!HU000007183T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 183
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(72) Feltalálók: VILLOSLADA DIAZ, Pablo, E-31008 Pamplona (ES); AVILA ZARAGOZA, Matías, E-31008 Pamplona (ES); MORENO BRUNA, Beatriz, E-31008 Pamplona (ES); CORRALES IZQUIERDO, Fernando, E-31008 Pamplona (ES); BERASAIN LASARTE, Carmen, E-31008 Pamplona (ES); RUIZ GARCIA-TREVIJANO, Elena, 46004 Valencia (ES)
(73) Jogosult: Proyecto de Biomedicina Cima, S. L., 31180 Cizur Mayor (Navarra) (ES)
(54)
HU 007 183 T2
A61K 31/7076 (2006.01)
(21) Magyar ügyszám: E 05 728461 (22) A bejelentés napja: 2005. 03. 17. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050728461 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1891961 A1 2006. 09. 21. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1891961 B1 2009. 09. 16.
A61P 37/06 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06097547 PCT/ES 05/000139
(74) Képviselõ: dr. Kiss Ildikó, DANUBIA Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft., Budapest
5’-Metil-tioadenozin (MTA) alkalmazása autoimmun betegségek és/vagy transzplantátumkilökõdés megelõzésében és/vagy kezelésében
A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 4 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 183 T2
A találmány mûszaki területe A találmány általánosságban 5’¹metil-tioadenozin (MTA), gyógyszerészetileg elfogadható sói és/vagy prodrogjai alkalmazására vonatkozik autoimmun betegségek megelõzésében és/vagy kezelésében, valamint transzplantátumkilökõdések megelõzésében és/vagy kezelésében, és különösen sclerosis multiplex (MS) megelõzésében és/vagy kezelésében. A találmány háttere Az autoimmun betegségek súlyos betegségek, amelyek jelentõs egészségi és személyi problémákat okoznak, és jelenleg a negyedik legfontosabb egészségi problémát jelentik az iparilag fejlett országokban. Például a sclerosis multiplex (MS) egy óriási egészségügyi fontossággal bíró autoimmun betegség, amely komoly következményekkel jár. Hasonlóképpen a transzplantátumkilökõdés – az autoimmunitás egy speciális esete, ahol a transzplantátum antigénspecifikus T¹limfociták aktiválása azok eliminációjához vezet – súlyos komplikációt jelent a transzplantátumot kapó betegek számára, és magas személyi és szociális költséggel jár. Specifikus jellemzõik (mechanizmus és kezelésekre adott válasz) következtében az autoimmun betegségek egy specifikus alcsoportot alkotnak a gyulladásos betegségeken belül. Amint az jól ismert, gyulladásos betegségek azok, amelyekben a veleszületett gyulladás van túlsúlyban, vagy amelyekben a kezelés a veleszületett gyulladás leküzdésére irányul. Azonban az autoimmun betegségek annyiban térnek el a gyulladásos betegségektõl, hogy az adaptív immunitás (limfociták) általi gyulladás van túlsúlyban; ennek következtében a klasszikus gyulladásellenes kezelések, amelyek a veleszületett gyulladás módosítását célozzák, nem hatékonyak az autoimmun betegségek kezelésében, láthatólag azon tény következtében, hogy az autoimmun betegség krónikus aktivitásának szabályozása érdekében a lokális gyulladás szuppresszálása mellett a limfocita aktivitás módosítására is szükség van immunmodulátorok segítségével. Az autoimmun betegségek kezelése komoly probléma, mivel számos terápia tüneti, és azok a terápiák, amelyek a betegség lefolyását módosítják, részleges hatékonysággal és mellékhatásokkal, valamint jelentõs költségekkel járnak. Az autoimmun betegségek kontrollja általában a T¹limfocita-aktiválás módosításán alapul immunszuppresszáns vagy immunmodulátor terápiák segítségével; ezen okból a klasszikus gyulladásgátló terápiák hatástalanok. Jelenleg az autoimmun betegségek és transzplantátumkilökõdések kezelésére három típusú terápiát szokás alkalmazni, amelyek mindegyike az autoreaktív T¹limfociták aktiválásának és hatásának korlátozására fókuszál: a) egyrészrõl kortikoidok (például prednizon, 5’¹metilprednizon, dexametazon és ACTH, többek között) beadása orálisan, szubkután módon vagy intravénásan és bóluszok formájában, rövid idõtartamon át vagy meghatározatlan idõn keresztül enyhítheti a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
fenti betegségek némelyikét, noha mindig csak részlegesen és jelentõs hosszú távú szekunder hatásokkal, amelyek korlátozzák ezek alkalmazását; b) másrészrõl immunszuppresszánsok (például ciklofoszfamid, mitoxantron, metotrexát, azatioprin és ciklosporin A, többek között) beadása orálisan vagy intravénásan javítja számos fenti betegség leküzdését, noha potenciálisan súlyos, sõt akár letális mellékhatásokkal, amelyek nagymértékben korlátozzzák ezek alkalmazását; és c) másrészrõl immunmodulátorok (például interferonbéta, interferon-alfa, glatiramer-acetát, antiCD20 vagy anti-TNF¹a monoklonális antitestek, többek között) beadása javítja a fenti betegségek leküzdését, noha csak részlegesen, habituális mellékhatásokkal és magas költségekkel, mivel ezek biotechnológiai termékek. Ezért nagyon kívánatos lenne, ha olyan új kezelés lenne hozzáférhetõ, amely hatékony a limfocita aktiválás megakadályozásában, és megakadályozza vagy csökkenti az autoimmun betegségek aktivitását és a transzplantátumkilökõdést, kevesebb szekunder hatással. Most azt találtuk, hogy az 5’¹metil-tioadenozin (MTA) autoimmun betegségek megelõzésében és/vagy kezelésében, valamint transzplantátumkilökõdések megelõzésében és/vagy kezelésében, különösen sclerosis multiplex (MS) megelõzésében és/vagy kezelésében alkalmazható. Az MTA egy hidrofób kéntartalmú adenin-nukleozid, amelyben a ribóz 5’¹helyzetében lévõ hidroxilcsoport egy metil-tio-csoporttal van helyettesítve. Az MTA alacsony koncentrációban minden sejttípusban megtalálható, beleértve a prokariotákat, élesztõket, növényeket és magasabb rendû eukariotákat, és megfigyelték, hogy az természetesen jelen van az összes emlõsszövetben. Az MTA egy jól ismert molekula, amely nagyon szerteágazó tulajdonságokat mutat a rák leküzdésében, valamint a regenerálódásban és a veleszületett gyulladásban. Az US 4454122 számú szabadalmi iratban ismertetik az MTA alkalmazását gyulladásgátló, analgetikus és lázcsillapító szerként; különösen az MTA alkalmazását veleszületett gyulladás kezelésében. A gyulladásgátló aktivitást a veleszületett immunválaszok szuppresszálásának útján határozzák meg ödéma, pleuritis és idegentestes granuloma modellekben. Nem analizálják az MTA szerepét a limfocitaaktiválás szuppresszálásban, sem immunmodulátorként betöltött szerepét autoimmun betegségekben és transzplantátumkilökõdésekben. Az MTA rákra kifejtett hatásait szintén tanulmányozták. Széles körben megfigyelték, hogy az MTAP (5’-metil-tioadenozin-foszforiláz) aktivitás hiányzik számos rosszindulatú sejtben, és azt, hogy tenyészetben ezek az MTAP-deficiens sejtek MTA¹t szekretálnak ahelyett, hogy azt metabolizálnák. Például a WO 2004/074325 számon publikált nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírják az MTAP enzimet gátló vegyületek alkalmazását rák kezelésében. A kémiailag indukált hepatokarcinogenezis kísérletes modelljeiben,
1
HU 007 183 T2
2
amelyekben megfigyelték az MTA-szintek csökkenését, MTA beadása a máj preneoplasztikus lézióinak és a DNS-szintézisnek dózisfüggõ gátlását indukálja. Másrészrõl a T¹limfociták funkciója és proliferációja különösen érzékenynek tûnik MTA általi gátlásra. Ez a vegyület reverzíbilis, nem toxikus és dózisfüggõ módon gátolja a mitogénstimulált egér limfoid sejtvonalak és humán periferiális limfociták proliferációját. Az MTA hatásai közül, amelyek zavarhatják a sejtproliferációt, idézhetjük a proteinmetilezés gátlását vagy a foszfodiészterázaktivitás gátlását. A jelen találmány feltalálói maguk közölték egy konferenciairatban az MTA alkalmazhatóságát metilezési reakciók erõs inhibitoraként, amely megakadályozza az autoimmunválasz kifejlõdését a kísérletes autoimmun encephalomyelitis (EAE) állatmodelljében, amelyben mielin bázikus proteinnel (MBP) immunizált Lewis-patkányokat alkalmaznak {„A Methylation-Inhibitor Suppresses T Cell Activation and Prevents Experimental Autoimmune Encephalomyelitis”, International Society of Neuroimmunology 7. találkozója, Velence, 2004. szeptember [az Abstract a Journal of Neuroimmunology 2004, 154 (1–2), 85. oldalán publikálva]}.
az MTA terápiásan hatékony mennyiségének beadását az említett egyednek. Az MTA alkalmazása autoimmun betegségek, különösen MS és transzplantátumkilökõdés megelõzésére 5 és/vagy kezelésére hatékony módját jelenti az olyan jelenlegi terápiás stratégiák által felvetett problémák elkerülésének, mint amilyen például az autoimmun betegségek és transzplantátumkilökõdés kezelésében alkalmazott kortikoidok, immunszuppresszánsok és im10 munmodulátorok hosszú távú másodlagos hatásai.
A találmány összefoglalása Meglepõ módon most azt találtuk, hogy az MTA módosító hatást képes kifejteni a T¹limfocita-aktiválásra, amely képessé teszi autoimmun betegségek és transzplantátumkilökõdés esetében a gyulladás módosítására, és ezért autoimmun betegségek megelõzésében és/vagy kezelésében, valamint transzplantátumkilökõdések megelõzésében és/vagy kezelésében, és különösen MS megelõzésében és/vagy kezelésében alkalmazható. Ebben a tekintetben a találmány értelmében az MTA immunmodulátor szerként mûködik, mivel hatását specifikusan a limfocitákon fejti ki. Az MTA fenti új alkalmazása az akut EAE és a krónikus-visszatérõ EAE állatmodelljein végett kutatómunkán alapul, ahol az állatoknak MTA¹t adagoltunk. Azt találtuk, hogy azok az állatok, amelyeket MTA-val kezeltünk, nem mutatták a betegség klinikai tüneteit, vagy ha a betegség már kialakult, szignifikáns enyhülés volt látható a betegség lefolyása során. Ezért egyik aspektusában a találmány az MTA alkalmazására vonatkozik (i) autoimmun betegség megelõzésére és/vagy kezelésére, vagy (ii) transzplantátumkilökõdés megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmazható gyógyszer elõállításában. Egy specifikus kiviteli alakban ez az autoimmun betegség az MS. Másik aspektusában a találmány eljárásra vonatkozik autoimmun betegség megelõzésére és/vagy kezelésére egy autoimmun betegségben szenvedõ egyedben, amely magában foglalja az MTA terápiásan hatékony mennyiségének beadását az említett egyednek. Egy specifikus kiviteli mód szerint ez az autoimmun betegség az MS. További aspektusában a találmány eljárásra vonatkozik transzplantátumkilökõdés megelõzésére és/vagy kezelésére egy transzplantáción átesett vagy transzplantáció elõtt álló egyedben, amely magában foglalja
25
15
20
30
35
40
45
50
55
60 3
Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra egy grafikon, amely az EAE indukálását mutatja tengerimalac MBP68–82-vel immunizált Lewis-patkányokban. Az átlagos napi klinikai pontszám ±S. E. M. látható a patkányok minden egyes csoportjára, ahol (*) statisztikailag szignifikáns különbséget jelent p<0,05 értéknél az MTA-val végzett kezeléssel összehasonlítva, és (**) statisztikailag szignifikáns különbséget jelent p<0,005 értéknél az MTA-val végzett kezeléssel összehasonlítva. Az adatok 3 különálló kísérletbõl származnak. A 2. ábra egy grafikon, amely rMOG-vel immunizált DA patkányokban mutatja a krónikus-visszatérõ EAE indukálását. Az átlagos napi klinikai pontszám ±S. E. M. látható a patkányok minden egyes csoportjára, ahol (*) statisztikailag szignifikáns különbséget jelent p<0,005 értéknél az MTA-val végzett kezeléssel összehasonlítva. A 3. ábra egy grafikon, amely MOG-vel immunizált DA patkányok túlélési görbéjét mutatja a közepes rokkantság eléréséig (pontszám=3,5) (p<0,001 Breslow-teszt szerint) (3A. ábra), és az MOG-vel immunizált DA patkányok túlélési görbéjét a pusztulás eléréséig (pontszám=5) (p=0,02 Breslow-teszt szerint) (3B. ábra). A 4. ábra egy oszlopdiagram, amely az MBP-specifikus T¹limfocita-választ mutatja MBPvel immunizált Lewis-patkányokban az immunizálás utáni 16. napon. Az eredmények átlagos stimulálásindexként vannak megadva, ahol (*) statisztikailag szignifikáns különbséget jelent p<0,05 értéknél a placebóval végzett kezeléssel összehasonlítva. Az 5. ábra egy oszlopdiagram, amely az IL–2, IFN¹g, TNF, IL–10 és iNOS mRNS expressziós mintákat mutatja EAE-ben szenvedõ patkányok szplenocitáiban. Az adatok a 18S rRNS konstitutív gén szintjéhez viszonyítva vannak kifejezve, ahol (*) szignifikáns különbséget jelent p<0,05 értéknél az MTA-val összehasonlítva.
1
HU 007 183 T2
A 6. ábra egy oszlopdiagram, amely a gyulladásos és demielinizációs sérülések hisztológiai pontszámait mutatja, ahol (*) statisztikailag szignifikáns különbséget jelent p<0,05 értéknél az MTA-val összehasonlítva.
5
A találmány részletes ismertetése Egy aspektusában a találmány MTA 10
15
20
vagy gyógyszerészetileg elfogadható sói és/vagy prodrogjai alkalmazására vonatkozik (i) autoimmun betegség megelõzésére és/vagy kezelésre vagy (ii) transzplantátumkilökõdés megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyszer elõállításában. A leírásban a „gyógyszerészetileg elfogadható sók” kifejezés bármely MTA sóra vonatkozik, amely gyógyszer elõállításában alkalmazható. A só természete nem kritikus, feltéve, hogy az gyógyszerészetileg elfogadható. Az MTA gyógyszerészetileg elfogadható sói közé tartoznak a savaddíciós sók, amelyek szerves vagy szervetlen savakkal állíthatók elõ szokásos, szakember számára jól ismert módszerekkel, a megfelelõ sav MTA-val történõ reagáltatásával megfelelõ sztöchiometriai mennyiségben. A fenti savaddíciós sók elõállítására alkalmazható savakra példaként említhetõk – a korlátozás szándéka nélkül – a szerves savak, például aszkorbinsav, citromsav, 1,4-butándiszulfonsav, p¹toluolszulfonsav stb., vagy a szervetlen savak, például sósav, kénsav stb. Illusztráció kedvéért például az MTA-hidroklorid injektálható készítményekben alkalmazható; az MTA-hidroklorid, MTA-szulfát, MTA-citrát, MTA-aszkorbát, MTA-1,4-butándiszulfonát (enterális bevonatú tabletták), MTA-p-toluolszulfonát stb. orális készítményekben alkalmazható. Ezenkívül a találmány tárgykörébe tartoznak az MTA prodrogjai is. A „prodrog” kifejezés a leírásban alkalmazva bármely MTA-ból származó vegyületet jelent, például észtert, amidot stb., amely az egyednek történõ beadás után képes az MTA¹t közvetlenül vagy közvetve biztosítani az említett egyednek. Elõnyösen az említett származék egy olyan vegyület, amely fokozza az MTA biológiai hasznosíthatóságát az egyednek való beadáskor, vagy elõsegíti az MTA felszabadulását egy biológiai kompartmentben. Az említett származék természete nem kritikus, feltéve, hogy az beadható egy egyednek és biztosítja az MTA¹t az egyed biológiai kompartmenjében. Az említett prodrog elõállítását szo-
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
kásos, szakember számára ismert módszerekkel hajtható végre. Az MTA egy kereskedelmi termék, amelyet a Sigma cégtõl szerezhetünk be. Alternatív módon az említett vegyületet ismert eljárásokkal elõállíthatjuk, például S¹adenozil-metioninból (SAM) kiindulva, Schlenk F. és munkatársai módszere szerint [Arch. Biochem. Biophys. 106, 95–100 (1964)], amint a leírás példájában említettük. Autoimmun betegség, mint például az MS megelõzésére és/vagy kezelésére történõ beadáshoz, vagy transzplantátumkilökõdés megelõzésére és/vagy kezelésére való beadáshoz az MTA¹t, annak gyógyszerészetileg elfogadható sóját és/vagy prodrogját terápiásan hatékony mennyiségben egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal, adjuvánssal vagy segédanyaggal együtt megfelelõ gyógyszerkészítménnyé formáljuk. A gyógyszerkészítményekre példaként említhetõ bármely szilárd (például tabletta, kapszula, granulátum stb.) vagy cseppfolyós készítmény (például oldat, szuszpenzió, emulzió stb.), amely bármely megfelelõ módon, például orálisan, szubkután módon, intraperitoneálisan, intravénásan stb. beadható; tipikusan orális úton a kezelendõ betegség krónikus természete miatt. Egy specifikus kiviteli alakban az említett gyógyszerkészítmények orális adagolásra megfelelõ gyógyszerformák lehetnek akár szilárd, vagy akár cseppfolyós formák. Az orális beadásra alkalmas gyógyszerformák közé tartoznak például a tabletták, kapszulák, granulátumok, oldatok, szuszpenziók stb., ezek szokásos segédanyagokat, például kötõanyagot, hígítóanyagot, dezintegrálóanyagot, síkosítóanyagot, nedvesítõanyagot stb. tartalmazhatnak, és szokásos eljárásokkal állíthatók elõ. A gyógyszerkészítmények parenterális beadásra is alkalmasak lehetnek például oldatok, szuszpenziók vagy steril, liofilizált termékek formájában, megfelelõ dózisformában; ebben az esetben az említett gyógyszerkészítmények megfelelõ segédanyagokat, például puffereket, felületaktív anyagokat stb. tartalmaznak. Mindenesetre a segédanyagokat a gyógyszerforma megválasztott beadási módjának alapján kell megválasztani. A hatóanyag beadására szolgáló különféle gyógyszerformák áttekintése és ezek elõállítása megtalálható a „Tratado de Farmacia Galénica” címû könyvben [de C. Fauli i Trillo, 10. kiadás, 1993, Luzán 5, S. A. de Ediciones]. Terápiában való alkalmazásához az MTA elõnyösen gyógyszerészetileg elfogadható vagy alapvetõen tiszta formában van, azaz az MTA gyógyszerészetileg elfogadható tisztasági szinttel rendelkezik, a gyógyszerészetileg elfogadható segédanyagok kivételével és nem beleértve a normális dózisszinteken toxikusnak tekintett anyagot. Az MTA tisztasági szintje elõnyösen nagyobb, mint 50%, még elõnyösebben nagyobb, mint 70%, még elõnyösebben 90% feletti. Egy elõnyös kiviteli alakban ez 95% MTA feletti. Általában az MTA beadható, terápiásan hatékony mennyisége különféle faktoroktól függ, többek között a kezelendõ egyedtõl, az egyed betegségének súlyossá-
1
HU 007 183 T2
gától, az adagolás választott módjától stb. Ezen okból a találmánnyal kapcsolatban említett dózisok szakember számára pusztán útmutatást jelentenek, és ezeket a dózisokat a szakembernek kell beállítani az említett változók alapján. Azonban az MTA beadható naponta egy vagy több alkalommal, például naponta 1, 2, 3 vagy 4 alkalommal, rendszerint összesen 25 és 75 mg/kg/nap közötti napi mennyiségben. Az MTA, gyógyszerészetileg elfogadható sói és/vagy prodrogjai és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények egyéb további hatóanyagokkal együtt is alkalmazhatók, amelyek autoimmun betegségek vagy transzplantátumkilökõdés megelõzésében és/vagy kezelésében alkalmazhatók, mint amilyenek például a kortikoidok, immunszuppresszánsok, immunmodulátorok stb., kombinációs terápia biztosítása érdekében. Az említett további hatóanyagok egyazon gyógyszerkészítmény részét alkothatják, vagy különálló készítmény formájában biztosíthatók, az MTA¹t vagy annak prodrogját vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóját tartalmazó gyógyszerkészítményekkel egyidejûleg vagy nem egyidejûleg történõ beadásra. A leírásban alkalmazva az „autoimmun betegség” kifejezés egy olyan betegséget jelent, amely válaszol az agresszív mechanizmusok beindítására a beteg védekezõ (immun) rendszerében saját testszövetei ellen. Közelebbrõl az autoimmun betegségekre jellemzõ, hogy túlsúlyban van az adaptív immunitás (amelyet specifikus vagy szerzett immunitásnak is neveznek) általi gyulladás, ahol az immunitást a fertõzõ ágenseknek való kitétel stimulálja, és fõ komponensei a limfociták. Az autoimmun betegségek listája az American Autoimmune Related Diseases Association webhelyen (http://www.aarda.org) található. Az autoimmun betegségekre példaként említhetõ, a korlátozás szándéka nélkül: MS, Crohn-betegség, reumatoid arthritis, I¹es típusú diabetes mellitus, pikkelysömör, lupus, fekélyes vastagbélgyulladás, vitiligo, lisztérzékenység, vasculitis, dermatomyositis, polymyositis, thyroiditis (Hashimoto, Graves), myasthenia gravis, Guillain–Barreszindróma, uveitis, lapos lichen, halántéki arteritis, sarcoidosis, száraz szindróma (Sjöegren), hörgõasztma, pemphigus, ankylosing spondylitis, sclerodermia, fibromyalgia, reumás láz stb. Egy specifikus kiviteli alakban a találmány MTA, gyógyszerészetileg elfogadható sói és/vagy prodrogjai alkalmazására vonatkozik MS megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyszer elõállításában, különösen MS kezelésére, és még közelebbrõl MS megelõzésére és/vagy kezelésére a betegség elkövetkezõ kitörései megjelenésének vagy a betegség kifejlõdésének (progresszív fázis) késleltetésében egy MS¹ben szenvedõ egyedben, azaz miután az MS már elkezdõdött. Az általunk végzett kísérletek azt mutatták, hogy az MTA preventív hatása mellett az EAE megelõzésében megfigyelt autoimmunitás kifejlõdésére MBP-vel immunizált Lewis-patkányokban (akut EAE modell) az MTA gyógyító hatást is kifejt a krónikus autoimmunitásra, mivel az MTA-val végzett kezelés enyhítette a klinikai tüneteket és javította a túlélést, amikor a betegség (MS)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
már elkezõdött, amint azt rMOG-vel immunizált DA patkányokkal a CR¹EAE modellben igazoltuk. Ez az aspektus nagyon fontos, mivel jelenleg az immunmodulátor terápiák csak akkor alkalmazhatók, amikor a betegség már elkezdõdött, lehetetlen preventív kezelést végezni, mivel nincsenek preszimptómás markerek. Egy másik specifikus kiviteli alakban a találmány MTA, gyógyszerészetileg elfogadható sói és/vagy prodrogjai alkalmazására vonatkozik transzplantátumkilökõdés megelõzésére és/vagy kezelésre alkalmazható gyógyszer elõállításában. Az MTA, gyógyszerészetileg elfogadható sói és/vagy prodrogjai gyakorlatilag bármely transzplantátumkilökõdésének megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmazható. Az ilyen transzplantátumokra példaként említhetõ, a korlátozás szándéka nélkül: vese, máj, szív, tüdõ, bél, hematopoietikus és csontvelõ, bõr, végtagok, szaruhártya, hasnyálmirigy, õssejtek és sejtterápia, grafitok vagy biológiai anyagok stb. Egy további aspektusban a találmány eljárásra vonatkozik autoimmun betegség megelõzésére és/vagy kezelésére egy autoimmun betegségtõl szenvedõ egyedben, amelynek során az MTA vagy annak egy gyógyszerészetileg elfogadható sója és/vagy prodrogja terápiásan hatékony mennyiségét beadjuk az említett egyednek. A kezelhetõ autoimmun betegségeket a fentiekben definiáltuk, ugyanúgy, mint a beadás, a gyógyszerkészítmény és az MTA terápiásan hatékony mennyisége jellemzõit. Egy specifikus kiviteli alakban az említett autoimmun betegség az MS. Egy specifikus kiviteli mód szerint az MTA, gyógyszerészetileg elfogadható sója és/vagy prodrogja az elkövetkezõ kitörések megjelenésének késleltetésére vagy az MS kifejlõdésének (progresszív fázis) késleltetésére alkalmazható egy MS¹ben szenvedõ egyedben. Egy további aspektusában a találmány eljárásra vonatkozik transzplantátumkilökõdés megelõzésére és/vagy kezelésére egy egyedben, aki transzplantáció elõtt áll, vagy már átesett a transzplantáción, amelynek során az MTA vagy annak egy gyógyszerészetileg elfogadható sója és/vagy prodrogja terápiásan hatékony mennyiségét beadjuk az egyednek. A transzplantátumok példáit, amelyek kilökõdése MTA-val vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható sójával és/vagy prodrogjával megelõzhetõ vagy kezelhetõ, a fentiekben felsoroltuk – a korlátozás szándéka nélkül – ugyanúgy, mint a beadás, a gyógyszerkészítmény és az MTA terápiásan hatékony mennyisége jellemzõit. Az említett gyógyszerkészítmény beadható a transzplantálás elõtt vagy után (azaz profilaktikus vagy terápiás célra) vagy akár a transzplantálás elõtt vagy után, akkor is, ha kezdetben nincsenek kilökõdési tünetek (azaz profilaktikus célra). A leírásban alkalmazva az „egyed” kifejezés bármely emlõsre vonatkozik, és magában foglalja – a korlátozás szándéka nélkül – a háziállatokat, rágcsálókat, fõemlõsöket és embert. Elõnyösen az említett egyed egy emberi lény, férfi vagy nõ, tetszõleges életkorú vagy fajú. A találmány egy specifikus kiviteli alakjában az MTA beadása önmagában vagy egyéb terápiákkal vagy
1
HU 007 183 T2
egyéb hatóanyagokkal kombinációban, kombinációs terápia formájában történik. A találmányt közelebbrõl példával illusztráljuk, a korlátozás szándéka nélkül. 5 Példa Az 1970¹es évek óta az akut kísérletes autoimmun encephalomyelitis (EAE) modellt úgy tekintik, mint a sclerosis multiplex (MS) modelljét, és hogy ezért az akut EAE esetén hatékony kezelések MS esetén is hatékonyak. Azonban vegyületek százait vizsgálták meg, amelyek hatékonyak voltak akut EAE kezelésében, azonban az MS kezelésében nem (Hohlfeld R. & Wekerle H. Proceeding National Academy of Sciences USA, October 2004, Vol. 101., Suppl. 2, page 14,599, heading: MS and EAE, paragraph 3). Ennek fényében, az akut EAE megelõzésében való hatékonyság kimutatása mellett a krónikus, visszatérõ EAE (az MS modellje általában) gyógyításában való hatékonyságot is bizonyítani kell. E tekintetben ebben a példában két nem humán állatmodellt alkalmaztunk az MTA hatékonyságának kimutatására autoimmun betegségek kezelésében, és különösen MS kezelésében; közelebbrõl (i) akut EAE MBP-vel immunizált Lewis-patkányokban [az MS kitörésének és az akut szóródott encephalomyelitisnek (ADE) modellje] és (ii) krónikus-visszatérõ EAE (CR-EAE) MOG-vel immunizált Dark Agouti (DA) patkányokban (MS modellje). I. Anyagok és módszerek Állatok A mielin bázikus proteinnel (MBP) történõ immunizálással generált akut EAE modelljéhez 6–8 hetes 175–200 g tömegû Charles River nõstény Lewis-patkányokat használtunk. Az oligodendrocita glikoproteinnel (MOG) történõ immunizálással generált krónikus-visszatérõ EAE modelljéhez Dark Agouti (DA) patkányokat használtunk, amelyek testtömege közelítõleg 200 g. Az állatokat mûanyag ketrecekben tartottuk természetes megvilágítású helyiségben, és naponta kaptak táplálékot és vizet. EAE indukálása és pontozása A Lewis-patkányokat 100 ml emulzióval immunizáltuk, amely azonos térfogatokban sóoldatot és nem komplett Freund-féle adjuvánst (IFA) 75 mg MBP-vel [tengerimalac mielin bázikus protein 68–82 fragmense (Sigma)] tartalmazott, és 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37RA-val (Difco) volt kiegészítve. Az immunizálást mindkét hátsó láb tövénél végeztük. A DA patkányokat 100 ml emulzióval immunizáltuk, amely azonos térfogatokban sóoldatot és nem komplett Freund-féle adjuvánst (IFA) 75 mg rMOG-vel [Viloslada, P. és munkatársai, J. Exp Med, 191(10). 1799–806 (2000)] (saját laboratóriumunkban tisztítva) tartalmazott, és 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosissal volt kiegészítve. Az immunizálást mindkét hátsó láb tövénél végeztük ugyanúgy, mint a Lewis-patkányok esetében.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2
Az állatokat lemértük, és az EAE klinikai tüneteit naponta ellenõriztük egy, a kezelést nem ismerõ „vak” kiértékelõ segítségével. Az EAE súlyosságát a következõ skála szerint mértük: 0=normális; 1=petyhüdt farok; 2=a hátsó lábak kétoldali enyhe bénulása (paraparesis), instabil mozgás; 3=keresztezett mellsõ vagy hátsó végtagi kétoldali bénulás (paraplegia); 4=négy végtag enyhe bénulása (tetraparesis); 5=pusztulás. Kezelések Az MBP-vel immunizált Lewis-patkányokat véletlenszerûen két csoportba osztottuk. Az egyik csoportot MTA-val (100 mmol/l koncentráció) kezeltük 4,3 mg/állat dózisban (28,6 mg/testtömeg¹kg dózissal ekvivalens). Az MTA¹t SAM-bõl (Europharma, Madrid, Spanyolország) szintetizáltuk Schlenk F. és munkatársai módszere szerint [Arch. Biochem. Biophys. 106, 95–100 (1964)] a Navarrai Egyetem Belgyógyászati Osztályának (CIMA) Hepatológiai és Génterápiai Csoportjában, 10%¹os dimetil-szulfoxiddal (DMSO) rekonstituáltuk, és a másik, placebocsoportot fiziológiás szérummal és 10% DMSO-val kezeltük intraperitoneális injektálással (ip.) naponta az immunizálás után. A rMOG-vel immunizált DA patkányokat véletlenszerûen két csoportra osztottuk, az egyik csoportot 100 mmol/l MTA-val kezeltük 300 mmol/l Tris- (pH=7,8) pufferben rekonstituálva, és a másik, placebocsoportot csak 300 mmol/l Tris-pufferrel kezeltük. A kezeléseket az immunizálás utáni 15. napon kezdtük el, és naponta végeztük ip. injektálással. A pontszámokat vakon értékeltük ki a betegség teljes lefolyása során. Szövetminták A két Lewis-patkány-csoportot elaltattuk, és intrakardiális úton 4% paraformaldehidet tartalmazó 0,1 mol/l foszfátpufferrel (p=7,6) injektáltuk a betegség 16. napján. Az agyakat és a nyaki, mellkasi és ágyéki gerincvelõ szegmenseket kivontuk, és egész éjszakán keresztül 4 °C¹on fixáltuk. Fixálás után a szöveteket paraffinba ágyaztuk a hisztopatológiai és immunhisztokémiai vizsgálathoz. A két DA patkánycsoportot elaltattuk, és ugyanazon protokoll szerint injektáltuk az immunizálás utáni 35. napon. A szöveteket is ugyanazon módon kezeltük a hisztopatológiai és immunhisztokémiai vizsgálatokhoz. Lép¹, máj- és vérmintákat is vettünk minden egyes állatból. A lépeket és májakat gyorsan lefagyasztottuk cseppfolyós nitrogénben, és –80 °C¹on tartottuk annak érdekében, hogy végre tudjuk hajtani a vizsgálatokat RT¹PCR-rel (reverz transzkripció és polimeráz-láncreakció). A vért 800 fordulat/perccel 10 percen keresztül centrifugáltuk, és a kapott szérumot –80 °C¹on tartottuk.
RNS-izolálás és cDNS-szintézis A lép- és májszövet szegmenseket 2% b¹merkaptoetanollal kiegészített RNS-lízispufferben homogenizáltuk kézi homogenizáló alkalmazásával. A teljes RNS¹t Rneasy Mini Kit (Quiagen) alkalmazásával extraháltuk 60 a gyártó elõírásai szerint. Az RNS tiszítása során a 55
6
1
HU 007 183 T2
DNS¹t DNáz enzimes kezeléssel elimináltuk. Az RNS koncentrációját és tisztaságát 260 nm¹en és 280 nm¹en az abszorpció mérésével határoztuk meg spektrofotométer (Eppendorf) segítségével. A teljes RNS reverz transzkripcióját High Capacity cDNS Archive Kit (Applied Biosystesm) alkalmazásával hajtottuk végre. A reverz transzkripciós reakciót 25 °C¹on 10 percen keresztül, 37 °C¹on 2 órán keresztül hajtottuk végre, és végül 4 °C¹on tároltuk. Primerek és szondák tervezése Fluoreszcenciálisan jelzett Taqman primer szekvenciákat és specifikus próbákat alkalmaztunk (Taqman Gene Expression Assays) (Applied Biosystems) az eukariota rRNS 18S, interferon-gamma (IFN¹g), interleukin–2 (IL–2), tumornekrózisfaktor-alfa (TNF¹a), interleukin–10 (IL–10) és indukálható nitrogén-oxidszintáz (iNOS) esetén. Kvantitatív real-time PCR A kvantitatív PCR-hez TaqMan Universal Master Mix¹et (Applied Biosystems) alkalmaztunk. A cDNS amplifikációt 96 rezervoáros lemezeken (MJ Research, Inc.) hajtottuk végre Opticon 2 real-time rendszerben (MJ Research). A reakciót 25 ml¹es végtérfogatú reakciókeverékben hajtottuk végre, amelynek összetétele: 1×TaqMan Universal Master Mix, 1×TaqMan Gene Expression Assay Mix (0,9 mmol/l az egyes primerekbõl és 0,25 mmol/l a szondához), és 20 ng cDNS, RNáz- és DNáz-mentes vízben oldva. A reakciókörülmények a következõk: 2 perc 50 °C¹on, 10 perc 95 °C¹on és 40 15 másodperces ciklus 95 °C¹on és 1 perc 60 °C¹on. Minden egyes mintát triplikátban vittünk fel, és minden egyes lemezen különbözõ rezervoárokban amplifikáltuk a vakot és az endogén kontrollt. Az IL–2, IFN¹g, TNF¹a, IL–10 és iNOS mRNS expressziós szinteket kvantitatívan meghatároztuk az rRNS 18S konstitutív génhez viszonyítva. Hisztopatológia, gyulladás és demielinizáció Elvégeztük a paraffinba ágyazott agyi és gerincvelõmetszetek hisztológiai kiértékelését. A metszeteket hematoxilin-eozin (HE) és Luxol fast-blue festékekkel megfestettük annak érdekében, hogy meg tudjuk becsülni a szövetek gyulladását és demielinizációját. Minden egyes patkánynál 24–30 szagittális metszetet vizsgáltunk meg. A gyulladás és demielinizáció vak félkvantitatív hisztológiai kiértékelését a korábbiakban leírtak szerint hajtottuk végre [Villoslada, P. és munkatársai, J. Exp. Med. 191(10), 1799–806 (2000)]. Immunohisztokémia Az immunohisztokémiai eljárásokat paraffinba ágyazott 10 mm¹es agyi és csontvelõ metszeteken hajtottuk végre. Az endogén peroxidáz-aktivitást 0,3% H2O2¹ot tartalmazó metanollal 20 percen keresztül dezaktiváltuk. A metszeteket 30 percen keresztül inkubáltuk PBSben 0,5% Tween® 20 és 10% kecske- vagy lószérum
2
(Vector Laboratorios) jelenlétében, és 2 órán keresztül PBS-ben 0,5% Tween® 20 és a primer antitestek jelenlétében a következõ hígításokban: nyúl antigliális fibrilláris savas poliklonális antiprotein antitest (GFAP), 5 1:1000 (Dakocytomation); egér béta-amiloid prekurzor antiprotein antitest (APP), 1:100 (Zymed Laboratorios); egér anti-IgA antitest (OX–6) 1:200 (Serotec); patkány anti-CD8 antitest, 1:250 (Serotec); II¹es típusú antiiNOS antitest, 1:250 (Serotec); patkány anti-CD68 anti10 test (ED1), 1:200 (Serotec) és patkány anti-CD43 antitest (W3/13), 1:50 (Serotec). Ezután a metszeteket PBS-sel mostuk és 45 percen át szobahõmérsékleten inkubáltuk a megfelelõ biotinilezett szekunder IgG antitesttel (1:100 PBS-ben; Vector Laboratorios), majd né15 hányszor mostuk PBS/Tween®-nel és 45 percen át szobahõmérsékleten inkubáltuk az avidin-biotin-peroxidáz komplexszel (ABC, Vector Laboratorios). A PBS/Tween® oldattal végzett mosások után az immunreaktivitást 0,5 mg/ml 3,3’-diamino-benzidin-tet20 rahidroklorát (DAB; Sigma) alkalmazásával mutattuk ki. Az immunreakció specificitásának meghatározására a metszeteket a primer antitest nélkül inkubáltuk. A képeket optikai mikroszkóp alkalmazásával kaptuk. Limfocita proliferáció vizsgálat A splenocitákat Ficoll Hypaque sûrûség centrifugálás segítségével tisztítottuk EAE-ben szenvedõ patkányokból és nem immunizált patkányokból kiindulva. A limfocita proliferáció vizsgálatot a korábban leírtakkal 30 azonos módon hajtottuk végre [Villoslada, P. és munkatársai, J. Exp Med 191(10), 1799–806 (2000)]. Röviden, a splenocitákat 2×106/ml koncentrációban 10% magzati borjúszérummal és penicillin/streptomicinnel kiegészített RPMI 1640 tenyésztõközegbe he35 lyeztük, fitohemagglutinin (PHA, 5 mg/ml), MBP (10 mg/ml), MTA (100 mmol/l) és DMSO jelenlétében vagy távollétében. A tenyészeteket 96 rezervoáros gömbölyû aljú lemezeken (0,2 ml/rezervoár) 37 °C¹on 5 napon keresztül inkubáltuk. A rezervoárokat 0,5 mCi 40 [3H]TdR-rel 18 órán keresztül kezeltük. A leolvasást folyadékszcintillációs számlálóval végeztük. Az eredményeket három meghatározásból származó átlagos stimulálás indexként fejeztük ki. 25
Statisztikai analízis A statisztikai összehasonlítást Mann–Whitney kétoldali próba és a túlélési görbék alkalmazásával hajtottuk végre. Szignifikáns különbségnek a p<0,05 értékeket tekintettük. A statisztikai kiértékelést SPSS 11.0 statisz50 tikai program alkalmazásával hajtottuk végre. 45
II. Eredmények MTA hatása az MS kitörés kifejlõdésének modelljére (akut EAE) MBP-vel immunizált Lewispatkányokon 55 Az immunizálás napjától kezdõdõen a Lewis-patkányokat véletlenszerûen az MTA-val kezelt csoportba vagy a placebóval kezelt csoportba osztottuk, és mindkettõ csoportnál intrapenitoneálisan (ip.) végeztük az 60 adagolást naponta. Az összes placebóval kezelt állat7
1
HU 007 183 T2
ban egy kivételével kifejlõdtek az EAE progresszív fogyásból, a farok erõtlenségébõl és a hátsó láb bénulásából vagy közepes vagy súlyos paraplégiából álló neurológiai tünetei. Az elsõ neurológiai tüneteket a 12.
2
napon figyeltük meg, a betegség fellépése átlagosan a 13,6±1,2 napon történt (n=21). Az egyes állatoknál elért maximális pontszám a kísérlet során 1‚48±1 volt (1. táblázat).
1. táblázat EAE pontszám
a
Kezelés
Patkányok száma
EAE elõfordulása
EAE fellépése (nap)
Maximális EAE pontszám
Kumulatív EAE pontszám
MTA
14
4/14 (28,57%)
15±1,2
0,14±0,23
2±0,07
Placebó
21
20/21 (95,23%)a
13,6±1,2
1,48±1a
83,5±0,65a
Statisztikailag szignifikáns különbség p<0,005 értéknél az MTA-val kezelthez viszonyítva.
Ezzel szemben azokban az állatokban, amelyeket MTA-val kezeltünk, nem jelentkeztek a klinikai tünetek, sõt erõsen enyhült a betegség lefolyása. Azokban a kezelt állatokban, amelyekben kifejlõdtek a klinikai tünetek, a betegség fellépése késleltetett volt a placebocsoporthoz viszonyítva (15±1,2 nap). A megfigyelt maximális klinikai pontszámok szignifikánsan kisebbek voltak, mint a placebocsoportéi (0,14±0,23) (1. táblázat) (1. ábra). MTA hatása az MS kifejlõdésének modelljében (CR-EAE) MOG-vel immunizált DA patkányokban Miután az elsõ kitörés lezajlott [5 nappal az elsõ kitörés fellépése után (az immunizálás utáni 15–18. nap körül)] a DA patkányokat véletlenszerûen szétosztottuk
MTA-val kezelt csoportba vagy placebóval kezelt cso20 portba, és mindkét csoportot intraperitoneálisan (ip.) kezeltük naponta. Az összes állatban kifejlõdött a betegség második kitörése, azonban a két csoport között a neurológiai tünetekben, a második kitörés súlyosságában és a túlélésben szignifikáns különbségek voltak. 25 Az MTA-val kezelt állatokban a második kitörés fellépése késleltetett volt a placebocsoporttal összehasonlítva (23,4±6,54 nap), noha a különbségek nem voltak szignifikánsak. A megfigyelt maximális klinikai pontszámok alacsonyabbak voltak, mint a placebocsoportnál kapot30 tak (2,7±1,75) (2. táblázat) (2. ábra). Ezenkívül a túlélési arány szignifikánsan magasabb volt az MTA-val kezelt csoportban (3. ábra).
2. táblázat EAE pontszám Kezelés
Patkányok száma
Második kitörés elõfordulása
Második kitörés fellépése (nap)
Maximális EAE pontszám
Kumulatív EAE pontszám
MTA
10
10/10
26±6
1,8±1,5
23±20
Placebó
10
10/10
21±3*
3,6±1,5*
50±20*
* statisztikusan szignifikáns különbség p<0,05 értéknél az MTA-val végzett kezeléshez viszonyítva.
MTA gátolja a limfocita proliferációt Annak meghatározására, hogy az MTA-val végzett kezelés módosítja¹e a perifériás immunrendszer válaszát az immunizálásban alkalmazott antigénre, mértük az MBP-vel indukált proliferációs válaszokat az MTAval és a placebóval kezelt állatok splenocitáiban (Lewis-patkányokban). Az MBP-specifikus proliferációválasz szignifikánsan kisebb volt az MTA-val kezelt állatokban, amint az a 4. ábrán látható. Vagyis az MTA-val kezelt csoport stimuláció indexe 1,18±0,4 volt, és a placebóval kezelt csoporté 2,13±1,09, ami azt jelzi, hogy a T¹sejt-válaszokat befolyásolta az MTA-val végzett kezelés. Ezért megállapíthatjuk, hogy az MTA gátolja az MBP-specifikus limfocita aktivációt, ami annak immunmodulátor hatását mutatja.
MTA módosítja a citokinek és progyulladásos mediátorok expresszióját Megvizsgáltuk, hogy az MTA rendelkezik¹e citoki50 nek és egyéb progyulladásos mediátorok expresszióját módosító kapacitással. Az IL–2, IFN¹g, TNF¹a, IL–10 és iNOS expressziót kvantitatív real-time PCR (RT-PCR) módszerrel analizáltuk. A placebóval kezelt Lewis-patkányokból és az MTA-val kezelt Lewis-pat55 kányokból származó splenocitákból izolált fenti gének relatív mRNS szintjeit az 5. ábra mutatja. Az említett citokinek mRNS expressziója alacsonyabb volt a placebocsoportban lévõ állatokéval összehasonlítva, noha csak a TNF-szintek voltak szignifikánsan külön60 bözõek. 8
1
HU 007 183 T2
Hisztológiai analízis A neuropatológiai kiértékelés alátámasztotta a megfigyelt klinikai védõhatást. A placebóval kezelt állatok agyának és gerincvelejének vizsgálata több gyulladásos gócot mutatott. Gyulladásos léziókat találtunk a nyaki, mellkasi és ágyéki gerincvelõnek mind a fehér, mind a szürke anyagában és az agyban. Azokban a patkányokban, amelyeket MTA-val kezeltünk, a gyulladásos beszûrõdéseknek mind a száma, mind a mérete kisebb volt (6. ábra). Szignifikáns különbségek voltak a placebóval kezelt állatok és az MTA-val kezeltek között mind a súlyosságot, mind az érintett központi idegrendszeri (CNS) régiókat tekintve. Az MTA-val végzett kezelés gátolja a gyulladásos EAE kifejlõdését MBP-vel immunizált Lewis-patkányokban. Immunhisztokémiai festéssel kimutattuk számos sejttípus jelenlétét a gyulladásos beszûrõdésekben, beleértve a makrofágokat és az aktivált mikrogliasejteket (EDI), T¹limfocitákat (W3/13) és B¹limfocitákat (OX–6). A pozitív ED1 és W3/13 sejtek száma magasabb volt a placebocsoportban, noha az állatok mindkét csoportjában azonos arányú volt a pozitív OX–6 sejtek elõfordulása. Az APP¹re és iNOS¹re történõ festéssel nagyon alacsony detektálási szinteket találtunk mindkét csoportban.
5
10
15
20
25 III. Kiértékelés Az EAE egy autoimmunitási modell, amely kritikusan függ a T¹sejt-aktiválástól. Az MBP- vagy MOGspecifikus CD4+ sejtek, e két CNS autoantigén, EAE¹t indukálhatnak. Limfocitaaktiválás szükséges a CNS¹be való kezdeti belépéshez. Az antigén CD4+ T¹sejtek általi felismeréséhez a II. osztályba tartozó MHC-molekulák expressziójára van szükség az antigén-prezentáló sejtekben (APC). Normális körülmények között a CNS-ben nagyon alacsony a fenti molekulák expressziója. Az INF¹g szekréciója során, ami erõsen stimulálja a II. osztályba tartozó MHC-molekulák expresszióját a CNS-ben lévõ antigénprezentáló sejtekben, mint például a mikroglia sejtek és asztrociták, a Th 1¹sejtek felismerik a mielint. Ezért egy olyan kezelés, amely a T¹limfocita-aktiválást zavarja, gátolhatja az autoimmun betegségek, például EAE kifejlõdését. Az MBP-specifikus proliferációs válasz csökkenése MBP-vel immunizált és MTA-val kezelt Lewis-patkányokban azt jelzi, hogy a metilezés egy kritikus lépés a limfocita aktiválásban. Az MBP elleni reaktív T¹sejtek szelektív gátlása megakadályozza az autoreaktív limfociták aktiválását, és a gyulladásos sejtek bejutását a CNS¹be a citokinek és/vagy kemokinek termelõdésén keresztül. Ennek következtében ez kevésbé súlyos betegséghez vezet, amint az MTA-val kezelt állatok EAE klinikai pontszámából és hisztológiai analízisébõl látható. A kumulatív EAE pontszám az MTA-val kezelt csoportban szignifikánsan alacsonyabb, mint a placebocsoportban, és a hisztológiai analízis azt mutatja, hogy a gyulladásos léziók száma jelentõsen csökkent. Az MTA-nak az autoimmunitás kifejlõdésére kifejtett preventív hatása mellett, amely Lewis-patkányokban az EAE prevenciójában megfigyelhetõ, megfigyeltük azt is, hogy az MTA gyógyító hatást is kifejt a króni-
30
35
40
45
50
2
kus autoimmunitásra. Az MTA-val végzett kezelés javította a tüneteket és túlélést, ha a betegség már elkezdõdött (az elsõ kitörés után), amint azt az MOG-vel immunizált DA patkányokon végzett EAE modellben igazoltunk. Ez az aspektus kritikusan szignifikáns gyógyászati szempontból, mivel a gyakorlatban az immunmodulátor kezeléseket akkor alkalmazhatjuk, amikor a betegség már elkezdõdött, enélkül jelenleg nem lehetséges preventív kezelést végezni, mivel nincsenek preszimptómás markerek. A T¹sejtek által termelt citokinek szignifikánsan befolyásolhatják a betegség lefolyását. Amint az 5. ábrából látható, a citokin expresszió alacsonyabb szintjét találtuk azokban a patkányokban, amelyeket MTA-val kezeltünk. Az EAE egyik jellemzõje az iNOS-expresszió aktiválása különféle sejttípusokban. Megfigyeltük, hogy az iNOS-expresszió alacsonyabb volt az MTA-val kezelt patkányok lépében. A TNF egy olyan citokin, amelyet szisztémás gyulladásokban centrális mediátorként azonosítottak, és amely ezenkívül hozzájárul az iNOS gén expresszió aktiválásához. Ebben az EAE modellben (CR-EAE), megfigyeltük, hogy az MTA a TNF-a-szinteket is csökkenti. Az IL–2 egy kulcscitokin a T¹függõ immunválaszokban a T¹sejtek növekedési faktoraként kifejtett erõs aktivitása következtében. A kapott eredmények azt mutatják, hogy az MTA az IL–2 limfocita termelõdést a specifikus T¹sejt-aktiválás gátlása révén csökkenti. Ezenkívül ez a molekula képes az IFN¹g termelõdését csökkenteni. Az MTA összes fenti hatása azt mutatja, hogy képes a citokinek egyensúlyát egy erõsebben gyulladásgátló profil irányába módosítani. Összefoglalóan, az elvégzett vizsgálatok bizonyítják, hogy az MTA megakadályozza az autoimmunitást az MBP-vel immunizált Lewis-patkányok EAE modelljében (akut EAE), és módosító és javító, azaz terápiás hatást fejt ki a betegségre az rMOG-vel immunizált DA patkányok EAE modelljében (CR-EAE). A fenti védõhatásokért felelõs mechanizmus az MBP- vagy MOGspecifikus T¹sejt-aktiválás gátlása lehet, noha egyéb szabályozó-útvonalak is részt vehetnek a védelemben. Ezek az eredmények megnyitják az utat az autoimmun betegségek és transzplantátumkilökõdések egy új, potenciális kezelése elõtt egy olyan hatóanyag alkalmazásával, amelyet könnyû elõállítani, hatékony és kevés mellékhatása van, és amely ezért szignifikáns elõrelépést jelent a fenti betegségek kezelésében.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1. 5’¹Metil-tioadenozin (MTA), gyógyszerészetileg elfogadható sói és/vagy prodrogjai – ahol az említett prodrogok az MTA észterei vagy amidjai, amelyek egy 55 egyednek történõ beadás után közvetlenül vagy közvetve MTA¹t szolgáltatnak az egyednek – alkalmazása (i) autoimmun betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére, vagy (ii) transzplantátumkilökõdés megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyszer elõállítá60 sában. 9
1
HU 007 183 T2
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett autoimmun betegség sclerosis multiplex (MS), Crohn-betegség, reumatoid arthritis, I¹es típusú diabetes mellitus, pikkelysömör, lupus, fekélyes vastagbélgyulladás, vitiligo, lisztérzékenység, vasculitis, dermatomyositis, polymyositis, thyroiditis (Hashimoto, Graves), myasthenia gravis, Guillain–Barre-szindróma, uveitis, lapos lichen, halántéki arteritis, sarcoidosis, száraz szindróma (Sjöegren), hörgõasztma, pemphigus, ankylosing spondylitis, sclerodermia, fibromyalgia vagy reumás láz. 3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett autoimmun betegség sclerosis multiplex (MS). 4. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett gyógyszer késlelteti a kitörések fellépését MS¹ben szenvedõ egyedben, vagy késlelteti az MS kifejlõdését (progresszív fázis) MS¹ben szenvedõ egyedben. 5. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett transzplantátum vese, máj, szív, tüdõ, bél, hema-
2
topoietikus és csontvelõ, bõr, végtag, szaruhártya, hasnyálmirigy, õssejt és sejtterápia, és graftok vagy biológiai anyagok közül megválasztott. 6. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az em5 lített gyógyszer orális, szubkután, intraperitoneális vagy intravénás beadásra alkalmas. 7. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett gyógyszer egy további hatóanyaggal kombinációban van beadva, amely autoimmun betegségek vagy 10 transzplantátumkilökõdés megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmas. 8. A 7. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett további hatóanyag, amely autoimmun betegségek vagy transzplantátumkilökõdés megelõzésére és/vagy 15 kezelésére alkalmas, egy, az MTA¹t tartalmazó gyógyszerkészítménnyel egyidejûleg vagy nem egyidejûleg való beadásra alkalmas különálló készítmény formájában van beadva.
10
HU 007 183 T2 Int. Cl.: A61K 31/7076
11
HU 007 183 T2 Int. Cl.: A61K 31/7076
12
HU 007 183 T2 Int. Cl.: A61K 31/7076
13
HU 007 183 T2 Int. Cl.: A61K 31/7076
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
