!HU000006857T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 006 857
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 738030 (22) A bejelentés napja: 2003. 06. 13. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030738030 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1512014 A1 2003. 12. 24. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1512014 B1 2009. 08. 05.
(51) Int. Cl.: G01N 33/68 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 03106692 PCT/EP 03/006251
(30) Elsõbbségi adatok: 02013423 2002. 06. 13.
(73) Jogosult: Merck Patent GmbH, 64293 Darmstadt (DE)
EP
(72) Feltalálók: STRITTMATTER, Wolfgang, 64372 Ober-Ramstadt (DE); MOLL, Heidrun, 97074 Würzburg (DE); SCHARM, Burkhard, 64354 Reinheim (DE) (54)
(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Eljárások alloantigének azonosítására és ezek alkalmazása rákterápiára és transzplantációra
(57) Kivonat
HU 006 857 T2
A találmány tárgya a graft versus tumor (GVT) reakció és/vagy graft versus host betegséget (GVHD) beindító alloantigének általános definiálásának új koncepciójával kapcsolatos. Az alloantigének új azonosítási eljárása új immunterápiai stratégiák kialakítását teszi szükségessé. Mivel a HLA-kötõ proteinek analízise
mára elvégezhetõ olyan alloantigénekkel, amelyekre ismert a megfelelõ aminosavszekvencia, a találmány szerinti megoldás alkalmazásával a GVHD¹t közvetítõ tumorreaktív T¹sejtektõl elkülöníthetõk azok a tumorreaktív T¹sejtek, amelyek csak felismerik a tumorsejteket.
A leírás terjedelme 64 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 006 857 T2
A találmány összefoglalása A jelen találmány értelmében a graft versus tumor (GVT) reakció és/vagy graft versus host betegséget (GVHD) beindító alloantigének általános definiálásának új koncepcióját tárjuk fel. Az alloantigének új azonosítási eljárása (amely ez idáig megoldatlan technikai problémát jelentett) új immunterápiai stratégiák kialakítását teszi szükségessé. Mivel a HLA-kötõ proteinek analízise mára elvégezhetõ olyan alloantigénekkel, amelyekre ismert a megfelelõ aminosavszekvencia, a találmány szerinti megoldás alkalmazásával a GVHD¹t közvetítõ tumorreaktív T¹sejtektõl elkülöníthetõk azok a tumorreaktív T¹sejtek, amelyek csak felismerik a tumorsejteket. Az új technológia alkalmazásával definiált antigének különösen elõnyösek a rák és a transzplantációval összefüggõ betegségek diagnosztizálására és ilyen betegségek elleni vakcinálásra. A technika állása Szakirodalmi adatok alapján ismert, hogy a tumorok nagy hányada megnövekedett szinten expresszál olyan – néha módosult – saját proteint, amely immunreakciók potenciális célpontjának tekinthetõ. Kimutatták továbbá, hogy az immunrendszer celluláris mechanizmusa (T¹limfociták) kísérleti modellekben és emberekben képes a ráksejtek felismerésére, azonban a tumorok progresszív módon növekednek tovább. Ezen ellentmondás magyarázatának egyik elmélete szerint a tumort hordozó gazdaszervezetben a T¹limfociták nem mûködnek megfelelõen. A másik alternatíva a tumorok antigénprezentáló mechanizmust gátló képessége, melynek eredményeként a T¹limfociták számára láthatatlanná válnak. Ennek megfelelõen továbbra is bizonytalan, hogy a túlzott mértékben expresszált vagy módosított proteinek képesek¹e serkenteni a citotoxikus T¹limfocitákat (CTL), és hozzájárulnak¹e a tumornövekedés immunológiai felügyeletéhez. Ezenfelül a tumorproteinek többsége univerzálisan expresszálódó protein, és valószínû, hogy a specifikus CTL¹ek autológ T¹sejt repertoárból történõ törlését közvetítik. Normális esetben az autoreaktív T¹sejtek fejlõdésük korai stádiumában antigén indukálta apoptózis vagy negatív szelekció révén törlõdnek. A negatív szelekciót – az antigéneken kívül – az antigénprezentáló sejtekbõl származó kostimulátor szignálok különbözõ sorozatai is befolyásolhatják [MacKinnon és mtsai.: Br. J. Haematol. 110, 12–17 (2000)], ami a saját antigénekkel szemben toleráns immunrendszer kialakulását eredményezi. A kedvezõtlen tapasztalatok ellenére továbbra is hatalmas érdeklõdés és várakozás tapasztalható annak vonatkozásában, hogy a tumorellenes vakcinálás mûködõképes lehet, és megoldja a jelenlegi terápiás módszerek hátrányait. A radioterápia és a kemoterápia kombinált alkalmazását az utóbbi 20–30 évben ismerték fel bizonyos anyagcsere- és vérképzési rendellenességek kezelésére, és egyértelmûvé vált, hogy a terápiás hatás csak részben köszönhetõ a leukémiás sejtek nagy dózisú kemoterápiás hatóanyagok és sugárkezelés okozta el-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
pusztításának. Számos klinikai megfigyelés szolgáltat meggyõzõ bizonyítékot arra vonatkozóan, hogy mindezeken felül a (donor T¹sejtes) immunreakciók is jelentõs mértékben hozzájárulnak a maradék rákos sejtek eliminálásához, és különösen a csontvelõ-átültetésen (BMT) alapuló terápiák hosszú távú sikeréhez. Visszatekintve, a csontvelõ-átültetéssel összefüggõ standard terápiás stratégia túlértékelte az akár nagyon nagy kemoterápiás dózisok rákellenes hatását, és alábecsülte csontvelõ-átültetés által közvetített immunterápia hatékonyságát. A vérképzési rendellenességek (leukémia) allogén csontvelõ-transzplantátumokkal (allo-BMT) végzett kezelését követõen tapasztalt klinikai sikerek nagyrészt megfeleltek egy gyógyító immunterápia alapkövetelményeinek. Az „allogén” kifejezést olyan szituáció leírására használjuk, amikor a donor és a recipiens különbözõ személyek (megkülönböztetésül a „szingén” kifejezéstõl, amely esetben a donor és a recipiens azonos ikrek, akik azonos szövettípussal bírnak, mivel genetikai felépítésük azonos). Az „autológ” transzplantátumok egy személytõl származnak, aki a folyamat elõrehaladása során késõbb saját sejtjeit kapja vissza. Szûkebb értelemben azonban ez nem tekinthetõ transzplantációnak, mivel itt nem létezik immunológiai transzplantációs barrier. Az allogén donorok két típusa ismeretes: rokonok, akik rendszerint testvér donorok, illetve nem rokonok, akik önkéntesek nagyon nagy csoportjából kerülnek ki (akik szövettípus-egyeztetés alapján a pácienssel azonos szövettípusúnak bizonyulnak). Az allogén transzplantáció – akár rokon, akár nem rokon donortól – abban különbözik a szingén vagy autológ transzplantációtól, hogy megvan a lehetõség a beültetett õssejtek recipiens szervezet általi kilökésére (host versus graft hatás), illetve a donor immunsejtjei által a recipiens szövetei ellen indított immunreakcióra (graft versus host betegség). Az immunológiai kilökõdést rendszerint úgy elõzik meg, hogy a recipienst – immunrendszere szuppresszálása céljából – a transzplantáció elõtt intenzív kezelésnek (kondicionálásnak) vetik alá. A kondicionálási sémák a transzplantációs központoktól és kezelni kívánt malignáns állapottól függõen változnak. Például leukémia kezelése esetén a páciens myeloablatív kondicionáláson esik át, amely csontvelõ-átültetés elõtti nagy dózisú ciklofoszfamidkezelés és teljestest-besugárzás kombinációjából áll. A transzplantációt követõen az immunreakciót immunszuppresszív hatóanyagok – pl. metotrexat, glükokortikoid hormonok (szteroidok), cyclosporin vagy mikroemulziója (Neoral®), tacrolimus (Prograf®), mikofenolát mofetil (Cellcept®) – korlátozott idõtartamú adagolásával állítják le (a páciens szöveteinek akut károsodásának és sérülésének elkerülése érdekében). A kontrollált immunszuppresszió mellett további elõnyt jelent a kondicionálás csökkentett toxicitása és csontvelõ-átültetés utáni immunreakció jelentõs mértékû gátlása. Mindazonáltal továbbra is súlyos komplikációk fordulnak elõ az oropharynxnál, a
1
HU 006 857 T2
gastrointestinalis traktusban, májban, tüdõben, bõrben, vesében, húgyvezetékben és idegrendszerben, következésképpen az allogén csontvelõ-átültetés (allo-BMT) a fiatalabb, orvosilag jó állapotban lévõ páciensekre korlátozódik. Általánosan elfogadott tény, hogy a hematológiai rákok kizárólag nagy dózisú kemoterápiával és sugárkezeléssel nem mindig gyógyíthatók, ehelyett alloBMT¹re van szükség. Ilyenformán, a hagyományos allo-BMT-alapú terápiák számos hematológiai malignáns betegség kezelését illetõen standard eljárássá váltak, és az összes immunterápia referenciájaként szolgálnak – a „gyógyulás” lehetõségét biztosítva. Az allogén csontvelõ-átültetés donorjait fõ hisztokompatibilitási komplex (MHC) molekulák, azaz a humán leukocita antigének (HLA) expressziója alapján szelektálják. A HLA-típusok genetikailag kódoltak, így az egyén HLA-típusa szüleitõl örökölt. A transzplantáció szempontjából három fõ gén tûnik különösen fontosnak, melyek egy klaszterbe tartoznak. Ez a három gén a HLA–A, HLA¹B és HLA¹DR. A HLA-klaszterben minden egyed mindegyik gén két kópiáját hordozza. Ezenfelül az egyes HLA-géneknek számos allélváltozata létezik. Az ideális „hatból hat” egyezéshez két embernek a két-két HLA–A, HLA¹B és HLA¹DR génjükbõl azonos allélokat kell hordozniuk, és 1:200-hoz annak esélye, hogy egy szülõ és gyermeke között HLA-egyezés legyen. Ha nem áll rendelkezésre HLA-egyezõ rokon, és sürget az idõ, rendszerint nem rokon donort is figyelembe vesznek. Egy az egymillióhoz annak esélye, hogy bármely két nem rokon személy mind a hat HLAgén vonatkozásában egyezõ legyen. A HLA-rendszer polimorfizmusa, az etnikai háttér és a diagnózis felállításakor érvényes átlagéletkor miatt HLA-egyezést mutató rokon donorok jelenleg az újonnan diagnosztizált páciensek 15–60%-ánál állnak rendelkezésre. Az alternatív donorok közé tartoznak a csekély mértékben inkompatibilis rokonok, valamint a HLA-kompatibilis nem rokon önkéntesek. A nyilvántartóközpont-hálózat kialakításával (napjainkra világszerte több mint 4,7 millió nyilvántartott donorral), illetve a egyéb források (pl. magzati köldökzsinórvér) hozzáférhetõsége révén megnõtt a HLA-egyezést vagy részlegesen hibás egyezést mutató, de még megfelelõ, nem rokon donorok megtalálásának valószínûsége. A csontvelõ-transzplantátum fõként vérképzési õssejtekbõl (stem-sejtekbõl) áll, melyek a csontvelõbõl, vérbõl és köldökzsinórvérbõl nyerhetõk. A vérképzési õssejteket rendszerint a csontvelõbõl csapolják le. Egy alternatív eljárás szerint a donorokat – az õssejtek és az elõdsejtek („progenitor cells”) csontvelõbõl vérbe történõ mobilizálása céljából – granulocita kolónia-stimuláló faktorral (G¹CSF) 3–5 napos kezelésnek vetik alá, majd a megfelelõ sejteket leukaferézissel gyûjtik ki a donorból. A placentában és az újszülöttek köldökzsinórjában lévõ vért egyre elterjedtebben használják az õssejtek új forrásaként. A köldökzsinórvér jelentõs számban tartal-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
maz õssejteket; bizonyos pácienseknél ez elõnyöket jelent a csontvelõ-transzplantátummal és a felnõttek vérébõl származó õssejtekkel szemben, és olyan esetekben, ha HLA-egyezéses nem rokon, csontvelõ-eredetû õssejtdonor nem áll rendelkezésre, számításba vehetõ. A köldökzsinórvér alkalmazásának egyik elõnye, hogy a recipienssel nincs szükség teljes szövettípus-egyezésre. A fentebb leírtak szerint elõkondicionált páciensek megkapják az õssejtkészítményt, és a transzplantáció után 2–5 héttel az átvitt sejtek a páciens vérében megjelenõ normál fehérvérsejtekként lesznek láthatók. A páciens meghatározott idõközönként transzfúzióval vörösvérsejteket és vérlemezkéket kap, mindaddig, míg az átültetett õssejtek helyre nem állítják a csontvelõfunkciót. A vérképzési rendszer felépülése rövidebb idõ alatt megy végbe a vérbõl származó õssejtek alkalmazásával, mint a csontvelõsejtek alkalmazása esetén. Az új kimérikus immunsejtek némelyike a gazdaszervezetet idegenként ismeri fel, és graft versus leukémia hatást indukál, amit a továbbiakban graft versus tumor (GVT) aktivitásnak nevezünk, s amely rendszerint graft versus host betegség (GVHD) kialakulásával jár. A GVHD-reakció akkor következik be, ha a donor immunsejtjei (különösen a T¹limfociták) a gazdasejteket önmaguktól eltérõnek ismerik fel. Az allo-BMT-indukálta graft versus host betegség a GVT-vel szorosan összefüggõ immunfunkció, amely nem sokkal azután következik be, hogy a transzplantált sejtek kezdenek megjelenni a recipiensben. Mindkét immunreakció-típust olyan T¹sejtek közvetítik, amelyek felismerik a genetikailag nem azonos sejteket, és ez adhat magyarázatot arra a régi keletû megfigyelésre, hogy a krónikus myeloid leukémia (CML) kezelésére az azonos ikrek közötti transzplantációk kevésbé sikeresek, mint az egyezést mutató testvérek közöttiek [Gale és mtsai.: Ann. Intern. Med. 1994, 120, 646–652]. Õssejt-transzplantáció esetén a donorsejtek – különbségekre utaló jeleket keresve – gondosan átvizsgálják a recipiens szervezet szöveti sejtjeit, és jelentõs mértékû eltérések azonosítása esetén megtámadják azokat. A transzplantáció utáni kezdeti stádiumban például pácienseredetû maradék antigénprezentáló sejtek (APC) vannak jelen, melyeket a donoreredetû T¹sejtek polimorf géneken alapuló különbségekre vizsgálnak át. Ha a donoreredetû T¹sejtek idegen antigéneket prezentáló gazdasejteket (azaz gyakorlatilag az összes immunsejtet) ismernek fel, citotoxikus reakciót indítanak be. Azt, hogy a T¹sejt-reakció életveszélyes graft versus host betegséggé (GVHD) vagy jótékony hatású GVT-reakcióvá alakul, attól függ, hogy a genetikailag manifesztálódott különbségek a rákos szövetekhez vagy szervekhez tartozó sejtek vonatkozásában prezentálódnak, vagy, rosszabb esetben, lényegében nem megbetegedett szervek (pl. bõr, ízületek, tüdõ, máj vagy vese) részét képezik. A GVHD súlyossága – az érintett szerv jelentõségétõl függõen – a kis kiütések megjelenésétõl az életveszélyes betegségig terjed. Az allo-BMT némileg nyers megközelítési mód marad, amelyre jelentõs mennyiségû, transzplantációval összefüggõ morbiditás
1
HU 006 857 T2
és mortalitás jellemzõ. Újabb beszámolók gyûjteménye alapján az elhalálozás kockázata 20–41%¹ra tehetõ, és – annak ellenére, hogy rendelkezésre állnak hatásos immunszuppresszív hatóanyagok – a kezelt páciensek 70%¹a szenved graft versus host betegségben. Jelen találmány fõ szempontja a betegséget kiváltó folyamatért felelõs alloantigének széles spektrumú azonosítása, valamint a betegség elleni küzdelemben elõnyös alloantigének meghatározása. Mindazonáltal a BMT-alapú immunterápia a transzplantációt követõen a páciensek akár 70%-ának leukémiamentes túlélést biztosít [Clift és mtsai.: Haematol. 10, 319–336 (1997)], azonban – betegségük státusa, elõrehaladott életkoruk vagy megfelelõ donor hiánya miatt – a CML-páciensek több mint 60%¹a esetében nem alkalmazható az allogén csontvelõ-átültetés. A BMT és/vagy egyéb õssejt-transzplantáció a következõ betegségek elfogadott kezelési opciójának tekinthetõ: akut myeloid leukémia (AML; az elsõ vagy azt követõ teljes remissziós idõszakban, korai relapszus vagy sikertelen indukciós kezelés esetén), CML, mielodiszplázia, aplasztikus anémia, Hodgkin-kór (szenzitív és rezisztens relapszus), agresszív limfóma (szenzitív és rezisztens relapszus) és alacsony malignitású („low grade”) limfóma. A graft versus host reakció akkor fordul elõ, ha a donor immunsejtjei (különösen T¹limfocitái) a gazdasejteket saját maguktól eltérõnek érzékelik. A különbségek a HLA-tipizálás során nem detektált proteinek széles spektrumában nyilvánulhatnak meg, illetve a HLAtípusban lehetnek alig látható különbségek, amelyek mellett még lehetõség van a transzplantációra, de reakció elõidézésével. A különbségek a megfelelõ HLA-molekulák egyes kodonjaiban (melyek nem tartoznak a HLA-tipizálásra alkalmazott kodonok közé) korlátozottabb polimorfizmust tükröznek. Ismert, hogy – a genetikailag azonos ikrek kivételével – bizonyos fokú inkompatibilitás még akkor is elõfordul, ha az alapos HLA-tesztelés a transzplantáció sikeréhez elégséges hasonlóságot jelez. A HLA-tipizálási eljárásokkal csak olyan polimorfizmusok fedhetõk le, amelyek empirikusan lényegesnek bizonyultak. A HLA-szekvenálásból származó, egyre növekvõ mennyiségû információk segítségével folyamatosan új allélváltozatok bukkannak fel, amelyeket az immunsejtek részben idegenként ismernek fel. A variációk olyan esetekben is nyilvánvalók, ha a donor és a recipiens ellenkezõ nemû. Összefoglalásul; az immunreakciók (pl. GVHD) súlyossága a páciens és a donor között fennálló, molekuláris szinten meghatározott proteinkülönbségek típusától és mértékétõl függ, amit a páciens sejtjei prezentálnak. A GVT-aktivitás legjobban CML-betegekben tanulmányozható, ahol a maradék tumorsejtek donoreredetû immunsejtek (citotoxikus T¹limfocitái) általi felismerése és megsemmisítése kulcsfontosságúnak bizonyul a hosszan tartó molekuláris remisszió indukálása szempontjából. CML esetében az immunszabályozás mechanizmusába történõ további betekintést nyújt az a megfigyelés, hogy a graftok T¹sejt-deplécióját követõen megnövekszik a relapszus kockázata. A relapszus koc-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
kázata graft versus host betegség esetében is növekszik [Goldman és mtsai.: Ann. Intern. Med. 108, 806–814 (1988); Horowitz és mtsai.: Blood 75, 555–562 (1990)]. Ezen túlmenõen a szingén iker csontvelõ-átültetés kevésbé hatásos, mint az egyeztetett testvér csontvelõ-átültetés. Ezek a felismerések együttesen azt jelzik, hogy a tumorsejtek T¹sejt-felismerése kulcsfontosságú elõfeltétele a terápiás hatásnak. Ha a betegség egy látszólag sikeres transzplantációt követõen kiújul, az immunszuppresszív hatóanyagok elhagyásával – vagy még meggyõzõbben, további donoreredetû T¹limfocita infúzióval – teljes remisszió érhetõ el. Ilyenformán az allogén csontvelõ-átültetéssel összefüggõ GVT hatás reprezentálja legmeggyõzõbb bizonyítékát annak, hogy emberekben az immunrendszer képes a rák gyógyítására, és hangsúlyozni kell, hogy a hatékony antileukémiás hatást a recipiensbe átvitt citotoxikus T¹sejtek generálják. A donoreredetû T¹limfociták a GVT hatás eredményeként elpusztítják a visszatérõ leukémiás sejteket, és e jelenséghez feltehetõen az allograftban lévõ CD4+ és CD8+ alpopulációk egyaránt hozzájárulnak. A CD4+ T¹sejtek gyakran helperfunkcióval bírnak az antitest vagy sejt közvetítette immunreakciókhoz, és MHC-II-korlátozottak. A CD8+ T¹sejtek gyakran citotoxikus funkciójúak, és rendszerint MHC-I-korlátozottak. Mind ez idáig még nem azonosították a releváns antigéneket (tumor által expresszált antigének, a recipiens hisztokompatibilitási antigénjei vagy mindkettõ), így a találmány kidolgozása során célul tûztük ki a szóban forgó antigének azonosítását és definiálását. Szembetûnõ, hogy a T¹sejt-depléción átesett graftok összefüggést mutatnak a krónikus myeloid leukémia (CML) relapszusának megnövekedett kockázatával [Goldman és mtsai.: Ann. Intern. Med. 108, 806–814 (1988); Horowitz és mtsai.: Blood 75, 555–562 (1990)]. Ahogy fentebb említettük, donoreredetû limfocita infúzió (DLI) alkalmazásakor az allo-BMT leukémia elleni hatásokat generálhat. Ilyen szituációban a DLI – az esetek akár 70%-ánál – tartós molekuláris remissziót idézhet elõ. Ugyanakkor a DLI jelentõs toxicitással is összefüggésben állhat, amit – a graft versus leukémia hatást gyakran követõ – graft versus host betegség idéz elõ (amelyre csontvelõi aplasiából és/vagy az esetek 50–90%-ánál elõforduló szisztémás graft versus host betegségbõl eredõ jelentõs mortalitás jellemzõ) [S. MacKinnon, Br. J. Haematol. 110, 12–17 (2000)]. A „hagyományos” allo-BMT protokoll toxicitásával összefüggõ hibák kiküszöbölése céljából olyan kondicionáló modellt javasoltak, amely mikofenolát mofetillel (Cellcept®) és ciklosporinnal végzett immunszuppresszióból, valamint minimális mértékben toxikus, alacsony dózisú teljestest-besugárzásból áll. Mindazonáltal a kevésbé szigorú kondicionálás miatt jellegzetes graft versus host reakció volt megfigyelhetõ. Ebben az esetben az infúzió elõtt a T¹sejtek transzplantátumból történõ kivonásával megelõzhetõ a GVHD. E megfigyelések alapján az utóbbi években kifejlesztették a transzplantációs eljárás egy módosított változatát, me-
1
HU 006 857 T2
lyet néha „minitranszplantátum”-nak neveznek. A graft kilökõdésének és a nagyobb relapszusgyakoriság veszélyei úgy küszöbölhetõk ki, ha a graftban a T¹sejtek csak bizonyos hányadát tartják meg. Perifériás vérkészítményekbõl a CD34+ sejtek pozitív szelekciója a T¹sejtek számának hozzávetõleg 1000-szeres csökkenését eredményezi. Az ilyen, elkötelezett és pluripotens õssejteket tartalmazó tisztított CD34+ sejtek alkalmasak az allogén transzplantációra. CML esetén a fokozatosan növelt T¹sejt-dózisok adagolását alkalmazták a graft versus host betegség problémájának részleges megoldására [MacKinnon és mtsai.: Blood, 86, 1261–1268 (1995)], illetve a GVT hatás egyidejû fokozására. Összefoglalásul; az allograft megközelítési módok jövõje a T¹sejt-depletált minitranszplantátumok alkalmazása és (a graftkilökõdés és a GVHD kockázatának csökkentése céljából) az átültetés utáni mérsékelt immunszuppresszió kombinálása felé mutat. Ez várhatóan rendkívüli módon csökkenti az allograft transzplantációval összefüggõ akut toxicitást, ezáltal az allogén csontvelõ-átültetés olyan páciensek esetében is alkalmazható (nagyrészt járóbeteg-ellátás keretében), akik erre korábban alkalmatlannak bizonyultak. Ez a jövõbeli fejlõdés várhatóan elõsegíti a különbözõ humán malignus betegségek kezelésének allogén immunterápián alapuló kezelési stratégiáinak kifejlesztését. A saját és nem saját immunológiai megkülönböztetésével összefüggõ legtöbb kutatási tevékenység a rendkívül polimorf MHC-molekulákra összpontosít (emberekben elsõsorban a HLA-molekulákra, egerekben pedig a H¹2-antigénekre). Mindazonáltal szem elõtt kell tartani, hogy a legtöbb csontvelõ-átültetésnél a donort annak alapján választják ki, hogy HLA-típusa jó vagy tökéletes egyezést mutasson a recipiens HLA-típusával. A HLA-egyeztetett donorok esetében a GVHD és GVT eredete feltehetõen a HLA-tól eltérõ polimorf molekulákkal függ össze. Az utóbbi idõben a csontvelõ-átültetésnél elõforduló GVHD és GVT immunreakciók megfejtésére tett kísérletek számára elõnyt jelentettek a specifikus T¹limfocita irányította reakciók, amelyek során a CTL¹ek – a recipiens HLA I. osztályú molekulái által prezentált – antigéneredetû peptideket ismernek fel. A kísérletek során ezeket a T¹sejteket izolálták és alkalmazták az alloantigének azonosítására. Kiderült, hogy a HLA-tól eltérõ polimorf antigének különbözõségei relevánsak a T¹limfocita irányította GVT és GVHD szempontjából. Ennek megfelelõen a GVHD és GVT immunreakció megértésének kulcsa az ezekben szerepet játszó antigének azonosítása. Az allogén immunreakciók területén végzett kutatások során megfontolták a fentebb említett szempontokat, és egyéb lényeges molekulák azonosítására koncentráltak; ezek az úgynevezett „minor” hisztokompatibilitási antigének (mHAg¹k). E rendkívül diverz molekulák nagy száma (bonyolult és változatos biológiai funkcióikkal párosulva) mind ez idáig meghiúsította a teljes karakterizálást. Az mHAg¹k, lényegükbõl adódóan, immunreakció kiváltására képesek [Lewalle és mtsai.: Br. J. Haematol. 92, 587–594 (1996)], és a T¹sejtes immunrendszer
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
számára specifikus HLA-molekulákhoz kötött peptidekként kerülnek prezentálásra. Ennek megfelelõen ezeket az antigéneket csak a T¹sejtek ismerik fel könnyen, s feltételezhetõ, hogy az mHAg¹k fontos szerepet játszanak a leukémia és egyéb saját antigének elleni CTL-reaktivitás indukálásában (allogén csontvelõ-átültetést követõen). Az eddig azonosított néhány mHAg legtöbbje sajnos nem leukémiaspecifikus, és ezeket a normál szövetek is expresszálják. Az ismert mHAg¹k relatív szöveti expresszióját – rendelkezésre álló reagensek hiányában – eddig nem határozták meg, azonban CTL¹ek alkalmazásával végzett funkcionális analízisek eredményei azt sugallják, hogy sok mHAg szövettípusra korlátozott eloszlású, így csak bizonyos szövetek esetében jelenik meg a kilökõdés kockázata. Szintén érdeklõdésre tarthat számot az a megfigyelés, hogy csontvelõ-átültetés esetén az mHAg indukálta graft versus host betegség klinikai képe több autoimmun betegségre (mint pl. szisztémás erythemás lupus és szklerodermia) emlékeztet, ami arra utal, hogy a krónikus graft versus host betegség tünetei autoimmunszerûek. Az mHAg¹k kódolása a 6. humán kromoszóma HLA-régióján kívül esik, azonban jelentõs immunreakció kiváltására képesek. Annak ellenére, hogy a graft versus host betegség mechanizmusa még nem teljesen tisztázott, elfogadott tény, hogy a páciens mHAgire specifikus donoreredetû CTL¹ek fontos szerepet játszanak a fõ célszervek (beleértve a bõrt, beleket, májat, tüdõt és ízületeket) ellen irányuló, T¹limfocita-vezérelt citotoxikus reakcióban és az abból eredõ – súlyos esetekben halálos kimenetelû – graft versus host betegség manifesztációjában. Bár a GVHD mechanizmusát meglehetõsen részletesen tanulmányozták, az mHAg¹k GVT indukálásában játszott szerepét kevésbé sikerült meghatározni. Ez annak köszönhetõ, hogy a teljes mHAg-készletbõl csak nagyon kevés antigént azonosítottak és vizsgáltak, és a ma rendelkezésre álló technológiákból hiányzik az antigének összehasonlítható módon/számban történõ felismerésére alkalmas eljárás. Másrészrõl, az antigének nélkülözhetetlenek a gyógyító vagy károsító hatásért felelõs CTL-klónok izolálásához és karakterizálásához. Ilyenformán a gyógyító csontvelõ-átültetési megközelítési mód – az érintett immunreakció specifitása vonatkozásában – empirikus diszciplína marad. A páciens és a transzplantációt végzõ orvos rendszerint kizárólag a terápia kimenetelére koncentrál, ami a páciensek többségénél, ahogy fentebb körvonalaztuk, meglehetõsen jól mûködik. Embereknél, bár azonosításuk körülményes, javasolták a GHVD beindításával összefüggõ mHAg-ket, azonban összes számuk és komplexitásuk továbbra is bizonytalan. Az egerekben végzett genetikai kísérletek sok mHAg¹t jeleztek, azonban csak néhány gént azonosítottak. Emberekben a specifikus mHAg-kkel reaktív T¹limfocita klónokat (genetikai kapcsoltsági analízissel kombinálva) használták két különbözõ lokusz ugyanazon páciensben történõ azonosítására, mely lokuszok olyan antigént kódoltak, amelyet a HLA¹B7 prezentál egy
1
HU 006 857 T2
T¹sejt-klón számára. Ezt a technikát in vivo T¹sejt-reakciókat kiváltani képes mHAg¹k számának durva meghatározására javasolták emberekben, azonban eddig nem derült ki, hogy az ilyen T¹sejt-reakciók összefüggésben vannak¹e a klinikai graft versus host betegséggel [Gubarev és mtsai.: Exp. Hematol. 10, 976–81 (1998)]. Hogy teljesebb képet kapjunk arról, milyen tulajdonságok alapján minõsíthetõ egy protein humán mHAgnek, a humán rendszerbõl származó információkat elõnyös az egér rendszerbõl (amelyben korábban további mHAg-ket azonosítottak) gyûjtött adatokkal kiegészíteni. Bebizonyosodott, hogy e proteinek humán homológjait humán alloreaktív citotoxikus T¹limfociták ismerik fel, és ugyanez érvényes egerekben is. Ennek megfelelõen egyre több mHAg (1/A és 1/B táblázat) reakciócélmolekulaként történõ azonosítására került sor, például graft versus host betegségben szenvedõ páciensekbõl származó, izolált CTL-klónok alkalmazásával. A klónok segítségével lehetõvé vált a megfelelõ mHAgkbõl származó peptidkomponensek (HLA-kötõ peptidek) és a felismerésükben szerepet játszó specifikus T¹sejt-klónok vizsgálata. A humán bõr explantátum modell egy olyan megközelítés, amelyet akut graft versus host betegség pontos indikátoraként javasoltak, amely további mHAg-különbségek detektálására lehet alkalmas. Ezt a modellt az esetek 77%-ában alkalmazták a graft versus host betegség kimenetelének megjóslására. Egyéb vizsgálatok, mint pl. a gazdareaktív T¹helper sejt és CTL-prekurzor-gyakoriság, segítettek megjósolni az akut graft versus host betegség elõfordulását HLA-azonos testvér csontvelõ-átültetést követõen [Dickinson, Transplantation 66, 857–63 (1998)]. A T¹sejt-receptor alfa-lánc variábilis régió és T¹sejtreceptor béta-lánc variábilis régió repertoárok analízise azt mutatta, hogy a T¹sejt-receptor-felhasználás a csontvelõ-átültetést követõ korai idõszakban (6–7 héttel utána) aszimmetrikus lett, ami arra utal, hogy a T¹sejtek, reakciójukat illetõen, allogén antigének (pl. mHAg¹k) felé terjeszkedhettek, és hogy a módosult repertoárok végsõ soron thymusfüggõ reakcióúton keresztül, T¹sejt-regenerációval normalizálódnak gyermekekben [Matsutani és mtsai.: Br. J. Haematol. 109, 759–769 (2000)]. A legkorábban azonosított mHAg¹k egyike az SMCY-gén által kódolt H¹Y antigén volt [Meadows és mtsai.: Immunity 6, 273–281 (1997); Wang és mtsai.: Science 269, 1588–1590 (1995)], amely a spermatogenezisben játszhat szerepet. A H¹Y antigének nõi recipiensekben HLA-egyezést mutató férfieredetû szerv kilökõdését és csontvelõ-transzplantátumok kilökõdését, nõi eredetû szervek férfiakba történõ átültetése esetén pedig a graft versus host betegség nagyobb arányú elõfordulását eredményezhetik (különösen, ha a nõi donor terhes volt). Idõközben további H¹Y antigének forrásaként azonosították a DFFRY-gént [Vogt és mtsai.: Blood 95, 1100–1105 (2000)] és az UTY-gént (WO 97/05168, WO0077046). Súlyos graft versus host betegségben szenvedõ páciensek retrospektív vizsgálatával további GVHD-in-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
dukáló antigéneket (név szerint a HA-1, HA-2, H-4, H¹5 és H¹8 proteincsaládot) azonosítottak [Mutis és mtsai.: Nat. Med. 5, 839–842 (1999)]. A HA¹1 antigént HLA–A*0201-korlátozott citotoxikus T¹limfociták segítségével azonosították, és kémiailag nonapeptidként karakterizálták, amely a KIAA0223gén egyik alléljébõl származik. cDNS-szinten a HA¹1 lokusznak két allélja van (HA¹1 H és HA¹1 R), melyek két nukleotidban különböznek egymástól (ami egy aminosavas szubsztitúciót eredményez); lásd den Haan és mtsai.: Science 279, 1054–1057 (1998); Arostequi és mtsai.: Tissue Antigens, 56, 69–76 (2000). A HA¹1 peptidet kódoló kozmid-DNS izolálása és szekvenálása azt mutatta, hogy a HA¹1-alléleket két exon kódolja, és mindkettõ tartalmaz intronszekvenciákat. Két különbözõ primerpárral (allélspecifikus primerekkel és közönséges primerekkel) végzett genomi DNS-tipizálással kimutatták, hogy három – 24 HLA–A*0201-pozitív személybõl álló – családot azonosítottak, amelyek valamennyi esetben korrelációt mutattak a citotoxikus T¹limfocitákon és RT¹PCR¹on alapuló mHAg-osztályozással. A jövõben a HA¹1-allélokra végzett prospektív genomi tipizálás elõsegítheti a donorszelekció javítását és azon HLA–A*0201-pozitív recipiensek azonosítását, akik HA¹1 indukálta graft versus host betegséggel veszélyeztetettek [Wilke és mtsai.: Tissue-Antigens 52, 312–317 (1998); W09905313]. A humán HA¹2 antigén egy HLA-kötõ nonamer peptid, amely I. osztályú miozinból származik (Goulmy és mtsai.: US 5770201). A HA¹1 és HA¹2 mHAg¹k expressziójáról leírták, hogy elsõsorban vérképzési szövetekre (ideértve a leukémiasejteket és leukémiasejt-prekurzorokat) korlátozódik [Mutis és mtsai.: Blood, 93, 2336–2341 (1999)]; fibroblasztokon, keratinocitákon és májsejteken nem expresszálódnak. Ez magyarázatul szolgálhat arra, hogy miért a HA¹1 és HA¹2 mHAg-kre specifikus citotoxikus T¹limfociták közvetítik a donoreredetû vérképzési sejtek HLAA*0201-korlátozott pusztítását. A HB¹1¹et egy másik olyan mHAg-ként írták le, amely HLA-egyezést mutató csontvelõ-átültetésen átesett B¹sejt ALL (B¹ALL) páciensben donoreredetû CTL-reaktivitást váltott ki. A HB¹1 gén által kódolt EEKRGSLHVW peptidet a citotoxikus T¹limfociták HLA-B44-gyel együtt felismerték [Dolstra és mtsai.: J. Exp. Med. 189, 301–308 (1999)]. További vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy egy HB¹1-génen belüli polimorfizmus a peptid 8. pozíciójában egy aminosavas szubsztitúciót (His®Tyr) eredményez, amely kulcsfontosságú a HB¹1-specifikus CTL¹ek által bekövetkezõ felismerés szempontjából. Felvetették, hogy a polimorf HB¹1-antigén B¹ALL-sejtek általi korlátozott expressziója és a HB¹1-specifikus CTL¹ek – peptiddel feltöltött dendritikus sejtek alkalmazásával – in vitro létrehozása lehetõséget biztosít az immunrendszer B¹ALL-sejtekre történõ specifikus irányítására (graft versus host betegség kiváltásának kockázata nélkül). A graft versus host betegséggel összefüggésbe hozható további antigén a CD31. Különbözõ CD31cDNS¹ek közvetlen szekvenálása a protein 125. pozíciójában egy aminosav cseréjét mutatta ki. E két allé-
1
HU 006 857 T2
len kívül egyéb polimorfizmust nem azonosítottak [Behar és mtsai.: N. Engl. J. Med. 334, 286–291 (1996)]. A megfelelõ, HLA-prezentált epitópok jó összefüggést mutattak a CTL¹ek által felismert egyszeres aminosavcserékkel. A HA¹1¹et, HA¹2¹t és egyéb mHAg-ket érintõ, fentebb leírt felismerések azt sugallják, hogy a specifikus T¹sejtek in vivo szelektíven képesek megtámadni a tumorsejteket és különbséget tenni a vérképzési õssejtek és a fibroblasztok által expresszált mHAg¹k között (csak az elõbbieket elpusztítva). Érdekes módon az elõzetesen in vitro „leukémiareaktívvá” tett donoreredetû T¹sejtekkel kezelt páciensben teljes remisszió indukálható [Falkenburg és mtsai.: Blood 94, 1201–1208 (1999)]. Mindazonáltal a GVHD¹t és a GVT¹t indukáló antigének megkülönböztetésének molekuláris alapja továbbra is ismeretlen, és jelenleg nem áll rendelkezésre olyan közvetlen megoldás, amely lehetõvé tenné az mHAg-eredetû HLA-kötõ peptidek azonosítását, és amellyel e peptidek ismert biokémiai szerkezetû proteinekkel lennének összefüggésbe hozhatók. Ezen túlmenõen keveset tudunk a proteinek funkciójáról vagy az mHAg-nek tekinthetõ proteinek számáról. Az mHAggén mutációi gyakoriságának és az egyes egértörzsek közötti mHAg-különbségek számának tanulmányozása alapján az mHAg¹k összes számát 430 és 720 gén közötti értékre becsülték. Mindazonáltal tudomásul kell venni, hogy e vizsgálatok némelyikét bõrgraft-kilökõdési modellekkel végezték, amelyek az mHAg-peptidek bõreredetû dendritikus sejtek általi prezentálásának köszönhetõen rendkívül érzékenyek. Az egyéb szervekbõl (pl. vérképzési rendszerbõl) származó dendritikus sejtek az antigéneket eltérõ módon prezentálhatják, ami sokkal kisebb számú mHAg¹t eredményezhet. Az e megközelítési módon alapuló becslések nagyságrendileg 80 különbözõ proteint jegyeznek. A leukémiás sejtek elleni GVT-reakció célantigénjei azonosítását célzó vizsgálatban Clave és mtsai. [J. Immunother. 22, 1–6 (1999)] kimutatták a myeloid leukémiában túlzott mértékben expresszált primer granulum protein, a proteináz¹3 polimorfizmusát. A vizsgálatot 10, hematológiai betegségektõl szenvedõ pácienssel és HLA-azonos csontvelõdonorjaikkal végezték. Az enzim a myeloid vonal sejtjeiben expresszálódik, myeloid leukémiában (beleértve a CML¹t) azonban túlzott mértékû expressziót mutat [Molldrem és mtsai.: Blood 90, 2529–2534 (1997); Dengler és mtsai.: Brit. J. Haematol. 89, 250–257 (1995)], és a PR1¹re (proteináz-3-eredetû peptid) specifikus citotoxikus T¹limfociták hatékonyan lizálják a CML-sejteket [Molldrem és mtsai.: Blood 90, 2529–2534 (1997). A keringésben lévõ PRl-specifikus citotoxikus T¹limfocitákat számos CML-páciensben kimutatták (beleértve az allogén csontvelõ-átültetéssel kezelt pácienseket is), és jelenlétük jó prognózissal állt összefüggésben [Molldrem és mtsai.: Nat. Med. 6, 1018–1023 (2000)]. Polimeráz-láncreakción (PCR) alapuló egyszálú konformációs polimorfizmus vizsgálattal, majd a PCR-termékek közvetlen szekvenálásával hét egypontos nukleotidpolimorfizmust (SNP) sikerült azonosítani, melyek egyike az aminosavszekvencia 119. pozí-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
ciójában izoleucint vagy valint kódol. A polimorf helyet (a 115–124. aminosavaknál) magukban foglaló peptidekrõl kimutatták, hogy in vitro kötõdnek a HLA–A2 molekulához. Myeloid leukémiában szenvedõ 23 HLA–A2 pácienst (és HLA-azonos donorjaikat) e polimorfizmusra szkríneltek. Négy értékelhetõ páciensbõl (akik legalább egy olyan allélt hordoztak, amely donorjaikból hiányzott) álló csoportban relapszus nem volt megállapítható, míg a többi 15 értékelhetõ páciens közül hétnél jelentkezett relapszus. Ezek az adatok alátámasztják annak lehetõségét, hogy a proteináz¹3 allélkülönbségeire irányuló T¹sejt-reakciók akut és krónikus myeloid leukémia kezelésére szolgáló leukémiaspecifikus adaptív T¹sejt-terápia tervezésének alapjaként használhatók fel. Összefoglalásul; az új mHAg protein jelöltek azonosításának jelenlegi megközelítési módjai fõként az izolált CTL¹ek és/vagy HLA-val eluált peptidek (melyek elsõsorban a GVHD-vel állnak összefüggésben) azonosításán alapulnak, és csak esetenként fordul elõ, hogy ezen antigének a megfelelõ proteineken keresztül kerülnek meghatározásra. Az 1/A táblázatban irodalmi forrásokból összegyûjtött mHAg¹k listáját adjuk meg (egerekre és emberekre). Mind ez idáig nem áll rendelkezésre az mHAg-azonosítást elõreláthatóbbá és gyorsabbá tevõ, jól megalkotott stratégia, így a hozzáférhetõ módszerekkel karakterizált új humán mHAg¹k génjelöltjei csak lassan jelennek meg. A jelenleg ismert szakirodalmi adatok szerint nincs olyan technika, amely könnyebb hozzáférést biztosítana további új mHAg-khez vagy protein jelöltekhez. Ezek feltehetõen diverz és nehezen meghatározható molekularészletek csoportjai, amelyek különféle celluláris háztartási funkciókban szerepet játszó proteinekbõl származnak, és az ezeket kódoló lokuszok elhelyezkedése általában nem ismert. Az mHAg¹k némelyike különféle szövetekben a teljes testben expresszálódnak, míg mások csak korlátozott szöveti eloszlást mutatnak. Ezek vizsgálata eddig nem volt összefüggésben a leukémia elleni reaktivitással – csaknem kizárólag az életveszélyes graft versus host betegség vonatkozásában végezték. Ennek oka, hogy a jelenleg rendelkezésre álló technikák erõteljesen a graft versus host betegséggel összefüggõ mHAg¹k azonosítása felé tolódtak el, és csak szórványosan fordul elõ, hogy egy mHAg alkalmazását betegségmegelõzésre (pl. GVTreakciók indukálására) javasolnák. Érdekes módon a GVHD és GVT immunreakciók karakterizálására szolgáló valamennyi vizsgálat eredménye az a váratlan megfigyelés, hogy az e reakciókban szerepet játszó antigének mHAg¹k, amelyek (a megfelelõ protein szekvenciájában egy aminosavas változást elõidézõ) ritka DNS-mutációkból származó, korlátozott számú polimorfizmusokkal bírnak. Látható továbbá, hogy a GVT-reakciók vagy a GVHD elõidézése érdekében ezen aminosavváltozásokat HLA I. osztályú molekulákon kell prezentálni. Több, a graft versus host betegségben szerepet játszó allogén T¹sejt-klónt izoláltak, melyekrõl kimutatták, hogy specifikusan felismerik a HLA által prezentált peptidek egy aminosavas szubsztitúcióit.
1
HU 006 857 T2
A leukémia, limfoma és myeloma olyan ráktípusok, amelyek a csontvelõbõl és a nyirokszövetekbõl erednek. E betegségeket a vérképzési rendszerbõl származó egyetlen sejt DNS-ének szerzett (és nem öröklött) genetikai sérülése okozza; az ilyen sejt leukémiás klónná alakul, majd folyamatos osztódásba kezd. Ez a korlátlan proliferáció megzavarja a szervezet egészséges vérsejttermelését, lehetetlenné téve a kulcsfontosságú fiziológiai funkciók elvégzését, valamint a fertõzésekkel szembeni védekezést. Az Egyesült Államokban 1999-ben becslések szerint 107 900 embernél diagnosztizáltak leukémiát, limfomát és myelomát, ami az Egyesült Államokban évente diagnosztizált rákos esetek 11 százalékát teszi ki. Jelenleg összesen kb. 632 000 amerikai lakos él leukémiával, limfomával és myelomával. Európára nagyon hasonló adatok állnak rendelkezésre; itt a leukémia, limfoma és myeloma évente kb. 60 500 ember halálát okozza. A leukémia és a limfoma a 35 év alatti fiatal nõk és férfiak leggyakoribb halálos rákbetegsége. A krónikus myeloid leukémia (CML) korai, krónikus szakaszára egy t(9;22) kromoszomális transzlokáció jellemzõ (Philadelphia kromoszóma, Ph), amely a bcrabl onkogént hozza létre. A kimérikus gén terméke egy konstitutív aktivitású tirozin kináz, amely olyan szintézisinhibitorok célpontja, mint pl. az STI571. A krónikus myeloid leukémiás pácienseknek – egyéb tumortípusokat hordozó páciensekkel összehasonlítva – a krónikus fázisban még viszonylag ép immunrendszerük van, és egyre inkább nyilvánvalóvá válik, hogy a bcr-abl peptideket – egyéb, ismeretlen, betegséggel összefüggõ antigénekkel együtt – a HLA-molekulák prezentálják és a T¹sejtek ismerik fel. A betegek fúziós proteinekkel történõ közvetlen immunizálását klinikai ellátásban az allogén csontvelõ-átültetés természetes vagy transzplantáció indukálta immunitást serkentõ képességének vizsgálatára alkalmazták. A kezdeti kísérletek szerint az ilyen vakcinálás biztonságosnak bizonyult: néhány páciensben az immunizáló antigén ellen specifikus T¹sejt-reakciók voltak megfigyelhetõk [Pinilla-Ibarz és mtsai.: Blood 95, 1781–1787 (2000)]. Az akut leukémia továbbra is hatalmas kihívást jelent, s kezelését (kemoterápia, csontvelõ-átültetés vagy sugárkezelés) a betegek citogenetikai profiljából levezetett kockázati profilnak megfelelõen állítják be. A csontvelõ-átültetést azon pácienseknél alkalmazzák, akik a csak kemoterápiával végzett kezelésre gyengén reagálnak. Ahhoz, hogy e pusztító hatású betegségek gyógyítása tekintetében elõrehaladás legyen elérhetõ, az érintett leukémiás klón megsemmisítéséhez vezetõ út elsõdleges lépése a leukémia biológiájának klinikai, celluláris és molekuláris szintû megértése. A vesesejt-karcinóma az összes rákos elhalálozás hozzávetõleg 5%¹áért felelõs. A felismeréskor a páciensek több mint 50%-ában már lokálisan elõrehaladott metasztázisok vannak jelen, és ötéves túlélési rátájuk 20%-nál kisebb. A számos különféle kezelési móddal végzett kísérletek csak csekély elõrehaladást hoztak. Az egy hatóanyagos vagy kombinációs terápiák egyike sem eredményezett 20%¹os vagy nagyobb
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
reakcióarányt. Az interleukin–2¹n és az interferon-a¹n alapuló terápiákat leggyakrabban elõrehaladott stádiumú betegség kezelésére alkalmazzák, ahol alacsony, de reprodukálható reakcióarányok érhetõk el 10–20%¹os nagyságrendben (tartós reakciók esetében 5% vagy még kisebb); lásd Nanus, Curr. Oncol. Rep. 2, 417–22 (2000)]. Mivel a vesesejt-karcinóma érzékeny a citokinvagy interferonalapú immunterápiára, jó okkal hihetõ, hogy az autológ tumorsejtek eliminálásában specifikus T¹sejtek játszanak szerepet [Schendel és mtsai.: J. Mol. Med. 75, 400–413 (1997). Nemrég vesesejt-karcinómába infiltrálódó limfociták közül – IFN-gamma befogásos vizsgálati eljárással – tumorspecifikus T¹sejteket izoláltak [Becker és mtsai.: Nat. Med. 7, 1159–1162 (2001)]. Mindazonáltal a vesesejt-karcinóma antigének (RCC-antigének), illetve a nekik megfelelõ, I. osztályú molekulák által prezentált peptidek hiányos ismerete miatt a T¹sejteknek a vesesejt-karcinóma interferon-alfa-alapú immunterápiájában játszott szerepe alig ismert. A vesesejt-karcinóma immunterápiájára alkalmazható új antigének azonosítása továbbra is kiemelt fontosságú. Az e betegség szempontjából releváns antigének azonosítási eljárásait transzkripciós és proteinexpressziós szinten tárták fel. A nem rákos vesébõl és a vesesejt-karcinómából származó proteázok kétdimenziós gélelektroforézissel (2¹DE) és ezüstfestéssel végzett összehasonlítása jelentõs mértékben eltérõ proteinmintázatokat eredményezett (a vesesejt-karcinóma esetében hozzávetõleg 800 folt, míg a normál vese esetében hozzávetõleg 1400 folt). A 2¹DE immunblottolás öt RCC-specifikus foltot eredményezett, amelyek a vesesejt-karcinómás páciensek szérumával reprodukálhatóan reaktívak voltak, az egészséges donorokéból származóval azonban nem. E két antigén közül kettõt preparatív 2¹DE-vel lett izolálva, és ezek SM22-alfaként (simaizom-protein 22¹alfa) kerültek azonosításra, amely elsõsorban simaizomsejtekben expresszálódó, ismeretlen funkciójú aktinkötõ protein. Az in situ hibridizáció azt mutatta, hogy az SM22-alfa nem a malignus sejtekben, hanem a tumor sztrómájának mesenchimasejtjeiben expresszálódik. A második antigén a karbon anhidráz-I¹et reprezentálja, amely a vesében rendszerint nem expresszálódó izoalak. Érdekes módon szerológiai expressziós klónozással, néhány vesesejt-karcinómában túlzott mértékben expresszálódó antigénként, korábban azonosítottak egy eltérõ izoalakot (CAXII) is. A rekombináns CAI vagy SM22-alfa elleni antitestek 11 vesesejt-karcinómás páciens közül három, illetve öt beteg szérumában kerültek detektálásra, míg 13 egészséges személybõl származó szérum nem adott reakciót. Következésképpen a szerológiai módszerek hasznos eszközök lehetnek a proteomanalízisben, és elõsegíthetik a vesetumorasszociált antigének azonosítását. Mindazonáltal továbbra is szükség van a releváns vesesejt-karcinóma (RCC) antigének azonosítására, és különösen annak kimutatására, hogy ezen antigének alkalmasak¹e rák elleni vakcinálásra.
1
HU 006 857 T2
A vesesejt-karcinóma esete tükrözi a különféle egyéb kemény tumoros betegségek státusát, ahol mindeközben összesen 60 különbözõ proteinantigént (melyek 178 epitópnak felelnek meg) azonosítottak. Ezen antigének (és a megfelelõ T¹sejt-epitópok) közül sokat alkalmaztak a különféle vakcinálási eljárásokban, adjuváns készítményekben és sejtalapú prezentációs rendszerekben immunreakció javítására. A konkrét eljárástól és az alkalmazott antigéntõl függetlenül a kapott eredmények meglehetõsen hasonlóak voltak: klinikai reakció nélküli T¹sejt-aktiválás. Ennek megfelelõen egy napon a vakcinák fontos szerepet játszhatnak a terápiában, azonban a klinikai kísérletekben megfigyelt immunreakciók a túlélési idõ megnövelése vonatkozásában mind ez idáig nem hoztak jelentõs elõrelépést. Mindeközben az allogén csontvelõ-átültetés immunterápiai lehetõségeit, hasonlóan a leukémiánál fentebb leírtakhoz, egyéb betegségekkel (így például enzimhiányos rendellenességek, Fanconi-vérszegénység és thalassemia major) összefüggésben tanulmányozták. Erre fõként az egyre növekvõ klinikai tapasztalatok révén volt lehetõség, és nyilvánvalóvá vált, hogy az allogén csontvelõ-átültetés metasztázisos kemény tumorok (pl. vesesejt-karcinóma) immunterápiájára is alkalmazható. Egy nemrégiben közzétett tanulmányban [Childs és mtsai.: N. Engl. J. Med. 343, 750–758 (2000)] hagyományos citokinterápiára nem reagáló páciensekben a metasztatikus vesesejt-karcinóma tartós regressziójának indukálása céljából nem mieloablatív allogén õssejt-transzplantációt alkalmaztak. A kísérletbe bevont 19 beteg közül tízen (53%) mérhetõ reakciót mutattak, és három betegnél teljes, hosszan tartó reakciót figyeltek meg. Bár ezek az eredmények biztatóak, és egyéb metasztatikus tumorok ellen hasonló kezelési stratégiák alkalmazására ösztönöz, a Childs és mtsai. által alkalmazott eljárás nem teljesen kielégítõ, mivel néhány páciensnél a tumor regresszióját súlyos graft versus host betegség kísérte. E kezelést követõen két beteg meghalt. Bár az eljárás – a komplikációk minimalizálása és hatékonyságának javítása céljából – további finomításokat igényel, az alapelv bizonyítéka már a kezünkben van: az allogén T¹sejtek képesek a vese rákos sejtjeinek elpusztítására, és a donoreredetû limfociták a nem mieloablatív kondicionálást követõen képesek életben maradni. Mindazonáltal e vizsgálat általánosabb üzenete az, hogy az allogén csontvelõ-átültetés kiterjeszthetõ a kemény tumorok kezelésére is. A kemény tumorok (mint pl. a vesesejt-karcinóma) terápiájában a jövõbeli fejlõdés a biztonságosabb és jobban kontrollált (GVHD reakcióktól mentes) tumorellenes immunterápia kifejlesztésének függvénye. A csontvelõ-átültetés sok szempontból hasonló a kemény szervek (pl. vese, szív, máj és tüdõ) átültetéséhez, ahol a szervbeültetés szintén több betegség esetén a választható legjobb kezelési módot jelenti. Bár a jobb immunszuppresszív hatóanyagok fejlesztésében elért elõrehaladás javította az allograftok rövid távú életben maradását, az immunológiai kilökõdés a hosszú idõtartamú túlélés szempontjából továbbra is
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
akadályt jelent. Meggyõzõ bizonyítékok alapján a donor szerve és a páciens közötti hibás egyezés (nevezetesen a hibás mHAg-egyezés) károsan befolyásolja a kemény szerv életben maradását, és elõsegíti a graft versus host betegség kialakulását. Ennek megfelelõen még a hosszú idõtartamú grafttúlélést mutató betegek esetében is gyenge a 10 éves prognózis (az átültetett vesék mindössze 40%¹a marad életképes tíz évnél hosszabb ideig). Nem ismert és tisztázásra vár, hogy e graftok elvesztésében milyen szerepet játszanak a hibás mHAg-egyezések. Ilyenformán a szervtranszplantáció (és különösen a veseátültetés) olyan terület, amelynek elõnye származhat az allogén csontvelõ-átültetésbõl és az allélspecifikus alloantigének azonosításából. Cosimi és mtsai. (Massachusetts General Hospital) beszámoltak arról, hogy a transzplantált vesék azt követõen ültethetõk be, hogy a recipiensek csontvelõt kapnak a donortól, ezáltal a páciensekben T¹sejt-kimérizmus alakul ki [N. Engl. J. Med. 346, 2089–92 (2002)]. A donoreredetû limfociták elméletileg a csecsemõmirigybe (thymus) vándorolnak (a donoreredetû szervbõl származó antigénnel együtt), és az új vese irányába toleranciát indukálnak. Egy még inkább jövõorientált forgatókönyv szerint a toleranciaindukálás a megfelelõ veseeredetû alloantigénekkel végzett vakcinálással segíthetõ elõ, amelyek a jövõben a találmány szerinti megoldás szerint kerülnek azonosításra, elõállításra és bejuttatásra. A jövõbeli kezelések egy köztes formája a vesetranszplantáció mellett allogén csontvelõ-átültetést foglalhat magában, azzal, hogy mindkét graft ugyanazon donorból származik. Az egypontos nukleotidpolimorfizmust (SNP) két DNS-szekvencia közötti mismatchként definiálták [Stoneking, Nature 409, 821–822 (2001)], és egy populáció genomjában lévõ gén szekvenciájának olyan változására vonatkozik, amely egyetlen bázist érintõ változásból ered, amely lehet inszerció, deléció, vagy elõnyösen (ahogy a leírásban használjuk) egy bázis cseréje, ami aminosavcserét eredményez. Az SNP¹k egy gén esetében különbözõ mendeli allélekben manifesztálódnak. A lokusz az a hely, ahol az eltérés van. A nukleotidcsere, ahogy a jelen találmány leírásában értelmezzük, a genom kódolórészében helyezkedik el, és a megfelelõ proteinbe egy alternatív aminosav beépülését eredményezi. Az aminosavcsere érintheti az említett aminosav poszttranszlációs módosításait (pl. glikozilációját). Ilyenformán az SNP egy populációban két vagy több, genetikailag meghatározott alternatív szekvencia vagy allél elõfordulását jelenti, és a populáció tagjainál a nukleinsavszekvenciákban, génexpresszióban (beleértve például a transzkripciót, processinget, transzlációt, transzportot, proteinprocessinget, traffickinget), DNS-szintézisben, termelõdött proteinekben, egyéb géntermékekben vagy a biokémiai reakcióutak termékeiben vagy poszttranszlációs módosításokban bekövetkezõ különbségekként manifesztálódhat. A szakirodalomban az SNP-ket fõként a módosított proteinfunkcióval összefüggésben tárgyalják. Mind-
1
HU 006 857 T2
azonáltal hárombillió DNS-bázis között funkcionálisan releváns SNP¹t találni, és ezeket a néhány millió, ismert hasznos funkció nélküli SNP-tõl megkülönböztetni komoly feladat, ami a posztgenomi kutatások egyik fõ kihívása. Miközben a funkcionálisan releváns SNP-információk létrehozása, ha lassan is, de folyamatosan halad elõre, a humán SNP¹k összes számára és azok egyes génekhez történõ kapcsolására vonatkozó információk különbözõ adatbázisokból (pl. dbSNP, CGAP, HGBASE, JST és GolPoly stb., melyek összegyûjtik és hasznosítják az Egyesült Államokban, Európában, Japánban és Kínában azonosított SNP¹k adatait) hozzáférhetõk. Bizonyos vállalatok, mint a Celera, SNP¹k azonosítására szolgáló eszközöket gyártanak és forgalmaznak, és 2002 végére a humán genom SNP-alapú kapcsoltsági térképét is megalkotják. A Celera-SNP adatbázis 40 vagy 50 egyénbõl származó DNS-szekvenciákon alapul, és ezt az információt használja az SNP¹k „lenyomozására”. Az ilyen adatokhoz való hozzáférés a jövõben lehetõvé teszi az SNP¹k egy specifikus génhez történõ hozzárendelését és a betegséggel összefüggõ SNP¹k megjóslását. Az antigének prezentálása két különbözõ reakcióúton alapul: exogén HLA II. osztályú és endogén HLA I. osztályú reakcióút. Az I. osztályú molekulákat a HLA–A, ¹B és ¹C lokusz kódolja, és úgy tartják, hogy ezek elsõsorban a CD8+ citotoxikus T¹sejteket aktiválják. A II. osztályú HLA-molekulákat a DR¹, DP¹ és DQ¹lokusz kódolja, és ezek elsõsorban CD4+ T¹sejteket (helper és citotoxikus sejteket) aktiválnak. Egy „normális” emberben hat HLA I. osztályú molekula van, rendszerint mindhárom (A, B és C) csoportból kettõ-kettõ. Ennek megfelelõen valamennyi emberben HLA II. osztályú molekulák saját készlete van jelen (a három DP, DQ és DR csoportból kettõ-kettõ). Az A, B és C, illetve DP, DQ és DR csoportok mindegyike több alcsoportra oszlik. Valamennyi géntermék nagymértékben polimorf. Az egyes személyek így különbözõ HLA-molekulákat expresszálnak, amelyek eltérnek a mások által expresszáltaktól (ez okozza a transzplantációkhoz megfelelõ, HLA-egyezõ szervdonorok megtalálásának nehézségét). A HLA-molekulák genetikai változatosságának immunbiológiai jelentõségét tükrözi az „immunreakciós génekként” játszott szerepük. Peptidkötõ képességüknek köszönhetõen bizonyos HLAmolekulák jelenléte vagy hiánya irányítja egy egyén peptidepitópokra való reagálási képességét. Következésképpen a HLA-molekulák határozzák meg a betegségekre vonatkozó ellenálló képességet vagy fogékonyságot. A HLA II. osztályú expresszió az antigénprezentáló sejtekre korlátozódik. Ez összhangban van a helper T¹limfociták funkcióival, amelyek lokálisan aktiválódnak ott, ahol olyan antigénprezentáló sejtekkel (makrofágokkal, dendritikus sejtekkel vagy B¹sejtekkel) találkoznak, amelyek internalizálták és feldolgozták a patogén organizmusok által termelt antigéneket. Az MHC (HLA) I. osztályú molekulák a test valamennyi sejtmaggal rendelkezõ sejtjén expresszálódnak, és a vírusok és egyéb intracelluláris patogének el-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 10
2
leni fõ immunológiai védekezõ mechanizmus részét képezik. Ezek a molekulák I. osztályú láncból (HLA–A, ¹B és ¹C) és oldható b2-mikroglobulinból álló heterodimerekként vannak összeszerelve, amelyek megkötik a sejt belsejében végbemenõ antigénfeldolgozással létrehozott peptideket, és azokat a sejtfelszínre szállítják, ahol e peptideket a citotoxikus T¹limfociták a T¹sejt-receptoron keresztül felismerik. Az I. és II. osztályú reakcióutak nem teljesen különbözõek. Például ismeretes, hogy a dendritikus sejtek – és bizonyos mértékig a makrofágok – képesek az extracelluláris proteinek endocitózisára (pinocitózis), majd azok MHC I. osztállyal összefüggésben történõ prezentálására. Bizonyítást nyert, hogy az exogén antigének szintén képesek az I. osztályú reakcióútba jutni [Rock és mtsai.: Immunol. Today 17, 131–137 (1996)]. Ez specializált célba juttatással érhetõ el, például az antigének vas-oxid-gyöngyökhöz történõ kapcsolásával, és központi mechanizmusnak tûnik az MHC I. és II. osztályú molekulák ugyanazon antigénprezentáló sejten történõ együttes expressziójának jelentõsége miatt, ami három sejttípusos klasztert idéz elõ. Ezt a három sejttípusos interakciós klasztert Mitchinson és mtsai. [Eur. J. Immunol. 17, 1579–83 (1987), majd további szerzõk tárták fel. Kimutatták az I. és II. osztályú epitópok ugyanazon antigénprezentáló sejttel történõ együttes prezentálásának jelentõségét. A CTL-aktiválás nemrégiben feltárt mechanizmusa szerint [Lanzavecchia, Nature 393, 413–414 (1998), Matzinger, Nat. Med. 616–617 (1999)] az antigént MHC II. osztályú MHC¹n keresztül prezentáló professzionális APC-ket T¹helper sejtek ismerik fel. Ez az APC¹k aktiválását eredményezi (amit a T¹helper sejten lévõ CD40 ligand és az APC¹n lévõ CD40 közötti interakció közvetít), és az antigénprezentáló sejtek számára lehetõvé teszi a citotoxikus T¹limfociták közvetlen stimulálását, melyek ezáltal aktiválódnak. Korábban kimutattuk, hogy egy idegen MHC-II-korlátozott T¹helper sejt epitóp saját antigénbe történõ inszerciója olyan antigén létrejöttét eredményezi, amely a nem módosított saját antigén ellen erõteljes keresztreaktív antitestreakciók indukálására képes (vö. WO 95/05849). Bebizonyosodott, hogy az autoantitestindukciót az inszertált idegen epitóp által indukált, specifikus T¹sejt segítség (help) okozza, és várható, hogy a módosított saját antigének – megfelelõ adjuváns segítségével – képesek az MHC I. osztályú antigénekre korlátozott saját epitópok ellen erõteljes CTL-reakciót indukálni. Ilyenformán a WO 95/05849 számú nemzetközi közzétételi iratban feltárt technológia úgy adaptálható, hogy intracelluláris és egyéb (MHC vonatkozásában prezentált epitópokkal bíró) sejtasszociált antigének elleni vakcinálási stratégiák legyenek kialakíthatók. A leggyakoribb I. osztályú allélek (HLA–A1, ¹A2, ¹A3, ¹A11, ¹A24, ¹B7), valamint több fõ II. osztályú molekula HLA-kötõ motívumait már leírták [lásd Rammensee és mtsai.: Immunogenet. 41, 178–228 (1995); Ruppert és mtsai.: Cell 74, 929–937 (1993); Kubo és mtsai.: J. Immunol. 1994; 152: 3913–3924, Kondo és mtsai.: Immunogenet. 45, 249–258 (1997); Southwood
1
HU 006 857 T2
és mtsai.: J. Immunol. 160, 3363–3373 (1998); Geluk és mtsai.: J. Immunol. 152, 5742–5748 (1994)]. Egy kötõmotívum annak alapján karakterizálható, hogy a peptid meghatározott pozícióiban bizonyos típusú (például nagyméretû és hidrofób vagy pozitív töltésû oldalcsoportokat hordozó) aminosavakra van szüksége ahhoz, hogy a HLA-kötõ barázda zsebeiben szoros illeszkedés legyen elérhetõ. Ennek eredménye – a peptid kötõbarázdán belüli maximum 8–10 aminosavas hosszúsági korlátozásával együtt –, hogy nagyon valószínûtlen, hogy az egyik típusú HLA I. osztályú molekulához kötõdõ peptid egy másik típushoz is kötõdjön. Ilyenformán például könnyen megtörténhet, hogy a HLA–A1 és HLA–A2 alcsoportokhoz (melyek egyaránt az I. osztályhoz tartoznak) való peptidkötõ motívum ugyanolyan mértékû különbséget mutat, mint a HLA–A1 és HLA¹B1 molekulákhoz való motívumok. Ugyanezen oknál fogva nem valószínû, hogy a különbözõ II. osztályú molekulák kötõbarázdájában pontosan ugyanazon aminosavszekvenciák helyezkednének el. A HLA II. osztályú molekulák esetén a peptidek kötõszekvenciái hosszabbak lehetnek, és kimutatták, hogy ezek rendszerint 10–16 aminosavat tartalmaznak, melyek közül néhány (egyik vagy mindkét végen) nem része a HLA kötõbarázdához való kötõmotívumnak. Több HLA I. és II. osztályú molekula különbözõ peptidkötõ motívumai között átfedések fordulhatnak elõ. A legalább két különbözõ HLA-molekulához való kötõszekvenciában átfedést hordozó peptideket „egymásba ágyazott” („nested”) T¹sejt-epitópoknak nevezzük. Az ilyen „egymásba ágyazott” epitóp-peptidben lévõ, különbözõ epitópok a peptid antigénprezentáló sejtek által történõ feldolgozás révén alakulhatnak ki, majd különbözõ HLA-molekulákon keresztül prezentálhatók a T¹sejtek számára. Emberekben a HLA-molekulák egyedi változékonysága olyan – egymásba illesztett epitópokat tartalmazó – peptidek létrejöttét eredményezi, amelyek általános vakcinaként elõnyösebbek, mint a csak egytípusú HLA-molekulához kötõdni képes peptidek. Egy egyén hatékony vakcinálása csak úgy valósítható meg, ha a páciensben legalább egy típusú HLA I. osztályú molekula és/vagy HLA II. osztályú molekula képes a vakcinapeptidhez (akár annak teljes hosszúságú alakjához, akár a páciens saját antigénprezentáló sejtjei által feldolgozott alakjához) kötõdni. Egy peptid általános vakcinaként való alkalmazhatósága – a populáció többségére vonatkozóan – növekszik azon különbözõ HLA-molekulák számával, amelyek képesek a peptidhez kötõdni (akár annak teljes hosszúságú alakjához, akár az antigénprezentáló sejtek által feldolgozott alakjához). Az ilyen motívumokat hordozó és különbözõ HLA-molekulákhoz kötõdni képes, antigénnel asszociált peptidek azonosításával a tumorok T¹sejt-epitópon alapuló immunterápia kifejlesztéséhez a humán populáció többségére (>80%) biztosítható lefedettség. Egy gén allélváltozatai által kódolt proteinbõl származó peptidek vakcinaként vagy rákellenes hatóanyagként történõ alkalmazásához (antitumor CD4+
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 11
2
és/vagy CD8+ T¹sejtek létrehozása céljából) a szóban forgó mutáns protein vizsgálatára és olyan peptidek azonosítására van szükség, amelyek – feltehetõen antigénprezentáló sejtek által rövidebb peptidekké történõ feldolgozásukat követõen – T¹sejtek stimulálására képesek. A tumorok – a tumorsejtekben található genetikai eltérések vonatkozásában – általában nagyon heterogének. Ez azt jelenti, hogy egy rákellenes vakcina potenciális terápiás hatása, illetve profilaktikus hatékonysága növekszik azon célmolekulák számával, amelyek ellen a vakcina T¹sejtes immunitást képes kiváltani. Ezen túlmenõen egy többcélú vakcina a primer tumorból származó „escape” változatok kezelése révén csökkenti az új tumor kialakulásának kockázatát is. A T¹sejt-epitópok (peptidfragmensek) HLA I. osztályú molekulán történõ prezentálása, magától értetõdõen, nem csupán a sejtek felismerésére szolgáló jellemzõ, hanem a tumorsejtek és egyéb – alloantigéneket hordozó – sejtek specifikus T¹sejtek általi feltérképezéséhez és elpusztításához szükséges elõfeltétel. Részletesebben: az epitóp létrehozásához a megfelelõ proteineket a proteoszómáknak specifikus C¹terminális aminosavakat tartalmazó peptidekre kell hasítaniuk. A hasított fragmenseket úgynevezett TAP-molekuláknak (antigénfeldolgozással összefüggõ transzportmolekulák) az endoplazmatikus retikulimba kell szállítani, ahol a HLA-kötés bekövetkezik, ha a fragmensek a megfelelõ HLA-kötõ motívumokat tartalmazzák. Ennek megfelelõen elõfeltétel, hogy az immunterápiás alkalmazásra kiszemelt (megfelelõ HLA-kötõ motívumot tartalmazó) célpeptidek a megfelelõ C¹terminális aminosavnál legyenek (proteoszóma által) hasítva. A kiszemelt proteinek megfelelõ proteoszómás hasításának kísérleti úton történõ megállapításához tisztított celluláris 20S proteoszómák alkalmazó in vitro hasítási vizsgálati eljárások (4–24 órás) lettek kifejlesztve, amelyek tömegspektrometriával végzett peptidanalízissel kombinálhatók. Az ilyen kísérletek eredményei azt jelzik, hogy a proteoszómás emésztés és a kötési vizsgálatok kombinálása elõnyös az immunterápiára kiszemelt célpeptidek meghatározására (definiálására), és szakember számára elõnyös lehet a PAProc (http:l/www.paproc.de), amely a betegséggel összefüggõ proteinek általános hasíthatóságának értékelésére kifejlesztett predikciós algoritmus. Napjainkig számos CTL-epitópot azonosítottak, és ezek – ahogy korábban rámutattunk – közös motívumokkal bírnak, melyek bizonyos pozíciókban elõnyös hosszúságúak és aminosav-összetételûek. A megjósolható motívumokat olyan számítógépes programok tervezésére használták fel, amelyek egy adott protein aminosavszekvenciáját CTL-epitópokra „fordítja le”. Az MHC I. osztályú ligandok és CTL-epitópok megjóslásán dolgozó immunológusok számára különösen elõnyös a következõk alkalmazása: SYFPEITHI (http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com) vagy BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla-bind/). A T¹sejt-reakciók in vivo tanulmányozását korlátozhatja az antigénspecifikus T¹sejtek nem specifikus
1
HU 006 857 T2
T¹sejtek sokaságában történõ azonosításának nehézsége. Ez a probléma nagyrészt a T¹sejt-receptor (TCR) és természetes ligandja, a HLA-peptid komplex közötti interakciók kis affinitásának köszönhetõ. A HLA-peptid komplexek tetramer technológiaként ismeretes multimerizációjával e technikai problémák kiküszöbölhetõk a TCR¹HLA interakció affinitásának olyan mértékû növelésével, miáltal az ilyen komplexek a T¹sejtek epitópspecifikus detektálására alkalmas reagensekként válnak alkalmazhatóvá. Az oldható HLA II. osztályú molekula/peptid komplexek létrehozása, talán a II. osztályú peptidkötõ barázda komplexebb szerkezete miatt, még nem kiforrott. E technikai problémák megoldásának ígéretes lehetõsége a rovarsejtekben történõ in vivo expresszáltatás és refolding, valamint a kovalens kötésû peptid-epitópok alkalmazása. A tetramerfestés különösen epitópspecifikus, és e technika alkalmazásával még a nagyon kis populációk is közvetlenül, ex vivo azonosíthatók. Ezek a reagensek – a pontos gyakorisági analízis mellett – az epitópspecifikus T¹sejt-populációk részletes fenotípusos és funkcionális karakterizálását is lehetõvé teszik (egyetlen sejt szintjén), például felületi markerek expressziója, citokinprofilok meghatározása és TCR-repertoár-analízisek. A tetramer HLA-peptid komplexek kötési kinetikája használható eszköznek tûnik az epitópspecifikus T¹sejtek ligandra vonatkozó relatív affinitásának méréséhez. A T¹sejt közvetítette immunreakciók – tetramerek alkalmazásával lehetõvé vált – alapvetõ megismerésén és mennyiségi meghatározásán túl, ez a technológia allogén csontvelõ-átültetésnél a graft versus host betegségben szerepet játszó autoreaktív T¹sejtek eliminálására is alkalmazható. Mindazonáltal egy CTL-epitópnak az ismert predikciós programok alkalmazásával történõ elméleti megjóslása csak ismert antigénekre végezhetõ el. Ilyenformán a vakcinák kifejlesztése szempontjából központi kérdés a védõhatású T¹sejtek által felismert epitópokat hordozó proteinek azonosítása. Ha T¹sejt által felismert peptid I. osztályú molekulák közül eluálva lett létrehozva, a peptidalapú vakcina irányába történõ további fejlesztés idõigényes feladat lehet. A találmány célkitûzése, hogy közelítsük egymáshoz a rákkal és a graft versus host betegséggel összefüggõ proteinantigének megjóslási stratégiáját. A WO 00/42181 számú nemzetközi közzétételi iratban minor hisztokompatibilitási antigéneket, valamint azok alkalmazását tárják fel tumorok diagnosztizálására és kezelésére, beleértve egy nem átfedõ primereket tartalmazó reagenskészletet egyetlen aminosavban eltérõ (SNP-vel összefüggõ) allélváltozat detektálására. E szabadalmi bejelentés speciális célkitûzése alloantigének (mint pl. mHAg¹k) azonosítása és karakterizálása, valamint ezek GVT-ben, graft versus host betegségben és kemény szövet graftok kilökõdésében játszott szerepének meghatározása. E cél érdekében új megoldásokat fejlesztettünk ki alloantigének (és az ellenük irányuló immunrendszer) azonosítására és karakterizálására. További kapcsoló-
5
10
15
20
25
2
dó szempontok közé tartoznak, többek között, az alloantigéneket és mHAg-ket kódoló genetikai lokuszok és allélek azonosítása és az mHAg-antigének/mHAglokuszok és ¹allélek összes számának meghatározására alkalmas technikák javítása. Az immundomináns mHAg-antigének/mHAg¹k azonosítása magában foglalja az antigén természetû peptidek és azok (gyógyításban és betegségben játszott) szerepének vizsgálatát, valamint a relatív gyakorisággal, a peptid HLA¹ra vonatkozó affinitásával és citotoxikus T¹sejt-reakcióval összefüggõ jelentõségük értékelését. Ezen túlmenõen a peptid in vitro immunológiai funkciójának in vivo összefüggései annak megállapítása céljából tanulmányozhatók, hogy az in vitro azonosított immundomináns peptidek in vivo is hasonlóan funkcionálnak¹e. Szintén vizsgálható a különbözõ alloantigének vagy mHAg¹k relatív szöveti expressziója, illetve ezek eltérõ szöveti eloszlásának transzplantátumkilökõdésre gyakorolt hatása. Ezen átfogó információk felhasználhatók – csontvelõ-átültetést követõen megfigyelt – GVT-reakciókat serkentõ megoldások azonosítására (a graft túlélésének meghosszabbítása céljából). A találmány szerinti megoldást alátámasztó kutatási terület magában foglalja, többek között, a következõkben leírásra kerülõ szélesebb körû, illetve specifikus kísérleti példákat. A példákat nem irányelvként, csupán a további kutatások tárgyát képezõ területek szemléltetése céljából ismertetjük.
30
35
40
45
50
55
60 12
A találmány összefoglalása A találmány szerinti megoldás azon a váratlan felismerésen alapul, hogy az egypontos nukleotidpolimorfizmusokat (SNP-ket) hordozó különbözõ gének (melyek közül néhány ismert, a többi pedig korábban ismeretlen volt) rákos betegekben expresszálódnak. A jelen találmány általánosabb szempontjának megfelelõen elsõként tárunk fel olyan eljárást, amellyel funkcionálisan heterogén – a GVHD és GVT immunreakciók indukálásával összefüggõ, korábban mHAg összefoglaló néven említett – proteinantigének csoportja definiálható. Az említett mHAg¹k olyan alloantigének csoportjába tartoznak, amelyek mind ez idáig egyetlen általános azonosítási séma számára sem voltak hozzáférhetõek. A jelen találmány értelmében univerzális eljárást tárunk fel, amely lehetõvé teszi az alloantigének csoportjának felbontását graft versus host betegség kialakulásáért felelõs antigénekre, illetve GVT-reakciót elõidézõ antigénekre. Feltárjuk továbbá, hogy a génekben kódoló SNP¹k eredményeként létrejött, egy aminosavban eltérõ allélváltozatokat rákos sejtek prezentálják, és az említett antigéneket, HLA-molekulákkal összefüggésben (donoeredetû) alloreaktív T¹sejtek ismerik fel, ami az említett sejt elpusztításához vezet. Egy génben egy kódoló SNP a kódolt proteinben egy aminosavas helyettesítést eredményez, amely egy adott személyre öröklött és egyedi. A transzplantáción átesett páciensek (illetve a nem szingén donortól származó csontvelõ-átültetésre vagy õssejt-transzplantációra gyógyászati okokból betervezett) páciensek – az
1
HU 006 857 T2
SNP által kódolt egy aminosavas helyettesítést hordozó géntermékek, illetve az említett T¹sejt-epitópra specifikus alloreaktív T¹sejtek vonatkozásában – kimérikus állapotot képviselnek. Következésképpen a géntermékeket a donoreredetû (gazda) immunrendszer ismeri fel, ami alapot szolgáltat a diagnosztizáláshoz, monitorozáshoz és terápiához. Röviden összefoglalva: a jelen találmány értelmében a GVT¹t és/vagy GVHD¹t beindító alloantigének általános meghatározásának (definiálásának) új koncepcióját tárjuk fel. A találmány kidolgozása során fõ célkitûzésünk olyan peptidekhez való hozzájutás, amelyek egyetlen aminosavcserét hordozó (ráksejtek által termelt és prezentált) proteinek peptidfragmenseinek felelnek meg, melyek T¹sejtek stimulálására alkalmazhatók. Figyelemre méltó, az egy aminosavas szubsztitúció molekuláris alapja, a találmány értelmében, egy allélkülönbség, amely egy normál proteinben egyetlen konzervatív aminosavszubsztitúciót foglal magában. A találmány tárgyához tartozik annak meghatározása, hogy egy csontvelõ-átültetést igénylõ (vagy csontvelõátültetésen már átesett) beteg egy adott proteinben hordoz¹e ilyen aminosavcserét, vagy sem. A találmány egy következõ szempontja annak meghatározása, hogy az említett protein fõként és/vagy szelektíven rákos szövetekre vagy normális szövetekre jellemzõ sejtekben expresszálódik¹e. A találmány egy további célja az említett (célsejteken prezentált) egy aminosavas eltéréseket felismerõ, donoreredetû T¹sejtek meghatározása és kívánt esetben izolálása. Az ilyen T¹sejtek ráksejtekre specifikusnak bizonyulhatnak, mely esetben gyógyászati célra alkalmazhatók, vagy más módon, mindenütt elõforduló proteinantigénekre specifikusnak bizonyulhatnak, s ezáltal graft versus host betegség stimulátoraiként azonosíthatók. A találmány szerinti eljárásokkal kapott peptidek közül néhányról széles körû szöveti eloszlást állapítottunk meg, és ezek graft versus host betegséget indítanak be, ezáltal felhasználhatók immunológiai tolerancia indukálására, míg a kizárólagosan expresszálódóként definiáltak GVT-reakciókat stimulálnak, és a betegség specifikus immunterápiájára alkalmazhatók. A találmány szerinti eljárások T¹sejtes immunitáson alapuló rákterápia kifejlesztését teszik lehetõvé, mely T¹sejtes immunitás a betegekben allogén csontvelõ-átültetéssel és/vagy saját T¹sejtjeik vagy donoreredetû T¹sejtek találmány szerinti peptidekkel in vivo vagy in vitro végzett stimulálásával indukálható citotoxikus T¹sejtes reakció beindítása és immunológiai tolerancia elfojtása céljából. A találmány szerinti eljárások lehetõvé teszik rák kialakulásának megelõzésére vagy már kialakult rák megszüntetésére szolgáló vakcina kialakítását is, amely kizárólag vagy részben olyan peptideken alapul, melyek találmány szerinti peptideknek felelnek meg. A rák elleni védekezés az egy nukleotidban módosult géneket és egy aminosavas szubsztitúciót tartalmazó peptideket hordozó sejtek elleni T¹sejtes citotoxikus aktivitás kialakításával hajtható végre.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 13
2
A találmány szerinti eljárások rákellenes kezelés vagy megelõzés tervezését is lehetõvé teszik, specifikusan ilyen kezelésre vagy megelõzésre szoruló emberek számára adaptálva, mely kezelés vagy megelõzés legalább egy vagy több, találmány szerinti peptid adagolását foglalja magában. Az egyetlen aminosavszubsztitúciót hordozó proteinek normális szöveti expressziója a graft versus host betegség megelõzésével és kezelésével függ össze, míg a szelektált szerv- és/vagy ráksejtspecifikus vagy betegséggel kapcsolatos expresszió terápiás T¹sejtreakciókkal állnak összefüggésben. A találmány e szempontja értelmében az aminosavszubsztitúciót hordozó protein különbségeit elõnyösebb donoreredetû mintában meghatározni, mint egy recipiensbõl származó mintában. A találmányunknak megfelelõen analizált (és a normál szöveti expresszióval korreláló) donor-recipiens különbségek erõteljesen a csontvelõ-átültetés utáni graft versus host betegségre utalnak. Már részrõl, a találmányunknak megfelelõen analizált (és a rákos szövetekben, szervekben és sejtekben kimutatható, betegséggel összefüggõ expresszióval korreláló) donor-recipiens különbségek erõteljesen az allogén csontvelõ-átültetést követõ elõnyös GVT-reaktivitásra utalnak. A rákos sejtekben megtalálható, SNP-ket tartalmazó gének által kódolt, egy aminosavas szubsztitúciót hordozó proteinek fragmenseinek megfelelõ (találmány szerinti eljárásokkal nyert) peptidek nemcsak izolált T¹sejtek létrehozására alkalmazhatók, hanem felhasználhatók a páciensben T¹sejt-reaktivitás indukálására, amely (ahogy fentebb leírtuk) elpusztítja az SNP¹t tartalmazó gént hordozó rákos sejteket is. A találmány szerinti eljárással kapott, eltérõ aminosavat tartalmazó peptidek legalább 8 aminosav hosszúságúak, és – akár teljes hosszúságú alakban, akár az antigénprezentáló sejtek által végzett feldolgozást követõen – megfelelnek az SNP-korrelált géntermékeknek vagy azok fragmenseinek, amelyeket rákos ember betegséggel összefüggõ sejtje termel. A találmány szerinti peptidek jellemzõk a következõk: a) legalább 8 aminosavas hosszúságú és egy rákos sejtben lévõ gén kódoló SNP-jébõl származó, egyetlen aminosavas szubsztitúciót hordozó protein fragmense; b) az egyetlen aminosavszubsztitúciót az említett gén által kódolt proteinszekvencia részekén tartalmazza; és c) teljes hosszúságú (vagy antigénprezentáló sejtek általi feldolgozás utáni) alakjában T¹sejt-reakciókat indukál. A peptidek elõnyösen 8–25, 9–20, 9–16, 8–12 vagy 20–25 aminosavat tartalmaznak. Például a peptidek 9, 12, 13, 16 vagy 21 aminosavat tartalmazhatnak. A találmány szerinti eljárásokkal kapott peptidek legelõnyösebben legalább 9 aminosav (például 9–18 aminosav) hosszúságúak, de – az antigénprezentáló sejtek antigénfeldolgozó képességének köszönhetõen – hosszabb peptidek is alkalmasak a HLAkomplexált peptidek létrehozására. Ilyenformán az egy vagy több egy aminosavas szubsztitúciót hordozó protein teljes aminosavszekvenciája felhasználható a találmány szerinti peptidként vagy proteinként, feltéve,
1
HU 006 857 T2
hogy legalább 8 aminosavat tartalmaz. Fontos megemlíteni, hogy az ilyen polipeptidet kódoló DNS-molekula ugyanúgy alkalmas a találmány szerinti peptid expresszálására és prezentálására. Annak meghatározásához, hogy a találmány szerinti eljárásokkal kapott peptidek alkalmazhatók¹e a jelen találmány szerinti készítményekben és eljárásokban, a következõ lépéseket kell elvégezni: 1. Ráksejtre specifikus gének azonosítása, amelyek az említett sejtben szelektíven expresszálódnak vagy szelektíven és túlzott mértékben expresszálódnak, és annak megállapítása, hogy az ilyen gének mutatnak¹e polimorfizmust az allélspecifikus egypontos nukleotid vonatkozásában (amely a géntermékben egy aminosavcserét eredményez). Egy gén szelektív vagy széles körû expressziós profilja alapján annak meghatározása, hogy az így azonosított peptidek alkalmasak¹e rák kezelésére vagy megelõzésére vagy graft versus host betegség megelõzésére. 2. Annak meghatározása, hogy a peptid polimorf része, amely az egy aminosavas eltérést reprezentálja (akár teljes hosszúságában, akár rövidebb fragmensek formájában), megfelel¹e – T¹sejtek stimulálásához szükséges – HLA I. osztályú T¹sejt-epitópok definíciójának. Adott esetben a következõ lépés is elvégezhetõ: 3. A különbözõ fõ HLA I. osztályú és/vagy HLA II. osztályú molekulákhoz való, egymásba illesztett („nested”) epitópokat tartalmazó peptidek meghatározása és e peptidek alkalmazása a T¹sejtek stimulálására vagy gátlására. Összefoglalásul; a találmány kulcsfontosságú szempontja az SNP-kódolt peptidek azonosítása, amelyek proteinek fragmensei és T¹sejt-epitópok vagy ezek származékai, és természetüknél fogva alloreaktivitással összefüggõ funkcionális vagy immunológiai tulajdonságokkal bírnak, és amelyekben az immunológiai különbséget egy vagy több egy aminosavas helyettesítés határozza meg, amely(ek)et az említett T¹sejt-epitópon belüli SNP kódol. A jelen találmány egy további szempontja értelmében szakember számára ismert, standard eljárások alkalmazásával lehetõvé válik új, releváns alloantigének azonosítása, amelyek felelõsek az mHAg-kkel, GVHD-antigénekkel, GVT-antigénekkel és host versus graft antigénekkel összefüggõ allogén immunreakció indukálásáért. Az itt feltárt eljárások és peptidek alkalmazásával genetikai próbák vagy láncindítók (primerek) állíthatók elõ, amelyek a protein egy aminosavban eltérõ allélváltozatát kódoló génben alloantigének (elsõsorban SNP¹k) szkrínelésére alkalmazhatók. Ezen túlmenõen eljárást tárunk fel egy páciens polimorf génre vonatkozó allélstátusának meghatározására, melynek során (a) a páciensbõl megfelelõ nukleinsavmintát veszünk; és (b) megállapítjuk, hogy az (a) lépésben kapott nukleinsavminta SNP által meghatározott alloantigént kódoló nukleinsav¹e (vagy ilyen nukleinsavból származik), miáltal meghatározható, hogy a páciens az SNP által meghatározott alloantigén génjének egyik vagy másik allélváltozatát hordozza¹e.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 14
2
A találmány értelmében legalább 15 nukleotidos oligonukleotidokat is feltárunk, amelyek specifikusan képesek hibridizálódni az SNP egy aminosavas helyettesítést eredményezõ allélváltozatát kódoló nukleinsavon belüli nukleotidszekvenciával. Feltárunk továbbá olyan, legalább 15 nukleotidos oligonukleotidokat is, amelyek specifikusan képesek a másik aminosavcserét kódoló nukleinsavon belüli nukleotidszekvenciával (a másik allélváltozattal) hibridizálódni, anélkül hogy hibridizálódnának a másik allélt kódoló nukleinsavval. A találmány értelmében feltárunk továbbá egy eljárást annak megállapítására, hogy egy páciens számára elõnyös lehet¹e a rákterápia céljából végzett allogén csontvelõ-átültetés, mely eljárás magában foglalja a következõ lépéseket: (a) a páciensbõl megfelelõ nukleinsavmintát veszünk; és (b) megállapítjuk, hogy az (a) lépésben kapott nukleinsavminta az egyik és/vagy a másik protein allélváltozatot kódoló nukleinsav¹e (vagy ilyen nukleinsavból származik), miáltal meghatározható, hogy a páciens hajlamos¹e graft versus host betegségre vagy GVT-reakcióra. A találmány egy elõnyös szempontja az említett, SNP által kódolt protein-allélváltozat szelektív szöveti expressziójára és eloszlására vonatkozik, és az itt feltárt peptidek szelektív terápiás hatóanyagok elõállítására alkalmazhatók, amelyek olyan betegségek leküzdéséhez szükségesek, mint a rák és/vagy graft versus host betegség. A páciens –, illetve, valójában a donor – immunreakciójának találmány szerinti megoldás értelmében azonosított alloantigénnel történõ serkentése hozzájárulhat az immunterápiák jelentõs mértékû javításához. Ahhoz, hogy egy páciensben védõhatású immunitást alakítsunk ki, a találmány szerinti polipeptidek közül egy vagy több hatásos mennyiségének adjuvánssal együttes adagolására lehet szükség. Az ilyen immunreakció-erõsítõ a kiválasztott immunizálási protokollnak megfelelõen választható ki. A találmány szerinti eljárások lehetõvé teszik olyan eljárás kifejlesztését, amely alkalmas graft versus host betegségre vagy GVT-reakciókra hajlamos páciens kezelésére, oly módon, hogy a graft versus host betegségre vagy rákra hajlamos páciens kezelése céljából az egyik és/vagy a másik protein-allélváltozatot kódoló, izolált nukleinsavat bejuttatjuk a páciensbe, vagy az egyik és/vagy a másik protein-allélváltozat hatásos mennyiségét és gyógyászatilag elfogadhatót adagolunk. A találmány szerinti eljárások lehetõvé teszik olyan eljárás kifejlesztését is, amellyel megállapítható, hogy a páciensben korábbi allogén õssejt- vagy csontvelõtranszplantációt követõen vannak¹e még rákos maradványok; mely eljárás magában foglalja a következõ lépéseket: (a) a beteg vérsejtjeibõl megfelelõ nukleinsavmintát veszünk; és (b) megállapítjuk, hogy az (a) lépésben kapott nukleinsavminta a páciens öröklött saját protein-allélváltozatát vagy a donor allélváltozatát kódoló nukleinsav¹e (vagy ilyen nukleinsavból származik¹e), meghatározva ezáltal, hogy a páciensben jelen van¹e rákos maradvány. Ezen túlmenõen a találmány szerinti eljárás lehetõvé teszi egy eljárás kifejlesztését kémiai vegyület azo-
1
HU 006 857 T2
nosítására, mely képes a páciensben a saját szabályozásukra képtelen sejtek szuppresszálására, mely eljárás magában foglalja a következõ lépéseket: a proteinváltozat egyik és/vagy másik allélváltozatának kémiai vegyülettel történõ érintkeztetése a protein egyik és/vagy másik allélváltozata és a kémiai vegyület közötti kötõdést elõsegítõ feltételek mellett; (b) a kémiai vegyület és a protein egyik és/vagy másik allélváltozata közötti specifikus kötõdés detektálása; és (c) annak megállapítása, hogy a kémiai vegyület gátolja¹e az egyik és/vagy a másik protein-allélváltozatot, azonosítva ezáltal a saját szabályozásukra képtelen sejtek szuppresszálására képes kémiai vegyületet. A jelen találmány fentebb felsorolt és egyéb szempontjai a következõ, részletes leírás és a mellékelt ábrák alapján lesznek érthetõk. A leírásban említett valamennyi hivatkozást teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni. A találmány részletes leírása A találmány értelmében az alloantigének rákterápiában – és általában a transzplantációban – történõ alkalmazásának új koncepcióját tárjuk fel. Az alloantigéneket és T¹sejt-felismerésüket közönséges saját proteinekbõl származó T¹sejt-epitópokon keresztül olyan peptidekként definiáljuk, amelyek egyetlen aminosavcserét hordoznak, mely helyettesítést egy kódoló SNP határozza meg, azzal a feltétellel, hogy az SNP által meghatározott T¹sejt-epitóp nem expresszálódik a donorban, azonban a recipiensben, a betegséggel összefüggõ sejtben expresszálódik, és HLA I. osztályú molekulán kerül prezentálásra. Ahogy korábban említettük, a tumorok elleni T¹sejtes immunitás természetes módon bekövetkezik, mivel nem szokatlan, hogy elõfordulnak tumorasszociált citotoxikus T¹limfociták, amelyek felismerik a rákos sejtekben lévõ saját antigéneket. Mindazonáltal bár a tumorok valamennyi típusában egyre több antigént és T¹sejt-epitópot nyilvánítanak célmolekulának, a terápiás T¹sejt-reakció rendszerint nem éri el a maximálisan lehetséges és kívánt mértékû reakció szintjét, ami annak köszönhetõ, hogy a fertõzésre, immunizálásra és tumorantigénekre történõ reagáláshoz rendelkezésre álló funkcionális T¹sejt-repertoárt olyan mechanizmusok alakítják, amelyek a saját antigének vonatkozásában immunológiai toleranciát alakítanak ki és tartanak fenn – ennek kiküszöbölésének egyik módja egy HLA-egyeztetett személy T¹sejt-repertoárjának találmányunk szerint feltárt alkalmazása. Közismert, hogy a normál szövetek elleni autoimmun támadás megakadályozásához a T¹sejt-repertoár thymusdependens szelektálása során a saját antigénekhez való nagy affinitású T¹sejt-receptorokat expresszáló T¹sejtek megsemmisítésére van szükség. Ezenfelül kizárólag thymuson kívül felismert saját antigének vonatkozásában megnyilvánuló reakcióképtelenség kialakításának egyéb mechanizmusait is leírták, és e két rendszert együttesen a saját antigénekre vonatkozó tolerancia létrehozására alkalmasnak tekintjük. Számos kísérlet bizonyítja, hogy a tumoranti-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 15
2
gének érett T¹sejtekkel való találkozása gyakran tolerancia kialakulását eredményezi, ami immunológiai ignorancia, anergia vagy fizikai deléció miatt következik be [Pardoll: Nature Med., 4, 525–531 (1998) (Staveley és mtsai.: 1998)]. A tolerancia indukciója felelõs lehet továbbá a tumor „immunkikerüléséért”, továbbá ez lehet az oka annak, hogy a jelenleg alkalmazott gyógyászati tumorspecifikus T¹sejt-reakció kialakításának jelenleg in vitro és in vivo alkalmazott módszerei megbízhatatlannak tûnnek. Következésképpen nem meglepõ, hogy a szakirodalomból ismert, több száz T¹sejtepitópnak megfelelõ, több mint hatvan tumorantigén többsége emberekben nem alkalmas hosszan tartó, gyógyító hatású tumorellenes immunreakció indukálására. Az autoantigénekkel eredendõen összefüggõ általános korlátozások kiküszöböléséhez a páciens toleranciastátusának módosítására van szükség, ami jelenleg – a toleranciát szabályozó mechanizmusok elégtelen ismerete miatt – nem lehetséges. A jelen találmány értelmében a jelenlegi rákellenes vakcinálási stratégiák általános gyengeségeit olyan citotoxikus T¹sejt-populációk alkalmazásával küszöböljük ki, amelyek a páciens saját antigénjeivel történõ elõzetes érintkeztetéssel nem lettek deletálva vagy tolerizálva. Az ilyen T¹sejtek HLA-azonos donoroktól férhetõk hozzá, és az elõzõleg allogén csontvelõ-átültetésen vagy hasonló – köldökzsinórvéren vagy mobilizált õssejteken alapuló – kezelésen átesett recipiensekben már megtalálhatók. Miközben az allogén csontvelõ-átültetés egy jól bevált eljárás, amely hatálytalanítja az immunológiai toleranciát, újabb megfigyelés szerint az allogén csontvelõ-átültetés és/vagy az allogén õssejt-transzplantáció T¹sejt-alapú, gyógyító hatású immunterápia alapját képezi, amely elõsegíti a betegség maradványának felszámolását. Az allogén reakció molekuláris háttere részben ismeretlen, és a lényeges felismerések egyike szerint az allogén csontvelõ-átültetésen átesett betegek sokkal jobb helyzetben vannak, mint azok, akik nem jutottak ilyen terápiához. A T¹sejt irányította eljárással elért eredmények és gyógyulási arányok a rák immunterápiájában elért legmeggyõzõbb eredmények között vannak, és a jelen találmány e hatékony mechanizmuson alapul. Megjegyezzük, hogy bizonyos, szervátültetéssel összefüggõ feltételek mellett a donor a polimorf, aminosaveltérést hordozó T¹sejt-epitópokat saját immunsejtjei számára prezentálja, és ez a vérõssejtrendszer elõzetes lecserélése nélkül következik be. Az alloantigének adott fajra jellemzõ antigén természetû peptidek vagy proteinek allélváltozataiként történõ azonosításának általános eljárása egy aminosavas helyettesítések detektálását igényli, és az eljárás a következõ lépéseket foglalja magában: (i) egy rendellenességgel összefüggõ szövetben, szervben vagy ezek részletében kizárólagos jelleggel expresszált vagy túlzott mértékben expresszált protein vagy peptid definiálása;
1
HU 006 857 T2
(ii) az említett faj egy vagy több DNS-könyvtárát tartalmazó adatbázis szkrínelése az említett definiált peptidre vagy proteinre vagy azok részletére; és (iii) a kódolórégiójában legalább egy egypontos nukleotidpolimorfizmust tartalmazó DNS-szekvencia által kódolt peptid/protein allélváltozatok, expressziós termék vagy fragmense aminosavcseréinek azonosítása és szelektálása; (iv) T-sejt-epitópok (9mer–16mer) epitópok létrehozása, amelyek az említett polimorfizmust hordozó aminosavat tartalmaznak; és (v) az MHC proteinkomplexhez kötõdõ, említett epitópok azonosítása. A polimorf, aminosaveltéréses peptidekre (melyek kizárólag a beteg szövetet reprezentáló szövetben, szervben vagy sejtben expresszálódnak vagy expresszálódnak túlzott mértékben) egy vagy több aminosaveltérés expressziója jellemzõ, melyek a proteinek allélváltozatait reprezentálják, melyek mindegyike más és más, betegséggel összefüggõ proteinre specifikus, és ahol az említett több aminosaveltérés legalább 2, legalább 3, legalább 4, legalább 5, legalább 6, legalább 7, legalább 8, legalább 9 vagy legalább 10 ilyen aminosaveltérést jelent. A találmány szerinti, aminosaveltérést hordozó alloantigének számos emberi betegségre (pl. AML, ALL, CML, Hodgkin-kór, limfoma, mielodiszplázia, aplasztikus anémia, vesesejt-karcinóma, graft versus host betegség és host versus graft betegség) specifikusak. A betegséggel nem érintett szövetekben expresszált proteinek egy aminosavas eltérést hordozó allélváltozatait tekintjük a graft versus host betegséget indukáló antigéneknek. A peptidek vakcina formájában betegekbe történõ bejuttatása olyan helyzetet eredményez, amelyben a recipiens HLA-molekulája, valamint a donorból származó antigénprezentáló sejtek a korábbi allogén csontvelõ-átültetésbõl származó, donoreredetû T¹sejtek számára prezentálják az antigént. A donoreredetû sejtek a donor vérképzési õssejtjeibõl is felszaporíthatók és differenciálhatók, vagy közvetlenül kinyerhetõk a donorból és a recipiensbe ültethetõk át, mely eljárás általánosan „donor limfocita infúzióként” (DLI) ismeretes. Ezek a T¹sejtek a páciensben – HLA-val összefüggésben prezentált antigénnel történõ találkozás hatására – könnyen aktiválhatók. A T¹sejtek ex vivo stimulálása és páciensbe történõ bejuttatása az aktivált citotoxikus T¹sejtek létrehozásának alternatív módjaként szolgálhat. Másrészrõl, az olyan betegségek esetében, amelyek például tolerancia indukálásával függenek össze, a páciens autológ T¹sejtjeinek megfelelõ aktiválására van szükség. A találmány értelmében feltárjuk az allogén csontvelõ-átültetésen alapuló terápiás protokollok molekuláris alapját, és definiáljuk azon antigén természetû peptideket és immunterápiás eljárásokat, amelyek a jelenleg alkalmazott eljárásokkal elérhetõhöz hasonló vagy annál jobb gyógyhatású immunreakciót indukálnak, azonban ezeknél jobban elõrejelezhetõ és kevésbé toxikus módon hajtható végre. A találmány szerinti meg-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 16
2
oldás kulcsfontosságú eleme, hogy az immunológiai tolerancia a HLA-azonos donorok T¹sejt-repertoárjának felhasználásával kiküszöbölhetõ. Ahogy azt az allogén csontvelõ-átültetés esetében már bemutattuk, a T¹sejtreakciók a fõ HLA-típusú eltérésektõl különbözõ antigének ellen irányulnak, amelyek a graft versus host betegség és a GVT-reakció részét képezik. Egy betegséggel összefüggõ proteinben az egyszeres konzervatív aminosavcsere analízise a genetikailag öröklött polimorfizmusok általános elvén alapul, ami a páciensek és donorok polimorf proteinek státusára vonatkozó tesztelését igényli. A találmány értelmében a kódoló SNP alloantigén kifejezés arra utal, hogy minden egyes egyén a mendeli törvények szerint egy gén egyik vagy másik vagy mindkét kódoló SNP-változatát hordozza, és az egyik vagy másik vagy mindkét polimorf aminosaveltéréses proteinváltozatot expresszálja, mely változatokra az jellemzõ, hogy a protein adott pozíciójában az egyik vagy a másik aminosav van jelen. Az aminosaveltéréses alloantigének allélváltozatainak diagnosztizálása a következõk szerint végezhetõ el: megváltoztatott aminosavat tartalmazó expressziós termék vagy egy expressziós termék HLA-val komplexált fragmense (amely magában foglalja az egy aminosavas szubsztitúciót) analízise, vagy egy páciensbõl izolált biológiai minták – SNP módosította nukleinsavrészlethez specifikusan kötõdõ – ágenssel történõ érintkeztetésével (ahol az SNP¹t hordozó nukleinsavmolekula elsõsorban vagy kizárólag a beteg szövet vagy szerv sejtjeiben expresszálódik). Az analízis elvégzéséhez összeállítjuk az ágenseket (a kódoló egyszálú nukleinsavmolekulát tartalmazó nukleinsavmolekulát, komplementer nukleinsavat vagy fragmensét), és a célgénnel elvégezzük a hibridizációs vizsgálatokat. Más módon, az alkalmazható olyan antitest, amely az expressziós termékben lévõ, egy aminosavszubsztitúciót hordozó allélváltozathoz kötõdik. Alkalmazhatók továbbá olyan antitestek is, amelyek egy HLA-molekulából és egy aminosaveltéréses allélváltozat fragmensébõl álló komplexhez kötõdnek. A kiválasztott eljárásnak megfelelõen különösen elõnyös az SNP által módosított nukleinsav nukleinsavmolekula analízisét olyan mintákkal elvégezni, amelyek betegséggel összefüggõ szövetekbõl, szervekbõl vagy sejtekbõl származnak. A proteinekben a terápiához megfelelõ egy aminosavas eltérések diagnosztizálását és kiválasztását elõnyösen a donorra és a recipiensre egyidejûleg végezzük, és egyszerûen kombinálhatjuk egyéb molekuláris diagnosztizálással (pl. HLA-tipizálással) is. Az eltérések tesztelését hatékony eszközzel, DNS-array formátumban is végezhetjük. Mindezeken túlmenõen a találmány szerinti megoldás értelmében a specifikus donoreredetû immunsejtek (nevezetesen a szóban forgó aminosavban eltérést hordozó donoroktól származó specifikus citotoxikus T¹limfociták) a recipiensben képesek felismerni az adott peptidpozícióban lévõ aminosavváltozatot, és az ilyen peptidet prezentáló célsejt ellen citotoxikus reakciót képesek indukálni.
1
HU 006 857 T2
A találmány értelmében számos új antigént vontunk vizsgálat alá és írtunk le, melyek nem csupán az allogén csontvelõ-átültetés és a GVT további finomítására, hanem betegek kezelésére is alkalmazhatók. Mivel a recipiensek saját T¹sejt-repertoárja az SNP által kódolt aminosavat reprezentáló homológ, expresszált allélváltozat vonatkozásában toleráns, illetve deletált, a HLAazonos donor repertoárja csak ritkán tartalmaz olyan citotoxikus T¹limfocitákat, amelyek HLA I. osztályú molekulák vonatkozásában specifikusan felismerik a T¹sejt-epitópot, és elpusztítják a prezentáló sejteket. Az ilyen, úgynevezett alloantigénre korlátozott („allorestricted”) citotoxikus T¹limfociták szelektíven azokat a tumorsejteket pusztítják el, amelyek egy specifikus SNP által meghatározott peptid aminosaveltérést tartalmazó allélváltozatát expresszálják. Feltéve, hogy az SNP által meghatározott T¹sejt-epitóp korlátozott szövet¹, szerv- vagy tumorspecifikus expressziós mintázatú proteineket reprezentál, a találmány szerinti megoldás tumorterápiára és egyéb állapotok általános kezelésére alkalmazható. Mivel a szakirodalomban számos szelektíven expresszált tumorantigént leírtak, szakember számára kézenfekvõ, hogy a találmány szerinti megoldás bármely – tumor¹, szövet¹, szerv- vagy sejtspecifikusként feltárt – protein vagy DNS-szekvenciára alkalmazható. A leukémia, limfoma és myeloma vérképzési eredete, az érintett beteg sejtek klonális eredete, valamint a differenciálódási klaszterekbe (CD) tartozó proteinek korlátozott expressziós mintázata különösen elõnyös az új koncepció demonstrálására. Mind a leukémiás vérsejtek, mind a differenciálódási klaszterekbe tartozó proteinek a vérképzõ rendszerbõl (pl. vérõssejtekbõl) származnak, ezáltal a leukémia, limfoma és myeloma olyan betegségek, amelyek a találmány szerinti megoldás alkalmazásával különösen jól értékelhetõk és gyógyíthatók. Egy másik szempont, amely a leukémia, limfoma és myeloma kezelését különösen ígéretessé teszi, abból adódik, hogy az allogén csontvelõ-átültetés során a páciensek teljes, csontvelõi õssejtekbõl kialakuló vérképzõ rendszere a donor véreredetû õssejtjeivel vagy csontvelõi õssejtjeivel kerül helyettesítésre, melyek azután kialakítják az összes vérsejtet (köztük az érintett limfocitákat). A rákeredetû betegségek közül a leukémia képezi azon betegségcsoportot, amely a találmány szerinti megoldás értelmében elõnyösen kezelhetõ. E csoporton belül a krónikus myeloid leukémiás (CML) betegek azok, akik számára a kezelésbõl a legnagyobb elõny származhat, míg az AML és ALL kezelése kevésbé elõnyös, de még mindig elõnyösebb, mint a limfomáé. A nem hematológiai betegségek közül e terápia elsõ számú célbetegsége az RCC, ugyanakkor a melanoma is kezelhetõ a találmány szerinti megoldás alkalmazásával. A találmány értelmében az antigének ez idáig ismeretlen belsõ molekuláris variabilitását használjuk fel az allogének új, általános karakterizálási rendszerének kidolgozásához, új alloantigének definiálásához és az alloantigének ellen irányuló immunreakció oly módon tör-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 17
2
ténõ „feldarabolásához”, hogy lehetõség nyíljon a graft versus host betegség megelõzésére, s közben a GVTreakció felerõsítésére. A találmány szerinti megoldás kielégíti a hatékony rákellenes vakcinák kifejlesztésének igényét, illetve annak elõfeltétele, és olyan kapcsolódó elõnyöket biztosít, mint a csontvelõ és a kemény szervtranszplantátumok tartós túlélése a recipiensekben, valamint a rákdiagnosztizálás. A találmány speciális megvalósítási módjai a gének egyszeres aminosavcseréket kódoló allélváltozatainak (általánosabban, alloantigének) említett eljárással történõ azonosítására vonatkoznak, mely eljárás a következõ lépéseket foglalja magában: a) Adott szövetben, szervben vagy betegséget okozó sejttípusban szelektíven expresszált vagy túlexpresszált releváns gének és megfelelõ proteinjeik szkrínelése, melyek a betegséggel nem összefüggõ, normális szövetekben vagy sejtekben jellemzõen kisebb mértékben expresszálódnak. b) Az (a) lépés szerint elõszelektált gének szkrínelése korábban ismert SNP¹k jelenlétére, ahol az egyes gének kódoló egypontos nukleotidváltozásai közvetlenül egy vagy több – jelenleg publikus doménen hozzáférhetõ vagy kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ – SNP-adatbázisból nyerhetõk. c) Az (a) lépés szerint elõszelektált gének (amelyeknek DNS-adatbázisokban nem találhatók elõzetesen ismert SNP összefüggései) szkrínelése homológ DNS-szekvenciák összehasonlításával és a génre jellemzõ variábilis pozíciók, illetve a proteinpolimorfizmusok illesztõ („alignment”) programmal (pl. BLAST) végzett detektálásával. d) Ismeretlen SNP-ket hordozó polimorf gének azonosítása indirekt eljárások (pl. a kívánt géneket lefedõ EST-szekvenciák/aminosavszekvenciák illesztése) alkalmazásával, ahol a különbözõ EST-adatbázisok hatalmas mennyiségû szekvenciainformációt szolgáltatnak az azonos szekvenciaszakaszok, átfedõ vagy részlegesen azonos DNS-szekvenciaszakaszok tekintetében, ami az SNP¹k szekvenciaillesztési technikák alkalmazásával történõ azonosítását és a megfelelõ gén annotációját teszi lehetõvé. e) A betegséggel összefüggõ SNP-ket hordozó – az (a)–(d) módszerek szerint elõzetes szkrínelésnek alávetett – gének és/vagy proteinek validálása szervi és/vagy szöveti eloszlásuk meghatározásával. f) Annak megállapítása, hogy az azonosított peptidek (akár teljes hosszúságú alakban, akár rövidebb fragmensekként) képesek¹e a T¹sejtek stimulálására; a T¹sejt-epitópok vagy egymásba illesztett epitópok különbözõ fõ HLA I. osztályú és HLA II. osztályú molekulákhoz lokalizálása; és a megfelelõ peptidek alkalmazása T¹sejtek stimulálására vagy gátlására A találmány értelmében javasolt diagnosztikai alkalmazások közé tartozik, többek között, a rák és/vagy csontvelõ-átültetés, õssejt- és szervtranszplantáció. A megfelelõ donorok vagy recipiensek azonosításának elõsegítésére, ahogy azt a következõkben részle-
1
HU 006 857 T2
tesen ismertetjük, különféle – a specifikus nukleinsavszekvenciák amplifikálásán vagy a proteinen vagy peptideken alapuló – technikák alkalmazhatók. A találmány egyik megvalósítási módja értelmében eljárást tárunk fel CD¹klaszter antigének alléljeinek tipizálására egy mintában, mely eljárás polimorf nukleotidok kimutatását foglalja magában az említett allélek (közelebbrõl az egyes gén alléljainak) cDNS vagy genomi nukleinsavaiban. Az egyik elõnyös megvalósítási mód szerint az említett tipizálási eljárás genomi DNS-tipizálás. Alternatív módon az említett eljárás cDNS-tipizálási eljárás is lehet. a) A mintában lévõ genomi polinukleinsavak legalább egy pár primerrel történõ érintkeztetése, miáltal a primerpár specifikusan hibridizálódik a flankingrégiókhoz (az említett allélekben ezek tartalmazzák a polimorf nukleotidot); és amplifikációs reakció végrehajtása. b) Az említett legalább egy láncindító pár mindegyikére kimutatjuk, hogy az (a) lépésben képzõdött¹e amplifikációs termék. c) A (b) lépésben kapott eredménybõl következtetünk arra, hogy az említett mintában mely SNP-allél van jelen. A fentebb bemutatott eljárás egy elõnyös megvalósítási módja értelmében az eljárásra jellemzõ, hogy az SNP által definiált alloantigének említett alléljei a donoreredetû alléltól és a recipiensben lévõ alléltól egyaránt eltérnek. A humán genom SNP-változékonyságának megfelelõen egy adott egyén egy adott gén két kópiáját hordozza, melyeket szüleitõl örökölt. A kópiák az öröklöttõl eltérõ vagy ahhoz hasonló allélpárt reprezentálhatnak, így szakember számára érthetõ, hogy a templátként mRNS¹t alkalmazó RT¹PCR vagy a templátként genomi DNS¹t alkalmazó standard PCR rutinszerûen alkalmazható SNP által kódolt aminosaveltérést hordozó allélváltozatok diagnosztizálására. A normális genetikai programmal vagy rendellenes expressziós mintázattal (pl. vérráksejtek) bíró vérsejtek mindegyike felületén a normális leukociták által expresszált, jellemzõ molekulakészletet hordozza. A leukociták felületén lévõ sejtvonalmarkerek és egyéb differenciálódási markerek antileukocita monoklonális antitestekkel rutinszerûen detektálhatók, és az antigéneket szisztematikusan – differenciálódási klaszter (CD) antigénként kijelölve – nevezzük el. Az e rendszerre vonatkozó információk számos forrása férhetõ hozzá az interneten; az egyik ilyen elõnyös weboldal lehet a következõ: http://www.vetmed.wsu.edu/tkp/Search.asp A leukociták által hordozott felületi molekulák korábbi kijelölésének széles körben elfogadott alapelvei, és az a tény, hogy a vérõssejtek valamennyi vérsejt közös eredetét képezik (beleértve vérráksejteket is), a CD¹antigéneket a találmány szerinti ideális antigénjelöltekké teszik. Az allogén õssejt-transzplantációt igénylõ páciensekben a kóros vérsejtrendszert reprezentáló valamennyi sejt (új vérképzõ rendszer felépítése során) a donoreredetû õssejtrendszer általi helyette-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 18
2
sítésre kerül, következésképpen, hogy a recipiens teljes eredeti immunsejt- és vérsejtrendszerét eliminálni kell. E tekintetben a CD¹antigének egyetlen „szervet” reprezentálnak, és rendkívül hasznosak a találmányi gondolat gyakorlati megvalósítására. A jelen találmány értelmében feltárjuk, hogy a jelenlegi CD¹rendszerben hozzáférhetõ több száz ismert leukocita-protein közül hogyan lehet kiválasztani a bizonyos véreredetû ráktípusokra legjobban jellemzõket. A példákban (az e területen dolgozó szakemberek által elismert és alkalmazott) specifikus CD¹antigéneket és betegséggel való kapcsolatukat ismertetjük. Jelenleg az elõre definiált CD¹proteinek analízise jelenti a leukémia és a limfomák diagnosztizálásának és stádiumaik megállapításának alapját. Mindazonáltal fontos tudni, hogy a találmány elsõsorban nem az itt megadott leukocita-antigének elõszelekciójára korlátozódik, hanem bármely szövetspecifikus vagy egyéb módon szelektíven expresszált proteinre vagy proteincsoportra alkalmazhatók. A találmány e vonatkozásának megfelelõen CD¹proteineket tárunk fel, amelyek immunogén aminosavcserét tartalmaznak, amely egy oldható alloantigén polimorf részletére jellemzõ, és amelyet molekuláris szinten egy kódoló SNP határoz meg. A betegségre jellemzõ, és aminosavcserét hordozó alloantigénekként minõsített említett CD¹proteineket a 2. táblázatban foglaljuk össze. Az itt leírt általános kitanítás alapján szakember számára nem okoz gondot egy, a szakirodalomból már ismert alloantigén (vagy további új, a szakirodalomban eddig még fel nem tárt vagy e leírásban nem említett alloantigén) definiálása. Ennek megfelelõen a találmány oltalmi köre nem korlátozódik csupán a 2–5. táblázatokban megadott alloantigének és T¹sejt-epitópok szelekciójára. Az egyik megvalósítási mód értelmében a találmány szerinti oldható alloantigén – elõzetesen allogén transzplantáción átesett páciensekben – immunreakciót indukál. Egy másik megvalósítási mód szerint az antigének HLA-molekulával összefüggésben történõ prezentálást követõen citolitikus aktivitást indukálnak. Az immunizálásra és citolízis indukálására különösen alkalmas aminosavszekvenciák a 3–5. táblázatokban bemutatott szekvenciákból álló csoportból (és azok változatai közül) választhatók ki. Mindazonáltal ahogy korábban említettük, az alloantigének feldolgozása in vivo nagyon változó lehet, és az aminosavcserét reprezentáló aminosavtól N¹ és/vagy C¹terminális irányba esõ szakaszok a bemutatott szekvenciáktól jelentõs mértékben eltérhetnek. Szakember számára nem okoz gondot a HLA-variabilitás vizsgálata és a HLA-kötõ peptid valós, illetve megjósolt variabilitásának egymáshoz viszonyítása. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány szerinti megoldással definiált, oldható alloantigén a páciensekben olyan immunreakciót indukál, amely kulcsfontosságú az immunológiai tolerancia kialakítása szempontjából. Az immunológiai tolerancia indukálása különösen elõnyös a graft versus host betegséggel összefüggõ antigén vonatkozásában, amelyet poli-
1
HU 006 857 T2
morfként és különbözõ szövetekben és szervekben (pl. tüdõ, máj, belek, ízületek stb.) széleskörûen expresszálódóként definiáltak. Az immunizálásra és toleranciaindukálásra különösen elõnyös aminosavszekvenciák az 1/A és 1/B táblázatban felsorolt mHAgszekvenciák közül és a 6. táblázatban felsorolt HLAszekvenciák (illetve ezek változatai) közül választhatók ki. A HLA-antigén a szakirodalomból ismert, és allogén immunreakciót beindító fõ antigénként definiálták. Ezen túlmenõen a molekulákon belüli antigén természetû szakaszok jól dokumentáltak, és különféle típusú detektáló ágensek állnak rendelkezésre. Mindazonáltal a találmány szerinti megoldás azért terjed ki a HLAmolekulákra, mert a 6. táblázatban felsorolt epitópok a (HLA-molekula-szintû egyeztetéshez általában alkalmazott) hipervariábilis antigénrégiókon kívül esõ proteinrégiókból lettek kiválasztva. Ilyenformán ezeket az antigéneket SNP által kódolt aminosavcseréknek kell tekinteni (ahogy azt a találmány értelmében definiáljuk). A T¹sejt-epitópok jellemzõen az õssejt- és szervtranszplantációval összefüggõ graft versus host betegség megelõzésére alkalmazhatók. Egy következõ megvalósítási mód értelmében az immunogén aminosavcserét tartalmazó alloantigénre a találmány szerinti polipeptideket kódoló DNS-szekvenciák jellemzõek, így például, többek között, izolált nukleinsavmolekulák, az ilyen molekulákat hordozó expressziós vektorok, valamint az ilyen molekulákkal transzformált vagy transzfektált gazdasejtek. A találmány tárgyához tartoznak továbbá izolált proteinek, peptidek, az ilyen proteinek és peptidek elleni antitestek, valamint az ilyen proteineket és peptideket felismerõ citotoxikus T¹limfociták is. A találmány tárgyához tartoznak az elõzõek fragmensei (köztük a funkcionális fragmensek) és változatai is. Feltárunk továbbá ilyen találmány szerinti molekulákat tartalmazó reagenskészleteket is. Mindezek olyan állapotok diagnosztizálására, monitorozására, kutatására vagy kezelésére alkalmazhatók, amelyek egy vagy több, rákkal összefüggõ alloantigén expressziójával jellemezhetõk. A jelen találmány kidolgozása elõtt mindössze néhány alloantigén génjét (pl. mHAg¹k génjeit) azonosították. A jelen találmány egy következõ szempontjának megfelelõen fúziós proteineket tárunk fel, amelyek egy elsõ és/vagy egy második találmány szerinti T¹sejt-epitópot tartalmaznak, vagy más módon, találmány szerinti polipeptidet és egy ismert tumorantigént (vagy a találmány szerinti epitópot immunogénné tevõ idegen epitópot) tartalmaznak. A találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazható egyetlen anyag vagy több, különbözõ anyag, sõt, anyagok nagyméretû sorozatai és kombinációi is alkalmazhatók. Például a találmány szerinti eljárásokban és termékekben alkalmazható SNP¹t hordozó egyetlen gén, az ilyen gén által kódolt egyetlen protein, annak egyetlen funkcionális fragmense, a protein elleni egyetlen antitest stb. Hasonlóan, diagnosztizálásra, monitorozásra és terápiára alkalmazhatók az ilyen anyagok (és adott esetben egyéb, rákkal összefüggõ alloantigének génjei, az ilyen gének géntermékei vagy
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 19
2
szokványos tumorantigének) párjai, csoportjai vagy akár sorozatai is. A párok, csoportok vagy sorozatok 2, 3, 4, 5 vagy több gént, génterméket, fragmenst vagy ilyen anyagokat felismerõ ágenst tartalmazhatnak. Az ilyen anyagok sokasága nem csupán az SNP által kódolt módosítást hordozó géntermékeket expresszáló sejtek monitorozására, tipizálására, karakterizálására és diagnosztizálására alkalmazható, hanem terápiás célra is felhasználhatók. Ennek egyik példája nagyszámú ilyen anyag profilaktikus vagy akut alkalmazása rák megelõzésére, kialakulásának késleltetésére, csillapítására stb. történõ alkalmazása ilyen géneket expresszáló (vagy a jövõben expresszáló) sejtekben. A találmány szerinti alkalmazhatóság szempontjából a gének, géntermékek (illetve a géneket, géntermékeket felismerõ anyagok) bármely kombinációja tesztelhetõ és azonosítható. Túl hosszadalmas lenne az összes ilyen kombináció felsorolása; szakember számára – különösen a találmány kitanítása alapján – könnyen meghatározható, hogy adott körülmények között mely kombinációk a leginkább alkalmasak. Ahogy a további leírásból érthetõ lesz, a találmány szerinti megoldásnak egyaránt vannak in vivo és in vitro – például terápiás, diagnosztikai, monitorozási és kutatási célú – alkalmazásai. A találmány egyik szempontja a találmány szerint azonosított gének közül többet expresszáló sejt „ujjlenyomatának” megalkotása, például az ilyen termékek expressziójának mennyiségi meghatározása alapján. Az ilyen ujjlenyomatok, például állatmodellekben kimutatott GVT és GVHD hatás rákterápiára vonatkozó megjóslása. A sejtek arra vonatkozóan is szkrínelhetõk, hogy expresszálnak¹e találmány szerint azonosított, SNP módosította géneket. A találmány egyik szempontjának megfelelõen eljárást tárunk fel terápiás szempontból releváns – kódoló SNP¹t hordozó nukleinsavmolekula által kódolt – alloantigén és rákkal összefüggõ antigén diagnosztizálására. Az eljárás magában foglalja egy betegbõl izolált biológiai minta érintkeztetését olyan ágenssel, amely specifikusan kötõdik egy kódoló SNP¹t hordozó nukleinsavmolekulához, annak expressziós termékéhez vagy az expressziós termék – MHC-molekulával (elõnyösen HLA-molekulával) komplexált – fragmenséhez, ahol a kódoló SNP által definiált molekula az 1–6. táblázatokban felsorolt alloantigének közül, nukleinsavmolekula formájában választható ki, és az ágens és a kódoló SNP¹t hordozó nukleinsavmolekula, annak expressziós terméke vagy az expressziós termék fragmense közötti interakció meghatározására alkalmazható. A találmány egy következõ szempontja értelmében eljárást tárunk fel terápiás szempontból releváns és rákkal összefüggõ – kódoló SNP¹t hordozó nukleinsavmolekula által kódolt – alloantigén diagnosztizálására, mely eljárás magában foglalja a következõ lépéseket: csontvelõ-átültetésre donorként alkalmasnak tekintett páciensbõl izolált biológiai minta érintkeztetése olyan ágenssel, amely specifikusan képes kötõdni egy kódoló SNP¹t hordozó nukleinsavmolekulához, annak expressziós termékéhez vagy az expressziós termék –
1
HU 006 857 T2
MHC-molekulával (elõnyösen HLA-molekulával) komplexált – fragmenséhez, ahol a kódoló SNP¹t hordozó nukleinsavmolekula az 1–6. táblázatokban felsorolt alloantigének közül van kiválasztva (nukleinsavmolekula formájában); és az ágens és a kódoló SNP¹t hordozó nukleinsavmolekula, annak expressziós terméke vagy az expressziós termék fragmense közötti interakció meghatározása. Egy másik megvalósítási mód szerint a kódoló SNP¹t hordozó nukleinsavmolekula vagy peptidfragmense antitesttel detektálható. Az egy aminosavas módosítást hordozó expressziós termék, amely MHC-molekulával, elõnyösen HLA-molekulával van komplexálva, antitesttel detektálható, vagy alternatív módon, a HLA-val komplexált peptid közvetlenül alkalmazható sejtek diagnosztizálására és aktiválására vagy gátlására. A rendellenességek különféle, rákkal összefüggõ antigén-prekurzorok expressziójával karakterizálhatók, melyek kódoló SNP által módosított géneket hordoznak. Ennek megfelelõen a diagnosztikai eljárásokban több ágens is alkalmazható, melyek mindegyike más-más humán rákkal összefüggõ SNP¹t hordozó antigén-prekurzorra (köztük a találmány szerinti, rákkal összefüggõ antigén-prekurzorok legalább egyikére) specifikus, és ahol a „több” ágens legalább 2, legalább 3, legalább 4, legalább 5, legalább 6, legalább 7, legalább 8, legalább 9 vagy legalább 10 ágenst jelent. A fenti megvalósítási módok mindegyikében az ágens humán betegségre specifikus, elõnyösen rákkal összefüggõ antigén-prekurzor lehet, ideértve a jelen találmány értelmében feltárt, veserákkal és vérrákkal összefüggõ antigén-prekurzorokat. A 2–6. táblázatokból kiválasztott fragmens mérete legalább 8 nukleotid, 10 nukleotid, 12 nukleotid, 14 nukleotid, 16 nukleotid, 18 nukleotid, 20 nukleotid, 22 nukleotid, 24 nukleotid, 26 nukleotid, 28 nukleotid, nukleotid, 50 nukleotid, 75 nukleotid, 100 nukleotid, 200 nukleotid, 1000 nukleotid és valamennyi egész nukleotidszámú köztes hosszúság. A molekula olyan polipeptidet vagy polipeptidfragmenst kódol, amely humán HLA-receptorhoz vagy humán antitesthez kötõdik. Egy fentebb leírt, izolált nukleinsavmolekulát tartalmazó expressziós vektor mûködõképesen promoterhez van kapcsolva. A találmány értelmében egy expressziós vektor – promoterhez mûködõképesen kapcsolva – olyan nukleinsavat tartalmaz, amely egy SNP által módosított molekula. A találmány egy további szempontja szerint az expressziós vektor SNP által módosított molekulát és egy – MHC-molekulát, elõnyösen HLA-molekulát kódoló – nukleinsavat tartalmaz. A találmány tárgyához tartozik az 1–6. táblázatokban felsorolt molekulák közül kiválasztott polipeptidek fragmense is, amely immunogén sajátságú. Az egyik megvalósítási mód szerint a fragmens – vagy annak egy részlete – HLA-hoz vagy humán antitesthez kötõdik. A találmány egy további szempontjának megfelelõen humán rákkal összefüggõ antigén-prekurzor izolált fragmensét tárjuk fel, amely (vagy amelynek részlete) HLA-hoz vagy humán antitesthez kötõdik, és a prekurzort egy kódoló SNP¹t hordozó nukleinsavmolekula kódolja, amely az 1–6. táblázatokban felsorolt moleku-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 20
2
lák közül van kiválasztva. A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a fragmens a HLA-val alkotott komplex része. Egy másik megvalósítási mód szerint a fragmens 8–12 aminosav hosszúságú. A találmány egy további szempontjának megfelelõen immunsejtek létrehozhatók in vitro, a limfociták a 2–5. táblázatokban felsoroltak közül kiválasztott (az alloantigén immunogén aminosavcseréjét reprezentáló – molekulákkal együtt végzett tenyésztésével, ahol az allélváltozat a páciens tumorsejtjei által expresszált változatnak felel meg. Az ilyen eljárás értelmében az alloantigének alkalmazásával a donor citotoxikus és helper T¹sejtjei (amelyek egy aminosavat érintõ változást hordozó antigént ismernek fel) in vitro olyan módszerrel hozhatók létre, amely gátolja a T¹sejteknek a gazda leendõ hisztokompatibilitási antigénjeire irányuló reaktivitását, meghagyva ezáltal az alloreaktív tumorspecifikus T¹sejtek populációját. Egy további – hisztokompatibilis testvérrel rendelkezõ vagy nem rendelkezõ páciensek esetében alkalmazható – megközelítési mód jól tolerált kondicionálási sémákat foglal magában, amelyek a graft versus host betegséget indukáló (találmány szerint definiált) alloantigének vonatkozásában immunszuppressziót okoznak, anélkül hogy a csontvelõ eltávolítására lenne szükség. Ezek az eljárások jelentõs mértékben javíthatnák az utóbbi években leírt klinikai vizsgálatok eredményeit, amelyeknél más indikációk (ideértve a kemény tumorokat és a kemény szervek transzplantációját) esetében nem myeloablatív õssejt-transzplantációt alkalmaztak. Ha ezt a megközelítési módot például rák kezelésére alkalmazzuk, a recipiensbe T¹sejt-depletált vérképzési õssejteket ültetünk be (melyek nem lökõdnek ki), majd egyre nagyobb számú donoreredetû T¹sejtet (vagy tumorspecifikus T¹sejtet) adagolunk, melyeket az alloantigének felismerésére vonatkozóan óvatosan stimuláltunk. E megközelítési módnál különösen elõnyös, ha a donoreredetû T¹sejteket – tumorellenes aktivitásuk serkentése céljából – ex vivo vagy in situ olyan HLA-kötõ peptidek segítségével expandáljuk, amelyek az alloantigén immunogén aminosavcseréjét reprezentálják (a 2–5. táblázatokban felsoroltak közül kiválasztott peptidek). Adoptív immunterápiás célokra elegendõ számú citotoxikus T¹limfocita nyerhetõ, következésképpen a csontvelõ-átültetés után romlott állapotú leukémia kezelésének új terápiáját teszi lehetõvé (graft versus host betegség indukálásának minimális kockázatával). Más lehetõség szerint az alloantigénre specifikus (egy aminosavas módosítást felismerõ) specifikus donoreredetû limfociták szakirodalomból ismert öngyilkos gén (pl. herpes simplex vírus timidin kináz génje) in vitro inszertálásával manipulálhatók. Ez a kezelõorvos számára lehetõséget biztosít az infúzióval bejuttatott limfociták kontroll nélküli graft versus host betegségben szenvedõ páciensekben történõ elpusztítására. Egy következõ – találmány szerinti eljárások alkalmazásával megvalósítható – megközelítési mód az allogén csontvelõ-átültetéshez alkalmas donorok transzplantáció elõtti immunizálását foglalja magában, amely
1
HU 006 857 T2
recipiens által definiált, egyetlen aminosavban módosított rák alloantigén vakcinával kerül végrehajtásra, amely fokozza a GVT-aktivitást, anélkül hogy graft versus host betegséget indukálna, mivel a donoreredetû T¹sejtek a feltételezett egy aminosavas módosítást hordozó antigének ellen vannak aktiválva, melyek csak a tumorsejteken találhatók meg. Összefoglalva; a találmány szerinti megoldás elõsegíti a csontvelõ-átültetéssel és egyéb, transzplantációval összefüggõ eljárásokkal kapcsolatos toxicitás és mortalitás kiküszöbölését. Az alloantigénekkel végzett vakcinálást igénylõ esetek elõnyösen kis tumorterheltséggel, illetve nagyobb tumorterheltség esetén tumorspecifikus T¹sejtek adoptív transzferével jellemezhetõk. Mindazonáltal a tumor CTL-epitópokat tartalmazó vakcinákkal végzett vakcinálás kimenetele nagyban függ az epitóp-célbajuttatás módjától. Meglepõ módon az MHC I. osztályú kötõdésû peptidekkel végzett vakcinálás – immunitás helyett – fokozott tumornövekedéssel párosuló CTL-toleranciát okozhat. Ezek az eredmények rámutatnak annak lehetõségére, hogy vakcinálás alkalmazásával tolerancia indukálható a graft versus host betegséget indukáló alloantigének ellen. A tolerancia indukálásának gátlásával ellentétben az antigénprezentáló sejtek módosítása az immunizálásra vonatkozó érzékenység növelésének ígéretes stratégiája (Sotomayor, 1999). Az alloantigénekkel végzett immunizálási eljárások részletes leírását a találmány leírásának kísérleti részében ismertetjük. A HLA genotípusazonos transzplantátumok recipienseit illetõen az alloantigénekben megnyilvánuló diszparitásokat a találmány értelmében az határozza meg, hogy hordoznak¹e SNP által kódolt aminosavcserét. Az SNP definiálta alloantigén lokusz genetikai azonosítása allélspecifikus PCR eljárásokkal végezhetõ. A donor és a recipiens közötti különbségeket általában két különbözõ láncindítókészlettel analizáljuk. Mindegyik láncindítókészlet allélspecifikus láncindítókból és közönséges láncindítókból áll, és mindkét láncindítókészlet tartalmazhat intronszekvenciákat. A megjósolt allélspecifikus termékek minden esetben összefüggésbe hozhatók az SNP által kódolt aminosavcserével, amely biokémiai módszerekkel, antitestekkel, citotoxikus T¹limfocitákkal vagy RT¹PCR eljárással detektálható. Ahogy a találmány leírásában bemutatjuk, a további új, SNP által kódolt alloantigének azonosítása felhasználható az SNP által kódolt alloantigénallélek prospektív genomi tipizálásra és a csontvelõ-átültetésen átesett recipiensek – graft versus host betegség kis vagy nagy kockázata, illetve a javított GVT vonatkozásában történõ – azonosítására. Az e célra alkalmas SNP¹k szekvenciaspecifikus módon – hibridizációs, láncindító-hosszabbítási (primer extenziós) vagy DNS-ligálási megközelítés alkalmazásával – detektálhatók. A szakember a következõkben felsorolt megoldások közül választhatja ki a megfelelõt, és az antigénanalízis a kiválasztott megközelítési módra specifikus standard eljárásokkal végezhetõ el. 1. A hibridizációs megközelítés két allélspecifikus próbán alapul, amelyek csak tökéletes illeszkedés ese-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 21
2
tén hibridizálnak a célszekvenciához. Optimalizált vizsgálati feltételek mellett az egybázisos „mismatch” kellõ mértékben destabilizálja a hibridizációt ahhoz, hogy megakadályozza az allélspecifikus próba célszekvenciához történõ bekötõdését („annealing”). Ha az allélspecifikus próbák szilárd hordozón vannak rögzítve, a megjelölt cél-DNS-minták befogásra kerülnek, és a hibridizációs eseményt a meg nem kötött célszekvenciák lemosása után a jelölõ detektálásával tesszük láthatóvá. 2. A láncindító-hosszabbítás az allélok megkülönböztetésének egy másik nagyon hatékony mechanizmusa. Rendkívül rugalmasan alkalmazható, és a legkisebb számú láncindítóra, illetve próbára van hozzá szükség. A próba tervezése és a vizsgálati eljárás optimalizálása rendszerint nagyon kézenfekvõ. A láncindító-hosszabbítási megközelítésnek számos változata létezik, melyek a DNS-polimeráz azon képességén alapulnak, hogy a templát-DNSszekvenciájával komplementer, specifikus dezoxiribonukleozidokat építenek be, mindazonáltal alapvetõen két kategóriába sorolhatók be. Részletesebben: a cél-DNS-ben lévõ polimorf bázis azonosságát allélspecifikus nukleotid beépítésével, majd szekvenálással határozzuk meg. Allélspecifikus PCR¹t alkalmazva a DNS-polimeráz csak akkor amplifikálja a cél-DNS¹t, ha a PCR-láncindítók tökéletesen komplementerek a cél-DNS-szekvenciával. Számos ötletes módszert dolgoztak ki a láncindító-hosszabbítás termékének homogén tesztekkel történõ vizsgálatára. E megközelítési módok többsége az új nukleinsavanalógokat kombinálja a kiindulási reagensek és a láncindító-hosszabbítási termékek fizikai tulajdonságai közötti érdekes különbségek monitorozásával. Az allélspecifikus PCR esetén arra támaszkodunk, hogy a DNS-polimeráz csak akkor hosszabbítja meg a láncindítót, ha az 3’¹végén tökéletesen komplementer a templáttal. Ha ez a feltétel teljesül, PCR-termék képzõdik. Annak meghatározása alapján, hogy képzõdik¹e PCR-termék, következtethetünk a cél-DNS¹en található allélra. A specifikus PCR-termékek képzõdésének homogén vizsgálati eljárásokkal történõ detektálására számos innovatív megközelítést alkalmaznak, melyek közül néhány olvadási görbe analízisen, néhány pedig célszekvencia-specifikus próbák hibridizációján alapul. E megközelítés egyik változata az allélspecifikus láncindító-hosszabbítás, mely módszernél a polimorf helyet tartalmazó PCR-termék szolgál templátként, és a láncindító-hosszabbítási próba 3’¹vége maga az allélbázis. A láncindító hosszabbítása csak akkor következik be, ha a 3’¹bázis komplementer a cél-DNS-ben jelen lévõ alléllal. A láncindító-hosszabbítási esemény nyomon követésével lehetõség nyílik arra, hogy következtessünk a DNS-mintában található allél(ek)re. A DNS-ligáz nagymértékben specifikus a DNS-molekulákban lévõ hasadások („nick”) javításában. Ha egy templát-DNS-hez két szomszédos oligonukleotid hibridizálódik, csak akkor ligálódnak össze, ha a kapcsolódási helynél mindkét oligonukleotid tökéletesen megfelel a templátnak. Ennek megfelelõen az allélspecifikus
1
HU 006 857 T2
oligonukleotidokkal „lekérdezhetõ” a polimorf helyen lévõ bázis természete, azaz a ligálás bekövetkezésének meghatározása alapján következtethetünk arra, hogy a cél-DNS-ben allél(ek) van(nak) jelen. Bár az összes megkülönböztetõ mechanizmus közül a ligálást jellemzi a legmagasabb szintû specifitás, és ezt a legkönnyebb optimalizálni, a ligálás a leglassabb és a legtöbb módosított próbát igénylõ reakció. Mindazonáltal a ligálás, mint mechanizmus, a célszekvencia elõzetes PCR-amplifikációja nélkül alkalmas a genotipizálásra. Pozitív allél reakciótermék a kibocsátott fény detektálásával, a termékek tömegének mérésével vagy a termékek képzõdésekor bekövetkezõ elektromos tulajdonságváltozás detektálásával mutatható ki.
5
10
15 Definíciók A következõ definíciókat a leírásban gyakran alkalmazott kifejezések megértésének elõsegítése céljából ismertetjük. Az „alloreaktív” kifejezést az egyes személyekben eltérõ polimorf T¹sejt-epitópok leírására használjuk, amelyeket specifikusan T¹sejtek ismernek fel. Ahogy a leírásban használjuk, az „antitestek” közé tartoznak a poliklonális és monoklonális antitestek, a kimérikus, egyláncú és humanizált antitestek, valamint az Fab-fragmensek (beleértve az Fab vagy egyéb immunglobulin expressziós könyvtárak termékeit). A „CD-proteinek” sejtvonal-specifikus sejtfelületi markerek, amelyek a sejtek normál genetikai programja vagy rendellenes (kóros) expressziós sémák szerint termelõdnek. A CD¹proteinek általában a vérképzési rendszerbõl származó sejtekkel állnak összefüggésben. A sejtmarkereket a differenciálódási klaszterek (CD) tudományos konszenzus alapján megalkotott standard nevezéktana alapján nevezik el. A CD¹proteinek detektálására fluoreszcensen jelzett, monospecifikus immunológiai reagenseket és áramlási citometriát (a sejtpopulációk számlálásához és analíziséhez) kombináló eljárással detektálhatók. A sejteket méret, markerreaktivitás, klonalitás és arány szerint osztályozzák. Az eljárást, amely szakember számára jól ismert, klinikailag széleskörûen alkalmazzák leukémia, limfomák és ezekkel összefüggõ állapotok diagnosztizálására, prognosztizálására, visszamaradt betegség értékelésére, terápiás nyomon követésre és esetkezelésére. Alkalmazásával különféle szövetek és testfolyadékok analizálhatók. A kiértékelések minõségének és klinikai alkalmazhatóságának biztosítása érdekében valamennyi citometriai adatot a minta mikroszkópos felülvizsgálatával összefüggésben értékelünk. A rákmarkerek „immunfenotipizálása” rendszerint egy kétlépcsõs festési eljárást foglal magában. Az elsõ lépésben a sejtekhez (korábban felsorolt) antigénspecifikus egéreredetû monoklonális antitesteket adunk. A monoklonális antitestek kötõdését FITC-vel konjugált antiegér¹Ig antiszérum alkalmazásával végzett immunfluoreszcens technikával értékeljük. Az antigének eloszlását áramlási citometriával és fénymikroszkópos vizsgálattal analizáljuk. Az immuntipizálás eredményei általában a minta kézhezvételétõl számított 24 órán be-
20
25
30
35
40
45
50
55
60 22
2
lül rendelkezésre állnak, és citometriai marker százalékokat adnak. Amennyiben szükséges, morfológiai és marker expressziós szint (intenzitás) vizsgálat is végezhetõ. Az antigénexpresszió intenzitása a passzálások között változhat, és a sejttenyésztési feltételek befolyásolhatják. Az „izolált” kifejezésen valaminek természetes állapotából „emberi kéz által” történõ megváltoztatását értjük, vagyis ha eredeti állapotában a természetben fordult elõ, akkor környezete meg lett változtatva vagy környezetébõl el lett távolítva (vagy mindkettõ). Például egy természetes állapotában élõ organizmusban található polinukleotid vagy polipeptid nem „izolált”, de a természetes állapotában vele együtt létezõ anyagoktól elválasztott ugyanezen polinukleotid vagy polipeptid – a találmány leírásának szóhasználata szerint – izoláltnak számít. Ezen túlmenõen egy organizmusba transzformációval, genetikai manipulációval vagy bármely más rekombináns módszerrel bejuttatott polinukleotid vagy polipeptid „izolált”, még akkor is, ha az említett organizmusban (amely élõ vagy élettelen egyaránt lehet) található. A „polinukleotid” kifejezés általában poliribonukleotidra (RNS) vagy polidezoxiribonukleotidra (DNS) vonatkozik, amely módosítatlan vagy módosított RNS vagy DNS egyaránt lehet. A „polinukleotidok” közé tartoznak, többek között, az egy- és kétszálú DNS¹ek, az egy- és kétszálú régiók keverékeként létezõ DNS¹ek, egy- és kétszálú RNS¹ek, az egy- és kétszálú régiók keverékeként létezõ RNS¹ek, valamint olyan hibrid molekulák, amelyek egyszálú vagy (gyakrabban) kétszálú (vagy egy- és kétszálú régiók keverékébõl álló) DNS¹t és RNS¹t tartalmaznak. Ezen túlmenõen a „polinukleotid” kifejezés jelentése kiterjed a háromszálú régiókat tartalmazó RNS¹re, DNS¹re vagy RNS¹re és DNS¹re is. Ezenfelül a „polinukleotidok” közé tartoznak az egy vagy több módosított bázist tartalmazó DNS¹ek vagy RNS¹ek, valamint a stabilitás érdekében vagy más okból módosított molekulagerincet tartalmazó DNS¹ek vagy RNS¹ek. A „módosított” bázisok közé tartoznak például a tritilezett bázisok és a ritka bázisok, mint pl. az inozin. A DNS-ben és RNS-ben különféle módosítások hajthatók végre; így a „polinukleotid” kifejezés jelentése magában foglalja a természetben megtalálható, kémiailag, enzimatikusan vagy metabolikusan módosított polinukleotidalakokat, valamint a vírusokra és sejtekre jellemzõ DNS és RNS kémiai alakjait. A „polinukleotid” kifejezés magában foglalja a viszonylag rövid polinukleotidokat is, melyeket gyakran oligonukleotidoknak nevezünk. A „polipeptid” kifejezés tetszõleges polipeptidre vonatkozik, amelyben két vagy több aminosav peptidkötésekkel vagy módosított peptidkötésekkel (peptid-izoészterek) kapcsolódik egymáshoz. A „polipeptid” kifejezés jelentése egyaránt kiterjed a rövid láncokra, melyeket általánosan peptideknek, oligopeptideknek vagy oligomereknek nevezünk, illetve a hosszabb láncokra, melyeket általánosan proteineknek nevezünk. A polipeptidek tartalmazhatnak a 20, gén által kódolt aminosavtól eltérõ aminosavakat is. A „polipeptidek” közé tar-
1
HU 006 857 T2
toznak a természetes folyamatok (pl. poszttranszlációs érés) következtében vagy a szakirodalomból jól ismert kémiai technikák eredményeként módosított aminosavszekvenciák is. Az ilyen módosítások leírása megtalálható az alapvetõ kéziratokban és a részletesebb monográfiákban, valamint a terjedelmes tudományos szakirodalomban. A módosítások a polipeptid bármely részében elõfordulhatnak, így pl. a peptidvázban, az aminosav-oldalláncokban és az N¹ vagy C¹terminálison. Ugyanazon típusú módosítás (azonos vagy változó mértékben) egy adott polipeptidben több helyen is elõfordulhat, továbbá egy adott polipeptid többféle típusú módosítást is tartalmazhat. A polipeptidek ubitikinálódás következtében ágazhatnak el, illetve – elágazással vagy elágazás nélkül – ciklikusak is lehetnek. A ciklikus, elágazó és a ciklikus elágazó polipeptidek természetes poszttranszlációs folyamatok eredményei lehetnek, illetve szintézises módszerekkel állíthatók elõ. A módosítások közé tartoznak a következõk: acetilezés, acilezés, ADP-ribozilálás, amidálás, biotinilálás, kovalens flavinkapcsolás, hem-egység kovalens kapcsolása, nukleotid vagy nukleotidszármazék kovalens kapcsolása, lipid vagy lipidszármazék kovalens kapcsolása, foszfotidil-inozitol kovalens kapcsolása, keresztkötésképzés, gyûrûvé zárás, diszulfidkötés kialakítása, demetilálás, kovalens keresztkötések kialakítása, cisztin kialakítása, piroglutamát kialakítása, formilezés, gamma-karboxilezés, glikozilálás, GPI-horgony létrehozása, hidroxilezés, jódozás, metilálás, mirisztoilálás, oxidáció, proteolitikus érés, foszforiláció, prenilezés, racemizálás, szelenoilálás, szulfatálás, aminosavak proteinekhez történõ, transzfer-RNS közvetítette hozzáadása (pl. arginilezés) és ubikitinezés [lásd pl. „Proteins – Structure and Molecular Properties”, 2. kiadás, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); Wold, F.: „Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects”, 1–12, in Post-translational Covalent Modification of Proteins, szerk.: B. C. Johnson, Academic Press, New York (1983); Seifter és mtsai.: „Analysis for protein modifications and no protein cofactors”, Meth. Enzymol., 182, 626–646 (1990), és Rattan és mtsai.: „Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging”, Ann. NY Acad. Sci., 663, 48–62, 1992]. Egy polipeptidszekvencia „fragmense” olyan polipeptidszekvencia, amely rövidebb, mint a vonatkoztatási szekvencia, de amely lényegében a vonatkoztatási szekvenciáéval azonos biológiai funkciót és aktivitást képes kifejteni. Egy polinukleotidszekvencia fragmense olyan polinukleotidszekvencia, amely rövidebb, mint a vonatkoztatási génszekvencia. A „változat” kifejezés olyan polinukleotidra vagy polipeptidre vonatkozik, amely eltér a vonatkoztatási polinukleotidtól, illetve polipeptidtõl, de megtartja annak kulcsfontosságú tulajdonságait. Egy polinukleotid jellemzõ változata a nukleotidszekvenciában tér el a vonatkoztatási szekvenciától. A nukleotidszekvenciában bekövetkezõ változások a vonatkoztatási polinukleotidszekvencia által kódolt polipeptid aminosavszekvenciáját nem befolyásolják. A nukleotidcserék a vonatkozta-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 23
2
tási szekvencia által kódolt polipeptidben aminosavak szubsztitúcióját, addícióját vagy delécióját okozhatják, illetve fúziókat vagy hasításokat eredményezhetnek (lásd lentebb). Egy polipeptid jellemzõ változata aminosavszekvenciájában tér el a vonatkoztatási polipeptidtõl. A módosítások általában csak olyan mértékûek, hogy a vonatkoztatási polipeptid és a változat szekvenciája összességében közel hasonló, számos régióban pedig azonos. A változat és az eredeti polipeptid aminosavszekvenciája egy vagy több szubsztitúcióban, inszercióban és delécióban térhet el egymástól (bármely kombinációban). Egy szubsztituált vagy inszertált aminosav a genetikai kód által kódolt vagy nem kódolt egyaránt lehet. A jellemzõ konzervatív szubsztitúciók közé tartoznak a következõk: Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; és Phe és Tyr. Egy polinukleotid vagy polipeptid változata természetben elõforduló (pl. egy allél) vagy természetben nem elõforduló lehet. A polinukleotidok vagy polipeptidek természetben nem elõforduló változatai mutagenizálási technikákkal vagy közvetlen szintézissel állíthatók elõ. Szintén a változatok közé tartoznak az egy vagy több poszttranszlációs módosítást (pl. glikozilációt, foszforilációt, metilezést, ADP-ribozilálást stb.) hordozó polipeptidek. Az ilyen módosítások megvalósítási módja közé tartozik az N¹terminális aminosav metilezése, a szerinek és treoninok foszforilálása és a C¹terminális glicinek módosítása. Az „allél” kifejezés egy génnek a genom adott lokuszán elõforduló két vagy több alternatív alakjának egyikét jelenti. Mivel az emlõsök diploid organizmusok, a gén két példányban van jelen, és kromoszómapárokat hordoznak. Egy jellemvonást az adott lokuszon, az egyforma testvérkromoszómákon, elhelyezkedõ két gén szabályoz, melyeket alléleknek nevezünk. Emberekben a kromoszómapárok különbözõ alléleket hordozhatnak. Ha mindegyik gén expresszálódik (heterozigóta szituációban), ezeket kodominánsaknak nevezzük, és két különbözõ géntermék (vagy alloantigén) képzõdik. Homozigóta szituációban valamennyi gén expresszálódása esetén csak egy géntermék képzõdik. Két vagy több egyed (vagy törzs) akkor allogén egymással, ha az egyes organizmusokban egy vagy több lokuszon a gének nem azonos szekvenciájúak. Az allogenitást rendszerint az érintett lokusz vagy lokuszok vonatkozásában határozzuk meg. Egy faj allogénnek tekinthetõ egyedei olyan antigénes különbséget reprezentálnak, amely allograft elleni immunreakciót okoznak. Az ilyen antigéneket gyakran alloantigéneknek nevezik. Az „alloantigéneket” hisztokompatibilitási géntermékek két csoportja reprezentálja. Ezek a fõ és minor hisztokompatibilitási antigének. A fõ hisztokompatibilitási antigén a graftkilökõdés akut, gyors és intenzív formáit stimulálják, és ezek közé a HLA I. és II. osztályú proteinek tartoznak. A minor hisztokompatibilitási antigének a krónikus, lassú, kevésbé intenzív reakciókat stimulálják, és funkcionálisan heterogén proteinek csoportját alkotják. Egyetlen epitópra irányuló monoklonális antitestek állíthatók elõ, és különbözõ HLA-antigé-
1
HU 006 857 T2
nekre specifikus különbözõ monoklonális antitestek sorozatát fejlesztették ki, amelyek szerológiai szövettipizálást tesznek lehetõvé. A „polimorfizmus” egy populáción belül egy nukleotidszekvenciának (és ha van, az általa kódolt polipeptidszekvenciának) a genom egy adott pozíciójára jellemzõ változata. Az „egypontos nukleotidpolimorfizmus” (SNP; „Single Nucleotide Polymorphism”) kifejezés a genomban egyetlen nukleotidpozíciónál elõforduló nukleotidváltozékonyságra vonatkozik. SNP egy génen belül vagy a genom gének közötti régióiban egyaránt elõfordulhat. A mutációkkal kialakított SNP¹k detektálására számos eljárás alkalmazható. Példaként említhetõ a mutáns ras-gének nagy érzékenységû vizsgálati eljárása és annak akut leukémiában a prezentálás és a relapszus genotípusainak vizsgálatára történõ alkalmazása [Oncogene 9, 553–563 (1994)]. A két széles körben alkalmazott eljárás az allélspecifikus amplifikáció (ASA) és a mutánst felszaporító („mutant enriched”) polimeráz-láncreakció (ME-PCR). Az ASA eljáráshoz legalább három láncindítóra van szükség. A közönséges láncindítót a vizsgálandó polimorfizmushoz reverz komplementként használjuk. E közönséges láncindító mérete a polimorf bázistól számítva 50 és 1500 bp közötti lehet. A másik két (vagy több) láncindító azonos egymással, azzal a kivétellel, hogy az utolsó 3’¹bázisa úgy változik, hogy a polimorfizmust reprezentáló két (vagy több) allél egyikének feleljen meg. A minta-DNS¹en ezután két (vagy több) PCR-reakciót végzünk, melyek mindegyikében a közönséges láncindítót és az allélspecifikus láncindítók egyikét használjuk. Az öröklött (különösen a leukémiával összefüggõ) kódoló SNP¹k detektálását illetõen nincs különösebb korlátozás arra vonatkozóan, hogy a normálsejtek nagy háttere mellett az SNP¹t hordozó sejtek kis százalékban vannak jelen, hiszen a rákos sejtek esetében általában ez a helyzet. Másrészrõl, vérsejtek vizsgálata esetében 104–106 „mismatched” típusú allélháttérben egy SNP-allél detektálása elõnyös lehet, ha egy transzplantáción átesett beteget a betegség kiújulására vizsgálunk. Az SNP¹k detektálását illetõen nagyon érzékeny és specifikus vizsgálati eljárásokat több helyen is leírtak [lásd Sidransky, Science 278, 1054–1058 (1997), Ahrendt és mtsai.: J. Natl. Cancer. Inst. 91, 332–339 (1999)]. A találmány egy fontos szempontja lehet az ilyen vizsgálati eljárások – nagy léptékû szkrínelést lehetõvé tevõ – automatizált vagy nagy kimenõteljesítményû módon történõ végrehajtásának igénye [Dong és mtsai.: J. Natl. Cancer Inst. 93, 858–865 (2001), Ahlquist és mtsai.: Gastroenterology 119, 1219–1227 (2000), Ahrendt és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 7382–7387 (1999)]. Ahogy a leírásban használjuk, a „splice-variáns” kifejezés cDNS-molekulákra vonatkozik, amelyek eredetileg ugyanazon genomi DNS-szekvenciából átíródott RNS-molekula alapján jöttek létre, de alternatív splicing eseményen estek át. Az alternatív RNS-splicing akkor fordul elõ, ha egy primer RNS-transzkriptum spli-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 24
2
cing folyamaton megy át (általában az intronok eltávolítása céljából), ami egynél több mRNS-molekula képzõdését eredményezi, melyek mindegyike különbözõ aminosavszekvenciát kódol. A „splice-variáns” kifejezés jelentése kiterjed a fenti cDNS-molekulák által kódolt proteinekre is. Az „azonosság” és „hasonlóság” két vagy több polipeptidszekvencia vagy két vagy több polinukleotidszekvencia közötti összefüggést tükröz, ami a nagyon hasonló hosszúságú szekvenciák összehasonlításával, illetve – nem egyforma hosszúságú szekvenciák esetén alkalmasabb módon – rövidebb, meghatározott hosszúságú szakaszok összehasonlításával [ún. helyi illesztéssel („alignment”)] állapítható meg. A két vagy több szekvencia azonosságának és hasonlóságának meghatározására alkalmas eljárások a szakirodalomból jól ismertek. Ilyen például a Wisconsin Sequence Analysis Package 9.1 verziójú programja (Devereux J. és mtsai.: Nucleic Acids Res. 12, 387–395). A polipeptidszekvenciák összehasonlítására elõnyösen a BLOSUM62 aminosavszubsztitúciós mátrixot [Henikoff, S. and Henikoff, J. G.: Proc. Nat. Acad Sci. USA 89, 10 915–10 919, (1992)] alkalmazzuk, beleértve azokat az eseteket, amikor a nukleotidszekvenciákat az összehasonlítás elõtt transzlációval aminosavszekvenciákká alakítjuk át. Egy polinukleotidszekvenciában, amelynek vonatkoztatási polinukleotidszekvenciához viszonyított azonossági indexe 0,95¹os, a vonatkoztatási szekvencia minden 100 nukleotidja közül öt lehet módosítva (delécióval, szubsztitúcióval, inszercióval vagy ezek bármely kombinációjával – ahogy azt korábban leírtuk). Értelemszerû változtatással ugyanez érvényes a többi azonossági index (pl. 0,96; 0,97; 0,98 és 0,99) esetében is. A „fúziós protein” olyan protein, amelyet két, egymással nem rokon, fuzionált gén vagy fragmens kódol. A találmány szerinti legtágabb értelemben legalább két alloantigén vagy fragmens (amely két aminosavváltozatot hordoz) fuzionálható egy polipeptiddé. Egy specifikusabb példa szerint az említett alloantigének, illetve fragmenseik immunglobulin Fc¹fragmensével fuzionálhatók. A példákat illetõen lásd az US 5541087 és 5726044 számú iratokat. A Fc¹alloantigén esetében, annak (vagy fragmenseinek) funkcionális expresszáltatása szempontjából (terápiás alkalmazásuk esetén farmakokinetikai és immunológiai tulajdonságaik javítása érdekében) elõnyös, ha a fúziós protein részeként egy immunglobulin Fc¹régiója van jelen. Bizonyos esetekben különösen elõnyös lehet egy dimerizált Fc¹alloantigén létrehozása. Az Fc¹DNS-konstrukció – 5’®3’ irányban – a következõ komponenseket tartalmazza: szekréciós kazetta, azaz az emlõssejtbõl történõ exportot beindító szignálszekvencia; az immunglobulin Fc¹régió fragmenst (mint fúziós partnert) kódoló DNS; és az alloantigént vagy fragmenseit kódoló DNS. Bizonyos alkalmazási területeken kívánatos lehet az eredeti funkcionális tulajdonságok (komplementkötés, Fc¹receptorkötés) módosítása a funkcionális Fc¹helyek mutageni-
1
HU 006 857 T2
zálásával (a fúziós protein több részét érintetlenül hagyva) vagy az expressziót követõen az Fc¹rész teljes deletálásával. A „szövetspecifikus” expressziós markereket (pl. CD¹proteinek) rutinszerûen alkalmazzák a leukémia és limfoma diagnosztizálására, továbbá olyan esetekben, amikor a hagyományos citológia önmagában nem ad egyértelmû eredményt, hasznosnak bizonyultak a kemény tumorok diagnosztizálására is. Szakember számára ismert, hogy a vérképzési eredetû sejtek a legtöbb szövetspecifikus gént – általános elnevezéssel sejtvonalmarkereket (CD-proteineket) – expresszáló sejttípusok közé tartoznak. Az ilyen sejtpopulációk közé tartoznak a monociták, NK¹sejtek, granulociták (neutrofil, bazofil, eozinofil), limfociták (T¹ és B¹sejtek), dendrites sejtek és prekurzoraik. A legtöbb humán rákreferenciasejtvonal (és különösen a leukémiával és limfomával összefüggõ sejtvonalak) hozzáférhetõ a DSMZ-tõl. Ennek megfelelõen a szöveti markerek expressziója valamennyi humán ráksejtvonalon jól karakterizált monoklonális antitestek sorozatának alkalmazásával rutinszerûen elvégezhetõ. Általában ezen antigének expressziós mintázata a származási sejttípusra jellemzõ mintázatot tükrözi, azonban a proteinek egyedi monoklonális antitestekkel detektált expressziója hosszabb idõn keresztül nem mindig stabil. Ennek megfelelõen a DSMZ referenciaklónokon nem szükségszerûen expresszálódik az adott sejtvonalra leírt valamennyi marker. Ezen túlmenõen ugyanazon antigén elleni különbözõ antitestek nem mindig kötõdnek azonos – hasonló festõdési intenzitásokat eredményezõ – mértékben, így a feltárt eredmények között különbségek lehetnek, ami nem feltétlenül kérdõjelezi meg a sejtvonal azonosságát. A szövet- vagy tumorspecifitás többféle módon alkalmazható elnevezés, ami egyrészt azt jelentheti, hogy egy gén vagy molekula bizonyos szövetben nagyobb mennyiségben expresszálódik, mint egyéb szövetekben, másrészt jelentheti azt, hogy adott szövetre jellemzõ gének vagy molekulák az adott szövetben expresszálódnak, más szövetekben azonban nem. A találmány értelmében mindkét kategóriába tartozó géneket célantigéneknek kell tekinteni, mivel SNP által kódolt polimorfizmusokat hordoznak. További példák 1. példa Rákmarkervizsgálatok mintaigénye A CD¹proteineket és rákmarkereket rutinszerûen olyan diagnosztikai eljárással detektáljuk, amelyben a sejtpopulációk számlálására és analizálására alkalmas áramlási citométert fluoreszcensen jelölt, monospecifikus immunológiai reagensekkel (antitest) kombináljuk. A sejteket méret, markerreaktivitás, klonalitás és arány szerint osztályozzuk. Az egyedi anti¹CD antitestek és leukémia/limfoma referencia-sejtvonalak referenciasejtek gyûjteményeibõl (pl. ATCC vagy DSMZ) könnyen hozzáférhetõk. A kívánt leukémia/limfoma immunológiai fenotípusának karakterizálása és szelektálása (és
2
ha szükséges, e fenotípus DSMZ-nél hozzáférhetõ, szelektált és standardizált referencia leukémia/limfoma sejtvonalakéval történõ összehasonlítása céljából) anti¹CD antitestek kívánt sorozatát választjuk ki. Az el5 járás, amely szakember számára jól ismert, klinikailag széleskörûen alkalmazható leukémia, limfomák és ezekkel összefüggõ állapotok diagnosztizálására, maradványértékelésére, terápiás monitorozására és esetkezelésére. A referencia anti¹CD antitestek és referen10 cia leukémia/limfoma sejtvonalak (amelyek karakterizált CD¹protein-expressziós profillal bírnak) például a DSMZ-tõl hozzáférhetõek („Deutsche Sammlung von Microorganism und Zellkulturen” GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Németország). Különfé15 le szövetek és testfolyadékok analizálhatók. A kiértékelések minõségének és klinikai alkalmazhatóságának biztosítása céljából valamennyi citometriai adatot a minta mikroszkópiai vizsgálatával összefüggésben értelmezzük. 20 Vér Nátrium-heparinos (zöld kupakos) csõben 5–7 ml vér és EDTA (lila kupakos) csõben 5–7 ml vér. A csövek átfordításával a vért alaposan összekeverjük. Az 25 optimális eredmények biztosítása céljából a mintákat 24 órán belül kell megkapni. Ha a minta 24 órán belül nem érkezik meg, szobahõmérsékleten tartható, azonban az EDTA-vérbõl vérkenetet kell készíteni, és azt a mintával elküldeni. Más lehetõség szerint 7 ml¹es vagy 30 10 ml¹es ACD (sárga kupakos) csõ is beadható (az ACD csõ levételével egyidejûleg meghatározott fehérvérsejtszámmal és differenciális vérsejtszámmal együtt); ilyen esetben az ACS hígítási hatásainak elkerülése érdekében a sejtszámokat egy másik csõbõl 35 származó vérbõl kell meghatározni. Csontvelõ Nátrium-heparinos fecskendõbe (amely a minta 1 ml¹ére hozzávetõleg 500 USP nátrium-heparint tar40 talmaz) 1¹2 ml csontvelõt veszünk. A mintát nátriumheparinnal kezelt csõbe helyezzük. Ha a csontvelõ túl kevés sejtet tartalmaz, több mintára lehet szükség. A mintákat 24 órán belül kell megkapni. Amennyiben a minták nem érkeznek meg 24 órán belül, azokat szállí45 tóközegbe kell helyezni (a levételhez heparinnal kezelt fecskendõre ilyenkor is szükség van). Szövet A szövetbiopsziát szövettenyésztõ tápközegben 50 steril tartályba helyezzük. A mintákat – az optimális életképesség biztosítása céljából – 24 órán belül meg kell kapni. A szövetbõl izolált sejtek analízise elõtt életképességi ellenõrzést végzünk. 2. példa Leukémiával összefüggõ szöveti markerek szelektálása A leukémia és limfomák immuntipizálását alkalmazzuk a vérben, csontvelõben és nyirokszövetekben lévõ 60 sejtek – biológiai vonaluk és differenciálódási stádiu55
25
1
HU 006 857 T2
muk szerinti – azonosítására és mennyiségi meghatározására. Az alkalmazott sejtmarkereket a CD¹proteineket definiáló standard nómenklatúra szerint nevezzük el. A CD¹marker proteinek – mivel vérképzési eredetû sejtek által expresszálódnak – kiváló választást képviselnek a találmány szerinti SNP-analízis megkezdéséhez. A hematológiai betegségek (mint a leukémia és a limfomák) diagnosztizálása szempontjából releváns sejtfelületi markerek listáját a 2. táblázatban mutatjuk be. A végsõ cél olyan polimorfizmusok azonosítása e CD¹proteineken belül, amelyek felelõsek a megfelelõ proteinekben bekövetkezõ aminosavváltozásokért. A vizsgálat elsõ lépése a limfoid vagy mieloid eredetû, differenciálatlan leukémiasejtek (melyek a B¹ vagy T¹sejtvonalba tartoznak) osztályozása, melyet a leukémiasejtek sejtvonaltípuson belüli további osztályozása követhet. A sejtfelületi markerek expressziójára vonatkozó részletes információk gyûjtése szakember számára jól ismert, és felhasználható a kísérleti rendszer megtervezésére. Ahogy az expressziós profilkészítés révén egyre több marker (elsõsorban általános rákmarker) válik ismertté, fokozatosan nõ a találmány szerinti megoldáshoz megfelelõ ráktípusok száma. A találmány kidolgozása során a leukémiaprofilok definiálására legelõnyösebben alkalmazható markereket teszteltük, melyeket a 2. táblázatban sorolunk fel. Szakember könnyen kiválaszthatja egy specifikus véreredetû betegség diagnosztizálására és kezelésére leginkább alkalmas CD¹markereket. A következõ bekezdésekben összefoglaljuk a specifikus betegségekre vonatkozó releváns CD¹proteinprofilokat. A specifikus betegségek közé tartoznak, többek között, a következõk: akut mieloid leukémia (AML), akut limfoblasztikus leukémia (ALL), mielodiszplázia szindróma (MDS) és egyéb krónikus mieloproliferatív szindrómák, krónikus mieloid leukémia (CML), krónikus limfoblasztikus leukémia (CLL), multiplex mieloma, limfoma (Hodgkin vagy non-Hodgkin), ideértve a follicularis limfomát, közepes malignitású limfomát, nagy malignitású limfoma-B¹t (nem hasított kis sejtes vagy T¹sejtes limfoblasztos limfomával), anaplasztikus nagy sejtes limfomát, köpenysejtes limfomát, perifériás T¹sejtes limfomát és az extranodális vagy B¹tünetekkel, vagy tömeges tumorral és súlyos aplasztikus anémiával járó Hodgkin-limfomát. A jelen találmány szerinti megoldás betegségek terápiájára és diagnosztizálására történõ alkalmazása során különösen elõnyös lehet egy profil különbözõ proteinjeit reprezentáló SNP¹k kombinációjának alkalmazása. A feltételezett vagy ismert leukémiás sejtpopulációk akut leukémia profilja T¹sejt-markerek (CD2, CD3, CD4, CD5, CD7 és CD8), B¹sejt-markerek (elõnyösen a CD10, CD19, CD20, CD21, CD22 és CD24), valamint myeloid/monocita markerek (CD13, CD14, CD15 és CD33) analízisén alapul. Ha szükség van rá, további B¹sejt-markerek is bevonhatók (pl. CD23, 37, 38, 39, 40, 72, 73, 74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85,
5
10
15
20
25
30
35
2
CD86). Az akut megakarioblasztos leukémia a CD61, CD42 és CD41 marker alkalmazásával igazolható. Az érettség státust (nem sejtvonalszinten) CD34, HLA¹DR és CD10 (CALLA) alkalmazásával határozzuk meg. Külön tesztként terminális transzferázra (TdT) is igényt lehet tartani (vagy utólagos igazoláskor a patológus pótolhatja). A krónikus leukémiaprofilokat és limfomaprofilokat az össz-T-sejt-populáció pan-T-sejt-markerek (CD2, CD3, CD7, CD5) jelenlétére végzett analízisével értékeljük. Az értékelésbe rutinszerûen bevonjuk a CD4 (T¹helper) és CD8 (T citotoxikus/szuppresszor) alpopulációk analízisét. A myeloid/monocita markerek közé tartozik a CD14 és CD15. Az össz-B-sejt-populáció a CD19 és CD20 B¹sejt-marker expressziójának meghatározásával szûkíthetõ. A CD5 és CD20 együttes expressziója gyakran neoplasztikus proliferációval áll összefüggésben. A CD41 és CD42 hólyagkrízisnél bevonható a CML differenciálásába. A CD10 (CALLA), CD22, CD23, CD38, CD45, FMC¹1 és HLA¹DR a standard profil készítésére alkalmazható. További markerek alkalmazhatók a T¹sejt-rendellenességek értékelésére (CD1, CD30), a Hodgkin-betegség (CD15, CD30) vagy az anaplasztikus (Ki¹1) limfóma értékelésére (CD30). A szõrös sejtes leukémia, prolimfocitás leukémia vagy köpenysejtes limfoma és leukémia olyan B¹sejtbetegségek, amelyekre krónikus leukémiaprofil és limfomaprofil (lásd fentebb), valamint a CD11c (komplement receptor), CD25 (IL–2-receptor) és CD103 szõrös sejt receptor, illetve az FMC¹7 prolimfocitás szõrös sejt marker expressziója jellemzõ. A CD23 B¹limfoid markert a krónikus leukémia vs. köpenysejtes limfoma eltérõ diagnosztizálásához a CD5-expresszióval összefüggésben értékeljük. A CD23 az alapvetõ limfomaprofil része. Az anaplasztikus (Ki¹1) limfomát és a Hodgkin-betegséget a CD1, CD15 és CD30 (Ki¹1) markerek alkalmazásával értékeljük.
40
45
50
55
60 26
3. példa DNS-adatbázisok szkrínelésével azonosított új SNP-k A humán genom allélváltozatait reprezentáló DNSadatbázisok szkrínelésével SNP-ket azonosítottunk (a DNS-szekvencia különbözõ személyekbõl származik). A szkrínelést különbözõ szinteken (EST, SNP vagy genomi DNS) végezhetjük, azonban ez végül ugyanarra az eredményre vezet. A közvetlen SNP-szkrínelésre alkalmas adatbázis a következõ csoportból választható ki: http://www.jbic.or.jp http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp http://www.celera.com http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/ Az SNP¹k CD¹klaszter proteinekben történõ azonosításának szemléltetésére a program alapértelmezett módjában (protein aminosavszekvenciája a transzlált DNS-adatbázissal szemben) végzett tblastn kereséshez különbözõ – rákkal összefüggõ különféle CD¹pro-
1
HU 006 857 T2
teineket reprezentáló – aminosavszekvenciákat alkalmaztunk. Az aminosavszekvenciák elõnyösebben alkalmazhatók a szkrínelésre, mint a nukleotidszekvenciák, mivel így kizárhatók azok az SNP¹k, amelyek aminosavhelyettesítést nem eredményeznek („csendes” mutációk). Az adatbank-átvizsgálást a fentebb említett, publikus domén SNP-adatbázisok közül egy vagy több felhasználásával végeztük. Az így kapott, egy adott CD¹protein szekvenciájának különbözõ klónjai közötti – cDNS-szekvencia-eltéréseket (feltételezett SNP-ket) reprezentáló – összeillesztéseket („alignments”) a következõ szigorú kritériumok alapján értékeltük tovább: (i) A genomi DNS vagy EST (expresszálódó jelölõszekvencia) és egy CD¹szekvencia összeillesztésében jelen lévõ X szekvenálási hiba, amelyet figyelmen kívül kell hagyni. (ii) Genomi DNS-klónok és egy DNS-szekvencia összeillesztésében – a 5’¹ vagy 3’¹véggel szomszédos helyen található – eltérések exon/intron határokat jeleznek, s ezeket is figyelmen kívül kell hagyni. (iii) A genomi DNS vagy EST-szekvenciák és egy CD¹szekvencia összeillesztésében megfigyelhetõ egy bázisos eltérés (melynek környezetében a többi bázis tökéletes egyezést mutat) meggyõzõ indikátora a feltételezett SNP-nek.
2
A DNS-szinten azonosított SNP-ket az azonosító („accession”) kód alapján hozzáférhetõ aminosavszekvenciájuk összehasonlításával további vizsgálatnak vetjük alá. A Tblastn keresés a következõ példá5 ban bemutatásra kerülõ CD42 analízisnél megadottak szerinti összeillesztést eredményezte, ami lehetõvé tette a megfelelõ genomi klónban jelen lévõ, feltételezett SNP¹k azonosítását. Az SNP-analízisben alkalmazott releváns proteinek listáját a 2. táblázatban mu10 tatjuk be. 4. példa CD42 SNP-változatok vizsgálata A 3. példában leírt eljárás részletesebb szemlélte15 tése céljából példaként a CD42b-proteint választottuk ki. A protein – No. P07359 azonosító kód alapján hozzáférhetõ – szekvenciáját alkalmaztuk a CD42b-protein feltételezett SNP-inek szkrínelésére. A tblastn keresés az alábbi összeillesztést, illetve 20 az AC032038.2 azonosító kódú genomi klónban jelen lévõ két feltételezett SNP azonosítását eredményezte. >gi|121531|sp|P07359|GPBA_HUMÁN VÉRLEMEZKE IB¹GLIKOPROTEIN ALFA LÁNC PREKURZOR (GP¹IB 25 ALFA) (GPIBA) (CD42B-ALFA) (CD42B) [TARTALMAZ: GLIKOKALICINT]
A CD42b aminosavszekvenciája MPLLLLLLLLPSPLHPHPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLA TLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRL TSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDT LLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVKA MTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRATRTVVKFP TKAHTTPWGLFYSWSTASLDSQMPSSLHPTQESTKEQTTFPPRWTPNFTLHMESITFSKTPKS TTEPTPSPTTSEPVPEPAPNMTTLEPTPSPTTPEPTSEPAPSPTTPEPTPIPTIATSPTILVSATSLIT PKSTFLTTTKPVSLLESTKKTIPELDQPPKLRGVLQGHLESSRNDPFLHPDFCCLLPLGFYVLGL FWLLFASWLILLLSWVGHVKPQALDSGQGAALTTATQTTHLELQRGRQVTVPRAWLLFLRG SLPTFRSSLFLWVRPNGRVGPLVAGRRPSALSQGRGQDLLSTVSIRYSGHSL
CD42b-fragmens illesztése A CD42b-protein allélváltozatait reprezentáló – és annak aminosavcseréit tartalmazó – szekvenciákat félkövér betûtípussal szedve jelöljük. >ss523802 Poz. allél=201 teljes hosszúság=401 SC_JCM|AC032038.2_49155|taxid 9606|mol=Genomi|subsnpClass=1 Hosszúság=401
Negatív szál HSP¹k: Pontszám=736 (264.1 bits), Várt=7.0e¹71, P=7.0e Azonosság=131/133 (98%), Pozitív=132/133 (99%), Keret=–1 45
Query: 192TLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVD TLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVD Sbjct: 401TLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVD
251
Query: 252VKAMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRATRTV VK+MTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGK CPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRATRTV Sbjct: 221VKSMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRATRTV
311
Query: 312VKFPTKAHTTPWG VKFPTKAHTTPWG Sbjct: 41VKFPTKAHTTPWG
324
222
42
3 27
1
HU 006 857 T2
5. példa Ráksejtvonalak tesztelése HLA¹ra és SNP-re Epstein–Barr-vírussal transzformált leukémia/limfoma sejtvonalak (karakterizált CD¹protein expressziós profilokkal) hozzáférhetõk (pl. a DSMZ¹n keresztül) vagy páciensekbõl izolálhatók. A sejteket immunfluoreszcens vizsgálati eljárással HLA–A2 (vagy más kívánt, I. osztályba tartozó molekula) expressziójára teszteltük, melynek során BB7.2 monoklonális antitestet vagy egyéb, az American Type Culture Collectionnél (Manassas, VA) hozzáférhetõ antitesteket alkalmaztunk. A vérképzési sejt és/vagy ráksejt expressziós és SNP-státusát genomi PCR-analízissel teszteltük. PoIi(A)+ RNS¹t QickPrep Micro mRNS-tisztító reagenskészlet (Amersham Pharmacia Biotech, Piscatawa, NJ) alkalmazásával izoláltunk. Például a CD42 gén (azonosító szám: J02940) polimorfizmusának sejt- vagy szövetspecifikus epxresszáltatásához és detektálásához a következõ PCR-láncindítókat alkalmaztuk: 5’¹CAAGAGAACTCGCTGTATACA¹3’ és 5’¹AAGGGGTGGTTTCGGGTATGT¹3’, amelyek a CD42-cDNS 586–607., illetve 939–960. bázispozícióinak felelnek meg. A polimeráz-láncreakció eredményeként 374 bázispáros PCR-terméket kaptunk. Az SNP-detektálást e PCR-termék szekvenálásával végeztük, amihez ABI.310 kapilláris szekvenálókészüléket alkalmaztunk. 6. példa SNP által kódolt HLA-kötõ peptidek azonosítása a CD42b-ben A releváns SNP definiálása szempontjából – a kódoló SNP¹k DNS- és aminosavszekvenciákban végzett felkutatása mellett – további fontos lépés a megfelelõ HLA I. osztályú kötõmotívum kiválasztása. A jellemzõ HLA I. osztályú prezentáló molekulák közül többet is kiválasztottunk. A HLA-kötõ peptidek megjóslásához a SYVPEITHI algoritmust alkalmaztuk. A pontszámokat a 4. táblázatban adjuk meg. A 8¹tól 27¹ig terjedõ pontszámok a peptidnek a HLA I. osztályú molekulákra vonatkozó nagy kötési affinitását jelzik. Ezen analízis eredményeként olyan humán szekvenciákat azonosítottunk, amelyek a peptid 9 aminosava közül nyolc pozícióban mutattak egyezést. Mindkét humán peptidet szintézissel elõállítottuk és szenzitizálóaktivitásukra teszteltük. Ritka esetekben a 9 aminosavas T¹sejt-epitópon belül egynél több aminosaveltérést is tapasztaltunk. 7. példa HLA-kötõ peptidek kiválasztása in vitro teszteléshez Az SNP-eredetû aminosavcsere in vitro tesztelése céljából az érett protein aminosavszekvenciájában – az elsõsorban a HLA–A2-höz való ismert kötõmotívumokat (HLA–A*02 vagy HLA-B51 vagy HLA-B62) hordozó nonamer peptidet kell azonosítani, ahogy azt fentebb a CD42 alloantigén esetében leírtuk. A HLA–A2-kötõ T¹sejt-epitópok kiválasztása általában elõnyösebb a többinél, mivel léteznek olyan, szak-
5
2
irodalomból ismert sejtvonalak, amelyek felhasználhatók az antigénprezentálás in vitro tanulmányozására. Ilyen sejtvonal, többek között, az LCL.174 (TAP-deficiens mutáns sejtvonal), amely felszínén HLA–A2¹t hordoz.
8. példa HLA–A2-kötött peptidek izolálása A HLA–A2-kötött peptideket standard eljárások 10 szerint [lásd Seeger és mtsai.: Immunogenetics 49, 571–576 (1999), Falk és mtsai.: Nature 351, 290–296 (1991)], HLA–A2-specifikus BB7.2 antitest, valamint savas kezelés, ultraszûrés és HPLC-frakcionálás alkalmazásával izoláltuk és szekvenáltuk. A peptidtartalmú 15 HPLC-frakciókat összeöntöttük, és nanokapilláris HPLC ESI¹MS analízissel [Schirle és mtsai.: Eur. J. Immunol. 30, 2216–2225 (2000)] kb. 1010 sejtbõl származó peptidkivonatnak megfelelõ aliquotokat analizáltunk. 9. példa Peptidszintézis A peptideket F¹moc protokoll szerint szintetizáltuk [G. A. Grant: „Synthetic Peptides: A User’s Guide”, W. H. Freeman and Co. (1992)]. A peptidek azonosságát 25 aminosavanalízissel és mátrix segítette lézerdeszorpciós/ionizációs tömegspektrometriával ellenõriztük. A liofilizált peptideket 20 mM koncentrációban DMSOban oldottuk, aliquotokra osztottuk és –80 °C¹on tároltuk. A peptideket szérummentes tenyésztõ tápközeg30 gel 4 mM koncentrációra hígítottuk, és a kívánt végkoncentrációkban használtuk fel. 20
35
40
45
50
10. példa Szintetikus HLA-kötõ peptidek in vitro tesztelése Az SNP indukálta egyedi aminosaveltéréseket hordozó – HLA–A2-molekulákhoz kötõdni képes – peptideket az LCL.174 sejtvonalba tartozó TAP-deficiens mutáns sejtek felületén a HLA–A2-expressziót fokozó képességük alapján azonosítottuk. Röviden összefoglalva: az LCL.174 sejteket gömbölyített aljú, 96 üregû tálcákon 200 ml RPMI-tápközegben, 2×106 sejt/üreg mennyiségben, 50 mM peptid jelenlétében, 37 °C¹on egy éjszakán át tenyésztettük. A sejteket ezután HLA–A2-specifikus BB7.2 monoklonális antitesttel (ATCC, Rockville, MD) kezeltük, majd FITC-vel konjugált kecske antiegér IgG-vel festettük. A fluoreszcenciaintenzitást áramlási citometriával analizáltuk. Pozitív kontrollként az influenzavírus M1 mátrixprotein FluMP58-peptidjét alkalmaztuk, amely egy ismert HLA–A2-korlátozott CTL-epitóp. A hepatitis B vírus envelope-antigén (HBenvAg125-peptid) nem kötõdik a HLA–A2-höz; ezt használtuk negatív kontrollként.
11. példa Antigénreaktív sejtek azonosítására alkalmas tetramertechnika Multimer, MHC I. osztályú molekula/peptid komplexeket rendszerint rekombináns b2-mikroglobulin és nehéz láncú HLA-molekulák baktériumokban történõ exp60 resszáltatásával állítunk elõ. A nehéz láncot a transz55
28
1
HU 006 857 T2
membránrégió eltávolítása, és a C¹terminálison specifikus biotinilálási szekvencia hozzáadása céljából mutagenizáljuk. A tisztított proteinek – stabil és oldható HLA/peptid komplexek kialakítása érdekében – a peptid/epitóp nagy koncentrációinak jelenlétében in vitro refoldálhatók. Az enzimatikus biotinilálást követõen e komplexeket sztreptavidinnel multimerizáljuk (a sztreptavidin négy biotinmolekulát köt meg). Fluoreszcens jelölõvel konjugált sztreptavidin alkalmazásával a megfestett sejteket áramlási citometriával vizualizáljuk. Amennyiben a T¹sejtek aktiválására I. osztályú molekula/peptid komplexeket alkalmazunk, az immunreakció még részletesebb tanulmányozása érdekében elõnyös lehet a tetramertechnikát citokinszekréciós analízissel kombinálni. 12. példa Citotoxikus T¹limfociták (CTL¹ek) in vitro stimulálása HLA–A2+ betegekbõl származó 30 ml heparinizált vérbõl Ficoll-Hypaque (Sigma, St. Louis, Mo.) sûrûséggradiens centrifugálással perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC-ket) nyertünk ki. A frissen izolált (vagy néha a folyékony nitrogénben lefagyasztott) PBMC¹k közül – anti-CD8 antitestekkel bevont mágneses mikrogyöngyök alkalmazásával, a gyártó (Milteny Biotec, Auburn, Kalifornia) útmutatása szerint végzett pozitív szelekcióval – CD8+ sejteket válogattunk ki. A CD8+ sejteket szérummentes DMEM-tápközegben újraszuszpendáltuk és 500 ml aliquotokban, 48 üregû lemezeken 3×106 sejt/üreg mennyiségben tenyésztettük. 5% CO2¹ot tartalmazó atmoszférában, 37 °C¹on két óra elteltével a nem tapadó sejteket ismételt öblítéssel eltávolítottuk, és a letapadt monocitákat 50 mM peptid és 5 mg/ml humán b2-mikroglobulin (Sigma, St. Louis, Mo.) jelenlétében négy óra hosszat inkubáltuk. Szérummentes DMEM-tápközeggel végzett mosást követõen mindegyik üreget – rhIL–7-tel (0,5 ng/ml; (0,5 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, Minn.) kiegészített, 10% humán szérumot tartalmazó 500 ml DMEM-tápközegben – 1,5×106 CD8+ sejttel (áramlási citometriával >90%¹os tisztaság) egészítettük ki. Két nap múlva, majd hetente kétszer a sejtekhez 25 E/ml rhIL–2¹t adtunk (a tenyésztõ tápközeg felét helyettesítve). A 10. napon a CTL-tenyészeteket reagáló sejt/stimuláló sejt=5 arány mellett sugárkezelt (5000 rad) autológ LCL-lel újrastimuláltuk. Más módon, az elõzetesen 50 mM – találmány szerinti megoldás értelmében definiált – HLA-kötõ peptiddel inkubált LCL.174 sejteket használtuk a HLA–A2+ páciensekbõl származó CTL-tenyészetek újrastimulálására. A CTLteszteket az újrastimulálás után egy héttel végeztük. Karakterizálást követõen a peptiddel stimulált CTL¹ek 30% humán szérumból, 10% DMSO-ból és 60% DMEM-bõl álló tápközegben fagyaszthatók és tárolhatók, majd felolvasztás után további analízishez felolvaszthatók. A peptidspecifikus citotoxikus T¹limfociták in vitro stimulálásához pozitív kontrollként az influenzavírus M1 mátrixproteinbõl származó FluMP58peptidet alkalmaztuk.
2
13. példa Alloantigénspecifikus CTL¹ek létrehozása ex vivo Egy elõnyös alloantigén allélváltozatait reprezentáló HLA-kötõ peptidek alkalmazhatók, és specifikus cito5 toxikus T¹limfociták izolálásával tovább karakterizálhatók. E megközelítési mód alkalmazhatóságát aktiválatlan („unprimed”), aminosaveltérést („mismatch”) hordozó, allélnegatív egészséges véradóktól származó alloantigénspecifikus citotoxikus T¹limfociták ex vivo lét10 rehozásával mutattuk ki. Az aktiválatlan, autológ vagy allogén CD8+ T¹sejtek stimulálására antigénprezentáló sejtként szintetikus peptiddel pulzuskezelt dendritikus sejtek alkalmazhatók. Az ex vivo létrehozott, aminosaveltérést hordozó, specifikus citotoxikus T¹limfociták 15 ezután akut mieloid leukémiás (AML) és akut limfoid leukémiás (ALL) betegekbõl származó leukémiasejtek hatékony lizálására alkalmazhatók. A nem vérképzési sejtek ellen litikus reaktivitást nem lenne szabad detektálni. Adoptív immunterápiás célokra elegendõ számú 20 citotoxikus T¹limfocita nyerhetõ. Fontos megemlíteni, hogy ez a technika, többek között, a találmány szerinti megoldás értelmében felismert valamennyi, SNP által definiált alloantigén esetében alkalmazható. 25
30
35
40
45
50
55
60 29
14. példa 51Cr-felszabadulási citotoxicitási teszt Ezen effektorsejtek citolitikus aktivitását az izotóp jelölt célsejtekrõl történõ felszabadulása alapján mérjük. A citotoxikus aktivitást gyakran krómfelszabadulási vizsgálati eljárással teszteljük, de egyéb eljárások is rendelkezésre állnak. A krómfelszabadulási tesztekben a radioaktív krómmal (51Cr) jelölt célsejteket összekeverjük az aktivált citotoxikus T¹limfocitákkal. Az élõ sejtek felveszik a radioaktív krómot (Na251CrO4 formájában), és a króm a sejt belsejében redukálódik. Ha a lizált sejtbõl a redukált króm felszabadul, azt más sejtek nem képesek újrahasznosítani, ezáltal a felszabadult króm mennyisége alapján jól mérhetõ az effektorsejtek citolitikus aktivitása. A citotoxikus T¹limfociták aktivitásának mérésére lényegében bármely sejttípus alkalmas lehet, azonban erre a célra aktivált sejtek, mint pl. limfoblasztok, szövettenyésztett sejtek vagy tumorsejtek bizonyultak legelõnyösebbnek. A természetes sejtpusztító aktivitást a K562 elnevezésû vonatkoztatási sejtvonal lízise alapján mérjük. Itt a tesztet a donorvagy recipienseredetû LAK-sejtek vagy citotoxikus T¹sejt-klónok (effektor) aktivitásának mérésére alkalmazzuk. A LAK-sejtek vagy T¹sejt-klónok a HLA és az alloantigén természetû peptid megfelelõ kombinációját expresszáló célsejteket pusztítják el. Kiválasztott allo-T-sejt epitóppal pulzuskezelt elõnyös célsejtvonal a humán HLA–A2-pozitív EBV-LCL sejtvonal. A DSMZ-nél a leukémia-sejtvonalak gazdag forrása áll rendelkezésre. 5 ml Falcon-csõbe 1×106 sejtet (célsejtet) helyezünk, majd ezeket lecentrifugáljuk, és 10 ml Na252CrO4 (nagy aktivitású) elegy hozzáadásával újraszuszpendáljuk, és 37 °C¹on 45 percig inkubáljuk. A jelölt sejteket PBS/FBS oldattal háromszor mossuk, majd 1 ml tápközegben újraszuszpendáljuk és megszámláljuk. A jelölt sejteket felhasználásig hûtve
1
HU 006 857 T2
tartjuk. A teszthez mindegyik célsejttípusból 5 ml szükséges (5×104 sejt/ml koncentrációban), és a koncentrációt be kell állítani. Citotoxikus T¹limfociták prekurzorsejtekbõl 1) „stimulátor” sejtek által hordozott antigénekkel (járulékos és helper T¹sejtek jelenlétében) végzett specifikus stimulálást követõen vagy 2) interleukin–2-vel 4¹5 napon át végzett inkubálással indukált poliklonális aktiválást követõen hozhatók létre citotoxikus T¹limfociták (utóbbi esetben LAK-sejteknek nevezzük). Az elõnyös effektorsejteket 50 ml¹es Falcon-csõbe helyezzük át, majd mossuk és újraszuszpendáljuk õket (2,5×106 sejt/ml). Az effektorsejteket és a célsejteket négy különbözõ effektor:target arányban (50:1, 25:1, 12,5:1 és 6:1) keverjük össze. Mindegyik effektor:target arányt három ismétléssel teszteljük. Az effektorsejtek sorozathígítását a tálcán készítjük el, oly módon, hogy az effektorsejtek össztérfogata a hígítás után 100 ml legyen, majd hozzáadjuk a célsejtszuszpenzió 100 ml¹ét. A célsejtek üregenkénti számának 5000-nek kell lennie. A spontán és maximális kibocsátás meghatározásához 100 ml tápközeget tartalmazó üregekben csak célsejteket alkalmazunk. A tálcákat 37 °C¹on, 5% CO2¹ot tartalmazó atmoszférában négy óra hosszat inkubáljuk, majd a sejteket betakarítjuk, és citotoxicitási teszthez kialakított gamma-számlálóban számláljuk. 14. példa „A” vakcinázási protokoll A kiválasztott SNP-kódolt alloantigéneket a teljes polimorf protein (vagy legalább annak polimorf peptidrészlete) formájában alkalmazzuk. Néhány protein és peptid immunogén hatású, míg másokból hiányzik az immunogenitás, mely hiány legkönnyebben a protein vagy peptid hordozóhoz történõ kapcsolásával küszöbölhetõ ki. Az e célra alkalmazható hordozók közé tartozik a keyhole limpet hemocianin (KLH), a szarvasmarha-szérumalbumin (BSA), a Mycobacterium bovis BCG, a tuberkulin tisztított proteinszármazéka vagy a koleratoxin B¹alegysége. A kapcsolás bármely, két funkciós csoportot tartalmazó (bifunkciós) keresztkötõ ágenssel létrehozható. Homo-bifunkciós reagensek – pl. bisz(szulfoszukcinimidil)-szuberát, diszukcinimidilszuberát vagy glutáraldehid – alkalmazhatók. Olyan esetekben, ha a protein vagy peptid egyikérõl ismert, hogy nem tartalmaz kereszkötéshez hozzáférhetõ csoportokat, a hetero-bifunkciós reagensek alkalmazása elõnyös. A szakirodalomból ismert hetero-bifunkciós reagensek közé tartozik például az m¹maleimdobenzoil-N-hidroxi-szukcinimid vagy a szulfo-m-maleimdobenzoil-N-hidroxi-szukcinimid, melyek a konjugálni kívánt vegyületek biokémiai tulajdonságainak megfelelõen választhatók ki. Az elõnyös példa szerint a kiválasztott antigénhez konjugált hordozóként KLH¹t alkalmazunk (KLH-antigén konjugátumot létrehozva), amely elõnyösen alkalmazható a QS¹21 adjuvánssal együtt. További antigénkészítmények tartalmazhatnak ISCOM-okat, MDP¹t, Mycobacterium bovis BCG¹t vagy alumínium-hidroxidot. A szaponinok vagy CpG-oligonukleotidok képesek az immunreakciók serkentésére,
2
és elõnyösek lehetnek a kiválasztott szekvenciákhoz vagy antigénkonjugátumokhoz. Alternatív eljárásként alkalmazható a kiválasztott antigénnel végzett ismételt vakcinálás. Embereknek a készítmény – alapos összerázás 5 után – intravénásan, intratumorálisan, intradermálisan, szubkután vagy orálisan adható be. Az adagolást elõnyösen a 0., 7. és 14. napon kell végezni. Adott esetben emlékeztetõ („booster”) immunizálásként B¹sejt10 epitóp peptidek is alkalmazhatók.
15
20
25
30
35
40
45
„B” vakcinázási protokoll A javasolt vakcinázó ágens a Salmonella typhimurium baktérium replikációra képes plazmidot hordozó, legyengített törzse, mely plazmidba a SNP kódolta alloantigén-peptidek in vivo expresszálására képes DNSszekvencia van inszertálva. Vektorként a legyengített Salmonella typhimurium X 4072 törzs [Schödel és mtsai.: Infect. Immun. 62, 1669–1676 (1994)] alkalmazását javasoljuk, amely has Dcrp¹1 és Dcya mutációt hordoz (melyek a baktériumot avirulenssé), illetve tartalmaz DasdA¹1 mutációt is, amely a baktériumot életképtelenné teszi, hacsak egy bejuttatott plazmidon nincs jelen normális asdA-gén. Mindazonáltal e törzs helyett egyéb biztonságos baktériumtörzsek is alkalmazhatók. A pYAN-plazmid a pYA292 Ncol-felismerési helyet hordozó, módosított alakja (Schödel és mtsai., lásd fentebb). Az Ncol-felismerési hely jelenléte lehetõvé teszi a kívánt idegen protein vagy peptid AUG startkodonjának plazmidba történõ, leolvasási fázison belüli inszercióját. A pYAN-plazmidból hiányoznak az antibiotikumrezisztencia-gének, ami lehetõvé teszi antibiotikum alkalmazását arra az esetre, ha Salmonella fertõzésre utaló tünetek jelennének meg. A pYAN-plazmid normál asdA-gént hordoz, ami csak azon baktériumokat tartja életképesen, amelyek hordozzák a plazmidot. Szintetizáltunk egy olyan DNS-szekvenciát, amely a startkodont (AUG) követõen a peptidet kódoló szekvenciákat hordozza. A javasolt dózis kisgyermekeknek 5×104 kolóniaképzõ egység, míg felnõtteknek 5×105 kolóniaképzõ egység. Felnõtteknek a baktériumokat nátrium-hidrogén-karbonáttal (150 ml desztillált vízben 2 g NaHCO3) együtt kell beadni – a páciensnek elõször ebbõl az oldatból 120 ml¹t meg kell inni (a gyomorsav semlegesítése céljából), majd egy perc múlva le kell nyelnie a maradék 30 ml hidrogén-karbonát-oldatot (ezúttal már a baktériumokkal együtt). A vakcinázás elõtt és után 90 perccel étel vagy ital fogyasztása nem megengedett.
50 „C” vakcinázási protokoll Alternatív lehetõség szerint a DNS egyéb DNS-célbajuttató technikák alkalmazásával is bejuttatható, így például a D. Zhang és mtsai. [J. Infect. Dis. 176, 55 1035–1040 (1997)] által leírt vakcinázási protokollhoz hasonló módszerrel. Bár a fentiekben az elõnyös megvalósítási módokat ismertettük, szakember számára érthetõ, hogy ezekben módosítások hajthatók végre, amelyek a találmány 60 igényelt oltalmi körén belül maradnak. Például a DNS 30
1
HU 006 857 T2
E. coli-ban történõ expresszáltatása helyett a DNS¹t egyéb gazdákhoz optimalizálhatjuk, és ezen gazdákban expresszáltathatjuk. Ezen túlmenõen, bár sikerült specifikus szekvenciákat azonosítani, úgy véljük, hogy a találmány szerinti technikák alkalmazhatók a kívánatos 8–10mer-eknél (amelyek elõnyös CTL-aktiváló tulajdonságokkal bírnak) hosszabb peptidek esetében is. Ilyenformán a szabadalmi igénypontokat a lehetõ legtágabb értelemben kell értelmezni ahhoz, hogy a teljes igényelt oltalmi kört definiálni lehessen. „D” vakcinázási protokoll A dendritikus sejteket (DC) rák elleni vakcinázásra alkalmas élõ vektornak tekintjük, és különösen alkalmasak a találmány szerinti antigének célba juttatására. Az újabb klinikai vizsgálatok többségét CD14+ prekurzorokból (5, 6) ex vivo létrehozott dendritikus sejtekkel (ún. monocitaeredetû dendritikus sejtek vagy Mo¹DC) alkalmazásával végzik, és újabban ezeket a sejteket tekintik arany standardként [Thurner, B. és mtsai.: J. Exp. Med. 190, 1669 (1999); Schuler-Thurner, B. és mtsai.: J. Exp. Med. 195, 1279 (2002)]. Az Mo¹DC sejtek a vérben lévõ prekurzorokból néhány nap alatt reprodukálhatóan, nagy mennyiségben hozhatók létre (300–500 millió érett DC/aferézis), lásd Feuerstein B. és mtsai.: J. Immunol. Methods. 245, 15–29 (2000). Mo¹DC sejtek esetében a sikerhez kulcsfontosságú az érési stimulus; közelebbrõl, a PGE2-nek az érési stimulus részének kell lennie ahhoz, hogy olyan, CCR7¹et expresszáló Mo¹DC sejteket nyerjünk, amelyek a – a dendritikus sejteket a nyiroksejtekbe irányító – CCL19¹re és CCL21¹re reagálva migrálnak [Luft T. és mtsai.: Blood 100, 1362 (2002); Scandella, E. és mtsai.: Blood 100, 1354 (2002)]. A dendritikus sejtek létrehozására rendelkezésre állnak olyan eljárások, amelyek lehetõvé teszik a tumorok elleni CD¹alapú peptidvakcina klinikai elõállítását. A dendritikus sejtek peptiddel történõ feltöltésére a kiválasztott SNP kódolta alloantigént hordozó peptidek alkalmazhatók. A dendritikus sejtek antigénekkel történõ feltöltésének egy másik megközelítési módja a kívánt antigént kódoló csupasz DNS transzfekcióval vagy elektroporációval történõ bejuttatása [Van Tendeloo, V. F. és mtsai.: Blood. 98, 49 (2001)], azt követõen pedig az antigénspecifikus T¹sejtek in vitro, illetve a páciensekben in vivo történõ indukálása. A dendritikus sejtek legfeljebb 20 HLA-I-korlátozott és 10 HLA-II-korlátozott T¹sejt-epitóppal tölthetõk fel, s így az antigénspecifikus CTL-reakciók indukálásához természetes adjuvánsként mûködhetnek. Az immunreakció nyomon követésére – a tetramertechnika és a CTL-gyakoriság meghatározása mellett – ex vivo végzett ELISPOT-analízis (a 15. példában leírt eljárás) alkalmazható.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55 15. példa A vakcinálás immunogenitásának és hatékonyságának értékelése A rákantigénekkel végzett klinikai kísérletek során elsõdleges cél immunogenitásuk meghatározása. Ezt
60 31
2
rendszerint a limfocitaaktiválás helyettesítõ köztes markereinek (pl. citokinek és interferonok) vagy az immunreakció végpontjainak (pl. antitestreakció) mérésével hajtjuk végre. Az e területen jártas szakember számára ismert, standard vizsgálati eljárással az határozható meg, hogy bekövetkezett¹e egy (allo)antigénspecifikus antitestreakció indukálása. Ezt sejt- vagy antigénalapú, enzimkötött immunszorbens vizsgálati eljárásokkal (ELISA), a páciensektõl a vakcina beadását megelõzõen és azt követõen vett szérum felhasználásával végezzük. ELISA-analízishez alkalmas célpontok az autológ leukémiasejtek vagy egyéb, betegséget okozó sejtek vagy izolált antigének (különösen azon aminosavcserét hordozó alloantigénjei). Egy másik eljárás az immunogenitás késõi típusú túlérzékenységi (DTH) bõrteszttel végzett értékelése. Ennek során valamennyi páciensnek – a vakcina beadása elõtt és után – intradermális injekcióval antigént, alloantigént vagy sugárkezelt autológ ráksejteket adunk be, és mérjük az injektálás után 48 órával észlelhetõ keményedés és bõrpír mértékét. Ezen túlmenõen a DTH-teszt keretében biopsziamintákat is gyûjthetünk, melyeket – az immunrendszer sejtjei beszivárgásának megállapítása céljából – immunhisztokémiai analízisnek vethetünk alá. A rákspecifikus effektorsejtek azonosításának egy másik módja egy nemrégiben kifejlesztett vizsgálati eljáráson alapul, amely alkalmas az antigénnel bekövetkezõ találkozás hatására specifikusan aktivált T¹sejtek meghatározására. Az aktivált sejtek citokinek felszabadításával reagálnak, melyek anticitokin antitestek alkalmazásával mérhetõk [e technika enzimkötött immunospot (ELISPOT) vizsgálati eljárás néven ismert]. Az ELISPOT-eljárás lehetõvé teszi a donor- vagy pácienseredetû limfociták in vitro újrastimulálásának végrehajtását és nagy érzékenységû mérését. Az effektorsejtek által szekretált citokineket mennyiségi meghatározásnak vetjük alá, és a T¹sejtek gyakoriságának mérése céljából további áramlási citometriai analízist hajthatunk végre. A rendszer standardizálásához influenzavírusból (FLU), citomegalovírusból (CMV) vagy tetanus toxoidból (TT) származó referenciapeptideket vagy proteineket alkalmazhatunk. Az IL–4 vagy IFN-gamma szekréció detektálása az antigénspecifikus CD4+, illetve CD8+ T¹sejtek normál PBMC-sejtek közötti kimutatásának indikátoraként szolgál. A memória típusú sejtek CD27¹et és CD28¹at expresszálnak, CD57¹et azonban nem. Az izolálást és IL–2-vel végzett expanziót követõen kinyert sejtek antigénspecifikus citotoxicitást mutatnak. Az antigénspecifikus T¹sejtek gyakorisága kisebb azon antigének vonatkozásában, amelyekkel ritkán találkoznak, és amelyek csak mérsékelten immunogének (mint pl. a TT; 1/10 000–1 000 00), a makacsul jelen lévõ CMV vírusra vonatkozóan azonban sokkal nagyobb (szeropozitív donorok PBMC-sejtjei közül 1/100–10 000). Ezek a technikák értékes eszközként szolgálnak a rákra és alloantigénekre specifikus T¹sejtek találmány szerinti analíziséhez és izolálásához.
1
HU 006 857 T2
16. példa Az alloaktiválás mérése Az allo-aktivált T¹sejtek hatékonyságának meghatározása klinikailag az aktivált és inaktivált sejtek megkülönböztetését foglalja magában. Az XTT-Formazan redukciós vizsgálati eljárás elõnyösen alkalmazható alloaktivált sejtek aktivitásának nem stimulált kontrolléval történõ összehasonlításához. Az eljárás az élõ sejtek XTT¹t narancsvörös színû Formazan-festékké redukáló képességén alapul, és alkalmas az aktivált sejtek inaktivált sejtektõl történõ megkülönböztetésére is. Gyakorlatilag bármilyen közegben gyakorlatilag bármely sejthez alkalmazható. A hasznos sejtszámtartomány 105–5×1006 sejt/ml. A felhasznált anyagok és reagensek a következõk: 96 üregû tálcák, lapos aljú (nem ELISA) tálcák, 1 mg/ml MTT [2,3bisz(2¹metoxi-4-nitro-5-szulfo-fenil-2H-tetrazolium-5karboxi-anilinid¹só; Sigma)], foszfátpufferelt sóoldatban frissen készítve, 1,53 mg/ml PMS (fenil-metánszulfonilfluorid, Sigma) foszfátpufferelt sóoldatban (fagyasztott, fénytõl védve tárolt). A vizsgálati eljárás elvégzéséhez 96 üregû tálca üregeibe sejteket tartalmazó 100 ml tenyésztõ tápközeget helyezünk (két vagy három példányban). Kontrollként sejtet nem tartalmazó 100 ml tápközeget alkalmazunk. Az elsõ oszlopot üresen hagyjuk. Az elõhíváshoz az XTT¹t közvetlenül a felhasználás elõtt PMS-sel (5 mg/ml XTT) összekeverjük, és mindegyik üreghez 50 ml XTT¹t adunk. Az üregek tartalmát a tálca óvatos ütögetésével összekeverjük. A tálcát lefedjük, és 37 °C¹on 4 óra hosszat keverjük. A tálcát 470 nm¹nél detektáljuk (referencia 650 nm¹nél). 17. példa A CD3/CD69 vagy CD3/FDA expresszió áramlási citometriás vizsgálata Ez a vizsgálati eljárás allogénes kevert limfocitastimulálást követõ T¹limfocita-aktiválás vizsgálatára alkalmas. A CD69-expresszió vagy észterázaktivitás összefüggést mutat a citokinszekrécióval, és a T¹limfocitaaktiválás helyettesítõ indikátoraként alkalmazható. A nem stimulált limfociták felületükön nem expresszálnak CD69¹et, és a nem specifikus észterázok kis mennyisége jellemzõ rájuk. Alloantigénekkel vagy nem specifikus mitogénekkel bekövetkezett aktiválásukat követõen a CD69 expressziója 48 órán belül megjelenik (csúcs a 24. órában). Az észterázaktivitás röviddel a stimulálás után növekszik, és ez több napig fennmarad. Nem mindegyik allostimulált limfocitareakció játszódik le azonos kinetikával, és elõnyös az aktiválást a tenyésztés 1., 2. és 3. napján is mérni. A donor- és pácienseredetû sejtek tesztmintáit kis tenyészetekben, 0,5×106 sejt/ml sejtsûrûséggel, 2% FCS¹t tartalmazó RPMI-tápközegben összekeverjük, és a kapott tenyészeteket tesztelésig 37 °C¹on, 5% CO2¹ot tartalmazó inkubátorban tartjuk. 18. példa Sejtproliferációs vizsgálati eljárás A [3H]-timidin-beépülést a következõk szerint mérjük: reagáló (responder) limfocitákat 1 millió sejt/ml
2
sejtsûrûséggel – 10% magzati borjúszérumot, antibiotikumokat (sztreptomicin/penicillin) és 5×10–5 M 2¹merkaptoetanolt tartalmazó – RPMI1640-tápközegben szuszpendálunk. E sejtek 100 ml¹ét gömbölyû aljú mik5 rotitertálcák (Costar) üregeibe helyezzük (három ismétléssel). Ezután – a reagáló sejtek készítéséhez hasonló módon – alloantigént hordozó stimulátorsejteket készítünk, de ezeket felhasználás elõtt sugárkezeljük (3000 R; 137Cs-forrás). A stimulátorsejtek 100 ml¹ét 10 hozzáadjuk a responder sejtekhez, és az összekevert limfocitatenyészetet 5% CO2¹ot tartalmazó inkubátorban 37 °C¹on hét napig inkubáljuk. Ezt követõen mindegyik üreghez hatórás idõtartamra 10 ml [3H]-timidint (0,5 mCi/ml, ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, Kali15 fornia) adunk. Ezt követõen a mikrotitertálcát MASH betakarítókészülékkel betakarítjuk a sejteket, és a beépült timidin mennyiségét a betakarított üregek folyadékszcintillációs számlálóval végzett számlálásával határozzuk meg. A stimulációs index (SI) meghatáro20 zásához a vegyes limfocitatenyészetbe beépült [3H]-timidin cpm-értékét elosztjuk a kontroll- (nem stimulált) tenyészetbe beépült [3H]-timidin cpm-értékével. A [3H]timidin beépülése helyett alkalmazhatjuk az akridinnarancs beépülését is. 25 19. példa Tumorantigének azonosítási technikája A SEREX-analízist (tumorantigének rekombináns cDNS-expressziós klónozással végzett szerológiai 30 analízise) Salim és mtsai. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11 810–11 813 (1995)] leírása szerint végezhetjük (lásd az 5,698,396 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást is, amelyet teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintünk). E megközelítési mód sze35 rint a közelmúltban allogén csontvelõ-átültetésen átesett páciensekbõl származó antiszérumot alkalmaznak a ráksejtekben expresszált immunogén proteinantigének – betegekbõl származó leukémiasejtek cDNSébõl létrehozott expressziós könyvtárak szkrínelésével 40 történõ – azonosítására. Az így azonosított, antigént kódoló klónokról bebizonyosodott, hogy azokban a páciensekben, akikbõl az antiszérum származott, nagy titerû humorális immunreakciót váltottak ki. Az ilyen nagy titerû IgG-reakció maga után vonja a detektált an45 tigén helper T¹sejt általi felismerését, ezáltal különösen elõnyös lehet az allogén csontvelõ-átültetésen átesett páciensek vizsgálatára. Az expresszált tumorantigének HLA I. és II. osztályú motívumok jelenlétére és citotoxikus T¹limfocitákkal való reaktivitásra szkrínelhetõk. 50 A SEREX-analízist különféle tumortípusok esetében alkalmazzák, és számos újonnan azonosított, rákkal összefüggõ immunogén génterméket klónoztak [lásd Tiireci és mtsai.: Mol. Med. Today 3, 342–349 (1997); Sahin és mtsai.: Curr. Opin. Immunol. 9, 709–716 55 (1997); Old és mtsai.: J. Exp. Med. 187, 1163–1167 (1998)]. Találmányunk értelmében az így detektált antigéneket specifikusan alloantigénekkel hozzuk összefüggésbe, ami ezen eljárással normális esetben (az ellenük irányuló antitestreakciók hiánya miatt) nem elér60 hetõ. 32
HU 006 857 T2
1/A táblázat Egerekbõl és emberekbõl származó, több allélváltozattal jellemezhetõ fõ hisztokompatibilitási antigének mHAg-k
Protein/gén
Allélek
Hivatkozás
Humán H-Y
SMCY protein
1
Wang és mtsai.
H¹X
SMCX protein
1
Goulmy és mtsai.
DFFRY
Y-specifikus gén
HA-1
KIAA0223 gén
2
Den Haan és mtsai.
HA-2
1. osztályú miozin
3
Goulmy és mtsai.
HA-3
Ismeretlen
n.n.
Goulmy és mtsai.
HA-4
Ismeretlen
n.n.
Goulmy és mtsai.
HA-5
Ismeretlen
2
Goulmy és mtsai.
HA-8
KAA0020
2
Brickner és mtsai.
HB-1
HB¹1 gén
2
Dolstra és mtsai.
CD31
PECAM-1
3
Behar és mtsai.
PR1
Proteináz-3
2
Molldrem és mtsai.
AAPDNRETF
Ismeretlen
2
Perreault és mtsai.
COI
Cyt.Oxidáz
2
Morse és mtsai.
H-Y
SMCY protein
1
Meadows és mtsai.
H-Y
UTY protein
1
Scott és mtsai.
NDI
Dehidrogenáz
4
Loveland és mtsai.
2 gén
Vogt és mtsai.
Egér
1/B táblázat T-sejt-epitópokkal jellemezhetõ humán minor hisztokompatibilitási antigének gyûjteménye mHAg
Gén/protein
Aminosaveltéréseket reprezentáló T¹sejt-epitópok
Humán H-Y
UTY-protein
LPHNHTDL
H-Y
SMCY-protein, AF273841
SPSVDKARAEL RESEEESVSL
H¹X
SMCX-protein, NM0044187
FIDSYICQV
DFFRY
Y-specifikus gén, Y13619
IVDCLTEMY IVDSLTEMY
HA-1
KIAA0223/AF09 2537, CD49a
VLHDDLLEA VLRDDLLEA
HA-2
1. osztályú miozin
YIGEVLVSV YLGEVLVSV YLGEVIVSV
HA-3
n.n.
n.n.
HA-4
n.n.
n.n.
HA-8
KIAA0020
PTLDKVLEV PTLDKVLEL RTLDKVLEV
HA-5
n.n
n.n.
HB-1
CD83 XM004500
EEKRGSLHVW EEKRGSLYVW
Q9Y696
FLDGNELTL FLDGNEMTL
CD31 Vese kloridcsatorna Proteináz-3
119 Ile>Val
33
HU 006 857 T2
2. táblázat Hematológiai betegségekre jellemzõ sejtfelületi markerek Marker
Szinonimák
Specifitás
CD1
Timociták, Langerhans-sejtek
CD2
T- és NK¹sejtek
CD3
Összes timocita, T¹ és NK¹sejtek
CD4
Helper T¹sejtek
CD5
Összes T¹sejt, néhány B¹sejt
CD7
Összes T¹sejt, néhány myeloid sejt
CD8
Citotoxikus T¹sejtek
CD10
CALLA antigén
Korai prekurzorsejtek és pre-B-sejtek
CD13
Granulociták, monociták
CD14
Monociták
CD15
Leu M2
Összes granulocita, Reed-Sternberg sejtek
CD16
NK-sejtek és granulociták
CD19
preB-sejtek, B¹sejtek, de a plazmasejtek nem
CD20
L26
preB-sejtek, de a plazmasejtek nem
CD21
EBV-R
Érett B¹sejtek és follicularis dendritikus sejtek
CD22
Érett B¹sejtek
CD23
Aktivált csontvelõi B¹sejtek
CD30
Ki-I
B-sejtek, T¹sejtek és monociták aktivációs markere
CD33
Myeloid elõd (progenitor) sejtek és monociták
CD34
Korai pluripotens elõdsejt
CD42
Vérlemezke GPIb
Myeloid elõdsejt
CD45
Közös leukocita-antigén (LCA)
Összes leukocita
CD61
Vérlemezke glikoforin
M7 AML¹
S100 CD103
A nyirokcsomó paracortex egymásba kapcsolódó dendritikus sejtjei alfa(E)béta 7¹intergrin
intraepithelialis T¹sejtek
3. táblázat Antigének kódoló SNP¹k által definiált aminosavcseréi Protein/klón
Aminosavpozíció a proteinben
Aminosavcsere
Klón forrása
219.
R>H
cDNS
461.
R>T
Genomi
26.
R>P
Genomi
44.
R>T
Genomi
81.
R>T
Genomi
456.
I>V
Genomi (inverz)
503.
L>V
Genomi (inverz)
186.
T>S
Genomi
101.
F>L
Genomi
Megj.
CD1b SS1509573 CD5
CD10
CD11a SS2883077
SS2077810
34
E/Ib határ?
HU 006 857 T2
3. táblázat (folytatás) Protein/klón
Aminosavpozíció a proteinben
Aminosavcsere
Klón forrása
201.
F>L
Genomi
1126.
V>A
Genomi
688.
D>G
Genomi
699.
H>Y
Genomi
CD11c
CD15 SS602631
717.
V>F
Genomi
SS568511
577.
S>R
Genomi
SS601426
623.
N>D
Genomi (inverz)
SS599361
585.
S>N
Genomi (inverz)
CD31 125.
L>V
563.
N>S
80.
V>M
670.
G>R
57.
Q>STOP
Genomi (inverz)
83.
Q>P
Genomi (inverz)
149.
R>H
Genomi (inverz)
174.
Q>P
Genomi (inverz),
180.
Q>H
Genomi (inverz)
254.
A>S
Genomi (inverz)
279.
G>W
Genomi (inverz)
BG220673
924.
F>V
BG199875
937.
A>V
961.
I>V
1018.
K>R
CD32 SS2972668
SS2707025
CD42b ss523802
CD49a/HA-1
BG207145
BG213953
BG216186
984.
T>S
1097.
R>G
1045.
N>D
1048.
S>Y
980.
N>D
1019.
N>L
BG189057
1089.
V>G
BG181165
1072.
S>C
CD64
SS2113895
SS2628592
272.
R>H
Genomi
224.
Q>STOP
Genomi
272.
R>H
Genomi
224.
Q>STOP
Genomi
35
Megj.
HU 006 857 T2
3. táblázat (folytatás) Protein/klón
Aminosavpozíció a proteinben
Aminosavcsere
Klón forrása
272.
R>H
Genomi
SS848192
224.
Q>STOP
Genomi
SS831265 azonos
SS831265
115.
T>M
Genomi
*
SS2494502
115.
T>M
Genomi
*
SS791727
105.
L>P
Genomi
*
115
T>M
Genomi
115
T>M
Genomi
171
M>K
Genomi
175
R>H
Genomi
SS2771101
324.
D>N
Genomi
338.
T>I
Genomi
SS2763847
SS2771100
SS2776265
SS2763848
324.
D>N
Genomi
338.
T>I
Genomi
324.
D>N
Genomi
338.
T>I
Genomi
324.
D>N
Genomi
338.
T>I
Genomi
338.
T>I
Genomi
324.
D>N
Genomi,
338.
T>I
Genomi
27.
W>R
Genomi
53.
L>M
Megj.
CD65 SS2676258 CD83/HB-15 BI7649019
52.
L>V
51.
K>N
86.
N>S
BI915668
185.
F>S
BG705577
24.
K>Q
23.
G>V
Genomi
*
25.
P>S
Genomi
*
39.
G>P
Genom
*
Desmin SS2086285
SS2857642
66.
S>L
Genomi
119.
F>S
Genomi
*
120.
A>P
Genomi
*
121.
N>I
Genomi
*
123.
I>M
Genomi
*
134.
A inszerció
Genomi
*
13.
A>E
cDNS
Glikoforin A SS1551184
36
HU 006 857 T2
3. táblázat (folytatás) Protein/klón
Aminosavpozíció a proteinben
Aminosavcsere
Klón forrása
206.
E>D
Genomi
Megj.
Ritka SS149153 SS2969286
1760.
I>V
Genomi
SS22973
1067.
N>K
Genomi
SS1524550
464.
G>E
cDNS
SS15224552
517.
Q>H
cDNS
748.
T>A
Genomi
755.
I>V
Genomi
804.
R>Q
Genomi
817.
V>A
Genomi
399.
T>A
cDNS
SMCY SS2882267
Vimentin SS1554759
4. táblázat A CD42-ben bekövetkezett aminosavcseréket reprezentáló HLA I. osztályú kötõpeptidek CD42b peptidfragmens
WKQGVDVKAMTSNVASVQ
WKQGVDVKSMTSNVASVQ
HLA típus
Poz.
HLA-kötõ peptidek
Pont
HLA–A*0201
9.
AMTSNVASV
27
HLA–A*0201
6.
DVKAMTSNV
14
HLA–A*0201
1.
WKQGVDVKA
10
HLA–A*0201
2.
KQGVDVKAM
9
HLA–A*0201
8.
KAMTSNVAS
9
HLA–A*0201
4.
GVDVKAMTS
8
HLA–A*0201
7.
VKAMTSNVA
8
HLA–A*0203
7.
VKAMTSNVA
12
HLA–A*0203
1.
WKQGVDVKA
9
HLA A1
4.
GVDVKAMTS
10
HLA A1
10.
MTSNVASVQ
9
HLA A3
4.
GVDVKAMTS
19
HLA A3
6.
DVKAMTSNV
16
HLA A3
10.
MTSNVASVQ
12
HLA A3
3.
QGVDVKAMT
8
HLA A3
8.
KAMTSNVAS8
8
HLA A3
9.
AMTSNVASV
8
HLA–A*0201
9.
SMTSNVASV
27
HLA–A*0201
6.
DVKSMTSNV
14
HLA–A*0201
2.
KQGVDVKSM
10
HLA–A*0201
4.
GVDVKSMTS
8
HLA–A*0203
7.
VKSMTSNVA
9
HLA A1
4.
GVDVKSMTS
10
HLA A1
10.
MTSNVASVQ
9
HLA A3
4.
GVDVKSMTS
16
HLA A3
6.
DVKSMTSNV
14
37
HU 006 857 T2
4. táblázat (folytatás) CD42b peptidfragmens
PVYICYPGKGCPTLGDEG
PVYKYPGKWCPTLGDEG
HLA típus
Poz.
HLA-kötõ peptidek
Pont
HLA A3
10.
MTSNVASVQ
12
HLA A3
3.
QGVDVKSMT
8
HLA A3
8.
KSMTSNVAS
8
HLA–A*0201
5.
YPGKGCPTL
17
HLA–A*0201
4.
KYPGKGCPT
8
HLA A1
3.
YKYPGKGCP
8
HLA A3
1.
PVYKYPGKG
16
HLA A3
3.
YKYPGKGCP
10
HLA A3
4.
KYPGKGCPT
9
HLA–A*0201
5.
YPGKWCPTL
15
HLA–A*0201
4.
KYPGKWCPT
8
HLA A1
3.
YKYPGKWCP
8
HLA A3
1.
PVYKYPGKW
16
HLA A3
3.
YKYPGKWCP
9
5. táblázat Kiválasztott CD¹proteinekben lévõ aminosavcseréket reprezentáló HLA-kötõ peptidek
38
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
39
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
40
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
41
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
42
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
43
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
44
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
45
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
46
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
47
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
48
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
49
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
50
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
51
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
52
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
53
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
54
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
55
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
56
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
57
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
58
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
59
HU 006 857 T2
5. táblázat (folytatás)
60
HU 006 857 T2
6. táblázat A HLA-antigének hipervariábilis régióin kívüli aminosavcseréket reprezentáló HLA-kötõ peptidek. Az I. osztályú allélváltozatokat a HLA–A*2502 vonatkoztatási szekvenciával összehasonlítva azonosítottuk HLA–A allél
A*0230
Aminosavpozíció
Aminosavcsere HLA–A*2502höz viszonyítva
3.
H>Q
7.
Y>C
9.
Y>F
9.
Y>S
A*2408 A*2420 A*2305 A*2425 A*01011
A*02016
A*0225
A*03011
A*7404
A*01012
A*0202
A*0226
A*03012
A*7405
A*0103
A*0203
A*0227
A*03013
A*7406
A*0106
A*0204
A*0229
A*0302
A*7407
A*0107
A*0205
A*0230
A*0304
A*7408
A*0108
A*0206
A*0231
A*0305
A*8001
A*0109
A*0207
A*0233
A*0306
A*02011
A*0208
A*0234
A*0307
A*02012
A*0209
A*0235
A*0308
A*02013
A*0210
A*0236
A*0309
A*02014
A*0211
A*0237
A*2503
A*02015
A*0212
A*0238
A*3201
A*02016
A*0213
A*0239
A*3202
A*0202
A*0216
A*0240
A*3203
A*0203
A*02171
A*0242
A*3204
A*0204
A*02172
A*0245
A*3205
A*0207
A*0218
A*0246
A*3206
A*0209
A*0219
A*0247
A*3601
A*02011
A*02201
A*0248
A*3602
A*02012
A*02202
A*0249
A*3603
A*02013
A*0222
A*0250
A*7401
A*02014
A*0224
A*0252
A*02015
A*7402 A*7403
A*0102
A*2415
A*2616
A*2301
A*2417
A*3001
A*2302
A*2418
A*3002
A*2303
A*2419
A*3003
A*2305
A*2420
A*3004
A*2402101
A*2422
A*3007
A*2402102
A*2423
A*3009
A*24022
A*2424
A*3010
A*24031
A*2425
A*3011
A*24032
A*2426
A*3207
A*2404
A*2427
A*2405
A*2428
A*2406
A*2429
A*2407
A*2430
61
HU 006 857 T2
6. táblázat (folytatás) Aminosavpozíció
Aminosavcsere HLA–A*2502höz viszonyítva
9.
Y>T
12.
V>M
17.
R>S
A*1102
19.
E>K
A*0242
24.
A>S
A*0221
30.
D>N
A*3006
31.
T>A
A*8001
31.
T>S
A*0109
33.
F>L
A*8001
35.
R>Q
A*2615
36.
F>L
A*0231
41.
A>G
A*0202
43.
Q>R
44.
R>K
52.
I>M
HLA–A allél
A*2408
A*2431
A*2410
A*2432
A*2413
A*2433
A*2414
A*2434
A*2416
A*3103
A*2901101
A*3104
A*2902
A*3105
A*2903
A*3106
A*2904
A*3301
A*2905
A*3303
A*2906
A*3304
A*31012
A*3305
A*3102
A*3306
A*0250 A*6802 A*6815 A*0102
A*3007
A*3001
A*3008
A*3002
A*3009
A*3003
A*3010
A*3004
A*3011
A*3006
A*0205 A*0208 A*0214 A*0247 A*01011
A*0108
A*01012
A*0109
A*0102
A*3601
A*0103
A*3602
A*0106
A*3603
A*0107 A*3306
62
1
HU 006 857 T2
2
6. táblázat (folytatás) Aminosavpozíció
Aminosavcsere HLA–A*2502höz viszonyítva
54.
Q>R
56.
G>R
A*0228
56.
G>S
A*8008
56.
G>E
HLA–A allél
A*3305 A*0107
A*3010
A*3001
A*31012
A*3002
A*3102
A*3004
A*3103
A*3006
A*3104
A*3007
A*3105
A*3008
A*3106
A*3009
A*3404
http://www.eurekah.com/reports/vaccines/kast/01/
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás egy adott fajból származó antigén természetû peptidek vagy proteinek – kódoló egypontos nukleotidpolimorfizmussal összefüggõ egy vagy több aminosavcserén alapuló – allélváltozatai epitópjainak azonosítására, mely eljárás magában foglalja a következõ lépéseket: (i) egy vagy több kívánt protein és/vagy peptid definiálása; (ii) az említett faj legalább két vagy több DNS-könyvtárát reprezentáló adatbázis szkrínelése az említett, egy vagy több definiált peptidre és/vagy proteinre; (iii) a kódolórégiójában legalább egy egypontos nukleotidpolimorfizmust tartalmazó DNS-szekvencia által kódolt peptid/protein allélváltozatok, expressziós termékek vagy fragmenseik aminosavcseréinek azonosítása és kiválasztása; (iv) a polimorfizmus által megváltoztatott aminosavat magukban foglaló, 8–25 aminosavból álló epitópok létrehozása; és (v) az MHC-proteinhez kötõdõ epitópok kiválasztása. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az allélváltozatok kiméra státusát allotranszplantált sejtek hozták létre vagy okozták, és a recipiens sejtek a donortól eltérõ allélváltozatokat expresszálnak és prezentálnak. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol az antigén természetû peptid vagy protein betegséggel vagy rendellenességgel áll összefüggésben, és a betegség vagy rendellenesség allogén transzplantációt igényel. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, ahol az antigén természetû peptid vagy protein beteg szövetben vagy szervben expresszálódik, normális szövet vagy szerv sejtjeivel összehasonlítva. 5. A 2. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, ahol a betegség vagy rendellenesség rák, és a beteg szövet vagy szerv rákos szövet vagy szerv.
25
30
35
40
45
50
55
60 63
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, ahol a recipiens rákos sejtjei expresszálták az allélváltozatot, amely eltérõ volt a donor allotranszplantált sejtjei által expresszálttól. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az MHCprotein egy HLA-molekula. 8. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az 1. igénypont (iv) lépésével létrehozott epitópok 9–16 aminosavból álló peptidek. 9. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az epitópok graft versus host betegség (GVHD) immunreakciót indukálnak. 10. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az epitópok graft versus tumor (GVT) immunreakciót indukálnak. 11. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a kívánt protein vagy polipeptid az 1–6. táblázatokban felsorolt antigének közül van kiválasztva. 12. Eljárás egy adott fajba tartozó egy vagy több egyed SNP-profiljának elkészítésére, az 1. igénypont szerinti eljárásnak az egyedek több proteinjére történõ alkalmazásával. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol az SNPprofil betegséggel állt összefüggésben. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, ahol a betegség rák. 15. Eljárás betegség diagnosztizálására egy egyedben, az egyed SNP-vel összefüggõ polimorfizmusprofiljának 12. igénypont szerinti eljárással történõ elkészítésével. 16. Ex vivo eljárás egy elsõ egyedbõl származó specifikus protein eltérõ allélváltozatainak meghatározására és kiválasztására ugyanazon fajba tartozó másik egyedbõl származókkal összehasonlítva, ahol az eltérésbõl az egyedek egyikében kóros állapotra vagy betegségre következtetünk, mely eljárás magában foglalja a következõ lépéseket: (i) mintavétel az elsõ, valamint a második egyed kiválasztott szövetébõl vagy szervébõl;
1
HU 006 857 T2
(ii) az egyes minták szkrínelése a protein allélváltozatainak legalább egy egyszeres aminosaveltérésére, mely aminosaveltérés HLA-proteinhez kötõdik és egyetlen SNP kódolja, vagy annak expressziós terméke vagy az expressziós termék fragmense; és (iii) kiválasztjuk azokat az eltéréseket, amelyek csak az egyik egyedben fordulnak elõ. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, ahol a minta beteg szövetbõl származik, és az aminosaveltérés a kóros állapotú egyedben fordul elõ.
5
2
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett egyszeres aminosaveltérést reprezentáló peptid vagy polipeptid kizárólag vagy elsõsorban a beteg egyed antigénprezentáló sejtjéhez vagy HLA-proteinjéhez kötõdik. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, ahol a peptidet vagy polipeptidet citotoxikus T¹limfociták (CTL¹ek) ismerik fel.
10
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
