!HU000006486T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 006 486
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 738849 (22) A bejelentés napja: 2003. 07. 07. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030738849 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1539231 A1 2004. 01. 15. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1539231 B1 2009. 06. 24.
(51) Int. Cl.: A61K 39/39 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04004762 PCT/SE 03/001180
(30) Elsõbbségi adatok: 0202110 2002. 07. 05.
(73) Jogosult: Isconova AB, 751 83 Uppsala (SE)
SE
(72) Feltalálók: MOREIN, Bror, S-755 91 Uppsala (SE); LÖVGREN BENGTSSON, Karin, S-756 53 Uppsala (SE)
HU 006 486 T2
(54)
(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest
Iscom elõállítása és alkalmazása
A leírás terjedelme 18 oldal (ezen belül 6 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 006 486 T2
A találmány tárgyköre A találmány tárgyát képezi készítmény, amely legalább két iscom komplexbõl vagy iscom-mátrix komplexbõl álló keveréket tartalmaz, amelyben mindkét komplex tartalmaz egy Quillaja Saponaria Molinából származó szaponinfrakciót, továbbá a készítmény immunmodulátorként vagy adjuvánsként történõ alkalmazása immunizáláshoz alkalmazandó formulákban, ezen belül oltóanyagokban. Különösen a találmány tárgyát képezi a quillaja-szaponin tisztított, félig tisztított vagy meghatározott frakcióinak alkalmazása olyan oltóanyagokban, amelyek adjuvánsként iscomot vagy iscom-mátrixot tartalmaznak. A találmány szerinti szaponinpreparátumok alkalmazása olyan termékeket eredményez, amelyek fokozott tolerálhatósággal és fokozott immunogenicitással rendelkeznek. A preparátumok alkalmazhatók immunogenicitás beállítására szolgáló eljárásokban, fokozott ellenõrzéssel a gyulladásos, túlérzékenységi és allergiás reakciók felett.
5
10
15
20 A technika állása A quillaja-szaponinok immunstimuláló tulajdonságai régóta jól ismertek (Ramon, 1926) és az 1950¹es évektõl kezdve alkalmaznak szabad formában, vagy idõnként Al(OH)3-dal kombináltan quillaja-szaponinokat a kereskedelmi forgalomban kapható oltóanyagokban (Dalsgaard, 1978; Ma és munkatársai, 1994; Espinet, 1951). Morein és munkatársai a hagyományos szabad formákkal összehasonlítva a quillaja-szaponinok egy lényegesen hatékonyabb alkalmazását írták le 1984ben: az ISCOM (iscom) technológiát (EP 0 109 942, EP 0 242 380 B1 és EP 0 180 564 B1 számú iratok), majd néhány évvel késõbb az ISCOM-mátrix technológiát (Lövgren és Morein, 1988, EP 0 436 620 B1 számú irat). Az iscom technológia alkalmazásával az oltóanyag-antigéneket egy 40 nm méretû, quillaja-szaponinokból, koleszterinbõl és foszfolipid(ek)bõl álló komplexbe építik be. Az ISCOM-mátrix technológia a quillaja-szaponin-koleszterin-foszfolipid komplexet az antigén(ek)hez kevert, ahhoz nem asszociált formában alkalmazza. Mindkét technológia csökkenti vagy megszünteti a quillaja-szaponinok hemolitikus aktivitását, amely tulajdonság lokális mellékhatásokat okoz és növeli a quillaja-szaponin preparátumok össztoxikusságát (Bomfod és munkatársai, 1992). A quillaja-szaponin preparátumok felületaktív glikozidok heterogén keverékei, és a jósolt és konzisztens adjuvánsaktivitással rendelkezõ gyártási tételek megtalálása és meghatározása terén jelentkezõ komoly problémák egy „Quillaja Saponaria Molina” elnevezésû „homogén” frakció izolálásához és jellemzéséhez vezettek (Dalsgaard, 1974). Késõbb kimutatták, hogy ez a frakció egy sor rokon szerkezetet tartalmaz, amelyeket reverz fázisú HPLC-vel (Kensil, 1988, 1991; Kensil, 1990, EP 0 362 279 B2, EP 0 55 276 B1 számú iratok) frakciók/csúcsok formájában tovább tisztítottak. E tisztítást nemcsak az motiválta, hogy könnyen jellemezhetõ és meghatározható, homogén szaponinfrakciókat állítsanak elõ, hanem az is, hogy meghatározzanak egy kevésbé toxikus terméket. Az akut toxikusság és mel-
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
lékhatások nagy problémát jelentettek a quillaja-szaponinok oltóanyag-preparátumokban történõ állatorvosi és különösen humán alkalmazásaiban is. E célokat csak részben tudták sikeresen elérni, bár a tisztított frakciókat, például a QA–21¹et (EP 0 362 279 B2 számú irat), és az A és C¹frakció kombinációit (WO 96/11711 számú irat, Isotec szabadalom) a „Quillaja Saponaria Moliná”-val összehasonlítva kémiailag meghatározták, de még mindig okoztak bizonyos mértékû toxikusságot és mellékhatásokat. Annak ellenére, hogy az A¹frakció látszólag nem volt toxikus, egy 70% A¹frakciót és 30% C¹frakciót tartalmazó keverék nem vagy csak alig volt kevésbé toxikus, mint a Quillaja Saponaria Molina C¹frakciója 100%-ban. A találmány kidolgozásához vezetõ munka során azt is kimutattuk, hogy a különféle quillaja-szaponin frakciók nemcsak, hogy eltérõ toxikusságot mutattak, de immunmoduláló tulajdonságaik is különbözõek voltak (Johansson és munkatársai, EP 0 362 279 B2 sz. irat). E frakciók kombinálásával különféle immunmoduláló kapacitásokat kaptunk, például Th1 felé irányító vagy Th2 felé irányító kapacitást. Azonban kívánatos azoknak a mellékhatások csökkentése, amelyek korlátozzák a tolerálható formulákban alkalmazható egyes frakciók mennyiségét. A találmány összefoglalása A találmány a quillaja-szaponin legalább két, tisztított csúcsának vagy meghatározott frakciójának külön entitásként (részecskeként) történõ alkalmazására vonatkozik, iscomban vagy iscom-mátrixban. Vagyis e frakciókat nem ugyanabban az iscom vagy iscom-mátrix részecskében kombináljuk össze, és különféle töltetû részecskéket keverünk össze az immunizálóformula elõállításához. Meglepetésünkre kiderült, hogy Quillaja Saponaria Molina különbözõ frakcióit tartalmazó iscomokból vagy iscom-mátrixokból álló keveréknek alacsonyabb a toxikussága, mint amikor a Quillaja Saponaria Molina-frakciókat ugyanabba az iscom vagy iscom-mátrix részecskébe építjük be. Például az A¹frakció mátrix és a C¹frakció mátrix keveréke, vagy az A¹frakció mátrix vagy a C¹frakció mátrix önmagában történõ alkalmazása jelentõs mértékben kevésbé volt toxikus egerekben, mintha ugyanazokat a frakciókat ugyanabba az iscom-mátrixba építettük volna be (4. példa, 1. táblázat). Emellett könnyebb beállítani az immunogenicitást vagy immunmoduláló tulajdonságokat, és jelentõs mértékben gyarapodnak az olyan, fejlettebb oltóanyag-formulák elõállítására szolgáló lehetõségek, amelyek a célfaj és az oltóanyag-antigének igényei/szükségletei szerint is optimalizáltak. Az egerek különösen érzékenyek a quillaja-szaponinokra és a túladagolás 4 napon, vagy gyakran 24 órán belül halálhoz vezet. Ezért egereket alkalmaztunk a találmány szerint elõállított formulák toxikus hatásainak és immunogenicitásának monitorozására. A quillaja-szaponinok iránti érzékenység terén óriási különbségek vannak a fajok között, ami jelzi, hogy a tolerálható formulák elõállításához szükséges a fajra történõ optimalizálás, de emellett az optimális immunogenicitású oltóanyag-for-
1
HU 006 486 T2
mulák elõállításának irányítására is. A lovak például nem pusztulnak el a nagy dózisú quillaja-szaponintól, de szabad Quillaja Saponaria Molina, Quillaja Saponaria Molinából készített iscom vagy iscom-mátrix vagy Quillaja Saponaria Molina kevert frakcióinak beinjekciózását követõen láz és lokális mellékhatások alakulhatnak ki. A találmány részletes ismertetése A találmány tárgyát képezi készítmény, amely legalább két iscom komplex keverékét tartalmazza, amelyben mindegyik komplex lényegében egy Quillaja Saponaria Molinából származó szaponinfrakciót tartalmaz. Az iscom komplex lehet iscom-mátrix komplex vagy iscom komplex. Az iscom legalább két glikozidot, legalább egy lipidet és legalább egyféle típusú antigént tartalmaz. A lipid legalább egy szterin, így például koleszterin és adott esetben foszfatidil-kolin. A komplex tartalmazhat még egy vagy több egyéb immunmoduláló (adjuvánsaktív) anyagot is, és elõállítása az EP 0 109 942 B1, az EP 0 242 380 B1 vagy az EP 0 180 564 B1 számú iratban leírtak szerint történhet. Az iscom-mátrix legalább egy glikozidot és legalább egy lipidet tartalmaz. A lipid legalább egy szterin, így például koleszterin és adott esetben foszfatidil-kolin. Az iscom komplex tartalmazhat még egy vagy több egyéb immunmoduláló (adjuvánsaktív) anyagot is, amely nem feltétlenül szaponin, és elõállítása az EP 0 436 620 B1 számú iratban leírtak szerint történhet. A találmány szerinti készítmény tartalmazhat vagy csak iscom vagy csak iscom-mátrix komplexeket, vagy tartalmazhatja iscom komplexek és iscom-mátrix komplexek valamilyen keverékét is. Különbözõ olyan iscom és/vagy iscom-mátrix komplexek keverhetõk össze, amelyekben a Quillaja Saponaria Molina különbözõ szaponinfrakcióit alkalmazták. A találmány tárgyát képezi továbbá legalább két olyan iscom komplex vagy iscom-mátrix komplex keverékének immunmoduláló gyógyászati termék elõállítására történõ alkalmazása, amelyek mindegyike egy Quillaja Saponaria Molinából származó szaponinfrakciót tartalmaz. A találmány egy másik szempontja legalább két olyan, 1. igénypont szerinti iscom komplex vagy iscommátrix komplex keverékének oltóanyag elõállítására történõ alkalmazását jelenti, amelyek mindegyike lényegében egy Quillaja Saponaria Molinából származó szaponinfrakciót, és legalább egy antigént tartalmaz. A találmány egy további szempontja legalább két olyan, 1. igénypont szerinti iscom-mátrix komplex keverékének adjuváns elõállítására történõ alkalmazását jelenti, amelyek mindegyike lényegében egy Quillaja Saponaria Molinából származó szaponinfrakciót tartalmaz. A találmány szerinti iscom-mátrixba beépített vagy ahhoz kapcsolódó immunogén bármilyen kémiai entitás lehet, ami immunválaszt képes indukálni egy egyedben, így például (többek között) emberben vagy
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
más állatban, ezen belül többek között humorális és/vagy sejtközvetített immunválaszt baktériumokkal, vírusokkal, mikoplazmákkal vagy más mikroorganizmusokkal szemben. A specifikus immunogén lehet fehérje vagy peptid, vagy szénhidrát, poliszacharid, lipopoliszacharid vagy lipopeptid; vagy lehet ezek bármely kombinációja is. A specifikus immunogén közelebbrõl lehet natív fehérje vagy fehérjefragmens, vagy szintetikus fehérje vagy fehérjefragmens vagy peptid; lehet natív glikoprotein, glikopeptid, lipoprotein, lipopeptid, nukleoprotein, nukleopeptid; lehet peptid-peptid konjugátum; vagy lehet rekombináns nukleinsav-expressziós termék. Ilyen immunogéneket említ az EP 0 109 942 B1 számú irat és ide tartoznak többek között azok, amelyek képesek immunválaszt kiváltani vírusos vagy bakteriális hepatitisz, influenza, diftéria, tetanusz, szamárköhögés, kanyaró, mumpsz, rubeola, polio, pneumococcus, herpesz, légúti óriássejtes vírus, hemofiliás influenza, chlamydia, varicella-zoster vírus, veszettség vagy humán immundeficienciavírus ellen. Az antigének beépíthetõk iscomba, vagy hozzákapcsolhatók iscomhoz vagy iscom-mátrixhoz vagy összekeverhetõk iscommal és/vagy iscom-mátrixszal. Iscomok vagy iscom-mátrixok bármilyen keveréke alkalmazható. Egy vagy több antigén is alkalmazható, továbbá szállító („transport”) vagy utas („passanger”) antigén is alkalmazható, ahogy az az EP 0 9600647.3 (PCT/SE97/00289) számú bejelentésben szerepel. Az alkalmazott lipidek közé tartoznak különösen a bejelentõ EP 0 109 942 B1 számú szabadalmában, és különösen annak 3. oldalán, valamint EP 0 436 620 B1 számú szabadalmában, a 7. oldal 7–24. soraiban leírtak. Különösen szterineket, így például koleszterint és foszfolipideket, így például foszfatidil-etanol-amint és foszfatidil-kolint alkalmaznak. A sejtkötõ komponensekhez kötõdni képes lipidtartalmú receptorok, így például a glikolipidek, ezen belül a koleratoxin receptora, amely a GM1-gangliozid, valamint fukózhoz kötött vércsoport-antigének is alkalmazhatók. A sejtkötõ komponensek ezután mint nyálkahártyához irányító molekulák mûködhetnek és hozzákötõdhetnek a lipidtartalmú anyagokhoz úgy, hogy egyszerûen hozzákeverjük õket ezeket tartalmazó komplexekhez. Ilyen receptorokat tartalmazó iscom komplexeket és receptorokat ismertet a WO 97/30728 számú irat. Az „egy Quillaja Saponaria Molinából származó szaponinfrakció” kifejezést a leírásban és az igénypontokban a Quillaja Saponaria egy félig tisztított vagy meghatározott szaponinfrakciójának vagy egy lényegében tiszta frakciójának általános leírására alkalmazzuk. Fontos, hogy a frakció nem tartalmaz annyi egyéb frakciót, amely negatívan befolyásolná azokat a jó eredményeket, amelyeket akkor kapunk, ha lényegében egyetlen frakciót tartalmazó iscomok vagy iscom-mátrixok keverékét alkalmazzuk. Ha kívánatos, a szaponinpreparátum tartalmazhat kis mennyiségben, például legfeljebb 40 tömeg%-ban, így például legfeljebb 30 tömeg%-ban, legfeljebb 25 tömeg%-ban, legfeljebb 20 tömeg%-ban, legfeljebb 15 tömeg%-ban, legfeljebb
1
HU 006 486 T2
10 tömeg%-ban, legfeljebb 7 tömeg%-ban, legfeljebb 5 tömeg%-ban, legfeljebb 2 tömeg%-ban, legfeljebb 1 tömeg%-ban, legfeljebb 0,5 tömeg%-ban, legfeljebb 0,1 tömeg%-ban egyéb vegyületeket, így például más szaponinokat vagy más adjuváns anyagokat is. A találmány szerinti szaponinfrakciók lehetnek a WO 96/11711 számú iratban ismertetett A¹, B¹ és C¹frakciók, az EP 0 436 620 számú iratban ismertetett B3¹, B4¹ és B4b-frakciók, az EP 0 362 279 B2 számú iratban ismertetett QA1–22 frakciók, a Q¹VAC (NorFeed AS, Dánia), vagy a Quillaja Saponaria Molina Spikoside (Isconova AB, Ultunaallén 2B, 756 51, Uppsala, Svédország). Alkalmazhatók az EP 0 362 279 B2 sz. iratban közölt QA¹1–2–3–4–5–6–7–8–9–10–11–12–13–14–15–16–17 –18–19–20–21 és –22 frakciók, és különösen a QA-7, –17, –18 és –21. Elõállításuk az EP 0 362 279 B2 számú iratban, különösen annak 6. oldalán, valamint 8. és 9. oldalán az 1. példában leírtak szerint történik. A WO 96/11711 számú iratban ismertetett A¹, B¹ és C¹frakciót a nyers vizes Quillaja Saponaria Molina kivonat lipofil frakciójának kromatográfiás elválasztásával, és a lipofil frakció kinyerése érdekében 70%¹os vizes acetonitrilben történõ elúciójával állítják elõ. A lipofil frakciót ezután félpreparatív HPLC-vel választják el, savas vízben 25–60% acetonitrilgradienst alkalmazó elúcióval. A leírásban „A¹frakció”-nak vagy „QH–A”-nak nevezett frakció az a frakció vagy annak a frakciónak felel meg, amely körülbelül 39% acetonitrilnél eluálódik. A leírásban „B¹frakció”-nak vagy „QH–B”-nek nevezett frakció az a frakció vagy annak a frakciónak felel meg, amely körülbelül 47% acetonitrilnél eluálódik. A leírásban „C¹frakció”-nak vagy „QH–C”-nek nevezett frakció az a frakció vagy annak a frakciónak felel meg, amely körülbelül 49% acetonitrilnél eluálódik. A különbözõ Quillaja Saponaria Molina-frakciókat tartalmazó iscom vagy iscom-mátrix komplexek kombinálásával olyan preparátumokat állíthatunk elõ, amelyek kevésbé toxikusak. Az is kiderült, hogy a készítmények hatása receptorközvetítettnek látszik, azaz a komplexeket felismerõ antigénprezentáló sejteken (APC) lévõ receptorokhoz kapcsolódik. Így azután, ha két különbözõ Quillaja Saponaria Molina frakciót ugyanabba az iscom komplexbe építünk be, akkor ez a komplex kötõdhet az 1. frakcióval szemben affinitással rendelkezõ receptorokhoz és a 2. frakcióval szemben affinitással rendelkezõ receptorokhoz is, azaz a receptorok két halmazához is. Ha azonban a frakciók külön iscom részecskékben vagy iscom-mátrix részecskékben vannak, mindegyik részecske a neki megfelelõ receptor(ok)hoz kötõdik és csak azokra a receptorokra korlátozódik, amelyekkel szemben affinitással rendelkezik. Amikor ugyanaz a részecske az APC¹n lévõ receptorok két halmazát is stimulálja, ez erõs hatásokat válthat ki, ami mellékhatásokhoz vezet. Emellett a különbözõ fajokban eltérõ lehet az a mód, ahogy a komplexek a receptorokon keresztül a hatásukat kifejtik. Ezért aszerint, hogy mit tartalmaznak a Quillaja Saponaria Molina különbözõ frakciói közül, az iscom komplexek bármilyen tömeg%¹os kombinációja alkalmazható.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
A találmány szerinti szaponinpreparátumok alkalmazása olyan termékeket eredményez, amelyek fokozott tolerálhatósággal és fokozott immunogenicitással rendelkeznek. A preparátumok alkalmazhatók immunogenicitás beállítására, ezen belül a gyulladásos, túlérzékenységi és allergiás reakciók feletti fokozott ellenõrzésre szolgáló eljárásokban. Az ilyen típusú beállítás fajfüggõ lehet és kihathat a toxikusságra, tolerálhatóságra és immunogenicitásra. A Quillaja Saponaria Molina szaponinok szubfragmenseinek bármilyen aránya alkalmazható. Emellett a Quillaja Saponaria Molina-szubfragmenseinek bármilyen kombinációja is alkalmazható. Így tehát két vagy több szubfragmenst építhetünk be egy-egy iscom vagy iscom-mátrix komplexbe és alkalmazhatjuk õket a találmány szerinti keverékben. Elõnyösen olyan iscom és/vagy iscom-mátrix keverékeket alkalmazunk, amelyekben a Quillaja Saponaria Molina-frakciót és a Quil C frakciót külön-külön építjük be különbözõ iscom komplexekbe vagy mátrixba. Ahogy azt már említettük, aszerint, hogy mit tartalmaznak a Quillaja Saponaria Molina A¹, illetve C¹frakciója közül, a különbözõ iscom komplexek bármilyen tömeg%¹os kombinációja alkalmazható. A keverék tartalmazhatja 0,1–99,9 tömeg%-ban, 5–95 tömeg%-ban, 10–90 tömeg%-ban, 15–85 tömeg%-ban, 20–80 tömeg%-ban, 25–75 tömeg%-ban, 30–70 tömeg%-ban, 35–65 tömeg%-ban, 40–60 tömeg%-ban, 45–55 tömeg%-ban, 40–60 tömeg%-ban, 50¹50 tömeg%-ban, 55–45 tömeg%-ban, 60–40 tömeg%-ban, 65–35 tömeg%-ban, 70–30 tömeg%-ban, 75–25 tömeg%-ban, 80–20 tömeg%-ban, 85–15 tömeg%-ban, 90–10 tömeg%-ban, 95–5 tömeg%-ban a Quillaja Saponaria Molina (leírásban definiált) A¹frakcióját tartalmazó iscom komplexeket, a 100 tömeg% fennmaradó részét pedig minden intervallum esetében a Quillaja Saponaria Molina (leírásban definiált) C¹frakcióját tartalmazó iscom komplexek adják, az alapján számítva, hogy az iscom komplexek mennyit tartalmaznak a Quillaja Saponaria Molina A és C¹frakciójából összesen. A keverék tartalmazhatja 75–99,5 tömeg%-ban az A¹frakciót, és 0,5–25 tömeg%-ban a C¹frakciót. A keverék elõnyösen 90–99 tömeg%-ban tartalmazza az A¹frakciót, és 1–10 tömeg%-ban a C¹frakciót. Egy különösen elõnyös preparátum körülbelül 91–98 tömeg%ban tartalmazza az A¹frakciót és körülbelül 2–9 tömeg%-ban a C¹frakciót, különösen körülbelül 92–96 tömeg%-ban az A¹frakciót és körülbelül 4–8 tömeg%-ban a C¹frakciót, az alapján számítva, hogy az iscom komplexek mennyit tartalmaznak a Quillaja Saponaria Molina A és C¹frakciójából összesen. A fent említett összes intervallum alkalmazható a Quillaja Saponaria Molina bármely frakcióinak bármely kombinációjához, bármely típusú humán vagy állatfajnak beadandó formulában. Az állatfajokra, amelyeknek a találmány szerinti formulák beadhatók, példák a házi kedvencek, így például a macskák, a kutyák, a lovak, a madarak, így például papagájok, és a gazdaságilag fontos fajok, így például a szarvasmarhafélék, például szarvasmarhafajok, a sertések, a juhok, és a kecskék.
1
HU 006 486 T2
Elõnyösen több mint 50 tömeg% C¹frakciót alkalmazunk bármely más frakcióval, és különösen az A¹frakcióval képzett bármely kombinációban. Így tehát 50,5–99,5 tömeg% C¹t és 0,5–49,5 tömeg% A¹t alkalmazhatunk. Ha a leírásban ismertetettek szerint állítjuk elõ a Quillaja Saponaria Molina A¹, B¹ és C¹frakcióját, akkor mindegyik meghatározható tulajdonságokkal rendelkezõ, kémiailag rokon vegyületek egy-egy csoportját vagy családját képviseli. A kromatográfiás körülmények, amelyek között ezeket kinyerjük, olyanok, hogy az elúciós profil és biológiai aktivitás terén nagymértékben konzisztens a gyártási tételek közötti reprodukálhatóság. A találmány tárgyát képezi továbbá oltóanyag-készítmény, amely aktív komponensként tartalmaz vagy (i) egy, a leírásban általánosságban ismertetett immunogén iscomot, vagy (ii) egy, a leírásban általánosságban ismertetett iscom-mátrixot és legalább egy immunogént, egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval és/vagy hígítószerrel együtt. Az ilyen oltóanyag formulázása technikában jártas szakember számára jól ismert. A megfelelõ gyógyászatilag elfogadható hordozók és/vagy hígítószerek közé tartozik minden hagyományos oldószer, diszpergáló közeg, töltõanyag, szilárd hordozó, vizes oldat, bevonat, baktériumellenes és gombaellenes szer, izotóniás és felszívódáskésleltetõ szer és hasonló. Az ilyen közegek és szerek gyógyászatilag aktív anyagokhoz történõ alkalmazása a technikában jól ismert, és például a következõ szakirodalomban található: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. kiadás, Mack Publishing Company, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok. Kivéve, ha bármelyik hagyományos közeg vagy szer inkompatibilis az aktív hatóanyaggal, a találmány szerinti gyógyászati készítményekben történõ alkalmazásuk is a találmány tárgyát képezi. A készítményekbe kiegészítõ aktív hatóanyagok is beépíthetõk. A találmány szerinti iscom vagy iscom-mátrix komplex, amely lényegében egy Quillaja Saponaria Molinából származó frakciót tartalmaz, beadható keverékként vagy külön-külön ugyanazon a beadási helyen vagy különbözõ beadási helyeken keresztül, ugyanakkor vagy eltérõ idõpontokban. A Quillaja Saponaria Molina különbözõ frakciói alkalmazhatók a különféle iscom komplexekben és mátrix komplexekben, és a különféle készítményekben. A találmány tárgyát képezik továbbá legalább két részbõl álló reagenskészletek, amelyekben mindegyik rész egy iscom komplexet vagy iscom-mátrix komplexet tartalmaz úgy, hogy mindegyik komplex egy Quillaja Saponaria Molinából származó szaponin frakciót tartalmaz. A Quillaja Saponaria Molina különbözõ frakciói alkalmazhatók a különféle iscom komplexekben és mátrix komplexekben, és a különféle részekben lévõ különféle készítményekben. A találmány szerinti készítmény vagy részekbõl álló reagenskészlet tartalmazhat még legalább egy olyan egyéb adjuvánst is, amely nem a Quillaja Saponaria Molina valamely frakciója. Az adjuvánsok az iscom és/vagy iscom-mátrix komplexekhez keverhetõk, vagy a komplexekbe beépíthetõk.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
Az iscomba és iscom-mátrixba beépíthetõ ilyen egyéb adjuvánsok lehetnek például bármilyen, a kívánt immunmoduláló hatással rendelkezõ adjuvánsok, akár természetesek, akár szintetikusak, például muramil-dipeptid- (MDP) származékok, így például zsírsavakkal szubsztituált MDP, az MDP treonilanalógjai; DDA, polanionok, így például dextrán-szulfát, és lipopoliszacharidok, például (a Quil A¹tól eltérõ) szaponinok. [„Future prospects for vaccine adjuvants”, Warren, H. S., CRC Crit. Rev. Immunol. 8: 2, 83–101 (1988); „Characterisation of a non-toxic monophosphoryl lipid A”, Johnson, A. G. és munkatársai, Rev. Infect. Dis. 9: 5, 5512–5516 (1987); „Developmental status of synthetic immunomodulators”, Berendt, M. J. és munkatársai, Year Immunol. 193–201 (1985); „Immunopotentiating conjugates”, Stewart-Tull, D. E., Vaccine, 3: 1,40–44 (1985)]. A beadás megkönnyítése és a dózisok egységessége érdekében különösen elõnyös a készítményeket dózisegységként formulázni. A leírás szerinti értelemben a dózisegységforma olyan fizikailag diszkrét egységeket jelent, amelyek egységes dózisként kerülnek kialakításra a kezelendõ humán alanyok számára úgy, hogy mindegyik egység azt az elõre meghatározott mennyiségû aktív hatóanyagot tartalmazza, amely a számítások szerint a kívánt terápiás hatást produkálja, továbbá a szükséges gyógyászati hordozót és/vagy hígítószert. A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi eljárás immunválasz kiváltására vagy indukálására egy egyedben, azzal jellemezve, hogy immunológiailag hatásos mennyiségben beadunk az egyednek egy, a leírásban általánosságban ismertetett oltóanyag-készítményt. Ahogy korábban említettük, az egyed lehet ember vagy más állat, ezen belül haszonállatok (például juh, tehén vagy ló), laboratóriumi tesztállatok (például egér, patkány, nyúl, tengerimalac), házi kedvencek (például kutya vagy macska) vagy vadon élõ állatok. Az immunológiailag hatásos mennyiség azt a mennyiséget jelenti, amely a kívánt immunválasz legalább részleges eléréséhez, vagy az adott kezelt állapot kialakulásának késleltetéséhez, progressziójának gátlásához, vagy kialakulásának vagy progressziójának teljes leállításához szükséges. Ez a mennyiség a kezelendõ egyed egészségi és fizikai állapotától, a kezelendõ egyed rendszertani csoportjától, az egyed immunrendszerének antitesttermelõ kapacitásától, a kívánt védelem fokától, az oltóanyag formulázásától, az orvosi helyzet értékelésétõl és egyéb releváns tényezõktõl függõen változik. A mennyiség várhatóan egy viszonylag széles tartományba esik majd, amelyet rutinkísérletekkel meg lehet határozni. A leírásban és az azt követõ igénypontokban a „tartalmaz” szó, továbbá különféle változatai, így például a „tartalmazza” vagy „tartalmazó” szavak magukban foglalják azt a jelentést, hogy benne van az adott komponens vagy komponenscsoport, de nem jelentik más komponensek vagy komponenscsoportok kizárását, kivéve ha a szövegkörnyezet mást igényel.
1
HU 006 486 T2
A találmányt az alábbi ábrák szemléltetik, amelyek közül: Az 1. ábra az A¹, B¹ és C¹frakció HPLC-vel történõ elõállítását mutatja. A 2. ábra, ahogy a szövegben ismertettük, influenzavírus-micellákkal szembeni, antigénspecifikus antitestválaszokat mutatja, amit ELISA-val (log titer) teszteltünk az IgG1 (A) és IgG2a (B) alosztályokban. A 2. táblázatban, azaz az 1–8. csoportokban ismertetett oltóanyag-formulákkal a 0. és a 4. héten (nõstény NMRI) egereket immunizáltunk. Az egereket a 3. és a 6. héten kivéreztettük. Az antitestes válaszokat a 6. héten gyûjtött vérbõl teszteltük. A 3. ábra a sejtközvetített immunválaszt mutatja, amelyet a 2. ábránál ismertetett immunizálás után 6 héttel gyûjtött lépsejtek IL–5 (A) és IFN¹g (B) citokintermeléseként mértünk in vitro, influenzavírus micellákkal történõ stimulálást követõen, ahogy az a szövegben szerepel. A 4. ábra azt mutatja, hogy a mátrixban nagy dózisban (50 mg) lévõ QHC toxikus, míg a QHA ISCOM-MÁTRIX-ban nem toxikus, ha Balb/C egerekben az antitestes válasz fokozása érdekében OVA-hoz adjuk (lásd a szövegben). Mindkét formula fokozza az OVA-val szembeni antigénspecifikus antitestes válaszokat, amit a második immunizálás után 3 héttel teljes IgG-válaszként (A) és az IgG2a alosztályban (B) ELISA-val mérünk. Az 5. ábra a QHA és QHC-mátrixok szinergisztikus hatásait mutatja, miután Balb/C egerekben az antitestes válaszok fokozása érdekében OVA-hoz adtuk (lásd a szövegben). A QHA és QHC-mátrix dózisa az alábbiak szerint változott: az 1. csoportban nulla A, nulla C; a 2. csoportban 0,3 mg A, nulla C; a 3. csoportban 0,3 mg A+2 mg C; a 4. csoportban 10 mg A, nulla C; az 5. csoportban 10 mg A, 2 mg C. Az OVA dózisa 10 mg volt. Csoportonként 8 egér volt, amelyeket 4 hetes idõközzel szubkután úton kétszer immunizáltunk a megfelelõ formulával. Az antitesttitereket ELISA-val mértük a következõkkel szemben: A. Összes IgG 3 héttel az elsõ immunizálás után B. IgG2a 2 héttel a második immunizálás után C. IgG1 2 héttel a második immunizálás után A 4. és 5. csoport között erõsen szignifikáns (p<0,0001) különbség mutatkozott. A leírásban említett összes hivatkozás a leírás részét képezi. A találmányt most az alábbi, az oltalmi kört nem korlátozó példákkal szemléltetjük.
2
1. példa: Ouillaja Saponaria Molina szubfragmens szaponinok elõállítása Nyers Quillaja Saponaria Molina-kivonat A¹, B¹ és C¹frakcióvá tisztítása. Nyers Quillaja-kéreg kivonat egy vizes oldatát 5 (0,5 g/ml) sep-pak oszlopon (Waters Associates, MA) elõkezeljük. Az elõkezelés során a feltöltött sep-pak oszlopot savas vízben oldott 10%¹os acetonitrillel átmossuk, hogy ezzel eltávolítsuk a hidrofil anyagokat. A lipofil 10 anyagokat, és ezen belül a QH–A¹t, QH–B¹t és QH–C¹t ezután 70%¹os vizes acetonitrillel eluáljuk. A sep-pak oszlopról lejövõ lipofil frakciót ezután félpreparatív HPLC-oszlopon (CT-sil, 10×250 mm, ChromTech, Svédország) választjuk el. A minta oszlopon keresztül 15 történõ elúciójához savas vízben 25–60%¹os acetonitrilgradienst alkalmazunk. Az elválasztás során három frakciót gyûjtünk a HPLC-oszlopról. A három frakció bepárlása utána kapott maradék a QH–A, QH–B és QH–C. A QH–A, QH–B és QH–C elnevezésû frakciókat ez20 után körülbelül 39%, 47%, illetve 49% acetonitrillel eluáljuk. A pontos elúciós profilt és körülményeket az 1. ábra mutatja. 2. példa: Az iscom-mátrix elõállítása Anyagok Koleszterin, például Sigma C 8503 Foszfatidil-kolin (tojáseredetû), például Sigma P 3556 MEGA–10 (Bachem AG, Svájc) Quillaja-szaponin A és C¹frakció (WO9611711 szá30 mú szabadalom) 0,22 mm¹es steril szûrõk (Acrodisc) PBS (10 mM foszfátpuffer 150 mM sóoldatban, pH=6,8–7,4) Slide-A-Lyzer kazetták, molekulatömeg-határ: 35 12–14000 (Pierce) 25
MEGA–10 (törzsoldat) Készítsünk 20 tömeg%¹os törzsoldatot úgy, hogy 40 2,0 g száraz, szilárd MEGA–10-hez 8 ml desztillált vizet adunk, Az oldást óvatos melegítéssel végezzük (30–50 °C). Szûrjük át 0,22 nm¹es steril szûrõn, adagoljuk szét és tároljuk –20 °C¹on. Lipidkeverék (15 mg/ml) Oldjunk fel 100 mg koleszterint és 100 mg foszfatidil-kolint 10 ml 20%¹os MEGA–10-ben. A lipidek 30–60 °C¹on, lassú kevertetés mellett oldódnak fel. Szûrjük át 0,22 nm¹es steril szûrõn, adagoljuk szét és 50 tároljuk –20 °C¹on. Fagyasztás után a lipidkeveréket 40 °C¹ra kell melegíteni, amíg átlátszóvá nem válik. Az összes oldatot temperáljuk 24±1 °C¹on. 45
Szaponin-törzsoldatok (100 mg/ml) 1,0 g Quillaja Saponaria Molina frakció (A vagy C, steril vízben oldva. Az aliquotokat tartsuk –20 °C¹on lefagyasztva.) Szûrjük át 0,22 nm¹es steril szûrõn, adagoljuk szét és tároljuk –20 °C¹on. A különféle iscom-mátrix preparátumokat az 1. táb60 lázatban vázoltak szerint készítjük el. 55
6
1
HU 006 486 T2
A keverékeket az alábbi módon állítjuk elõ. Mérjünk 2 ml PBS¹t egy 50 ml¹es Falcon-csõbe. 1. Adjuk hozzá a lipidkeveréket és alaposan keverjük össze. 2. Adjuk hozzá a szaponint és alaposan keverjük össze. 3. Adjunk hozzá PBS¹t úgy, hogy a végtérfogat 12,0 ml legyen, és alaposan keverjük össze. 4. Inkubáljuk 30 percig.
5
2
5. Töltsük be a Slide-A-Lyzer¹be. 6. Dializáljuk 4×2 liter PBS-sel szemben (24±1 °C) (48–60 óráig). 7. Pipettázzuk ki a Slide-A-Lyzer-bõl és szûrjük át 0,22 nm¹es steril szûrõn. Az iscom-mátrix kialakulását negatív festéses elektronmikroszkópiával ellenõriztük, és HPLC-vel meghatároztuk a quillaja-szaponin kapott koncentrációját.
1. táblázat Elõállítás
Lipidkeverék
Quillaja-szaponin
PBS
Mennyiség (mg)
Térfogat (ml)
Mennyiség (mg)
Térfogat (ml)
Térfogat (ml)
A-mátrix
12
800
48
480
2,0+8,72
C-mátrix
12
800
30
380
2,0+8,90
703-mátrix
12
800
42
420
2,0+8,78
3. példa: PR–8 fehérjemicellák elõállítása 1. Hígítsunk PR–8 monomerekbõl (1,5 mg/ml) 12 mg¹ot PBS-sel úgy, hogy a végkoncentráció 1,0 mg/ml legyen. 2. Szûrjük át 0,22 nm¹es steril szûrõn. 3. Töltsük be a Slide-A-Lyzer¹be. 4. Dializáljuk 4×2 liter PBS-sel szemben (24±1 °C) (48–60 óráig). 5. Pipettázzuk ki a Slide-A-Lyzer-bõl. 4. példa: Immunizálási vizsgálat Ezt a példát azért végeztük el, hogy összehasonlító vizsgálatban megmutassuk, hogy a keverék mátrixrészecskék alkotta iscom-mátrix minimális mértékû mellékhatásokat vált ki. A részecskék egyik halmaza egyetlen szaponinként QHA¹t tartalmaz, a részecskék másik halmaza egyetlen szaponinként QHC¹t tartalmaz, és a 2. példa szerint állítottuk elõ õket. Ennek a formulának az a neve, hogy mátrix „részecskék keverékével”. Az összehasonlítást egy, a WO 96/11711 számú szabadalomban leírtak szerint végezzük, azaz mindegyik részecske QHA¹t és QHC¹t is tartalmaz, például olyan arányban, hogy 70% QHA és 30% QHC. Ennek az a neve, hogy mátrix mindennel egy részecskében.
25
30
35
40
45
Balb/C egereket a 0. és 42. napon mátrix részecskék keverékével típusú iscom-mátrix formulával kevert 1 mg (a 3. példában leírtak szerint elõállított) PR8-micellával immunizáltunk, majd összehasonlítottuk mátrix mindennel egy részecskében típusú iscom-mátrix formulával, vagy 100% QHA¹t vagy a 100% QHC¹t tartalmazó iscom-mátrixszal, ahogy az a 2. táblázatban szerepel. Azokat a csoportokat, amelyekben az egerek több mint 50%¹a elpusztult vagy elfogadhatatlan mellékhatásoktól szenvedett a kezelés miatt, leselejteztük és kizártuk a további vizsgálatokból. Az 1–7. csoportokban az 56. napon, azaz két héttel az emlékeztetõ oltás beadását követõen, minden egértõl szérummintákat vettünk. A szérumokat az IgG1 (A) és az IgG2a (B) alosztályba tartozó antigénspecifikus antitestekkel szûrtük. Az ábrán a 8. csoport a beoltatlan egereket jelenti. Az eredményeket a 2. ábrán mutatjuk be. A második véreztetés után csoportonként két egérbõl kivettük a lépet (2., 4., 5., 6. és 7. csoport). A lépsejteket ezután in vitro PR8-micellákkal stimuláltuk, majd mértük az IL–5 (A) és az IFN¹g (B) antigénspecifikus indukcióját. Az ábrán a 8. csoport a beoltatlan egereket jelenti. Az eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be.
2. táblázat Balb/C egereket a 0. és 42. napon a mátrix részecskék keverékével típusú iscom-mátrix formulával (1., 2. és 3. MlXcsoport) immunizáltunk, majd összehasonlítottuk a mátrix mindennel egy részecskében típusú iscom-mátrixszal (7., 8., 9., 10. és 11. CONV-csoport), vagy 100% QHA¹t (4. és 5. csoport) vagy 100% QHC¹t tartalmazó (6. és 12. csoport) iscom-mátrixszal. A csoport száma
Mennyiség (mg)
A:C (arány)
MIX/CONV
Az egerek száma
Elpusztultak száma/összes
1.
50
80:20
MIX
8
2/8
2.
50
92:8
MIX
8
0/8
3.
50
96:4
MIX
8
0/8
7
1
HU 006 486 T2
2
2. táblázat (folytatás) A csoport száma
Mennyiség (mg)
A:C (arány)
4.
50
5.
10
6.
MIX/CONV
Az egerek száma
Elpusztultak száma/összes
100% A
8
0/8
100% A
8
0/8
10
100% C
8
0/8
7.
10
70:30
CONV
8
0/8
8.
50
80:20
CONV
8
8/8
9.
50
92:8
CONV
8
6/8
10.
50
96:4
CONV
8
5/8
11.
50
70:30
CONV
8
8/8
12.
50
100% C
8
8/8
Elpusztultak száma: Azoknak az egereknek a száma, amelyek a beadást követõ 24 órában elaltatásra kerültek vagy elpusztultak. A:C arány: (tömeg szerint) a quillaja A és C¹szaponinfrakciójának aránya.
Eredmények Azok az egerek, amelyeket adjuvánsként nagy dózisban (50 mg) 80% QHA¹t és 20%, azaz 10 mg QHC¹t tartalmazó iscom-mátrixszal kiegészített PR8-micellákkal immunizáltunk, 1¹2 napon belül elpusztultak. Hasonló módon 2 napon belül elpusztultak azok az egerek, amelyeket 50 mg, 100%-ban QHC¹t tartalmazó formulával immunizáltunk. Ezzel ellentétben megfigyelhetõ káros reakciók nélkül éltek túl azok az egerek, amelyeket 50 mg, 100%-ban QHA¹t tartalmazó formulával immunizáltunk. Vagyis a QHC alsó dózisa már elég volt ahhoz, hogy megölje az egereket, ha ugyanabba a mátrixrészecskébe építettük be, mint a QHA¹t (CONVcsoport a 2. táblázatban). Még akkor is, ha egy CONVmátrixban csak 4 mg (8%) QHC¹t kombináltunk 46 mg (92%) QHA-val, 8 egér közül 6 elpusztult (9. csoport a 2. táblázatban). Még 2 mg (4%) QHC is elpusztította az egereket, amikor CONV-mátrixban QHA-val kombináltuk (10. csoport a 2. táblázatban). A 6. csoportban (2. táblázat) lévõ egerek 10 mg QHC¹t kaptak, ami a mátrixban 100%-nak felelt meg (nulla QHA), és minden egér túlélt. Az egerek tehát érzékenyebbek voltak a QHC¹re, amikor ugyanabban a CONV-mátrix részecskében kombináltuk a QHA-val (8., 9. és 10. csoport). Azok az egerek, amelyek alacsony dózisban kapták a mátrixot, azaz 10 mg összes szaponinból 70% QHAval és 30% QHC-vel, mind túléltek. Az egerek ebben az esetben 3 mg QHC¹t kaptak. A különféle mátrixrészecskéket, azaz részecskék valamely, a QHA és QHC egy-egy halmazát is magában foglaló keverékét (MIX) tartalmazó formulával, mint adjuvánssal kiegészített PR8-micellákkal immunizált egerek jóval nagyobb dózisú mátrixformula beadását is túlélték, mint a CONV-csoportban. A 92% QHA¹t (46 mg) és 8% QHC¹t (4 mg) tartalmazó formulával [a 2. táblázat 2. csoportja (92:8)] vagy a 2 mg QHC¹t tartalmazó 96:4 formulával (a 2. táblázat 3. csoportja) injekciózott egerek mind túléltek. Ezt az eredményt összehasonlítjuk a CONVmátrixban alkalmazott megfelelõ mennyiségû QHA-val és QHC-vel kapott eredményekkel (9. és 10. csoport a 2. táblázatban), amelyek nagyfokú elhalálozást okoztak.
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
A QHC és a QHA fizikai elkülönítésével és különbözõ mátrixrészecskékben történõ elosztásával tehát elkerülhetõ a mortalitás és toxikusság. Az antitestes válasz fokozása Az eredményeket a 2. ábrán mutatjuk be. IgG alosztályok szerint bontott antigénspecifikus válasz. A 2. táblázatban ismertetett oltóanyag-formulákkal a 0. és a 4. héten (nõstény NMR1) egereket immunizáltunk. Az egereket a 3. és a 6. héten kivéreztettük. A 6. héten mért IgG1-választ (10 log Elisa titer) az A, az IgG2-válasznak megfelelõt a B panel mutatja. Fontos eredménye ennek a kísérletnek, hogy az antitestes válaszok mérése alapján megmarad vagy fokozódik az immunválasz-fokozó kapacitás amikor a QHA¹t és QHC¹t részecskék különbözõ halmazaiban különítjük el, ahogy az a 2. ábrán látható. A 2. ábrán látható, hogy a részecskék keveréke (MIX) ugyanarra a szintre fokozza a PR8-micellák elleni IgG1 antitestet (2A. ábra), mint ha a QHA és QHC azonos dózisát azonos arányokban ugyanabba a részecskébe, azaz CONV-részecskékbe építjük be. Az IgG2a antitestek esetében azonban a MlX-formula magasabb szintre fokozta az antitestválaszt (2B. ábra). A 2. és 3. csoportot (MIX) a következõkkel hasonlítjuk össze: 9. és 10. (CONV) csoport, QHA és QHC-mátrix, 100% kis dózisú QHC¹t tartalmazó mátrix (6. csoport) és 100% nagy dózisú QHA¹t tartalmazó mátrix (4. csoport, 2. táblázat). A 7. csoportban lévõ egerek, amelyek 10 mg¹os alacsony – azaz az egerek számára elfogadható – dózisban kapták az injekciót (CONV 70:30), erõteljes IgG1-választ mutattak (2A. ábra), de alacsony IgG2a-választ (2B. ábra). A mátrixrészecskék keverékét tartalmazó, találmány szerinti mátrixformula nagy dózisban is adható a mellékhatások elkerülése mellett, és fokozhatja a CONV-mátrixnál magasabb szintekre adott antitestes választ. Különösen az IgG2a-válasz fokozódik. Például különösen fontos az IgG2a-válasz az intracelluláris parazitákkal, például vírusokkal szembeni védekezésben.
1
HU 006 486 T2
Az sejtközvetített antitestes válasz fokozása A tolerált dózisokban a CONV-mátrix formulák kevésbé képesek a sejtközvetített immunitás fokozására, mint a MlX-formulák (3A. és 3B. ábra). A MlX-formula (92:8, 2. csoport) jelentõsen jobban fokozza az IL–5szinteket, mint a CONV-formula (70:30, 7. csoport), a QHA-QHC formula, vagy a 100% QHC-mátrix formula (6. csoport). A MlX-formula (92:8, 9. csoport) az IFN-gszinteket is jelentõsen jobban fokozza, mint a 100% QHC-mátrix formula (6. csoport) vagy a CONV-formula (70:30, 7. csoport). Említésre érdemes, hogy a QHA erõteljes kapacitással rendelkezik az IL–5- és IFN-g-termeléssel mért sejtközvetített immunválaszok fokozására, de alacsony a kapacitása az antitestes válasz fokozására. A találmány végeredményben egy olyan koncepciót határoz meg az iscom és iscom-mátrix formulákhoz, amely csökkenti a toxikusságot és a mellékhatásokat, és ez lehetõvé teszi az aktív adjuvánsmolekula erõteljes dózisokban való alkalmazását anélkül, hogy elvesztenénk az immunválasz-fokozó kapacitást. Ezenfelül, bár az alacsony, de elfogadható dózisú QHC-mátrix formulának jó képessége van IgG1-válasz fokozására, a fontos IgG2a-válasz tekintetében ez a képesség gyengébb. A QHC-mátrix sejtközvetített immunválaszt indukáló képessége is aránylag csekély a találmány szerinti megoldáshoz képest. A QHA-mátrix erõteljesen fokozza a sejtközvetített immunitást, de a találmány szerinti megoldásnál kevésbé fokozza az antitestközvetített immunitást. Az IgG2 antitestes válasz és a sejtközvetített válaszok mérése alapján a kevert mátrix-részecskés találmány szerinti megoldás jobb, mint a QHA¹t és QHC¹t azonos részecskékben tartalmazó mátrixformulák (CONV). A találmány szerinti új megoldás a teljes immunválaszt fokozza és ezért jobb, mint a korábban ismertetett mátrixformulák, amelyeket ez a 4. példa mutat. 5. példa Ebben a kísérletben hangsúlyozzuk, hogy a QHA jól tolerálható és erõteljes immunfokozó és immunmoduláló kapacitással rendelkezik. Azért használjuk az ovalbumint (OVA), mert gyenge antigén, és mint ilyen, nem indukál Th1 típusú választ. A QHA¹t a QHC-hez hasonlítjuk, mivel ez utóbbit humán klinikai vizsgálatban értékelik. Anyagok és módszerek A Quillaja Saponaria Molina szubfragmensek elõállítását az 1. példa ismerteti. A Iscom-mátrix elõállítását a 2. példa ismerteti. A kísérlet felépítése Az 1. csoportban 8 egér volt, amelyeket szubkután úton (sc.), 4 hetes idõközzel, 10 mg OVA-val kiegészített 50 mg QHA-val kétszer immunizáltunk. A 2. csoportban ugyanannyi egér volt, amelyeket azonos eljárással immunizáltunk, de itt 50 mg QHC volt az adjuváns.
2
A bemutatott antitestes válaszok az emlékeztetõ oltás után 2. héttel gyûjtött szérumból származnak. Antitestmeghatározás A specifikus OVA szérum antitestes válaszokat a teljes IgG-válasz és az IgG2a alosztály esetében is ELISA-val határoztuk meg, ahogy az a 4. példában szerepel, standard eljárás alkalmazásával, amelynek során az ELISA-lemezeket tesztantigénként 10 mg/ml 10 OVA-val fedtük. 5
15
20
25
30
35
40
45
Eredmények Az OVA-val kiegészített QHA-mátrixszal immunizált egerek közül mindegyik túlélt, és nem jelentkeztek náluk kellemetlenségre utaló jelek. Az OVA-val kiegészített QHC-mátrixszal immunizált 8 egér közül 4, azaz 50% elpusztult. A teljes antitestes válasz tekintetében nincs szignifikáns különbség a csoportok között (4A. ábra), de az ELISA-titerek nagyobb mértékben változtak az 1. csoportban lévõ állatok, azaz a QHA-val immunizált egerek körében. Az IgG2a alosztály esetében a közepes titerek tekintetében nem volt különbség az 1. és 2. csoport között, kivéve, hogy az ELISA-titerek nagyobb mértékben változtak a 2. csoportban lévõ egyes állatok, azaz a QHC-vel immunizált egerek körében (4B. ábra). Az ehhez a példához tartozó második kísérletben azt tártuk fel, hogy hasznos lehet¹e a QHA-mátrixot más adjuvánsokkal kiegészíteni. A QHA-mátrix és QHC-mátrix dózisa az alábbiak szerint változott: az 1. csoportban nulla A, nulla C; a 2. csoportban 0,3 mg A, nulla C; a 3. csoportban 0,3 mg A+2 mg C; a 4. csoportban 10 mg A, nulla C; az 5. csoportban 10 mg A, 2 mg C. Az OVA dózisa 10 mg volt. Csoportonként 8 egér volt, amelyeket 4 hetes idõközzel szubkután úton kétszer immunizáltunk a megfelelõ formulával. (5A., 5B. és 5C. ábra). A szérumokat az elsõ immunizálás után 3 héttel és az emlékeztetõ oltás után 2 héttel gyûjtöttük. A specifikus OVA-szérum antitestes válaszokat a teljes IgG-válasz és az IgG2a és IgG1 alosztályok esetében is a szakirodalom szerint ELISA-val határoztuk meg [Johansson, M. és Lövgren-Bengtsson, „Iscoms with different quillaja saponin components differ in their immunomodulating activities”. Vaccine 19, 2894–2900 (1999)].
Eredmények Az elsõ immunizálás után semmilyen antitestes vá50 laszt nem detektáltunk az adjuváns nélküli OVA¹t vagy az adjuvánsként 0,3 mg QHA-mátrixot és 0 vagy 2 mg QHC-mátrixot tartalmazó OVA¹t kapó egerekben. (5A. ábra) A második immunizálás után az adjuvánst nem tar55 talmazó OVA-val immunizált 8 egér közül 3¹ban alacsony választ detektáltunk az IgG1 alosztályban, az IgG2a alosztályban pedig semmilyen választ nem láttunk. A QHA-mátrix, mint adjuváns, legalacsonyabb dózisával (azaz 0,3 mg QHA és 0 vagy 2 mg QHC-mát60 rix) sem láttunk antitestes választ. Egyértelmûen foko9
1
HU 006 486 T2
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
zódott az antitestes válasz az IgG2a alosztályban akkor, ha a 2 mg¹os alacsony dózisban QHC¹t adtunk a 10 mg QHA-hoz (5B. ábra). Következtetések Ha ISCOMATRIX¹ba építjük, a QHA-MÁTRIX nagyon kismértékben toxikus, de még mindig erõteljes moduláló hatással rendelkezik, amit az is mutat, hogy az adjuváns nélküli vagy nagyon kevés adjuvánst tartalmazó OVA-val szemben – amely csak az IgG1 alosztályban váltott ki antitestes választ – erõteljes TH1 típusú választ vált ki. Az is látszik, hogy a QHAmátrix szinergizál az alacsony dózisú QHC-mátrixszal. Ezek az eredmények azért fontosak, mert egyszerû módon lehetõvé teszik az adjuvánshatás optimalizálását és a mellékhatások minimalizálását. Ahogy azt egy olyan gyenge és erõteljes adjuvánst igénylõ antigén, mint az OVA esetében kimutattuk. Hivatkozások Bomford, R., Stapleton, M., Winsor, S., Beesley, J. E., Jessup, E. A., Price, K. R. and Fenwick, G. R. (1992). Adjuvanticity and iscom formation by structurally diverse saponins. Vaccine 10, 572–577. Cox, J. C. and Coulter, A. R. (1992), „Advances in Adjuvant Technology and Application”, in Animal Parasite Control Utilising Biotechnology, Chapter 4, Ed. Yong, W.K. CRC Press. Dalsgaard, K. (1974), Arch. Gesamte Virusforsch, 44, 243. Dalsgaard, K. (1978). A study on the isolation and characterisation of the saponin Quillaja Saponaria Molina. Evaluation of its adjuvant activity with special reference to the application in foot-and-mouth disease. Acta Vet. Scand. 69 (Suppl.), 1–40. Espinet, R. G. (1951). Nuevo tipo de vacuna antiafosa a complejo glucovirico. Gac. Vet. 74, 1–13. Johansson, M., Lövgren-Bengtsson, K. (1999) Iscoms with different quillaja saponin components differ in their immunomodulating activities. Vaccine. 17, 2894–2900. Kensil, C. A., et al. (1988), International Patent Application No. PCT1US88101842. Kensil, C. A. et al. (1991), J. Immunol., 146,431. Kersten, G. F. A. et al. (1990). „Aspects of Iscoms. Analytical, Pharmaceutical and Adjuvant Properties; Thesis, University of Utrecht”. Lövgren, K. and Morein, B. (1988). The requirement of lipids for the formation of immunostimulating complexes (iscoms). Biotechnol. Appl. Biochem. 10, 161–172. Ma, J., Bulger, P. A., Davis, D. R., Perilli-Palmer, P., Bedore, D. A., Kensil, C. R., Young, E. M., Hung, C. H., Seals, J. R. and Pavia, C. S. (1994). Impact of the saponin adjuvant QS¹21 and alumínium hydroxide on the immunogenicity of recombinant OspA and OspB of Borrelia burgdorferi. Vaccine 12, 925–932. Ramon, G. (1926). Procédés pour accroitre la production des antitoxines. Ann. Inst. Pasteur, Paris 40, 1–10.
2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 10
1. Készítmény, amely legalább két különbözõ iscom komplexet tartalmaz, és minden különbözõ komplex egyetlen, Quillaja Saponaria Molinából származó szaponinfrakciót tartalmaz, ahol az egyik komplexben lévõ szaponinfrakció különbözik a másik komplexben lévõ szaponinfrakciótól, és amely immunmoduláló aktivitású, fokozott adjuváns aktivitású és csökkentett toxicitású. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben az iscom részecskék iscom komplexek. 3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben az iscom részecskék iscom-mátrix komplexek. 4. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben az iscom részecskék iscom komplexek és iscom-mátrix komplexek. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely tartalmaz legalább egy olyan, egyéb adjuvánst is, amely nem a Quillaja Saponaria Molina egy szaponinfrakciója. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amelyben a Quillaja Saponaria Molinából származó szaponinfrakció a következõk közül választott: Quillaja Saponaria Molina A¹frakciója, B¹frakciója C¹frakciója, spikozid, Q VAC és QA 1–22. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amelyben a Quillaja Saponaria Molinából származó szaponinfrakció a Quillaja Saponaria Molina A¹frakciója, a Quillaja Saponaria Molina B¹frakciója és a Quillaja Saponaria Molina C¹frakciója közül választott. 8. A 7. igénypont szerinti készítmény, amely 5–95 tömeg%-ban a Quillaja Saponaria Molina A¹frakcióját tartalmazza, a 100 tömeg% fennmaradó része pedig a Quillaja Saponaria Molina C¹frakciója, az A¹frakció és a C¹frakció tömege alapján számítva. 9. A 7. igénypont szerinti készítmény, amely 90–99 tömeg%-ban a Quillaja Saponaria Molina A¹frakcióját, 1–10 tömeg%-ban pedig a Quillaja Saponaria Molina C¹frakcióját tartalmazza, az A¹frakció és a C¹frakció tömege alapján számítva. 10. A 7. igénypont szerinti készítmény, amely 50–70 tömeg%-ban a Quillaja Saponaria Molina A¹frakcióját, 30–50 tömeg%-ban pedig a Quillaja Saponaria Molina C¹frakcióját tartalmazza, az A¹frakció és a C¹frakció tömege alapján számítva. 11. A 7. igénypont szerinti készítmény, amely 30–50 tömeg%-ban a Quillaja Saponaria Molina A¹frakcióját, 50–70 tömeg%-ban pedig a Quillaja Saponaria Molina C¹frakcióját tartalmazza, az A¹frakció és a C¹frakció tömege alapján számítva. 12. A 6. igénypont szerinti készítmény, amelyben a Quillaja Saponaria Molinából származó szaponinfrakció a Quil 1–21 közül választott. 13. Az 1–12. igénypontok bármelyike szerinti, a Quillaja Saponaria Molina legalább két tisztított és meghatározott szaponinfrakcióját külön iscom részecskékben tartalmazó, immunmoduláló aktivitású, fokozott adjuváns aktivitású és csökkentett toxicitású készít-
1
HU 006 486 T2
mény alkalmazása immunmoduláló gyógyászati termék elõállítására. 14. Az 1–12. igénypontok bármelyike szerinti, a Quillaja Saponaria Molina legalább két tisztított és meghatározott szaponinfrakcióját külön iscom részecskékben tartalmazó, immunmoduláló aktivitású, fokozott adjuváns aktivitású és csökkentett toxicitású készítmény alkalmazása oltóanyag elõállítására. 15. Az 1–12. igénypontok bármelyike szerinti, a Quillaja Saponaria Molina legalább két tisztított és meghatározott szaponinfrakcióját külön iscom-részecskékben tartalmazó, immunmoduláló aktivitású, fokozott
2
adjuváns aktivitású és csökkentett toxicitású készítmény alkalmazása adjuváns elõállítására. 16. Részekbõl álló reagenskészlet, amely legalább két részt tartalmaz, ahol mindegyik rész különbözõ is5 com komplexet tartalmaz és minden különbözõ komplex egyetlen Quillaja Saponaria Molinából származó szaponinfrakciót tartalmaz, ahol az egyik komplexben lévõ szaponinfrakció különbözik a másik komplexben lévõ szaponinfrakciótól, és amely reagenskész10 let tartalmaz egy immunmoduláló aktivitású, fokozott adjuváns aktivitású és csökkentett toxicitású készítményt.
11
HU 006 486 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
12
HU 006 486 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
13
HU 006 486 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
14
HU 006 486 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
15
HU 006 486 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
16
HU 006 486 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
17
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
