!HU000007993T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 993
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C12N 5/16
(21) Magyar ügyszám: E 05 764208 (22) A bejelentés napja: 2005. 07. 21. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050764208 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1771468 A1 2006. 02. 02. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1771468 B1 2010. 01. 20.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 04017907 2004. 07. 29.
(73) Jogosult: Dompe’ S.P.A., 67100 L’Aquila (IT)
EP
(72) Feltalálók: GIANNI, Alessandro, M., I-20133 Milano (IT); CARLO-STELLA, Carmelo, I-20133 Milano (IT); COLOTTA, Francesco, I-20122 Milano (IT) (54)
(2006.01) C07K 14/705 (2006.01) C12N 15/28 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06010558 PCT/EP 05/007957
(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Tumornekrózisfaktor-rokon apoptózist indukáló ligand (TRAIL) termeltetésére manipulált, tumorra homingoló sejtek
(57) Kivonat
HU 007 993 T2
A találmány tárgyát tumornekrózisfaktor-rokon apoptózisindukáló liganddal (TRAIL) transzdukált CD34+ hae-
matopoetikus sejtek és alkalmazásuk képezi, tumorok kezelésére.
A leírás terjedelme 12 oldal (ezen belül 3 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 993 T2
A találmány leírása A találmány mûszaki területe A jelen találmány tumornekrózisfaktor-rokon apoptózist indukáló ligandot (TRAIL) expresszáló, tumorra homingoló sejtekkel és ezek tumorellenes terápiában történõ alkalmazásával kapcsolatos. A találmány mûszaki háttere A hibásan szabályozott apoptózismechanizmusok alapvetõ szerepet játszanak a limfoproliferatív betegségek patogenezisében és progressziójában, lehetõvé téve a neoplasztikus sejtek túlélését normális élettartamukon túl, végül kémiai és sugárrezisztenciájukhoz vezetve [1]. Ennek megfelelõen az apoptotikus szabályozóutak vonzó terápiás célpontokat jelentenek a rosszindulatú sejtek apoptózisérzékenységének helyreállítása, vagy az apoptózisagonistáinak aktiválása céljából [2]. Az apoptotikus gének és fehérjék befolyásolása érdekében számos stratégiát dolgoztak ki, melyek az apoptózis belsõ (Bcl-2, Bcl¹XL), külsõ (DR4, DR5, FLIP), vagy konvergens (cIAP2) útvonalait célozzák [3]. A tumornekrózisfaktor-rokon, apoptózist indukáló ligand (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL) a sejthalált okozó úgynevezett halálligandokon belül a TNF-családba tartozik [4]. A TRAIL¹t kódoló izolált DNS-szekvenciák, ezen DNS-szekvenciákat tartalmazó vektorok és rekombináns TRAIL-polipeptidek a WO 97/01633-ban kerültek nyilvánosságra. A TRAIL a 4. számú halálreceptorhoz (death receptor, DR4) és az 5. számú halálreceptorhoz (DR5) kapcsolódik, melyek számos rákos sejt felszínén expresszálódnak [5]. Az oldott TRAIL kapcsolódása a DR4-hez vagy DR5-höz kaszpázaktivációhoz és apoptózishoz vezet [6]. Liu Zhongyu és munkatársai (J. Clin. Invest. 112. kötet, 9. szám, 2003.9.11, 1332–1341. oldal) hoztak nyilvánosságra rekombináns adenovírus segítségével TRIAL-transzdukált dendritikus sejteket és ezek potenciális orvosi alkalmazásait ízületi gyulladás kezelésére. Nem említik ezen sejtek lehetséges alkalmazását tumorok kezelésében. In vitro és in vivo tanulmányok szerint magas fokú ráksejtspecificitása és komoly tumorellenes aktivitása miatt a szolubilis rekombináns TRAIL szerepet játszhat a rákellenes terápiában [7]. Valóban, a TRAIL szelektíven indukál apoptózist számos transzformált sejtben, miközben az egészséges sejteket megkíméli [4]. Emellett egerekben a TRAIL beadása figyelemre méltó hatékonyságot mutat vastagbél-karcinóma [8, 9], emlõkarcinóma [10], mieloma multiplex [11] vagy glióma [12, 13] tumorxenograftok ellen. Egérben és nem emberi fõemlõsökben végzett toxicitási tanulmányok megmutatták, hogy egészséges hepatociták és keratinociták rezisztensek a TRAIL trimerizált változatával szemben [14, 15], míg jelentõs érzékenységet mutatnak a nem optimalizált TRAIL-készítmények vagy a ligandum ellenanyaggal keresztkötött változatainak apoptózisindukáló hatásával szemben
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
[16]. Hogy a májtoxicitás lényeges problémát jelent¹e a TRAIL trimerizált változata nagy dózisainak alkalmazásakor, ellentmondásos marad. A szolubilis TRAIL alkalmazásának egy további korlátját a hiányos apoptotikus válasz jelenti, melyet lényeges számú, változatos tumorsejtvonalon figyeltek meg, melyek vagy hosszú inkubációs idõt, vagy a szolubilis TRAIL nagyon magas dózisát igénylik, hogy az apoptózis bekövetkezzen [17, 18]. Intravénás injekciót követõen a TRAIL farmakokinetikai profilját figyelembe véve (plazma-féléletidõ 32 perc, eliminációs féléletidõ 4,8 óra), a hosszú behatási idõ és a magas koncentráció körülményei nem vihetõk át semmilyen in vivo kezelési stratégiába [10]. A szolubilis rekombináns TRAIL-lel kapcsolatos korlátok kiküszöbölésére és a tumorsejtek specifikus célba vételére számos adenovírusközvetített géntranszfer-megközelítés áll kipróbálás alatt különféle állatkísérletes modellekben [19, 20]. Másfelõl a géntranszfer-megközelítések hatásossága nagyrészt a tumor hatékony fertõzésén és az immunológiai elimináló mechanizmusok kiküszöbölésén múlik [21]. Emellett az adenovírusvektorok szisztémás injektálásával kapcsolatos számos biztonsági megfontolás még megválaszolásra vár [22]. Példának okáért a TRAIL adenovirális transzfere kiküszöböli a hepatómasejtek csökkent apoptotikus válaszkészségét, de súlyos apoptózist okoz az elsõdleges emberi májsejtekben [19]. Jelenleg az adenovírusalapú génterápiás megközelítések fõként a TRAIL-kódoló adenovírusok tumoron belüli célba juttatásán alapulnak [23]. A helyi tumorellenes aktivitás ellenére a TRAIL tumoron belüli célba juttatása nem mutat szisztémás tumorellenes aktivitást, így nincs semmilyen klinikai értéke. Ismeretes, hogy különféle sejttípusok elõnyben részesítik a tumorokba történõ homingot [24] és feltölthetõk olyan konstrukciókkal, melyek tumorellenes molekulák termeléséhez szükségesek. Homingjellemzõik miatt a CD34+ sejtek [25] és a természetes ölõsejtek (natural killer, NK) [26] alkalmazhatók a tumorellenes molekulák célbajuttató eszközeiként. Intravénás infúziót követõen a CD34+ sejtek sajátos homingtulajdonságokat mutatnak, beleértve azt a képességet, hogy állandó jelleggel megszállják a májat és a lépet [27–30]. Ezen homingtulajdonságok szorosan kötõdnek az adhéziós receptorok (például CXCR–4, VLA–4, VLA–5, CD44 stb.) expressziójához, mely receptorok specifikus ligandokkal (például SDF–1, VCAM–1 stb.) lépnek kölcsönhatásba, mely ligandok a csontvelõ mikrokörnyezetében a sztrómasejteken, és a tumorok mikrokörnyezetében expresszálódnak [31–34]. Az NK sejtek a limfociták egy alcsoportja, melyek a tumorsejtek elleni sejtalapú immunvédelemben alapvetõ szerepet játszanak a fõ hisztokompatibilitási komplex által nem korlátozott mechanizmusok útján [35]. Intravénás infúziót követõen az NK¹sejtek a csontvelõbe és a nyirokszervekbe vándorolnak, és a tumorok közelében a megfelelõ citokinszignálok hatása alatt kilépnek a vérerekbõl. Számos munkacsoport próbál-
1
HU 007 993 T2
kozott az NK¹sejtek alkalmazásával, a homingtumorok felé irányításával terápiás célokkal [36–38]. Bár az NK¹sejtek tumor-homing tulajdonságai ismertek, a genetikailag módosított sejtek stresszhatást szenvednek, ami a transzdukált gén fajtájától függ. Ezen stressz következményeképpen a sejtek elveszthetik eredeti tumor-homing tulajdonságaikat, ha a TRIAL génnel traszdukcióra kerülnek. Ennek megfelelõen a siker nem szükségszerû, és valós kísérleti vizsgálatok szükségesek annak eldöntésére, hogy az adott megközelítés életképes¹e vagy sem. A jelen vizsgálatokban azt találtuk, hogy a TRAIL expressziójára átalakított CD34+ sejtek elõnyösen alkalmazhatók in vivo sejtközvetített tumorellenes aktivitás elérésére. A találmány leírása A jelen találmány szerint CD34+ tumor-homingot mutató sejtek kerülnek átalakításra adenovírusközvetített géntranszfer útján, tumornekrózisfaktor-rokon apoptózist indukáló ligand (TRAIL) termelése céljából. A jelen találmány szerinti sejtek szisztémás beadásra kerülnek a TRAIL-nek a tumor helyére történõ célba juttatása céljából, a fent említett hátrányok okozása nélkül. Ennek megfelelõen a jelen találmány TRAIL¹t expresszáló, tumor-homingot mutató sejtekkel és ezeket tartalmazó sejtes készítményekkel kapcsolatos. A találmány továbbá ezen sejteknek tumorellenes terápiára, különösen az emberi limfóma terápiájára szolgáló sejtes készítmények elõállítására való alkalmazásával kapcsolatos. A találmány szerinti sejteket tumor-homingot mutató sejteknek az emberi TRAIL gént valamely alkalmas promoter, például a CMV promoter kontrollja alatt kódoló, replikációra nem képes adenovírussal (AdTRAIL) történõ transzdukciójával lehet elõállítani. A transzdukciót a molekuláris biológusok által jól ismert eljárásokkal, elõnyösen a példákban ismertetett eljárással lehet végrehajtani. A „tumor-homingot mutató” sejtek kifejezés a jelen találmány vonatkozásában olyan sejteket jelöl, melyek képesek (1) intravénás injekciót követõen a tumorszövetbe vándorolni (homing), és (2) alkalmas mennyiségû membránkötött TRAIL¹t (mTRAIL) expresszálni legalább néhány napig. A jelen találmány szerinti tumor-homingot mutató sejtek növekedési faktorral kezelt tumoros betegek perifériás vérébõl származó, mTRAIL expressziója céljából átalakított CD34+ haematopoetikus sejtek. Az mTRAIL alkalmas expressziójának biztosítására számos eljárás lehet alkalmas, beleértve az alkalmas szabályozó genetikai elemekkel, így szövetspecifikus promoterekkel és/vagy erõsítõkkel (enhancer) ellátott plazmidok és virális vektorok alkalmazását. A CD34+ sejtek optimális transzdukciós hatásfokának elérésére a sejteket az Ad¹TRAIL 50 és 500 relatív infekciós egységnyi (multiplicity of infection=MOI, a fertõzõ ágens és a célsejt aránya) mennyiségének lehet kitenni szérummentes körülmények között 37 °C¹on.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
Ezután szérummal ellátott tápközeg (RPMI–1640/FBS 20%) kerül hozzáadásra, és néhány órával késõbb a tenyészeteket Gene Boosterrel (1:200) egészítjük ki, majd 18 óra hosszat tovább inkubáljuk. A találmány szerinti készítményeket parenterális, különösen intravénás beadásra alkalmas hordozók alkalmazásával lehet elõállítani, így a REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N. J. 1991) kiadványban ismertetett hordozók alkalmazásával. Példának okáért az alkalmazható segédanyagok közé tartozik bármely farmakológiai hatóanyag, mely nem káros a készítményt kapó egyénre, így a víz, sóoldat, glicerin és etanol, választható módon keverve járulékos anyagokkal, mint nedvesítõ- vagy emulzifikálóágensekkel, pufferekkel és hasonlókkal. Az alkalmas dózisok függenek többek közt a kezelni kívánt egyén nemétõl, korától és állapotától, a betegség súlyosságától. Az alkalmas hatásos mennyiség könnyen meghatározható bármely gyakorlott szakember és klinikai kísérletek által. A terápiásan hatékony dózis általában 103 és 1015 transzdukált sejt között lesz. Természetesen más dózisokat is meg lehet állapítani hagyományos kísérletekkel, vagyis a dózis-hatás görbék elemzésével, a maximális elviselhetõ dózis (maximal tolerable dose, MTD) meghatározásával, korlátozott számú betegen, I. fázisú klinikai kísérletben. A dozírozás lehet egyetlen dózisú vagy többszörös dózisú séma. Továbbá az alanynak annyi dózist lehet beadni, amennyi szükséges. A jártas szakember könnyen meghatározza a leghatékonyabb adagolási sémát. A találmány most nagyobb részletességgel kerül illusztrálásra a következõ példák segítségével, világos és meggyõzõ bizonyítékot szolgáltatva arra, hogy: (i) CD34+ õssejteket in vitro hatékonyan lehet transzdukálni TRAIL¹t expresszáló adenovektorral; (ii) transzdukció után ezen sejttípusok átmenetileg expresszálják a TRAIL¹t a sejtfelszínükön; (iii) a TRAIL expresszió ilyen rövid idõtartama is potens apoptotikus hatással jár a transzdukált sejtekkel együtt tenyésztett TRAIL-érzékeny és TRAIL-rezisztens tumorsejtekben; (iv) a transzdukált sejtek in vivo injekciója korai vagy elõrehaladott stádiumú tumort hordozó NOD/SCID egerekbe ez egerek túlélésének jelentõs meghosszabbodásával jár, ami arra utal, hogy a transzdukált CD34+ sejtek hatékonyan szolgálnak hordozóként a TRAIL szisztémás, terápiás célú célba juttatásához. Az intravénás beadás hatékonysága egyértelmû elõnyt jelent az összehasonlítható, tumoron belüli célba juttatási eljárásokhoz képest. Míg az mTRAIL¹t expresszáló emberi sejtek in vitro tumorellenes hatásának mechanizmusa a legvalószínûbb módon az mTRAIL és a tumorsejteken jelen lévõ receptorai közötti közvetlen kölcsönhatás által kiváltott apoptózis, nem tudjuk, mi az in vivo tumorellenes aktivitásuk alapja. A tumorsejtek közvetlen elpusztítása lehetséges módon indirekt növekedésgátló hatással is kapcsolódhat, ami a tumorban található, TRAIL recep-
1
HU 007 993 T2
torokat expresszáló nem tumoros sejtek apoptózisából adódhat (a tumorfejlõdésben és a tumorsejtek túlélésében kritikus szerepet játszó vaszkuláris, perivaszkuláris, intersticiális és más sejttípusokban). Az in vivo megfigyelhetõ tumorellenes aktivitás mechanizmusának jobb megértését szolgáló kísérletek folyamatban vannak, még ha természetesen a találmány nem is korlátozódik a megfigyelt aktivitások valós mechanizmusaira vonatkozó bármely hipotézisre. 1. példa – Apoptózis kiváltása in vitro, adenovírusközvetített géntranszfert követõen TRAIL¹t expresszáló CD34+ sejtekkel együtt tenyésztett limfómasejtvonalakban Limfómasejtvonalak adenovírusközvetített géntranszfert követõen TRAIL¹t expresszáló CD34+ sejtekkel együtt történõ tenyésztésének hatásait értékeltük. A kezdeti in vitro kísérletekben egy TRAIL¹t expresszáló adenovírusvektort (Ad-TRAIL) alkalmaztunk a CD34+ sejtek adenovírusfertõzése optimális körülményeinek meghatározása céljából. A CD34+ felszínen a TRAIL-expresszió idõbeli lefutását monitoroztuk egy PE¹konjugált anti-TRAIL monoklonális ellenanyag (Rik¹2 klón) alkalmazásával. Végül a membránkötött TRAIL apoptózisindukáló kapacitását határoztuk mega az Ad¹TRAIL/CD34+ sejtek és limfómasejtvonalak együtt-tenyésztésével. Eljárások Emberi TRAIL gént kódoló adenovírus. A kísérletekhez egy, az emberi TRAIL gént CMV promoterrõl expresszáló, replikációdeficiens adenovírust (AdTRAIL) alkalmaztunk [39]. Az Ad¹TRAIL az emberi TRAIL teljes szekvenciáját tartalmazza, a pAd5CMVKNpA XhoI- és NotI-helyeire klónozva. A kapott plazmid és adenovírus-gerincszekvenciákat (Ad5), melybõl az E1 gének deletáltak, 293 jelû emberi embrionális vesesejtekbe transzfektáltuk, a vírusrészecskéket izoláltuk, és a TRAIL-expresszió analíziséhez amplifikáltuk. A rekombináns adenovírusokat replikációkompetens vírusokra az A549 plakkvizsgálattal vizsgáltuk, és a vírustitert 293 sejteken plakkteszttel határoztuk meg. A tisztított vírusokat felhasználásig 3% szukrózt tartalmazó PBS-ben tartottuk –80 °C¹on. A TRAIL géntermék a transzdukált sejtek felszínén expresszálódik, és áramlási citometriával detektálható. A CD34+ sejtek adenovirális transzdukciója. Az Ad¹TRAIL-lel transzdukálandó CD34+ sejteket beleegyezésüket adó, kemoterápiában részesülõ, haematopoetikus növekedési faktorokkal kezelt rákos betegek perifériás vérébõl vett leukoferezismintákból dúsítottuk immunmágneses technikával és pozitív szelekcióval (Miltenyi Biotech). Az adenovírustranszdukcióhoz a CD34+ sejteket 2×10 6 /ml koncentrációban 35 mm Petri-csészékre szélesztettük 1 ml szérummentes tápfolyadékban (IMDM), mely az Ad¹TRAIL 100 és 1000 közötti MOI-egységét tartalmazta. Inkubáció után (37 °C, 5% CO 2 , 2 óra) a tenyészeteket 1 ml IMDM/FBS 20% tápfolyadékkal egészítettük ki, és 4 óra múlva GeneBoostert (1:200) adtunk. A sejteket
2
tovább inkubáltuk 18 óra hosszat, majd alaposan mostuk (3×) szérumtartalmú tápfolyadékkal, végül a transzdukciós hatékonyságot direkt immunfluoreszcenciával határoztuk meg, egy PE¹konjugált anti-TRAIL ellen5 anyag alkalmazásával. Együtt-tenyésztés. A CD34+ sejtek membránján expresszált TRAIL apoptózisaktivitást kiváltó hatását in vitro együtt-tenyésztéses kísérletekkel határoztuk meg. Röviden, Ad¹TRAIL/CD34+ sejteket (effektorsejtek) 10 együtt tenyésztettünk limfómasejtekkel (célsejtek). Az apoptózisindukciót 24 és 48 órával az együtt-tenyésztés kezdete után értékeltük. Ezen kísérletekben az effektor:célsejt arányt az effektorsejtek transzdukciós hatékonysága alapján számítottuk. 15 Eredmények A CD34+ sejtek adenovirális transzdukciója. Elõkísérletek azt mutatták, hogy a CD34+ sejtek optimális transzdukciós hatékonyságát a CD34+ sejtek 20 (2×10 6 /ml) meghatározott mennyiségû (100 és 1000 MOI között) Ad¹TRAIL-lel szérummentes körülmények között 2 óra hosszat (37 °C) történõ inkubációjával kaptuk. Ezután szérummal kiegészített tápfolyadék (IMDM/FBS 20%) egyenlõ térfogatát adtuk, és 25 4 óra múlva a tenyészetet Gene Boosterrel (1:200) egészítettük ki, majd tovább inkubáltuk 18 óra hosszat. Végül a sejteket alaposan mostuk (3×) szérumtartalmú tápfolyadékkal, és a transzgén expresszióját direkt immunfluoreszcenciával határoztuk meg, egy PE¹konju30 gált anti-TRAIL ellenanyag alkalmazásával. Míg semmilyen háttér-TRAIL jel nem volt detektálható a kontrollsejtekben, az Ad¹nak kitett sejtekben bizonyos százalék TRAIL-pozitív CD34+ sejt volt, ami a MOI-tól függõen nõtt. Egy jellemzõ kísérletben a 35 TRAIL-pozitív CD34+ sejtek aránya 25%, illetve 84% volt 100, illetve 1000 MOI alkalmazása esetén. A fent leírt infekciós eljárás a maximális génátvitelt következetesen 1000 MOI-nál adta, a TRAIL-pozitív CD34+ sejtek aránya (átlag±SD) 83±8% (70–95%, n=5) 40 volt. A sejtek életképessége tripánkék-kizárásos vizsgálattal értékelve nem károsodott még magas, 1000 MOI víruskoncentrációnál sem (85% életképes sejt). A transzgén expressziójának idõbeli lefutását vizsgálva, CD34+ sejteket transzdukáltunk 1000 MOI-val 45 és a TRAIL-expressziót a transzdukció után 7 napig mértük. Ezen kísérletekben a CD34+ sejtek túlélésének segítésére a tenyészeteket alacsony dózisban (3 ng/ml) granulocita kolóniastimuláló faktorral (G¹CSF) egészítettük ki. Amint azt az 1. táblázat mutatja, a 50 CD34+ sejtek jelentõs része (25%) tovább expresszálta a TRAIL¹t a transzdukció utáni 120 óra után.
55
60 4
1. táblázat Ad-TRAIL-lel transzdukált CD34+ sejtek transzgénexpressziója idõben A fertõzés utáni órák száma
24
48
72
120
168
TRAIL¹t expresszáló CD34+ sejtek %¹a
95
70
42
25
13
1
HU 007 993 T2
Együtt-tenyésztés. Végezetül a membránkötött TRAIL apoptózisindukáló képességét értékeltük limfoid sejtvonalakon az Ad¹TRAIL/CD34+ sejtek és a tumoros sejtvonalak (célsejtek) együtt-tenyésztésével. Ezen kísérletekhez két sejtvonalat választottunk ki a szolubilis TRAIL-lel szembeni érzékenységük szempontjából. Közelebbrõl, a TRAIL-érzékeny KMS–11 sejtvonalat és a TRAIL-rezisztens JVM–2 sejtvonalat alkalmaztuk. A fenti infekciós eljárás szerint optimális körülmények között transzdukált CD34+ sejteket 24 órával a kezdeti adenovíruskitettség után összegyûjtöttük, alaposan mostuk és a KMS–11 vagy JVM–2 sejtekkel együtt tenyésztettük. Amikor Ad¹TRAIL/CD34+ sejteket tenyésztettünk együtt 0,8:1 effektor:célsejt arány mellett, a KMS–11 sejtek jelentõs része (81%) volt apoptotikus és nekrotikus 24 óra együtt-tenyésztés után. Az apoptotikus sejtek aránya tovább nõtt 48 óra együtt-tenyésztés után (93% apoptotikus sejt). A TRAIL-érzékeny KMS–11 sejtvonal esetében a membrán-kötött TRAIL apoptotikus potenciálja hasonló volt magas dózisú (100 ng/ml) szolubilis TRAIL 24–48 óra alatt kifejtett hatásához (3. táblázat). Tekintetbe véve viszont a TRAIL farmakokinetikai profilját intravénás injekció után (plazma-féléletidõ 32 perc, eliminációs féléletidõ 4,8 óra), folyamatos 48 vagy akár 24 órás, 100 ng/ml¹es koncentrációt nem lehet in vivo elérni. 3. táblázat Szolubilis TRAIL hatása a KMS–11 sejtekre A szolubilis TRAIL mennyisége
Életképes sejtek %¹a 24 óra után
Életképes sejtek %¹a 48 óra után
0 ng/ml
78
75
100 ng/ml
27
2
A szolubilis TRAIL¹re rezisztens NM–2 sejtvonallal szintén végeztünk együtt-tenyésztéses kísérleteket, Ad¹TRAIL/CD34+ sejtekkel vagy Ad¹TRAIL/NK sejtekkel együtt inkubálva. Amikor Ad¹TRAIL/CD34+ sejteket tenyésztettünk együtt 0,8:1 effektor:célsejt arány mellett, a KMS–11 sejtek jelentõs része (51%) volt apoptotikus és nekrotikus 48 óra együtt-tenyésztés után. A TRAIL-rezisztens JVM–2 sejtvonal esetében a membránkötött TRAIL apoptotikus potenciálja szignifikánsan magasabb volt, mint a magas dózisú (100 ng/ml) szolubilis TRAIL 48 óra alatt kifejtett hatása (4. táblázat).
5
10
15
Életképes sejtek %¹a 48 óra után
0 ng/ml
87
84
100 ng/ml
86
80
5. táblázat Apoptózis indukciója Ad¹TRAIL/CD34+ sejtek és KMS–11 sejtek 24 órás együtt-tenyésztésekor növekvõ effektor:célsejt arányok mellett CD34+/KMS–11 arány
0:1
0,08:1
0,4:1
0,8:1
Maradék életképes sejtek %¹a
71
67
34
22
2. példa – Adenovírusközvetített géntranszfert követõen TRAIL¹t expresszáló CD34+ sejtek tumorellenes aktivitásának in vivo értékelése NOD/SCID egerekben Az Ad¹TRAIL/CD34+ sejtek terápiás potenciáljának 25 értékelése céljából NOD/SCID egereket infundáltunk a TRAIL-szenzitív KMS–11 mieloma multiplex sejtvonallal. Ezt követõen az egerekbe Ad¹TRAIL/CD34+ sejteket injekcióztunk, és az egerek túlélését tekintettük a TRAIL sejtalapú célba juttatása hatékonyságának mér30 tékéül.
35
40
45
50
55 Életképes sejtek %¹a 24 óra után
A sejtközvetített TRAIL-célbajutattás apoptotikus aktivitási potenciálját tovább vizsgálva effektorsejteket (Ad-TRAIL/CD34+ sejtek) tenyésztettünk együtt célsejtekkel (KMS–11 sejtvonal) 24 óra hosszat különbözõ effektor:célsejt arányok mellett. Amint azt az 5. táblázat mutatja, az Ad¹TRAIL/CD34+ sejtek a KMS–11 sejtek jelentõs százalékában 66%) indukáltak apoptózist vagy nekrózist 0,4:1 effektor:célsejt aránnyal indított tenyészetekben.
20
4. táblázat Szolubilis TRAIL hatása a JVM–2 sejtekre A szolubilis TRAIL mennyisége
2
60 5
Eljárások Az Ad¹TRAIL/CD34+ sejtek tumorellenes aktivitásának értékelése. Hat–nyolchetes, 20–25 g¹os nõstény NOD/SCID egereket a Charles Rivertõl (Milánó, Olaszország) szereztünk be. Az egereket szokásos laboratóriumi körülmények között tartottuk az intézeti iránymutatásoknak megfelelõen. Az állatokon végzett kísérletes eljárásokat az Istituto Nazionale Tumori állatkísérletes etikai bizottsága hagyta jóvá, és az Egyesült Királyság Rákkutatási Koordinációs Bizottságának útmutatói alapján hajtottuk végre. Az egereket intravénásan (IV) inokuláltuk KMS–11 sejtekkel (egerenként 0,5×106). Az Ad¹TRAIL/CD34+ sejtekkel történõ kezelés (egerenként 1×106) 4 hétig heti 1 IV injekciót foglalt magába, a tumorinokulációtól számított 7. vagy 17. napon kezdve. A beadott Ad¹TRAIL/CD34+ sejtek transzdukciós hatékonysága 83±8% és 61±18% volt. Így minden egyes egér átlagosan 3,32×106 TRAIL¹t expresszáló CD34+ sejtet kapott a négy injekcióban. Az egereket hetente kétszer ellenõriztük a tumor megjelenése szempontjából, testtömegmérés és toxicitási vizsgálatok céljából. Az állatok túlélési idejét csoportonként feljegyeztük, és a csoportok közötti különbségeket statisztikai elemzéssel értékeltük. A megfelelõ kontrollcsoportok a következõk voltak: (i) csak tumorsejttel beinjekciózott egerek, (ii) tumorsejtekkel és nem transzdukált CD34+ sejtekkel injekciózott egerek.
1
HU 007 993 T2
Eredmények Ad-TRAIL/CD34+ sejtek. A KMS–11 sejtekkel (egerenként 0,5×106) xenograftált egereket Ad¹TRAIL/CD34+ sejtekkel kezeltük 4 IV injekcióval, heti rendszerességgel, két különbözõ séma alapján, azaz a kezelés a KMS–11 sejteket tartalmazó injekció után a 7. napon, a korai tumor stádiumában, vagy a 17. napon, az elõrehaladott tumor stádiumában kezdõdött. Minthogy a beadott Ad¹TRAIL/CD34+ sejtek transzdukciós hatékonysága 83±8% (n=9) volt, minden egyes egér átlagosan 3,32×106 TRAIL¹t expresszáló CD34+ sejtet kapott a négy injekcióban. Amint azt az 1. ábra mutatja, a KMS–11 sejtekkel beoltott NOD/SCID egerek túlélésének középértéke 56 nap volt. A vad típusú CD34+ sejtek injektálása nem volt hatással a túlélésre (56 nap), míg az Ad¹TRAIL/CD34+ sejtekkel a tumor korai stádiumában kezelt NOD/SCID egerek 111 nap középértékû túlélést mutattak (P£0,0001). Az elõrehaladott stádiumú tumorok Ad¹TRAIL/CD34+ sejtekkel történõ kezelésének hatása a 2. ábrán látható. A KMS–11 sejtekkel injektált NOD/SCID egerek túlélésének középértéke 56 nap volt. A vad típusú CD34+ sejtek injektálása nem volt hatással a túlélésre (56 nap), míg az Ad¹TRAIL/CD34+ sejtekkel a késõi tumorstádiumban kezelt NOD/SCID egerek 98 napos túlélési középértéket mutattak (P£0,007). 3. példa – CD34+/Ad-TRAIL sejtek in vitro tumorellenes aktivitása emlõráksejtvonalak ellen Az emlõráksejtvonalak jelentõs része rezisztens a TRAIL-indukált apoptózisra, többféle mechanizmus következményeképpen, melyek között szerepel a TRAIL befogása TRAIL álreceptorok által, az R1 és R2 receptorok expressziójának elvesztése, FLIP túlexpresszálás stb. [40]. Elõzõ eredményeink alapján, melyek szerint az sTRAIL-rezisztens limfómasejtvonalak TRAIL¹re válaszképesekké válnak mTRAIL hatására, két emlõráksejtvonal sTRAIL¹re és mTRAIL¹re mutatott érzékenységét is megvizsgáltuk. Az emlõráksejtvonalak sTRAIL¹re mutatott sejtpusztulási érzékenységét hasonlítottuk össze a CD34/Ad-TRAIL sejtekkel együtt tenyésztett, sTRAILérzékeny és sTRAIL-rezisztens emlõráksejtvonalakban in vitro indukált apoptózissal. Két emlõráksejtvonalat, az MCF–7 és MDAMB–361 jelûeket alkalmaztuk. A sejtvonalaknak az sTRAIL által indukált sejtpusztító hatás iránti érzékenységének vizsgálatára a tumorsejteket (5–10×104/ml) 72 óra hosszat alacsony (10 ng/ml) és magas (100 ng/ml) dózisú sTRAIL-nek tettük ki. Ezután az apoptózist annexin-V/propidium-jodid kettõs festéssel értékeltük. Eljárások Sejtvonalak. Az MCF–7 és MDA-MB–361 jelû emlõráksejtvonalakat rendre a DSMZ-tõl (Braunschweig, Németország, EU) és az ATCC-tõl (Manassas, VA,
2
USA) szereztük be. A sejteket rendszeren vizsgáltuk polimeráz-láncreakcióval mikoplazmaszennyezésre. Valamennyi in vitro kísérlet exponenciálisan növekvõ sejtekkel történt. Annexin¹V expresszió. Az Annexin V¹FITC tesztet 5 (PharMingen) alkalmaztuk a korai, illetve késõi apoptózisban és nekrózisban lévõ sejtek százalékos arányának meghatározására. Röviden: az analizálandó sejteket kétszer mostuk hideg PBS-ben, majd újra10 szuszpendáltuk kötõpufferben (10 nM HEPES, 140 nM NaCl, 5 nM CaCl2, pH=7,4). Inkubálást követõen 0,1 ml sejtszuszpenziót vittünk át 5 ml¹es tenyésztõcsövekbe, és 5 ml Annexin V¹FITC¹et, valamint 10 ml propidium-jodidot adtunk hozzá. Vorte15 xelés után a mintákat 15 percig szobahõmérsékleten, sötétben inkubáltuk. Az inkubálás végén 0,4 ml kötõpuffert adtunk és a sejteket áramlási citometriával vizsgáltuk. Eredmények Annak vizsgálatára, hogy az sTRAIL-lel történõ inkubáció együtt jár¹e az apoptózis kiváltásával, MCF–7 és MDA-MB–361 sejtvonalakat sTRAIL-nek (10–100 ng/ml, 72 óra) tettünk ki, és az apoptotikus és 25 nekrotikus sejtek százalékos arányát FACS-analízissel detektáltuk. Amint azt a 7. táblázat mutatja, az sTRAILnek kitettség nem indukált semmilyen apoptotikus választ az MCF–7 sejtekben, ellenben jelentõs sejtpusztulási választ váltott ki az MDA-MB–361 sejtekben, ha 30 100 ng/ml sTRAIL-lel inkubáltuk õket 72 óra hosszat. Ezen eredmények szerint az MCF–7 sTRAIL-rezisztens sejtvonal, míg az MDA-MB–361 sTRAIL-érzékeny sejtvonal. 20
35
7. táblázat Emlõráksejtvonalak sTRAIL iránti érzékenysége Sejtvonal
sTRAIL (ng/ml)
Fenotípus 0
40
10
100
apoptotikus+nekrotikus sejtek (%)
45
MCF–7
BC
10
9
13
MDA-MB–361
BC
6
9
46
Ezután az apoptózis in vitro kiválthatóságát vizsgáltuk adenovírusközvetített géntranszfert követõen TRAIL¹t expresszáló CD34+ sejtekkel (CD34/Ad50 TRAIL) együtt tenyésztett emlõráksejtvonalakon. Eljárások Emberi TRAIL gént kódoló adenovírus. A kísérletekhez egy, az emberi TRAIL gént CMV promo55 terrõl expresszáló, replikációdeficiens adenovírust (Ad-TRAIL) alkalmaztunk [39]. Az Ad¹TRAIL az emberi TRAIL teljes szekvenciáját tartalmazza, a pAd5CMVK-NpA XhoI- és NotI-helyeire klónozva. A kapott plazmid és adenovírus-gerincszekvenciákat 60 (Ad5), melybõl az E1 gének deletáltak, 293 jelû embe6
1
HU 007 993 T2
ri embrionális vesesejtekbe transzfektáltuk, a vírusrészecskéket izoláltuk, és a TRAIL expresszióanalíziséhez amplifikáltuk. A rekombináns adenovírusokat replikációkompetens vírusokra az A549 plakkvizsgálattal vizsgáltuk, és a vírustitert 293-sejteken plakkteszttel határoztuk meg. A tisztított vírusokat felhasználásig 3% szukrózt tartalmazó PBS-ben tartottuk –80 °C¹on. A TRAIL géntermék a transzdukált sejtek felszínén expresszálódik, és áramlási citometriával detektálható. A CD34+ sejtek adenovirális transzdukciója. Az Ad¹TRAIL-lel transzdukálandó CD34+ sejteket beleegyezésüket adó, kemoterápiában részesülõ, haematopoetikus növekedési faktorokkal kezelt rákos betegek perifériás vérébõl vett leukoferezismintákból dúsítottuk immunmágneses technikával és pozitív szelekcióval (Miltenyi Biotech). Az adenovírustranszdukcióhoz a CD34+ sejteket 2×10 6 /ml koncentrációban 35 mm Petri-csészékre szélesztettük 1 ml szérummentes tápfolyadékban (IMDM), mely az Ad¹TRAIL 100 és 1000 közötti MOI-egységét tartalmazta. Inkubáció után (37 °C, 5% CO 2 , 2 óra) a tenyészeteket 1 ml IMDM/FBS20% tápfolyadékkal egészítettük ki, és 4 óra múlva GeneBoostert (1:200) adtunk. A sejteket tovább inkubáltuk 18 óra hosszat, majd alaposan mostuk (3×) szérumtartalmú tápfolyadékkal, végül a transzdukciós hatékonyságot direkt immunfluoreszcenciával határoztuk meg egy PE¹konjugált anti-TRAIL ellenanyag alkalmazásával. Együtt-tenyésztés. A CD34+ sejtek membránján expresszált TRAIL apoptózisaktivitást kiváltó hatását in vitro együtt-tenyésztéses kísérletekkel határoztuk meg. Röviden, Ad¹TRAIL/CD34+ sejteket (effektorsejtek) együtt tenyésztettünk emlõráksejtekkel (célsejtek). Az apoptózisindukciót 24 és 48 órával az együtt-tenyésztés kezdete után értékeltük. Ezen kísérletekben az effektor:célsejt arány 1:1 és 4:1 volt. Eredmények A CD34+ sejtek adenovirális transzdukciója. A CD34+ sejtek optimális transzdukciós hatékonyságát a CD34+ sejtek (2×106/ml) meghatározott mennyiségû, 500 MOI Ad¹TRAIL-lel szérummentes körülmények között 2 óra hosszat (37 °C) történõ inkubációjával kaptuk. Míg semmilyen háttér-TRAIL jel nem volt detektálható a kontrollsejtekben, a TRAIL¹t expresszáló sejtekben 93±8% (átlag±szórás) TRAIL-pozitív CD34+ sejt volt. A tripánkék-kizárásos teszt szerinti sejtéletképességet még 1000 MOI sem befolyásolta (85% életképes sejt). Együtt-tenyésztés. Az mTRAIL apoptóziskiváltó kapacitását emlõráksejtvonalakon a CD34/Ad-TRAIL sejtek (effektorsejtek) és a tumorsejtek (célsejtek) együtt-tenyésztésével vizsgáltuk. CD34/Ad-TRAIL sejteket a kezdeti adenovíruskitettség után 24 órával gyûjtöttünk, alaposan mostuk és az MCF–7 vagy MDA-MB–361 sejtekkel együtt tenyésztettük õket. Ezen kísérletekben az effektor:célsejt arány 1:1 és 4:1 volt. Az eredményeket a 8. táblázat foglalja össze.
2
8. táblázat Az mTRAIL tumorsejtölõ képessége emlõráksejtvonalakon 5
Sejtvonal
Tenyésztési körülmények
Apoptózis+ nekrózis
MDA-MB–361 kontroll
10
15
20
25
30
28
CD34/Ad-TRAIL (E:C arány=4:1)
50
CD34/Ad-Mock (E:C arány=1:1)
12
CD34/Ad-Mock (E:C arány=1:1)
19
Ad-TRAIL 106 pfu
6
kontroll
5
MCF–7
CD34/Ad-TRAIL (E:C arány=1:1)
17
CD34/Ad-TRAIL (E:C arány=4:1)
64
CD34/Ad-Mock (E:C arány=1:1)
21
CD34/Ad-Mock (E:C arány=4:1)
22
Ad-TRAIL 106 pfu
35
40
45
50
55
60 7
6
CD34/Ad-TRAIL (E:C arány=1:1)
9
Jelentõs arányú sejtpusztulás volt észlelhetõ a CD34/Ad-TRAIL sejtek és az sTRAIL-érzékeny MDAMB-361 sejtek 48 óra hosszat történõ együtt-tenyésztésekor 1:1 E:C arány mellett (sejtpusztulás=28%) és 4:1 E:C arány mellett (sejtpusztulás=50%). Az sTRAIL-érzékeny MDA-MB–361 sejtvonal esetében az mTRAIL-nek való 48 órás kitettség apoptotikus hatása hasonló volt nagy dózisú (100 ng/ml) sTRAILnek való 72 órás kitettség hatásához (7. táblázat). Annak igazolására, hogy az CD34/Ad-TRAIL citotoxikus hatása valóban az mTRAIL-nek tulajdonítható, MDA-MB–361 sejteket tenyésztettünk együtt áltranszdukált CD34+ sejtekkel. Amint azt a 2. táblázat mutatja, az MDA-MB–361 sejtek együtt-tenyésztése áltranszdukált CD34+ sejtekkel csekély sejtpusztulást okozott, mely hatás csak a legmagasabb E:C aránynál volt észlelhetõ. Ez a csekély mértékû sejtpusztulás valószínûleg a tenyészet túlzsúfoltsága miatt következett be. Azon lehetõség kizárására, miszerint a CD34/AdTRAIL sejtpusztító hatása szabad adenovirális részecskék jelenlétének lett volna betudható, mely részecskéket nem sikerült volna kimosni az Ad¹TRAIL-lel történõ CD34+-fertõzés végén, MDA-MB–361 sejteket tettünk ki 106 plakk-képzõ egységnek (pfu). Sejttoxicitásra utaló jeleket nem észleltünk az MDAMB–361 sejteken 106 vírusrészecske jelenlétében (8. táblázat). A pfu-számot a következõk szerint számítottuk.
1
HU 007 993 T2
5×105 CD34+ sejt infekciójára 500 MOI¹n 250×106 pfu¹t alkalmaztunk, amit 1 ml CD34+ sejtszuszpenzióhoz adtunk. A fertõzés után a CD34+ sejteket 3× mostuk tenyészfolyadékkal. Minden egyes mosási lépésben 1:20¹as hígítási faktort alkalmaztunk, tehát a szuszpenziós tenyészetet legalább 8000-szeresen hígítottuk. Feltéve, hogy 250×106 pfu még jelen volt a szuszpenziós tenyészetben a mosási eljárás végén, 8000szeres hígítást figyelembe véve <50 000 maradék pfu kerülhetett az együtt-tenyésztésbe. Tehát annak kizárására, hogy az együtt-tenyésztés alatt a sejtpusztulás ki nem mosott szabad adenovírusrészecskéknek lenne betudható, az emlõráksejtvonalakat az elméleti maradék pfu-nak megfelelõ pfu-nak tettük ki, megszorozva hússzal (azaz 50 000×20=106 pfu). Ezután együtt-tenyésztési kísérleteket végeztünk CD34/Ad-TRAIL sejtek és az sTRAIL-rezisztens MCF–7 sejtvonal együttes inkubálásával. Ezen kísérletekben jelentõs arányú sejtpusztulás volt észlelhetõ a CD34/Ad-TRAIL sejtek és az sTRAIL-rezisztens MCF–7 sejtek 48 óra hosszat történõ együtt-tenyésztésekor 4:1 E:C arány mellett (sejtpusztulás=64%), míg 1:1 E:C arány mellett nem volt sejtpusztulás észlelhetõ. Az sTRAIL-rezisztens MCF–7 sejtvonal esetében, a 48 órás mTRAIL-kitettség apoptotikus potenciálja lényegesen magasabb volt, mint a nagydózisú (100 ng/ml) sTRAIL-nek való 72 órás kitettség hatása (7. és 8. táblázat). Annak igazolására, hogy az CD34/Ad-TRAIL citotoxikus hatása valóban az mTRAIL-nek tulajdonítható, MCF–7 sejteket tenyésztettünk együtt áltranszdukált CD34+ sejtekkel. Amint azt a 8. táblázat mutatja, az MCF–7 sejtek együtt-tenyésztése áltranszdukált CD34+ sejtekkel csekély sejtpusztulást okozott, mely hatás valószínûleg a tenyészet túlzsúfoltsága miatt következett be. Azon lehetõség kizárására, miszerint a CD34/AdTRAIL sejtpusztító hatása szabad adenovirális részecskék jelenlétének lett volna betudható, mely részecskéket nem sikerült volna kimosni az Ad¹TRAIL-lel történõ CD34+-fertõzés végén, MCF–7 sejteket tettünk ki 106 pfu-nak. Sejttoxicitásra utaló jeleket nem észleltünk a 106 pfu-nak kitett MCF–7 sejteken (8. táblázat).
5
10
15
20
25
30
35
40
45 Hivatkozások jegyzéke 1. Daniai, N. N. and S. J. Korsmeyer, Cell death: critical control points. Cell, 2004. 116(2): p. 205–19. 2. Blagosklonny, M. V., Prospective strategies to enforce selectively cell death in cancer sejtek. Oncogene, 2004. 23(16): p. 2967–75. 3. Waxman, D. J. and P. S. Schwartz, Harnessing apoptosis for improved anticancer gene therapy. Cancer Res, 2003. 63(24): p. 8563–72. 4. Ashkenazi, A. and V. M. Dixit, Death receptors: signaling and modulation. Science, 1998. 281(5381): p. 1305–8. 5. Ashkenazi, A. and V. M. Dixit, Apoptosis control by death and decoy receptors. Curr. Opin. Cell. Biol., 1999. 11 (2):p. 255–60.
50
55
60 8
2
6. Wang, S. and W. S. El¹Deiry, TRAIL and apoptosis induction by TNF-family death receptors. Oncogene, 2003.22(53): p. 8628–33. 7. Almasan, A. and A. Ashkenazi, Apo2L/TRAIL: apoptosis signaling, biology, and potential for cancer therapy. Cytokine Growth Factor Rev., 2003. 14(3–4): p. 337–48. 8. LeBlanc, H., et al., Tumor-cell resistance to death receptor-induced apoptosis through mutational inactivation of the proapoptotic Bcl¹2 homolog Bax. Nat. Med., 2002. 8(3): p. 274–81. 9. Ashkenazi, A., et al., Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand. J. Clin. Invest., 1999. 104 (2): p. 155–162. 10. Walczak, H., et al., Tumoricidal activity of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in vivo. Nat. Med., 1999. 5(2): p. 157–63. 11. Mitsiades, C. S., et al., TRAIL/Apo2L ligand selectively induces apoptosis and overcomes drug resistance inmultiple myeloma: therapeutic applications. Blood, 2001. 98(3): p. 795–804. 12. Fulda, S., et al., Smac agonists sensitize for Apo2L/TRAIL- or anticancer drug-induced apoptosis and induce regression of malignant glioma in vivo. Nature Medicine, 2002. 8(8): p. 808–815. 13. Pollack, I. F., M. Erff, and A. Ashkenazi, Direct stimulation of apoptotic signaling by soluble Apo2L/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand leads to selective killing of glioma sejtek. Clinical Cancer Research, 2001.7 (5): p. 1362–1369. 14. Lawrence, D., et al., Differential hepatocyte toxicity of recombinant Apo2L/TRAIL versions. Nat. Med., 2001. 7 (4): p. 383–5. 15. Qin, J., et al., Avoiding premature apoptosis of normal epidermal sejtek. Nature Medicine, 2001. 7 (4): p. 385–386. 16. Jo, M., et al., Apoptosis induced in normal human hepatocytes by tumor necrosis factor-related apoptosis- inducing ligand. Nat. Med., 2000. 6(5): p. 564–7. 17. Johnston, J. B., et al., Role of the TRAIL/APO2¹L death receptors in chlorambucil- and fludarabine-induced apoptosis in chronic lymphocytic leukemia. Oncogene, 2003. 22(51): p. 8356–69. 18. Yamanaka, T., et al., Chemotherapeutic agents augment TRAIL-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell lines. Hepatology, 2000. 32(3): p. 482–90. 19. Armeanu, S., et al., Adenoviral gene transfer of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand over- comes an impaired response of hepatoma sejtek but causes severe apoptosis in primary human hepatocytes. Cancer Res., 2003. 63(10): p. 2369–72. 20. Voelkel-Johnson, C., D. L. King, and J. S. Norris, Resistance of prostate cancer sejtek to soluble TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL/Apo2L) can be overcome by doxorubicin or adenoviral delivery of full-length TRAIL. Cancer Gene Ther, 2002. 9(2): p. 164–72.
1
HU 007 993 T2
21. McCormick, F., Cancer gene therapy: fringe or cutting edge? Nat. Rev. Cancer, 2001. 1 (2): p. 130–41. 22. Somia, N. and I. M. Verma, Gene therapy: trials and tribulations. Nat. Rev. Genet., 2000. g (2): p. 91–9. 23. Griffith, T. S. and E. L. Broghammer, Suppression of tumor growth following intralesional therapy with TRAIL recombinant adenovírus. Mol. Ther., 2001. 4(3): p. 257–66. 24. Harrington, K., et al., Sejtek as vehicles for cancer gene therapy: the missing link between targeted vectors and systemic delivery? Hum. Gene. Ther., 2002. 13(11): p. 1263–80. 25. Rafii, S. and D. Lyden, Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nat. Med., 2003. 9(6): p. 702–12. 26. Rosenberg, S. A., Karnofsky Memorial Lecture. The immunotherapy and gene therapy of cancer. J. Clin. Oncol., 1992. 10(2): p. 180–99. 27. Hardy, C. L., The homing of hematopoietic stem sejtek to the bone marrow. Am. J. Med. Sci., 1995. 309(5): p. 260–6. 28. Lapidot, T., Mechanism of human stem cell migration and repopulation of NOD/SCID and B2mnull NOD/SCID mice. The role of SDF-1/CXCR4 interactions. Ann. N Y Acad. Sci., 2001. 938: p. 83–95. 29. Lapidot, T. and I. Petit, Current understanding of stem cell mobilization: the roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal sejtek. Exp. Hematol., 2002. 30(9): p. 973–81. 30. Srour, E. F., et al., Homing, cell cycle kinetics and fate of transplanted hematopoietic stem sejtek. Leukemia, 2001.15(11): p. 1681–4. 31. Clark, B. R., J. T. Gallagher, and T. M. Dexter, Cell adhesion in the stromal regulation of haemopoiesis. Baillieres Clin. Haematol., 1992. 5(3): p. 619–52. 32. Deguchi, T. and Y. Komada, Homing-associated cell adhesion molecule (H–CAM/CD44) on human CD34+hematopoietic progenitor sejtek. Leuk. Lymphoma, 2000. 40(1–2): p. 25–37. 33. Tavassoli, M. and J. J. Minguell, Homing of hemopoietic progenitor sejtek to the marrow. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1991. 196(4): p. 367–73. 34. Verfaillie, C. M., Adhesion Receptors as Regulators of the Hematopoietic Process. Blood, 1998. 92 (8): p. 2609–2612. 35. Cooper, M. A., T. A. Fehniger, and M. A. Caligiuri, The biology of human natural killer-cell subsets. Trends Immunol., 2001. 22(11): p. 633–40.
2
36. Basse, P. H., T. L. Whiteside, and R. B. Herberman, Use of activated natural killer sejtek for tumor immunotherapy in mouse and human. Methods Mol. Biol., 2000. 121: p. 81–94. 37. deMagalhaes-Silverman, M., et al., Posttrans5 plant adoptive immunotherapy with activated natural killer sejtek in patients with metastatic breast cancer. J. Immunother., 2000. 23(1): p. 154–60. 38. Rosenberg, S. A., et al., Prospective randomi10 zed trial of high-dose interleukin–2 alone or in conjunction with lymphokine-activated killer sejtek for the treatment of patients with advanced cancer. J. Natl. Cancer Inst., 1993. 85 (8): p. 622–32. 39. Griffíth, T. S., et al., Adenoviral-mediated trans15 fer of the TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo¹2 ligand gene induces tumor cell apoptosis. J. Immunol., 2000. 165(5): p. 2886–94. 40. Kazhdan 1. and R. A. Martiniak, Death receptor 4 (DR4) efficiently kills breast cancer sejtek irrespective 20 of ther sensitivity to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). Cancer Gene. Ther., 2004. 11:p. 691–698.
25
30
35
40
45
9
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Növekedési faktorral kezelt rákos betegek perifériás vérébõl származó CD34+ haematopoetikus sejtek, melyek tumornekrózisfaktor-rokon apoptózisindukáló liganddal vannak transzdukálva, azzal a megkötéssel, hogy a sejtek nem dendritikus sejtek. 2. Az 1. igénypont szerinti sejtek, melyek CD34+ sejtek tumornekrózisfaktor-rokon apoptózisindukáló ligandot kódoló adenovírusvektorral történõ transzdukcióval állíthatók elõ. 3. Sejtes készítmények, amelyek 1. vagy 2. igénypont szerinti sejteket keverékben, élettanilag elfogadható hordozókkal együtt tartalmaznak. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti sejtek alkalmazása tumorok kezelésére szolgáló gyógyszerek készítésére. 5. A 4. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a tumor limfóma. 6. A 4. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a tumor mammakarcinóma. 7. A 4., 5. vagy 6. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer intravénásan kerül alkalmazásra.
HU 007 993 T2 Int. Cl.: C12N 5/16
10
HU 007 993 T2 Int. Cl.: C12N 5/16
11
HU 007 993 T2 Int. Cl.: C12N 5/16
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
