 33% glukózt tartalmaz. A különbözõ oligoszacharidok homológiája így 75% (50% fruktóz+25% glukóz). Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti készítmény tartalmaz galaktooligoszacharidokat és a következõk legalább egyet: fruktooligoszacharidok vagy inulin. Minden egyes találmány szerinti oligoszacharid a benne található monoszacharidegységek összes számának elõnyösen legalább 66%-ban, elõnyösebben
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
legalább 90%-ban olyan monoszacharidegységet tartalmaz, amely a következõk bármelyike: mannóz, arabinóz, fruktóz, fukóz, ramnóz, galaktóz, b¹D-galaktopiranóz, ribóz, glukóz, xilóz, uronsav vagy ezek származékai. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány szerinti oligoszacharidok közül legalább egy a következõk bármelyike: fruktánok, fruktooligoszacharidok, emészthetetlen dextrinek galaktooligoszacharidok (ideértve a transzgalaktooligoszacharidokat), xilooligoszacharidok, arabinooligoszacharidok, glukooligoszacharidok, mannooligoszacharidok, fukooligoszacharidok, savas oligoszacharidok (lásd alább például uronsav oligoszacharidok, mint amilyen a pektinhidrolizátum) vagy ezek keverékei. Elõnyösen a találmány szerinti készítmény tartalmaz legalább egyet, elõnyösen legalább kettõt a következõ oligoszacharidok közül: fruktooligoszacharidok vagy inulin, galaktooligoszacharidok vagy pektinhidrolizátum. A jó nyálkamennyiség és ¹minõség érdekében a találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább egy oligoszacharidot tartalmaz, amely legalább 66% galaktózt vagy fruktózt tartalmaz monoszacharidegységként. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a készítmény tartalmaz legalább egy oligoszacharidot, amely legalább 66% galaktózt tartalmaz monoszacharidegységként, és legalább egy oligoszacharidot, amely legalább 66% fruktózt tartalmaz monoszacharidegységként. Egy különösen elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti készítmény tartalmaz galaktooligoszacharidot és a következõ oligoszacharidok bármelyikét: fruktooligoszacharid vagy inulin. A fruktooligoszacharidok serkentik a szulfomucintermelést a distalis vastagbélben az emberiflóra-kapcsolt patkányokban [Kleessen és munkatársai, (2003) Brit J. Nutr 89: 597–606] és a galaktooligoszacharidok serkentik a savas mucintermelést [Meslin és mtsai., (1993) Brit. J. Nutr 69: 903–912]. A nyálkaréteg vastagságának a további javításához a teljes vastagbélben, a találmány szerinti készítményben az oligoszacharidoknak legalább 10 tömeg%-ának a DP¹je 2 és 5 közötti (például 2, 3, 4, és/vagy 5) és legalább 5 tömeg%-ának a DP¹je 10 és 60 közötti. Elõnyösen az oligoszacharidoknak legalább 50 tömeg%ának, még elõnyösebben legalább 75 tömeg%-ának a DP¹je 2 és 9 közötti (például 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, és/vagy 9), mivel ezekrõl úgy gondoljuk, hogy a csípõbél (ileum) teljes hosszában és a vastagbél proximális és középsõ részein mûködnek, és mert a kívánt hatás eléréséhez a készítményhez hozzáadni szükséges oligoszacharidok tömegszázalékai csökkentettek. Elõnyösen a tömegarányok: a) (2 és 5 közötti DP¹jû oligoszacharidok): (6, 7, 8 és/vagy 9 DP¹jû oligoszacharidok) >1; b) (10 és 60 közötti DP¹jû oligoszacharidok): (6, 7, 8 és/vagy 9 DP¹jû oligoszacharidok) >1; vagy mindkettõ nagyobb, mint 1. Elõnyösen mindkét tömegarány 2 feletti, még elõnyösebben 5 feletti. A nyálkaréteg vastagságának és minõségének még további javításához a teljes vastagbél területén, elõ-
1
HU 007 356 T2
nyösen a legalább kettõ különbözõ oligoszacharid mindegyike különbözõ lánchosszúságúként kerül hozzáadásra, elõnyösen a megfelelõ oligoszacharid teljes tömegének legalább 10 tömeg%¹a minden egyes oligoszacharid esetében 2 és 5 közötti DP¹jû (például 2, 3, 4, és/vagy 5) és legalább 5 tömeg%¹a 10 és 60 közötti DP¹jû. Elõnyösen az adott oligoszacharid össztömegének legalább 50 tömeg%-ának, elõnyösebben legalább 75 tömeg%-ának DP¹je 2 és 10 közötti, mivel ezekrõl úgy véljük, hogy az ileum teljes hosszában és a vastagbél középsõ részein mûködnek. Savas oligoszacharidok A gát integritásának további javításához a találmány szerinti készítmény tartalmaz 2 és 60 közötti DP¹jû savas oligoszacharidokat. A savas oligoszacharid olyan oligoszacharidot jelöl, amely legalább egy savas csoportot tartalmaz a következõk közül: N¹acetilneuraminsav, N¹glikoloil-neuraminsav, szabad vagy észterezett karbonsav, kénsavcsoport vagy foszforsavcsoport. A savas oligoszacharid elõnyösen tartalmaz uronsavegységeket (például uronsavpolimer), még elõnyösebben galakturonsavegységeket. A savas oligoszacharid lehet homogén vagy heterogén szénhidrát. Megfelelõ példák a pektin- és/vagy algináthidrolizátumok. Az intestinalis szakaszban az uronsavpolimerek uronsavmonomerekké hidrolizálódnak, amely serkenti az intestinalis acetáttermelést, amely serkenti az intestinalis nyálkakiválasztást (Barcelo és munkatársai, Gut 2000; 46:218–224). Elõnyösen a savas oligoszacharidok az alábbi I¹es szerkezettel bírnak, amelyben a terminális hexóz (bal) elõnyösen tartalmaz kettõs kötést. A terminális hexózegységen kívüli hexózegységek elõnyösen uronsavegységek, még elõnyösebben galakturonsavegységek. A karbonsavcsoportok ezeken az egységeken lehetnek szabadok vagy (részlegesen) észterezettek, és elõnyösen legalább 10%-ban metilezettek (lásd alább). I¹es szerkezet: Savas oligoszacharidpolimer
5
10
15
20
25
30
35
40
45
ahol: R elõnyösen a következõk bármelyike: hidrogén, hidroxi- vagy savcsoport, elõnyösen oxi; és az R2, R3, R4 és R5-bõl álló csoport legalább egyike N¹acetil-neuraminsavat, N¹glikoloil-neuraminsavat, szabad vagy észterezett karbonsavat, kénsavcsoportot vagy foszforsavcsoport jelöl, és a többi R2, R3, R4 vagy R5 jelentése hidroxi és/vagy hidrogén. Elõnyösen az R2, R3, R4 vagy R5-bõl álló csoport bármelyike N¹acetil-neuraminsavat, N¹glikoloil-neuraminsavat, szabad vagy észterezett karbonsavat, kénsavcsoportot vagy foszforsavcsoport jelöl, és a többi R2, R3, R4 vagy R5 jelentése hidroxi és/vagy hidrogén. Még elõnyösebben
50
55
60 5
2
az R2, R3, R4 és R5-bõl álló csoport egyike szabad vagy észterezett karbonsavat jelöl, és a többi R2, R3, R4 vagy R5 jelentése hidroxi és/vagy hidrogén; és n egész szám és a hexózegységek számát jelöli (lásd még a polimerizációs fokot az alábbiakban), ami bármilyen hexózegység lehet. Megfelelõen n egy 1 és 5000 közötti egész szám. Elõnyösen a hexózegység(ek) uronsavegységek. Legelõnyösebben R1, R2 és R3 jelentése hidroxi, R4 jelentése hidrogén, R5 jelentése karbonsav, n 1 és 250 közötti egész szám, elõnyösen 1 és 10 közötti, és a hexózegység galakturonsav. A találmányban alkalmazott elõnyös savas oligoszacharidok detektálását, mérését és analízisét ismertetik korábbi szabadalmi beadványok, amelyek tárgya a savas oligoszacharid, például WO 0/160378 számú nemzetközi közzétételi irat. A vastagbél teljes területén a nyálkaréteg vastagságának serkentéses javításához, a találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább 10 tömeg% 2 és 5 közötti (például 2, 3, 4 és/vagy 5) DP¹jû savas oligoszacharidot tartalmaz és legalább 5 tömeg% 10 és 60 közötti DP¹jû savas oligoszacharidot tartalmaz, amely tömeg% az oligoszacharidok teljes tömegén alapszik. A találmány szerinti alkalmazott savas oligoszacharidokat pektinbõl, pektátból, alginátból, chondroitinbõl, hialuronsavakból, heparinból, heparánból, szialoglikánokból, fukodiánból, fukooligoszacharidokból vagy karragenánból állítjuk elõ, elõnyösen pektinbõl és/vagy alginátból. Oligoszacharidtartalom Amennyiben etetésre kész folyadék formában van, akkor a találmány szerinti készítmény 0,1–100 gramm emészthetetlen oligoszacharidokat tartalmaz literenként, elõnyösebben 0,5–50 grammot literenként, még elõnyösebben 1–25 grammot literenként. A túl magas oligoszacharidtartalom kellemetlen érzéseket válthat ki a jelentõs fermentáció miatt, míg a nagyon alacsony tartalom elégtelen nyálkaréteget eredményezhet. A legalább kettõ különbözõ oligoszacharid tömegaránya elõnyösen 1 és 10 közötti, még elõnyösebben 1 és 5 közötti. Ezen tömegarányok optimálisan serkentik a különbözõ típusú mucinok termelését, különbözõ helyeken a belekben. A találmány szerinti készítményhez az oligoszacharidot 0,1 tömeg%-nál nagyobb mennyiségben adjuk, elõnyösen 0,2 tömeg%-nál nagyobban, még elõnyösebben 0,5 tömeg%-nál nagyobban és még elõnyösebben 1 tömeg%-nál nagyobban, a készítmény teljes száraz tömegére vetítve. A készítmény oligoszacharidtartalma elõnyösen 20 tömeg% alatti, elõnyösebben 10 tömeg% alatti, még elõnyösebben 5 tömeg% alatti. A találmány szerinti készítményhez nukleotidok és/vagy nukleozidok hozzáadása tovább javítja a bélnyálka gátfunkcióját, különösen, mivel gátolja és/vagy csökkenti a bakteriális transzlokáció elõfordulását és csökkenti a belek sérülését. Ennek megfelelõen a találmány szerinti készítmény tartalmaz továbbá 1 és 500 mg közötti mennyiségben nukleozidokat és/vagy
1
HU 007 356 T2
nukleotidokat a száraz tápszer 100 grammjára vetítve, még elõnyösebben 5 és 100 mg közötti mennyiségben. Alkalmazás A találmány szerinti készítményt elõnyösen alkalmazhatjuk emlõsökben, különösen emberekben a gát integritásának javítására szolgáló eljárásban. A találmány szerinti készítményt továbbá elõnyösen alkalmazhatjuk a csökkent gátintegritással asszociált betegségek kezelésére vagy megelõzésére. A találmány szerinti készítmény beadása elõnyösen szájon át történik. A betegeknek és csecsemõknek a találmány szerinti készítmény elõnyösen kombinálva van teljes táplálékkal, ideértve a fehérjét, szénhidrátot és zsírt. A találmány szerinti készítmény elõnyösen 0 és 2 év közötti csecsemõknek kerül beadásra. A készítmény beadható olyan pácienseknek, akik a gát integritásának sérülésében szenvednek és egészséges pácienseknek. A találmány szerinti készítményt elõnyösen koraszülött csecsemõ (olyan csecsemõ, aki 37 hét gesztációs idõ elõtt születik) táplálékszükségleteit adó eljárásban alkalmazhatjuk. A találmány szerinti készítményt elõnyösen alkalmazhatjuk továbbá intestinalis sérülés kezelésére és/vagy megelõzésére, melynek során a találmány szerinti készítményt az intestinalis sérülést kiváltható orvosi kezelést megelõzõen vagy azt követõen adjuk be. Ilyen orvosi kezelés lehet például a sebészet vagy az enterális gyógyszeres kezelés (például antibiotikumos, analgéziás, NSAID, kemoterápiás vegyületek stb.). A találmány szerinti készítményt elõnyösen alkalmazhatjuk továbbá olyan betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére, amelyekben az intestinalis gát sérülése határozza meg a betegség elõrehaladását, például krónikus gyulladásos megbetegedések, különösen a gyulladásos bélbetegség (IBD), irritábilis bél szindróma (IBS), coeliákia, pankreatitisz, hepatitisz, arthritis vagy cukorbetegség megelõzésére vagy kezelésére. Továbbá a találmány alkalmazható olyan páciensek táplálására, akik abdominális sebészeti beavatkozáson estek át vagy fognak átesni és olyan pácienseknek, akiknél a belek posztoperatív mûködési zavarait tapasztalják és/vagy rosszul táplált pácienseknek. A találmány egy megvalósítási módja szerint a találmány szerinti készítményt olyan pácienseknek adjuk be, akik szerzett immunhiány szindrómában (AIDS) szenvednek és/vagy olyan pácienseknek, akik emberi immunhiányvírussal (HIV) fertõzöttek, például AIDSés/vagy HIV-fertõzés kezelésére alkalmas eljárásban. A kezelés tartalmazza a találmány szerinti készítmény beadását, elõnyösen a következõ tápanyagok bármelyikével együtt: szénhidrát, zsír vagy fehérje. A találmány szerinti készítmények különösen alkalmasak olyan páciensekre, akiknek a CD4+ T¹sejt-számuk a kritikus 700 sejt/ml vérérték alatt van, ha általánosan még nem szükséges nagyon hatásos retrovírus elleni terápia („Highly Active Antiretroviral Therapy”, HAART), de ha a páciensek esetében az intestinalis gát épségéhez, különösen az intestinalis gát épségé-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
nek mûködészavarához kapcsolódó problémák kialakulásának kockázata már fennáll vagy azok már ki is alakultak. Tehát egy további szempont szerint a találmány segíti a CD4+ T¹sejtek száma csökkenésének lassítását vagy megállítását vagy javítja a CD4+ T¹sejtek számát HIV-ben és/vagy AIDS-ben szenvedõ páciensek esetében. Egy megvalósítási mód szerint a találmány magában foglalja a találmány szerinti készítmény beadását páciensnek, amely páciens olyan humán alany, akinek a CD4+ T¹limfocita-sejtszáma 200–700 sejt/ml vér. Egy még további megvalósítási mód szerint a találmány magában foglalja a találmány szerinti készítmény beadását páciensnek, amely páciens nincs nagyon hatásos retrovírus elleni terápiával kezelve. Egy különös megvalósítási mód szerint a páciens CD4+ T¹limfocita-sejtszáma 200–700 sejt/ml vér és a páciens nincs nagyon hatásos retrovírus elleni terápiával kezelve. Továbbá a találmányt alkalmazhatjuk a gát integritásának csökkenése által okozott komplikációk megelõzésére vagy kezelésére, különösen a hasmenés, különösen a csecsemõhasmenés kezelésére és/vagy megelõzésére. A csecsemõhasmenés csökkent elõfordulási gyakorisága miatt a találmány szerinti készítmény elõnyösen alkalmazható a pelenka által okozott kiütések csökkentésére. A találmány szerinti készítmény beadása csökkenti a táplálék és mikrobiális antigének, különösen az élelmiszer-allergének átjutását az intestinalis lumenbõl a nyálkahártyába vagy a szisztémás keringésbe, és ennek megfelelõen elõnyösen alkalmazható allergia és/vagy allergiás reakció kezelésére vagy megelõzésére, különösen élelmiszer-allergia kezelésére vagy megelõzésére, például élelmiszer anyagok bevitele által kiváltott allergiás reakció. Azt is tapasztaltuk, hogy az EPA, DHA és/vagy ARA képesek az IL–4 hatását csökkenteni az intestinalis permeabilitáson. Ennek megfelelõen a találmány szerint készítmény alkalmazható olyan betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére, amelyekben az intenstinalis IL–4-koncentráció megemelkedett (például allergiás betegségek), mint például atopiás dermatitisz. A találmány szerinti készítmény elõnyösen csomagolt por vagy etetésre kész tápszer. Annak érdekében, hogy megelõzzük a termék pazarlását, az etetésre kész tápszer csomagolási mérete nem haladja meg az egy adagot, például elõnyösen nem haladja meg az 500 ml¹t; és a por alakú találmány szerinti készítmény csomagolása elõnyösen nem haladja meg a 250 adagnyit. A por megfelelõ csomagolási mérete a 2000 g¹os vagy ennél kisebb, elõnyösen az 1000 g¹os vagy ennél kisebb. A találmány tárgyát képezik címkével ellátott csomagolt termékek, amelyek explicite vagy implicite utasítják a fogyasztót a termék alkalmazására a fenti vagy alábbi okoknak megfelelõen. Az ilyen címkék például hivatkozhatnak a találmány szerinti eljárásra, amely az élelmiszer allergének által kiváltott allergiás reakciók megelõzésére szolgál, olyan kifejezésekkel mint, „csökkentett élelmiszer-érzékenység”, az „intestinalis tolerancia javí-
1
HU 007 356 T2
tása”, „javított tápláléktolerancia” vagy hasonló kifejezések. Hasonló módon lehet hivatkozni jelen allergia kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló eljárásra a „javított rezisztencia” vagy „csökkentett érzékenység” kifejezésekkel ekvivalens terminológiával. Tápszerek Azt találtuk, hogy a találmány szerinti készítményt elõnyösen lehet alkalmazni élelmiszerekben, mint amilyen a csecsemõ-élelmiszer és a klinikai élelmiszer. Az ilyen élelmiszer elõnyösen tartalmaz lipidet, fehérjét és szénhidrátot és elõnyösen folyadék formában kerül beadásra. A „folyékony élelmiszer” kifejezés a találmány szerinti értelemben száraz élelmiszert tartalmaz (például porokat), amelyekhez utasításokat mellékelünk arra vonatkozóan, hogy a száraz élelmiszer-keveréket megfelelõ folyadékkal (például vízzel) kell elkeverni. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát képezi továbbá táplálékkészítmény, amely tartalmaz 5 és 50 en% közötti lipidet, 5 és 50 en% közötti fehérjét, 15 és 90 en% közötti szénhidrátot és oligoszacharidok és LC¹PUFA¹k jelen kombinációját. Elõnyösen jelen táplálékkészítmény elõnyösen tartalmaz 10 és 30 en% közötti lipidet, 7,5 és 40 en% közötti fehérjét, 25 és 75 en% közötti szénhidrátot (az en% az energiaszázalék rövidített formája, és az egyes összetevõknek a készítmény teljes kalorikus értékéhez való hozzájárulását képviseli). Elõnyösen növényi lipidek kombinációját és a következõk közül legalább egyet alkalmazunk: halolaj, omega¹3 növényi, alga- vagy baktériumolaj. A táplálékkészítményben alkalmazott fehérjék elõnyösen a következõk bármelyike: nem emberi állati fehérjék (mint amilyenek a tejfehérjék, húsfehérjék vagy tojásfehérjék), növényi fehérjék (mint amilyen a szójafehérje, búzafehérje, rizsfehérje vagy borsófehérje), szabad aminosavak vagy ezek keverékei. Tehéntej eredetû nitrogénforrás, különösen tehéntejfehérjék, mint amilyen a kazein és a savófehérjék különösen elõnyösek. A széklet rendszertelenségek (például kemény székletek, nem megfelelõ széklettérfogat, hasmenés) sok folyadék-élelmiszert kapó csecsemõ és beteg alanyok esetében fontos problémák. Azt találtuk, hogy a székletproblémák csökkenthetõk jelen oligoszacharidok folyékony élelmiszerként történõ beadásával, amelyeknek az ozmolaritása 50 és 500 mOsm/kg közötti, elõnyösebben 100 és 400 mOsm/kg közötti. A fentiek fényében, az is fontos, hogy a folyékony tápláléknak ne legyen túlzott kalorikus sûrûsége, azonban az alany táplálásához még elégséges kalóriát adjon. Ennek megfelelõen a folyékony élelmiszer kalorikus sûrûsége 0,1 és 2,5 kcal/ml közötti, még elõnyösebben 0,5 és 1,5 kcal/ml közötti a kalorikus sûrûsége, legelõnyösebben 0,6 és 0,8 kcal/ml közötti.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55 Példák 1. példa: Az LC¹PUFA hatása a gát integritásra Intestinalis T84¹es epitélsejtvonalak [American Type Culture Collection (ATTC), Manassas, Amerikai
60 7
2
Egyesült Államok] egysejtrétegeit („monolayer”, MC) tenyésztettük Transwell szûrõkön (Corning, Costar BV, Hollandia) amely lehetõvé tette mind a nyálka, mind a szerológiai mintavételt és az emberi intestinalis epithelsejtek serkentését. A konfluencia elérését követõen két héttel az egy sejtrétegeket inkubáltuk az üreges rekeszekben többszörösen telítetlen zsírsavakkal, ARA-val (arachidonsav; 5,8,11,14-eikozatetraénsav), DHA-val (cisz-4,7,10,13,16,19 dokozahexaénsav), EPA-val (eikozapentaénsav) vagy kontroll palmitinsavval (C 16:0) (Palm) (Sigma, St. Louis, Amerikai Egyesült Államok). Az utóbbi eljárást azért választottuk, hogy utánozza a táplálék vegyületek in vivo beadási útvonalát. A sejteket inkubáltuk ARA-val, DHA-val, EPA-val, vagy palmitinsavval 0, 24, 48 és 72 óráig különbözõ koncentrációkban (10 mM és 100 mM). A kísérleteket az alap integritás értékelésére végeztük. Az epithelialis gát funkciót a transzepithelialis ellenállás (TER. W·cm2) megmérésével határoztuk meg, epithelialis volt-ohm mérõ készülékkel (EVOM; World Precision Instruments, Németország) és 4 kD FITC dextránpermeabilitással (paracelluláris permeabilitási jel, Sigma, Amerikai Egyesült Államok). Rezisztancia (Az epitheliumpermeabilitást a 4 kDa FITC-dextránra a következõ módon határoztuk meg. A dextránfluxusokat megelõzõen a tápközeget felfrissítettük egy óráig fenolvörös nélküli tenyésztõközeggel, amit 5 l (100 mg/ml törzs) 4 kDa FITC-dextrán hozzáadása követett az üreges rekeszbe. 30 perc inkubáció eltelte után 100 ml mintát vettünk a szerológiai rekeszbõl és mértük a fluoreszcens jelet 485 nm¹es excitációs hullámhosszon 520 nm¹es emisszión (FLUOstarGalaxy®, BMG Labtechnologies. Amerikai Egyesült Államok). A FITC-dextrán fluxusokat pmol FITC-dextrán/cm2/h¹ként számoltuk ki. A statisztikai elemzéseket ANOVA alkalmazásával végeztük (SPSS 10¹es verzió). A zsírsavak (100 mM) hatásának eredményeit a spontán gátintegritásra 72 órás inkubációt követõen adtuk meg az 1. táblázatban. Az 1. táblázat azt mutatja, hogy az ARA, EPA és DHA LC¹PUFA¹k csökkentik a molekuláris fluxust és javítják az epithelialis ellenállást. Ezzel szemben a kontroll kísérletek azt mutatják, hogy a palmitinsavnak ellentétes hatása van, azaz elrontja a gát integritását. Ezek az eredmények mutatják az EPA, DHA és ARA, és különösen az ARA elõnyös alkalmazását a találmány szerinti készítményben és a találmány szerinti eljárásban, azaz a gát integritásának javítására szolgáló eljárásban. Ezen eredmények továbbá alátámasztják a jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharid kombináció szinergisztikus hatásait. Az 1. ábra különbözõ zsírsavaknak (palmitinsav, DHA, GLA, és AA) idõ- és dózisfüggõ (10 mM és 100 mM) hatásait mutatja az alap gátintegritásra (TER). Az 1. ábra azt mutatja, hogy az AA, DHA, és GLA LC¹PUFA¹k javítják az epitéliális gát integritását, ahogy ez a megnövekedett ellenállásból (TER) tükrözõdik. Ezek az eredmények jellemzik az EPA, DHA, GLA és ARA, különösen az ARA elõnyös alkalmazását a találmány szerinti készítményben a gát integritásának javítására. Ezek az eredmények továbbá alátámasztják a
1
HU 007 356 T2
jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharid kombináció szinergisztikus hatásait. 1. táblázat 5
2
nikai és csecsemõtáplálék-kiszerelésekben az IL–4 által kiváltott gátsérülés megelõzésére vagy csökkentésére, például ahogy ez élelmiszer- vagy tehéntej-allergia esetén történik. Ezen eredmények további alátámasztást adnak a jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharid kombináció szinergisztikus hatásainak.
Összetevõ (LC-PUFA)
Fluxus
Ellenállás (TER)
Kontroll
79
1090
Palmitinsav
161
831
DHA
72
1574
ARA
28
1816
Kontroll
1493
GLA
360¯
331
ARA
273¯
337
EPA
236¯
375
DHA
304¯
328
EPA
65
2. táblázat 10
15 2. példa: Az LC¹PUFA hatása az IL–4 által kiváltott gátsérülésre Intenstinalis T84¹es epitélsejtvonalak (ATTC, Amerikai Egyesült Államok) egysejtrétegeit („mono-layer”, MC) tenyésztettük Transwell filter (Corning, Costar BV, Hollandia) amely lehetõvé tette mind a nyálka, mind a szerológiai mintavételt és az emberi intestinalis epitélsejtek serkentését. A konfluencia elérését követõen két héttel az egysejtrétegeket inkubáltuk IL–4 (2 ng/ml, szerológiai kompartment, Sigma, Amerikai Egyesült Államok) jelenlétében ARA, DHA, EPA vagy kontroll palmitinsavval többszörösen telítetlen zsírsavakkal, vagy ezek nélkül (10 mM vagy 100 mM, nyálkarekesz, Sigma, St. Louis, Amerikai Egyesült Államok). A sejteket 48 órát elõ inkubáltuk ARA-val, DHA-val, EPA-val vagy palmitinsavval az IL–4¹es inkubációt megelõzõen. A PUFA¹k és a palmitinsav együttes inkubációját az IL–4-gyel további 48 óráig végeztük; miközben a tenyésztõközeget és az adalékokat minden 24 órában cseréltük. Az epitéliális gátfunkciót a transzepithelialis ellenállás és a permeabilitás megmérésével határoztuk meg az 1. példában ismertetett módon. Az ARA, DHA, EPA és palmitinsav (100 mM) hatásának eredményeit az IL–4 által kiváltott gátsérülésre a 2. táblázatban adtuk meg. A 2. táblázat azt mutatja, hogy az ARA, DHA és EPA LC¹PUFA¹k gátolják az IL–4 által kiváltott megnövekedett fluxust. Ezzel szemben a palmitinsavnak káros hatása volt és csökkentette a gát sérülését a kontrollal összehasonlítva. Ezek az eredmények jellemzõek az ARA, DHA és EPA elõnyös alkalmazására klinikai vagy csecsemõtáplálék kiszerelésekben az IL–4 által kiváltott gátsérülés megelõzésére vagy csökkentésére, például ahogy ez élelmiszervagy tehéntej-allergia esetén történik. Ezen eredmények további alátámasztást adnak a jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharid kombináció szinergisztikus hatásainak. A 2. ábra adja meg az idõ és dózis (10 mM vagy 100 mM) függõ védõ hatásait a különbözõ FA¹knak (palmitinsav, DHA, GLA, és AA) az IL–4 által kiváltott gátsérülésre (Fluxus). A 2. ábra azt mutatja, hogy az ARA, DHA és GLA védenek az IL–4 által kiváltott gátsérüléssel szemben, ahogy ez a lecsökkent 4 kD dextránfluxusból tükrözõdik. Ezek az eredmények jellemzõek az ARA, DHA és GLA elõnyös alkalmazására kli-
Összetevõ (LC-PUFA)
IL–4 Fluxus
573
IL–4 TER
281
¯=PUFA által csökkentett permeabilitás; =PUFA által növelt
20 ellenállás
25
30
35
40
45
50
55
60 8
3. példa: Oligoszacharidok hatása az acetáttermelésre Mikroorganizmusokat vettünk tápszerrel táplált csecsemõk friss székletébõl. Friss székletanyagot gyûjtöttünk 1–4 hónapos korú csecsemõktõl és két órán belül tartósítóközegbe tettük. Szubsztrátként vagy prebiotikumot [TOS; TOS/inulin (HP) 9/1 (tömeg/tömeg) arányú keverék: inulin; oligofruktóz(OS)/inulin 1/1 (tömeg/tömeg) arányú keverékben], vagy semmit sem (üres) alkalmaztunk. A transzgalaktooligoszacharidokat (TOS) a Vivinal GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Hollandia cégtõl szereztük be és emészthetetlen oligoszacharidként a következõket tartalmazta: 33 tömeg% diszacharidok, 39 tömeg% triszacharidok, 18 tömeg% tetraszacharidok, 7 tömeg% pentaszacharidok és 3 tömeg% hexa¹, hepta- és oktaszacharidok. Az inulin (HP) Orafti active food ingredients, Tienen, Belgium, például RaftilineHP®, 23¹as átlagos DP¹vel. Tápközeg: McBain & MacFarlane tápközeg: pufferezett pepton víz 3,0 g/l, élesztõkivonat 2,5 g/l, mucin [kefeszegély („brush border”)] 0,8 g/l, tripton 3,0 g/l, L¹cisztein-HCl 0,4 g/l, epesavas sók 0,05 g/l, K2HPO4.3H2O 2,6 g/l, NaHCO3 0,2 g/l, NaCl 4,5 g/l, MgSO4.7H2O 0,5 g/l, CaCl2 0,228 g/l, FeSO4.7H2O 0,005 g/l. 500 ml¹es Scott üvegeket töltöttünk meg a tápközeggel és 15 percig sterilizáltuk 121 °C¹on. Pufferezett tápközeg: K2HPO4.3H2O 2,6 g/l, NaHCO3 0,2 g/l, NaCl 4,5 g/l, MgSO4.7H2O 0,5 g/l, CaCl 2 0,228 g/l, FeSO 4 .7H 2 O 0,005 g/l. A pH=6,3±0,1¹re állítva K2HPO4-gyel vagy NaHCO3-tal. 500 ml¹es Scott-üvegeket töltöttünk meg a tápközeggel és 15 percig sterilizáltuk 121 °C¹on. Tartósító tápközeg: Pufferezett pepton 20,0 g/l, L¹cisztein-HCl 0,5 g/l, nátrium-tioglikolát 0,5 g/l, resazurin tabletta literenként 1, a pH¹t 6,7±0,1¹re állítottuk 1 M NaOH-lal vagy HCl-dal. Mikrohullámban fõzve. Szérumüvegeket töltöttünk meg 25 ml tápközeggel és 15 percig sterilizáltuk 121 °C¹on. Friss székletmintákat kevertünk össze tartósító tápközeggel és több óráig tároltuk 4 °C¹on. A székletek
1
HU 007 356 T2
tartósított oldatát 13 000 rpm¹en centrifugáltuk 15 percig, a felülúszót eltávolítottuk és McBain & Mac Farlane közeggel összekevert székletet kevertünk hozzá 1:5 tömegarányban. Ebbõl a székletoldatból 3 ml¹t kevertünk össze 85 mg glukózzal vagy prebiotikummal vagy semmivel (üres) egy üvegben és teljesen elkevertük. t=0 mintát vettünk (0,5 ml). Az eredményül kapott 2,5 ml szuszpenziót dialízis csõbe tettük egy 60 ml¹es üvegbe, amely 60 ml pufferezett tápközeget tartalmazott. Az üveget jól lezártuk és 37 °C¹on inkubáltuk. A dialíziscsövekbõl (0,2 ml) vagy a dialízispufferbõl (1,0 ml) mintákat vettünk hipodermiás fecskendõvel 3, 24, és 48 órát követõen és azonnal jégre tettük a fermentáció megállításához. A kísérletet a következõ minták alkalmazásával végeztük: 1) 85 mg TOS, 2) 85 mg inulin, 3) 85 mg TOS/inulin 9/1 (tömeg/tömeg) arányban, és 4) 85 mg OS/inulin 1/1 (tömeg/tömeg) arányban. SCFA¹t (acetát, propionát, butirát) határoztunk meg Varian 3800 gázkromatográf (GC) (Varian Inc., Walnut Creek, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával, amely lángionizációs detektorral volt ellátva. A mintákból 0,5 ml¹t injektáltunk 80 °C¹on az oszlopba (Stabilwax, 15×0,53 mm, 1,00 mm filmvastagság, Restek Co., Amerikai Egyesült Államok) hélium hordozógáz alkalmazása mellett [20,7 KPa (3,0 psi)]. A minta injektálását követõen a kemencét 160 °C¹ra hevítettük 16 °C/perc sebességgel, amelyet 220 °C¹ra történõ melegítés követett 20 °C/perc sebességgel és végül 220 °C¹on tartottuk 1,5 percig. Az injektor és a detektor hõmérséklete 200 °C volt. 2¹etil-butirsavat alkalmaztunk standardként. A 3. ábra mutatja az abszolút (3A. ábra) és a relatív SCFA profilt (3B. ábra), amely a különbözõ oligoszacharidok fermentációja révén keletkezett. A 3A. ábra azt mutatja, hogy két különbözõ oligoszacharid keveréke (TOS/inulin), amelyben a két különbözõ oligoszacharid homológiája a monoszacharidegységekben 90 alatti, és a különbözõ lánchosszúság azt eredményezi, hogy az SCFA (különösen az acetát) mennyisége egy gramm rostra vetítve szignifikánsan és szinergisztikusan nagyobb, mint az egyedi komponenseké. A 3B. ábra azt mutatja, hogy a TOS/inulin kombináció hozzáadása az elõnyös acetát nagyobb arányának kedvezett (B). Az in vivo acetáttermelés a kehelysejtek általi javított nyálkatermelést és intestinalis nyálkaréteg-vastagodást vált ki (lásd 4. példa). Ezen eredmények jellemzik a találmány szerinti készítmény elõnyös alkalmazását.
5
10
15
20
25
30
35
ben a MUC-2-expresszió meghatározásához, mivel a mucinok különösen nagyméretû glikoproteinek (500 kDa felettiek), amely nehézzé teszi a kezelésüket Western-blottolásos technikákban. Az eljárást validáltuk preimmunszérum (T84-gyel festve negatív), CCD–18¹Co (ATTC. Amerikai Egyesült Államok) negatív kontrollsejtek és marhaszérum-albumin (BSA) alkalmazásával. Sejtmintákat gyûjtöttünk Laemmliben (fehérjeizolációs puffer) és fehérjemeghatározást végeztünk mikrofehérjevizsgálat (Biorad, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával, a gyártó protokollja szerint. Mintákat (0,3–0,7–1,0 mg/2 ml) pöttyöztünk nitro-cellulóz-membránokra (Schleicher & Schuell, Németország). A membránokat blokkoltuk TBST/5% Protivarban (Nutricia, Hollandia) melyet 1 órás inkubáció követett antiMUC–2 antitesttel (Dr. Einerhand kedves adománya, Erasmus University, Rotterdam, Hollandia). A mosást követõen a blottokat kecske nyúl elleni-HRP-vel inkubáltuk (Santacruz Biotechnology, Amerikai Egyesült Államok) és a szubsztrátdetektáláshoz ECL¹t (Roche Diagnostics, Hollandia) alkalmaztunk. Denzitometriát végeztünk Lumi-Imager (Boehringer Mannheim B. V., Hollandia) alkalmazásával és a jelet fényegységekben fejeztük ki (BLU). A BLU-kat kifejeztük relatíve a kontroll inkubációkhoz is (%BLU). Az SCFA-nak a MUC-2-expresszióra kifejtett serkentõhatásának összehasonlításához az alap MUC–2 expressziós szinteket levontuk. A 4. ábra mutatja az SCFA (acetát, propionát, butirát) különbözõ hatásait a MUC-2-expresszióra intestinalis epithelialis sejtekben (MC T84) és epithelialis-mesenchymalis közös sejttenyészetekben (CC T84). A 4. ábra azt is mutatja, hogy az acetát hatásosabb a MUC-2-serkentésre (nyálkatermelés) a propionáttal és a butiráttal összehasonlítva. Ennek megfelelõen oligoszacharidok jelen kombinációja [amelyrõl bemutattuk, hogy növeli az acetáttermelést (lásd 3. példa)] különösen alkalmas a nyálkatermelés serkentésére és elõnyösen alkalmazható a gát integritásának javítására szolgáló eljárásban.
40
45
50 4. példa: Az SCFA hatásai a nyálkatermelésre Intenstinalis T84¹es epithelsejtek (ATTC, Amerikai Egyesült Államok) egysejtrétegeit tenyésztettük 24 vagy 96 lyukú szövettenyészet lemezeken (Corning B. V.). A T84¹et inkubáltuk a rövid láncú zsírsavak acetátjával, propionátjával és butirátjával (SCFA, Merck, Amerikai Egyesült Államok) 24 órát 0,025–4,0 mM koncentrációtartományban. Felülúszót és/vagy sejteket gyûjtöttünk és meghatároztuk a MUC¹2- (mucin) termelést. Pontblottolásos technikát alkalmaztunk a sejttenyészetek-
2
55
60 9
5. példa: Csecsemõ tejtápszer I Összetevõk (egy literben), energia 672 Kcal; fehérje 15 g; tejsavó:kazein arány 60: 40; zsír 36 g; szénhidrát 72 g; A¹vitamin 750 RE; kevert természetes karotinoidok 400 IU; D¹vitamin 10,6 mcg; F¹vitamin 7,4 mg; K¹vitamin 67,0 mcg; B1¹vitamin (thiamin) 1000 mcg; B2¹vitamin (riboflavin) 1500 mcg; B6¹vitamin (piridoxin) 600 mcg; B12-vitamin (cianokobalamin) 2,0 mcg; niacin 9,0 mcg; folsav 80 mcg; pantoténsav 3000 mcg; biotin 90 mcg; C¹vitamin (aszkorbinsav) 90 mg; kolin 100 mg; inozitol 33 mg; kalcium 460 mg; foszfor 333 mg; magnézium 64 mg; vas 8,0 mg; cink 6,0 mg; mangán 50 mcg; réz 560 mcg; jód 100 mcg; nátrium 160 mg; kálium 650 mg; klorid 433 mg és szelén 14 mcg; amelyben a zsírtartalom tartalmaz 3 gramm halolajat és 3 gramm 40%¹os arachidonsav-olajat (DSM Food Specialties, Delft, Hollandia); tartalmaz továbbá 4 gramm transzgalaktooligoszacharidot Elix’or™ (Borculo Domo Ingredients, Hollandia) és 4 gramm Raftiline™¹et (Orafti Active Food Ingredients, Belgium).
1
HU 007 356 T2
2
6. példa: HIV/AIDS rokon tünetek csökkentésére szolgáló táplálékrúd összetétele Nyersanyag
g/nap
Fehérje
Szénhidrát
Zsír
g/100 g
Tejfehérje
20,00
15,00
2,10
0,80
21,04
Tojásfehérje
21,09
16,87
0,00
0,00
22,19
Borágóolaj
4,00
0,00
0,00
4,00
4,21
EPA-DHA olaj
6,00
0,00
0,00
6,00
6,31
Galaktooligoszacharidok
15,38
0,00
4,78
0,00
16,18
Inulin
0,79
0,00
0,00
0,00
0,83
Pektin-hidrol
8,54
0,11
0,09
0,00
8,98
15,40
0,00
11,92
0,00
16,20
3,85
0,00
3,83
0,00
4,05
95,05
31,98
22,72
10,80
100,00
Fructosestroop Glicerin Összesen
Naponta kcal
En%
100 g¹ban kcal
128
40,5
135
Energia fehérje Energia szénhidrát
91
28,8
96
Energia zsír
97
30,8
102
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Többszörösen telítetlen zsírsavak alkalmazása humán immunhiányvírussal (HIV) fertõzött páciens kezelésére szolgáló készítmény elõállítására, amely készítmény tartalmaz: a) eikozapentaénsavat (EPA), dokozahexaénsavat (DHA) és arachidonsavat (ARA), ahol a 20 és 22 szénatomos hosszú láncú, többszörösen telítetlen zsírsavak aránya a teljes zsírtartalom legalább 15 tömeg%¹a és legfeljebb 85 tömeg%¹a; és b) legalább két különbözõ oligoszacharidot (OL1 és OL2), ahol a két különbözõ oligoszacharid homológiája monoszacharidegységekben kifejezve 90% alatti. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a készítmény továbbá gamma-linolénsavat (GLA) is tartalmaz. 3. Táplálékkészítmény, amely tartalmaz: a) eikozapentaénsavat (EPA), dokozahexaénsavat (DHA) és arachidonsavat (ARA), ahol a 20 és 22 szénatomos hosszú láncú, többszörösen telítetlen zsírsavak aránya a teljes zsírtartalom legalább 15 tömeg%¹a és legfeljebb 85 tömeg%¹a; és b) legalább két különbözõ oligoszacharidot (OL1 és OL2), ahol a két különbözõ oligoszacharid homológiája monoszacharidegységekben kifejezve 90% alatti, c) pektinbõl, pektátból, alginátból, chondroitinbõl, hialuronsavakból, heparinból, heparánból, szialoglikánokból, fukodiánból, fukooligoszacharidokból vagy karragenánból elõállított savas oligoszacharidot,
30
35
40
45
50
55
10
elõnyösen 2 és 60 közötti polimerizációs fokú (DP) uronsavpolimert. 4. A 3. igénypont szerinti készítmény, amely fruktooligoszacharidok, inulin és ezek keverékei közül választott fruktánt és galaktooligoszacharidot tartalmaz. 5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti készítmény, ahol az oligoszacharid legalább 10 tömeg%¹a 2–5 polimerizációs fokú (DP) és legalább 5 tömeg%-ának polimerizációs foka 10–60. 6. A 3–5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely 7,5–12,5 energia% fehérjét; 40–55 energia% szénhidrátokat; és 35–50 energia% zsírt tartalmaz, ahol a fehérje hidrolizált tejfehérje, növényi fehérje és/vagy aminosavak alkotta csoportból választott tagot foglal magában. 7. A 3–6. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely készítmény kalóriatartalma 0,6–0,8 kcal/ml; ozmolaritása 50–500 mOsm/kg; és viszkozitása 50 mPa·s alatti. 8. A 3–7. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely készítmény továbbá GLA¹t is tartalmaz. 9. A 3–8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, gyógyszerként történõ alkalmazásra. 10. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a páciens olyan humán alany, akinek a CD4+ T¹limfocitasejtszáma 200 és 700 sejt/ml vér közötti, és ahol a páciens nincs kezelve nagyon hatásos, retrovírus elleni terápiával („Highly Active Retroviral Therapy”). 11. A 3–9. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása emlõsben hasmenés kezelésére vagy megelõzésére szolgáló gyógyszer gyártására.
HU 007 356 T2 Int. Cl.: A23L 1/30
11
HU 007 356 T2 Int. Cl.: A23L 1/30
12
HU 007 356 T2 Int. Cl.: A23L 1/30
13
HU 007 356 T2 Int. Cl.: A23L 1/30
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest