!HU000008343T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 343
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 468043 P 2003. 05. 05. 468014 P 2003. 05. 05. 512038 P 2003. 10. 15.
(73) Jogosult: Probiodrug AG, 06120 Halle/Saale (DE)
US US US
(72) Feltalálók: DEMUTH, Hans-Ulrich, 06114 Halle/Saale (DE); HOFFMANN, Torsten, 06114 Halle/Saale (DE); NIESTROJ, André, J., 06193 Sennewitz (DE); SCHILLING, Stephan, 06130 Halle/Saale (DE); HEISER, Ulrich, 06108 Halle/Saale (DE) (54)
HU 008 343 T2
A61K 31/00
(21) Magyar ügyszám: E 04 731150 (22) A bejelentés napja: 2004. 05. 05. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040731150 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1620082 A2 2004. 11. 18. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1620082 B1 2010. 04. 21.
(2006.01) A61K 31/4745 (2006.01) A61P 25/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04098625 PCT/EP 04/004778
(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
A glutaminil- és glutamát-ciklázok inhibitorainak orvosi alkalmazása Alzheimer-kór és Down-szindróma kezelésére
A leírás terjedelme 56 oldal (ezen belül 21 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.
1
HU 008 343 T2
A találmány területe A találmány tárgyát glutaminil-cikláz (QC, EC 2.3.2.5) képezi, amely az N¹terminális glutaminoldalláncok intramolekuláris ciklizálását katalizálja piroglutaminsavvá (5¹oxo-prolin, pGlu*) ammónia felszabadulása mellett és az N¹terminális glutamátoldalláncok intramolekuláris ciklizálását piroglutaminsavvá víz felszabadulása mellett. A jelen találmány az emlõs QC¹ket metalloenzimekként azonosítja, és a tárgyát képezik QC¹k új fiziológiás szubsztrátjai emlõsökben, és QC inhibitorainak és QC inhibitorait tartalmazó gyógyászati készítmények alkalmazása olyan állapotok kezelésére, amelyek kezelhetõk QC¹aktivitás modulálásával. Emellett kimutattuk, hogy a fémkölcsönhatás hasznos megközelítési mód QC inhibitorok kifejlesztésére. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát képezi QC¹aktivitás inhibitorainak alkalmazása kombinációban DP¹IV vagy DP¹IV-szerû enzimek inhibitoraival olyan állapotok kezelésére vagy enyhítésére, amelyek kezelhetõk QC¹ és/vagy DP¹IV-aktivitás modulálásával. Háttér A glutaminil-cikláz (QC, EC 2.3.2.5) az N¹terminális glutaminoldalláncok intramolekuláris ciklizálását katalizálja piroglutaminsavvá (pGlu*) ammónia felszabadításával. A QC¹t elõször Messer izolálta a Carica papaya trópusi növény latexébõl 1963-ben (Messer, M., 1963 Nature 4874, 1299. oldal). 24 évvel késõbb a megfelelõ enzimaktivitást felfedezték állati hipofízisben (Busby, W. H. J. és munkatársai, 1987 J. Biol. Chem. 262, 8532–8536. oldal; Fischer, W. H. és Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 3628–3632. oldal). Az emlõs QC esetében a Gln QC általi pGlu¹vá történõ konverziója kimutatható a TRH és GnRH prekurzorai esetében (Busby, W. H. J. és munkatársai, 1987 J. Biol. Chem. 262, 8532–8536. oldal; Fischer, W. H. és Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 3628–3632. oldal). Emellett a QC kezdeti lokalizációs kísérletei feltárták a katalízis feltételezett termékeivel való együttes lokalizációt a szarvasmarha-hipofízisben, tovább javítva a javasolt funkcióját a peptid-hormon szintézisben (Bockers, T. M. és munkatársai., 1995 J. Neuroendocrinol 7, 445–453. oldal). Ezzel ellentétben a növényi QC fiziológiás funkciója kevésbé világos. A C. papayából származó enzim esetében javasolták a növény védekezését patogén mikroorganizmusok ellen (El Moussaoui, A. és munkatársai, 2001 Cell Mol Life Sci 58, 556–570. oldal). Újabban azonosítottak feltételezett QC¹ket más növényekbõl is szekvencia-összehasonlításokkal (Dahl, S. W. és munkatársai, 2000 Protein Expr Purif 20, 27–36. oldal). Ezen enzimek fiziológiás funkciója azonban továbbra sem egyértelmû. A növényekbõl és állatokból ismert QC¹k szigorú specifitást mutatnak L¹glutaminra a szubsztrátok N¹terminális pozíciójában és a kinetikai viselkedésükrõl azt találták, hogy követik a Michaelis–Menten-egyenletet (Pohl, T. és munkatársai, 1991 Proc Natl Acad Sci U S
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
A 88, 10059–10063. oldal; Consalvo, A. P. és munkatársai, 1988 Anal Biochem 175, 131–138. oldal; Gololobov, M. Y. és munkatársai, 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377, 395–398. oldal). A C. papayából származó QC¹k és emlõsökbõl származó erõsen konzervált QC¹k elsõdleges szerkezetének az összehasonlítása azonban nem mutatott szekvenciahomológiát (Dahl, S. W. és munkatársai, 2000 Protein Expr Purif 20, 27–36. oldal). Míg a növényi QC¹k látszólag egy új enzimcsaládba tartoznak (Dahl, S. W, és munkatársai, 2000 Protein Expr Purif 20, 27–36. oldal), az emlõs QC¹krõl azt találták, hogy kifejezett szekvenciahomológiát mutatnak bakteriális aminopeptidázokkal (Bateman, R. C. és munkatársai, 2001 Biochemistry 40, 11246–11250. oldal), ami arra következtetésre vezetett, hogy a növényekbõl és állatokból származó QC¹k különbözõ evolúciós eredetûek. Az EP 02 011 349.4 számú európai szabadalmi bejelentés rovar glutaminil-ciklázt kódoló polinukleotidokat, valamint azok által kódolt polipeptideket tár fel. Ennek a bejelentésnek továbbá tárgyát képezik olyan gazdasejtek, amelyek a találmány szerinti polinukleotidokat tartalmazó expressziós vektorokat tartalmaznak. Izolált polipeptidek és rovar QC¹ket tartalmazó gazdasejtek hasznosak olyan ágensekre szkrínelõ eljárásokban, amelyek csökkentik a glutaminil-cikláz aktivitását. Ilyen ágenseket peszticidként hasznosnak írnak le. Az Alzheimer-kórt (AD) extracelluláris amiloid plakkok abnormális felhalmozódása jellemzi, ami szoros kapcsolatban áll disztrófiás neuronokkal, reaktív asztrocitákkal és mikrogliával (Terry, R. D. és Katzman, R., 1983 Ann Neurol 14, 497–506. oldal; Glenner, G. G. és Wong, C. W., 1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885–890. oldal; Intagaki, S. és munkatársai, 1989 J Neuroimmunol 24, 173–182. oldal; Funato, H. és munkatársai, 1998 Am J Pathol 152, 983–992. oldal; Selkoe, D. J., 2001 Physiol Rev 81, 741–766. oldal). Az amiloid¹b (Ab) peptidek a szenilis plakkok elsõdleges komponensei és azokat közvetlenül részt vevõnek tartják az AD patogenezisében és elõrehaladásában, amely hipotézist genetikai vizsgálatok is alátámasztanak (Glenner, G. G. és Wong, C. W., 1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885–890. oldal; Borchelt, D. R. és munkatársai, 1996 Neuron 17, 1005–1013. oldal; Lemere, C. A. és munkatársai, 1996 Nat Med 2, 1146–1150. oldal; Mann, D. M. és Iwatsubo, T., 1996 Neurodegeneration 5, 115–120. oldal; Citron, M. és munkatársai, 1997 Nat Med 3, 67–72. oldal; Selkoe, D. J., 2001 Physiol Rev 81, 741–766. oldal). Az Ab a b¹amiloid prekurzor fehérje (APP) proteolitikus feldolgozásával jön létre (Kang, J. és munkatársai, 1987 Nature 325, 733–736. oldal; Selkoe, D. J., 1998 Trends Cell Biol 8,447–453. oldal), amely szekvenciálisan elhasítódik b¹szekretázzal az Ab N¹terminálisán és a g¹szekretázzal a C¹terminálisán (Haass, C. és Selkoe, D. J., 1993 Cell 75, 1039–1042. oldal; Simons, M. és munkatársai, 1996 J Neurosci 16 899–908. oldal). Az N¹terminálison L¹Asp¹t tartalmazó domináns Ab peptidek (Ab1–42/40) mellett, az N¹terminálisan csonkolt formák nagymértékû heterogenitása fordul elõ szenilis
1
HU 008 343 T2
plakkokban. Beszámoltak arról, hogy az ilyen rövidített peptidek neurotoxikusabbak in vitro és gyorsabban aggregálódnak, mint a teljes hosszúságú izoformák (Pike, C. J. és munkatársai, 1995 J Biol Chem 270 23895–23898. oldal). Az N¹csonkolt peptidek ismert módon túltermelõdnek a korai megjelenésû családi AD¹ben (FAD) szenvedõ alanyokban (Saido, T. C. és munkatársai, 1995 Neuron 14, 457–466. oldal; Russo, C. és munkatársai, 2000 Nature 405, 531–532. oldal), hamar megjelennek és növekszenek a korral a Down-szindrómás (DS) agyban (Russo, C. és munkatársai, 1997 FEBS Lett 409, 411–416. oldal, Russo, C. és munkatársai, 2001 Neurobiol Dis 8, 173–180. oldal; Tekirian, T. L. és munkatársai, 1998 J Neuropathol Exp Neurol 57, 76–94. oldal). Végezetül a mennyiségük tükrözi a betegség progresszív súlyosságát (Russo, C. és munkatársai, 1997 FEBS Lett 409, 411–416. oldal). További poszt-transzlációs folyamatok tovább módosíthatják az N¹terminálist a 1. és 7. pozícióban található aszparaginsav izomerizációjával vagy racemizációjával, és a 3. és 11. pozícióban található glutaminsav ciklizációjával. A 3¹as pozícióban piroglutamátot tartalmazó izoformák [pGlu3]Ab3–40/42] jelentik a szenilis plakkokban található N¹csonkolt fajták prominens – az Ab összes mennyiségének 50%¹a – formáit (Mori, H. és munkatársai, 1992 J Biol Chem 267, 17082–17086. oldal, Saido, T. C. és munkatársai, 1995 Neuron 14, 457–466. oldal; Russo, C. és munkatársai, 1997 FEBS Lett 409, 411–416. oldal; Tekirian, T. L. és munkatársai, 1998 J Neuropathol Exp Neurol 57, 76–94. oldal; Geddes, J. W. és munkatársai, 1999 Neurobiol Aging 20, 75–79. oldal; Harigaya, Y. és munkatársai, 2000 Biochem Biophys Res Commun 276, 422–427. oldal) és jelen vannak a preamiloid léziókban is (Lalowski, M. és munkatársai, 1996 J Biol Chem 271, 33623–33631. oldal). Az AbN3(pE) peptidek felhalmozódása valószínûleg azon szerkezeti módosulások miatt van, amelyek fokozzák az aggregációt és rezisztenciát okoznak a legtöbb amino-peptidázzal szemben (Saido, T. C. és munkatársai, 1995 Neuron 14, 457–466. oldal; Tekirian, T. L. és munkatársai, 1999 J Neurochem 73, 1584–1589. oldal). Ez a bizonyíték a kulcsa az AbN3(pE) peptidek AD patogenezisében betöltött döntõ szerepének. Azonban viszonylag keveset tudunk a neurotoxicitásukról és aggregációs tulajdonságaikról (He, W. és Barrow, C. J., 1999 Biochemistry 38, 10871–10877. oldal; Tekirian, T. L. és munkatársai, 1999 J Neurochem 73, 1584–1589. oldal). Továbbá ezen izoformák hatása a gliasejtekre és a gliális válasz ezekre a peptidekre teljesen ismeretlen, habár az aktivált glia szigorúan a szenilis plakkokkal kapcsolatos és aktívan hozzájárulhat az amiloid lerakódások felhalmozódásához. Újabb vizsgálatokban az Ab1–42, Ab1–40, [pGlu3]Ab3–42 és [pGlu3]Ab3–40 peptidek toxicitását, aggregációját és katabolizmusát vizsgálták neuronális és glia sejttenyészetekben, és kimutatták, hogy a piroglutamát módosítás súlyosbítja az Ab-peptidek toxikus tulajdonságait és gátolja azok tenyésztett asztrociták általi degradációját is. Shirotani és munkatársai vizsgálták a [pGlu3]Ab peptidek keletkezését Sindbis
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
vírussal megfertõzött primer agykérgi neuronokban in vitro. Létrehoztak amiloid prekurzor fehérje komplementer DNS-eket, amelyek a [pGlu3]Ab potenciális prekurzorát kódolják aminosavszubsztitúcióval és delécióval. Egy, a természetes prekurzorban lévõ glutamát helyett N¹terminális glutaminoldallánccal kezdõdõ mesterséges prekurzor esetében spontán konverziót vagy glutaminil-cikláz általi piroglutamáttá történõ konverziót javasoltak. A [pGlu3]Ab természetes prekurzorában a 3¹as pozícióban található N¹terminális glutamát ciklizációs mechanizmusát nem határozták meg in vivo (Shirotani, K., Tsubuki, S., Lee, H. J., Maruyama, K., és Saido, T. C. (2002) Neurosci Lett 327, 25–28. oldal). A dipeptidil-peptidáz¹IV (DP¹IV) egy poszt-prolin (kisebb mértékben poszt-alanin, poszt-szerin vagy posztglicin) hasító szerin proteáz, amely a szervezet különbözõ szöveteiben található meg, beleértve a vesét, májat és a belet, és N¹terminális dipeptideket hasít le peptidláncokról. Újabban kimutatták, hogy a DP¹IV fontos szerepet játszik a neuropeptid-anyagcserében, T¹sejtaktiválásban, ráksejtek endotéliumhoz való kapcsolódásában és HIV limfoid sejtekbe történõ bejutásában. Lásd a WO 02/34242, WO 02/34243, WO 03/002595 és WO 03/002596 számú nemzetközi közzétételi iratokat. Ismert, hogy a DP¹IV inhibitorok hasznosak lehetnek a zavart glükóz-tolerancia és diabetes mellitusz kezelésére (WO 99/61431 számú nemzetközi közzétételi irat, Pederson, R. A. és munkatársai, 1998 Diabetes 47, 1253–1258. oldal és Pauly, R. P. és munkatársai, 1999 Metabolism 48, 385–389. oldal). Közelebbrõl a WO 99/61431 számú nemzetközi közzétételi irat aminosav-oldalláncot és tiazolidin vagy pirrolidin-csoportot tartalmazó DP¹IV inhibitorokat és azok sóit tárja fel, különösen az L¹treo-izoleucil-tiazolidin, L¹allo-izoleuciltiazolidin, L¹treo-izoleucil-pirrolidin, L¹allo-izoleucil-tiazolidin, L¹allo-izoleucil-pirrolidin és azok sói. Az alacsony molekulatömegû dipeptidil-peptidáz¹IV inhibitorok további példái az olyan ágensek, mint például a tetrahidroizoquinolin-3-karboxamid származékok, N¹szubsztituált 2¹cianopirolok és ¹pirrolidinek, N¹(N’-szubsztituált glicil)-2-cianopirrolidinok, N¹(szubsztituált glicil)-tiazolidinek, N¹(szubsztituált glicil)-4-cianotiazolidinek, amino-acil-borono-prolil-inhibitorok, ciklopropil-fuzionált pirrolidinek és heterociklusos vegyületek. Dipeptidil-peptidáz¹IV inhibitorokat ismertetnek a következõ irodalmi helyeken: US 6 380 398, US 6 011 155; US 6 107 317; US 6 110 949, US 6,124,305, US 6,172,081, WO 95/15309, WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99161219, DE 198 34 591, WO 97/40832, DE 196 16 486 C2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/38501, WO 01/68603, WO 01/40180, WO 01/81337, WO 01/81304, WO 01/55105, WO 02/02560 és WO 02/14271, WO 02/04610, WO 02/051836, WO 02/068420, WO 02/076450, WO 02/083128, WO 02/38541, WO 03/000180, WO 03/000181, WO 03/000250, WO 03/002530, WO 03/002531, WO 03/002553, WO 03/002593, WO 03/004496, WO 03/024942 és WO 03/024965.
1
HU 008 343 T2
A találmány összefoglalása A találmány tárgyát QC új fiziológiás szubsztrátjai képezik emlõsökben, Ab3–40/42, [Gln3]Ab3–40/42, [Glu11]Ab11–40/42, [Gln11]Ab11–40/42, [Gln1]gasztrin, [Gln1]neurotenzin, [Gln1]FPP, [Gln1]CCL 2, [Gln1]CCL 7, [Gln 1 ]CCL 8, [Gln 1 ]CCL 16, [Gln 1 ]CCL 188, [Gln1]fraktalkin, [Gln1]orexin¹A, [Gln3]glukagon3–29 és [Gln1]P-anyag5–11, és QC inhibitorok és QC inhibitorokat tartalmazó gyógyászati készítmények alkalmazása olyan állapotok kezelésére, amelyek kezelhetõk a QC¹aktivitás modulálásával. Inhibíciós vizsgálatokkal kimutattuk, hogy a humán QC fémfüggõ transzferáz. A QC apoenzimet leghatékonyabban cinkionokkal aktiválhatjuk újra, és cinkfüggõ aminopeptidázok fémkötõ motívuma is jelen van a humán QC¹ben. Az aktív helyhez kötött fémmel reagáló vegyületek hatásos inhibitorok. Váratlan módon kimutattuk, hogy a rekombináns humán QC, valamint az agyi extraktumokból származó QC¹aktivitás katalizálja az N¹terminális glutaminil, valamint a glutamát ciklizációját egyaránt. A legmeglepõbb az a felismerés, hogy a ciklázkatalizált Glu1-konverzió pH=6,0 körül favorizált, míg a Gln1-konverzió pGluszármazékokká 8,0 körüli pH¹optimumon megy végbe. Mivel a pGlu-Ab-val kapcsolatos peptidek kialakulását szuppreszálhatjuk a rekombináns humán QC és sertés hipofízis extraktumokból származó QC¹aktivitás gátlásával, a QC enzim gyógyszer-fejlesztés célpontja Alzheimer-kór kezelésére. QC-aktivitás inhibitorainak emlõsnek történõ beadásával lehetséges lehet megelõzni vagy enyhíteni vagy kezelni az Alzheimer-kór és Down-szindróma közül választott állapotokat. Ezenfelül a QC¹aktivitás inhibitorainak emlõsnek történõ beadásával lehetséges lehet szuppresszálni a mieloid progenitor sejtek proliferációját. Emellett QC inhibitorok beadása hím termékenység szuppresszálásához vezethet. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát képezi QC¹aktivitás inhibitorainak alkalmazása kombinációban DP¹IV vagy DP¹IV-szerû enzimek inhibitoraival olyan állapotok kezelésére vagy enyhítésére, amelyek kezelhetõk QC¹ és/vagy DP¹IV-aktivitás modulálásával. A találmány tárgyát gyógyászati készítmények képezik parenterális, enterális vagy orális beadásra, amelyek legalább egy QC inhibitort tartalmaznak, adott esetben kombinációban szokásos hordozókkal és/vagy excipiensekkel; vagy amelyek legalább egy QC inhibitort tartalmaznak kombinációban legalább egy DP¹IV inhibitorral, adott esetben kombinálva szokásos hordozókkal és/vagy excipiensekkel. Az ábrák rövid ismertetése A találmány ezen és más aspektusai nyilvánvalóak az alábbi ábrákra való hivatkozással, amelyeken: az 1. ábra a H¹Gln-Ala¹OH ciklizációja elõrehaladásának a görbéjét mutatja be, humán QC¹vel katalizálva, 340 nm¹en monitorozva az abszorbancia csökkenését.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
A minták 0,3 mM NADH/H+¹t, 14 mM a¹ketoglutársavat, 30 U/ml glutaminsavdehidrogenázt és 1 mM H¹Gln-Ala-OH¹t tartalmaztak. Az A¹D görbéken különbözõ koncentrációjú QC¹t alkalmaztunk: A, 10 mU/ml, B, 5 mU/ml, C, 2,5 mU/ml. A D görbe esetében elhagytuk a QC¹t. Lineáris összefüggést kaptunk a QC koncentráció és a megfigyelt aktivitás között (beágyazva). A 2. ábra humán és papaya (beágyazva) QC pH¹függését mutatja be, elsõrendû sebességi körülmények között meghatározva, Gln-bNA¹t alkalmazva szubsztrátként. A humán QC esetében a pufferrendszer állandó ionerõsséget biztosított, amilyet Ellis és Morrison alkalmazott, amely 25 mM MES-bõl, 25 mM ecetsavból és 50 mM Tris-bõl állt (Ellis, K. J. és Morrison, J. F. 1982 Methods Enzymol. 87, 405–426. oldal). A Tris kismértékû gátlóhatása miatt a papaya QC¹t 50 mM Mops puffer alkalmazásával vizsgáltuk. Az ionerõsséget 0,05 M¹ra állítottuk be NaCl hozzáadásával. A sebesség-profilokat olyan modellre illesztve értékeltük, amely disszociáló csoportokon alapszik. A papaya QC esetében 7,13±0,03 pKa értéket kaptunk az adatok egyetlen disszociációs modellre való illesztésével. A 3. ábra a pH hatását mutatja be papaya latexbõl származó QC és humán QC stabilitására. Enzimtörzsoldatot hígítottunk meg 20¹szorosra különbözõ pH¹jú 0,1 M pufferekben (pH=4–7 nátrium-citrát, pH=7–10 nátrium-foszfát). Enzimoldatokat inkubáltunk 30 °C¹on 30 percen keresztül és azután elemeztük az enzimaktivitást szokásos protokoll alkalmazásával. A 4. ábra a kcat/KM specifitási állandó összehasonlítását mutatja be a második aminosavpozícióban glutamátot tartalmazó szubsztrátok készletére. Míg a humán QC specifitásának növekedését detektáltuk a di®tetrapeptidek esetében, nem figyeltünk meg változást a papaya QC esetében. A bemutatott adatok a 3. táblázatban megadott paraméterek újbóli ábrázolását képviselik. Az 5. ábra pGlu-Lys(pGlu)-Arg-Leu-Ala-NH2 kialakulását mutatja be H¹Gln-Lys(Gln)-ArgLeu-Ala-NH2-bõl, humán QC által katalizálva. A szubsztrát átalakulását az m/z arány ammónia kipárolgása miatti idõfüggõ változásával monitoroztuk. A minta összetétele 0,5 mM szubsztrát, 38 nM QC volt 40 mM Tris/HCl, pH=7,7 pufferben. A jelzett idõpontokban mintákat vet-
1
HU 008 343 T2
tünk a vizsgálati csõbõl, összekevertük mátrixoldattal (1:1 v/v) és azt követõen felvettük a tömegspektrumot. Hasonló függést figyeltünk meg a papaya QC esetében. A 6. ábra pGlu-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2 kialakulását mutatja be H¹Gln(NMe)-Phe-Lys-AlaGlu-NH2-bõl, papaya QC által katalizálva. A szubsztrát átalakulását az m/z arány metil-amin kipárolgása miatti idõfüggõ változásával monitoroztuk. A minta összetétele 0,5 mM szubsztrát, 0,65 mM papaya QC volt 40 mM Tris/HCl, pH=7,7 pufferben. A jelzett idõpontokban mintákat vettünk a vizsgálati csõbõl, összekevertük mátrixoldattal (1:1 v/v) és azt követõen felvettük a tömegspektrumot. Nem figyeltük meg szubsztrát átalakulást papaya QC nélküli mintákban, vagy ahol maximum 1,5 mM humán QC¹t alkalmaztunk a szubsztráton (nem mutatjuk). A 7. ábra [Gln3]-Ab3–11 kialakulását mutatja be [Gln3]Ab1–11-bõl, DP¹IV által katalizálva. A jelzett idõpontokban mintákat vettünk a vizsgálati csõbõl, összekevertük mátrixoldattal (1:1 v/v) és azt követõen felvettük a tömegspektrumot. A 8. ábra [Gln 3 ]Ab1–11 elhasításának gátlását mutatja be a DP¹IV-inhibitor Val-pirrolidid (Val-Pyrr) által. A jelzett idõpontokban mintákat vettünk a vizsgálati csõbõl, összekevertük mátrixoldattal (1:1 v/v) és azt követõen felvettük a tömegspektrumot. A 9. ábra [pGlu3]Ab3–11 kialakulását mutatja be [Gln3]Ab3–11-bõl, QC által katalizálva. A jelzett idõpontokban mintákat vettünk a vizsgálati csõbõl, összekevertük mátrixoldattal (1:1 v/v) és azt követõen felvettük a tömegspektrumot. A 10. ábra [pGlu3]Ab3–11 [Gln3]Ab3–11-bõl történõ kialakulásának gátlását mutatja be a QC¹inhibitor 1,10-fenantrolin által. A jelzett idõpontokban mintákat vettünk a vizsgálati csõbõl, összekevertük mátrixoldattal (1:1 v/v) és azt követõen felvettük a tömegspektrumot. A 11. ábra [pGlu3]Ab3–11 kialakulását mutatja be [Gln3]Ab1–11-bõl DP¹IV és QC egymást követõ katalízise után. A jelzett idõpontokban mintákat vettünk a vizsgálati csõbõl, összekevertük mátrixoldattal (1:1 v/v) és azt követõen felvettük a tömegspektrumot. A 12. ábra [pGlu3]Ab3–11 [Gln3]Ab1–11-bõl történõ kialakulásának gátlását mutatja be a QC¹inhibitor 1,10-fenantrolin által katalitikusan aktív DP¹IV és QC jelenlétében. A jelzett idõpontokban mintákat vettünk
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
a vizsgálati csõbõl, összekevertük mátrixoldattal (1:1 v/v) és azt követõen felvettük a tömegspektrumot. A 13. ábra [pGlu3]Ab3–11 [Gln3]Ab1–11-bõl történõ kialakulásának csökkenését mutatja be a DP¹IV-inhibitor Val-Pyrr által katalitikusan aktív DP¹IV és QC jelenlétében. A jelzett idõpontokban mintákat vettünk a vizsgálati csõbõl, összekevertük mátrixoldattal (1:1 v/v) és azt követõen felvettük a tömegspektrumot. A 14. ábra [pGlu3]Ab-peptide3–11 kialakulását mutatja be [Gln3]Ab1–11-bõl a sertés hipofízis homogenizátumban jelen lévõ aminopeptidáz(ok) és QC egymást követõ katalízise után. A jelzett idõpontokban mintákat vettünk a vizsgálati csõbõl, összekevertük mátrixoldattal (1:1 v/v) és azt követõen felvettük a tömegspektrumot. A 15A. és 15B. ábra olyan rekombináns humán QC¹vel inkubált Ab3–11a és Ab3–21a tömegspektrumát mutatja be, amelyet alkalmazás elõtt 10 percen keresztül forraltunk. C és D Ab3–11 és Ab3–21a tömegspektrumát mutatja be aktív humán QC jelenlétében, ami [pGlu3]Ab3–11a és [pGlu3]Ab3–21a kialakulását eredményezi. E és F Ab3–11a és Ab3–21a tömegspektrumát mutatja be aktív QC és 5 mM benzimidazol jelenlétében, ami szuppresszálja a [pGlu3] kialakulását. A 16. ábra papaya QC által katalizált Glu-bNA átalakítás reakciósebességét mutatja be a szubsztrát koncentráció függvényében. A kezdeti sebességet 0,1 M pirofoszfátpufferben, pH=6,1 (négyzetek), 0,1 M foszfátpufferben, pH=7,5 (körök) és 0,1 M borátpufferben, pH=8,5 (háromszögek) mértük. A kinetikai paraméterek a következõk voltak: KM=1,13±0,07 mM, k cat =1,13±0,04 min –1 (pH=6,1); KM=1,45±0,03 mM, kcat=0,92±0,01 min–1 (pH=7,5); K M =1,76±0,06 mM, kcat=0,56±0,01 min–1 (pH=8,5). A 17. ábra a Gln-bNA (körök) és Glu-bNA (négyzetek) átalakításnak pH¹függését mutatja be, elsõrendû sebességi körülmények között (S<
1
HU 008 343 T2
a Gln-bNA és 4,6±0,1 és 7,55±0,02 értékkel a Glu-bNA esetében. A megfelelõ szubsztrát aminocsoportok pKa-értékei – titrálással meghatározva – 6,97±0,01 (Gln-bNA) és 7,57±0,05 (Glu-bNA) voltak. Az összes meghatározást 30 °C hajtottuk végre. A 18. ábra H-Gln-AMC humán QC által katalizált ciklizálásának elõrehaladási görbéit mutatja imidazol, dipikolinsav jelenlétében és gátlóvegyület hiányában. A görbe hiperbolikus alakja dipikolinsav jelenlétében fémionnak a QC aktív helyérõl történõ eltávolítására utal. A 19. ábra QC idõfüggõ inaktiválását mutatja be a heterociklusos 1,10-fenantrolin komplexképzõ által. A QC¹enzimnek az inhibitorral szubsztrát hiányában történõ inkubálása után (folyamatos vonal) csökkent enzimaktivitást figyeltünk meg olyan mintákkal összehasonlítva, amelyek nem voltak elõinkubálva inhibitorral (pontozott vonal), fémionnak a QC aktív helyérõl történõ eltávolítására utalva. A 20. ábra humán QC reaktiválást mutatja be monovalens és divalens fémionokkal. A QC¹t 2 mM dipikolinsav hozzáadásával inaktiváltuk 50 mM Bis-Tris, pH=6,8 pufferben. Azt követõen az enzimet dializáltuk 50 mM Bis-Tris, pH=6,8 pufferrel szemben, amely 1,0 mM EDTA¹t tartalmazott. Az enzimek reaktiválását az inaktivált enzimnek 0,5 mM koncentrációjú fémionnal történõ inkubálásával értük el 0,5 mM EDTA je-
5
10
15
20
25
30
2
lenlétében, hogy elkerüljük a pufferoldatokban nyomokban jelen lévõ fémionok általi nem specifikus reaktiválódást. A kontrollok olyan enzimminták, amelyek nem voltak inaktiválva, de dializálva voltak EDTA oldattal szemben, mint inaktivált enzim (+EDTA) és olyan enzimminták, amelyek pufferoldatokkal szemben voltak dializálva EDTA hozzáadása nélkül (¹EDTA). A 21. ábra humán QC (hQC) és más, a metallopeptidáz MH klánba tartozó M28 családtagok szekvencia egymás alá rendezését mutatja be. Többszörös szekvencia egymás alá rendezést hajtottunk végre a ClustalW alkalmazásával a ch.EMBnet.org internetes helyen az alapértelmezett beállításokkal. Bemutatjuk a cinkiont ligáló oldalláncok konzerváltságát a humán QC (hQC; GenBank X71125), a Streptomyces griseusból származó Zn¹függõ aminopeptidáz (SGAP; SwissProt P80561), és a humán glutamát-karboxipeptidáz¹II (hGCP II; Swiss-Prot Q04609), az N¹acetilált-alfa-kapcsolt savas dipeptidáz (NAALADase I) doménje (274–587. oldalláncok) esetében. A fémkötésben részt vevõ aminosavakat félkövéren és aláhúzva mutatjuk. A humán QC esetében ezek az oldalláncok a peptidázok feltételezett megfelelõi.
Peptidszekvenciák Az itt említett és alkalmazott peptideknek a követ35 kezõ a szekvenciája:
Ab1–42:
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-ValPhe-Phe-Ala-Glu-Asp-VaI-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-lle·Gly-Leu-Met-ValGly-Gly-Val-Val-Ile-Ala Ab1–40:
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-ValPhe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-ValGly-Gly-Val-Val Ab3–42:
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-PheAla-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-lle-Gly-Leu-Met-Val-Gly-GlyVal-Val-Ile-Ala Ab3–40:
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-PheAla-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ata-Ile-lle-Gly-Leu-Met-Val-Gly-GlyVal-Val Ab1–11a:
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2
6
1
HU 008 343 T2
2
Ab3–11a:
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2 Ab1–21a:
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-ValPhe-Phe-Ala-NH2 Ab3–21a:
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-PheAla-NH2 Gln3-Ab3–40:
Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-PheAla-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-lle-Gly-Leu-Met-Val-Gly-GlyVal-Val GIn3-Ab3–21a:
Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-PheAla-NH2 Gln3-Ab1–11a:
Asp-Ala-Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2 Gln3-Ab3–11a:
Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2 A találmány részletes leírása A találmány tárgyát glutaminil-cikláz (QC) inhibitorai képezik, a) olyan betegségek kezelésére emlõsökben, amelyek kezelhetõk QC¹aktivitás in vivo modulálásával és/vagy b) pGlu-tartalmú peptidek hatásán alapuló fiziológiás folyamatok modulálására a QC¹aktivitás modulálásával. Ezenfelül a találmány tárgyát képezi vegyületek glutaminil-cikláz (QC, EC 2.3.2.5) és/vagy QC¹szerû enzimek gátlására emlõsben és QC¹aktivitás inhibitorainak alkalmazása QC¹aktivitással kapcsolatos patológiás állapotok kezelésére. A bejelentés tárgyát képezi új eljárás is Alzheimerkór és Down-szindróma kezelésére. Az Alzheimer-kórban és Down-szindrómában lerakódott amiloid b¹peptidek N¹terminálisa piroglutaminsavat hordozhat. A pGlu kialakulása fontos esemény a betegség kialakulásában és elõrehaladásában, mivel a módosított amiloid b¹peptidek fokozott hajlamosságot mutatnak a b¹amiloid aggregálódására és toxicitására, valószínûen súlyosbítva a betegség megjelenését és elõrehaladását. (Russo, C. és munkatársai, 2002 J Neurochem 82,1480–1489. oldal). Ezzel ellentétben a természetes Ab-peptidekben (3–40/42), a glutaminsav N¹terminális aminosavként van jelen. Mindmáig nem ismert a Glu pGlu¹vá történõ enzimatikus átalakulása. Ezenkívül a Glu-peptidek pGlu-peptidekké történõ spontán ciklizációját sem figyelték meg. Tehát a találmány egyik aspektusa a QC szerepének meghatározása volt Alzheimer-kórban és Down-szindrómában. Ezt az aspektust Ab3–11 és Ab1–11 szintézisével oldottuk meg, amelyek glutamin
30
35
40
45
50
55
60 7
aminosavat tartalmaznak glutaminsav oldallánc helyett a 3. pozícióban, ezen módosított amiloid b¹peptidek szubsztrát jellegzetességeinek meghatározása QC¹vel, DP¹IV¹el és DP¹IV-szerû enzimekkel és aminopeptidázokkal szemben, és QC¹inhibitorok alkalmazása pGlu kialakulásának megakadályozására az amiloid b¹eredetû 1–11 és 3–11 peptidek N¹terminális glutaminil-oldalláncából. Az eredményeket a 8. példában mutatjuk be. Az alkalmazott eljárást a 3. példában ismertetjük. Mindmáig nem volt utalás a QC részvételére a betegség elõrehaladásában, mert glutaminsav az N¹terminális aminosav az Ab-ban (3–40/42 vagy 11–40/42). De a QC az egyetlen ismert enzim, amely képes pGlu kialakítására a peptidek N¹terminálisán. A találmány más aspektusai a következõ felismerésekkel és felfedezésekkel kapcsolatosak: a) mellékreakcióban a QC katalizálja glutaminsav piroglutaminsavvá történõ ciklizálását nagyon kis sebességgel, b) az APP glutaminsava vagy az azt követõen kialakult amiloid-b-peptidek poszttranszlációsan átalakulnak glutaminná egy ismeretlen enzimatikus aktivitás által és egy második lépésben a QC katalizálja a glutamin ciklizálását piroglutaminsavvá az amiloid b¹peptid N¹terminálisának processzálása után, c) a glutaminsav poszttranszlációsan átalakul glutaminná kémiai katalízissel vagy autokatalízissel, és azt követõen a QC katalizálja a glutamin piroglutaminsavvá történõ ciklizációját az amiloid b¹peptid N¹terminálisának processzálása után, d) vannak olyan mutációk az amiloid b¹fehérjét kódoló APP génben, amelyek Gln¹t eredményeznek a 3. pozícióban Glu helyett. Az N¹terminális transzláció-
1
HU 008 343 T2
ja és processzálása után a QC katalizálja a glutamin piroglutaminsavvá történõ ciklizálását, e) glutamin épül be az APP születõ peptidláncába, hibás mûködés vagy ismeretlen enzimaktivitás miatt, és azt követõen a QC katalizálja az N¹terminális glutamin piroglutaminsavvá történõ ciklizációját az amiloid b¹peptid N¹terminálisának processzálása után. A QC szerepet játszik a fent felsorolt mind az öt eset kritikus lépésében, nevezetesen a piroglutaminsav kialakulásában, ami favorizálja az amiloid b¹peptidek aggregációját. Ily módon a QC gátlása a plakkformáló Ab3–40/41/43 vagy Ab11–40/41/43 kicsapódásának megakadályozásához vezet, ami az Alzheimer-kór és Down-szindróma megjelenését és elõrehaladását okozza, függetlenül attól a mechanizmustól, ahogyan a ciklizáció bekövetkezik. Glutamát található az amiloid b¹peptid 3., 11. és 22. pozíciójában. Ezek közül leírták a 22. pozícióban található glutaminsav (E) glutaminná (Q) (ami megfelel az APP 693 amiloid prekurzor fehérjének, Swissprot P05067) történõ mutációját, ami az úgynevezett holland típusú cerebroarteriális amiloidózis mutációt. A 3., 11. és/vagy 22. pozícióban piroglutaminsavat tartalmazó b¹amiloid peptideket citottoxikusabbnak és hidrofóbabbnak írták le, mint az Ab1–40/42/43¹t (Saido T. C., 2000 Medical Hypotheses 54(3): 427–429. oldal). A több N¹terminális variációt létrehozhatja a különbözõ helyeken a b¹szekretáz enzim b¹hely amiloid prekurzor fehérjét hasító enzim (BACE) (Huse J. T. és munkatársai, 2002 J. Biol. Chem. 277 (18): 16 278–16 284. oldal), és/vagy az aminopeptidáz processzálás. Minden esetben a ciklizáció a fenti a)–e) pont szerint megy végbe. Mindeddig nem volt kísérletes bizonyíték, amely alátámasztotta a Glu1-peptidek enzimatikus átalakítását pGlu-peptidekké egy ismeretlen glutamil-cikláz (EC) által az a) útvonalnak megfelelõen (Garden, R. W., Moroz, T. P., Gleeson, J. M., Floyd, P. D., Li, L. J., Rubakhin, S. S. és Sweedler, J. V., (1999) J Neurochem 72, 676–681. oldal; Hosoda R. és munkatársai, (1998) J Neuropathol Exp Neurol. 57, 1089–1095. oldal). Mindmáig nem azonosítottak ilyen enzimaktivitást, amely képes ciklizálni a Glu1-peptideket, amelyek N¹terminálisan protonáltak, és negatívan töltött Glu1 g¹karboxilát molekularészt tartalmaznak enyhén alkalikus pH¹jú körülmények között. A QC¹aktivitás Gln1-szubsztrátokon drasztikusan csökken pH=7,0 alatt. Ezzel szemben úgy tûnik, hogy a Glu1-konverzió elõfordulhat savas körülmények között (Iwatsubo, T., Saido, T. C., Mann, D. M., Lee, V. M. és Trojanowski, J. Q., (1996) Am J Pathol 149, 1823–1830. oldal; Russo, C., Saido, T. C., DeBusk, L. M., Tabaton, M., Gambetti, P. és Teller, J. K., (1977) FEBS Lett 409, 411–416. oldal; Russo, C., Salis, S., Dolcini, V., Venezia, V., Song, X. H., Teller, J. K. és Schettini, G., (2001) Neurobiol Dis 8, 173–180. oldal; Tekirian, T. L., Saido, T. C., Markesbery, W. R., Russell, M. J., Wekstein, D. R., Patel, E. és Geddes, J. W.,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
(1998) J Neuropathol Exp Neurol. 57, 76–94. oldal; Russo, C., Violani, E., Salis, S., Venezia, V., Dolcini, V., Damonte, G., Benatti, U., DArrigo, C., Patrone, E., Carlo, P. és Schettini, G., (2002) J Neurochem 82, 1480–1489. oldal; Hosoda, R., Saido, T. C., Orvos, L., Jr., Arai, T., Mann, D. M., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. és Iwatsubo, T., (1998) J Neuropathol Exp Neurol. 57, 1089–1095. oldal; Garden, R. W., Moroz, T. P., Gleeson, J. M., Floyd, P. D., Li, L. J., Rubakhin, S. S. és Sweedler, J. V., (1999) J Neurochem 72, 676–681. oldal). A találmány szerint megvizsgáltuk, hogy a QC képes¹e felismerni és átalakítani az amiloid¹b eredetû peptideket enyhén savas körülmények között. Tehát megszintetizáltuk és megvizsgáltuk a [Gln3]Ab1–11a, Ab3–11a, [Gln3]Ab3–11a, Ab3–21a, [Gln3]Ab3–21a és [Gln3]Ab3–40 peptideket, mint az enzim potenciális szubsztrátjait. Ezeket a szekvenciákat úgy választottuk ki, hogy imitálják a természetes N¹terminálisan és C¹terminálisan csonkolt [GIU3]AI3 peptideket és [Gln3]Af3 peptideket, amelyek a poszttranszlációs Gluamidálás miatt fordulhatnak elõ. A találmány szerint kimutattuk, hogy a papaya és humán QC katalizálja a glutaminil- és glutamilciklizációt egyaránt. Látszólag a QC elsõdleges fiziológiás funkciója a hormonérés folyamatának befejezése az endokrin sejtekben a glutaminciklizációval a hormon szekréciós folyamatát megelõzõen vagy az alatt. Az ilyen szekréciós vezikulumok ismert módon savas pH¹júak. Ily módon az enzim mellékreakciója a szûk 5,0–7,0 pH¹tartományban az újonnan felismert glutamil-cikláz-aktivitása lehet, amely Glu-Ab peptideket is transzformál. Azonban a Glu-ciklizáció Gln-ciklizációhoz hasonlítva sokkal lassabb elõfordulása miatt kérdéses, hogy a glutamilciklizáció szignifikáns fiziológiás szerepet játszik¹e. A neurodegeneratív rendellenességek patológiájában azonban a glutamilciklizáció jelentõs lehet. Az enzimatikus reakció pH¹függését vizsgálva azt találtuk, hogy az protonálatlan N¹terminális esszenciális volt a Gln1-peptidek ciklizációjához és ennek megfelelõen a szubsztrát pKa-értéke azonos volt a QC katalízis pKa-értékével (lásd a 17. ábrát). Ily módon a QC stabilizálja a protonálatlan a¹amino molekularészek intramolekuláris nukleofil támadását az amidálással elektrofilaktivált g¹karbonil szénen (1. séma). Az N¹terminális glutamint tartalmazó peptideken jelen lévõ monovalens töltéssel ellentétben az N¹terminális Glu-oldallánc a Glu-tartalmú peptidekben elsõsorban bivalensen töltött semleges körüli pH¹n. A glutamát körülbelül 4,2 és 7,5 pKa-értékeket mutat a g¹karboxil és az a¹amino-csoportokra. Azaz semleges pH¹n és afelett – habár az a¹amino nitrogén részben vagy teljesen protonálatlan és nukleofil – a g¹karboxilcsoport protonálatlan és így nem mutat elektrofil karbonil aktivitást. Ily módon az intramolekuláris ciklizáció lehetetlen. Azonban a körülbelül 5,2–6,5 pH¹tartományban a megfelelõ pKa-értékeik között a két funkciós csoport egyaránt ionizálatlan formában van jelen, körülbelül 1–10% (–NH2) vagy 10–1% (–COOH) koncentráció a
1
HU 008 343 T2
teljes N¹terminális Glu-tartalmú peptidben. Ennek eredményeképpen az enyhén savas pH¹tartományban olyan N¹terminális Glu-peptidek vannak jelen, amelyekben mindkét csoport töltés nélküli, és ezért lehetséges, hogy a QC stabilizálni képes a pGlu-peptiddé való intramolekuláris ciklizációjának köztitermékét. Azaz ha a g¹karboxilcsoport-protonált, a karbonil szén eléggé elektrofil ahhoz, hogy lehetõvé tegye a nukleofil támadást a protonálatlan a¹amino-csoport által. Ezen a pH¹n a hidroxilionok funkcionálnak távozó csoportként (3. séma). Ezeket a feltételezéseket megerõsítik a pH¹függési adatok, amelyeket a Glu-bNA QC katalizált átalakításával kaptunk (lásd a 11. példát). A Gln-bNA QC általi átalakításával ellentétben a katalízis pH¹optimuma eltolódik a savas tartományba pH=6,0 körül, azaz abba a pH¹tartományba, amelyben egyformán gyakoriak a protonált g¹karboxil és protonálatlan a¹amino-csoportot hordozó szubsztrát-molekulák. Továbbá a kinetikailag meghatározott 7,55±0,02 pKa-érték kiválóan egyezik a Glu-bNA a¹amino-csoportjáéval, titrálással meghatározva (7,57±0,05). Fiziológiásan pH=6,0 értéken a QC¹katalizált glutamátciklizáció másodrendû sebességi állandója (vagy specifitási állandó, kcat/KM) 8000-szer lassabb, mint a glutaminciklizációé (17. ábra). Azonban Glu-bNA és Gln-bNA modell szubsztrátok nem enzimatikus átalakulása elhanyagolható, ami összhangban van a találmány szerint megfigyelt elhanyagolható pGlu-peptid keletkezéssel. Így a QC általi pGlu-kialakulás esetében legalább 108-szoros gyorsulást becsülhetünk az enzimatikus vs. nemenzimatikus sebességi állandók arányából (összehasonlítva az enzimes katalízis másodrendû sebességi állandóit a megfelelõ nem enzimatikus ciklizáció elsõrendû sebességi állandóival, a katalitikus hatékonyság 108-1010 M–1 a Gln- és a Glu-átalakulásokra). Az ezen adatokból levonható következtetés az, hogy in vivo csak a pGlu-kialakulást eredményezõ enzimatikus útvonal képzelhetõ el. Mivel a QC nagyon gyakori az agyban, és figyelembe véve az újabban a 30 mM (Gln¹)TRH-szerû peptid érésére kapott magas – 0,9 min–1 – átalakulási arányt (Prokai, L., Prokai-Tatrai, K., Ouyang, X., Kim, H. S., Wu, W. M., Zharikova, A. és Bodor, N., (1999) J Med Chem 42, 4563–4571. oldal), azt jósolhatjuk, hogy a ciklizáció féléletideje körülbelül 100 óra egy megfelelõ glutamát-szubsztrátra, hasonló reakciókörülményeket feltételezve. Ezenkívül az agyi QC/EC szekréciós útvonalon való kompartmentalizációját és lokalizációját figyelembe véve a valós in vivo enzimés szubsztrátkoncentrációk és reakciókörülmények még kedvezõbbek lehetnek az enzimatikus ciklizációra intakt sejtekben. És ha az N¹terminális Glu átalakul Gln¹né, sokkal gyorsabb QC általi pGlu-keletkezést várhatunk. In vitro mindkét reakciót szuppresszáltuk a QC/EC-aktivitás inhibitorainak alkalmazásával (9., 10. és 15. ábra). Összefoglalva, a találmányban kimutatjuk, hogy a humán QC – amely nagyon gyakori az agyban – az amiloidogén pGlu-Ab peptidek kialakulásának valószínû katalizátora Glu-Ab és Gln-Ab prekurzorokból, ame-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
lyek az Alzheimer-kórban talált plakklerakódások több mint 50%¹át teszik ki. Ezek a felismerések a QC/EC¹et az öregkori plakk-kialakulás szereplõjeként azonosítják, és ily módon új gyógyszercélpontként az Alzheimer-kór kezelésében. A találmány egy második megvalósítási módja szerint azt találtuk, hogy az amiloid b¹eredetû peptidek a dipeptidil-peptidáz¹IV (DP¹IV) vagy DP¹IV-szerû enzimek, elõnyösen dipeptidil-peptidáz¹II (DP¹II) szubsztrátjai. A DP¹IV, DP¹II vagy más DP¹IV-szerû enzimek dipeptidet szabadítanak fel a módosított amiloid b¹peptid (1–11) N¹terminálisáról, amiloid b¹peptidet (3–11) hozva létre glutaminnal az N¹terminális aminosav-oldalláncként. Az eredményeket a 8. példában mutatjuk be. A DP¹II, DP¹IV vagy más DP¹IV-szerû enzimek általi hasítást megelõzõen az aszparaginsav (az amiloid b¹peptid 1. oldallánca) és alanin (az amiloid b¹peptid 2. oldallánca) közötti peptidkötés izomerizálódhat, izoaszpartil-oldalláncot eredményezve, amint azt a szakirodalomban ismertetik (Kuo, Y.¹M., Emmerling, M. R., Woods, A. S., Cotter, R. J., Roher, A. E., (1997) BBRC 237, 188–191. oldal; Shimizu, T., Watanabe, A., Ogawara, M., Mori, H. és Shirasawa, T., (2000) Arch. Biochem. Biophys. 381, 225–234. oldal). Ezek az izoaszpartil-oldalláncok az amiloid b¹peptideket rezisztenssé teszik az aminopeptidázos degradációra, és ennek következtében a plakkok magja nagy mennyiségû isoAsp1-amiloid b¹peptidet tartalmaz, ami csökkent átalakulásra utal az N¹terminálison. Azonban a találmányban elõször demonstráltuk, hogy az N¹terminális H¹isoAsp1-Ala2¹OH dipeptid felszabadítható dipeptidil-peptidázokkal, különösen savas körülmények között. Ezenkívül kimutattuk, hogy az izomerizáció megelõzheti a b¹szekretáz általi hasítást, és hogy az izomerizáció felgyorsíthatja a proteolitikus processzálást, ami ily módon az izoAsp1-amiloid b¹peptidek N¹terminális izoaszpartil kötésének felszabadulásához vezet, ami azt követõen elérhetõ a DP¹II, DP¹IV vagy DP¹IV-szerû enzimek általi átalakításhoz [Momand, J. és Clarke, S., (1987) Biochemistry 26, 7798–7805. oldal; Kuo, Y.¹M., Emmerling, M. R., Woods, A. S., Cotter, R. J., Roher, A. E., (1997) BBRC 237, 188–191. oldal]. Ennek megfelelõen az izoaszpartil-keletkezés gátlása a b¹szekretáz általi hasítás csökkenéséhez vezethet, ami pedig az amiloid b¹peptidek csökkent mértékû kialakulásához. Emellett az isoAsp1amiloid b¹peptid átalakulás blokkolása a DP¹II, DP¹IV vagy DP¹IV-szerû enzimek gátlásával megakadályozná a [Glu3]Ab elérhetõségét a [pGlu3]Ab QC/EC-katalizált keletkezéséhez. A találmány egy harmadik megvalósítási módja szerint a DP¹IV-aktivitás inhibitorainak és a QC inhibitorainak a kombinációja alkalmazható az Alzheimer-kór és Down-szindróma kezelésére. A DP¹IV és/vagy DP¹IV-szerû enzimek és QC kombinált hatásait a következõkkel szemléltetjük: a) DP¹IV és/vagy DP¹IV-szerû enzimek elhasítják az Ab1–40/42¹t, H¹Asp-Ala-OH¹t tartalmazó dipeptid és Ab3–40/42 szabadul fel,
1
HU 008 343 T2
b) mellékreakcióban a QC katalizálja glutaminsav piroglutaminsavvá történõ ciklizálását nagyon kis sebességgel, c) a glutaminsav poszttranszlációsan átalakul glutaminná egy ismeretlen enzimatikus aktivitás következtében, és azt követõen a QC katalizálja a glutamin piroglutaminsavvá történõ ciklizációját az amiloid b¹peptid N¹terminálisának processzálása után, d) a glutaminsav poszttranszlációsan átalakul glutaminná kémiai katalízissel vagy autokatalízissel, és egy második lépésben a QC katalizálja a glutamin piroglutaminsavvá történõ ciklizációját az amiloid b¹peptid N¹terminálisának processzálása után, e) vannak olyan mutációk az amiloid b¹fehérjét kódoló APP génben, amelyek Gln¹t eredményeznek a 3. pozícióban Glu helyett. Az N¹terminális transzlációja és processzálása után a QC katalizálja a glutamin piroglutaminsavvá történõ ciklizálását, f) glutamin épül be az APP születõ peptidláncába, hibás mûködés vagy ismeretlen enzimaktivitás miatt, és azt követõen a QC katalizálja az N¹terminális glutamin piroglutaminsavvá történõ ciklizációját az amiloid b¹peptid N¹terminálisának processzálása után. Az N¹terminális Gln-érintkezést QC¹aktivitás általi elérhetõségét különbözõ peptidáz aktivitásokkal is kiválthatjuk. Aminopeptidázok képesek egymás után eltávolítani az Asp¹t és Ala¹t az Ab1–40/41/43 N¹terminálisáról, ily módon elõhozva a 3. aminosavat, amely hajlamos ciklizációra. Dipeptidil-peptidázok, mint például a DP¹I, DP¹II, DP¹IV, DP-8, DP¹9 és DP¹10 az Asp-Ala dipeptidet egy lépésben távolítják el. Ily módon az aminopeptidáz- vagy dipeptidilpeptidáz-aktivitás gátlása hasznos az Ab3–40/41/43 keletkezésének megakadályozására. A DP¹IV és/vagy DP¹IV-szerû enzimek inhibitorainak és QC aktivitást csökkentõ szerek kombinált hatásait a következõkkel szemléltetjük: a) A DP¹IV és/vagy DP¹IV-szerû enzimek inhibitorai gátolják az Ab1–40/42 Ap3–40/42¹vé történõ átalakulását. b) Ezáltal megakadályozódik az N¹terminális glutaminsav elérhetõsége, és nem alakul át glutaminná, sem enzimatikus, sem kémiai katalízissel, és azt követõen nem lehetséges a piroglutaminsav kialakulása. c) A QC inhibitorai emellett megakadályozzák a piroglutaminsav kialakulását bármilyen reziduális Ab3–40/42 molekulából és azokból a módosított Ab3–40/42 molekulákból, amelyek az APP gén mutációjával keletkeztek. A találmány szerint a DP¹IV vagy DP¹IV-szerû enzimek és QC hasonló kombinált hatását demonstráltuk további peptidhormonok esetében, mint például glukagon, CC kemokinek és P¹anyag. A glukagon egy 29¹aminosav méretû polipeptid, amely a hasnyálmirigy szigetek alfa-sejtjeibõl szabadul fel, hogy fenntartsa az euglikémiát a májbeli glükogenolízis és glükoneogenezis stimulálásával. A fontossága ellenére vita van a glukagon szervezetbõl való ki-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 10
2
ürüléséért felelõs mechanizmusokról. Pospisilik és munkatársai megvizsgálták a glukagon enzimatikus anyagcseréjét érzékeny tömegspektrometriás módszerekkel, hogy azonosítsák a molekuláris termékeket. Glukagon inkubálása tisztított sertés dipeptidil-peptidáz-IV¹el (DP¹IV) glukagon3–29 és glukagon5–29 egymás követõ kialakulását eredményezte. A humán szérumban a glukagon3–29¹é való degradációt gyorsan követte a glukagon N¹terminális ciklizációja, megakadályozva a további DP¹IV-közvetített hidrolízist. A glukagon biológiai vizsgálati eljárása a tisztított DP¹IV¹el vagy normál patkányszérummal való inkubálást követõen a hiperglikémiás aktivitás szignifikáns csökkenését eredményezte, míg hasonló inkubálás DP¹IV-deficiens patkányszérumban nem mutatott semmilyen csökkenést a glukagon biológiai aktivitásában. A degradációt – tömegspektormetriával és biológiai vizsgálati eljárással monitorozva – blokkolta a specifikus DP¹IV inhibitor, az izoleucil-tiazolidin. Ezek az eredmények a DP¹IV¹et a glukagon degradációjában és inaktiválásában elsõdleges enzimként azonosítják. Ezeknek a felismeréseknek fontos következményei vannak a glukagon szintjének humán plazmában való meghatározására [Pospisilik és munkatársai, Regul Pept 2001 Jan 12; 96(3):133–141. oldal]. A 2¹es humán monocita kemotaktikus proteint (MCP) eredetileg stimulált oszteoszarkómasejtekbõl izolálták, mint az MCP-1¹el és MCP-3¹al együtt termelt kemokint. Von Coillie és munkatársai (Van Coillie, E. és munkatársai, 1998 Biochemistry 37, 12672–12680. oldal) megklónoztak egy 5’¹végén meghosszabbított MCP¹2 cDNS¹t humán here cDNS-könyvtárból. Az egy 76 oldallánc hosszúságú MCP¹2 fehérjét kódolt, de különbözött a leközölt csontvelõ-eredetû MCP¹2 cDNSszekvenciától a 46. kodonban, ami Lys¹t kódolt Gln helyett. Összehasonlították ezt az MCP-2Lys46 variáns – amelyet egy egyedi nukleotid polimorfizmus (SNP) okoz – az MCP-2Gln46¹al. A kódolórégiót szubklónozták a pHEN1 bakteriális expressziós vektorba, és Escherichia coli¹ba történõ transzformálás után a két MCP¹2 fehérjevariánst visszanyerték a periplazmából. Az Edman degradáció Gln oldalláncot mutatott az NH2terminálison pGlu helyett. Az rMCP-2Gln46 és rMCP2Lys46 és az NH2-terminális ciklizált párjaikat tesztelték monocita sejteken kalcium-mobilizációs és kemotaxis vizsgálati eljárásokban. Nem figyelték meg szignifikáns különbséget az rMCP-2Gln46 és rMCP2Lys46 izoformák biológiai aktivitásában. Azonban mindkét MCP¹2 variáns esetében az NH2-terminális piroglutamátról kimutatták, hogy esszenciális a kemotaxishoz, de a kalciummobilizációhoz viszont nem az. Az rMCP-2Lys46 NH2-terminális csonkolása a CD26/dipeptidil-peptidáz¹IV (CD26/DPP IV) szerin proteázzal az NH2-terminális Gln-Pro dipeptid felszabadulását eredményezte, míg a szintetikus MCP¹2 amino-terminális pGlu-val változatlan maradt. A CD26/DPP IV¹levágott rMCP-2Lys46(3–76) majdnem teljesen inaktív volt a kemotaxis és jeltovábbítási vizsgálati eljárásokban egyaránt. Ezek a megfigyelések arra utaltak, hogy az NH2-terminális pGlu az MCP-2-ben szükséges a kemo-
1
HU 008 343 T2
taktikus aktivitáshoz, de arra is, hogy megvédi a fehérjét a CD26/DPP¹IV általi degradációtól (van Coillie, E. és munkatársai, Biochemistry 1998 37, 12672–12680. oldal). A találmány szerint meghatároztuk LC/MS-elemzéssel, hogy az N¹terminális piroglutamátoldallánc kialakulását a glukagon3–29-ben (Pospisilik és munkatársai, 2001) és az MCP¹2 izoformákban (van Coillie és munkatársai, 1998) a QC katalizálja. Emellett bebizonyítottuk LC/MS-vizsgálattal, hogy a Lys-Pro és Arg-Pro dipeptidek N¹terminális DP¹IV katalizált P¹anyagról való eltávolítása után a megmaradó [Gln5]P5–11¹et a QC átalakítja [pGlu5]P5–11¹é. DP¹IV inhibitorokat feltárnak a WO 99/61431 számú nemzetközi közzétételi iratban. Közelebbrõl olyan DP¹IV inhibitorokat tárnak fel, amelyek aminosav-oldalláncot és tiazolidin vagy pirrolidin-csoportot tartalmaznak, és azok sóit, különösen az L¹treo-izoleucil-tiazolidin, L¹allo-izoleucil-tiazolídín, L¹treo-izoleucil-pirrolidin, L¹allo-izoleucil-tiazolidin, L¹allo-izoleucil-pirrolidin és azok sói. Az alacsony molekulatömegû dipeptidil-peptidáz¹IV inhibitorok további példái az olyan ágensek, mint például a tetrahidroizoquinolin-3-karboxamid-származékok, N¹szubsztituált 2¹ciano-pirolok és ¹pirrolidinek, N¹(N’-szubsztituált glicil)-2-ciano-pirrolidinok, N¹(szubsztituált glicil)-tiazolidinek, N¹(szubsztituált glicil)-4-cianotiazolidinek, amino-acil-borono-prolil-inhibitorok, ciklopropilfuzionált pirrolidinek és heterociklusos vegyületek. Dipeptidil-peptidáz¹IV inhibitorokat ismertetnek a következõ irodalmi helyeken: US 6,380,398, US 6,011,155; US 6,107,317; US 6,110,949; US 6,124,305; US 6,172,081; WO 95/15309, WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 198 34 591, WO 97/40832, DE 196 16 486 C2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/38501, WO 01/68603, WO 01/40180, WO 01/81337, WO 01/81304, WO 01/55105, WO 02/02560 és WO 02/14271, WO 02/04610, WO 02/051836, WO 02/068420, WO 02/076450; WO 02/083128, WO 02/38541, WO 03/000180, WO 03/000181, WO 03/000250, WO 03/002530, WO 03/002531, WO 03/002553, WO 03/002593, WO 03/004496, WO 03/024942 és WO 03/024965. A QC effektoraival való kombinációban való alkalmazásra elõnyösek az olyan DPIV inhibitorok, mint például az NVP-DPP728A (1¹[[[2¹[{5¹ciano-piridin-2¹il}-amino]-etil]-amino]-acetil]-2-ciano¹(S)-pirrolidin) (Novartis), amint azt Hughes és munkatársai, 1999 Biochemistry 38 11597–11603. oldal ismertetik, LAF-237 (1¹[(3¹hidroxi-adamant-1-il-amino)-acetil]-pirrolidin-2(S)-karbonitril); amint azt Hughes és munkatársai, Meeting of the American Diabetes Association 2002, Abstract no. 272 (Novartis) ismertetik, TSL-225 (triptofil-1,2,3,4-tetrahidroizoquinolin-3-karbonsav), amint azt Yamada és munkatársai, 1998 Bioorg Med Chem Lett 8, 1537–1540. oldal ismertetik, 2¹ciano-pirrolididek és 4¹ciano-pirrolididek, amint azt Asworth és munkatársai, 1996 Bioorg Med Chem Lett 6, 1163–1166. oldal ismertetik, és a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2
2745–2748, FE¹999011, amint azt Sudre és munkatársai, 2002 Diabetes 51,1461–1469. oldal (Ferring) ismertetik, és a WO 01/34594 számú nemzetközi közzétételi iratban (Guilford) feltárt vegyületek, a fenti irodalmi helyeken megadott dózisokban alkalmazva. A QC effektoraival való kombinációban való alkalmazásra elõnyösebb DP¹IV inhibitorok azok, amelyekben az aminosav elõnyösen a természetes aminosavak közül van kiválasztva, mint például leucin, valin, glutamin, glutaminsav, prolin, izoleucin, aszparagin és aszparaginsav. A találmány szerint alkalmazott dipeptidszerû vegyületekre vonatkoztatva 10 mM koncentrációjánál (a dipeptid vegyületek) csökkentik a plazma dipeptidil-peptidáz¹IV vagy DP¹IV-analóg enzim aktivitását legalább 10%-kal, különösen legalább 40%-kal. Gyakran az aktivitás legalább 60%¹os vagy 70%¹os csökkentése kívánatos in vivo. Az elõnyös vegyületek mutathatnak maximum 20%¹os vagy 30%¹os aktivitás csökkentést is. Elõnyös dipeptid vegyületek az N¹valil-prolil, O¹benzoil-hidroxil-amin, alanil-pirrolidin, izoleucil-tiazolidin, mint például L¹allo-izoleucil-tiazolidin, L¹threo-izoleucilpirrolidin és azok sói, különösen a fumársav sóik, és az L¹allo-izoleucil-pirrolidin és annak sói. Különösen elõnyös vegyületek a glutaminil-pirrolidin és glutaminil-tiazolidin, H¹Asn-pirrolidin, H¹Asn-tiazolidin, H¹Asp-pirrolidin, H¹Asp-tiazolidin, H¹Asp(NHOH)-pirrolidin, H¹Asp(NHOH)-tiazolidin, H¹Glu-pirrolidin, H¹Glu-tiazolidin, H¹Glu(NHOH)-pirrolidin, H¹Glu(NHOH)-tiazolidin, H–His-pirrolidin, H–His-tiazolidin, H¹Pro-pirrolidin, H¹Pro-tiazolidin, H¹IIe-azididin, H¹IIe-pirrolidin, H¹L-allo-Ile-tiazolidin, H¹Val-pirrolidin és H¹Val-tiazolidin és azok gyógyászatilag elfogadható sói. Ezeket a vegyületeket a WO 99/61431 számú nemzetközi közzétételi iratban és az EP 1 304 327 számú európai szabadalmi iratban ismertetik. Ezenkívül a találmány tárgyát képezi QC effektorainak alkalmazása kombinációban a dipeptidil-peptidáz¹IV katalízis kompetitív modulálására hasznos szubsztrátszerû peptidekkel. Elõnyös peptid vegyületek a 2¹amino-oktánsav-Pro-Ile, Abu-Pro-Ile, Aib-ProIle, Aze-Pro-Ile, Cha-Pro-Ile, Ile-Hyp-Ile, Ile-Pro-alloIle, Ile-Pro-t¹butil-Gly, Ile-Pro-Val, Nle-Pro-Ile, Nva-ProIle, Orn-Pro-Ile, Phe-Pro-Ile, Phg-Pro-Ile, Pip-Pro-Ile, Ser(Bzl)-Pro-Ile, Ser(P)-Pro-Ile, Ser-Pro-Ile, t¹butil-GlyPro-D-Val, t¹butil-Gly-Pro-Gly, t¹butil-Gly-Pro-Ile, t¹butilGly-Pro-Ile-amid, t¹butil-Gly-Pro-t-butil-Gly, t¹butil-GlyPro-Val, Thr-Pro-Ile, Tic-Pro-Ile, Trp-Pro-Ile, Tyr(P)Pro-Ile, Tyr-Pro-allo-Ile, Val-Pro-allo-Ile, Val-Pro-t¹butilGly, Val-Pro-Val és gyógyászatilag elfogadható sóik, ahol a t¹butil-Gly definíciója:
55
és a Ser(Bzl) és Ser(P) definíciója benzil-szerin és 60 foszforil-szerin. A Tyr(P) jelentése foszforil-tirozin. Eze11
1
HU 008 343 T2
ket a vegyületeket a WO 03/002593 számú nemzetközi közzétételi iratban tárják fel. További elõnyös DP¹IV-inhibitorok – amelyek alkalmazhatók a találmány szerint a QC effektoraival kombinációban – peptidilketonok, például: – 2¹Metil-karbonil-1-N-[(L)-Alanil¹(L)-Valinil]-(2S)pirrolidin hidrobromid, – 2¹metil-karbonil-1-N-[(L)-Valinil¹(L)-Prolil¹(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidin hidrobromid, – 2¹[(acetil-oxi-metil)karbonil]-1-N-[(L)-Alanil¹(L)Valinil]-(2S)-pirrolidin hidrobromid, – 2¹[benzoil-oxi-metil)-karbonil]-1-N-[{(L)-Alanil}¹(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidin hidrobromid, – 2¹{[(2,6-diklór-benzil)-tiometil]-karbonil}-1-N-[{(L)Alanil}¹(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidin, – 2¹[benzoil-oxi-metil)-karbonil]-1-N-[Glycil¹(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidin hidrobromid, – 2¹[([1,3]-tiazoletiazol-2¹il)-karbonil]-1-N-[{(L)-Alanil}¹(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidin trifluoracetát, – 2¹[(benzo-tiazoletiazol-2¹il)-karbonil]-1-N-[N¹{(L)Alanil}¹(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidin trifluoracetát, – 2¹[(¹benzo-tiazoletiazol-2¹il)-karbonil]-1-N-[{(L)Alanil}-Glycil]-(2S)-pirrolidin trifluoracetát, – 2¹[(piridin-2¹il)-karbonil]-1-N-[N¹{(L)-Alanil}¹(L)Valinil]-(2S)-pirrolidin trifluoracetát és azok más gyógyászatilag elfogadható sói. Ezeket a vegyületeket a WO 03/033524 számú nemzetközi közzétételi iratban tárják fel. Továbbá a találmány szerint szubsztituált aminoketonokat alkalmazhatunk a QC effektoraival kombinációban. Elõnyös szubsztituált aminoketonok a – 1¹ciklopentil-3-metil-1-oxo-2-pentanaminium klorid, – 1¹ciklopentil-3-metil-1-oxo-2-butanaminium klorid, – 1¹ciklopentil-3,3-dimetil-1-oxo-2-butanaminium klorid, – 1¹ciklohexil-3,3-dimetil-1-oxo-2-butanaminium klorid, – 3¹(ciklopentil-karbonil)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolinium klorid, – N¹(2¹ciklopentil-2-oxo-etil)-ciklohexanaminium klorid és azok más gyógyászatilag elfogadható sói. A prolinspecifikus proteázok ritka csoportjában a DP¹IV¹et eredetileg az egyetlen membránkötött enzimnek gondolták, amely prolinra specifikus, mint az utolsó elõtti oldallánc a polipeptidlánc aminoterminálisán. Azonban azonosítottak más molekulákat is, amelyek bár szerkezetileg nem homológok a DP¹IV¹el, de megfelelõ enzimaktivitással rendelkeznek. Az eddig azonosított DP¹IV-szerû enzimek közé tartozik például a fibroblaszt aktivációs protein a, dipeptidil-peptidáz¹IV b, dipeptidil-aminopeptidáz-szerû protein, N¹acetilált a¹kapcsolt savas dipeptidáz, nyugvó sejtes prolin-dipeptidáz, dipeptidil-peptidáz¹II, attraktin és dipeptidilpeptidáz-IV¹el rokon protein (DPP¹8), DPL1 (DPX, DP6), DPL2 és DPP-9, amelyeket a Sedo & Malik (Sedo és Malik, 2001, Biochim Biophys Acta, 36506, 1–10. oldal) és az Abbott és Gorrell (Abbott, C. A. és
5
10
15
20
25
30
35
2
Gorrell, M. D., 2002 szerk: Langner & Ansorge, „Ectopeptidases”, kiad.: Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 171–195. oldal) összefoglalókban ismertettek. Újabban beszámoltak a dipeptidil-peptidáz¹10 (DPP¹10) klónozásáról és jellemzésérõl (Qi, S. Y. és munkatársai, Biochemical Journal Immediate Publication, publikálva 2003. március 28¹án, a BJ20021914 számú kéziratként). Az effektorok a leírás szerinti értelemben olyan molekulák, amelyek enzimekhez kötõdnek és növelik vagy csökkentik azok aktivitását in vitro és/vagy in vivo. Bizonyos enzimeknek vannak kötõhelyeik kismolekulák számára, amelyek befolyásolják azok katalitikus aktivitását; egy stimulátor molekulát aktivátornak nevezünk. Az enzimeknek akár több helyük is lehet egynél több aktivátor vagy inhibitor felismerésére. Az enzimek képesek detektálni különféle molekulák koncentrációját és ezen információt alkalmazni a saját aktivitásuk megváltoztatására. Az effektorok képesek modulálni az enzimaktivitást, mert az enzimek képesek aktív és inaktív konformációk felvételére: az aktivátorok pozitív effektorok, az inhibitor negatív effektorok. Az effektorok nemcsak az enzimek aktív helyére hatnak, hanem a szabályozó, vagy alloszterikus helyeken is, amely kifejezések azt hangsúlyozzák, hogy a szabályozó hely az enzim olyan eleme, amely eltér a katalitikus helytõl, és a szabályozás ezen formája megkülönböztetendõ a szubsztrátok és az inhibitorok katalitikus helyen való kompetíciójától (Damell, J., Lodish, H. és Baltimore, D., 1990, „Molecular Cell Biology”, 2. kiadás, kiad.: Scientific American Books, New York, 63. oldal). A találmány szerinti peptidekben mindegyik aminosav-oldalláncot egybetûs vagy hárombetûs jelölések képviselnek, amelyek az aminosav triviális nevének felel meg, a következõ hagyományos listának megfelelõen: Aminosav
40
45
50
55
60 12
Egybetûs jel
Hárombetûs jel
Alanin
A
Ala
Arginin
R
Arg
Aszparagin
N
Asn
Aszparaginsav
D
Asp
Cisztein
C
Cys
Glutamin
Q
Gin
Glutaminsav
E
Glu
Glicin
G
Gly
Hisztidin
H
His
Izoleucin
I
Ile
Leucin
L
Leu
Lizin
K
Lys
Metionin
M
Met
Fenilalanin
F
Phe
Prolin
P
Pro
Szerin
S
Ser
Treonin
T
Thr
1
HU 008 343 T2
Táblázat (folytatás) Aminosav
Egybetûs jel
Hárombetûs jel
Triptofán
W
Trp
Tirozin
Y
Tyr
Valin
V
Val
5
A „QC” kifejezés a leírás szerint magában foglalja a glutaminil-ciklázt (QC) és QC¹szerû enzimeket. A QC és 10
2
QC¹szerû enzimek azonos vagy hasonló enzimatikus aktivitásúak, amit a továbbiakban QC¹aktivitásnak definiálunk. Ebben a vonatkozásban a QC¹szerû enzimek molekuláris szerkezete alapvetõen eltérhet a QC¹étõl. A „QC-aktivitás” kifejezést a leírás szerint az N¹terminális glutaminoldalláncok piroglutaminsavvá (pGlu*) vagy N¹terminális L¹homoglutamin vagy L¹b-homoglutamin ciklikus piro-homoglutamin-származékká történõ, ammónia felszabadulása melletti intramolekuláris ciklizációjaként definiáljuk. Lásd az 1. és 2. sémát.
1. séma: Glutamin QC általi ciklizálása
2. séma: L¹homoglutamin QC általi ciklizálása
Az „EC” kifejezés a leírás szerint magában foglalja a QC és QC¹szerû enzimek, mint például glutamát-cikláz (EC) mellékreakcióját, amit a továbbiakban EC¹aktivitásnak definiálunk. Az „EC-aktivitás” kifejezést a leírás szerint N¹termi- 40 nális glutamátoldallánc piroglutaminsavvá (pGlu*) történõ QC általi intramolekuláris ciklizációjaként definiáljuk. Lásd a 3. sémát. A „fémfüggõ enzim” kifejezést a leírás szerint olyan enzimként definiáljuk, amely kötött fémiont igényel a 45 katalitikus funkciója végrehajtásához és/vagy kötött fémiont igényel a katalitikusan aktív szerkezet kialakításához. 3. séma: Töltés nélküli glutamil-peptidek QC általi N¹terminális ciklizálása
13
Az enzimekhez kötõdõ és azok aktivitását növelõ vagy csökkentõ molekulákat „effektoroknak” nevezzük. Az effektorok képesek modulálni az enzimaktivitást, mert az enzimek képesek aktív és inaktív konformációk felvételére: az aktivátorok pozitív effektorok; az inhibitor negatív effektorok. Az effektorok a szabályozó helyekhez, vagy alloszterikus helyekhez (ami a „másik alak” görög megfelelõje) kötõdnek, amely kifejezést annak hangsúlyozására alkalmazzák, hogy a szabályozó hely az enzim olyan eleme, amely eltér a katalitikus helytõl, és a szabályozás ezen formája megkülönböztetendõ a szubsztrátok és az inhibitorok katalitikus helyen való kompetíciójától. A találmány egyedi megvalósítási módjai szerint az inhibitorok az elõnyösek.
1
HU 008 343 T2
A találmány egy másik aspektusa QC új fiziológiás szubsztrátjainak az azonosítása. Ezeket ciklizációs kísérletek végrehajtásával azonosítottuk emlõs peptidek alkalmazásával, amint az 5. példában ismertetjük. Elõtte humán QC¹t és papaya QC¹t izoláltunk
2
amint az 1. példában ismertetjük. Az alkalmazott eljárásokat a 2. példában ismertetjük, és az alkalmazott peptidszintézist a 6. példában körvonalazzuk. A vizsgálat eredményeit az 1. táblázatban mutatjuk be.
5
1. táblázat A glutaminil-cikláz új fiziológiás szubsztrátjai (*, minõségi meghatározás MALDI-TOF kísérletekkel) Szubsztrát
[Gln1]-Gasztrin
Humán QC
Papaya QC
KM (mM)
kcat (s–1)
kcat/Km (mM–1 s–1)
KM (mM)
kcat (s–1)
kcat/kM (mM–1 s–1)
31±1
54,1±0,6
1745,2±36,9
34±2
25,8±0,5
759±30
[Gln1]-Neurotenzin
37±1
48,8±0,4
1318,9±24,8
40±3
35,7±0,9
893±44
[Gln3]-FPP
87±2
69,6 to 3
800,0±14,9
232±9
32,5±0,4
140±4
[Gln3]-TRH
90±4
82,8±1,2
920,0±27,6
n,d
n,d
n,d
[Gln1]-GnRH
53±3
69,2±1,1
1305,7±53,2
169±9
82,5±1,9
488,2±14,8
[Gln3]-glukagon (3–29)
*
*
[Gln3]-P-anyag(5–11)
*
*
Az összes elemzést a humán vagy növényi QC aktivitásának és stabilitásának optimális tartományában 25 hajtottuk végre, amint a 4. példában demonstráljuk. Az N¹terminális glutaminoldalláncot tartalmazó, és ezáltal
a QC enzimnek szubsztrátot jelentõ fiziológiásan aktív peptidek aminosavszekvenciáit a 2. táblázatban soroljuk fel:
2. táblázat N-terminális glutaminoldalláncot tartalmazó, fiziológiásan aktív peptidek aminosavszekvenciája Peptid
Aminosavszekvencia
Funkció
Gasztrin 17 Swiss-Prot: P01350
QGPWL EEEEEAYGWM DF (amid)
A gasztrin stimulálja a gyomornyálkahártyát sósav termelésére és szekretálására, és a hasnyálmirigyet a emésztõenzimjeinek szekretálására. Stimulálja továbbá a simaizom összehúzódását és növeli a vérkeringést és víz kiválasztását a gyomorban és a bélben.
Neurotenzin Swiss-Prot: P30990
QLYENKPRRP YIL
A neurotenzin endokrin vagy parakrin szerepet játszik a zsíranyagcsere szabályozásában. A simaizom összehúzódását okozza.
QEP amid
A tirotrofin felszabadító hormonnal (TRH) rokon tripeptid az ondóplazmában található. Újabb in vitro és in vivo szerzett bizonyítékok azt mutatták, hogy az FPP fontos szerepet játszik a sperma fertilitásának szabályozásában.
TRH Swiss-Prot: P20396
QHP amid
A TRH a TSH bioszintézisének szabályozójaként mûködik az elülsõ hipofízis mirigyben, és neurotranszmitter/neuromodulátorként a központi és perifériás idegrendszerben.
GnRH Swiss-Prot: P01148
QHWSYGL RP(G) amid
Stimulálja a gonadotropinok szekrécióját; egyaránt stimulálja a luteinizáló és follikulusstimuláló hormonok szekrécióját.
FPP
14
HU 008 343 T2
2. táblázat (folytatás) Peptid
Aminosavszekvencia
Funkció
CCL16 (kis indukálható citokin A16) Swiss-Prot: 015467
QPKVPEW VNTPSTCCLK YYEKVLPRRL WGYRKALNC HLPAIIFVTK RNREVCTNPN DDWVQEYIKD PNLPLLPTRN LSTVKIITAK NGQPQLLNSQ
Kemotaktikus aktivitást mutat limfocitákra és monocitákra, de neutrofilekre nem. Hatásos mieloszuppresszív aktivitást is mutat, szuppresszálja a mieloid progenitor sejtek proliferációját. A rekombináns SCYA16 kemotaktikus aktivitást mutat monocitákra és THP¹1 monocitákra, de nem mutat azt nyugvó limfocitákra és neutrofilekre. Kalciumáramlást indukál THP¹1 sejtekben, amelyek deszenzitizálva lettek RANTES azt megelõzõ expressziójával.
CCL8 (kis indukálható citokin A8) Swiss-Prot: P80075
QPDSVSI PITCCFNVIN RKIPIQRLES YTRITNIQCP KEAVIFKTKR GKEVCADPKE RWVRDSMKHL DQIFQNLKP
Kemotaktikus faktor, amely monocitákat, limfocitákat, bazofileket és eozinofileket vonz. Szerepet játszhat a neopláziában és gyulladásos gazdaválaszokban. Ez a fehérje heparint képes kötni.
QPDAINA PVTCCYNFTN RKISVQRLAS YRRITSSKCP KEAVIFKTIV AKEICADPKQ KWVQDSMDHL DKQTQTPKT
Kemotaktikus faktor, amely monocitákat és bazofileket vonz, de neutrofileket és eozinofileket nem. Fokozza a monociták daganatellenes aktivitását. Kapcsolatba hozták monocitás beszûrõdéssel jellemzett betegségek, mint például pszoriázis, reumatoid arthritis vagy atheroszklerózis patogenezisével. Szerepet játszhat monociták toborzásában az artériák falába az atheroszklerózis betegség elõrehaladása folyamán. CCR2¹t és CCR4¹et köt.
CCL18 (kis indukálható citokin A18) Swiss-Prot: P55774
QVGTNKELC CLVYTSWQIP OKFIVDYSET SPQCPKPGVI LLTKRGRQIC ADPNKKWVQK YISDLKLNA
Kemotaktikus faktor, amely limfocitákat vonz, de monocitákat és granulocitákat nem. Szerepet játszhat a B¹sejt migrációban a nyirokcsomók B¹sejt follikulusaiba. Naiv T¹limfocitákat vonz a dendritikus sejtek és aktivált makrofágok felé a nyirokcsomókban, kemotaktikus aktivitása van naiv T¹sejtekre, CD4+ és CD8+ T¹sejtekre, és ily módon szerepet játszhat a humorális és sejtközvetített immunválaszokban egyaránt.
Fraktalkin (neurotaktin) Swiss-Prot: P78423
QHHGVT KCNITCSKMT SKIPVALLIH YQQNQASCGK RAIILETRQH RLFCADPKEQ WVKDAMQHLD RQAAALTRNG GTFEKQIGEV KPRTTPAAGG MDESWLEPE ATGESSSLEP TPSSQEAQRA LGTSPELPTG VTGSSGTRLP PTPKAQDGGP VGTELFRVPP VSTAATWQSS APHQPGPSLW AEAKTSEAPS TQDPSTQAST ASSPAPEENA PSEGQRVWGQ GQSPRPENSL EREEMGPVPA HTDAFQDWGP GSMAHVSVVP VSSEGTPSRE PVASGSWTPK AEEPIHATMD PQRLGVLITP VPDAQAATRR QAVGLLAFLG LLFCLGVAMF TYQSLQGCPR KMAGEMAEGL RYIPRSCGSN SYVLVPV
Az oldható forma kemotaktikus T¹sejtekre és monocitákra, de neutrofilekre nem. A membránkötött forma elõsegíti ezen leukociták adhézióját az endoteliális sejtekhez. Szerepet játszhat a leukocita-adhézió és az endotéliumba történõ migrációs folyamatok szabályozásában. Kötõdik a cx3crl-hez.
CCL2 (kis indukálható citokin A2) Swiss-Prot: P13500
15
1
HU 008 343 T2
2
2. táblázat (folytatás) Peptid
CCL7 (kis indukálható citokin A7) Swiss-Prot: P80098
Orexin¹A (Hipokretin¹1) Swiss-Prot 043612
P-anyag
Aminosavszekvencia
Funkció
QPVGINT STTCCYRFIN KKIPKQRLES YRRTTSSHCP REAVIFKTKL DKEICADPTQ KWVQDFMKHL DKKTQTPKL
Kemotaktikus faktor, amely monocitákat és eozinofileket vonz, de neutrofileket nem. Fokozza a monociták daganatellenes aktivitását. Indukálja a zselatináz¹B felszabadulását is. Ez a fehérje heparint képes kötni. Kötõdik CCR1-hez, CCR2-höz és CCR3hoz.
QPLPDCCRQK TCSCRLYELL HGAGNHAAGI LTL
Neuropeptid, amely szignifikáns szerepet játszik az élelemfelvétel és az alvás-ébrenlét szabályozásában, lehetséges módon ezen kiegészítõ homeosztatikus funkciók komplex viselkedési és fiziológiás válaszainak koordinálásával. Széleskörûbb szerepet is játszik az energia-anyagcsere szabályozásában, autonóm funkciók, hormonális egyensúly és a testfolyadékok szabályozásában. Az Orexin¹A nagy affinitással kötõdik OX1R-hez és OX2R-hez is.
RPK PQQFFGLM
A tachikininek közé tartozik. A tachikininek olyan aktív peptidek, amelyek neuronokat serkentenek, viselkedési válaszokat váltanak ki, hatásos vazodilátorok és szekretagógok, és sok simaizmot összehúznak (közvetlenül vagy közvetetten).
Egy negyedik megvalósítási mód szerint a [Gln 1 ]gasztrin (17 és 34 aminosav hosszúságú), [Gin1]neurotenzin és [Gln1]FPP peptideket a QC új fiziológiás szubsztrátjaiként azonosítottuk. A gasztrin, neurotenzin és FPP pGlu oldalláncot tartalmaznak az N¹terminális pozíciójukban. Errõl az N¹terminális pGlu oldalláncról kimutattuk, hogy N¹terminális glutaminból keletkezik QC katalízis révén mindegyik peptid esetében. Ennek eredményeképpen ezek a peptidek aktiváltak a biológiai funkciójuk tekintetében az N¹terminális glutaminoldallánc pGlu¹vá történõ átalakításával. A transzepitéliális transzdukáló sejtek, különösen a gasztrin (G) sejtek, koordinálják a gyomorsav-szekrécióját az élelem gyomorba érkezésekor. Újabb munkák azt mutatták, hogy több aktív termék keletkezik a gasztrin prekurzorból, és hogy több szabályozó pont van a gasztrin bioszintézisében. A bioszintetikus prekurzorok és köztitermékek (progasztrin és Gly-gasztrinok) feltételezett növekedési faktorok; azok termékei, az amidált gasztrinok szabályozzák az epitéliális sejtek proliferációját, a savtermelõ parietális sejtek és a hisztamin-szekretáló enterokromaffin-szerû (ECL) sejtek differenciációját, és az ECL sejtekben való hisztamin szintézissel és tárolással kapcsolatos gének expresszióját, valamint akut módon stimulálják a savszekréciót. A gasztrin stimulálja az epidermális növekedési faktor (EGF) család tagjainak a termelõdését is, amelyek pedig gátolják a parietális sejtek funkcióját, de stimulálják a felszíni epitéliális sejtek növekedését. A plazma gasztrinkoncentrációk emelkedettek Helicobacter pylorit tartalmazó alanyokban, akik ismert módon fokozottan ki vannak téve duodenális fekélybeteg-
30
35
40
45
50
55
60 16
ségnek és gyomorráknak (Dockray, G. J., 1999 J Physiol 15 315–324. oldal). A gasztrin peptidhormon – amely az antrális G¹sejtekbõl szabadul fel – ismert módon stimulálja a hisztamin szintézisét és felszabadulását ECL sejtekbõl az oxyntikus nyálkahártyából a CCK¹2 receptorok révén. A mobilizált hisztamin savszekréciót indukál a parietális sejtek elhelyezkedõ H(2) receptorokhoz való kötéssel. Újabb vizsgálatok arra utalnak, hogy a gasztrin – a teljesen amidált és kevésbé feldolgozott formájában (progasztrin és glicinnel meghosszabbított gasztrin) egyaránt – növekedési faktor is a gasztrointesztinális rendszer számára. Megállapították, hogy az amidált gasztrin fõ trofikus hatása a gyomor oxyntikus nyálkahártyájára van, ahol a gasztrikus õssejtek és ECL sejtek megnövekedett proliferációját okozza, ami megnövekedett parietális és ECL-sejt-tömeget eredményez. Másrészrõl a kevésbé processzált gasztrin (például glicinnel meghosszabbított gasztrin) fõ trofikus célpontjának a vastagbél-nyálkahártya tûnik (Koh, T. J. és Chen, D., 2000 Regul Pept 9337–9344. oldal). A neurotenzin (NT) egy neuropeptid, amelyet a skizofrénia patofiziológiájával hoztak kapcsolatba, és amely specifikusan modulálja a rendellenességben korábban hibásan szabályozottnak demonstrált neurotranszmitter rendszereket. A cerebrospinális folyadék (CSF) NT koncentrációit mérõ klinikai vizsgálatok feltárták a skizofréniás páciensek egy olyan alcsoportját, akinek csökkent a CSF NT¹je, amit visszaállított a hatásos antipszichotikus gyógyszerkezelés. Számottevõ bizonyíték létezik az NT rendszerek részvételére az antipszichotikus gyógyszerek mechanizmusában. A központilag beadott NT viselkedési és biokémiai hatásai fi-
1
HU 008 343 T2
gyelemre méltóan hasonlítanak a szisztémásan beadott antipszichotikus gyógyszerekére, és az antipszichotikus gyógyszerek növelik az NT neurotranszmissziót. A felismerések ezen sorozata ahhoz a hipotézishez vezetett, hogy az NT endogén antipszichotikus szerként funkcionál. Ezenfelül a tipikus és atipikus antipszichotikus gyógyszerek differenciálisan megváltoztatják az NT neurotranszmissziót nigrostriatális és mezolimbikus dopamin terminális régiókban, és ezek a hatások prediktívek a mellékhatások elõfordulására és a hatékonyságra (Binder, E. B. és munkatársai, 2001 Biol Psychiatry 50 856–872. oldal). A fertilizációt elõsegítõ peptid (FPP) – a tirotrofin felszabadító hormonnal (TRH) rokon tripeptid – az ondóplazmában található. Újabb in vitro és in vivo szerzett bizonyítékok azt mutatták, hogy az FPP fontos szerepet játszik a sperma fertilitásának szabályozásában. Közelebbrõl az FPP kezdetben stimulálja a nem fertilizáló (’uncapacitated’) spermiumokat hogy „bekapcsolódjanak”, és gyorsabban termékennyé váljanak, de azután megakasztja az ’kapacitálódásukat’, oly módon, hogy azok nem vesztik el spontán az akroszómáikat, és ezért nem vesztik el a termékenyítõképességüket. Ezeket a válaszokat imitálja, sõt fokozza az adenozin, amely ismert módon szabályozza az adenilil-cikláz (AC)/cAMP jeltovábbítási útvonalat. Az FPP-rõl és adenozinról egyaránt kimutatták, hogy stimulálják a cAMPtermelést ’uncapacitated’ sejtekben, de gátolják azt ’capacitated’ tett sejtekben, és az FPP receptorok valahogyan kölcsönhatásba lépnek az adenozin receptorokkal és G fehérjékkel, hogy elérjék az AC szabályozását. Ezek az események befolyásolják különféle fehérjék tirozin-foszforilációját, amelyek közül néhány fontos a kezdeti „bekapcsolásban”, mások pedig magában az akroszóma-reakcióban vesznek részt. A kalcitonin és angiotenzin II – amelyek szintén megtalálhatók az ondóplazmában – hasonló hatásúak in vitro az ’ucapacitated’ spermiumokra, és fokozhatják az FPP¹re adott válaszokat. Ezek a molekulák hasonló hatásúak in vivo, befolyásolják a termékenységet a termékenyítõképesség stimulálásával majd fenntartásával. Az FPP, adenozin, kalcitonin és angiotenzin II elérhetõségének csökkenése vagy azok receptorának a sérülése hozzájárul a hímterméketlenséghez (Fraser, L. R. és Adeoya-Osiguwa, S. A., 2001 Vitam Horm 63, 1–28. oldal). Újabban számos citotoxikus T¹limfocita peptidalapú vakcinát tanulmányoztak klinikai vizsgálatokban hepatitisz¹B, humán immundeficiencia vírus és melanóma ellen. Egy érdekes melanóma vakcinajelölt – önmagában vagy más tumorantigénekkel kombinációban – az ELA dekapeptid. Ez a peptid egy Melan-A/MART¹1 antigén immundomináns peptidanalóg, N¹terminális glutaminsavval. Arról számoltak be, hogy a glutaminsav aminocsoportja és gamma-karboxil-csoportja, valamint a glutaminok aminocsoportja és gamma-karboxil-csoportja könnyen kondenzálódik, piroglutaminszármazékokat alkotva. Ezen stabilitási probléma megoldására számos gyógyászatilag érdekes peptidet kifejlesztettek piroglutaminsavval az N¹terminális glutamin vagy gluta-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 17
2
minsav helyett, a gyógyászati tulajdonságok elvesztése nélkül. Sajnos az ELA-val összehasonlítva a piroglutaminsavszármazék (PyrELA) és az N¹terminális acetilsapkázott származék (AcELA) nem váltott ki citotoxikus T¹limfocita (CTL) aktivitást. A PyrELA és AcELA látszólagos kis változtatásai ellenére ez a két származék feltehetõen alacsonyabb affinitású, mint az ELA a specifikus I. osztályos fõ hisztokompatibilitási komplexre nézve. Ennek következtében, hogy megõrizzük az ELA teljes aktivitását, el kell kerülni a PyrELA kialakulását [Beck A. és munkatársai, 2001, J Pept Res 57(6):528–538. oldal]. Újabban azt találták, hogy a glutaminil-cikláz (QC) enzim is túltermelõdik melanómákban (Ross D. T és munkatársai, 2000, Nat Genet 24:227–235. oldal). Számos fehérje poliglutaminmeghosszabbítása neurodegeneratív rendellenességekhez, mint például Parkinson-kórhoz és Kennedy-betegséghez vezet. Ezek mechanizmusa nagyjából ismeretlen maradt. A poliglutamin ismétlõdések biokémiai tulajdonságai egy lehetséges magyarázatra utalnak: a glutaminil-glutaminil kötés endolitikus elhasítása majd piroglutamát kialakulása hozzájárulhat a patogenezishez a polyglutaminil fehérjék katabolikus stabilitásának, hidrofobitásának, amiloidogenitásának és neurotoxicitásának fokozásával [Saido, T; Med Hypotheses (2000) Mar; 54(3):427–429. oldal]. Az emlõs QC gátlását kezdetben csak az 1,10-fenantrolin és redukált 6¹metil-pterin esetében detektálták (Busby, W. H. J. és munkatársai, 1987 J Biol Chem 262, 8532–8536. oldal). Az EDTA nem gátolta a QC¹t, ily módon arra következtettek, hogy az nem egy fémfüggõ enzim (Busby, W. H. J. és munkatársai. 1987 J Biol Chem 262, 8532–8536. oldal, Bateman, R. C. J. és munkatársai, 2001 Biochemistry 40, 11246–11250. oldal, Booth, R. E. és munkatársai, 2004 BMC Biology 2). A találmány szerint azonban kimutatjuk, hogy a humán QC és más állati QC¹k fémfüggõ enzimek, amint azt a QC 1,10-fenantrolin, dipikolinsav, 8¹hidroxi-quinolin és más kelátorok általi gátlási jellemzõi (18., 19. ábra), és a QC átmenetifémekkel való reaktiválása (20. ábra) feltárta. Végezetül a fém-függést más fémfüggõ enzimek szekvencia-összehasonlításával körvonalazzuk, ami a komplexáló aminosav-oldalláncok konzerváltságát mutatja a humán QC¹ben is (21. ábra). A vegyületek kölcsönhatása az aktív helyhez kötött fémionnal általános módot jelent a QC¹aktivitás gátlására. A találmány szerint kimutatjuk, hogy az imidazolszármazékok hatásos QC inhibitorok. A folyamatos vizsgálati eljárás alkalmazásával (a részletekért lásd a 2. példát) sok imidazolszármazékot elemeztünk a humán QC, mint az erõsen konzervált emlõs QC¹k egy képviselõjének gátlására való képességükre. Ily módon a találmány tárgyát képezik imidazolszármazékok és a hisztidin és származékai, mint a QC¹aktivitását csökkentõ effektorok, és azok jellemzõi a gátlás típusára és hatásosságára. A szerkezeteket és Ki-értékeket a 3. és 4. táblázatban mutatjuk be. Az eredményeket részletesen ismertetjük a 7. példában.
HU 008 343 T2
3. táblázat Imidazolszármazékok gátlási állandója a humán QC katalizált reakcióban. A meghatározásokat 30 °C¹on végeztük 5 mM EDTA¹t tartalmazó 0,05 M Tris-HCl pH=8,0 pufferben. Vegyület
Ki-érték (mM)
Alapszerkezet Imidazol
0,103±0,004
Benzimidazol
0,138±0,005
N¹1 származékok 1-Benzilimidazol
0,0071±0,0003
1-Metil-imidazol
0,030±0,001
1-Vinilimidazol
0,049±0,002
Oxálsav-diimidazolidid
0,078±0,002
N-Acetil-imidazol
0,107±0,003
N-(Trimetil-szilil)-imidazol
0,167±0,007
N-Benzoilimidazol
0,174±0,007
1-(2¹Oxo-2-fenil-etil)-imidazol
0,184±0,005
1-(3¹Amino-propil)-imidazol
0,41±0,01
1-Fenilimidazol
nincs gátlás
1,1-Szulfonildiimidazol
nincs gátlás
C-4(5) származékok N-omega-Acetil-hisztamin
0,017±0,001
L-Hisztidinamid
0,56±0,04
H–His-Trp-OH
0,60±0,03
L-Hisztidinol
1,53±0,12
L-Hisztidin
4,4±0,2
4-Imidazol-karboxaldehid
7,6±0,7
Imidazol-4-karbonsav
14,5±0,6
Metil-észter L-hisztamin
0,85±0,04
C-4,5 származékok 5-Hidroxi-metil-4-metil-imidazol
0,129±0,005
4-Amino-imidazol-5-karbonsav-amid
15,5±0,5
4,5-Difenil-imidazol
nincs gátlás
4,5-Diciano-imidazol
nincs gátlás
C¹2 származékok 2-Metil-benzilimidazol
0,165±0,004
2-Etil-4-metil-imidazol
0,58±0,04
2-Amino-benzimidazol
1,8±0,1
2-Kloro-1H-benzimidazol
nincs gátlás
Mások
3-(1H-Imidazol-1¹il)-1-(3¹metil-benzo[b]tiofen-2¹il)-propan-1-on
0,0025±0,0001
18
Szerkezet
HU 008 343 T2
3. táblázat (folytatás) Vegyület
Ki-érték (mM)
4-[(1¹Metil-1H-imidazol-5¹il)-metil]-3-propildihidrofurán-2(3H)-on
0,0067±0,0003
4-[2¹(1H¹Imidazol-1¹il)-etoxi]-benzoesav
0,0034±0,0001
3-[3¹(1H-Imidazo-1¹il)-propil]-2-tioxo-imidazolidin-4-on
0,00041±0,00001
5-Nitro-2-[2¹([{3¹(1H-imidazol-1-il¹)-propil}-amino]-karbonil)-fenil]-furamid
0,0066±0,0004
N-(4¹Kloro-fenil)-N’-[2¹(1H-imidazol-1¹il)-etil]-tiourea
0,00165±0,00007
0,0322±0,0007
n. d.
Imidazo<1,5a>piridin
0,0356±0,0005
Metil-(2S)-2-{[(2S)-2-amino-5-(1H¹imidazol-1-il-amino)-5oxo-pentanoil]-amino}-3-metil-butanoát
0,164±0,004
19
Szerkezet
1
HU 008 343 T2
2
4. táblázat QC gátlása L¹hisztaminnal és annak két biológiai anyagcseretemékével (más néven tele-metil-hisztamin) Vegyület
Ki-érték (mM)
L-Hisztamin
0,85±0,04
3-Metil-4-(b-amino-etil)-imidazol
0,120±0,004
1-Metil-4-(b-amino-etil)-imidazol
n. i.
Meglepõ módon az enzimatikus aktivitás jellemzése folyamán felfedeztük, hogy az N¹terminális glutaminil-oldallánc mellett az N¹terminális b¹homoglutaminiloldalláncok is eleget tesznek aa növényi és állati eredetû QC¹k szubsztrát-feltételeinek. Az N¹terminális b¹homoglutaminil-oldallánc öttagú laktámgyûrûvé alakult át a humán és papaya QC általi katalízissel. Az eredményeket az 5. példában ismertetjük. Az alkalmazott eljárásokat a 2. példában ismertetjük, és a peptidszintézist a 6. példában ismertetett módon hajtottuk végre. Ezeket a vegyületeket átalakíthatjuk savaddíciós sókká, különösen gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sókká. A találmány szerinti vegyületek sói szervetlen vagy szerves sók formájában lehetnek. Ezeket a vegyületeket átalakíthatjuk vagy alkalmazhatjuk savaddíciós sókká, különösen gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sókká. A gyógyászatilag elfogadható só általában olyan formát vesz fel, amelyben egy bázikus oldallánc protonálva van szervetlen vagy szerves savval. Reprezentatív szerves vagy szervetlen savak közé tartozik a sósav, brómossav, perklórsav, kénsav, salétromsav, foszforsav, ecetsav, propionsav, glikolsav, tejsav, borostyánkõsav, maleinsav, fumársav, almasav, borkõsav, citromsav, benzoesav, mandelsav, metánszulfonsav, hidroxi-etánszulfonsav, benzolszulfonsav, oxálsav, pamoinsav, 2¹naftalénszulfonsav, p¹toulolszulfonsav, ciklohexánszulfámsav, szalicilsav, szaccharinsav vagy trifluor-ecetsav. A találmány szerinti vegyületek összes gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sója a találmány tárgykörébe tartozik. A szabad vegyületek és a só formájuk közötti szoros kapcsolat tükrében amikor egy vegyületre hivatkozunk ebben a vonatkozásban, a megfelelõ sót is értjük alatta, amennyiben az lehetséges vagy elfogadható az adott körülmények között. Ahol az alkalmazott vegyületeknek legalább egy királis központja van, azok ennek megfelelõen enantiomerekként létezhetnek. Ahol a vegyületek két vagy
Szerkezet
25
30
35
40
45
50
55
60 20
több királis centrummal rendelkeznek, azok továbbá diasztereomerekként létezhetnek. Nyilvánvaló, hogy az összes ilyen izomer és azok keverékei a találmány tárgykörébe tartoznak. Ezenfelül a vegyületek némely kristályos formája polimorf változatként létezhet, és ilyenként is a találmány tárgykörébe tartozik. Emellett a vegyületek némelyike szolvátot alkothat vízzel (azaz hidrátokat) vagy közönséges oldószerekkel, és az ilyen szolvátok is a találmány tárgykörébe tartoznak. A vegyületek, beleértve a sóikat is, elõállíthatók hidrátok formájában, vagy más oldószereket tartalmazhatnak a kristályosításkor. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány tárgya találmány szerinti glutaminil-cikláz inhibitorainak vagy azokat tartalmazó gyógyászati készítményeknek az alkalmazása a QC enzim gátlásával közvetített állapot megelõzésére vagy kezelésére azt igénylõ alanyban az állapot kezelésére terápiásan hatásos mennyiségben vagy adagolási rendben. Emellett a találmány tárgyát képezi találmány szerinti QC inhibitorok és megfelelõ gyógyászatilag elfogadható savaddíciós só formáik alkalmazása QC¹aktivitás gátlása által közvetített állapot alanyban történõ megelõzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. A vegyületet a páciensnek bármilyen hagyományos útvonalon beadhatjuk, nem korlátozó példaként beleértve intravénás, orális, szubkután, intramuszkuláris, intradermális, parenterális és ezek kombinációi. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát képezik glutaminil-cikláz-inhibitorai vagy azok gyógyászatilag elfogadható sói, az Alzheimer-kór és Down-szindróma közül választott betegség megelõzésében vagy kezelésében történõ alkalmazásra. Emellett a találmány tárgyát képezik glutaminil-cikláz inhibitorai vagy azok gyógyászatilag elfogadható sói alkalmazása az Alzheimer-kór és Down-szindróma közül választott betegség megelõzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát gyógyászati készítmények, azaz gyógyszerek képezik, amelyek legalább egy glutaminil-
1
HU 008 343 T2
cikláz inhibitort vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazzák, adott esetben kombinációban egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval és/vagy oldószerrel. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát gyógyászati készítmény képezi, amely glutaminil-cikláz legalább egy inhibitorát vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza, az Alzheimer-kór és Down-szindróma közül választott betegség megelõzésében vagy kezelésében történõ alkalmazásra. Emellett a találmány tárgyát képezi glutaminil-cikláz legalább egy inhibitorát vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazó gyógyászati készítmény alkalmazása az Alzheimer-kór és Down-szindróma közül választott betegség megelõzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. A gyógyászatilag elfogadható készítmények például parenterális vagy enterális kiszerelések formájában lehetnek, és megfelelõ hordozókat tartalmazhatnak, vagy orális kiszerelések formájában lehetnek, amelyek az orális beadásra alkalmas megfelelõ hordozókat tartalmazhatnak. Elõnyösen azok orális kiszerelések formájában vannak. A QC¹aktivitás találmány szerint beadott effektorait gyógyászatilag elfogadható kiszerelésekben vagy kiszerelési komplexekben alkalmazhatjuk inhibitorokként vagy kombinációban inhibitorokkal, szubsztrátokkal, pszeudoszubsztrátokkal, a QC expresszió inhibitoraival, kötõfehérjékkel, vagy olyan enzimfehérjék elleni ellenanyagokkal, amelyek csökkentik a QC fehérje koncentrációját emlõsökben. A találmány szerinti vegyületek lehetõvé teszik a kezelés egyedi beállítását páciensekre és betegségekre, és különösen lehetséges, hogy elkerüljük az egyedi intoleranciákat, allergiákat és mellékhatásokat. A vegyületek eltérõ mértékû aktivitást mutatnak az idõ függvényében. A kezelést nyújtó doktornak ezáltal lehetõsége van különbözõ módon reagálni a páciensek egyedi szituációira: egyrészrõl képes pontosan beállítani a hatás megjelenésének sebességét, másrészrõl a hatás idõtartamát és különösen a hatás intenzitását. Egy találmány szerinti elõnyös alkalmazás új megközelítési módot jelent a QC enzim aktivitás gátlása által közvetített állapot megelõzésére vagy kezelésére emlõsökben. Az kedvezõen egyszerû, alkalmas kereskedelmi alkalmazásra és különösen megfelel olyan betegségek kezelésére, amelyek fiziológiásan aktív QC szubsztrátok – például az 1. és 2. táblázatban felsoroltak – kiegyensúlyozatlan koncentrációján alapszanak, emlõsökben, és különösen emberi gyógyászatban. A vegyületeket elõnyösen például olyan gyógyászati készítmények formájában adhatjuk be, amelyek a hatóanyagot a szakterületen ismert szokásos adalék anyagokkal, mint például oldószerekkel, excipiensekkel és/vagy hordozókkal kombinálva tartalmazzák. Például azokat parenterálisan adhatjuk be (például iv. fiziológiás sóoldatban) vagy enterálisan (például orálisan, szokásos hordozókkal kiszerelve). Az endogén stabilitásuktól és bioelérhetõségüktõl függõen a vegyületek egy vagy több dózisát adhatjuk
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 21
2
be naponta, annak érdekében, hogy a vércukorértékek kívánt normalizálását elérjük. Például az ilyen dózistartomány emberekben a körülbelül 0,01 mg és 250,0 mg per nap tartományba esik, elõnyösen a körülbelül 0,01 és 100 mg közötti tartományba, a vegyület testtömeg-kilogrammjára. A QC¹aktivitás inhibitorai emlõsnek történõ beadásával lehetséges megelõzni vagy enyhíteni vagy kezelni az Alzheimer-kór és Down-szindróma közül választott állapotot. A találmány szerint alkalmazott vegyületet ennek megfelelõen átalakíthatjuk önmagukban ismert hagyományos kiszerelésekké, mint például tablettákká, kapszulákká, drazsékká, pilulákká, kúpokká, granulátumokká, aeroszolokká, szirupokká, folyadékokká, szilárd és krémszerû emulziókká és szuszpenziókká és oldatokká, inert, nem toxikus, gyógyászatilag elfogadható hordozók és adalék anyagok és oldószerek alkalmazásával. Az egyes kiszerelésekben a terápiásan hatásos vegyületek elõnyösen megközelítõleg 0,1–80 tömeg%, elõnyösebben 1–50 tömeg% koncentrációban vannak jelen a keverék teljes tömegére vonatkoztatva, azaz az elérendõ említett dózisterjedelemhez szükséges mennyiségben. Az anyagokat gyógyszerekként alkalmazhatjuk drazsék, kapszulák, rágókapszulák, tabletták, cseppek, szirupok vagy kúpok vagy orrspray¹k formájában. A kiszereléseket elõnyösen például a hatóanyagok oldószerekkel és/vagy hordozókkal való kiegészítésével állíthatjuk elõ, adott esetben emulgeálószerek és/vagy diszpergálószerek alkalmazásával, és lehetséges, hogy például abban az esetben ahol vizet alkalmazunk oldószerként, szerves oldószereket alkalmazzunk segédoldószerekként. A találmány szerint hasznos excipiensek példái közé tartozik: víz, nem toxikus szerves oldószerek, mint például paraffinok (például természetes olaj-frakciók), növényi olajok (például repceolaj, földimogyoróolaj, szezámolaj), alkoholok (például etil- alkohol, glicerin), glikolok (például propilénglikol, polietilénglikol); szilárd hordozók, mint például természetes porított ásványok (például nagyon diszpergált szilika, szilikátok), cukrok (például nyerscukor, laktóz és dextróz); emulgeálószerek, mint például nemionos és anionos emulgeálószerek (például poli(oxi-etilén)-zsírsav-észterek, poli(oxi-etilén)-zsírsav-alkohol éterek, alkilszulfonátok és arilszulfonátok), diszpergálószerek (például lignin, szulfit-folyadékok, metil-cellulóz, keményítõ és poli(vinil-pirrolidon)) és kenõanyagok (például magnéziumsztearát, talkum, sztearinsav és nátrium-lauril-szulfát) és adott esetben ízesítõszerek. A beadást a szokásos módon hajthatjuk végre, elõnyösen enterálisan vagy parenterálisan, különösen orálisan. Az enterális beadás esetében tabletták az említett hordozók mellett további adalék anyagokat tartalmazhatnak, mint például nátrium-citrátot, kalciumkarbonátot és kalcium-foszfátot, együtt különféle adalék anyagokkal, mint például keményítõvel, elõnyösen burgonyakeményítõvel, zselatinnal és hasonlókkal. Ezenfelül kenõanyagokat, mint például magnézium-
1
HU 008 343 T2
sztearátot, nátrium-lauril-szulfátot és talkumot alkalmazhatunk a tablettázáshoz. Az orális beadásra szánt vizes szuszpenziók és/vagy elixírek esetében különféle ízjavítókat vagy színezékeket adhatunk a hatóanyagokhoz a fent említett excipiensek mellett. A parenterális beadás esetében a hatóanyagok alkalmas folyékony hordozókban készített oldatait alkalmazzuk. Általában elõnyösnek találtuk intravénás beadás esetében megközelítõleg 0,01–2,0 mg/kg, elõnyösen megközelítõleg 0,01–1,0 mg/kg testtömegre és naponta vetített mennyiség beadását, hogy hatásos eredményeket kapjunk, és az enterális beadás esetében a dózis megközelítõleg 0,01–2 mg/kg, elõnyösen megközelítõleg 0,01–1 mg/kg a testtömegre és naponta vetítve. Mindazonáltal szükséges lehet bizonyos esetekben lehet eltérni a feltüntetett mennyiségektõl, a kísérleti állat vagy páciens testtömegétõl vagy a beadás útvonalának típusától függõen, vagy az állat faja szerint és a gyógyszerre vagy a végrehajtott beadás idõközére adott egyéni válaszának alapján is. Ennek megfelelõen bizonyos esetekben elégséges lehet kevesebb mennyiséget alkalmazni, mint a fent említett minimális mennyiség, míg más esetekben meghaladhatjuk az említett felsõ határt. Azokban az esetekben, amikor viszonylag nagy mennyiségeket adunk be, tanácsos lehet elosztani azokat a mennyiségeket több egyedi dózisra a nap folyamán. Humán gyógyszer beadásakor ugyanezt a dózisterjedelmet biztosítjuk. A fenti megjegyzések analóg módon alkalmazhatók ebben az esetben. Gyógyászati kiszerelések példái 1. Kapszulánként 100 mg találmány szerinti vegyületet tartalmazó kapszulák: Megközelítõleg 10 000 kapszulához a következõ összetételû oldatot állítjuk elõ: Találmány szerinti vegyület 1,0 kg Glicerin 0,5 kg Polietilénglikol 3,0 kg Víz 0,5 kg 5,0 kg Az oldatot lágyzselatin-kapszulákba csomagoljuk önmagában ismert módon. A kapszulák rágásra vagy lenyelésre alkalmasak. 2. 100 mg találmány szerinti vegyületet tartalmazó tabletták vagy bevonatos tabletták vagy drazsék: A következõ mennyiségek 100 000 tabletta készítésére vonatkoznak: Találmány szerinti vegyület, finomra õrölve 10,0 kg Glükóz 4,35 kg Laktóz 4,35 kg Keményítõ 4,50 kg Cellulóz, finomra õrölve 4,50 kg A fenti összetevõket összekeverjük és azután a következõkbõl készített oldatban oldjuk Poli(vinil-pirrolidon) 2,0 kg Poliszorbát 0,1 kg és víz megközelítõleg 5,0 kg
2
és granuláljuk önmagában ismert módon a nedves tömeg lereszelésével és – 0,2 kg magnézium-sztearát hozzáadása után – megszárításával. A 30,0 kg kész tabletta keveréket processzáljuk 300 mg tömegû kon5 vex tablettákká. Ideális esetben a tablettákat bevonhatjuk vagy cukros bevonatolhatjuk önmagában ismert módon. A leírásban definiált gyógyászati készítmények elõnyösen QC¹aktivitás legalább egy effektorát és leg10 alább egy DP¹IV inhibitort tartalmaznak. Ilyen gyógyászati készítmények különösen hasznosak Alzheimerkór és Down-szindróma kezelésére. 1. példa: Humán és Papaya QC elõállítása Gazdatörzsek és tápközegek A humán QC expresszáltatására alkalmazott Pichia pastoris X33 törzset (AOX1, AOX2) a gyártó (Invitrogen) utasításainak megfelelõen tenyésztettük, transzformáltuk és elemeztük. A P. pastoris számára szüksé20 ges tápközeget, azaz pufferelt glicerin (BMGY) komplex vagy metanol (BMMY) komplex tápközeget, és a fermentációs alap sótápközeget a gyártó javaslatai szerint állítottuk elõ. 15
A humán QC¹t kódoló plazmidvektorok molekuláris klónozása Az összes klónozási eljárást szokásos molekuláris biológiai módszerek alkalmazásával végeztük. Az élesztõben történõ expresszióhoz a pPICZaB vektort 30 (Invitrogen) alkalmaztuk. A pQE¹31 vektort (Qiagen) alkalmaztuk a humán QC E. coli-ban történõ expresszáltatására. A 38. kodonnal kezdõdõ érett QC cDNS¹át fázisban fuzionáltattuk a plazmidon kódolt 6×hisztidincímkével. A pQCyc¹1 és pQCyc¹2 láncindítók (1. táblá35 zat) alkalmazásával végzett amplifikálás és szubklónozás után a fragmenst beinszertáltuk az expessziós vektorba az Sphl és Hindlll restrikciós helyek alkalmazásával. 25
40
45
50
55
60 22
P. pastoris transzformálása és a kisléptékû expresszió Plazmid DNS¹t amplifikáltunk E. coli JM109-ben és megtisztítottuk a gyártó (Qiagen) javaslatai szerint. Az alkalmazott expressziós plazmidban – pPICZaB – három restrikciós hely szolgál a linearizálásra. Mivel a Sacl és BstXl hasít a QC cDNS¹en belül, a Pmel¹t választottuk ki a linearizálásra. 20–30 mg plazmid DNS¹t linearizáltunk Pmel-gyel, kicsaptuk etanollal és feloldottuk steril ioncserélt vízben. Azután 10 mg DNS¹t alkalmaztunk kompetens P. pastoris sejtek elektroporációval végzett transzformálására a gyártó (BioRad) utasításai szerint. A szelekciót 150 mg/ml zeocint tartalmazó csészéken végeztük. A linearizált plazmiddal végzett egy transzformáció több száz transzformánst eredményezett. A rekombináns élesztõklónok QC expresszióra való tesztelése érdekében rekombinánsokat növesztettünk 24 órán keresztül 2 ml BMGY¹t tartalmazó 10 ml¹es kúpos csövekben. Azután az élesztõt lecentrifugáltuk és újra felszuszpendáltuk 0,5% metanolt tartalmazó 2 ml
1
HU 008 343 T2
BMMY-ben. Ezt a koncentrációt fenntartottuk metanol hozzáadásával minden 24 órában 72 órán keresztül. Azt követõen meghatároztuk a QC¹aktivitást a felülúszóban. Igazoltuk a fúziós fehérje jelenlétét Westernblot elemzéssel a 6×hisztidincímke elleni ellenanyag (Qiagen) alkalmazásával. A legmagasabb QC¹aktivitást mutató klónokat választottuk ki további kísérletekre és fermentációra. Nagyléptékû expressziófermentorban A QC expresszáltatását 5 l¹es reaktorban (Biostat B, B. Braun biotech) hajtottuk végre, lényegében amint a „Pichia fermentation process guidelines” (Invitrogen) irodalmi helyen ismertetik. Röviden, a sejteket fermentációs alapsótápközegben növesztettük, amely ki volt egészítve nyomelem sókkal és glicerinnel, mint egyedüli szénforrással (pH=5,5). A kiindulási batchfázisban körülbelül 24 órán keresztül és azután a betáplálásos batchfázisban körülbelül 5 órán keresztül felhalmozódott a sejttömeg. Ha egyszer a sejtek nedves tömege elérte a 200 g/l¹t, a QC expresszió indukálását metanol alkalmazásával hajtottuk végre háromlépcsõs betáplálási profil szerint a teljes fermentáció ideje alatt, megközelítõleg 60 órán keresztül. Azt követõen a sejteket eltávolítottuk a QC¹t tartalmazó felülúszóból centrifugálással 6000×g¹n, 4 °C¹on 15 percen keresztül. A pH¹t beállítottuk 6,8¹re NaOH hozzáadásával, és a kapott zavaros oldatot ismét lecentrifugáltuk 37 000×g¹n, 4 °C¹on 40 percen keresztül. Megmaradó zavarosság esetén egy további szûrési lépést alkalmaztunk cellulóz membrán (pórusmérete 0,45 mm) alkalmazásával. A P. pastoris-ban expresszáltatott 6×hisztidincímkézett QC tisztítása A His-címkézett QC¹t elõször immobilizált fémaffinitási kromatográfiával (IMAC) tisztítottuk. Egy tipikus tisztításban 1000 ml tenyészet felülúszót vittünk fel Ni2+¹el feltöltött Chelating Sepharose FF oszlopra (1,6×20 cm, Pharmacia), amely ekvilibrálva volt 750 mM NaCl¹ot tartalmazó 50 mM foszfátpufferrel, pH=6,8, 5 ml/perc áramlási sebesség mellett. 10 oszloptérfogatnyi ekvilibrációs pufferrel és 5 oszloptérfogatnyi, 5 mM hisztidint tartalmazó ekvilibrációs pufferrel végzett mosás után a megkötõdött fehérjét 150 mM NaCl¹ot és 100 mM hisztidint tartalmazó 50 mM foszfátpufferre, pH=6,8 történõ váltással eluáltuk. A kapott eluátumot dializáltuk 20 mM Bis-Tris/HCl, pH=6,8 pufferrel szemben 4 °C¹on éjszakán keresztül. Azt követõen a QC¹t tovább tisztítottuk anioncserélõ kromatográfiával Mono Q6 oszlopon (BioRad), ami dialízispufferrel volt ekvilibrálva. A QC¹t tartalmazó frakciókat 4 ml/perc áramlási sebességgel vittük fel az oszlopra. Azután az oszlopot megmostuk 100 mM NaCl¹ot tartalmazó ekvilibrációs pufferrel. Az eluálást két gradienssel végeztük, amelyek 240 mM és 360 mM NaCl¹ot tartalmazó ekvilibrációs puffer volt rendre 30 vagy 5 oszloptérfogatban. 6 ml¹es frakciókat gyûjtöttünk és a tisztaságukat SDS-PAGE-vel elemeztük. A homogén QC¹t tartalmazó frakciókat összeöntöttük, és betöményítettük ultraszûréssel. A hosszú távú tároláshoz (¹20 °C)
5
10
15
20
25
2
glicerint adtunk hozzá 50% végkoncentrációban. A fehérjetartalmat Bradford vagy Gill és von Hippel (Bradford, M. M., 1976 Anal Biochem 72, 248–254. oldal; Gill, S. C. és von Hippel, P. H., 1989 Anal Biochem 182, 319–326. oldal) eljárásai szerint határoztuk meg. QC expresszáltatása és tisztítása E. coli-ból A QC¹t kódoló konstrukciót betranszformáltuk M15 sejtekbe (Qiagen) és szelektív LB agar csészéken tenyésztettük 37 °C¹on. A fehérjeexpressziót 1% glükózt és 1% etanolt tartalmazó LB tápközegben hajtottuk végre szobahõmérsékleten. Amikor a tenyészet elérte a megközelítõleg 0,8 OD600-értéket, az expresszió indukáltuk 0,1 mM IPTG-vel éjszakán keresztül. Egy ciklus fagyasztás és felolvasztás után a sejteket 4 °C¹on lizáltuk 2,5 mg/ml lizozim hozzáadásával 50 mM foszfátpufferben, pH=8,0, amely 300 mM NaCl¹ot és 2 mM hisztidint tartalmazott, megközelítõleg 30 percen keresztül. Az oldatot centrifugálással feltisztítottuk 37 000×g¹n, 4 °C¹on 30 percen keresztül, majd szûrtük üvegszûrõ alkalmazásával (DNS elválasztása) és két további szûrési lépéssel cellulózszûrõk alkalmazásával a nyers és finom csapadék elválasztására. A felülúszót (megközelítõleg 500 ml) felvittük Ni2+-affinitási oszlopra (1,6×20 cm) 1 ml/perc áramlási sebesség mellett. A QC eluálását 50 mM foszfátpufferrel hajtottuk végre, amely 150 mM NaCl¹ot és 100 mM hisztidint tartalmazott. A QC¹t tartalmazó frakciókat betöményítettük ultraszûréssel.
30
35
40
45
50
55
60 23
QC tisztítása papaya latexbõl A papaya latexbõl származó QC¹t a BioCAD 700E (Perseptive Biosystems, Wiesbaden, Germany) készülék alkalmazásával tisztítottuk meg a korábban leközölt eljárás módosított változatával (Zerhouni, S. és munkatársai, 1989 Biochim Biophys Acta 138, 275–290. oldal). 50 g latexet feloldottunk vízben és lecentrifugáltuk, amint ott ismertetik. A proteázok inaktiválását S¹metil-metán-tioszulfonáttal végeztük, és a kapott nyers extraktumot dializáltuk. A dialízis után a teljes felülúszót felvittük SP Sepharose Fast Flow oszlopra (21×2,5 cm átmérõ), amely ekvilibrálva volt 100 mM nátrium-acetát pufferrel, pH=5,0 (áramlási sebesség: 3 ml/perc). Az eluálást három lépésben végeztük a nátrium-acetát növekvõ koncentrációjával 2 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az elsõ lépés lineáris gradiens volt 0,1-tõl 0,5 M acetát-pufferkoncentrációig 0,5 oszloptérfogatban. A második lépés a pufferkoncentráció lineáris növelése volt 0,5-tõl 0,68 M¹ig négy oszloptérfogatban. Az utolsó elúciós lépésben egy oszloptérfogat 0,85 M puffer alkalmaztunk. A legmagasabb enzimaktivitást tartalmazó frakciókat (6 ml) összeöntöttük. Koncentrálást és puffercserét végeztünk 0,02 M Tris/HCl, pH=8,0 pufferre ultraszûréssel (Amicon; a membrán molekulatömeg-vágási értéke: 10 kDa). Ammónium-szulfátot adtunk 2 M végkoncentrációban a koncentrált papayaenzimhez, amelyet az ioncserélõ kromatográfiás lépésben kaptunk. Ezt az oldatot vittük fel Butyl Sepharose 4 Fast Flow oszlopra (21×2,5 cm átmérõ, áramlási sebesség 1,3 ml/perc),
1
HU 008 343 T2
2
amely ekvilibrálva volt 2 M ammónium-szulfát, 0,02 M Tris/HCl, pH=8,0 pufferrel. Az eluálást három lépésben végeztük az ammónium-szulfát csökkenõ koncentrációival. Az elsõ lépésben 2¹tõl 0,6 M¹ig ammóniumszulfát lineáris gradiens, 0,02 M Tris/HCl, pH=8,0 puffert alkalmaztunk 0,5 oszloptérfogatban 1,3 ml/perc áramlási sebesség mellett. A második lépésben 0,6-tól 0 M ammónium-szulfát lineáris gradiens, 0,02 M Tris/HCl, pH=8,0 puffert alkalmaztunk 5 oszloptérfogatban 1,5 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az utolsó elúciós lépést 0,02 M Tris/HCl, pH=8,0 puffer alkalmazásával végeztük 2 oszloptérfogatban 1,5 ml/perc áramlási sebesség mellett. A QC¹aktivitást tartalmazó összes frakciót összeöntöttük, betöményítettük ultraszûréssel. A kapott homogén QC¹t –70 °C¹on tároltuk. A végsõ fehérjekoncentrációkat Bradford eljárásának alkalmazásával határoztuk meg, szarvasmarha-szérumalbumin standard görbéhez hasonlítva.
man, R. C. J., 1989 J Neurosci Methods 30, 23–28. oldal), glutamát-dehidrogenáz segédenzim alkalmazásával. A minták a megfelelõ QC szubsztrátból, 0,3 mM NADH-ból, 14 mM a¹ketoglutársavból és 30 U/ml gluta5 mát-dehidrogenázból álltak 250 ml végtérfogatban. A reakciókat a QC hozzáadásával indítottuk, és a 340 nm¹en mért abszorbancia csökkenésének monitorozásával végeztük 8–15 percen keresztül. A termék kialakulásának tipikus idõgörbéit az 1. ábrán mutatjuk 10 be. Értékeltük a kezdeti sebességeket, és meghatároztuk az enzimaktivitást ammónia vizsgálati körülmények között felvett standard görbéjébõl. Az összes mintát 30 °C¹on mértük, vagy a SPECTRAFluor Plus vagy a 15 Sunrise (mindkettõ TECAN) mikrotiterlemez-leolvasó alkalmazásával. A kinetikai adatokat a GraFit szoftverrel értékeltük.
2. példa: A glutaminil-cikláz-aktivitás vizsgálati eljárása Fluorometriás vizsgálati eljárások Minden mérést mikrotiterlemezes BioAssay Reader HTS-7000Plus készülékkel végeztünk (Perkin-Elmer) 30 °C¹on. A QC¹aktivitást H¹Gln-pNA alkalmazásával értékeltük fluorometriával. A minták 0,2 mM fluorogén szubsztrátból, 0,25 U piroglutamil-aminopeptidázból (Unizyme, Horsholm, Denmark) álltak 0,2 M Tris/HCl, pH=8,0 pufferben, amely 20 mM EDTA¹t tartalmazott, és a QC megfelelõ hígítását 250 ml végtérfogatban. A gerjesztési/emissziós hullámhosszak 320/410 nm voltak. A vizsgálati reakciót glutaminil-cikláz hozzáadásával indítottuk be. A QC¹aktivitást b¹naftilamin standard görbe alapján határoztuk meg, amelyet a vizsgálati eljárás körülményei között vettünk fel. Az egy egységet a QC olyan mennyiségének definiáljuk, amely percenként 1 mmol pGlu-bNA kialakulását katalizálja H¹Gln-bNA-ból az ismertetett körülmények között. Egy második fluorometriás vizsgálati eljárásban a QC¹aktivitást H¹Gln-AMC szubsztráttal határoztuk meg. A reakciókat 30 °C¹on végeztük a NOVOStar mikrotiterlemez-leolvasó alkalmazásával (BMG labtechnologies). A minták különbözõ koncentrációjú fluorogén szubsztrátból, 0,1 U piroglutamil-aminopeptidázból (Qiagen) álltak 0,05 M Tris/HCl, pH=8,0 pufferben, amely 5 mM EDTA¹t tartalmazott, és a QC megfelelõ hígítását 250 ml végtérfogatban. A gerjesztési/emissziós hullámhosszak 380/460 nm voltak. A vizsgálati reakciót glutaminil-cikláz hozzáadásával indítottuk be. A QC¹aktivitást 7¹amino-4-metilkumarin standard görbe alapján határoztuk meg, amelyet a vizsgálati eljárás körülményei között vettünk fel. A kinetikai adatokat a GraFit szoftverrel értékeltük.
20
QC spektrofotometriás vizsgálati eljárása Ezt az új vizsgálati eljárást alkalmaztuk a legtöbb QC szubsztrát kinetikai paramétereinek meghatározására. A QC¹aktivitást folyamatos eljárással határoztuk meg spektrofotometrikusan, amely egy korábbi szakaszos vizsgálati eljárás adaptálásából származott (Bate-
55
Inhibitor vizsgálati eljárás Az inhibitor teszteléshez a mintakészítmények ugyanazok voltak, mint amiket fent ismertettünk, kivéve, hogy a feltételezett inhibitor is hozzáadtuk. A QC¹gátlás gyors teszteléséhez a minták 4 mM megfelelõ inhibitort tartalmaztak és a szubsztrát koncentrá25 ció 1 KM volt. A gátlás részletes vizsgálatához és a Kiértékek meghatározásához elõször megvizsgáltuk az inhibitor hatását a segédenzimekre. Egyik enzim esetében sem detektáltuk hatást, ami ily módon lehetõvé tette a QC¹gátlás megbízható meghatározását. A gát30 lási állandót kompetitív inhibíció görbéinek illesztésével értékeltük a GraFit szoftver alkalmazásával.
35
40
45
50
60 24
3. példa: MALDI-TOF tömegspektrometria Mátrixasszisztált lézer deszorpciós/ionizációs tömegspektrometriát hajtottunk végre a Hewlett-Packard G2025 LD¹TOF System alkalmazásával lineáris repülési idõ analizátorral. A készülék fel volt szerelve 337 nm¹es nitrogénlézerrel, potenciális gyorsulási forrással (5 kV) és egy 1,0 m¹es repülési csõvel. A detektort pozitív-ion módban mûködtettük és a jeleket LeCroy 9350M digitális tárolóoszcilloszkóppal vettük fel és szûrtük, amely személyi számítógéphez volt kapcsolva. A mintákat (5 ml) összekevertük azonos térfogatú mátrixoldattal. Mátrixoldatként DHAP/DAHC¹t alkalmaztunk, amelyet 30 mg 2’,6’-dihidroxi-acetofenon (Aldrich) és 44 mg diammónium-hidrogén-citrát (Fluka) összekeverésével állítottunk elõ 1 ml acetonitril/0,1% vizes TFA (1/1, v/v) oldatban. Egy kis térfogatú (=1 ml) mátrix-analit-keveréket vittünk át a próba hegyére és azonnal elpárologtattuk vákuumkamrában (HewlettPackard G2024A minta-prep tartozék), hogy biztosítsuk a minta gyors és homogén kristályosodását. A Glu1-ciklizáció hosszú távú teszteléséhez Ab-eredetû peptideket inkubáltunk 30 °C¹on 100 ml 0,1 M nátrium-acetát pufferben, pH=5,2 vagy 0,1 M Bis-Tris pufferben, pH=6,5. A peptideket 0,5 mM [Ab3–11a] vagy 0,15 mM [Ab3–21a] koncentrációban alkalmaztuk, és 0,2 U QC¹t adtunk hozzá 24 órán keresztül. Az Ab3–21a esetében a vizsgálati eljárás 1% DMSO¹t tartalmazott. Különbözõ idõpontokban mintákat távolítot-
1
HU 008 343 T2
tunk el a vizsgálati csõbõl, a peptideket extraháltuk ZipTips (Millipore) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint, összekevertük mátrixoldattal (1:1 v/v) és azt követõen felvettük a tömegspektrumokat. A negatív kontrollok nem tartalmaztak sem QC¹t, sem hõvel inaktivált enzimet. A gátlási vizsgálatokhoz a minta összetétele ugyanaz volt, mint amit fent ismertettünk, kivéve, hogy inhibitor vegyületet is hozzáadtuk (5 mM benzimidazol vagy 2 mM 1,10-fenantrolin).
jából a QC¹k szubsztrát-specifitási összehasonlításának végrehajtására.
5
10 4. példa: pH¹függés A humán és papaya QC katalízisének pH¹függését elsõrendû sebességi körülmények között vizsgáltuk, ily módon azok tükrözik a protonkoncentráció hatását a kcat/KM specifitási állandóra. Ebbõl a célból a segédenzimként piroglutamil-aminopeptidázt és szubsztrátként Gln-bNA¹t alkalmazó kapcsolt enzimatikus reakciót alkalmaztuk. A piroglutamil-aminopeptidázról kimutatták, hogy aktív és stabil pH=5,5–8,5 között [Tsuru, D. és munkatársai, 1978 J Biochem (Tokyo) 84, 467–476. oldal]. Ily módon a vizsgálati eljárás lehetõvé tette a QC katalízis vizsgálatát ebben a tartományban. A kapott sebességi profilokat klasszikus haranggörbékre illesztettük, amint a 2. ábrán bemutatjuk. A humán QC¹nek nagyon szoros a pH¹függése, amelynek az optimuma körülbelül pH=7,8–8,0. A sebesség csökkent bázikusabb pH¹kon. Ez ellentétben áll a papaya QC¹vel megfigyelt sebességi profillal, amely nem mutatott aktivitáscsökkenést pH=8,5¹ig (2. ábra, beágyazott kép). Azonban mindkét enzim specifitási optimuma pH=8¹on volt. Meglepõ módon a görbék értékelése azonos pKa-értékeket tárt fel a savas tartományban 7,17±0,02 és 7,15±0,02 értékkel a humán és papaya QC¹re. A humán QC¹aktivitásának csökkenése bázikus pH¹értékeken nyilvánvalóan a megközelítõleg 8,5 pKa értékû csoport disszociációja miatt volt. A papaya QC esetében nem volt lehetséges további adatgyûjtés a bázikus pH¹tartományban, hogy lehetõvé tegye a második pKa-érték megbízható meghatározását. Ezt alátámasztja az adatok illesztése egy-disszociációs modellre, ami majdnem azonos pKa-értéket adott (pKa 7,13±0,03), összehasonlítva az adatok két-disszociációs kinetikai modellre történõ illesztésével. Ez arra utal, hogy a két pKa-érték eléggé eltérõ.
15
20
25
30
35
40
45 pH-stabilitás A glutaminil-ciklázok stabilitását a növényi és állati enzimek inkubálásával vizsgáltuk 30 °C¹on 30 percen keresztül különbözõ pH¹értékeken pH=4 és 10 között. Azután meghatároztuk a QC¹aktivitást szokásos körülmények között. Az eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be. A papaya latexbõl származó QC stabil volt a vizsgált pH¹tartományban, nyilvánvaló instabilitási trend nélkül a savas vagy bázikus tartományban. Ezzel szemben a humán QC csak a 7 és 8,5 közötti pH¹tartományban mutatott összehasonlítható stabilitást, és rendkívüli instabilitást mutatott 8,5 fölött és pH=6 alatt. Ily módon a pH=8 körüli régió tûnik optimálisnak a növény és humán QC¹aktivitása és stabilitása szempont-
2
50
55
5. példa: A QC szubsztrát-specifitásának meghatározása Spektrofotometriás vizsgálati eljárás A folyamatos spektrofotometriás vizsgálati eljárást a 2. példában ismertetett módon hajtottuk végre. Ennek megfelelõen a QC¹aktivitást a 340 nm¹en mért abszorbancia csökkenése tükrözi, amit az ammónia felszabadulása és a NADH/H+ azt követõ elfogyasztása okoz a glutamát a¹ketoglutársavból történõ kialakulása miatt. Amint az 1. ábrán bemutatjuk, lineáris görbéket vettünk fel, és lineáris összefüggés volt a mért aktivitás és a QC koncentrációja között. Ezenkívül a H¹GlnGln¹OH esetére a folyamatos vizsgálati eljárással kapott kinetikai paraméterek bemutatása (1. táblázat) jól megegyezett a szakaszos eljárás alkalmazásával kapottakkal (KM=175±18 mM, kcat=21,3±0,6 s–1). Emellett a H¹Gln-Ala¹OH, H¹Gln-Glu¹OH, H¹Gln-Gln¹OH, H¹GlnOtBu és H¹Gln-NH2 szubsztrátok papaya QC általi átalakításának 1. táblázatban bemutatott kinetikai paraméterei jó egyezésben vannak a pH=8,8¹on és 37 °C¹on a közvetlen eljárással meghatározottakkal (Gololobov, M. Y. és munkatársai, 1996 Biol Chem Hoppw Seyler 377, 395–398. oldal). Ily módon teljesen nyilvánvaló, hogy az új folyamatos vizsgálati eljárás megbízható eredményeket produkál. Di¹, tri- és dipeptidhelyettesítõk A fenti ismertetett új folyamatos vizsgálati eljárás alkalmazásával körülbelül 30 vegyületet teszteltünk a C. papayából és emberbõl származó QC potenciális szubsztrátjaként. Az eredményeket az 5. táblázatban mutatjuk be. A specifitások összehasonlításával kimutattuk, hogy majdnem az összes rövid peptid szubsztrátot hatékonyabban alakította át a papaya QC, összehasonlítva a humán enzimmel. Érdekes módon a második pozícióban nagy hidrofób oldalláncokat tartalmazó szubsztrátok mindkét enzim esetében a leghatásosabbak, amint azt a H¹Gln-Tyr-Ala¹OH, H¹Gln-Phe-AlaNH2 és H¹Gln-Trp-Ala-NH2 specifitása mutatja, összehasonlítva a többi tripeptidekével vagy a H¹Gln-AMC, H¹Gln-PNA és H¹Gln-Tyr¹OH kromogén szubsztrátok reaktivitásával, összehasonlítva a dipeptid szubsztrátokkal. A papaya QC esetében ez a felismerés megegyezett a korábbi eredményekkel, amelyek azt mutatták, hogy a specifitás korrelál a második aminosav oldallánc méretével (Gololobov, M. Y. és munkatársai, 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377, 395–398. oldal). Az egyetlen szembeszökõ különbséget a növényi és állati QC specifitásában a H¹Gln-OtBu esetében figyeltük meg. Míg az észtert a papaya QC hasonló specifitással alakította át a dipeptid szubsztrátokkal összehasonlítva, a humán QC egy nagyságrenddel lassabban alakította azt át.
Oligopeptidek A több dipeptid és tripeptid mellett számos oligo60 peptidet teszteltünk papaya és humán QC¹vel átalakít25
1
HU 008 343 T2
va (5. táblázat). Érdekes módon az általános különbség a humán és növényi QC tetrapeptidek készlete iránti specifitása között nem volt olyan nagy, mint amit a dipeptid és tripeptid szubsztrátokra megfigyeltünk. Ez arra utal, hogy a harmadik és és negyedik pozícióban található aminosavak még mindig befolyásolják különösen a humán QC kinetikai viselkedését. Kivételt alkotnak azonban azok a peptidek, amelyekben prolin oldallánc van a második aminosavpozícióban, ami megfigyelhetõen csökkentett kcat/KM-értékeket mutat a H¹Gln-X aa -Tyr-Phe-NH 2 szerkezetû tetrapeptidek készletében (5. táblázat). A specifitás csökkenése kife-
2
jezettebb volt a humán QC esetében, megközelítõleg 8¹szoros különbséghez vezetve kcat/KM-értékben a papaya QC¹hez hasonlítva. A humán QC kissé csökkent specifitását figyeltük 5 meg a pozitívan töltött C¹terminális glutamint tartalmazó szubsztrátok esetében, amint azt a H¹Gln-Arg-TyrPhe-NH2, H¹Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2 és H¹Gln-Lys-ArgLeu-NH2 specifitása mutatja, összehasonlítva többi tetrapeptiddel. Úgy látszik, hogy a csökkent specifitás 10 fõleg a kisebb átalakítási ciklusszámnak tulajdonítható. Ez a hatás nem volt meg a növényi enzim esetében.
5. táblázat A humán és Papaya QC peptidszubsztrátjainak kinetikai elemzése (n.r., nrexogén molekulák reagál; n.i., nincs gátlás; n.d., nem határoztuk meg; *, szubsztrát gátlás) Szubsztrát
Humán QC
Papaya QC
KM (mM)
kcat (s– 1)
K i* (mM)
kcat/Kag (mM–1 s–1)
KM (mM)
kcat (s–1)
Ki* (mM)
kcat/KM (mM–1 s–1)
n.r.
n.r.
n.d.
n.r.
n.d.
n.d.
n.d.
0,23±0,1
H-Gln-AMC
54±2
5,3±0,1
n.d.
98±2
42±1
39,4±0,4
n.d.
938±13
H-Gln-PNA
70±3
20,6±0,5
1,21 ±0,07
294±6
38±3
51,4±1,4
1,20±0,08
1353±70
H-Gln-OtBu
1235±74
6,7±0,2
n.i.
5,4±0,2
223±9
49,4±0,6
n.i.
222±6
H-Gln-NH2
409±40
12,8±0,5
n.i.
31±2
433±13
44,8±0,4
n.i.
103±2
H-Gln-Gly-OH
247±10
13,2±0,2
n.i.
53±1
641±20
45,8±0,4
n.i.
71±2
H-Gln-Ala-OH
232±5
57,2±0,4
n.i.
247±4
158±8
69,8±1,0
n.i.
442±16
H-Gln-Gln-OH
148±5
20,7±0,2
n.i.
140±2
44±3
43,2±0,7
n.i.
982±51
H-Gln-Glu-OH
359±10
24,7±0,2
n.i.
58±1
106±5
50,3±0,6
n.i.
475±17
H-Gln-Val-OH
196±5
17,2±0,1
n.i.
88±2
n.d.
n.d.
n.i.
n.d.
H-Gln-Tyr-OH
211±5
94±1
n.i.
446±6
n.d.
n.d.
n.i.
n.d.
H-Gln-Glu-TyrNH2
79±2
45,1±0,4
n.i.
524±8
103±4
53,6±0,7
n.i.
520±13
H-Gln-Gly-Pro-OH
130±5
25,3±0,2
n.i.
195±7
333±15
41,7±0,5
n.i.
125±4
H-Gln-Tyr-Ala-OH
101±4
125±1
n.i.
930±27
63±3
104,0±1,0
n.i.
1650±63
H-Gln-Phe-Ala-NH2
69±3
109±1
n.i.
1811±64
111±5
132,1±0,6
n.i.
1190±48
H-Gln-Trp-Ala-NH2
50±2
47,0±0,7
n.i.
940±24
78±5
151,8±2,6
n.i.
1946±91
H-Gln-Arg-Gly-Ile-NH2
143±4
33,5±0,4
n.i.
234±4
123±10
49,2±1,7
n.i.
400±19
H-Gln-Asn-Gly-Ile-NH2
172±5
56,6±0,5
n.i.
329±7
153±9
51,4±0,9
n.i.
336±14
H-Gln-Ser-Tyr-Phe-NH2
55±3
52,8±0,8
n.i.
960±38
135±6
64,9±1,0
n.i.
481±14
H-Gln-Arp-Tyr-Phe-NH2
55±2
29,6±0,3
n.i.
538±14
124±6
48,9±0,7
n.i.
394±13
H-Gln-Pro-Tyr-Phe-NH2
1889±152
31,7±1,2
n.i.
17±1
149±14
18,8±0,6
n.i.
126±8
H-Gln-His-Tyr-Phe-NH2
68±3
55,4±0,7
n.i.
815±26
92±7
75,9±1,4
n.i.
825±48
H-Gln-Gln-Tyr-Phe-NH2
41±2
41,4±0,4
n.i.
1010±40
45±2
52,9±0,7
n.i.
1176±37
H-Gln-Glu-Tyr-Pho-NH2
47±4
46±1
n.i.
979±62
100±4
54,6±0,6
n.i.
546±16
H-Gln-Glu-Ala-Ala-NH2
77±4
46±1
n.i.
597±18
102±4
53,7±0,6
n.i.
526±15
H-Gln-Glu-Tyr-Ala-NH2
69±2
42,1±0,4
n.i.
610±12
1113±5
44,7±0,5
n.i.
396±13
H-Gln-Glu-Ala-Phe-NH2
39±3
39±1
n.i.
1000±51
81±3
48,5±0,45
n.i.
599±17
H-Gln-OH
26
1
HU 008 343 T2
2
5. táblázat (folytatás) Szubsztrát
Humán QC
Papaya QC
KM (mM)
kcat (s– 1)
K i* (mM)
kcat/Kag (mM–1 s–1)
KM (mM)
kcat (s–1)
Ki* (mM)
kcat/KM (mM–1 s–1)
H-Gln-Glu-Asp-Leu-NH2
55±2
45,8±0,5
n.i.
833±21
107±6
58,5±0,4
n.i.
547±27
H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2
54±3
33,4±0,5
n.i.
619±25
118±6
48,2±0,8
n.i.
408±14
A tetrapeptidekkel kapott eredmények egy másik következtetést is eredményeznek. Amint már rámutattunk, a papaya QC magasabb szelektivitást mutatott a dipeptidekre. Azonban némely tetrapeptid esetében magasabb specifitási állandót figyeltünk meg a humán QC¹re, amint azt a 4. ábrán bemutatjuk, amely az 5. táblázatban megadott adatokat ábrázoló grafikont mutat, a második aminosavpozícióban glutamátot tartalmazó peptidek készletére. Ezenkívül amint a lánchossz növekszik di®tetrapeptid irányban, a humán QC szelektivitása növekszik, ellentétben a papaya QC¹re kapott eredményekkel. Emellett a legmagasabb szelektivitást a humán QC esetében a 3. és 4. aminosavpozícióban nagyméretû hidrofób oldalláncokat tartalmazó peptidek esetében rögzítettük, amely az enzimmel való hidrofób kölcsönhatásra utal. A megfelelõ peptidek kinetikai paramétereinek összehasonlításával a változások láthatóan az alacsonyabb KM-értékek miatt vannak, a peptidek átalakítási ciklusszámát ha-
15
20
25
30
sonlónak találtuk. Ily módon a humán QC hosszabb peptidek iránti nagyobb szelektivitását a hidrofóbabb szubsztrátok enzimhez való szorosabb kötõdése eredményének tekintjük. A humán és papaya QC között a 3. és 4. pozícióban hidrofób aminosavakat tartalmazó peptidek esetén megfigyelt különbségek nyilvánvalóak az enzimek H¹Gln-Arg-Gly-Ile-NH 2 és H¹Gln-Arg-Tyr-Phe-NH 2 vagy H¹Gln-Gln¹OH és H¹Gln-Gln-Tyr-Phe¹OH iránti specifitási állandóinak összehasonlításával is. A humán QC¹t szelektívebbnek találtuk N¹terminális Gln¹t és növekvõ számú C¹terminális Ala oldalláncot tartalmazó homológ szubsztrátokra is (6. táblázat). Míg a humán QC szelektivitása növekedett a szubsztrát hosszúságával, nem volt ilyen trend a papaya QC¹vel. Mivel a humán QC kevésbé volt specifikus a szekvenciában Ser oldalláncot tartalmazó peptidre, az oldallánc természete is fontosnak tûnik (6. táblázat).
6. táblázat A szubsztrát hosszának hatása a humán és papaya QC¹aktivitására Szubsztrát
Humán QC
Papaya QC
KM (mM)
Kcat (s–1)
kcat/KM (mM–1 s–1)
KM (mM)
kcat (s–1)
kcat/KM (mM–1 s–1)
H-Gln-Ala-NH2
155±9
40,1±0,9
259±9
212±21
628±3,0
298±5
H-Gln-Ala-Ala-NH2
87±3
76,3±0,7
877±22
164±6
83,2±1,0
507±12
H-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-NH2
65±3
60,5±0,7
1174±43
197±8
74,6±1,0
379±10
H-Gln-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-NH2
79±6
55,3±1,6
700±33
216±6
78,5±1,0
363±5
Az ionerõsség hatása a katalízis erõsségére Egy másik paraméter amelyet vizsgáltunk a 50 szubsztrát-specifítás befolyásolásának vonatkozásában az ionerõsség. Ebbõl a célból meghatároztuk számos szubsztrát ciklizálásnak kinetikai paramétereit 0,5 M KCI jelenlétében és hiányában (7. táblázat). Meglepõ módon a töltés nélküli gerincû szubsztrátok 55 iránti szelektivitás nem változott szignifikáns mértékben a só hozzáadásával a papaya latexbõl származó QC és a humán QC esetében. A humán QC H¹GlnAla¹OH és H¹Gln-Glu¹OH iránti specifitási állandója csökkent a KCI hozzáadásával. Amint az egyedi kine- 60 27
tikai paraméterek mutatják, ez a hatás a növekvõ KM és a kissé csökkenõ kcat-érték miatt volt. A papaya QC esetében nem detektáltunk hatást az egyik paraméterre sem. A hatás önmagában nem látszódott a negatívan töltött szubsztrát miattinak, mivel a változatlan paramétereket találtunk a negatívan töltött H¹Gln-Glu-Asp-Leu-NH2 peptidre. A só hozzáadásának egy érdekes hatását találtuk a pozitívan töltött H¹Gln-Arg-Gly-Ile-NH 2 és H¹Gln-Lys-Arg-Leu-NH 2 szubsztrátok esetében. A növényi és humán QC esetében a katalízisre gyakorolt pozitív hatást fõleg a kisebb KM-értéknek és a kissé nagyobb átalakítási számnak tulajdonítottuk.
Human QC
Papaya QC
28 31±1 29,4±0,5 48,6±0,5
0,051±0,003
0,080±0,002
H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2
H-Gln-Glu-Asp-Leu-NH2
21,4±0,3
0,166±0,013
0,373±0,015
H-Gln-Glu-OH
54,4±0,5
H-Gln-Arg-Gly-Ile-NH2
0,289±0,007
H-Gln-Ala-OH
21,7±0,5
50,8±0,8
0,076±0,004
H-Gln-bNA
12,8±0,3
0,054±0,003
0,442±0,030
H-Gln-NH2
481±18
493±22
499±26
1747±73
459±18
509±19
1356±50
100±3
Kcat/kM (mM–1 s–1)
777±18
577±24
187±9
941±41
57±2
202±3
285±8
29±1
0,05 M Tris-HCl, pH=8,0
52,4±0,7
H-Gln-Trp-Ala-NH2
0,109±0,005
50±1
0,102±0,007
H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2
H-Gln-Glu-Asp-Leu-NH2
52,9±1,2
0,106±0,008
45,0±0,5
H-Gln·Arg-Gly·Ile-NH2
0,098±0,005
H-Gln-GluOH
69,7±9
138±3
0,137±0,007
H-Gln-Ala-OH
48,8±1,0
0,079±0,005
0,036±0,002
H-Gln-bNA
43,4±0,4
kcat (s– 1)
0,05 M Tricine-NaOH, pH=8,0
H-Gln-Trp-Ala-NH2
0,434±0,015
KM (mM)
H-Gln·NH2
Szubsztrát
n.l.
n.l.
n.l.
n.l.
n.l.
n.l.
1,39±0,08
n.l.
n.l.
n.l.
n.l.
n.l.
n.l.
n.l.
1,14±0,05
n.l.
Ki (mM)
0,061±0,002
0,034±0,001
0,091±0,005
0,056±0,002
0,607±0,036
0,357±0,012
0,063±0,003
0,401±0,014
0,094±0,003
0,053±0,002
0,065±0,005
0,072±0,004
0,094±0,003
0,143±0,005
0,032±0,002
0,446±0,010
KM (mM)
7. táblázat Az ionerõsség hatása a humán és papaya QC katalízisre
570±13
1096±28
745±42
1847±61
472±12
480±12
1478±70
101±2
kcat/kM (mM–1 s–1)
45,8±0,5
31,6±0,3
29,8±0,5
50,0±0,4
18,9±0,5
47,6±0,6
20,0±0,4
12,2±0,1
748±16
929±19
327±12
893±25
31±1
133±3
318±9
30±1
0,05 M Tris-HCl pH=8,0, 0,5 M KCI
53,6±0,5
58,1±0,7
48,4±1,0
133±3
44,4±0,3
68,1±0,6
47,2±0,8
45,2±0,3
Kcat (s–1)
0,05 M Tricine-NaOH, pH=8,0, 0,5 M KCI
n.l.
n.l.
n.l.
n.l.
n.l.
n.l.
0,97±0,04
n.l.
n.l.
n.l.
n.l.
n.l.
n.l.
n.l.
1,33±0,07
n.l.
Ki (mM)
HU 008 343 T2
1
HU 008 343 T2
Fiziológiás szubsztrátok Korábbi vizsgálatokban a [Gln1]-TRH és [Gln1]GnRH QC általi átalakítását kimutatták a szarvasmarha és sertés hipofízisébõl származó QC esetében (Busby, W. H. J. és munkatársai, 1987 J Biol Chem 262, 8532–8536. oldal; Fischer, W. H. és Spiess, J., 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 3628–3632. oldal). Ezen már megvizsgált hipofízis hormonok mellett megszintetizáltuk a humán QC három potenciális fiziológiás szubsztrátját és teszteltük az átalakításukat, nevezetesen a [Gln1]gasztrint, [Gln1]eurotenzint és [Gln1]FPP¹t. Az átalakításuk kinetikai paramétereit az 1. táblázatban soroljuk fel. Érdekes módon a glutaminil-peptidek a méretüktõl függõen növekvõ specifitási állandóval alakulnak át a megfelelõ piroglutamil peptidekké, azaz az elsõ a 17 aminosav méretû legnagyobb progasztrin, majd azt követi a proneurotenzin, pro-GnRH, pro-TRH és pro-FPP. Ezek a felismerések egybevágnak a szintetikus peptidekre kapott adatokkal. Meglepõ módon a hosszabb szubsztrátokat is nagyobb szelektivitással alakítja át a növényi enzim, amely eredmény ellentétben áll a rövidebb oligopeptidekkel kapott eredményekkel. Lehetséges, hogy másodlagos kötési kölcsönhatások vannak a szubsztrát és az enzim között távolabb az aktív helytõl. Módosított aminosavakat tartalmazó peptidek A QC¹k specifitásának és szelektivitásának további vizsgálata érdekében módosított N¹terminális glutaminil-oldalláncot vagy második pozícióban módosított aminosavat tartalmazó peptideket szintetizáltunk. Ezen peptidek átalakítását minõségileg vizsgáltuk MALDITOF tömegspektrográfia alkalmazásával (lásd még a 3. példát). A glutaminil-oldallánc vagy analógja ciklizációja miatt a szubsztrát és a katalízis termékének tömegkülönbségét detektáljuk. A szubsztrát móljaiként egy mól ammónia felszabadulása esetében az átalakulást mennyiségileg is elemeztük a spektrofotometriás vizsgálati eljárás alkalmazásával. H-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-Ala-NH2. Ez az N¹terminális elágazó peptid – amely két glutaminil-oldalláncot tartalmaz az N¹terminálison, amelyek liziloldallánchoz vannak kapcsolva peptid és részleges izopeptid kötésen keresztül – látszólag azonos módon alakult át a humán (5. ábra) és papaya QC (nem mutatjuk) által. Mindkét glutaminil-oldallánc átalakult piroglutaminsavvá, bármilyen detektálható preferencia nélkül az egyik oldallánc irányában, amit a konzisztens szubsztrátátalakulás jelzett (5. ábra). Ily módon a QC¹k szelektivitása a különbözõen kötött glutaminil-oldalláncok iránt alapvetõen nem különbözik. H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2. A metilált glutaminil-oldalláncot csak a papaya QC alakította át piroglutaminil-oldallánccá (6. ábra). Emellett nem detektáltuk a humán QC peptid általi gátlását, ami arra utal, hogy a metilált oldalláncot nem ismeri fel a humán QC. H-Glu(OMe)-bNA és H¹Glu-bNA. Ezen vegyületek egyikét sem alakította át a papaya vagy humán QC. Ezeket a fluorogén szubsztrátokat fluorometriásan elemeztük, piroglutamil-aminopeptidáz segédenzimként
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2
történõ alkalmazásával. Az O¹metilált glutamátoldallánc azonban figyelemre méltó instabilitást mutatott Tris és Tricin pufferben egyaránt, nem enzimatikusan katalizált ciklizációra hajlamosan. Ezenkívül egyik QC H¹Gln-AMC szubsztráton való aktivitását sem gátolták a hosszabb H¹Glu(OMe)-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2 vagy H¹Glu-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2 peptidek, ami arra utal, hogy a glutaminsav-oldalláncot vagy ¹származékát nem ismeri fel egyik QC forma sem. Ezenkívül az eredmények arra is utalnak, hogy a glutaminsav oldallánc negatív töltése az oka a peptidnek az aktív helyrõl való kilökõdésének. H-Gln-ciklo(Ne-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe. A H-Glnciklo(Ne-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe), – amely intramolekuláris részleges izopeptid kötést tartalmaz – átalakítását mennyiségileg elemeztük, ami 240±14 mM és 133±5 mM KM-értékeket eredményezett a humán és papaya QC¹re. A papaya QC általi magasabb átalakítási szám (49,4±0,6 s –1 ) miatt a humán QC¹vel (22,8±0,6 s –1 ) összehasonlítva a növényi enzim 372±9 mM–1 min–1 értéket mutat, ami megközelítõleg 4¹szer magasabb kcat/KM-érték, mint a humán QC¹é. Ily módon a specifitási állandó a papaya QC esetében csak kissé kisebb a hasonló méretû szubsztrátokkal összehasonlítva, mint például H¹Gln-Ala-Ala-Ser-AlaAla-NH 2 . A humán QC k cat /K M -értékét azonban 95±3 mM–1s–1-nek, megközelítõleg egy nagyságrenddel kisebbnek találtuk a hasonló méretû szubsztrátokkal összehasonlítva (5. táblázat). H-bhomoGln-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2. A N¹terminális b¹homoglutaminil-oldallánc öttagú laktámgyûrûvé alakult át a humán és papaya QC általi katalízis által. Az ammónia együtt járó felszabadulását spektrofotometriásan és MALDI-tof¹al elemeztük, amint fent ismertettük. Nem detektáltuk ammónia felszabadulását, amikor a QC¹t kihagytuk vagy felforraltuk, ami a ciklizáció specifikus katalízisére utal. Érdekes módon a C. papayából származó QC (K M =3,1±0,3 mM, kcat=4,0±0,4 s–1) és humán QC (KM=2,5±0,2 mM, kcat=3,5±0,1 s–1) ezen peptid átalakulását majdnem azonos k cat /K M -értékekkel katalizálja (1,4±0,1 és 1,3±0,1 mN–1s–1). Ily módon a b¹homoglutaminoldallánc ciklizációja megközelítõleg 1000-szer csökkent hatékonysággal katalizált a hasonló méretû, az N¹terminálisukon glutaminil-oldalláncot tartalmazó peptidekhez hasonlítva. Ez azt mutatja, hogy a szubsztrát a¹szénatomja fontos a QC formák általi szubsztrát felismeréshez, de nem esszenciális. A szubsztrát létezésének esszenciális feltétel a g¹amidcsoport és protonálatlan N¹terminális aminocsoport megléte a ciklizációhoz megfelelõ távolságban és szögben, amely feltételeknek az N¹terminális glutaminil és b¹homo-glutaminiloldalláncok eleget tesznek.
6. példa: A QC szubsztrátok szintézise Oligopeptidek. A peptideket szemiautomatikusan szintetizáltuk 0,5 mmol léptékben peptidszintetizátor (Labortec SP650, Bachem, Switzerland) alkalmazásával, amint korábban ismertették (Schilling, S. és mun60 katársai, 2002 Biochemistry 41, 10 849–10 857. oldal). 55
29
1
HU 008 343 T2
A hosszabb peptideket 25 mmol léptékben szintetizáltuk meg az automatizált Symphony peptidszintetizátor (Rainin Instrument Co.) alkalmazásával, amint ismertették (Manhart, S. és munkatársai, 2003 Biochemistry 42, 3081–3088. oldal). Az összes peptidkapcsoláshoz a módosított szilárd fázisú peptidszintézis Fmocprotokollját alkalmaztuk 2¹(1H-benzotriazol-1¹il)1,1,3,3,¹tetrametil-urónium-tetrafluoroborát (TBTU; Novabiochem)/bázis (diizopropil-etil-amin vagy N¹metilmorfolin; Merck) alkalmazásával, vagy nehéz kapcsolások esetében N¹[(dimetil-amino)-1H-1,2,3,¹triazolo[4,5¹b]piridin-1-il-metilén]-N¹metil-metán-ammóniumhexafluoro-foszfát N¹oxid (4,5) (HATU; Applied Biosystems)/diizopropil-etil-amin kapcsolóreagenst alkalmazunk. A rezinrõl trifluor-ecetsavat (TFA; Merck) tartalmazó koktéllal történõ lehasítás után a nyers peptideket preparatív HPLC-vel tisztítottuk meg savmentes oldószerekben, annak érdekében, hogy elkerüljük az N¹terminális glutamin további ciklizációját. A preparatív HPLC¹t acetonitril (Merck) vízben készített (5–40% vagy 65% acetonitril 40 perc alatt) lineáris gradiensével végeztük 250–21 Luna RP18 oszlopon (Phenomenex). A peptid tisztaságának és azonosságának igazolására analitikai HPLC¹t és ESI-MS¹t alkalmaztunk. Glu(NH¹NH2)-Ser-Pro-Thr-Ala-NH2. A lineáris prekurzor peptidet (Fmoc-Glu-Ser-Pro-Thr-Ala-NH2) standard Fmoc-eljárások szerint szintetizáltuk meg (Schilling, S. és munkatársai, 2002 Biochemistry 41, 10849–10857. oldal) Rink-amid MBHA gyantán (Novabiochem). Az Fmoc-védett peptid gyantáról történõ lehasítása után a peptidet kicsaptuk dietil-éterrel (Merck), leszûrtük és megszárítottuk. HMBA–AM gyantát (1,16 mmol/g, Novabiochem) alkalmaztunk a prekurzor peptid glutaminsav g¹karbonsav csoportjának (3 eq.) diklór-metánban (DCM, Merck) történõ kapcsolására. Diciklohexil-karbodiimidet (DCC, Serva) (4 eq.) és dimetil-amino-piridint (DMAP, Aldrich) (0,1 eq) alkalmaztunk kapcsoló reagensként. 12 óra elteltével a gyantát leszûrtük, megmostuk DCM¹mel és a reakciót megismételtük. Az N¹terminális Fmoc-csoport 20% piperidin DMF-ben (3×5 perc) való alkalmazásával történõ deprotektálása után a peptidgyantát 5% hidrazinoldattal (20 ml/g) kezeltük 1,5 órán keresztül. A gyantát leszûrtük, megmostuk dimetil-formamiddal (DMF, Roth, Germany) és TFA-val. Bepárlást követõen a nyers peptidet kicsaptuk éterrel, ami 76% kitermelést adott. H-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-Ala-NH2. A lineáris peptidet standard Fmoc/Bu eljárás szerint szintetizáltuk meg Rink-amid MBHA¹n (Schilling, S. és munkatársai, 2002 Biochemistry 41, 10849–10857. oldal) FmocLys(Fmoc)¹OH alkalmazásával utolsó elõtti aminosavkapcsolásként. A lizin két amino-védõcsoportjának 20% piperidinnel (Merck) DMF-ben (4 eq.) történõ deprotektálása után Fmoc-Gln(Trt)¹OH kapcsoltunk. A szokásos hasítási eljárás 95% kitermelést eredményezett. H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2. Fmoc-Gln(NMe)OH¹t szintetizáltunk Fmoc-MI¹AM (Novabiochem) gyantára töltött Fmoc-Glu-OtBu-ból kiindulva. A DCM¹el történõ duzzasztás után a gyantát (0,5 g) megmostuk
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
DMF¹el és deprotektáltuk 20% piperidin DMF¹es oldatával. A gyantára 5 ml DMF¹et és 5 eq. Fmoc-Glu-OtBu¹t, 5 eq. HATU¹t és 10 eq. DIPEA¹t adtunk, és azután 6 órán keresztül rázattuk. Szûrés és mosás után a terméket standard TFA hasítási körülményekkel hasítottuk le. A H¹Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2 peptidet ismert eljárással szintetizáltuk meg (Schilling, S. és munkatársai, 2002 Biochemistry 41, 10849–10857. oldal). FmocGln(NMe)-OH¹t kapcsoltunk HATU/DIPEA-val éjszakán keresztül. Standard hasítási eljárás 78% nyers peptidet eredményezett. H-Glu(OMe)-b-naftilamid, H¹Gln-Val¹OH, H¹GlnTyr¹OH. Boc-védett dipeptideket szintetizáltunk standard kevert anhidrideljárás alkalmazásával izobutilklórkarbonát (Merck) alkalmazásával. A C¹terminális Boc-Gln-Tyr-OMe és Boc-Gln-Val-OMe metilésztereket 1 N NaOH-val szappanosítottuk el dioxánban. A Boc-védett peptideket HCl/dioxán oldattal deprotektáltuk 10 percen keresztül. Bepárlás után a maradékot kristályosítottuk számos oldószerbõl, ami 60–70% szilárd vegyületet eredményezett. H-Gln-ciklo(Ns-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe). A BocGln(Trt)-Lys-Arg(Pmc)-Ala-Gly-Phe¹OH lineáris prekurzort savérzékeny 2¹klórtritil gyantán szintetizáltuk meg. A kapcsolást standard Fmoc/Bu protokoll szerint hajtottuk végre Fmoc-Lys(Mtt)¹OH alkalmazásával. A 3% TFA DCM¹es oldatával végzett hasítás után (10-szer 5 perc), az oldatot semlegesítettük 10% piridinnel (Merck) metanolban (MeOH; Merck), megmostuk 3¹szor DCM¹el és MeOH-val, bepároltuk 5% térfogatra és a nyers peptidet kicsaptuk jéghideg vízzel. Azt követõen a nyers peptidet ciklizáltuk DCC/N¹hidroxi-benzotriazol (HOBt; Aldrich) aktiválás alkalmazásával. A nyers peptidet feloldottuk száraz diklór-metánban (0,2 mmol/50 ml), 0,2 mmol N¹metil-morfolint és 0,4 mmol 1¹hidroxibenzotriazolt adtunk hozzá. Ezt az oldatot cseppenként hozzáadtuk 0,4 mmol diciklohexilkarbodiimid 250 ml diklór-metános oldatához 0 °C¹on. A reakciót éjszakán keresztüli kevertetéssel fejeztük be szobahõmérsékleten. A N,N’-diciklohexilurea leszûrése után az oldószert bepárlással távolítottuk el. A maradékot feloldottuk etil-acetátban és többször megmostuk 1 N HCl-dal, NaHCO3 telített oldatával és vízzel. Az oldatot megszárítottuk vízmentes Na2SO4¹on, leszûrtük és szárazra bepároltuk vákuumban.
7. példa: QC effektorainak jellemzése Imidazolszármazékok Az 5 tagú gyûrû különbözõ pozícióiban szubszti50 tuenseket hordozó imidazol- és benzimidazolszármazékokat teszteltünk QC inhibitoraiként (3. táblázat). A számozási szabályok az imidazolgyûrûre vonatkoznak. Az alkalmazott eljárásokat a 2. példában ismertetjük. C-4(5) és C-4,5 származékok. Az imidazol 4. vagy 55 5. pozíciójában lévõ természetüknél fogva ekvivalens vagy a mindkét pozícióban szubsztitúciót hordozó vegyületek csökkent hatásosságot mutattak a humán QC gátlására. Az egyetlen kivétel azonban N¹w-acetilált 60 hisztamint tartalmazott, ami az egyik leghatásosabb in30
1
HU 008 343 T2
hibitor vegyületnek bizonyult. Kis szubsztituensek ezekben a pozíciókban csak kis hatással voltak a kötésre, amit az 5¹hidroxi-metil-4-metil-imidazol imidazolhoz hasonló gátlási állandója mutatott. Az ezekre a helyekre kapcsolt nagyobb és kiterjedtebb csoportok csökkentették vagy megszüntették a vegyület enzim általi kötését. A többi tesztelt szubsztituens némelyike ismert módon negatív indukáló vagy mezomorf hatást fejt ki, amelyek képesek csökkenteni az imidazolgyûrû elektronsûrûségét, ami szintén hozzájárul a gyengébb kötési tulajdonságokhoz. Az L¹hisztidin és hisztidinamid Ki-értékének a különbsége a töltés kötésre gyakorolt hatására is utal. A töltött szubsztrátok elektrosztatikus taszításának bizonyítékát már kimutatták szubsztrátspecifitási vizsgálatokban, azaz a glutaminamid könnyen átalakult termékekké humán QC által, de nem figyeltek meg reaktivitást szabad glutamin szubsztráttal. C¹2 származékok. Az összes tesztelt származék gyengébben gátolta a QC¹t, mint az imidazol. A protonnál nagyobb bármilyen szubsztitúció zavarja a megfelelõ QC¹kötést. Csak a 2¹metil-benzimidazolban lévõ metilcsoport miatt körülbelül egy nagyságrenddel csökken a gátlási állandó. Nagyon hasonló összefüggést mutattunk ki a benzimidazol és 2¹amino-benzimidazol Ki-értékeinek összehasonlításával. Ezenkívül az eredmények arra utalnak, hogy a hatás nem függ az elektronváltozásoktól. N¹1 származékok. A humán QC gátlására tesztelt imidazolszármazékok között a legtöbb, imidazolhoz hasonlítva javított Ki-értékû vegyület egy nitrogénatom megváltoztatását mutatta. Ezen vegyületek közé tartozott az egyik leghatásosabb QC inhibitor, az 1¹benzilimidazol. Érdekes, hogy ezen szerkezetnek csak kis megváltoztatása az inhibitor tulajdonság elvesztését eredményezte, amint azt az 1¹benzoilimidazol és fenilimidazol esetében látjuk, amelyek inaktívak a kísérleti körülmények között. Továbbá ebben az esetben a megfigyelt változások látszólag nemcsak az imidazolgyûrûnek a fenolcsoport negatív mezomer hatása miatti csökkent elektronsûrûsége miatt vannak, hanem a terjedelmes trimetil-szilil-csoport miatt is, amely pozitív indukáló hatást mutat, ami csökkent kötést mutat a többi oldallánchoz képest. Érdekes, hogy ezen csoport egyik kevésbé hatásos vegyülete az 1¹amino-propilimidazol. Ezen vegyület kis hatékonyságát a bázikus aminocsoport okozza, mivel a szterikusan hasonló 1¹metil-imidazol és 1¹vinil-imidazol javított kötõdést mutatott az aktív helyhez. Ily módon a pozitívan töltött aminocsoport felel a kisebb Ki-értékért, amely eredménye egybevág az N¹w-acetilált hisztamin (3. táblázat) és hisztamin (4. táblázat) Ki-értékek összehasonlításával. A 3,4 és 3,5 származékoltatás hatása. Azokról az imidazolszármazékokról, amelyek szubsztituenseket tartalmaztak a 4(5) vagy mindkét pozícióban, kimutattuk, hogy korlátozott a hatékonyságuk az enzimhez való kötõdésre. A specifikus szubsztitúciók hatását L¹hisztamin és a hisztamin biológiai degradációja két köztitermékének, a 3¹metil-4-hisztamin és 3¹metil-5-
2
hisztamin (4. táblázat) gátlási állandójának összehasonlításával határoztuk meg. Az L¹hisztaminnak olyan Ki-értéke volt, amely körülbelül egy nagyságrenddel kisebb, az acetilált párjával összehasonlítva. Egy nitro5 gén metilálása jelentõs javulást eredményezett a 3¹metil-4-hisztaminok esetében. Azonban a 3¹metil-5hisztaminhoz vezetõ metilálás a gátlóaktivitás teljes elvesztését eredményezte. Ily módon a megfigyelt hatásokat látszólag fõként a kötés szterikus zavarása okoz10 ta a bázikus nitrogén melletti szénatom származékoltatása miatt. Feltehetõleg a bázikus nitrogén kulcsszerepet játszik az enzimhez való kötõdésben. 8. példa: Ab3–40/42 származékok kialakítása A méréseket az Ab-40/42, [Gln3]-Ab1–11 (szekvencia: DAQFRHDSGYE) és [Gln3]Ab3–11 – amely glutamint tartalmaz a harmadik pozícióban glutaminsav oldallánc helyett – két rövid N¹terminális peptid szekvenciájával hajtottuk végre. A két peptid DP¹IV általi hasí20 tását és az N¹terminális glutaminoldallánc QC általi ciklizációját MALDI-TOF tömegspektrometriával teszteltük. A méréseket tisztított DP¹IV (sertésvese) vagy QC forrásaként nyers sertés hipofízis homogenizátum alkalmazásával hajtottuk végre, valamint mindkét enzim25 mel egymást követõ katalízis esetében. 15
Eredmények 1. [Gln3]Ab3–11a kialakulása [Gln3]Ab1–11a-ból DP¹IV által katalizálva és annak megakadályozása Val-pirrolidid (Val-Pyrr) DP¹iV-inhibitorral 30 A DP¹IV vagy DP¹IV-szerû aktivitás hasítja a [Gln3]Ab1–11a¹t [Gln3]Ab3–11a kialakulása mellett (7. ábra). A 3. pozícióban található oldalláncot kiszabadítja ez a hasítás, és hozzáférhetõvé válik más enzi35 mek, mint például QC általi módosítás számára. Amint vártuk, a katalízis teljesen megakadályozható Val-Pyrr által (8. ábra). 2. [pGlu3]Ab3–11a kialakulása [Gln3]Ab3–11a-ból a hipofízis homogenizátumban található QC katalízissel és annak megakadályozása 1,10-fenantrolinnal A sertés hipofízisben található glutaminil-cikláz katalizálja a [Gln3]Ab3–11a átalakulását [pGlu3]Ab3–11a¹vá 45 (9. ábra). A [pGlu3]Ab3–11 kialakulását gátolta az 1,10fenantrolin hozzáadása (10. ábra). 40
3. DP¹IV és QC egymást követõ katalízise [pGlu3]Ab3–11a kialakulásában és annak megakadályozása Val-Pyrr és 1,10-fenantrolin 50 alkalmazásával A [pGlu3]Ab3–11a kialakulása [Gln3]Ab1–11a-ból végbemegy a DP¹IV és QC egymást követõ katalízise után, amint azt sertés hipofízis nyers homogenizátum 55 és hozzáadott sertésvese DP¹IV alkalmazásával mértük (11. ábra). Nem alakult ki [pGlu3]Ab3–11a, amikor az 1,10-fenantrolin QC¹inhibitort (12. ábra) vagy a ValPyrr DP¹IV-inhibitort (13. ábra) hozzáadtuk. A [pGlu3]Ab3–11a kismértékû megjelenése az amino60 peptidáz hasítás és a glutaminoldallánc azt követõ cik31
1
HU 008 343 T2
lizációjának az eredménye, amit a [Gln3]Ab2–11 a megjelenése is jelez. 4. [pGlu3]Ab3–11a kialakulása nyers hipofízis homogenizátumban aminopeptidáz(ok) általi katalízissel A [pGlu3]Ab3–11a DP¹IV katalízistõl független kialakulása miatt megvizsgáltuk a [Gln3]1–11a degradációját nyers hipofízis homogenizátumban DP¹IV hozzáadása nélkül (14. ábra). Amint vártuk a 4. szakaszban lévõ adatokból, [pGlu3]Ab3–11a kialakulását figyeltük meg. Az adatok azt mutatják, hogy [Gln3]Ab1–11a degradációját katalizálhat)a(k) aminopeptidáz(ok) is, ami [pGlu3]Ab3–11a¹t eredményez. Emiatt az eredmények azt mutatják, hogy a piroglutamil kialakulása az N¹terminális degradáció végpontja ebben a szövetben, ami tovább alátámasztja a QC szerepét a plakkok kialakulásában. 9. példa: [Gln3]Ab3–11a; 3–21a és 3–40 átalakítása rekombináns humán QC által Az összes tesztelt [Gln3]Ab eredetû peptidet hatékonyan átalakította a humán QC a megfelelõ piroglutamil formákká (8. táblázat). A [Gln 3 ]Ab3–21a és [Gln3]Ab3–40 vizes oldatban való rossz oldékonysága
5
10
15
20
25
2
a meghatározásokat 1% DMSO jelenlétében hajtottuk végre. A [Gln3]Ab3–11a jobb oldékonysága azonban lehetõvé tette a QC¹katalizált átalakítás kinetikai elemzését DMSO jelenlétében és hiányában (8. táblázat). Mindezt összevetve a 8, 18 és 37 aminosav lánchosszúságú Ab peptidek QC¹szubsztrátokként való vizsgálata (lásd a 8. táblázatot) megerõsítette azt a megfigyelést, hogy a humán QC¹aktivitás növekszik a szubsztrátok hosszúságával. Ennek megfelelõen a Gln1-gasztrin, Gln1-neurotenzin, Gln1-GnRH a legjobb QC¹szubsztrátok, figyelembe véve a specifitási állandókat. Hasonlóképpen a [Gln3]Ab3–40 és glukagon, az eddig vizsgált legnagyobb QC¹szubsztrátok nagy másodrendû sebességi állandót mutattak (rendre 449 mM–1s–1 és 526 mM–1s–1), még 1% DMSO jelenlétében is (8. táblázat). Érdekes, hogy a vizsgált amiloid peptidek kinetikai paraméterei nem változtak nagymértékben a növekvõ mérettel, ami az Ab C¹terminális részének csak közepes hatására utal a QC katalízisben. Tehát a jobb oldékonyság és kezelhetõség miatt a peptidek N¹terminális aminopeptidáz processzálását célzó további vizsgálatokat az Ab, [Gln 3 ]Ab1–11a, [Gln 3 ]Ab3–11a és Ab3–11a kisebb fragmenseinek alkalmazásával hajtottuk végre.
8. táblázat Az N¹terminális Gln-tartalmú peptidek rekombináns humán QC általi átalakításának kinetikai paraméterei 1% DMSO¹t tartalmazó pufferoldatban KM (mM)
kcat (s–1)
kcat/KM (mM–1 s–1)
[Gln3]Ab3–11a
87±3#
55±1#
632±10#
[Gln3]Ab3–1a
155±4
41,4±0,4
261±4
[Gln3]Ab3–21a
162±12
62±3
383±10
[Gln3]Ab3–40
89±10
40±2
449±28
Glukagon (3–29)
19±1
10,0±0,2
526±17
Peptid
40 10. példa: Ab3–11a és Ab3–21a átalakítása rekombináns humán QC által Az Ab3–11a és Ab3–21a inkubálása QC jelenlétében feltárta, hogy a korábbi munkákkal ellentétben a glutamáttartalmú peptidek is szolgálhatnak QC¹szubsztrátként (15C. és D. ábra). A [pGlu 3 ]Ab3–11a és 45 [pGlu 3 ]Ab3–21a QC¹katalizált kialakulását rendre pH=5,2¹n és 6,5¹n vizsgáltuk. Ha a benzimidazol QC¹inhibitort hozzáadtuk az oldathoz a vizsgálati eljárás QC hozzáadásával való elindítása elõtt, a [pGlu3]Ab3–11a¹t vagy [pGlu3]Ab3–21a¹t eredményezõ szubsztrát-átala- 50 kítás szuppresszált volt (15E. és F. ábra). Ha QC¹t megforraltuk a hozzáadás elõtt, a pGlu-peptidek keletkezés elhanyagolható volt (15A. és B. ábra). 55 11. példa: A Gln-bNA és Glu-bNA papaya QC¹katalizált ciklizációjának pH¹függése A papaya QC átalakította a Glu-bNA¹t maximum 2 mM¹ig terjedõ koncentrációtartományban (amelyet a szubsztrát oldódása limitált) Michaelis–Menten-kinetika 60 32
szerint (16. ábra). A Glu-bNA pH=6,1 és 8,5 közötti QC¹katalizált átalakulását a szubsztrátkoncentráció függvényében ábrázoló grafikonok szemrevételezése azt tárta fel, hogy ezen Glu-szubsztrát mindkét paramétere – KM és kcat – pH¹függõ módon változott (16. ábra). Ez ellentétben áll a korábban leírt QC¹katalizált glutaminciklizációval, ahol csak a KM változását figyelték meg az adott pH¹tartományban [Gololobov, M. Y., Song, I., Wang, W., és Bateman, R. C., (1994) Arch Biochem Biophys 309, 300–307. oldal]. Azt követõen a protonkoncentráció Glu- és Gln-ciklizáció alatti hatásának tanulmányozására megvizsgáltuk a Glu-bNA és Gln-bNA elsõrendû sebességi szabályok (azaz jóval a KM-érték alatti szubsztrátkoncentrációknál) közötti ciklizációjának pH¹függését (17. ábra). A glutamin ciklizációjának a pH¹optimuma pH=8,0, ellentétben a glutaminsav ciklizációjáéval, amely pH=6,0¹os pH¹optimumot mutatott. Míg a specifitási állandó a megfelelõ pH¹optimumokon eltér megközelítõleg 80 000-szeresen, a QC vs. EC¹aktivitás pH=6,0, körül csak körülbelül 8000.
1
HU 008 343 T2
A Gln-bNA-ból pH=6,0¹on vizsgált nem enzimatikus pGlu-keletkezést 4 héten keresztül követtük, és az 1,2*10–7 s–1 elsõrendû sebességi állandót mutatott. Azonban ugyanazon idõszak alatt nem keletkezett pGlu-bNA Glu-bNA-ból, ami az átalakulás 1,0*10–9 s–1 korlátozó sebességi állandójának meghatározását tette lehetõvé. 12. példa: Enzim inaktiválási/reaktiválási eljárások Humán QC aliquotját (0,1–0,5 mg, 1 mg/ml) inaktiváltuk éjszakán keresztül végzett dialízissel 3000-szeres feleslegben lévõ 5 mM 1,10-fenantrolint vagy 5 mM dipikolinsavat tartalmazó 0,05 M Bis-Tris/HCl, pH=6,8 pufferrel szemben. Azt követõen az inaktiválószert gondosan eltávolítottuk a minta dialízisével (3 ciklus, 2000-szeres felesleg) 0,05 M Bis-Tris/HCl, pH=6,8 pufferrel szemben, amely 1 mM EDTA¹t tartalmazott. A reaktiválási kísérleteket szobahõmérsékleten hajtottuk végre 15 percen keresztül Zn++, Mn++, Ni++, Ca++, K+ és Co++ ionokkal 1,0, 0,5, 0,25 mM koncentrációban 0,025 M Bis-Tris, pH=6,8 pufferben, amely 0,5 mM EDTA¹t tartalmazott. A QC¹aktivitási vizsgálati eljárásokat 0,05 M Tris/HCl, pH=8,0 pufferben hajtottuk végre, amely 2 mM EDTA¹t tartalmazott, annak érdekében, hogy elkerüljük a gyors reaktiválást a pufferoldatokban jelen lévõ fémionnyomok által. A sertés QC 1,10-fenantrolin általi gátlását már leírták (Busby, W. H. J. és munkatársai, 1987 J Biol Chem 262, 8532–8536. oldal, Bateman, R. C. J. és munkatársai, 2001 Biochemistry 40). Azonban az a tény, hogy az EDTA-ról kimutatták, hogy aktiváló hatása van a QC katalízisre, arra utalt, hogy a fenantrolin általi gátlás nem a fémkomplexálás miatt van (Busby, W. H. J. és munkatársai, 1987 J Biol Chem 262, 8532–8536. oldal, Bateman, R. C. J. és munkatársai, 2001 Biochemistry 40). Amellett, hogy gátolja az 1,10-fenantrolin, a humán QC¹katalizált szubsztrát-ciklizáció megszûnt dipikolinsav és 8¹hidroxiquinolin jelenlétében is, amelyek a metalloenzimek inhibitorai. Ezek a komplexképzõk kompetitíven és idõfüggõ módon gátolták a QC¹t, azaz a már kompetitíven gátolt kiindulási aktivitásról azt találtuk, hogy tovább csökkent a vegyületekkel való elnyújtott inkubáció után (18., 19. ábra). Érdekes, hogy az EDTA nem mutatott figyelemre méltó gátlást az inkubálás idejétõl függetlenül semmilyen körülmények között. A humán QC¹t teljesen majdnem inaktivált volt 5 mM 1,10-fenantrolin vagy 5 mM dipikolinsav elleni alapos dialízis után. Komplexképzõtõl mentes pufferrel szembeni ismételt éjszakán keresztüli dialízis után a QC¹aktivitás részlegesen reaktiválódott maximum 50–60%¹ra. Azonban amikor 1 mM EDTA¹t tartalmazó pufferekkel szemben dializáltuk, nem figyeltünk meg reaktivációt. A QC¹aktivitás akár dipikolinsavval, akár 1,10-fenantrolinnal történõ inaktiválás utáni közel teljes visszaállítását értük el, amikor a fehérjét 10 percen keresztül inkubáltuk 0,5 mM ZnSO4¹al 0,5 mM EDTA jelenlétében (20. ábra). A QC¹aktivitás részleges visszaállítását értük el Co++ és Mn++ ionok reaktivációra történõ alkalmazásával. Még 0,25 mM Zn++ jelenlétében is lehetséges volt az eredeti aktivitás 25%-ának a reak-
2
tiválása. Nem figyeltünk meg reaktiválást Ni++, Ca++ vagy K+ ionok alkalmazásával. Hasonlóképpen a teljesen aktív QC ezen ionokkal történõ inkubálásának nem volt hatása az enzim aktivitására. 5 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Gyógyászati készítmény parenterális, enterális 10 vagy orális beadásra, amely glutaminil-cikláz legalább egy inhibitorát vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza. 2. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely továbbá DP¹IV vagy DP¹IV-szerû enzim inhibito15 rát tartalmazza, ahol a DP¹IV-szerû enzim a fibroblaszt aktiválási protein¹a, dipeptidil-peptidáz-IVb, dipeptidilaminopeptidáz-szerû fehérje, N¹acetilált a¹kapcsolt savas dipeptidáz, nyugvó sejtes prolin-dipeptidáz, dipeptidil-peptidáz¹II, attraktin és DPP-8, DP6, DPL2, 20 DPP¹9 és DPP¹10 közül van kiválasztva. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti gyógyászati készítmény alkalmazása az Alzheimer-kór és Downszindróma közül választott betegség megelõzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti gyógyászati ké25 szítmény, Alzheimer-kór és Down-szindróma közül választott betegség kezelésére. 5. Glutaminil-cikláz inhibitora vagy gyógyászatilag elfogadható sója alkalmazása az Alzheimer-kór és 30 Down-szindróma közül választott betegség megelõzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. 6. Glutaminil-cikláz inhibitora vagy gyógyászatilag elfogadható sója, az Alzheimer-kór és Down-szindróma közül választott betegség megelõzésére vagy ke35 zelésére. 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti glutaminil-cikláz inhibitor vagy alkalmazás, ahol a glutaminil-cikláz inhibitor DP¹IV vagy DP¹IV-szerû enzim inhibitorával kombinációban van alkalmazva, ahol a DP¹IV-szerû enzim 40 a fibroblaszt aktiválási protein¹a, dipeptidil-peptidázIVb, dipeptidil-aminopeptidáz-szerû fehérje, N¹acetilált a¹kapcsolt savas dipeptidáz, nyugvó sejtes prolin-dipeptidáz, dipeptidil-peptidáz¹II, attraktin és DPP-8, DP6, DPL2, DPP¹9 és DPP¹10 közül van kiválasztva. 8. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti gyó45 gyászati készítmény vagy glutaminil-cikláz inhibitor vagy alkalmazás, ahol a glutaminil-cikláz inhibitor kompetitív inhibitor. 9. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti gyó50 gyászati készítmény vagy glutaminil-cikláz inhibitor vagy alkalmazás, ahol a glutaminil-cikláz inhibitor a következõk közül választott: 3-(1H-imidazol-1¹il)-1-(3¹metil-benzo[b]tiofen-2¹il)-propan-1¹on 55
60 33
1
HU 008 343 T2
4-[(1¹metil-1H-imidazol-5¹il)-metil]-3-propil-dihidrofuran-2-(3H)¹on
5
4-[2¹(1H¹imidazol-1¹il)-etoxi]-benzoesav
10
15
3-[3¹(1H-imidazol-1¹il)-propil]-2-tioxoimidazolidin-4¹on 20
25 5-nitro-2-[2¹([{3¹(1H-imidazol-1-il¹)-propil}-amino]-karbonil)-fenil]-furamid
30
35 1-benzilimidazol. 10. A 3. és 5–9. igénypontok bármelyike szerinti glutaminil-cikláz inhibitor vagy alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az Ab3–40/42, [Gln 3 ]Ab3–40/42, [Glu11]Ab111–40/42 és [Gln11]Ab11–40/42 közül választott legalább egy glutaminil-cikláz szubsztrát N¹terminális glutaminsav vagy glutamin-oldalláncának piroglutaminsav oldallánccá történõ átalakulása gátolt. 11. A 3. és 7–10. igénypontok bármelyike szerinti glutaminil-cikláz inhibitor vagy alkalmazás, ahol a DP¹IV-szerû enzim H¹isoAsp-Ala-OH¹t létrehozó aktivitása blokkolva van. 12. A 3. és 7–11. igénypontok bármelyike szerinti glutaminil-cikláz inhibitor vagy alkalmazás, ahol a DP¹IV-szerû enzim DP¹II. 13. A 3. és 7–10. igénypontok bármelyike szerinti glutaminil-cikláz inhibitor vagy alkalmazás, ahol a DP¹IV-inhibitor következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: L¹treo-izoleucil tiazolidin, L¹allo-izoleucil tiazolidin, L¹treo-izoleucil pirrolidin, L¹allo-izoleucil pirrolidin, NVP-DPP728A (1¹[[[2¹[{5¹ciano-piridin-2¹il}amino]-etil]-amino]-acetil]-2-ciano¹(S)-pirrolidin), LAF237 (1¹[(3¹hidroxi-adamant-1-il-amino)-acetil]-pirrolidin-
40
45
50
55
60 34
2
2(S)-karbonitril); TSL-225 (triptofil-1,2,3,4-tetrahidroizoquinolin-3-karbonsav), FE¹999011, N¹valil prolil, O¹benzoil hidroxil-amin, alanil pirrolidin, H¹Asn-pirrolidin, H¹Asn-tiazolidin, H¹Asp-pirrolidin, H¹Asp-tiazolidin, H¹Asp(NHOH)-pirrolidin, H¹Asp(NHOH)-tiazolidin, H¹Glu-pirrolidin, H¹Glu-tiazolidin, H¹Glu(NHOH)-pirrolidin, H¹Glu(NHOH)-tiazolidin, H–His-pirrolidin, H–Histiazolidin, H¹Pro-pirrolidin, H¹Pro-tiazolidin, H¹Ile-azididin, H¹Ile-pirrolidin, H¹L-allo-Ile-tiazolidin, H¹Val-pirrolidin és H¹Val-tiazolidin, 2¹amino-oktánsav-Pro-Ile, AbuPro-Ile, Aib-Pro-Ile, Aze-Pro-Ile, Cha-Pro-Ile, Ile-HypIle, Ile-Pro-allo-Ile, Ile-Pro-t¹butil-Gly, Ile-Pro-Val, NlePro-Ile, Nva-Pro-Ile, Orn-Pro-Ile, Phe-Pro-Ile, Phg-ProIle, Pip-Pro-Ile, Ser(Bzl)-Pro-Ile, Ser(P)-Pro-Ile, SerPro-Ile, t¹butil-Gly-Pro-D-Val, t¹butil-Gly-Pro-Gly, t¹butilGly-Pro-Ile, t¹butil-Gly-Pro-Ile-amid, t¹butil-Gly-Prot¹butil-Gly, t¹butil-Gly-Pro-Val, Thr-Pro-Ile, Tic-Pro-Ile, Trp-Pro-Ile, Tyr(P)-Pro-Ile, Tyr-Pro-allo-Ile, Val-Pro-allo-Ile, Val-Pro-t¹butil-Gly, Val-Pro-Val, vagy ezek gyógyászatilag elfogadható sója. 14. A 3. és 7–10. igénypontok bármelyike szerinti glutaminil-cikláz inhibitor vagy alkalmazás, ahol a DP¹IV-inhibitor a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: 2¹metil-karbonil-1-N-[(L)-Alanil¹(L)-Valinil]-(2S)pirrolidin hidrobromid, 2¹metil-karbonil-1-N-[(L)-Valinil¹(L)-Prolil¹(L)Valinil]-(2S)-pirrolidin hidrobromid, 2¹[(acetil-oxi-metil)-karbonil]-1-N-[(L)-Alanil¹(L)Valinil]-(2S)-pirrolidin hidrobromid, 2¹[benzoil-oxi-metil)-karbonil]-1-N-[{(L)-Alanil}¹(L)Valinil]-(2S)-pirrolidin hidrobromid, 2¹{[(2,6-diklór-benzil)-tiometil]-karbonil}-1-N-[{(L)Alanil}¹(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidin, 2¹[benzoil-oxi-metil)-karbonil]-1-N-[Glicil¹(L)-Valinil](2S)-pirrolidin hidrobromid, 2¹[([1,3]-tiazoletiazol-2¹il)-karbonil]-1-N-[{(L)Alanil}¹(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidin trifluoracetát, 2¹[(benzotiazoletiazol-2¹il)-karbonil]-1-N-[N¹{(L)Alanil}¹(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidin trifluoracetát, 2¹[(¹benzotiazoletiazol-2¹il)-karbonil]-1-N-[{(L)Alanil}-Glicil]-(2S)-pirrolidin trifluoracetát, 2¹[(piridin-2¹il)-karbonil]-1-N-[N¹{(L)-Alanil}¹(L)Valinil]-(2S)-pirrolidin trifluoracetát, 1¹ciklopentil-3-metil-1-oxo-2-pentanaminium klorid, 1¹ciklopentil-3-metil-1-oxo-2-butanaminium klorid, 1¹ciklopentil-3,3-dimetil-1-oxo-2-butanaminium klorid, 1¹ciklohexil-3,3-dimetil-1-oxo-2-butanaminium klorid, 3¹(ciklopentil-karbonil)-1,2,3,4tetrahidroizoquinolinium klorid és N¹(2¹ciklopentil-2-oxo-etil)-ciklohexanaminium klorid, vagy ezek gyógyászatilag elfogadható sója. 15. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény vagy glutaminil-cikláz inhibitor vagy alkalmazás, ahol a glutaminil-cikláz inhibitor a glutaminil-cikláz aktív helyhez kötött fémionjához kötõdik.
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
35
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
36
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
37
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
38
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
39
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
40
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
41
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
42
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
43
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
44
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
45
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
46
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
47
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
48
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
49
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
50
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
51
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
52
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
53
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
54
HU 008 343 T2 Int. Cl.: A61K 31/00
55
Kiadja a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
