(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000005333T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 005 333

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C07K 14/415

(21) Magyar ügyszám: E 05 812763 (22) A bejelentés napja: 2005. 12. 02. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050812763 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1817330 A2 2006. 06. 08. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1817330 B1 2008. 12. 10.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 20282004 2004. 12. 02.

(73) Jogosult: BIOMAY AG, 1090 Wien (AT)

AT

(72) Feltalálók: WESTRITSCHNIG, Kerstin, A-1180 Vienna (AT); FOCKE, Margarete, A-1140 Vienna (AT); VALENT, Peter, A-1180 Vienna (AT); KELLER, Walter, A-8111 Graz (AT); VALENTA, Rudolf, A-2604 Theresienfeld (AT) (54)

(2006.01) A61K 38/16 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06058359 PCT/AT 05/000486

(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest

Fehérjeallergén-származékok

(57) Kivonat

HU 005 333 T2

A találmány tárgyát csökkent allergénaktivitású, vad típusú fehérjeallergén-származékok és más allergénszármazékok elõállítására szolgáló eljárás képezi, amit az alábbi lépések jellemeznek: vad típusú, allergénakti-

vitású fehérjeallergén elõállítása, a vad típusú fehérjeallergén két, csökkent allergénaktivitású vagy hiányzó allergénaktivitású részre szabása és a két fragmentum fordított orientációban történõ összekapcsolása.

A leírás terjedelme 60 oldal (ezen belül 14 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 005 333 T2

A találmány tárgyát vad típusú, fehérjeeredetû allergének allergénaktivitásának csökkentésére szolgáló eljárás, újszerû allergénszármazékok és allergia elleni vakcinálási stratégiák képezik. Az allergia a normális esetben ártalmatlan, idegen (azaz nem saját) anyagok („allergének”) elleni reagálási képesség specifikus, örökletes vagy szerzett megváltozása. Az allergia az érintett szervrendszerekben (bõr, kötõhártya, orr, garat, a bronchiális nyálkahártya, gyomor- és bélrendszer) fellépõ gyulladásos reakciókkal, azonnali betegségi szimptómákkal, mint például allergén orrnyálkahártya-gyulladás, kötõhártya-gyulladás, bõrgyulladás, anafilaxiás sokk és asztma, és krónikus betegségek jelentkezésével – például késõi stádiumú asztmás reakciók és atópiás bõrgyulladás – jár együtt. Az I¹es típusú allergia a világ iparosodott lakosságának körülbelül 20%¹át érintõ, genetikailag meghatározott túlérzékenységi betegség. Patofiziológiailag az l¹es típusú allergiát a máskülönben ártalmatlan antigének (allergének) elleni „E” immunglobulin (IgE) antitestek termelése fémjelzi. Jelenleg az allergia egyetlen, a betegség kiváltó okaira irányuló kezelési módja az allergénre specifikus immunterápia, ahol allergénre specifikus érzékenység megszüntetésének indukálása céljából a betegnek növekvõ dózisban allergént adnak be. Bár számos vizsgálat már kimutatta az allergénre specifikus immunterápia klinikai hatásosságát, az ezt mozgató mechanizmus még nem teljesen tisztázott. Az allergénre specifikus immunterápia fõ hátránya az, hogy függ a természetes allergén kivonatának alkalmazásától, és ilyen kivonatot – legalábbis ipari termelési szinten – nehéz, illetve gyakorlatilag lehetetlen standardizálni. Ilyen természetes allergénkivonatok különféle allergén és nem allergén vegyületekbõl állnak, és e tény következtében lehetséges, hogy bizonyos allergének nincsenek jelen a beadott kivonatban, vagy – ami még ennél is rosszabb – a kezelés során betegek új IgE-specificitások fejlõdjenek ki az összetevõkre. A kivonaton alapuló kezelés egy másik hátránya abból a ténybõl ered, hogy biológiailag aktív allergénkészítmények beadása anafilaxiás mellékhatásokat indukálhat. Az allergének jellemzésének területén a molekuláris biológiai eljárások alkalmazása lehetõvé tette minden releváns, környezeti allergént kódoló cDNS¹ek izolálását és a rekombináns allergének elõállítását. Ilyen rekombináns allergének alkalmazásával végzett in vitro diagnosztikai eljárásokkal (azaz allergénre specifikus IgE antitestek kimutatása szérumban) vagy in vivo teszteléssel meg lehet határozni a kérdéses beteg reaktivitási profilját. E technológia alapján lehetségesnek tûnt a beteg reaktivitási profiljára illesztett, új, komponensalapú, allergia – különösen l¹es típusú allergia – elleni vakcinálási stratégiákat kifejleszteni. A rekombináns allergének és azok természetes hasonmásai közötti hasonlóság miatt azonban a rekombináns allergének is jelentõs allergénaktivitást mutatnak. Mivel a rekombináns allergének teljes mértékben utánozzák a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

vad típusú allergének allergénaktivitását, a természetes allergéneket alkalmazó immunterápiában az ezen allergénaktivitással kapcsolatos akadályok a rekombináns allergének esetében is fennállnak. Az immunterápia javítása céljából a rekombináns allergének allergénaktivitását olyan mértékben le kell csökkenteni, hogy az allergének beadandó dózisát úgy lehessen növelni, hogy közben az anafilaxiás mellékhatások kockázata alacsony legyen. Korábban már indítványozták, hogy csak T¹sejteredetû epitópokat tartalmazó peptidek beadásával kizárólag az allergénre specifikus T¹sejtek aktivitását kellene befolyásolni. A T¹sejt-eredetû epitópok az intakt allergének antigénbemutató sejtek általi proteolitikus emésztésekor keletkezett kisméretû peptidek. Ilyen T¹sejt-eredetû epitópok szintetikus peptidekként elõállíthatók. Azonban a T¹sejt-eredetû epitópokkal eddig végzett vizsgálatok gyenge eredményeket és alacsony hatékonyságot mutattak. A T¹sejt-eredetû peptiden alapuló immunterápia alacsony hatékonyságának számos magyarázata már mérlegelés tárgyát képezte: elõször, bonyolult lehet a T¹sejt-aktiválás helyett T¹sejt-tolerancia eléréséhez szükséges optimális dózist beadni. Másodszor, a testben a kisméretû T¹sej-tepitóp-peptidek féléletideje rövid. Harmadszor, számottevõ bizonyíték gyûlt össze arra nézve, hogy atópiás egyedekben az IgE-termelés emlékezõ (memory) immunválasz, amelyhez nem szükséges de novo osztályváltás, és így azt nem lehet T¹sejtbõl származó citokinekkel szabályozni. Ennélfogva kizárólag a T¹sejt-eredetû epitópok beadásán alapuló kezelési módok ugyan módosíthatják az allergénspecifikus T¹sejtek aktivitását, ám kevéssé befolyásolják a már bekapcsolt emlékezõ (memory) B¹sejtek általi, allergénspecifikus IgE antitestek elõállítását. Felmerült továbbá a hipoallergén allergénszármazékok vagy ¹fragmentumok rekombináns DNS-technológiával vagy peptidszintézissel történõ elõállítása is. Az ilyen származékok vagy fragmentumok T¹sejt-epitópokat hordoznak, és a natív allergén IgE általi felismerésével versengõ IgG antitesteket indukálhatnak. Több mint 20 évvel ezelõtt már kimutatták, hogy allergének proteolitikus emésztése olyan, kisebb allergénfragmentumokat eredményezett, amelyek megtartották IgE-kötõ képességüket, viszont azonnali típusú reakciókat nem váltottak ki. Bár az allergének proteolízisét bonyolult szabályozni és standardizálni, a molekuláris biológia új távlatokat nyitott az IgE¹t kötõ haptének elõállítása terén. Az ilyen, IgE¹t kötõ hapténekrõl úgy gondolják, hogy az anafilaxiás mellékhatásokkal járó aktív immunizálásra és passzív terápiára alkalmasak az allergénnel való érintkezést megelõzõen az effektorsejthez kötött IgE telítése, és így az allergén által indukált mediátor felszabadulásának blokkolása révén. Egy másik felvetés a hipoallergén allergénváltozatok génsebészeti úton történõ elõállítására irányul, amely azon a megfigyelésen alapul, hogy természetes körülmények között az allergének gyakran csak néhány aminosavban különbözõ és/vagy alacsony IgEkötõ képességû konformációjú izoformákként fordulnak

1

HU 005 333 T2

elõ. Például a nyírfapollen fõ allergénjének, a Bet v 1¹nek génsebészeti úton végzett oligomerizálása nagymértékben csökkent allergénaktivitású rekombináns trimert eredményezett. Más lehetõségként felvetették, hogy a pontmutációk bevitele vagy konformációváltozásokat okoz az allergén szerkezetében, megrongálva ezzel a nem folytonos IgE-epitópokat, vagy pedig közvetlenül befolyásolja az IgE-kötõ képességet [Valenta és munkatársai, Biol. Chem. 380, 815–824 (1999)]. Kimutatták már azt is, hogy az allergén néhány részre (például két részre) való fragmentálása – az allergén natívhoz hasonló felgombolyodásának elvesztése miatt – csaknem a teljes, IgE-kötõ képesség és allergénaktivitás elvesztéséhez vezet [Vrtala és munkatársai J. Clin. Invest. 99, 1673–1681 (1997) a Bet v 1 esetében; Twardosz és munkatársai, BBRC 239, 197–204 (1997) a Bet v4¹nél; Hayek és munkatársai, J. Immunol. 161, 7031–7039 (1998) az Aln g 4¹nél; Zeiler és munkatársai, J. Allergy Clin. Immunol. 100, 721–727 (1997) a borjúszõr (dander)-allergénnél; Elfman, Int. Arch. Allergy lmmunol. 117, 167–173 (1998) a Lep d2¹nél; és Westritschnig, J. Immunol. 172, 5684–5692 (2004) a Phl p 7¹nél; stb.)]. A fõként nem folytonos/konformációs IgE-epitópokat tartalmazó fehérjék fragmentálása az allergén IgE-kötõ képességének lényeges mértékû csökkenéséhez vezet. Ezen ismeret alapján a technikában megvizsgálták azt, hogy az ilyen hipoallergén allergénfragmentumok képesek¹e pozitív immunválaszt indukálni in vivo [Westritschnig és munkatársai (Curr. Opinion in Allergy and Clin. Immunol. 3, 495–500 (2003)]. Vrtala és munkatársai [Methods, 32, 313–320 (2004)] allergének hipoallergén molekulákká való átalakítására irányuló stratégiákat írnak le. E stratégiákban allergénfragmentumokat, mutáns allergéneket és kémiailag módosított allergénszármazékokat állítanak elõ. Az EP 1 403 280 számú európai közzétételi irat tárgyát komócsinpollen-eredetû Phl p 7 allergénbõl származó hipoallergén molekulát tartalmazó vakcinák képezik. Niederberger és munkatársai közleményükben [PNAS 101, 14677–14682 (2004)] a genetikailag módosított allergének, különösen a rekombináns Bet v 1 fragmentumok vakcinálásra történõ alkalmazását írják le. Valenta és munkatársai [Science, 253, 557–560 (1991)] a profilinek szekvenciájával nagymértékben homológ, nyírfapollen-allergén azonosítását írják le. A cikk szerzõi felismerték, hogy allergiás egyedekbõl származó IgE antitestek egyaránt képesek kötõdni a nyírfaprofilinhez és az emberi profilinhez. A találmány szerinti megoldás egyik célja a fentiekben megadott ismeretanyag alapján módokat és eljárásokat szolgáltatni az allergia elleni tökéletesített immunterápia számára. Az ilyen eljárásoknak és módoknak az anafilaxiás sokk alacsony kockázata mellett hatékonynak kell lennie, ezenkívül könnyen alkalmazhatónak és az adott egyedi beteg szükségleteinek megfelelõen adaptálhatónak, illetve ipari léptékekre könnyen átalakíthatónak kell lennie. Ennélfogva a találmány tárgyát csökkent allergénaktivitású, vad típusú fehérjeallergén-származékok elõ-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

állítására szolgáló eljárás képezi, amit az alábbi lépések jellemeznek: vad típusú, allergénaktivitású fehérjeallergén elõállítása, a vad típusú fehérjeallergén két, csökkent allergénaktivitású vagy hiányzó allergénaktivitású részre történõ szabása és a két fragmentum fordított orientációban történõ ismételt összekapcsolása. A találmány szerinti eljárás azon a tényen alapul, hogy fõként nem folytonos/konformációs IgE-epitópokat tartalmazó fehérjék fragmentálása az allergén IgEkötõ képességének lényeges mértékû csökkenéséhez vezet. Azonban bizonyos allergének fragmentumai egy adott védõ antitestválasz indukálásához nem eléggé immunogének [Westritschnig és munkatársai, (2004)]. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával olyan, új és meghatározott fehérjeallergén-származékokat biztosítunk, amelyek kombinálják a T¹sejt- és B¹sejtepitópon alapuló megközelítések elõnyeit. Ugyanekkor a csak fragmentumokkal vagy bonyolult elrendezésû fragmentumokkal (például IgE-kötõ haptének és két vagy több fragmentum keverése, azaz „shuffling”) végzett vakcinálás hátrányai a találmány szerinti allergénszármazékoknál nem fordulnak elõ. A találmány szerinti megoldással ténylegesen kimutatható volt, hogy optimális eredmények érhetõk el az olyan szerkezettel, amely – a szerkezeti elemek teljességét tekintve – leginkább emlékeztet a vad típusú allergénre (azaz a vad típusú allergén minden aminosavát illetõen), azonban annak allergénhatása nélkül (vagy lényegesen csökkent allergénhatása mellett). Természetes, hogy ha az allergénszármazékok elõállítása során csak néhány aminosav hiányzik (deletálva lett), vagy hozzá lett adva (be lett illesztve), vagy ha a részek valamilyen közvetlen kombinálás helyett linkerrel vannak összekapcsolva, a találmány szerinti elõnyök ettõl még megmaradnak. Az allergénaktivitás ilyen csökkentése vagy megszüntetése az allergének meghatározott fragmentumokra való osztásának ismert és általános alapelvei szerint történik. Ezen általános alapelv mellett a találmány szerinti megoldásban fordított orientációban ismételten összekapcsoljuk az allergénbõl elõállított két részt, amely az allergén lényegében minden szerkezeti információját tartalmazó allergénszármazékokat eredményez (mivel a találmány szerinti allergénszármazékok tartalmazzák az összes vagy csaknem az összes aminosavszekvenciát), de allergénaktivitásuk a vad típusú allergénéhez képest alacsony (vagy egyáltalán nincs). Ezek a találmány szerinti „fej-farok” származékok alkalmas egyedi és hatékony immunterápiát tesznek lehetõvé az allergiás betegek esetében, amely származékok elõállításának léptéke rutinlépésekkel könnyen fokozható. A találmány szerinti származékok védõ IgG antitesteket indukálnak, amelyek a betegben blokkolják az IgE kötõdését a vad típusú allergénhez, és gátolják az allergén által indukált bazofil degranulációt. A találmány szerinti eljárás specifikusan alkalmazható a rekombináns DNS-technológiában. Miután a

1

HU 005 333 T2

származék génsebészeti úton elõállításra került, alkalmas gazdákban végzett ipari léptékû transzgénexpresszióval jelentõs mennyiségben könnyen kinyerhetõ. A találmány szerinti allergénszármazékok elõnyösen elõállíthatók nagy expressziós kapacitású gazdában. A találmány szerint módosítható elõnyös allergének közé tartozik például a www.allergen.org/List.htm hon-

5

2

lapon elérhetõ minden fontosabb fehérjeallergén. A találmány szerinti allergének specifikusan elõnyös csoportjaiba tartoznak az alábbi allergének: profilinek, különösen a Phl p 12, nyírfaeredetû allergének, különösen a Bet v 4, poratkaallergének, különösen a Der p 2, készletatka-eredetû allergének, különösen a Lep d 2, réti komócsin-eredetû allergének, különösen a Ph1 p 7, és az A) táblázatban felsorolt allergének.

A) táblázat A találmány szerint, keveréssel („shuffling”) módosítandó, elõnyös allergének (referenciapéldákkal együtt) Allergének Fajnév Az allergén neve

Biokémiai azonosító vagy nem használt név

MW

cDNS (C) vagy fehérje (F)

Hivatkozás, nyilvántartási szám

Ambrosia artemisiifolia Parlagfû Amb a 1

E antigén

a

C

8, 20

Amb a 2

K antigén

38

C

8, 21

Amb a 3

Ra3

11

C

22

Amb a 5

Ra5

5

C

11, 23

Amb a 6

Ra6

10

C

24, 25

Amb a 7

Ra7

12

F

26

4,4

C

9, 10, 27

Art v 1

27–29

C

28

Art v 2

35

F

28A

Ambrosia trifida Óriás parlagfû Arab t 5

Ra5G

Artemisia vulgaris Fekete üröm

Art v 3

lipidtranszfer-fehérje

12

F

53

Art v 4

profilin

14

C

29

Helianthus annuus Napraforgó Hel a 1 Hel a 2

34

29A

profilin

15,7

C

Y15210

profilin

14–15

C

Y13271

17

C

AY049012, 29B

Mercurialis annua Mer a 1 Caryophyllales Chenopodium album Fehér libatop Che a 1 Fehér libaparéj Che a 2

profilin

14

C

AY082337

Che a 3

polkalcin

10

C

AY082338

43

F

29C

Salsola kali Homoki ballagófû Sal k 1

4

HU 005 333 T2

A) táblázat (folytatás) Allergének Fajnév Az allergén neve


MW



C

AY335187

Rosales Humulus japonicus Japán komló Hum j 4w Parietaria judaica Par j 1

lipidtranszfer-fehérje 1

C

lásd izoallergének felsorolása

Par j 2

lipidtranszfer-fehérje 2

15

C


Par j 3

profilin

C


Parietaria officinalis Par o 1


15

29D

B) Füvek Poales Cynodon dactylon Csillagpázsit Cyn d 1

32

C

30, S83343

C

31, X91256

14

C

31a, Y08390

9

C

AF517686

adatok

függõben C

AF517685

F

függõben

Cyn d 7 Cyn d 12

profilin

Cyn d 15 Cyn d 22w

enoláz

Cyn d 23

Cyn d 14

9

Cyn d 24

patogenezissel kapcsolatos p.

21

AgDgl

32

F

32

11

C

33, S45354

C

33A, U25343

31

F

34

60

–

Dactylis glomerata Csomós ebír Dae g 1 Dae g 2 Dae g 3 Dae g 5 Festuca pratensis Réti csenkesz Fes p 4w Holcus lanatus Pelyhes selyemperje Hoi l 1

C

Z27084

Lolium perenne Angolperje Lol p 1

I. csoport

27

C

35, 36

Lol p 2

XI. csoport

11

F

37, 37A, X73363

Lol p 3

III. csoport

11

F

38

Lol p 5

Lol p IX, Lol p 1b

31/35

C

34, 39

Lol p 11 horn:

tripszin inhibitor

16

5

39A

HU 005 333 T2



MW



C

40, S80654

Phalaris aquatica Gumós pántlikafû Pha a 1 Phleum pratense Réti komócsin Phl p 1

C

X78813

Phl p 2

C

X75925, 41

Phl p 4

F

41A

Phl p 5

27

Ag25

32

Phl p 6 Phl p 11

tripszin inhibitor hom.

Phl p 12

profilin

Phl p 13

poligalakturonáz

20

C

42

C

Z27082, 43

C

AF521563, 43A

C

X77583, 44

55–60

C

AJ238848

33

F

46

31/34

C

34, 47

C

48

14,3

C

Asturias p. c.

17

C

S50892

C


C

M65179

C

X79267

Poa pratensis Réti perje Poa p 1

I. csoport

Poa p 5 Sorghum halepense Fenyércirok Sor h 1 C) Fák Arecales Phoenix dactylifera Datolyapálma Pho d 2

profilin

Fagales Alnus glutinosa Enyves éger Aln g 1 Betula verrucosa Bibircses nyír Bet v 1 Bet v 2

17 profilin

15

Bet v 3 Bet v 4 Bet v 6 h: Bet v 7

izoflavon-reduktáz ciklofilin

8

C

X87153, S54819

33,5

C


18

F

P81531

17

C


Carpinus betulus Gyertyán Car b 1

6

HU 005 333 T2



MW



22

F

52

F

53

C


Castanea sativa Szelídgesztenye Cas s 1 cas s 5

kitináz

Cas s 8


9,7

Corylus avellana Közönséges mogyoró Cor a 1 Cor a 2

17 profilin

14

C

Cor a 8


9

C

Cor a 9 IIS

globulinszerû fehérje

40/?

C

Beyer p. c.

Cor a 10

luminális kötõfehérje

70

C

AJ295617

vicilinszerû fehérje

49

C

AF441864

17

F

54

20

F

58A, AF526295

20

F

58A

16

C

59, 60

15–18

C

60A

32

F

P80741

16

F

P80740

Ole e 6

10

C

60C, U86342

Ole e 7

1

F

60D, P81430

Ca2+-kötõ fehérje

21

C

60E, AF078679

Ole e 9

b-1,3-glükanáz

46

C

AF249675

Ole e 10

glikozilhidroláz hom.

11

C

60F, AY082335

20

F

58A

Cor a 11 7S Quercus alba Fehér tölgy Que a 1 Lamiales Oleaceae Fraxinus excelsior Magaskõris ash Fra e 1 Ligustrum vulgare Fagyal Lig v 1 Olea europea Olajfa Ole e 1 Ole e 2

profilin

Ole e 3

9,2

Ole e 4 Ole e 5

Ole e 8

szuperoxid-dizmutáz

60B

Syringa vulgaris Orgona Syr v 1 Plantaginaceae

7

HU 005 333 T2



MW



18

F

P842242

41–45

C

55, 56

C

57, D29772

43

C

A1243570

Cup s 1

43

C


Cup s 3w

34

C

hivatkozás függõben

43

F

P81294

C

57A, AJ404653

30

F

57B, P81295

29

C

57C, AF031471

50

F

58

43

F

P81825, 58B

Pla a 1

18

F

P82817

Pla a 2

43

F

P82967

10

F

Iris p. c.

14*

C

AJ006774

Plantago lanceolata Lándzsás útifû Pla l 1 Pinales Cryptomeria japonica Japán szugifenyõ Cry j 1 Cry j 2 Cupressus arizonica Arizoniai ciprus Cup a 1 Cupressus sempervirens Európai ciprus

Juniperus astiei Hegyi cédrus Jun a 1 Jun a 2 Jun a 3 Juniperus oxycedrus Vörös boróka Jun o 4 hom:

kalmodulin

Juniperus sabinoides Hegyi boróka Jun s 1 Juniperus virginiana Virginiai boróka Jun v 1 Platanaceae Platanus acerifolia Juharlevelû platán

Pla a 3


D) Atkák Acarus siro

arthropoda

Atka Aca s 13

zsírsavkötõ-feh.

Blomia tropicalis Atka

8

HU 005 333 T2



MW



Bio t 1

ciszteinproteáz

39

C

AF277840

Bio t 3

tripszin

24*

C

Cheong p. c.

Bio t 4

a-amiláz

56

C

Cheong p. c.

C

U59102

25

C

Cheong p. c.

Bio t 5 Bio t 6

kimotripszin

Bio t 10

tropomiozin

33

C

61

Bio t 11

paramiozin

110

C

AF525465, 61A

Bio t 12

Btlla

C

U27479

Bio t 13

Bt6, zsírsavkötõ-feh.

Bio t 19

antimikrobiális pep. hom.

C

U58106

C

Cheong p. c.

C

69

C

70, 70A, lásd izoallergének felsorolása

30

C

63

24–31

C

SW:Q26456, 71

C

72

7,2

Dermatophagoides farinae Poratka Der f 1

ciszteinproteáz

25

Der f 2 Der f 3

14 tripszin

Der f 7 Der f 10

tropomiozin

Der f 11

paramiozin

Der f 14

mag3, apolipoforin

Der f 15

98k kitináz

Der f 16 Der f 17 Der f 18w

98

C

72A

C

D17S86

98

C

AF178772

gelzolin/villin

53

C

71A

Ca-kötõ EF fehérje

53

C

71A

60k kitináz

60

C

Weber p. c.

ciszteinproteáz

25

F

6B

C

62, lásd izoallergének felsorolása

C

62A–C, lásd izoallergének felsorolása

Dermatophagoides microceras Poratka Der m 1 Dermatophagoides pteronyssinus Házi poratka Der p 1

25

antigén PI, ciszteinproteáz

Der p 2

14

Der p 3

tripszin

28/30

C

63

Der p 4

amiláz

60

F

64

Der p 5

14

c

65

Der p 6

kimotripszin

25

F

Der p 7

22/28

c

67

Der p 8

glutationtranszferáz

C

67A

Der p 9

kollagenolitikus szerinpro.

F

67B

9

66

HU 005 333 T2



MW



Der p 10

tropomiozin

36

C

Y14906

Der p 14

apolipoforinszerû feh.

C

Epton p. c.

C


C

AF149827

C

72B, lásd izoallergének felsorolása

C

73, 74, 74A, lásd izoallergének felsorolása

Lep d 5

C

75, AJ250278

Lep d 7

C

75, AJ271058

Euroglyphus maynei Atka Eur m 2 Eur m 14

apolipoforin

177

Glycyphagus domesticus Házi atka Gly d 2 Lepidoglyphus destructor Szénaatka Lep d 2 Lep d 1

Lep d 10

15

tropomiozin

C

75A, AJ250096

C

75, AJ250279

C

75B, ¥12690

C

76, lásd izoallergének felsorolása

11

C

L39834

C

M18780

Lep d 13 Tyrophagus putrescentiae Korhadékatka Tyr p 2 E) Állatok Bos domesticus Szarvasmarha Bos d 2 Ag3

20

lipokalin

(lásd még élelmiszerek) Bos d 3

Ca-kötõ S100 hom.

Bos d 4

a-laktalbumin

14,2

Bos d 5

b-lactoglobulin

18,3

C

X14712

Bos d 6

szérumalbumin

67

C

M73993

Bos d 7

immunoglobulin

160

Bos d 8

kazeinek

77

20–30

77

Canis familiaris (Canis domesticus) Kutya Can f 1

25

Can f 2 Can f 3

27 albumin

Can f 4

18

10

C

78, 79

C

78, 79

C

S72946

F

A59491

HU 005 333 T2



MW



Equ c 1

lipokalin

25

C

070823

Equ c 2

lipokalin

18,5

F

79A, 79B

Equ c 3

Ag3 – albumin

67

C

79C, X74045

Equus caballus Ló

Equ c 4 Equ c 5

17

F

79D

AgX

17

F

Goubran Botros p. c.

cat-1

38

C

15

Felis domesticus Macska (nyál) Fel d 1 Fel d 2

albumin

C

79E, X84842

Fel d 3

cisztatin

11

C

79F, AF238996

Fel d 4

lipokalin

22

C

AY497902

Fel d 5w

immunoglobulin A

Fel d 6w

immunoglobulin M

400

Adedoyin p. c.

Fel d 7w

immunoglobulin G

150

lipokalin homológ

20

F

SW:P83507, 80

17

F

SW:P83508

19

C

81, 81A

17

C

82, 83

Alt a 1

28

C

082633

Alt a 2

25

C

83A, U62442

800–1000

Adedoyin p. c. Adedoyin p. c.

Cavia porcellus Tengerimalac Cav p 1 Cav p 2 Mus musculus Egér (vizelet) Mus m 1

MUP

Rattus norvegius Patkány (vizelet) Rat n 1 F) Fungi (penészek) 1. Ascomycota 1.1 Dothideales Altemaria alternata

Alt a 3

hõsokk feh.

70

C

087807, U87808

Alt a 4

feh. diszulfidizomeráz

57

C

X84217

Alt a 6

savas riboszomális feh. P2

11

C

X78222, U87806

Alt a 7

YCP4 fehérje

22

C

X78225

Alt a 10

aldehid-dehidrogenáz

53

C

X78227, P42041

Alt a 11

enoláz

45

C

082437

Alt a 12

savas riboszomális feh. PI

11

C

X942V6

Cladosporium herbarum Cla h 1

13

11

83B, 83C

HU 005 333 T2



MW

Cla h 2


23 53


83B, 83C

Cla h 3

aldehid-dehidrogenáz

C

X78228

Cla h 4

savas riboszomális feh. P2

11

C

X78223

Cla h 5

YCP4 fehérje

22

C

X78224

Cla h 6

enoláz

46

C

X78226

Cla h 12

savas riboszomális feh. PI

11

C

X851B0

alkalikus szerinproteáz

34

1.2 Eurotiales Aspergillus flavus Asp fl 13

84

Aspergillus fumigatus Asp f 1

18

C

M83781, S39330

Asp f 2

37

C

056938

19

C

020722

30

C

AJ001732

40

C

Z30424

26,5

C

053561

12

C

AJ223315

11

C

AJ224333

34

C

AJ223327

C

X85092

Asp f 3

peroxiszomális fehérje

Asp f 4 Asp f 5

metalloproteáz

Asp f 6

Mn szuperoxid-dizmut.

Asp f 7 Asp f 8

riboszomális feh. P2

Asp f 9 Asp f 10

aszpartil-proteáz

34

Asp f 11

peptidil-prolil-izomeráz

24

Asp f 12

hõsokk feh. P90

90

Asp f 13


34

Asp f 15

16

Asp f 16

43

Asp f 17 Asp f 18 Asp f 22w Asp f 23

vakuoláris szerinproteáz

34

84A C

85 34B

C

AJ002026

C

g3643813

C

AJ224865 84C

enoláz

46

C

AF2B4645

1.3 riboszomális fehérje

44

C

85A, AF464911

Aspergillus niger Asp n 14

b-xilozidáz

105

C

AF108944

Asp n 18


34

C

84B

Asp n 25

3-fitáz B

66–100

C

85B, P34754

85

C

Z84377

Asp n ? Aspergillus oryzae Asp o 13


34

C

X17561

Asp o 21

TAKA-amiláz A

53

C

D00434, M33218


33

Penicillium brevicompactum Pen b 13 Penicillium chrysogenum (korábban P. notatum)

12

86A

HU 005 333 T2



MW



Pen ch 13


34

87

Pen ch 18


32

87

Pen ch 20

N-acetil glukózaminidáz

68

87A

Pen c 3

peroxiszomális mem feh.

18

86B

Pen c 13


33

Pen c 19

hõsokk feh P70

70

C

U64207

enoláz

46

C

AF254643

C

AY363911

Penicillium citrinum

Pen c 22w Pen c 24

b1 elongációs faktor

86A

Penicillium oxalicum Pen o 18


34

87B

Fus c 1

riboszomális feh P2

11*

C

AY077706

Fus c 2

tioredoxinszerû feh

13*

C

AY077707

Tri r 2

C

88

Tri r 4 szerinproteáz

C

88

30

F

88A

83

C

88

40

C

89

29

C

AY136739*

20

C

J04984, J04985

1.3 Hypocreales Fusarium culmorum

1.4 Onygenales Trichophyton rubrum

Trichophyton tonsurans Tri t 1 Tri t 4

szerinproteáz

1.5 Saccharomycetales Candida albicans Cand a 1 Cand a 3

peroxiszomális fehérje

Candida boidinii Cand b 2 2. Basidiomycotina 2.1 Hymenomycetes Psilocybe cubensis Psi c 1 Psi c 2

ciklofilin

16

leucincipzár-fehérje

11

89A

Coprinus eomatus Gyapjas tintagomba Cop c 1

C

AJ132235

Cop c 2

AJ242791

Cop c 3

AJ242792

Cop c 5

AJ242793

Cop c 7

AJ242794

2.2 Uredinioraycetes

13

HU 005 333 T2



MW



Rho m 1

enoláz

47

C

89B

Rho m 2


31

C

AY547285

Mala f 2

MF1, peroxiszomális membránfehérje

21

C

AB011804, 90

Mala f 3

MF2, peroxiszómális membránfehérje

20

C

AB011805, 90

Mala f 4

mitokondriális malát-dehidrogenáz

35

C

AF084828, 90A

C

X96486, 91

Rhodotorula mucilaginosa

2.3 Ustilaginomycetes Malassezia furfur

Malassezia sympodialis Mala s 1 Mala s 5

18*

C

AJ011955

Mala s 6

17*

C

AJ0U956

C

AJ011957, 91A

Mala s 7 Mala s 8

19*

C

AJ011958, 91A

Mala s 9

37*

C

AJ011959, 91A

Mala s 10

hõsokk feh. 70

86

C

AJ42B052

Mala s 11


23

C

AJ54B421

szerinproteáz

30

F

SW¹.P83340, 91B

apiráz

68

C

L12389

37

C

M33157

3. Deuteromycotina 3.1 Tuberculariales Epicoccum purpurascens (korábban E. nigrum) Bpi p 1 G) Rovarok Aedes aegypti Egyiptomi csípõszúnyog Aed a 1 Aed a 2 Apis mellifera Mézelõ méh Api m 1

foszfolipáz A2

16

C

92

Api m 2

hialuronidáz

44

C

93

Api m 4

melittin

3

C

94

F

Kettner p. c.

COB szerinproteáz

39

C

AY127579

foszfolipáz

16

F

95

Api m 6 Api m 7

7–8

Bombus pennsylvanicus „Bumble” (zümmögõ) méh Bom p 1

14

HU 005 333 T2


Bom p 4


MW

proteáz



F

95

Blattella germanica Német csótány Bla g 1 Bd90k Bla g 2

C aszpartil-proteáz

36

C

96

Bla g 4

kalicin

21

C

97

Bla g 5

glutationtranszferáz

22

C

98

Bla g 6

troponin C

27

C

98

Periplaneta americana Amerikai csótány Per a 1

Cr-PII

Per a 3

Cr-PI

Per a 7

C 72–78

C

98A

tropomiozin

37

C

Y14854

tropomiozin

32,5*

C

AJ012184

hemoglobin

16

C

99

Chi t 1.01

III komponens

16

C

P02229

Chi t 1.02

IV komponens

16

C

P02230

Chi t 2.0101

I komponens

16

C

E02221

Chi t 2.0102

IA komponens

16

C

P02221

Chi t 3

II¹b komponens

16

C

P02222

Chi t 4

IIIA komponens

16

C

P02231

Chi t 5

VI komponens

16

C

P02224

VIIA komponens

16

C

P02226

Chironomus kiiensis Árvaszúnyog Chi k 10 Chironomus thummi thummi Árvaszúnyog Chi t 1–9

Chi t 6.01 Chi t 6.02

IX komponens

16

C

P02223

Chi t 7

VIIB komponens

16

C

P02225

Chi t 8

VIII komponens

16

C

P02227

Chi t 9

X komponens

16

C

P02228

Mlb

27

C

AF231352

25

C

15

F

Ctenocephalides felis felis Macskabolha Cte f 1 Cte f 2 Cte f 3 Thaumetopoea pityocampa Fenyõ-búcsújárólepke Tha p 1 Lepisma saccharina Ezüstös pikkelyke

15

PIR:A59396, 99A

HU 005 333 T2



MW



tropomiozin

36

C

AJ309202

Dol m 1

foszfolipáz A1

35

C

100

Dol m 2

hialuronidáz

44

C

101

Dol m 5

antigén 5

23

C

102, 103

antigén 5

23

C

104

Pol a 1

foszfolipáz A1

35

F

105

Pol a 2

hialuronidáz

44

F

105

Pol a 5

antigén 5

23

C

104

Lep s 1 Dolichovespula maculata ‚‚White face” (fehérpofájú) lódarázs

Dolichovespula arenaria „Yellow” (sárga) lódarázs Dol a 5 Polistes annularies Darázs

Polistes dominulus Déli papírdarázs Pol d 1 Pol d 4

Hoffman p. c. szerinproteáz

32–34

C

Pol d 5

Hoffman p. c. P81656

Polistes exclamans Darázs Pol e 1

foszfolipáz A1

34

F

107

Pol e 5

antigén 5

23

C

104

antigén 5

23

C

106

antigén 5

24

C

P83377

antigén 5

23

C

106

Vesp c 1

foszfolipáz

34

F

107

Vesp c 5

antigén 5

23

C

106

Polistes fuscatus Darázs Pol f 5 Polistes gallicus Franciadarázs Pol g 5 Polistes metricus Darázs Pol m 5 Vespa crabo Lódarázs

Vespa mandarins Lódarázs Vesp m 1

Hoffman p. c.

Vesp in 5

P81657

16

HU 005 333 T2



MW



antigén 5

23

C

106

antigén 5

23

C

106

Vespula flavopilosa Darázs Ves f 5 Vespula germanica Német darázs Ves g 5 Vespula maculifrons Darázs Ves m 1

foszfolipáz A1

33,5

C

108

Ves m 2

hialuronidáz

44

F

109

Ves m 5

antigén 5

23

C

104

antigén 5

23

C

106

antigén 5

23

C

106

antigén 5

23

C

106

Ves v 1

foszfolipáz A1

35

C

105A

Ves v 2

hialuronidáz

44

F

105A

Ves v 5

antigén 5

23

C

104

Myr p 1

C

X70256

Myr p 2

C

S81785

Vespula pennsylvanica Darázs Ves p 5 Vespula squamosa Darázs Ves s 5 Vespula vidua Ves vi 5 Vespula vulgaris Kecskedarázs

Myrmecia pilosula Ugróhangya

Solenopsis geminata Tûzhangya Sol g 2

Hoffman p. c.

Sol g 4

Hoffman p. c.

Solenopsis invicta Tûzhangya Sol i 2

13

C

110, 111

Sol i 3

24

C

110

Sol i 4

13

C

110

Solenopsis saevissima Brazil tûzhangya Sol s 2

Hoffman p. c.

17

HU 005 333 T2



MW



prokalin

20

C

AF179004, 111A.

allergén M

12

C

112, 113

parvalbumin

12

C

X97824

Bos d 4

a-laktalbumin

14,2

C

M18780

(Tej) Bos d 5

b-laktoglobulin

18,3

C

X14712

Bos d 6

szérumalbumin

67

C

M73993

Bos d 7

immunoglobulin

160

Bos d 8

kazeinek

Triatoma protracta Tria p 1 H) Élelmiszerek Gadus callarias Tõkehal Gad c 1 Salmo salar Lazac Sal s 1 Bos domesticus Szarvasmarha

Lásd még állatok 77

20–30

77

Gallus domesticus Tyúk Gal d 1

ovomukoid

28

C

114, 115

Gal d 2

ovalbumin

44

C

114, 115

Gal d 3

Ag22, konalbumin

78

C

114, 115

Gal d 4

lizozim

14

C

114, 115

Gal d 5

szérumalbumin

69

C

X60688

C

U08008

Metapenaeus ensis Dél-csendes-óceáni nagy garnéla Met e 1

tropomiozin

Penaeus aztecus Ostorgarnéla Pen a 1

tropomiozin

36

F

116

tropomiozin

34

C

116a

Pen m 1

tropomiozin

38

C

Pen m 2

arginikináz

40

C

AF479772, 117

tropomiozin

38

F

117A

Penaeus indicus Indiai fehér garnéla Pen i 1 Penaeus monodon Óriás tigrisgarnéla

Todarodes pacificus Kalmár Tod p 1

18

HU 005 333 T2



MW



tropomiozin

36

C

Y14855, 117B

Helix aspersa Pettyes éticsiga Hel as 1 Haliotis midae Midász-fülcsiga Hal m 1

49

117C

Rana esculenta Kecskebéka Ran e 1

a-parvalbumin

11,9*

C

AJ315959

Ran e 2

b-parvalbumin

11,7*

C

AJ414730

2S albumin

14

C

118

2S albumin

15

F

118A, P80208

hom: prohevein

25

Hor v 15

BMAI-1

15

C

119

Hor v 16

a-amiláz

Hor v 17

b-amiláz

Hor v 21

g¹3 hordein

34

C

119A

Brassica juncea Barna mustár Bra j 1 Brassica napus Repce Bra n 1 Brassica rapa Tarlórépa Bra r 2

P81729

Hordeum vulgare Árpa

SW:P80198 Secale cereale Rozs Sec c 20

secalin


Triticum aestivum Búza Tri a 18

agglutinin

Tri a 19

W¹5 gliadin

65

F

PIR:A59156

lipidtranszfer-feh.

9

F

P19656

C

119B, 031771

Zea mays Kukorica Zea m 14 Oryza sativa Rizs Ory s 1 Apium graveolens Zeller

19

HU 005 333 T2



MW



Api g 1

hom: Bet v 1

16*

C

Z48967

Api g 4

profilin

AF129423

Api g 5

55/58

F

P81943

C

117D, izoallergének felsorolása

C

AF456482

Daucus carota Murok Dau c 1 Dau c 4

16

hom: Bet v 1 profilin

Corylus avellana Közönséges mogyoró Cor a 1.04

hom: Bet v 1

17

C


Cor a 2

profilin

14

C

AF327622

Cor a 8


9

C

AF329829

C


Malus domestica Nemes alma Mai d 1 hom: Mai d 2 hom: Mai d 3 Mai d 4

Bet v 1 taumatin lipidtranszfer-fehérje

9 14,4*

profilin

C

AJ243427

C

Pastorello p. c.

C


Pyrus communis Nemes körte Pyr c 1

hom: Bet v 1

18

C

AF05730

Pyr c 4

profilin

14

C

AF129424

Pyr c 5

hom: izoflavon-reduktáz

33,5

C

AF071477

32

C

Z78202

C

U93165

Persea americana Avokádó Pers a 1

endokitináz

Prunus americana Kajszibarack Pru ar 1

hom: Bet v 1

Pru ar 3


9

F

Prunus avium Vadcseresznye Pru av 1

hom: Bet v 1

C

U66076

Pru av 2

hom: taumatin

C

032440

Pru av 3


10

C

AF221501

Pru av 4

profilin

15

C

AF129425


9

F

119C

Prunus domestica Szilva Pru d 3

20

HU 005 333 T2



MW



Prunus persica Õszibarack Pru p 3


10

F

P81402

Pru p 4

profilin

14

C



9

F

119D

Asparagus officinalis Közönséges spárga Aspa o 1 Crocus sativus Sáfrány Cro s 1

21

Varasteh A¹R p. c.


9

Vieths p. c.


9

F

P80274

profilin

15

C

AF37794 8

Ana c 1

profilin

15

C

AF377949

Ana c 2

bromelain

22,8*

C

119E–G, D14059

Lactuca sativa Saláta Lac s 1 Vitis vinifera Szõlõ Vit v 1 Musa x paradisiaca Termesztett banán Mus xp 1 Ananas comosus Termesztett ananász

Citrus limon Közönséges citrom Cit l 3


9

F

Torrejon p. c.

Cit s 1

germinszerû fehérje

23

F

Torrejon p. c.

Cit s 2

profilin

14

F

Torrejon p. c.

Cit s 3


9

F

Torrejon p. c.

profilin

15

C

AY049013

2S albumin

14

C

120

HPS

7

F

120A

8

F

A57106

Citrus sinensis Narancs

Litchi chinensis Licsiszilva Lit c 1 Sinapis alba Mustár Sin a 1 Glycine max Szója Gly m 1 Gly m 2

21

HU 005 333 T2



MW



Gly m 3

profilin

14

C


Gly m 4

(SAM22) PR¹10 feh.

17

C

X60043, 120B

PR¹10 fehérje

15

C

AY792956

63,5

C

L34402

Vigna radiata Mungbab Vig r 1 Arachis hypogaea Földimogyoró Ara h 1

vicilin

Ara h 2

konglutin

17

C

L77197

Ara h 3

glicinin

60

C

AF093541

Ara h 4

glicinin

37

C

AF086821

Ara h 5

profilin

15

C

AF059616

Ara h 6

hom: konglutin

15

C

AF092846

Ara h 7

hom: konglutin

15

C

AF091737

Ara h 8

PR¹10 fehérje

17

C

AY32B08B

Len c 1

vicilin

47

C


Len c 2

magbiotinilált feh.

66

F

120C

Lens culinaris Lencse

Pisum savitum Borsó Pis s 1

vicilin

44

C


Pis s 2

convicilin*

63

C

pending

Act c 1

ciszteinproteáz

30

F

P00785

Act c 2

taumatinszerû fehérje

24

F

SW:P81370, 121

ozmotinszerû fehérje

23

C

AJ297410

profilin

14

C

AJ417552

Lye e 1

profilin

14

C

AJ417553

Lye e 2

b-fruktofuranozidáz

50

C


Lye e 3

lipidtranszfer-feh.

6

C

081996

Sola t 1

patatin

43

F

P15476

Sola t 2

katepszin D inhibitor

21

F

P16348

Sola t 3

ciszteinproteáz-inhibitor

21

F

P20347

Actinidia chinensis Kivi

Capsicum annuum Csemegepaprika Cap a 1w Cap a 2 Lycopersicon esculentum Paradicsom

Solanum tuberosum Burgonya

22

HU 005 333 T2


Sola t 4


MW



aszpartil-proteáz-inhibitor

16+4

F

P30941

Ber e 1

2S albumin

9

C

P04403, M17146

Ber e 2

11S globulin magbeli tárolófehérje

29

C

AY221641

Jug n 1

2S albumin

19*

C

AY102930

Jug n 2

vicilinszerû feh.

56*

C

AY102931

C

U66866

Bertholletia excelsa Paradió

Juglans nigra Fekete dió

Juglans regia Dió Jug r 1

2S albumin

Jug r 2

vicilin

44

C

AF066055

Jug r 3


9

F

Pastorello

Ana o 1

vicilinszerû fehérje

50

C


Ana o 2

leguminszerû fehérje

55

C

AF453947

Ana o 3

2S albumin

14

C

AY081BS3

C

P01089

Anacardium occidentale Kesudió

Ricinus communis Csodafa Ric c 1

2S albumin

Sesamum indicum Szezám Ses i 1

2S albumin

9

C

121A, AF240005

Ses i 2

2S albumin

7

C

AF091841

Ses i 3

7S vicilinszerû globulin

45

C

AF240006

Ses i 4

oleozin

17

C

AAG23840

Ses i 5

oleozin

15

C

AAD42942

Cue m 1

szerinproteáz

66

C

D32206

Cue m 2

profilin

14

C

AY271295

Cue m 3

patogenezissel kapcs. p. PR¹1

16*

F

P83834

24

F

121B, A59069

97

C

AF173004

Cucumis melo Sárgadinye

I) Egyebek Anisakis simplex Fonálféreg Ani s 1 Ani s 2

paramiozin

23

HU 005 333 T2


Ani s 3


MW



tropomiozin

41

C

121C, Y19221

9

F

P83885

17

C

AJ697694

10

F

122

23,4*

C

122A, M15203

53

F

122B

58

F

123, 124

34/36

C

125

24

F

126, 127

100–115

F

128

Ani s 4 Argas reflexus Galambkullancs Arg r 1 Ascaris suum Sertés orsóféreg Ase s 1 Carica papaya Papaja Car p 3w

papain

Dendronephthya nipponica Vörös lágykorall Den n 1 Hevea brasiliensis Kaucsukfa Hev b 1

elongációs faktor

Hev b 2

1,3-glükanáz

Hev b 3 Hev b 4

mikrohélix-komplex komponense

Hev b 5

16

C

042640

Hev b 6.01

hevein. prekurzor

20

C

M36986, p02877

Hev b 6.02

hevein

5

C

M36986, p02877

Hev b 6.03

C-terminális fragmentum

14

C

M36986, p02877

Hev b 7.01

hom: patatin B¹szérumból

42

C

O80598

Hev b 7.02

hom: patatin C¹szérumból

44

C

AJ223038

C


Hev b 8

14

profilin

Hev b 9

enoláz

51

C

AJ132580

Hev b 10


26

C


Hev b 11

1. osztály kitináz

C


Hev b 12


Hev b 13

észteráz

C

AY057860

42

9,3

F

P83269

Hom s 1

73*

C

Y14314

Hom s 2

10,3*

C

X80909

Hom s 3

20,1*

C

X89985

Hom s 4

36*

C

Y17711

Hom s 5

42,6*

C

P02538

Homo sapiens Emberi autoallergének

24

1

HU 005 333 T2

2



MW



1. osztály kitináz

38,5

F

Kespohl p. c.

Triplochiton scleroxylon Abachi Trip s 1

Hivatkozások 1. Marsh, D. G., and L. R. Freidhoff. 1992. ALBE, an allergen database. IUIS, Baltimore, MD, Edition 1.0. 2. Marsh, D. G., L Goodfriend, T. P. King, H. Lowenstein, and T. A. E. Platts-Mills. 1986. Allergen nomenclature. Bull WHO 64: 767–770. 3. King, T. P., P. S. Norman, and J. T. Cornell. 1964. Isolation and characterization of allergen from ragweed pollen. II. Biochemistry 3: 458–468. 4. Lowenstein, H. 1980. Timothy pollen allergens. Allergy 35: 188–191. 5. Aukrust, L. 1980. Purification of allergens in Cladosporium herbarum. Allergy 35: 206–207. 6. Demerec, M, E. A. Adelberg, A. J. Clark, and P. E. Hartman. 1966. A proposal for a uniform nomenclature in bacterial genetics. Genetics 54: 61–75. 7. Bodmer, J. G., E. D. Albert, W. F. Bodmer, B. Dupont, H. A. Erlich, B. Mach, S. G. E. Marsh, W. R. Mayr, P. Parham, T. Sasuki, G. M. Th. Schreuder, J. L Strominger, A. Svejgaard, and P. I. Terasaki. 1991. Nomenclature for factors of the HLA system, 1990. Immunogenetics 33: 301–309. 8. Griffith, I. J., J. Pollock, D. G. Klapper, B. L. Rogers, and A. K. Nault. 1991. Sequence polymorphism of Amb a I and Amb a II, the major allergens in Ambrosia artemisiifolia (short ragweed). Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 96: 296–304. 9. Roebber, M., D. G. Klapper, L. Goodfriend, W. B. Bias, S. H. Hsu, and D. G. Marsh. 1985. Immunochemical and genetic studies of Amb t V (Ra5G), an Ra5 homologuefrom giant ragweed pollen. J. Immunol. 134: 3062–3069. 10. Metzler, W. J., K. Valentine, M. Roebber, M. Friedrichs, D. G. Marsh, and L Mueller. 1992. Solution structures of ragweed allergen Amb t V. Biochemistry 31: 5117–5127. 11. Metzler, W. J., K. Valentine, M. Roebber, D. G. Marsh, and L. Mueller. 1992. Proton resonance assignments and three-dimensional solution structure of the ragweed allergen Amb a V by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry 31: 8697–8705. 12. Goodfriend, L., A. M. Choudhury, J. Del Carpio, and T. P. King. 1979. Cytochromes C: New ragweed pollen allergens. Fed. Proc. 38: 1415.

15 13. Ekramoddoullah, A. K. M., F. T. Kisil, and A. H. Sehon. 1982. Allergenic cross reactivity of cytochrome c from Kentucky bluegrass and perennial ryegrass pollens. Mol. Immunol. 19: 1527–1534. 14. Ansari, A. A., E. A. Killoran, and D. G. Marsh. 1987. 20 An investigation of human response to perennial ryegrass (Lolium perenne) pollen cytochrome c (Lol p X). J. Allergy Clin. Immunol. 80: 229–235. 15. Morgenstern, J. P., I. J. Griffith, A. W. Brauer, B. L. Rogers, J. F. Bond, M. D. Chapman, and M. Kuo. 25 1991. Amino acid sequence of Fel d I, the major allergen of the domestic cat: protein sequence analysis and cDNA cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9690–9694. 16. Griffith, I. J., S. Craig, J. Pollock, X. Yu, J. P. Mor30 genstern, and B. L.Rogers. 1992. Expression and genomic structure of the genes encoding Fdl, the major allergen from the domestic cat. Gene 113: 263–268. 17. Weber, A., L. Marz, and F. Altmann. 1986. Charac35 teristics of the asparagine-linked oligosaccharide from honeybee venom phospholipase A2. Comp. Biochem. Physiol. 83B: 321–324. 18. Weber, A., H. Schroder, K. Thalberg, and L. Marz. 1987. Specific interaction of IgE antibodies with a 40 carbohydrate epitope of honey bee venom phospholipase A2. Allergy 42: 464–470. 19. Stanworth, D. R., K. J. Dorrington, T. E. Hugli, K. Reid, and M. W. Turner. 1990. Nomenclature for synthetic peptides representative of immunoglobu45 lin chain sequences. Bulletin WHO 68: 109–111. 20. Rafhar, T., I. J. Griffith, M. C. Kuo, J. F. Bond, B. L. Rogers, and D. G. Klapper. 1991. Cloning of Amb a I (Antigen E), the major allergen family of short ragweed pollen. J. Biol. Chem. 266: 1229–1236. 50 21. Rogers, B. L., J. P. Morgenstern, I. J. Griffith, X. B. Yu, CM. Counsell, A. W. Brauer, T. P. King, R. D. Garman, and M. C. Kuo. 1991. Complete sequence of the allergen Amb a II: recombinant expression and reactivity with T cells from ragweed allergic pa55 tients. J. Immunol. 147: 2547–2552. 22. Klapper, D. G., L. Goodfriend, and J. D. Capra. 1980. Amino acid sequence of ragweed allergen Ra3. Biochemistry 19: 5729–5734. 23. Ghosh, B., M. P. Perry, T. Rafhar, and D. G. Marsh. 60 1993. Cloning and expression of immunologically 25

1

HU 005 333 T2

active recombinant Amb a V allergen of short ragweed (Ambrosia artemisiifolia) pollen. J. Immunol. 150: 5391–5399. 24. Roebber, M., R. Hussain, D. G. Klapper, and D. G. Marsh. 1983. Isolation and properties of a new short ragweed pollen allergen, Ra6. J. Immunol. 131: 706–711. 25. Lubahn, B., and D. G. Klapper. 1993. Cloning and characterization of ragweed allergen Amb a VI (abst). J. Allergy Clin. Immunol. 91: 338. 26. Roebber, M., and D.G. Marsh. 1991. Isolation and characterization of allergen Amb a VII from short ragweed pollen. J. Allergy Clin. Immunol. 87: 324. 27. Goodfriend L, Choudhury AM, Klapper DG, Coulter KM, Dorval G, DelCarpio J, Osterland CK. Ra5G, a homologue of Ra5 in giant ragweed pollen: isolation, HLA-DR-associated activity and amino acid sequence. Mol Immunol 22: 899–906, 1985. 28. Himly M, Jahn-Schmid B, Dedic A, Kelemen P, Wopfner N, Altmann F, van Ree R, Briza P, Richter K, Ebner C, Ferreira F. Art v 1, the major allergen of mugwort pollen, is a modular glycoprotein with a defensin-like and a hydroxyproline-rich domain. FASEB J 17: 106–108, 2003. 28A. Nilsen, B. M., K. Sletten, M. O’Neill, B. Smestead Paulsen, and H. van Halbeek. 1991. Structural analysis of the glycoprotein allergen Artv II from pollen of mugwort (Artemesia vulgaris). J. Biol. Chem. 266: 2660–2668. 29. Wopfner N, Willeroidee M, Hebenstreit D, van Ree R, Aalbers M, Briza P, Thalhamer J, Ebner C, Richter K, Ferreira F. Molecular and immunological characterization of profilin from mugwort pollen. Biol Chem 383: 1779–1789, 2002. 29A. Jimenez A, Moreno C, Martinez J, Martinez A, Bartolome B, Guerra F, Palacios R 1994. Sensitization to sunflower pollen: only an occupational allergy Int Arch Allergy Immunol 105: 297–307. 29B Barderas R, Villalba M, Lombardero M, Rodriguez R. Identification and characterization of Che a I allergen from Chenopodium album pollen. Int Arch Allergy Immunol 127: 47–54, 2002. 29C. Carries J, Fernandez-Caldas E, Casanovas M, Lahoz C, Colas C. Immunochemical characterization of Salsola kali pollen extracts. Allergy 56, Supplement 68: 274, 2001. 29D. Giuliani A, Pini C, Bonini S, Mucci N, Ferroni L, Vicari G: Isolation and purification of a major allergen from Parietaria officinalis pollen. Allergy 42: 434–440, 1987. 30. Smith, P. M., Suphioglu, C., Griffith, I. J., Theriault, K., Knox, R. B. and Singh, M. B. 1996. Cloning and expression in yeast Pichia pastoris of a biologically active form of Cyn d l, the major allergen of Bermuda grass pollen. J. Allergy Clin. Immunol. 98: 331–343. 31. Suphioglu. C., Ferreira. F. and Knox. R. B. 1997. Molecular cloning and immunological characterisation of Cyn d 7, a novel calcium-binding allergen

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 26

2

from Bermuda grass pollen. FEBS Lett. 402:167–172. 31a. Asturias JA, Arilla MC, Gomez-Bayon N, Martinez J, Martinez A, and Palacios R. 1997. Cloning and high level expression of Cynodon dactylon (Bermuda grass) pollen profilin (Cyn d 12) in Escherichia coli: purification and characterization of the allergen. Clin Exp Allergy 27: 1307–1313. 32. Mecheri, S., G. Peltre, and B. David. 1985. Purification and characterization of a major allergen from Dactylis glomerata pollen: The Ag Dg I. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 283–289. 33. Roberts, A. M., L. J. Bevan, P. S. Flora, I. Jepson, and M. R. Walker. 1993. Nucleotide sequence of cDNA encoding the Group II allergen of Cocksfoot/Orchard grass (Dactylis glomerata), Dae g II. Allergy 48: 615–623. 33a. Guerin-Marchand, C., Senechal, H., Bouin, A. P., Leduc-Brodard, V., Taudou, G., Weyer, A., Peltre, G. and David, B. 1996. Cloning, sequencing and immunological characterization of Dae g 3, a major allergen from Dactylis glomerata pollen. Mol. Immunol. 33: 797–806. 34. Klysner, S., K. Welinder, H. Lowenstein, and F. Matthiesen. 1992. Group V allergens in grass pollen IV. Similarities in amino acid compositions and amino terminal sequences of the group V allergens from Lolium perenne, Poa pratensis and Dactylis glomerata. Clin. Exp. Allergy 22: 491–497. 35. Perez, M., G. Y. Ishioka, L. E. Walker, and R. W. Chesnut. 1990. cDNAcloning and immunological characterization of the rye grass allergen Lol p I. J. Biol. Chem. 265: 16210–16215. 36. Griffith, I. J., P. M. Smith, J. Pollock, P. Theerakulpisut, A. Avjioglu, S. Davies, T. Hough, M. B. Singh, R. J. Simpson, L. D. Ward, and R. B. Knox. 1991. Cloning and sequencing of Lol p I, the major aliergenic protein of ryegrass pollen. FEBS Letters 279: 210–215. 37. Ansari, A. A., P. Shenbagamurthi, and D. G. Marsh. 1989. Complete amino acid sequence of a Lolium perenne (perennial rye grass) pollen allergen, Lol p II. J. Biol. Chem. 264: 11181–11185. 37a. Sidoli, A., Tamborini, E., Giuntini, 1., Levi, S., Volonte, G., Paini, C., De Lalla, C., Siccardi, A. G., Baralle, F. E., Galliani, S. and Arosio, P. 1993. Cloning, expression, and immunological characterization of recombinant Lolium perenne allergen Lol p II. J. Biol. Chem. 268: 21819–21825. 38. Ansari, A. A., P. Shenbagamurthi, and D. G. Marsh. 1989. Complete primary structure of a Lolium perenne (perennial rye grass) pollen allergen, Lol p III: Comparison with known Lol p 1 and II sequences. Biochemistry 28: 8665–8670. 39. Singh, M. B., T. Hough, P. Theerakulpisut, A. Avjioglu, S. Davies, P. M. Smith, P. Taylor, R. J. Simpson, L. D. Ward, J. McCluskey, R. Puy, and R. B. Knox. 1991. Isolation of cDNA encoding a newly identified major allergenic protein of rye-grass pol-

1

HU 005 333 T2

len: Intracellular targeting to the amyloplost. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 1384–1388. 39a. van Ree R, Hoffman DR, van Dijk W, Brodard V, Mahieu K, Koeleman CA, Grande M, van Leeuwen WA, Aalberse RC. 1995. Lol p XI, a new major grass pollen allergen, is a member of a family of soybean trypsin inhibitor-related proteins. J Allergy Clin Immunol 95: 970–978. 40. Suphioglu, C. and Singh, M. B. 1995. Cloning, sequencing and expression in Escherichia coli of Pha a 1 and four isoforms of Pha a 5, the major allergens of canary grass pollen. Clin. Exp. Allergy 25: 853–865. 41. Dolecek, C., Vrtala, S., Laffer, S., Steinberger, P., Kraft, D., Scheiner, O. and Valenta, R. 1993. Molecular characterization of Ph1 p II, a major timothy grass (Phleum pratense) pollen allergen. FEBS Lett. 335: 299–304. 41A. Fischer S, Grote M, Fahlbusch B, Muller WD, Kraft D, Valenta R. 1996. Characterization of Ph1 p 4, a major timothy grass (Phleum pratense) pollen allergen. J Allergy Clin Immunol 98: 189–198. 42. Matthiesen, F., and H. Lowenstein. 1991. Group V allergens in grass pollens. I. Purification and characterization of the group V allergen from Phleum pratense pollen, Ph1 p V. Clin. Exp. Allergy 21: 297–307. 43. Petersen, A., Bufe, A., Schramm, G., Schlaak, M. and Becker, W. M. 1995. Characterization of the allergen group VI in timothy grass pollen (Ph1 p 6). II. cDNA cloning of Ph1 p 6 and structural comparison to grass group V. Int. Arch. Allergy Immunol. 108: 55–59. 43A. Marknell DeWitt A, Niederberger V, Lehtonen P, Spitzauer S, Sperr WR, Valent P, Valenta R, Lidholm J. Molecular and immunological characterization of a novel timothy grass (Phleum pratense) pollen allergen, Ph1 p 11. Clin Exp Allergy 32: 1329–1340, 2002. 44. Valenta. R., Ball. T., Vrtala. S., Duchene. M., Kraft. D. and Scheiner. O. 1994. cDNA cloning and expression of timothy grass (Phleum pratense) pollen profilin in Escherichia coli: comparison with birch pollen profilin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 199: 106–118. 46. Esch, R. E., and D. G. Klapper. 1989. Isolation and characterization of a major cross-reactive grass group I allergenic determinant. Mol. Immunol. 26: 557–561. 47. Olsen, E., L. Zhang, R. D. Hill, F. T. Kisil, A. H. Sehon, and S. Mohapatra. 1991. Identification and characterization of the Poa p IX group of basic allergens of Kentucky bluegrass pollen. J. Immunol. 147: 205–211. 48. Avjioglu, A., M. Singh, and R. B. Knox. 1993. Sequence analysis of Sorh I, the group I allergen of Johnson grass pollen and it comparison to rye-grass Lol p I (abst). J. Allergy Clin. Immunol. 91: 340. 52. Kos T, Hoffmann-Sommergruber K, Ferreira F, Hirschwehr R, Ahorn H, Horak F, Jager S, Sperr W,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 27

2

Kraft D, Scheiner O. 1993. Purification, characterization and N¹terminal amino acid sequence of a new major allergen from European chestnut pollenCas s 1. Biochem Biophys Res Commun 196: 1086–92. 53. Diaz-Perales A, Lombardero M, Sanchez-Monge R, Garcia-Selles FJ, Pernas M, Fernandez-Rivas M, Barber D, Salcedo G. 2000. Lipid-transfer proteins as potential plant panallergens: cross-reactivity among proteins of Artemisia pollen, Castaneae nut and Rosaceae fruits, with different IgE-binding capacities. Clin Exp Allergy 30: 1403–1410. 54. Ipsen, H., and O. C. Hansen. 1991. The NH2-terminal amino acid sequence of the immunochemically partial identical major allergens of alder (Alnus glutinosa) Aln g 1, birch (Betula verrucosa) Bet v I, hornbeam (Carpinus betulus) Car b I and oak (Quercus alba) Que a I pollens. Mol. Immunol. 28: 1279–1288. 55. Taniai, M., S. Ando, M. Usui, M. Kurimoto, M. Sakaguchi, S. Inouye, and T. Matuhasi. 1988. N¹terminal amino acid sequence of a major allergen of Japanese cedar pollen (Cry j I). FEBS Lett. 239: 329–332. 56. Griffith, I. J., A. Lussier, R. Garman, R. Koury, H. Yeung, and J. Pollock. 1993. The cDNA cloning of Cry j I, the major allergen of Cryptomeria japonica (Japanese cedar) (abst). J. Allergy Clin. immunol. 91: 339. 57. Sakaguchi, M., S. Inouye, M. Taniai, S. Ando, M. Usui, and T. Matuhasi. Identification of the second major allergen of Japanese cedar pollen. Allergy 45: 309–312, 1990. 57A. Yokoyama M, Miyahara M, Shimizu K, Kino K, Tsunoo H. Purification, identification, and cDNA cloning of Jun a 2, the second major allergen of mountain cedar pollen. Biochem Biophys Res Commun 275: 195–202, 2000. 57B. Midoro-Horiuti T, Goldblum RM, Kurosky A, Wood TG, Brooks EG. Variable Expression of Pathogenesis-Related Protein Allergen in Mountain Cedar (Juniperus ashei) Pollen. J Immunol 164: 2188–2192, 2000. 57C. Tinghino R., Barletta B., Palumbo S., Afferni C, Iacovacci P., Mari A., Di Felice G., Pini. C. Molecular characterization of a cross-reactive Juniperus oxycedrus pollen allergen, Jun o 2: a novel calciumbinding allergen J. Allergy Clin. Immunol. 101: 772–777, 1998. 58. Gross GN, Zimburean JM, Capra JD. Isolation and partial characterization of the allergen in mountain cedar pollen. Scand J Immunol 8: 437–441, 1978. 58A. Obispo TM, Melero JA, Carpizo JA, Carreira J, Lombardero M. The main allergen of Olea europaea (Ole e I) is alo present in other species of the oleaceae family. Clin Exp Allergy 23: 31–316, 1993. 58B. Midoro-Horiuti T, Goldblum RM, Brooks EG. Identification of mutations in the genes for the pollen allergens of eastern red cedar (Juniperus virginiana).

1

HU 005 333 T2

Clin Exp Allergy 31: 771–778, 2001. 59. Lombardero M., Barbas J. A., Moscoso del Prado J., Carreira J. cDNA sequence analysis of the main olive allergen, Ole e I. Clin. Exp. Allergy 24: 765–770, 1994. 60. Villalba, M., E. Batanero, C. Lopez-Otin, L. M. Sanchez, R. I. Monsalve, M. A. Gonzalez de la Pena, C. Lahoz, and R. Rodriguez. Amino acid sequence of Ole e I, the major allergen from olive tree pollen (Olea europaea). Eur. J. Biochem. 216: 863–869, 1993. 60A. Asturias JA, Arilla MC, Gomez-Bayon N, Martinez J, Martinez A, Palacios R. Cloning and expression of the panallergen profilin and the major allergen (Ole e I) from olive tree pollen. J Allergy Clin Immunol 100: 365–372, 1997. 60B. Batanero E, Villalba M, Ledesma A Puente XS, Rodriguez R. Ole e 3, an olive-tree allergen, belongs to a widespread family of pollen proteins. Eur J Biochem 241: 772–778, 1996. 60C. Batanero E, Ledesma A, Villalba M, Rodriguez R. Purification, amino acid sequence and immunological characterization of Ole e 6, a cysteine-enriched allergen from olive tree pollen. FEBS Lett. 410: 293–296, 1997. 60D. Tejera ML, Villalba M, Batanero E, Rodriguez R. Identification, isolation, and characterization of Ole e 7, a new allergen of olive tree pollen. J Allergy Clin Immunol 104: 797–802, 1999. 60E. Ledesma A, Villalba M, Rodriguez R. Cloning, expression and characterization of a novel four EF¹hand Ca(2+)-binding protein from olive pollen with allergenic activity. FEBS Lett 466: 192–196, 2000. 60F. Barral P, Batanero E, Palomares O, Quiralte J, Villalba M, Rodriguez R. A major allergen from pollen defines a novel family of plant proteins and shows intra- and interspecies [correction of interspecie] cross-reactivity. J Immunol 172: 3644–3651, 2004. 61. Yi FC, Cheong N, Shek PC, Wang DY, Chua KY, Lee BW. Identification of shared and unique immunoglobulin E epitopes of the highly conserved tropomyosins in Blomia tropicalis and Dermatophagoides pteronyssinus. Clin Exp Allergy 32: 1203–1210, 2002. 61A. Ramos JD, Cheong N, Lee BW, Chua KY. cDNA cloning and expression of Bio t 11, the Blomia tropicalis allergen homologous to paramyosin. Int Arch Allergy Immunol 126: 286–293, 2001. 62. Chua, K. Y., G. A. Stewart, and W. R. Thomas. Sequence analysisof cDNA encoding for a major house dust mite allergen, Derp I.J. Exp. Med. 167: 175–182, 1988. 62A. Chua, K. Y., C. R. Doyle, R. J. Simpson, K. J. Turner, G. A. Stewart, and W. R. Thomas. Isolation of cDNA coding forthe major mite allergen Derp II by IgE plaque immunoassay. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91: 118–123, 1990. 62B. Smith AM, Benjamin DC, Derewenda U, Smith WA, Thomas WR, Chapman MD. Sequence poly-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 28

2

morphisms and antibody binding to the group 2 dust mite allergens. Int Arch Allergy Immunol 124: 61–63, 2001. 62C. Smith AM, Benjamin DC, Hozic N, Derewenda U, Smith WA, Thomas WR, Gafvelin G, van HageHamsten M, Chapman MD. The molecular basis of antigenic cross-reactivity between the group 2 mite allergens. J Allergy Clin Immunol 107: 977–984, 2001. 63. Smith WA, Thomas WR. Comparative analysis of the genes encoding group 3 allergens from Dermatophagoides pteronyssinus and Dermatophagoides farinae. Int Arch Allergy Immunol 109: 133–140, 1996. 64. Lake, F. R., L. D. Ward, R. J. Simpson, P. J. Thompson, and G. A. Stewart. House dust mite-derived amylase: Allergenicity and physicochemical characterisation. J. Allergy Clin. Immunol. 87: 1035–1042, 1991. 65. Tovey, E. R., M. C. Johnson, A. L. Roche, G. S. Cobon, and B. A. Baldo. Cloning and sequencing of a cDNA expressing a recombinant house dust mite protein that binds human IgE and corresponds to an important low molecular weight allergen. J. Exp. Med. 170: 1457–1462, 1989. 66. Yasueda, H., T. Shida, T. Ando, S. Sugiyama, and H. Yamakawa. 1991. Allergenic and proteolytic properties of fourth allergens from Dermatophagoides mites. In: „Dust Mite Allergens and Asthma. Report of the 2nd international workshop” A. Todt, Ed., UCB Institute of Allergy, Brussels, Belgium, pp. 63–64. 67. Shen, H.¹D., K.¹Y. Chua, K.¹L. Lin, K.¹H. Hsieh, and W. R. Thomas. Molecular cloning of a house dust mite allergen with common antibody binding specificities with multiple components in mite extracts. Clin. Exp. Allergy 23: 934–940, 1993. 67A. O’Neil GM, Donovan GR, Baldo BA. Cloning and charaterisation of a major allergen of the house dust mite Dermatophagoides pteronyssinus, homologous with glutathione S¹transferase. Biochim Biophys Acta,1219: 521–528, 1994. 67B. King C, Simpson RJ, Moritz RL, Reed GE, Thompson PJ, Stewart GA. The isolation and characterization of a novel collagenolytic serine protease allergen (Der p 9) from the dust mite Dermatophagoides pteronyssinus. J Allergy Clin Immunol 98: 739–747, 1996. 68. Lind P, Hansen OC, Horn N. The binding of mouse hybridoma and human IgE antibodies to the major fecal allergen, Derp I of D. pteronyssinus. J. Immunol. 140: 4256–4262, 1988. 69. Dihvorth, R. J., K. Y. Chua, and W. R. Thomas. Sequence analysis of cDNA coding for a major house dust allergn Der f I. Clin. Exp. Allergy 21: 25–32, 1991. 70. Nishiyama, C., T. Yunki, T. Takai, Y. Okumura, and H. Okudaira. Determination of three disulfide bonds in a major house dust mite allergen, Derf II. Int. Arch. Allergy Immunol. 101: 159–166, 1993.

1

HU 005 333 T2

70A. Trudinger, M., K. Y. Chua, and W. R. Thomas. cDNA encoding the major dust mite allergen Derf II. Clin. Exp. Allergy 21: 33–38, 1991. 71. Shen HD, Chua KY, Lin WL, Hsieh KH, Thomas WR. Molecular cloning and immunological characterization of the house dust mite allergen Der f 7. Clin Exp Allergy 25: 1000–1006, 1995. 71A. Tategaki A, Kawamoto S, Aki T, Jyo T, Suzuki O, Shigeta S, Ono K. Newly described house dust mite allergens. ACI International suppl. 1: 74–76, 2000. 72. Aki T, Kodama T, Fujikawa A, Miura K, Shigeta S, Wada T, Jyo T, Murooka Y, Oka S, Ono K. Immunochemical characteristion of recombinant and native tropomyosins as a new allergen from the house dust mite Dermatophagoides farinae. J Allergy Clin Immunol 96: 74–83, 1995. 72A. Tsai L, Sun Y, Chao P, Ng H, Hung M, Hsieh K, LiawS, ChuaK. Sequence analysis and expression of acDNA clone encoding a 98¹kDa allergen in Dermatophagoides farinae. Clin Exp Allergy 29: 1606–1613, 1999. 72B. Gafvelin G, Johansson E, Lundin A, Smith AM, Chapman MD, Benjamin DC, Derewenda U, Van Hage-Hamsten M. Cross-reactivity studies of a new group 2 allergen from the dust mite Glycyphagus domesticus, Gly d 2, and group 2 allergens from Dermatophagoides pteronyssinus, Lepidoglyphus destructor, and Tyrophagus putrescentiae with recombinant allergens. J Allergy Clin Immunol 107: 511–518, 2001. 73. van Hage-Hamsten, M., T. Bergman, E. Johansson, B. Persson, H. Jornvall, B. Harfast, and S. G. O. Johansson. N¹terminal amino acid sequence of major allergen of the mite lepidoglyphus destructor (abst). J, Allergy Clin. Immunol. 91: 353, 1993. 74. Varela J, Ventas P, Carreira J, Barbas JA, Gimenez-Gallego G, Polo F. Primary structure of Lep d I, the main Lepidoglyphus destructor allergen. Eur J Biochem 225: 93–98, 1994. 74A. Schmidt M, van der Ploeg I, Olsson S, van Hage Hamsten M. The complete cDNA encoding the Lepidoglyphus destructor major allergen Lep d I. FEBS Lett 370: 11–14, 1995. 75. Eriksson TLJ, Rasool O, Huecas S, Whitley P, Crameri R, Appenzeller U, Gafvelin G, van HageHamsten M. Cloning of three new allergens from the dust mite Lepidoglyphus destructor using phage surface display technology. Eur. J. Biochem. 268: 287–294, 2001. 75A. Saarne T, Kaiser L, Rasool O, Huecas S, van Hage-Hamsten M, Gafvelin G: Cloning and characterisation of two IgE-binding proteins, homologous to tropomyosin and a¹tubulin, from the mite Lepidoglyphus destructor. Int Arch Allergy Immunol 130: 258–265, 2003. 75B. Eriksson TL, Johansson E, Whitley P, Schmidt M, Elsayed S, van Hage-Hamsten M. Cloning and characterisation of a group II allergen from the dust mite Tyrophagus putrescentiae. Eur. J. Biochem. 251 (1–2), 443–447, 1998.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 29

2

76. Rautiainen J, Rytkonen M, Pelkonen J, Pentikainen J, Perola O, Virtanen T, Zeiler T, Mantyjarvi R. BDA20, a major bovine dander allergen characterized at the sequence level is Bos d 2. Submitted. 77. Gjesing B, Lowenstein H. Immunochemistry of food antigens. Ann Allergy 53: 602, 1984. 78. deGroot, H., K. G. H. Goei, P. van Swieten, and R. C. Aalberse. Affinity purification of a major and a minor allergen from dog extract: Serologic activity of affiity-purified Can f 1 and Can f 1¹depleted extract. J. Allergy Clin. Immunol. 87: 1056–1065, 1991. 79. Konieczny, A. Personal communication; Immunologic Pharmaceutical Corp. 79A. Bulone, V. Separation of horse dander allergen proteins by two-dimensional electrophoresis. Molecular characterisation and identification of Equ c 2.0101 and Equ c 2.0102 as lipocalin proteins. Eur J Biochem 253: 202–211, 1998. 79B. Swiss-Prot ace. P81216, P81217. 79C. Dandeu J. P., Rabillon J., Divanovic A., Carmi-Leroy A., David B. (1993). Hydrophobic interaction chromatography for isolation and purification of Equ c l, the horse major allergen. J. Chromatogr. 621: 23–31. 79D. Goubran Botros H., Rabillon J., Gregoire C., David B., Dandeu J. P. 1998. Thiophilic absorption chromatography: purification of Equ c 2 and Equ c 3, two horse allergens from horse sweat. J. Chromatogr. B 710: 57–65. 79E. Hilger C, Kohnen M, Grigioni F, Lehners C, Hentges F. Allergic cross-reactions between cat and pig serum albumin. Allergy 52: 179–187, 1997; and Hilger C, Grigioni F, Hentges F. Sequence of the gene encoding cat (Felis domesticus) serum albumin. Gene 169: 295–296, 1996. 79F. Ichikawa K, Vailes LD, Pomes A, Chapman MD. Molecular cloning, expression and modeling of cat allergen, cystatin (Fel d 3), a cysteine protease inhibitor. Clin Exp Allergy, In Press 2001. 80. Fahlbusch B, Rudeschko O, Szilagyi U, Schlott B, Henzgen M, Schlenvoigt G, Schubert H. Purification and partial characterization of the major allergen, Cav p l, from guinea pig Cavia porcellus. Allergy 57: 417–422, 2002. 81. McDonald, B., M. C. Kuo, J. L Ohman, and L. J. Rosenwasser. 1988. A 29 amino acid peptide derived from rat alpha 2 euglobulin triggers murine allergen specific human T cells (abst). J. Allergy Clin. Immunol. 83: 251. 81A. Clarke, A. J., P. M. Cissold, R. A. Shawi, P. Beattie, and J. Bishop. 1984. Structure of mouse urinary protein genes: differential splicing configurations in the 3’¹non-coding region. EMBO J 3: 1045–1052. 82. Longbottom, J. L 1983. Chracterization of allergens from the urines of experimental animals. McMillan Press, London, pp. 525–529. 83. Laperche, Y., K. R. Lynch, K. P. Dolans, and P. Feigelsen. 1983. Tissue-specific control of alpha 2u globulin gene expression: constitutive synthesis in submaxillary gland. Cell 32: 453–460.

1

HU 005 333 T2

83A. Bush RK, Sanchez H, Geisler D. 1999. Molecular cloning of a major Alternaria alternata allergen, rAlt a 2. J Allergy Clin Immunol 104: 665–671. 83B. Aukrust L, Borch SM. 1979. Partial purification and characterization of two Cladosporium herbarum allergens. Int Arch Allergy Appl Immunol 60: 68–79. 83C. Sward-Nordmo M, Paulsen BS, Wold JK. 1988. The glycoprotein allergen Ag¹54 (Cla h II) from Cladosporium herbarum. Structural studies of the carbohydrate moiety. Int Arch Allergy Appl Immunol 85: 288–294. 84. Shen, et al. J. Allergy Clin. Immunol. 103: S157, 1999. 84A. Crameri R. Epidemiology and molecular basis of the involvement of Aspergillus fumigatus in allergic diseases. Contrib. Microbiol. Vol. 2, Karger, Basel (in press). 84B. Shen, et al. (manuscript submitted), 1999. 84C. Shen HD, Ling WL, Tan MF, Wang SR, Chou H, Han SIH. Vacuolar serine proteinase: A major allergen of Aspergillus fumigatus. 10th International Congress of Immunology, Abstract, 1998. 85. Kumar A, Reddy LV, Sochanik A, Kurup VP. 1993. Isolation and characterization of a recombinant heat shock protein of Aspergillus fumigatus. J. Allergy Clin. Immunol. 91: 1024–1030. 85A. Saxena S, Madan T, Muralidhar K, Sarma PU. 2003. cDNA cloning, expression and characterization of an allergenic L3 ribosomal protein of Aspergillus fumigatus. Clin Exp Immunol 134: 86–91. 85B. Baur X, Melching-Kollmuss S, Koops F, Strassburger K, Zober A. IgE-mediated allergy to phytase – a new animal feed additive. Allergy 57: 943–945, 2002. 86A. Shen HD, Lin WL, Tsai JJ, Liaw SF, Han SH. 1996. Allergenic components in three different species of Penicillium: crossreactivity among major allergens. Clin Exp Allergy 26: 444–451. 86B. Shen, et al. Abstract; The XVIII Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology, Brussels, Belgium, 3–7 July 1999. 87. Shen HD, Lin WL, Tarn MF, Wang SR, Tzean SS, Huang MH, Han SH. Characterization of allergens from Penicillium oxalicum and P. notatum by immunoblotting and N¹terminal amino acid sequence analysis. Clin Exp Allergy 29: 642–651, 1999. 87A. Shen HD, Liaw SF, Lin WL, Ro LH, Yang HL, Han SH. Molecular cloning of cDNA coding for the 68 kDa allergen of Penicillium notatum using MoAbs. Clin Exp Allergy 25: 350–356, 1995. 87B. Shen HD, Wang CW, Lin WL, Lai HY, Tarn MF, Chou H, Wang SR, Han SH. cDNA cloning and immunologic characterization of Pen o 18, the vacuolar serine protease major allergen of Penicillium oxalicum. J Lab Clin Med 137: 115–124, 2001. 88. Woodfolk JA, Wheatley LM, Piyasena RV, Benjamin DC, Platts-Mills TA.1998. Trichophyton antigens associated with IgE antibodies and delayed type hypersensitivity. Sequence homology to two

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 30

2

families of serine proteinases. J Biol Chem 273: 29489–96. 88A. Deueil, B., L. K. Arruda, M. L. Hayden, M. D. Chapman and T. A. E. Platts-Mills. 1991. Trichophyton tonsurans Allergen I. J. Immunol. 147: 96–101. 89. Shen, H. D., K. B. Choo, H. H. Lee, J. C. Hsieh, and S. H. Han. 1991. The 40 kd allergen of Candida albicans is an alcohol dehydrogenease: molecular cloning and immunological analysis using monoclonal antibodies. Clin. Exp. Allergy 21: 675–681. 89A. Horner WE, Reese G, Lehrer SB. 1995. Identification of the allergen Psi c 2 from the basidiomycete Psilocybe cubensis as a fungal cyclophilin. Int Arch Allergy Immunol 107: 298–300. 89B. Chang CY, Chou H, Tarn MF, Tang RB, Lai HY, Shen HD. Characterization of Enolase Allergenfrom Rhodotorula mucilaginosa. J Biomed Sci 9: 645–655, 2002. 90. Yasueda H, Hashida-Okado T, Saito A, Uchida K, Kuroda M, Onishi Y, Takahashi K, Yamaguchi H, Takesako K, Akiyama K. Identification and cloning of two novel allergens from the lipophilic yeast, Malassezia furfur. Biochem Biophys Res Commun 248: 240–244, 1998. NB: strainTIMM2782 (Teikyo University Institute for Medical Mycology) equai to strain CBS 1878 (Central Bureau von Schimmelkulturen). 90A. Onishi Y, Kuroda M, Yasueda H, Saito A, SonoKoyama E, Tunasawa S, Hashida-Okado T, Yagihara T, Uchida K, Yamaguchi H, Akiyama K, Kato I, Takesako K. Two-dimensional electrophoresis of Malassezia allergens for atopic dermatitis and isolation of Mai f 4 homologs with mitochondrial malate dehydrogenase. Eur J Biochem 261: 148–154, 1999. NB: strain TIMM2782 (Teikyo University Institute for Medical Mycology) equal to strain CBS 1878 (Central Bureau von Schimmelkulturen). 91. Schmidt M, Zargari A, Holt P, Lindbom L, Hellman U, Whitley P, van der Ploeg I, Harfast B, Scheynius A. The complete cDNA sequence and expression of the first major allergenic protein of Malassezia furfur, Mai f 1. Eur J Biochem 246: 181–185, 1997. NB: strain ATCC no. 42132 (American Type Culture Collection). 91A. Rasool O, Zargari A, Almqvist J, Eshaghi H, Whitley P, Scheynius A. Cloning, characterization and expression of complete coding sequences of three IgE binding Malassezia furfur allergens, Mai f 7, Mai f 8 and Mai f 9. Eur J Biochem 267: 4355–4361, 2000. NB: strain ATCC no. 42132 (American Type Culture Collection). 91B. NB: strain 4625 (Indian Agricultural Research Institute, PUSA; New Delhi, India). 92. Kuchler, K., M. Gmachl, M. J. Sippl, and G. Kreil. 1989. Analysis of the cDNA for phospholipase A2 from honey bee venom glands: The deduced amino acid sequence reveals homology to the corresponding vertebrate enzymes. Eur. J. Biochem. 184: 249–254.

1

HU 005 333 T2

93. Gmachl, M., and G. Kreil. 1993. Bee venom hyaluronidase is homologous to a membrane protein of mammalian sperm. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3569–3573. 93A. Hoffman DR. 1977. Allergens in bee venom III. Identification of allergen B as an acid phosphatase. J Allergy Clin. Immunol. 59: 364–366. 94. Habermann, E. 1972. Bee and vvasp venoms. Science 177: 314–322. 95. Hoffman DR, Jacobson RS. 1996. Allergens in Hymenoptera venom XXVII: Bumblebee venom allergy and allergens. J. Allergy Clin. Immunol. 97: 812–821. 95A. Hoffman DR, El¹Choufani AE, Smith MM, de Groot H. 2001. Occupational allergy to bumblebee venom: Allergens of Bombus terrestris. J Allergy Clin Immunol In press. 95B. Helm R, Cockrell G, Stanley JS, Brenner RJ, Burks W, Bannon GA. 1996. Isolation and characterization of a clone encoding a majore allergen (Bla g Bd90K) involved in IgE mediated cockroach hypersensitivity. J Allerg Clin Immunol 98: 172–180. 95C. Pomes A, Melen E, Vailes LD, Retief JD, Arruda LK, Chapman MD. 1998. Novel allergen structures with tandem amino acid repeats derived from German and American cockroach. J Biol Chem 273: 30801–30807. 96. Arruda LK, Vailes LD, Mann BJ, Shannon J, Fox JW, Vedvick TS, Hayden ML, Chapman MD. Molecular cloning of a major cockroach (Blattella germanica) allergen, Bla g 2. Sequence homology to the aspartic proteases. J Biol Chem 270: 19563–19568, 1995. 97. Arruda LK, Vailes LD, Hayden ML, Benjamin DC, Chapman MD. Cloning of cockroach allergen, Blag 4, identifies ligand binding proteins (orcalycins) as a cause of IgE antibody responses. J Biol Chem 270: 31196–31201, 1995. 98. Arruda LK, Vailes LD, Benjamin DC, Chapman MD. Molecular cloning of German Cockroach (Blattella germanica) allergens. Int Arch Allergy Immunol 107: 295–297, 1995. 98A. Wu CH, Wang NM, Lee MF, Kao CYY, Luo SF. 1998. Cloning of the American cockroach Cr¹PII allergens: Evidence for the existence of cross-reactive allergens between species. J Allergy Clin Immunol 101: 832–840. 98B. Melen E, Pomes A, Vailes LD, Arruda LK, Chapman MD. 1999. Molecular cloning of Per a 1 and definition of the cross-reactive Group 1 cockroach allergens. J Allergy Clin Immunol 103: 859–64. 98C. Wu CH, Lee MF, Liao SC, Luo SF. Sequencing analysis of cDNA clones encoding the American cockroach Cr¹PI allergens. J Biol Chem 271: 17937–17943, 1996. 98D. Wu CH, Lee MF, Wang NM, Luo SF. Sequencing and immunochemical characterization of the American cockroach Per a 3 (Cr¹PI) isoallergenic variants. Molecular Immunol 34: 1–8, 1997.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 31

2

98E. Santos ABR, Chapman MD, Aalberse RC, Vailes LD, Ferriani VPL, Oliver C, Rizzo MC, Naspitz CK, Arruda LK. 1999. Cockroach allergens and asthma in Brazil: Identification of tropomyosin as a major allergen with potential cross-reactivity with mite and shrimp allergens. J Allergy Clin Immunol 104: 329–337. 98F. Asturias JA, Gomez-Bayon N, Arilla MC, Martinez A, Palacios R, Sanchez-Gascon, Martinez J. 1999. Molecular characterization of American cockroach tropomyosin (Periplaneta americana allergen 7), a cross-reactive allergen. J Immunol 162: 4342–4348. 99. Mazur, G., X. Baur, and V. Liebers. 1990. Hypersensitivity to hemoglobins of the Diptera family Chironomidae: Structural and functional studies of their immunogenic/allergenic sites. Monog. Allergy 28: 121–137. 99A. Moneo I, Vega JM, Caballero ML, Vega J, Alday E. Isolation and characterization of Tha p 1, a major allergen from the pine processionary caterpillar Thaumetopoea pityocampa. Allergy 58: 34–37, 2003. 100. Soldatova, L., L. Kochoumian, and T. P. King. 1993. Sequence similarity of a hornet (D. maculata) venom allergen phospholipase A1 with mammalian lipases. FEBS Letters 320: 145–149. 101. Lu, G., L. Kochoumian and T. P. King. Whiteface hornet venom allergen hyaluronidase: cloning and its sequence similarity with other proteins (abst). 1994. J. Allergy Clin. Immunol. 93: 224. 102. Fang, K. S. F., M. Vitale, P. Fehlner, and T. P. King. 1988. cDNA cloning and primary structure of a white-faced hornet venom allergen, antigen 5. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 895–899. 103. King, T. P., D. C. Moran, D. F. Wang, L. Kochoumian, and B. T. Chait. 1990. Structural studies of a hornet venom allergen antigen 5, Dol m V and its sequence similarity with other proteins. Prot. Seq. Data Anal. 3: 263–266. 104. Lu, G., M. Villalba, M. R. Coscia, D. R. Hoffman, and T. P. King. 1993. Sequence analysis and antigen cross reactivity of a venom allergen antigen 5 from hornets, wasps and yellowjackets. J. Immunol. 150: 2823–2830. 105. King, T. P. and Lu, G. 1997. Unpublished data. 105A. King TP, Lu G, Gonzalez M, Qian N and Soldatova L. 1996. Yellow jacket venom allergens, hyaluronidase and phospholipase: sequence similarity and antigenic cross-reactivity with their hornet and wasp homologs and possible implications for clinical allergy. J. Allergy Clin. Immunol. 98: 588–600. 106. Hoffman, D. R. 1993. Allergens in hymenoptera venom XXV: The amino acid sequences of antigen 5 molecules and the structural basis of antigenic cross-reactivity. J. Allergy Clin. Immunol. 92: 707–716. 107. Hoffman DR. 1992. Unpublished data. 108. Hoffman DR. The complete amino acid sequence of a yellowjacket venom phospholipase (abst). J. Allergy Clin. Immunol. 91: 187, 1993.

1

HU 005 333 T2

109. Jacobson RS, Hoffman DR, Kemeny DM. The cross-reactivity between bee and vespid hyaluronidases has a structural basis (abst). J. Allergy Clin. Immunol. 89: 292, 1992. 110. Hoffman DR. Allergens in Hymenoptera venom XXIV: The amino acid sequences of imported fire ant venom allergens Sol i II, Sol i III, and Sol i IV. J. Allergy Clin. Immunol 91: 71–78, 1993. 111. Schmidt M, Walker RB, Hoffman DR, McConnell TJ. Nucleotide sequence of cDNA encoding the fire ant venom protein Sol i II. FEBS Letters 319: 138–140, 1993. 111A. Paddock CD, McKerrow JH, Hansell E, Foreman KW, Hsieh I, Marshall N. Identification, cloning, and recombinant expression of procalin, a major triatomine allergen. J Immunol 167: 2694–2699, 2001. 112. Elsayed S, Bennich H. The primary structure of Allergen M from cod. Scand J Immunol 3: 683–686, 1974. 113. Elsayed S, Aas K, Sletten K, Johansson SGO. Tryptic cleavage of a homogeneous cod fish allergen an isolation of two active polypeptide fragments. Immunochemistry 9: 647–661, 1972. 114. Hoffman, D. R. 1983. Immunochemical identification of the allergens in egg white. J. Allergy Clin. Immunol. 71: 481–486. 115. Langeland.T. 1983. A clinical and immunological study of allergy to hen’s egg white. IV. specific IgE antibodies to individual allergens in hen’s egg white related to clinical and immunolgical parameters in egg-allergic patients. Allergy 38: 493–500. 116. Daul CB, Slattery M, Morgan JE, Lehrer SB. 1993. Common Crustacea allergens: identification of B cell epitopes with the shrimp specifíc monoclonal antibodies. In: „Molecular Biology and Immunology of Allergens” (D. Kraft and A. Sehon, eds.). CRC Press, Boca Raton, pp. 291–293. 116A. Shanti KN, Martin BM, Nagpal S, Metcalfe DD, Subba Rao PV. Identification of tropomyosin as the major shrimp allergen and characterization of its IgE-binding epitopes. J. Immunol. 151: 5354–5363, 1993. 117. Yu CJ, Lin YF, Chiang BL, Chow LP. Proteomics and Immunological Analysis of a Novel Shrimp Allergen, Pen m 2. J Immunol 170: 445–453, 2003. 117A. Miyazawa M, Fukamachi H, Inagaki Y, Reese G, Daul CB, Lehrer SB, Inouye S, Sakaguchi M. Identification of the first major allergen of a squid (Todarodes pacificus). J. Allergy Clin. Immunol. 98: 948–953, 1996. 117B. Asturias JA, Eraso E, Arilla MC, Gomez-Bayon N, Inacio F, Martinez A. Cloning, isolation, and IgEbinding properties of Helix aspersa (brown garden snail) tropomyosin. Int Arch Allergy Immunol 128: 90–96, 2002. 117C. Lopata AL, Zinn C, Potter PC. Characteristics of hypersensitivity reactions and identification of a unique 49 kd IgE-binding protein (Hal-m¹1) in abalone (Haliotis midae). J. Allergy Clin. Immunol. 100: 642–648, 1997.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 32

2

117D. Hoffmann-Sommergruber K, O’Riordain G, Ahorn H, Ebner C, Laimer Da Camara Machado M, Puhringer H, Scheiner O, Breiteneder H. Molecular characterization of Dau c 1, the Bet v 1 homologous protein from carrot and its cross-reactivity with Betv 1 and Api g 1. Clin. Exp. Allergy 29: 840–847, 1999. 118. Monsalve R1, Gonzalez de la Pena MA, Menendez-Arias L, Lopez-Otin C, Villalba M, Rodriguez R. Characterization of a new mustard allergen, Bra j IE. Detection of an allergenic epitope. Biochem. J. 293:625–632 1993. 118A. Monsalve RI, Gonzalez de la Pena MA, LopezOtin C, Fiandor A, Fernandez C, Villalba M, Rodriguez R. 1997. Detection, isolation and complete amino acid sequence of an aeroallergenic protein from rapeseed flour. Clin Exp Allergy 27: 833–841. 119. Mena, M., R. Sanchez-Monge, L. Gomez, G. Salcedo, and P. Carbonero. A major barley allergen associated with baker’s asthma disease is a glycosylated monomeric inhibitor of insect alpha-amylase: cDNA cloning and chromosomal location of the gene. Plant Molec. Biol. 20: 451–458, 1992. 119A. Palosuo K, Varjonen E, Kekki OM, Klemola T, Kalkkinen N, Alenius H, Reunala T. Wheat omega¹5 gliadin is a major allergen in children with immediate allergy to ingested wheat. J. Allergy Clin. Immunol. 108: 634–638, 2001. 119B. Xu H, Theerakulpisut P, Goulding N, Suphioglu C, Singh M. B. Bhalla P. L. Cloning expression and immunological characterization of Ory s 1, the major allergen of rice pollen. Gene 164: 255–259, 1995. 119C. Pastorello EA, Ortolani C, Farioli L, Pravettoni V, Ispano M, Borga A, Bengtsson A, Incorvaia C, Berti C, Zanussi C. Allergenic cross-reactivity among peach, apricot, plum, and cherry in patients with oral allergy syndrome: an in vivo and in vitro study. J. Allergy Clin. Immunol. 94: 699–707, 1994. 119D. Diaz-Perales A, Tabar AI, Sanchez-Monge R, Garcia BE, Gomez B, Barber D, Salcedo G. Characterization of asparagus allergens: a relevant role of lipid transfer proteins. J Allergy Clin Immunol 110: 790–796, 2002. 119E. Galleguillos F, Rodriguez JC. Asthma caused by bromelin inhalation. Clin Allergy 8: 21–24, 1978. 119F. Baur X. Studies on the specificity of human IgEantibodies to the plant proteases papain and bromelain. Clin Allergy 9: 451–457, 1979. 119G. Gailhofer G, Wilders-Truschnig M, Smolle J, Ludvan M. Asthma caused by bromelain: an occupational allergy. Clin Allergy 18: 445–450, 1988. 120. Menendez-Arias, L., I. Moneo, J. Dominguez, and R. Rodriguez. 1988. Primary structure of the major allergen of yellow mustard (Sinapis alba L.) seed, Sin a I. Eur. J. Biochem. 177: 159–166. 120A. Gonzalez R, Varela J, Carreira J, Polo F. Soybean hydrophobic protein and soybean hull allergy. Lancet 346: 48–49, 1995. 120B. Kleine-Tebbe J, Vogel L, Crowell DN, Haustein UF, Vieths S. Severe oral allergy syndrome and

1

HU 005 333 T2

anaphylactic reactions caused by a Bet v 1 – related PR¹10 protein in soybean, SAM22. J Allergy Clin Immunol 110: 797–804, 2002. 120C. Sanchez-Monge R, Pascual CY, Diaz-Perales A, Fernandez-Crespo J, Martin-Esteban M, Salcedo G. Isolation and characterization of relevant allergens from boiled lentils. J. Allergy Clin. Immunol. 106:955–961, 2000. 121. Gavrovic-Jankulovic M, clrkovic T, Vuckovic O, Atanaskovic-Markovic M, Petersen A, Gojgic G, Burazer L, Jankov RM. Isolation and biochemical characterization of a thaumatin-like kiwi allergen. J Allergy Clin Immunol 110: 805–810, 2002. 121A. Pastorello EA, Varin E, Farioli L, Pravettoni V, Ortolani C, Trambaioli C, Fortunato D, Giuffrida MG, Rivolta F, Robino A, Calamari AM, Lacava L, Conti A. The major allergen of sesame seeds (Sesamum indicum) is a 2S albumin. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 756: 85–93, 2001. 121B. Moneo I, Caballero ML, Gomez F, Ortega E, Alonso MJ. Isolation and characterization of a major allergen from the fish parasite Anisakis simplex. J. Allergy Clin. Immunol. 106: 177–182, 2000. 121C. Asturias JA, Eraso E, Martinez A. 2000. Is tropomysoin an allergen in Anisakis Allergy 55: 898–890. 122. Christie, J. F., B. Dunbar, I. Davidson, and M. W. Kennedy. 1990. N¹terminal amino acid sequence identity between a major allergen of Ascaris lumbricoides and Ascaris suum and MHC-restricted IgE responses to it. Immunology 69: 596–602. 122A. Baur X, Konig G, Bencze K, Fruhmann G. Clinical symptoms and results of skin test, RAST and bronchial provocation test in thirty-three papain workers: evidence for strong immunogenic potency and clinicaliy relevant ’proteolytic effects of airborne papain’. Clin Allergy 12: 9–17, 1982. 122B. Onizuka R, Kamiya H, Muramoto K, Goto R, Inoue K, Kumamoto K, Nakajima Y, lida S, Ishigami F. Purification of the major allergen of red soft coral (Dendronephthya nipponica). Int Arch Allergy Immunol 125: 135–143, 2001. 123. Czuppon AB, Chen Z, Rennert S, Engelke T, Meyer HE, Heber M, Baur X. The rubber elongation factor of rubber trees (Hevea brasiliensis) is the major allergen in latex. J Allergy Clin Immunol 92: 690–697, 1993. 124. Attanayaka DPSTG, Kekwick RGO, Franklin FCH. 1991. Molecular cloning and nucleotide sequencing of the rubber elongation factor gene from hevea brasiliensis. Plant Mol Biol 16: 1079–1081. 125. Chye ML, Cheung KY. 1995. J 1,3-glucanase is highly expressed in Laticifers of Hevea brasiliensis. Plant Mol Biol 26: 397–402. 126. Alenius H, Palosuo T, Kelly K, Kurup V, Reunala T, Makinen-Kiljunen S.Turjanmaa K, Fink J. 1993. IgE reactiviry to 14¹kD and 27¹kD natural rubber proteins in Latex-allergic children with Spina bifida and other congenital anomalies. Int Arch Allergy Immunol 102: 61–66.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 33

2

127. Yeang HY, Cheong KF, Sunderasan E, Hamzah S, Chew NP, Hamid S, Hamilton RG, Cardosa MJ. 1996. The 14.6 kD (REF, Hev b 1) and 24 kD (Hev b 3) rubber particle proteins are recognized by IgE from Spina Bifida patients with Latex allergy. J Allerg Clin Immunol in press. 128. Sunderasan E, Hamzah S, Hamid S, Ward MA, Yeang HY, Cardosa MJ. 1995. Latex B¹serum J1,3-glucanase (Hev b 2) and a component of the microhelix (Hev b 4) are major Latex allergens. J nat Rubb Res 10: 82–99. A találmány szerinti illesztéssel/fej-farok módosítással az allergénaktivitásban jelentõs mértékû csökkenés érhetõ el. Az eljárástól függõen a vad típusú fehérjeallergén esetében ezen aktivitás nagyrészt megszüntethetõ. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, az allergénaktivitás csökkenését a vad típusú allergénnel összehasonlítva, az IgE-kötõ képesség legalább 10%¹os, elõnyösen legalább 20%¹os, különösen legalább 30%¹os gátlásának megfelelõ csökkenésével mérjük. Az alábbi, „Példák” címû részben bemutatjuk az egyik elõnyös eljárást. Az allergénaktivitás csökkenésének meghatározására szolgáló alternatív, de szintén elõnyös mód az IgE-vel való kötõdés mérését alkalmazza. Allergénnel érzékenyített beteg szérumában lévõ IgE antitesteknek a származék dot-blotjához való kötõdésének hiányát a legnagyobb mértékû csökkenés jelzésének tekintjük. Az alábbi, „Példák” címû részben ezt az eljárást is bemutatjuk. A találmány szerint elõállított származékok könnyen kombinálhatók gyógyászatilag elfogadható vivõanyaggal, és e származékokból kész gyógyászati készítmény állítható elõ. Elõnyös, ha a származékokat alkalmas vakcinaadjuvánssal kombináljuk, és a kombinációból gyógyászatilag elfogadható kész vakcinakészítményt állítunk elõ. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti származékokat további allergénekkel kombinálva kombinációs vakcinát állítunk elõ. Ilyen allergének elõnyösen vad típusú allergének, különösen vad típusú allergének keveréke, rekombináns vad típusú allergének, vad típusú allergének származékai vagy azok keverékei. Ilyen keverékek egy adott beteg specifikus szükségleteinek (allergénprofilja) megfelelõen készíthetõk el. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában egy ilyen gyógyászati készítmény még allergénkivonatot is tartalmaz. A találmány egy másik szempontja szerint vad típusú fehérjeallergén allergénszármazékát állítjuk elõ, amely vad típusú fehérjeallergén I¹tõl Z¹ig terjedõ aminosavszekvenciájú, azzal jellemezve, hogy a származék egymás mellett – N¹terminális-C-terminális orientációban – tartalmazza a két vad típusú, X–Z és I–X allergénfragmentumot, és a két vad típusú allergénfragmentumnak csökkent allergénaktivitása van, vagy nincs allergénaktivitásuk. Elõnyös, ha a találmány szerinti allergénszármazékot az jellemzi, hogy X–Z és I–X legalább 30 aminosav,

1

HU 005 333 T2

elõnyösen legalább 50 aminosav, különösen legalább 60 aminosav hosszúságú. Ennél is elõnyösebb, ha X®Z és I®X méretüket tekintve 50%-ban vagy annál kisebb mértékben, elõnyösen 30%-ban vagy annál kisebb mértékben, különösen 20%-ban vagy annál kisebb mértékben eltérnek. A találmány szerint különösen elõnyös allergénszármazékok az I¹es típusú allergének közül, elõnyösen az A) táblázatban felsorolt allergének közül kerülnek ki; legelõnyösebbek az alábbiak: a réti komócsin (Phelum pratense) pollenje, különösen a Phl p 12, a nyír (Betula verrucosa) pollenje, különösen a Bet v 2 és Bet v 4, a kecskedarázs (Vespula vulgaris) venomja, a papírdarázs (Polistes annularis) venomja, a Parietaria judaica pollenje, az angolperje pollenje, poratkaallergének, különösen a Der p 2 stb. Elõnyös, ha a találmány szerinti származékok olyan allergénkészítményként vannak biztosítva, amelyben nemcsak egy, hanem két vagy három allergén van jelen. A találmány szerinti származékok összekeverhetõk olyan allergénkivonatokkal, amelyek a találmány szerinti származékok kiegészítésével pótolják a természetes kivonatban lévõ specifikus allergének megfelelõ mennyiségének hiányát. Allergénkeverékekre különösen olyan betegeknél van szükség, akiknél nemcsak egyetlen allergén elleni allergénreakció tapasztalható. Ennélfogva elõnyös, ha a találmány szerinti származékokat további (más) allergénekkel kombinálva, kombinációs vakcinaként biztosítjuk. Ennélfogva a találmány szerinti allergénszármazékok valamilyen allergénkészítményben elõnyösen kombinálhatók vad típusú allergénekkel, különösen vad típusú allergének keverékével, rekombináns vad típusú allergénekkel, vad típusú fehérjeallergének származékaival vagy azok keverékeivel (minden azonos és/vagy különbözõ allergénnel és/vagy annak izoformáival vagy mutánsaival, amennyiben – az egész készítményben lévõ vad típusú fehérjéhez vagy rekombináns allergénhez képest – az allergénaktivitás általános csökkenését eredményezi). Elõnyös, ha a találmány szerinti készítmény allergénkivonatot is tartalmaz. Elõnyös, ha a találmány szerinti allergén vagy allergénkészítmény gyógyászatilag elfogadható vivõanyagot tartalmaz. A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgya a találmány szerinti allergénszármazék alkalmazása allergénre specifikus immunterápiás gyógyszer elõállítására. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgya a találmány szerinti allergénszármazék vagy allergénkészítmény alkalmazása passzív immunizálásra szolgáló gyógyszer elõállítására. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgya a találmány szerinti allergénszármazék vagy allergénkészítmény alkalmazása megelõzõ immunizálásra szolgáló gyógyszer elõállítására. A találmány szerinti allergénszármazékok vagy allergénkészítmények különbözõ egyedek megelõzõ immunizálására alkalmazhatók az allergia hatékony meg-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 34

2

elõzése céljából. Mivel a találmány szerinti allergénszármazékok vagy allergénkészítmények, mint amilyenek például a Der p 2 származékok, a vad típusú allergénnel összehasonlítva csökkent allergén-immunválaszt adnak, és nem kívánt mellékhatásokat nem váltanak ki. Az ilyen gyógyszer elõnyösen 1–3 éves korú gyermekeknek adható be. Az említett gyermekek ilyen, még az allergénekkel való érintkezést megelõzõen végzett vakcinálása megakadályozza a gyermekekben az allergénre specifikus IgE antitestek kialakulását. Elõnyös, ha a gyógyszer még más alkalmas összetevõket, például adjuvánsokat, hígítókat, tartósítószereket stb. is tartalmaz. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a gyógyszer beadandó dózisonként 10 ng és 1 g közötti, elõnyösen 100 ng és 10 mg között, különösen 0,5 mg és 200 mg közötti mennyiségben tartalmazza a rekombináns allergénszármazékot. A beadás elõnyös módjai közé tartozik minden, általában és specifikusan az allergia elleni immunterápiában vakcinálásra leírt és javasolt standard beadási rend (orális, transzdermális, intravénás, intranazális, nyálkahártyán át stb.). A találmány tárgya eljárás allergia kezelésére és megelõzésére, amely eljárásban a találmány szerinti gyógyászati készítmény hatékony mennyiségének beadása történik. A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát a találmány szerinti allergénszármazék elõállítására szolgáló eljárás képezi, amely eljárást az alábbi lépések jellemeznek: a találmány szerinti allergénszármazékot kódoló DNS-molekula elõállítása, valamilyen gazdasejt transzformálása a DNS-molekulával, és a származék expresszálása a gazdasejtben, és a származék izolálása. Elõnyös, ha a gazda nagy expressziós kapacitású gazda. A leírás szerinti értelemben a „nagy expressziós kapacitású gazda” kifejezés olyan gazdát jelent, amely a kérdéses fehérjét legalább 10 mg/l tenyészet mennyiségben, elõnyösen legalább 15 mg/l tenyészet mennyiségben, elõnyösebben legalább 20 mg/l tenyészet mennyiségben expresszálja, az expresszió kapacitása a kiválasztott gazdától és expressziós rendszertõl (például a vektortól) is függ. A találmány szerinti elõnyös gazdák az alábbiak: E. coli, Pichia pastoris, Bacillus subtilis, növényi (például dohányból származó) sejtek stb. A találmány szerinti allergénszármazékok természetesen bármilyen más alkalmas eljárással, különösen kémiai szintézissel vagy félkémiai szintézissel is elõállíthatók. A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgya egy elsõ vad típusú profilinmolekulából a találmány szerinti eljárással kinyerhetõ profilinszármazéknak vagy egy elsõ vad típusú profilinmolekula találmány szerinti származéknak alkalmazása egy második vad típusú profilinmolekula által kiváltott allergiás betegség megelõzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására. Meglepetésünkre kiderült, hogy a találmány szerinti elsõ vad típusú profilinmolekula profilinszármazé-

1

HU 005 333 T2

kai által és azok ellen irányított antitestek más vad típusú profilinmolekulákhoz is kötõdnek. Ennélfogva a származékok számos allergiás betegség kezelésére vagy megelõzésére alkalmazhatók. Ilyen profilinszármazékok egyedek csak egy vagy két immunogén molekulával való immunizálását lehetõvé tevõ, széles spektrumú vakcinákként alkalmazhatók. A profilin minden eukarióta sejtben expresszálódó allergén, és így olyan pánallergén, amely érzékenyített betegekben belégzéses allergiákat (például rhinoconjunctivis, asztma) és orális felvétel esetén orális allergiás szindrómákat (az ajkak és a nyelv viszketése és duzzadása) indukál. Például újrakevert (átrendezett, „reshuffled”) Phl p 12 származék (MP12) immunizálás után olyan IgG antitesteket indukál, amelyek a pollenekbõl és növényi eredetû táplálékból származó profilineket egyaránt felismeri. MP12 által indukált antitestek gátolják a beteg szérumában lévõ IgE kötõdését a pollenekbõl és növényi eredetû táplálékból származó profilinekhez. Ennélfogva az MP12 és más újrakevert profilinmolekulák alkalmasak a profilinallergiáért felelõssé tehetõ pollentáplálék keresztérzékenyítés kezelésére. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában az elsõ és második profilinmolekula a Phl p 12, Bet v 2, Art v 4, Ana c, Api g 4, Mus xp 1, Cor a 2, és Dau c 4 alkotta csoportból lett kiválasztva. Szerkezeti hasonlóságaik miatt a találmány szerinti alkalmazásra különösen ezen allergének felelnek meg. Azonban egyértelmû, hogy szerkezetileg hasonló más allergének is alkalmazhatók ennek megfelelõen. Az elsõ profilinmolekula elõnyösen Phl p 12, a második profilinmolekula pedig elõnyösen a Bet v 2, Art v 4, Ana c, Api g 4, Mus xp 1, Cor a 2, és Dau c 4 alkotta csoportból lett kiválasztva. Különféle vizsgálatok feltárták, hogy széles spektrumú vakcinák céljára különösen a Phl p 12 származékok alkalmasak. Különösen elõnyös származékok olyan fúziós fehérjékbõl állnak, amelyekben a vad típusú Phl p 12 1–77. aminosavai N¹terminálisan vannak fuzionálva a 78–131. aminosavakkal (lásd 1. ábra). A találmány szerinti megoldásban ismertetett és a találmány szerinti eljárással elõállítható Bet v 2, Art v 4, Ana c, Api g 4, Mus xp 1, Cor a 2, és Dau c 4 fehérjeszármazékok elõnyösen alkalmazhatók a profilinallergiáért felelõssé tehetõ pollen-táplálék érzékenyítés kezelésére és/vagy megelõzésére. A találmány szerinti megoldást az alábbi példák és ábrák révén – minden korlátozás nélkül – részletesen leírjuk. 1. ábra: Az MP12 (a találmány szerint újrakevert Phl p 12 allergén) primer szerkezetének vázlatos bemutatása a vad típusú Phl p 12¹vel összehasonlítva. 2. ábra: A vad típusú Phl p 12 és az MP12 CD¹spektruma. A Phl p 12 és az MP12 származék fõ átlagos oldallánc-ellipticitása [Q] hullámhosszak adott tartományára (x tengely) van bemutatva. 3. ábra: Polipropilénoszlopra felvitt rekombináns MP12-bõl származó frakciók 14%¹os SDS-PAGE képe (Coomassie festés). „M” sáv: molekulasúly-marker, 1. sáv: átfolyó frakció, 2–4. sáv: mosáskor kapott frakció,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 35

2

5–6. sáv: eluált frakciók. A molekulatömegek (kDa) a bal szélen vannak feltüntetve. 4. ábra: Nitro-cellulózra cseppentett Phl p 12 és MP12 reaktivitása IgE¹re. Felcseppentett fehérjéket – és negatív kontrollnak szánt emberi szérumalbumint (HSA) – 24, Phl p 12¹re allergiás beteg szérumával érintkeztettük (1–24 sávok). Az „N” sáv egy nem allergiás kontrollegyed szérumának felel meg. A kötõdött IgE antitesteket emberi IgE elleni antitestekkel mutattuk ki. 5. ábra: Bazofil hisztaminfelszabadulás indukálása két, Phl p 12¹re allergiás betegben. A betegek granulocitáit különbözõ koncentrációjú (x tengely) Phl p 12¹vel (négyzetek) és MP12-vel (körök) inkubáltuk. A felülúszóba felszabadult összes hisztamin arányát az y tengelyen tüntettük fel. 6. ábra: Nyúleredetû antiszérum reaktivitása réti komócsin, nyír és fekete üröm pollenjébõl származó profilinekkel. Phl p 12 (rombuszok) és MP12 (négyzetek) ellen készített nyúl antiszérumot teszteltünk Phl p 12¹bõl (A), Bet v 2¹bõl (B), és fekete ürömbõl (C) származó profilinre ELISA alkalmazásával. A szérumhígításokat az x tengelyen, a megfelelõ OD¹értékeket pedig az y tengelyen tüntettük fel. A megfelelõ, immunizálás elõtti szérum semmilyen reaktivitást sem mutatott. 7. ábra: rPhl p 12 által indukált bazofil degranuláció gátlása anti-rPhl p 12 (P12) és anti-MP12 által indukált IgG-vel. Patkányeredetû bazofil granulocitákat Phl p 12¹re specifikus, egéreredetû IgE-vel inkubáltunk. 8. ábra: Der p 2 Hibrid (a találmány szerint újrakevert Der p 2 allergén) primer szerkezetének és elõállításának vázlatos bemutatása a vad típusú Der p 2¹vel összehasonlítva. 9. ábra: rDer p 2 és rDer p 2 származékokat His-toldalékkal ellátott fehérjékként expresszáló BL21-bõl (DE3) készült fehérjekivonat (1 sáv), tisztított rDer p 2, rDer p 2 fragmentumok és rDer p 2 Hibrid (2. sáv), és molekulasúly-marker („M” sáv) Coomassie-val festett SDS-PAGE¹je. 10. ábra: tisztított rDer p 2, és rDer p 2 származékok tömegspektrometriás analízise. Az x tengely a tömeg/töltés arányokat, az y tengely pedig a jelintenzitásokat ábrázolja a legintenzívebb jelek arányaként. 11. ábra: A tisztított rekombináns Der p 2, rDer p 2 fragmentumok és rDer p 2 hibrid távoli UV¹ben felvett CD¹spektrumai. A fehérjék spektrumait az adott hullámhosszoknál (x tengely) az oldallánc-ellipticitás átlagaként (y tengely) fejeztük ki. 12. ábra: Rekombináns Der p 2 és rekombináns Der p 2 származékok IgE-felismerése. Dot-blotolt, rekombináns Der p 2¹vel, rekombináns Der p 2 fragmentumokkal, rekombináns Der p 2 hibriddel és BSA-val 17, atkára allergiás egyedbõl (1–17. sávok), egy nem allergiás egyedbõl (18. sáv) származó szérumot és szérum nélküli puffert (19. sáv) teszteltünk IgE-reaktivitásra nézve. A kötött IgE¹t 125I-vel jelzett, emberi IgE elleni antitestekkel mutattuk ki és autoradiográfiával tettük láthatóvá. 13. ábra: Bazofilek aktiválása rekombináns Der p 2¹vel és rDer p 2 származékokkal CD203c-expresszióval mérve. 10, atkára allergiás betegbõl vett vérmintát 10 mg/ml rekombináns rDer p 2¹nek, Der p 2fragmentu-

1

HU 005 333 T2

moknak, a fragmentumok keverékének, IgE-nek vagy puffernek tettünk ki. Három reprezentatív betegre kapott eredményeket mutattuk be. A CD203c-expressziót FACS-analízissel határoztuk meg és átlagos fluoreszcenciaindexként (MFI) adtuk meg. 14. ábra: Bazofilek aktiválása rekombináns Der p 2¹vel és rDer p 2 származékokkal CD203c-expresszióval mérve. Ugyanazon 10, atkára allergiás betegtõl vett vérmintát különféle koncentrációjú rDer p 2¹nek és rDer p 2 hibridnek, IgE-nek vagy puffernek tettük ki (x tengely). Hat reprezentatív betegre kapott eredményeket mutattunk be. A CD203c-expressziót FACS-analízissel határoztuk meg és serkentési indexként (SI) adtuk meg. 15. ábra: Egerekben rDer p 2 és rDer p 2 származékokkal végzett immunizálással indukált, Der p 2¹re specifikus IgG kialakulása. Öt¹öt egérbõl álló csoportokat tisztított rDer p 2¹vel vagy rDer p 2 származékokkal immunizáltunk, és az indukált IgG1 antitesteket ELISA-val határoztuk meg. Az y tengelyen feltüntetett optikai sûrûségi értékek (OD 405 nm) az egerek szérumában lévõ IgG antitestek szintjének felelnek meg. Az eredmények doboz ábrázolással vannak bemutatva, ahol az értékek 50%¹a a dobozokon belül van, és nem esik az oszlopokon kívülre. A dobozokon belüli vonalak jelzik az átlagos értékeket. Üres körökkel és csillagokkal jeleztük az egyes egércsoportokon kívül esõ és extrém értékeket. 16. ábra: Az rDer p 2 származékok alacsony allergénaktivitásának bemutatása RBL-sejtekbõl felszabaduló b¹hexózaminidáz láthatóvá tételével. Patkányból származó bazofil leukémiás (RBL) sejteket egerekbõl rDer p 2 vad típusú allergénnel és rDer p 2 származékokkal való immunizálás elõtt (preimmunszérum) és után (immunszérum) vett szérummal inkubáltunk. Az rDer p 2¹vel indukált b¹hexózaminidáz-felszabadulást a teljes b¹hexózaminidáz-felszabadulás arányában ábrázoltuk (átlagérték ±SD, az egyes egércsoportokból származó, mind az öt szérumra) (y tengely). 17. ábra: Nyúleredetû antiszérum reaktivitása réti komócsin pollenjébõl (Phl p 12), nyír pollenjébõl (Bet v 2), fekete üröm pollenjébõl (Art v 4), kesudióból (Ana c), zellerbõl (Api g 4), banánból (Mus xp 1), mogyoróból (Cor a 2), és sárgarépából (Dauc4) származó profilinekkel. Phl p 12 (rombuszok) és MP12 (négyzetek) ellen nyúlban készített antiszérumot teszteltünk az említett profilinekkel való reaktivitásra nézve (ELISA alkalmazásával). A szérumhígításokat az x tengelyen, a megfelelõ OD¹értékeket pedig az y tengelyen tüntettük fel. A megfelelõ, immunizálás elõtti szérumok semmilyen reaktivitást sem mutattak.

más profilinek által kiváltott allergiás betegségek elleni vakcinaként.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50 Példák Az 1–5. példákban a találmány szerinti megoldás alapelvét mutatjuk be egy profilinallergént, a komócsin pollenjébõl származó profilint (Phl p 12) hozva fel példaként. A 6–11. példák a Dermatophagoides pteronyssinus atka fõ allergénjével, a Der p 2¹vel foglalkoznak. A 12–13. példák mutatják be a Phl p 12 és más, a réti komócsin pollenjétõl eltérõ forrásból származó profilinek keresztreaktivitását, ami következésképpen demonstrálja a Phl p 12 származékok alkalmazhatóságát

2

55

60 36

1. példa: Réti komócsin pollenjébõl származó profilin hipoallergén származékának jellemzése a) A réti komócsin pollenjébõl származó profilin (Phl p 12) hipoallergén változatának generálása, expressziója és tisztítása Az újrakevert Phl p 12 származék elkészítésére átfedõ PCR-eljárást alkalmaztunk. A PCR-templát pet17b expressziós vektorba szubklónozott, réti komócsin pollenjének Phl p 12 profilinjét kódoló cDNS volt. Az átfedõ szekvenciákat, az NdeI és EcRI restrikciós helyeket, illetve a fehérjetisztításhoz szükséges C¹terminális 6x Hisztoldalékot tartalmazó két PCR-fragmentum elõállítására az alábbi láncindítókat alkalmaztuk: Az 1¹es fragmentumhoz az MDE¹1 láncindítót: 5’¹CATATGAGGCCCGGCGCGGTCATC¹3’, és az MDE¹2 láncindítót: 5’¹GTACGTCTGCCACGCCATCATGCCTTGTTCAAC¹3’ alkalmaztuk; a 2 fragmentumhoz a MABC¹1 láncindítót: 5’¹GTTGAACAAGGCATGATGTCGTGGCAGACG¹3’ és a MABC¹2 láncindítót: 5’¹GAATTCTTAATGGTGATGGTGATGGTGACCCTGGATGACCATGTA¹3’ alkalmaztuk. A következõ lépésben a leírtak szerint kapott mindkét PCR-terméket templátként alkalmaztuk az MDE¹1 és MABC¹2 láncindítókkal végzett átfedéses PCR-reakcióban a Phl p 12 származékot (azaz MP12¹t, vázlatosan lásd 1. ábra) kódoló cDNS elõállítására. Az MP12¹t kódoló DNS¹t pBluescript vektorrendszerbe (Stratagene) klónoztuk, és a DNS-szekvenciát kétszálas szekvenálással (MWG Biotech, Németország) ellenõriztük. Fehérjetisztításhoz az MP12¹t kódoló cDNS¹t pet17b expressziós vektorrendszerbe kellett szubklónozni az NdeI és EcoRI restrikciós enzimek alkalmazásával és a DNS-szekvenciát kétszálas szekvenálással ismét ellenõriztük. Fehérjetisztításhoz az MP12¹t folyékony tenyészetben tartott Escherichia coli BL21 (DE3) törzsben (Stratagene, East Kew, Ausztrália) expresszáltuk. E. colit 100 mg/l ampicillint tartalmazó LB¹tápoldatban OD600=0,4 értékig szaporítottunk. A rekombináns fehérjék expresszióját 1 mM végkoncentrációban adagolt izopropil-b-tiogalaktopiranoziddal indukáltuk, és a tenyészetet további 4 órán át 37 °C¹on inkubáltuk. Egy 500 ml¹es tenyészetbõl centrifugálással E. coli sejteket gyûjtöttünk és „A” pufferben (100 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris, 8 M Urea, pH=7,5) felszuszpendáltuk. 20 000 rpm-mel 30 percig végzett centrifugálás után a felülúszót Ni¹NTA-agarózoszlopra (Quiagen, Hilden, Németország) vittük fel és a %x Hisz-toldalékkal ellátott MP12 fehérjét csökkenõ pH¹jú „A” pufferrel eluáltuk. A pH=4,9-nél eluált fehérje natív térszerkezetének újbóli kialakulását (felgombolyodását, „refold”) ezután 6–0 M ureát tartalmazó „A” puffer (pH=7,5) elleni szakaszos dialízissel váltottuk ki. A dialízis végsõ lépését foszfáttal pufferelt sóoldat (PBS) ellen végeztük, ahol a centrifugálási vizsgálatok szerint az MP12 oldható volt. A fehérje tisztaságát SDS-PAGE-vel ellenõriztük, és Micro BCA készlet (Pierce, USA) alkalmazásával mennyiségi meghatározást végeztünk.

1

HU 005 333 T2

b) A másodlagos szerkezet analízise Jasco J¹715 spektropolariméterrel (0,1 cm fényúthosszúságú, 20 °C¹on ekvilibrált cella) cirkuláris dikroizmus (CD) méréseket végeztünk. A spektrumokat 0,5 nm¹es felbontással, 100 nm/perc pásztázási sebességgel vettük fel, ami átlagosan 3 vagy annál több pásztázást eredményezett. A végsõ spektrumon az azonos körülmények között MilliQ vízzel felvett megfelelõ spektrum kivonásával alapvonal-korrekciót végeztünk. Az eredményeket a másodlagos szerkezet becslésére szolgáló J¹700 programmal illesztettük. Az eredmények szerint a származékban jelentõs mennyiségû másodlagos szerkezet van jelen. A Phl p 12 spektrumát 218 nm¹es minimum és 200 nm¹es erõs maximum jellemzi, míg a származék minimuma eltolódott egy kisebb hullámhossz felé, és a görbe nulla metszéspontja 200 nm alatt van (2. ábra). Ezen eredmények szerint a származékban a véletlenszerûen felgombolyodott másodlagos szerkezet aránya magasabb.

massie-festéssel tettük láthatóvá (3. ábra). Az eredmények jelezték, hogy a Phl p 12 elsõdleges szerkezetének átrendezõdése miatt a poliprolinkötési hely megszûnt. 5

10

15

20 c) Hipoallergén Phl p 12 származék poliprolinra nem mutat affinitást A proliprolinnal szembeni affinitás a különbözõ szervezetekbõl származó profilinek közös tulajdonsága. Bemutattuk, hogy a hipoallergén Phl p 12 származék (MP12) poliprolint nem köt, és így megváltozott biokémiai tulajdonságokat mutat. Körülbelül 5 mg, PBS-ben oldott, tisztított rekombináns MP12¹t poliprolinnal töltött, PBS-sel ekvilibrált, CnBr-dal aktivált agarózoszlopra (Amersham Bioscience, Uppsala, Svédország) vittünk fel. Az átesõ összegyûjtése után az oszlopot 3 térfogat PBS-sel mostuk, és 2 M vagy 6 M ureát (megfelelõen) tartalmazó, 5×1 ml PBS-sel elúciót végeztünk. Az átesõbõl, a mosáskor kapott frakciókból és az eluált frakciókból 10¹10 ml¹t 14%¹os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamidgélelektroforézisnek vetettünk alá, és a fehérjéket Coo-

2

25

30

35

2. példa: Az MP12 IgE-kötõ képességének csökkenése a) Az MP12 erõsen csökkent IgE-kötõ képességet mutat Dot-blot analízist végeztünk 24, profilinnel érzékenyített betegbõl származó szérumokkal a rekombináns MP12 IgE-kötõ képessége és a vad típusú, rekombináns Phl p 12 IgE-kötõ képessége összehasonlítása céljából. Phl p 12¹t, MP12¹t és kontrollként emberi szérumalbumint (HSA) cseppentettünk nitro-cellulózra, és 24, profilinnel érzékenyített betegbõl származó szérumokkal vizsgáltuk. Kötött IgE antitesteket 125I-vel jelzett, emberi IgE elleni antitestekkel mutattunk ki. A vad típusú Phl p 12 ellen minden beteg széruma IgE-reaktivitást mutatott, míg az MP12¹re és a kontroll HSA fehérjére a 24 szérum egyike sem reagált (4. ábra). Az MP12 IgE-kötõ képessége csökkenésének mértékét folyadékfázisú gátlásokkal határoztuk meg. Ebbõl a célból hat, profilinnel érzékenyített beteg szérumát 10 mg Phl p 12¹vel vagy MP12-vel elõinkubáltuk, majd azután ELISA-lemezhez kötött Phl p 12¹vel (5 mg/ml) inkubáltuk. Kötött IgE antitesteket alkalikus foszfatázzal jelzett, emberi IgE elleni antitesttel (Pharmingen) mutattunk ki. Az IgE kötõdésének gátlását az alábbi képlettel számítottuk ki: gátlás(%)=100×[(A–b)/A]. A=a szérum BSA-val történt inkubálása után mért OD értékek, B=a szérum Phl p 12¹vel vagy MP12-vel (megfelelõen) történt inkubálása után kapott OD értékek. A 2. táblázat százalékos gátlásként bemutatja az MP12-nek az IgE Phl p 12¹höz való kötõdésre gyakorolt gátlóhatását [20–40%¹os, átlag 31,2%¹os gátlás az MP12-nél, 76–91% (átlag 86%) a Phl p 12¹nél].

2. táblázat Antitestkötõdés immobilizált Phi 12¹höz való gátlása Phl p 12 és MP12 alkalmazásával. IgE antitest kötõdését 6, profilinnel érzékenyített betegbõl származó szérum, vad típusú Phl p 12¹vel vagy MP12-vel való elõinkubálásával gátoltuk. Az antitestkötõdés gátlásának átlagát kiszámítottuk és feltüntettük Fehérje neve

Phl p 12

MP12

Aminosavszekvencia

Aminosavak száma

Számított Pi

MW (kDa)

Szerkezeti integritás

MSWQTWDEHLMCEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQS ADFPQFKPEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVAGAKYM VIOGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALWGIYDEPMT PGQCNMVVERLGDYLVEQGM

131

4,92

14,1

+

MEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALVGIYDEPMTPGQ CNMVVERLGDYLVEQGMMSWQTWDEHLMCEIEGHH LASMILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITGIMKDFDEP GHLAPTGMFVAGAKYMVIQGHHHHHH

137

5,68

15

+

b) Az MP12 csökkent allergénaktivitást mutat Ezt követõen összehasonlítottuk az újrakevert Phl p 12 és a vad típusú Phl p 12, profilinre allergiás bete-

gekbõl származó bazofilekbõl történõ hisztaminfelszabadulást indukáló képességét. Dextránülepítéssel granulocitákat izoláltunk réti ko60 mócsin pollenjére allergiás betegektõl vett, heparinnal 37

1

HU 005 333 T2

kezelt vérmintákból. Izolálás után a sejteket különbözõ koncentrációjú Phl p 12¹vel, MP12-veI, illetve kontrollként emberi IgE elleni monoklonális antitesttel (Immunotech, Marseille, Franciaország) inkubáltuk. A felülúszóba felszabadult hisztamint radioimmunvizsgálattal (Immunotech) mértük. A teljes hisztamint a sejtek fagyasztása-olvasztása után határoztuk meg. Az eredményeket két meghatározás átlagértékeként adtuk meg, ami a teljes hisztamin százalékos arányának felel meg. Ahogyan az 5. ábrán példaként bemutattuk, a Phl p 12 erõs és dózistól függõ hisztaminfelszabadulást indukált a betegektõl származó bazofilekben (maximális hisztaminfelszabadulás 10–5 és 10–4 mg/ml közötti koncentrációnál), ezzel szemben az MP12 még a maximálisan alkalmazott 10–2 mg/ml koncentrációnál sem váltott ki hisztaminfelszabadulást, ami az allergénaktivitás több mint ezerszeres csökkenésére utal. Ezenfelül az MP12 hozzáadása után megfigyelt maximális hisztaminfelszabadulás jelentõsen alacsonyabb volt, mint a vad típusú Phl p 12 esetében. 3. példa: MP12-vel végzett immunizálás olyan IgG antitesteket indukál, amelyek a vad típusú Phl p 12¹t és más pollenekbõl származó profilineket egyaránt felismerik Annak tesztelésére, hogy vajon az újrakevert Phl p 12¹vel végzett immunizálás indukál¹e olyan IgG antitesteket, amelyek a vad típusú Phl p 12¹t és más pollenekbõl származó profilineket egyaránt felismerik, Freud-féle komplett és inkomplett adjuvánsok (Charles River, Kisslegg, Németország) alkalmazásával (200 mg/injekció) nyulakat immunizáltunk Phl p 12¹vel vagy MP12-vel (háromszor). Négyhetente szérummintákat vettünk. A szérumokat az analízisig –20 °C¹on tároltuk. Az MP12 és Phl p 12 által indukált IgG antitestek reaktivitását ELISA-val vizsgáltuk (6. ábra). A Phl p 12¹vel, illetve nyírfapollenbõl (Bet v 2) és réti komócsinból származó profilinekkel (5 mg/ml) ELISA-lemezeket vontunk be, és nyúl antiszérumból készült hígítási sorozatokkal (1:2000–1:64 000) inkubáltuk. A felkötõdött nyúl antitesteket szamárban készült, 1:1000 arányban hígított, peroxidázzal jelzett nyúl antiszérummal (Amersham Pharmacia Biotech) mutattuk ki. Az MP12 a vad típusú Phl p 12 által indukálttal összehasonlítható mértékû, Phl p 12 elleni IgG antitest választ indukált (6A. ábra). Ezenfelül a Phl p 12 és MP12 által indukált IgG antitestek egyaránt keresztreagáltak a nyírbõl és réti komócsinból származó profilinekkel (6B. és C. ábra). 4. példa: Az MP12 elleni antitestek Phl p 12¹vel kompetícióban gátolják a füvek pollenjére allergiás betegek szérumából származó IgE kötõdését Kompetíciós ELISA-vizsgálatban tanulmányoztuk, hogy az MP12-vel indukált, nyúleredetû IgG képes¹e gátolni az allergiás betegekbõl származó IgE kötõdését. ELISA-lemezeket (Nunc Maxisorp, Rosklide, Dánia) vontunk be Phl p 12¹vel (1 mg/ml) és vagy 1:250 hí-

2

gítású, MP12 elleni szérummal, vagy a Phl p 12 elleni szérummal, illetve – kontrollként – a megfelelõ, immunizálás elõtti szérummal elõinkubáltuk. Mosás után a lemezeket hét, Phl p 12¹vel érzékenyített, fûpollenre al5 lergiás beteg 1:3 arányban hígított szérumával inkubáltuk, és a felkötött IgE antitesteket 1:1000 arányban hígított, emberi IgE elleni monoklonális patkányeredetû antitesttel (Pharmingen, San Diego, CA), majd 1:2000 arányban hígított, HRP-vel konjugált, patkány10 eredetû Ig elleni birka antitesttel (Amersham) mutattuk ki. A peptid vagy mutáns elleni antiszérummal végzett elõinkubálással elért IgE-kötõdés százalékos gátlását az alábbiak szerint számítottuk ki. IgE-kötõdés %¹os gátlása=100–ODi/ODP×100. ODi és ODP=a nyúl im15 munszérumokkal és az immunizálás elõtt gyûjtött megfelelõ antiszérummal végzett elõinkubálás után mért extinkciók (megfelelõen). Ahogyan a 3. táblázat bemutatja, a betegek IgE-jének a Phl p 12¹höz való kötõdésének Phl p 12 elleni antitestekkel elért gátlásának 20 mértéke 30,2–66,7% (49,8%¹os átlagú gátlás) volt. Hasonlóképpen, a Phl p 12 elleni IgE-reaktivitás jelentõs mértékû, 10,8–27,6% közötti tartományba esõ (átlag 20,8%) csökkenését figyeltük meg az MP12 ellen kifejlesztett antitestekkel (3. táblázat). 25 3. táblázat Allergiás betegek IgE-jének rPhl p 12¹höz való kötõdésének gátlása nyúleredetû antitestekkel. Hét, Phl p 12¹re allergiás beteg esetében az IgE rPhl p 12¹höz való kötõdésének, nyúl antiszérummal 30 (Phl p 12 elleni, MP12 elleni nyúlszérum) végzett elõinkubálással elért százalékos gátlását és a számított átlagos gátlást az alábbiakban mutatjuk be Anti-Phl p 12

Anti-MP12

1

66,7

27,6

2

53,8

18,8

3

46,0

16,2

4

43,2

18,9

5

45,7

27,0

6

30,2

10,8

7

63,0

26,1

Átlag

49,8

20,8

35

40

45

5. példa: Az MP12 elleni antiszérum bazofil degranulációt mutat. A peptiddel indukált IgG antitestek biológiai relevanciáját és lehetséges 50 védõaktivitását vizsgáltuk allergénre specifikus IgE-vel töltött, patkányeredetû bazofil leukémia (RBL) sejteken alapuló meghatározott sejtmodellrendszerben 96 lyukú szövettenyésztõ lemezekre (4×10 4 55 sejt/lyuk) kilemezelt RBL-2H3-sejteket 24 órán át 37 °C¹on inkubáltunk 7% CO2-tartalom mellett. Profilinre reaktív IgE¹t tartalmazó, 1:30 végsõ arányban hígított egérszérummal passzív érzékenyítést végeztünk 60 2 órán át. A nem kötött antitesteket Tyrode-pufferrel 38

1

HU 005 333 T2

(137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 5,6 mM D¹glükóz, 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES és 0,1% w/v BSA, pH=7,2) végzett kétszeres mosással távolítottuk el. Phl p 12¹re specifikus, egéreredetû IgE-vel feltöltött RBL-sejteket rPhl p 12¹nek (0,005 mg/ml) tettünk ki. Phl p 12¹t, 0, 2,5, 7,5 vagy 10% (v/v) – –Phl p 12¹vel immunizált nyúlból, MP12-vel immunizált nyúlból származó, nyúleredetû antiszérumot vagy a megfelelõ, immunizálást megelõzõen gyûjtött (preimmun) – nyúlszérumot tartalmazó Tyrode-pufferben 2 órán át 37 °C¹on inkubáltunk. Elõinkubált Phl p 12¹t adtunk az RBL-sejtekhez és párás atmoszférában 37 °C¹on 30 percig inkubáltuk, majd a felülúszókat b¹hexózaminidáz-aktivitásra teszteltük 80 mM, citrátpufferben (0,1 M, pH=4,5) oldott 4¹metilumbelliferil-N-acetil-p-D-glükózamiddal (SigmaAldrich, Bécs, Ausztria) végzett 1 órás, 37 °C¹on folytatott inkubálással. A reakciót 10 ml glicinpuffer (0,2 M glicin, 0,2 M NaCl, pH=10,7) hozzáadásával állítottuk le, és a fluoreszcenciát fluoreszcens-mikrolemezleolvasó alkalmazásával (Spectrafluor, Tecan, Ausztria) Iex: 360/Iem: 465 nm¹en mértük. Az eredményeket fluoreszcenciaegységekben és a sejtek 1%¹os Triton X¹100-zal történt lizálásakor felszabadult összes b¹hexózaminidáz százalékában adtuk meg. A 7. példában ismertetettek szerint Phl p 12, növekvõ koncentrációjú (2–10% v/v), MP12 elleni nyúleredetû antitestekkel és Phl p 12 elleni nyúleredetû antitestekkel történõ elõzetes inkubálása, rPhl p 12 által indukált mediátor, Phl p 12¹re specifikus, egéreredetû IgEvel elõzõleg feltöltött RBL-ekbõl való felszabadulásának dózistól függõ gátlásához vezetett. Az ugyanilyen koncentrációjú, immunizálás elõtti Ig¹vel elõzetesen inkubált allergén esetében nem figyeltünk meg bazofil degranulációt. 6. példa: Dermatophagoides pteronyssinus allergén Der p 2 hipoallergén származékának (Der p 2 Hibrid) expresszálása, tisztítása és jellemzése A házi poratkával [House dust mite (HDM)] szembeni allergia világszerte az egyik legelterjedtebb, az összes allergiás beteg több mint 50%¹át érintõ allergia. Európában a Dermatophogoides pteronyssinust a házi porban elõforduló allergének legfontosabb forrásaként azonosították. Az atkaallergének húsz csoportját jellemezték eddig, és a 2. csoportba tartozó allergéneket azonosították a fõ atkallergénekként, amelyekkel szemben az allergiás betegek több mint 80%¹a van érzékenyítve, és amelyek fõként az atkák ürülékében fordulnak elõ. A 2. csoportba tartozó allergéneket elõször magas IgE-kötõ aktivitású, 14 000–18 000 Da allergénként írták le. A Der p 2¹t kódoló cDNS¹ek izolálása és analízise feltárta, hogy a Der p 2 129 aminosavból álló allergént tartalmaz, amelynek számított molekulatömege 14 000 Da, s nincs rajta N¹glikozilációs hely. A 2. csoport allergénjei három diszulfidkötést tartalmaznak, és két antiparallel b¹lemezbõl állnak. A Der p 2 T¹sejt-epitópjai a fehérje minden régiójában megtalálhatók, és IgE epitópjai konformációs epitópoknak bizonyultak.

5

10

15

20

25

30

35

2

Nyers atkakivonatokkal végzett immunterápiás vizsgálatok kimutatták, hogy a HDM-kivonatokkal végzett immunterápia során veszélyes szisztemikus mellékhatások jelentkezhetnek [Akcakaya és munkatársai, Ann. Allergy Asthma Immunol. 85, 317 (2000)] és tengeri hal/rák ételekkel szemben új IgE-reaktivitások indukálódhatnak [van Ree és munkatársai, Allergy 51, 108 (1996)]. A kivonaton alapuló immunterápia hátrányainak kiküszöbölése végett számos stratégiát alkalmaztak hipoallergén allergénszármazékok kifejlesztésére. A Der p 2 esetében csökkent IgE-reaktivitású változatokat fejlesztettek ki a diszulfidkötések irányított mutagenezissel történõ megszüntetésére, a diszulfidkötések N¹ és C¹terminális deléciókkal vagy mutációk bevitelével való megszüntetésére. Azonban a termékek biológiai aktivitása kérdéses. Az alábbi példákban a konformációs B¹sejt-epitópok megszüntetése és a fõ T¹sejt-epitópok megtartása céljából elõállítottuk a Dermatophagoides pteronyssinusm 2. allergéncsoportjába (Der p 2) tartozó két, az 1–53. aminosavakat és az 54–129. aminosavakat tartalmazó rekombináns fragmentumot. Továbbá készítettünk egy olyan rekombináns Der p 2 hibridmolekulát (54–129. aa+1–53. aa), amelyben a két rDer p 2 fragmentumot PCR-alapú gén-SOEing eljárással („gene splicing by overlap extension”, génátrendezés a túlnyúló végek lánchosszabbításával) fordított sorrendben rekombináltuk. Az 1–53. és 54–129. aminosavakat tartalmazó két rekombináns Der p 2 fragmentumot PCR-amplifikációval állítottuk elõ az 1. példában körvonalazottak szerint (lásd 8. ábra). Der p 2 Hibridmolekulát készítettünk fordított sorrendben (54–129. as+1–53. as), PCR-alapú gén-SOEing eljárással [Linhart és munkatársai, FASEB J. 16, 1301–1303 (2002)].

a) Expresszálás E. coliban, illetve Derp 2, Derp 2 fragmentumok és Derp 2 hibrid tisztítása Hisz-toldalékkal ellátott Der p 2¹t, Der p 2 fragmen40 tumokat (54–129. aa és 1–53. aa) és Der p 2 hibridet (54–129. aa+1–53. aa) kódoló cDNS¹t állítottunk elõ a 4. táblázatban ismertetett láncindítók (MWG, Ebersberg, Németország) alkalmazásával végzett PCR45 amplifikációval, illetve Der p RNS-bõl fordított transzkripcióval Der p 2 cDNS¹t készítettünk. 4. táblázat 50

55

60 39

Láncindító

Szekvencia

1 (F)

5’-GGAATTCCATATGGATCAAGTCGATGTC¹3’

2 (R)

5’-GGAATTCCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTTCAATTTTAGGGGT¹3’

3 (F)

5’-GGAATTCCATATGATCAAAGCCTCAAT¹3’

4 (R)

5’-GGAATTCCTTAGTGATGGTGATGGTGATGATCGCGGATTTTA¹3’

1

HU 005 333 T2

4. táblázat (folytatás) Láncindító

Szekvencia

5 (átfedõ)

5’-GTTTGACATCGACTTGATCATCGCGGATTTTAGCAT¹3’

6 (átfedõ)

5’-CATGCTAAAATCCGCGATGATCAAGTCGATGTCAAA¹3’

Elõre (F), vissza (R) és átfedõ láncindítókat jeleztük. Az EcoRI és NdeI helyeket aláhúztuk. A Hisz-toldalékot kódoló nukleotidokat vastag/dõlt betûkkel szedtük. Az 1. és 4. láncindítókat az rDer p 2 cDNS amplifikálására, az 1. és 2. láncindítókat az (1–53. aa) rDer p 2 fragmentumot kódoló cDNS, a 3. és 4. láncindítókat pedig az (54–129. aa) rDer p 2 fragmentumot kódoló cDNS amplifikálására alkalmaztuk. RDer p 2 hibridet a 2. és 3., illetve a két átfedõ 5. és 6. láncindító alkalmazásával végzett, PCR-alapú gén-SOEing eljárással állítottunk elõ. A 3’¹láncindítók NdeI és EcoRI helyet, az 5’¹láncindítók pedig EcoRI helyet és hat Hisz-kodont tartalmaztak. A PCR-terméket Ndel/EcoRI enzimekkel hasítottuk, gélen tisztítottuk, majd pET17b plazmid Ndel/EcoRI helyeire szubklónoztuk. A plazmidokat kalcium-klorid-eljárással XL¹1 Blue E. coli-törzsbe transzformáltuk. NuceloBond AX kit – maxi-prep (MachereyNagel, Németország) alkalmazásával plazmid-DNS¹t izoláltunk, és ellenõrzésképpen a cDNS inzert szekvenciáját automata szekvenálórendszerrel (MWG, Németország) mindkét DNS-szálon meghatároztuk. C-terminálisukon hat hisztidinbõl álló toldalékot tartalmazó rekombináns fehérjéket BL21 (DE3) E. colitörzs folyékony tenyészetében, 0,5 mM izopropil-b-tiogalaktopiranoziddal (IPTG) történt indukcióval expresszáltuk (1 órás OD=600, 5 h, 37 °C). Sejteket gyûjtöttünk össze centrifugálással (4000 g, 15 p, 4 °C). Tizenegy folyékony tenyészetbõl nyert baktériumüledéket 10 ml 25 mM¹os imidazolban (pH=7,4, 0,1% v/v Triton X–100) felszuszpendáltunk, és 100 mg Iizozimmel 30 percig, szobahõmérsékleten kezeltük. Sejteket lizáltunk 3 fagyasztásos/olvasztásos ciklussal (–70 °C/+50 °C), DNS emésztettünk 1 mg DNÁz I¹gyel (10 perc, szobahõmérséklet), és a sejttörmeléket centrifugálással (10 000 g, 30 perc, 4 °C) eltávolítottuk. Az oldható frakcióban lévõ rDer p 2 1. fragmentumot natív körülmények között, Ni¹NTA-gyantából készült affinitásoszlopon (QIAGEN, Németország) tisztítottuk. Az rDer p 2, rDer p 2 2. fragmentuma és az rDer p 2 hibrid az inklúziós testeket tartalmazó üledékben volt, amit 8 M urea, 100 mM NaH2PO4 és 10 mM Tris¹Cl (pH=8) tartalmú oldattal 60 percig szobahõmérsékleten szolubilizáltunk. Az oldhatatlan maradékot centrifugálással (10 000×g, 15 perc, 4 °C) távolítottuk el, és az rDer p 2¹t, rDer p 2 2. fragmentumát és az rDer p 2 hibridet denaturáló körülmények között, Ni¹NTA-gyantából készült affinitásoszlopon (QIAGEN, Németország) tisztítottuk. 90%-osnál nagyobb tisztaságú rekombináns fehérjéket tartalmazó frakciókat 50 mM NaH2PO4 (pH=7) el-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2

len dializáltunk, és a végsõ fehérjekoncentrációt Micro BCA Protein Assay Kit készlettel (Pierce, USA) határoztuk meg. A fentiekben leírtak szerinti hibridmolekula-konstrukció tönkretette a Der p 2 két b¹lemeze közül legalább az egyiket és a C8 és C119 közötti diszulfidkötést, és így a Der p 2 konformációs IgE-epitópjai megszûntek, a fõ T¹sejt-epitópok pedig megmaradtak. Az E. coliban látható sávként fokozottan expresszált rDer p 2 származékok megkülönböztetett akkumulációt eredményeztek (9. ábra, 1. sor), az rDer p 2 1. fragmentumát az oldható frakcióban találtuk meg, míg az oldhatatlan inklúziós testekben felgyülemlett többi fehérjét ureában fel lehetett oldani. Az rDer p 2¹t és rDer p 2 2. fragmentumát nikkel-affinitáskromatográfiával tisztítva (9. ábra, 2. sor) 1 liter E. coli tenyészetre vetítve 20–30 mg fehérjéhez jutottunk. Dialízissel történt újrafelgombolyítás („refolding”) után az rDer p 2, rDer p 2 1. fragmentuma és az rDer p 2 hibrid 0,5 mg/ml és 1 mg/ml közötti koncentrációban, fiziológiai pufferekben oldható maradt, míg az rDer p 2 2. fragmentuma csak 0,1 mg/ml alatti koncentrációban maradt oldható. SDS-PAGE-analízis szerint a fehérjék 90%-osnál nagyobb tisztaságúak voltak, és monomer, illetve dimer formákban migráltak (9. ábra, 2. sor). b) Az rDer p 2 és rDer p 2 származékok mátrixsegített lézerdeszorpció és ionizációs repülési idõ [matrix-assisted laser desorption and ionization-time of flight (MALDI-TOF)] tömegspektrometriája Lézerdeszorpciós tömegspektrumot vettünk fel lineáris módban time of¹flight Compact MALDI II berendezéssel (Kratos, U.K.; piCHEM, Ausztria). Mintákat oldottunk fel 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó 10%¹os acetonitrilben, mátrixként pedig 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó 60%¹os acetonitrilben oldott a¹ciano-4-hidroxi-fahéjsavat alkalmaztunk. Mintaelõkészítéshez fehérje és mátrixoldat 1:1 arányú keverékét helyeztük a célra, és levegõvel megszárítottuk. A négy fehérje MALDI-TOF tömegspektrometriás analízise szerint az rDer p 2 molekulatömege 15072,9 Da, az rDer p 2 1. fragmentumáé 6806,7 Da, az rDer p 2 2. fragmentumáé 9216,3 Da, az rDer p 2 hibridé pedig 15001,8 Da, ami megfelelt az aminosavszekvenciából számított elméleti fehérjetömegnek (10. ábra).

c) Cirkuláris dikroizmus (CD) analízis A tisztított rekombináns fehérjék CD¹spektrumait JASCO J715 spektropolariméterrel vettük fel, amelynek hullámhossza a gyártó javaslatai szerint neodimiumüveggel volt kalibrálva. A CD¹méréseket kétszeresen desztillált vízben oldott rDer p 2¹vel és rDer 55 P 2 származékokkal (C=0,1–0,5 mg/ml) végeztük szobahõmérsékleten. Küvettaként 0,1 cm¹es úthosszú, cirkuláris kvarcküvettát alkalmaztunk, és a spektrumokat 0,2 nm¹es felbontással és 50 nm/perces pásztázási sebességgel vettük fel. A spektrumokat legalább há60 rom pásztázási eredmény összegyûjtésével jelátlagol50

40

1

HU 005 333 T2

tuk, és az eredményeket egy adott hullámhosszúságra vonatkozó, átlagos oldallánc-elipticitásként adtuk meg. A tisztított rekombináns Der p 2 távoli ultraibolyaspektruma b¹lemezkonformációra utaló, 217 nm¹es negatív sávot tartalmaz (11. ábra). Ezzel szemben az rDer p 2 származékok CD¹spektruma jelzi, hogy e fehérjék nagyrészt nincsenek felgombolyodva. Az rDer p 2 1. fragmentuma jellemzõ, a körülbelül 200 nm¹nél megfigyelhetõ negatív sávval azonosított, legombolyodott konformációt mutat. Az rDer p 2 2. fragmentuma is fõként legombolyodott konformációt mutat, bár a jelintenzitás igen alacsony volt. Az rDer p 2 hibrid spektruma kis mennyiségû b¹lemezszerkezetek mellett fõként random gombolyag konformációt mutatott (11. ábra). A háromdimenziós konformáció megszûnte cirkuláris dikroizmus analízissel igazolható, amely a vad típusú rDer p 2 esetében találtakhoz képest az rDer p 2 származékokban elveszett vagy csökkent b¹lemezszerkezet mutatott ki. 7. példa: Rekombináns Der p 2 Hibrid (rDer p 2 Hibrid) jelentõs mértékben csökkent IgE-kötõ képességet mutat Tisztított rekombináns Der p 2¹t, a két rDer p 2 fragmentumot [az 1. fragmentumot (1–53. aa) és a 2. fragmentumot (54–129. aa)] és az rDer p 2 hibridet IgE-reaktivitásra teszteltük nem denaturáló dot-blot vizsgálatokban. A tisztított fehérjékbõl 2 mikrolitert (0,1 mg/ml) és – kontrollcélokra – BSA¹t cseppentettünk nitro-cellulóz-membránszalagokra (Schleicher &; Schuell, Németország). A dot-blotolt fehérjéket „A” pufferben (40 mM Na2HPO4, 0,6 mM NaH2PO4, pH=7,5, 0,5% [v/v] Tween 20, 0,5% [w/v] BSA, 0,05% [w/v] NaN3) blokkoltuk, és atkára allergiás betegek vagy nem allergiás személyek szérumaival (1:10 hígítás) vagy szérumot nem tartalmazó „A” pufferrel inkubáltuk. A kötött IgE antitesteket 125I-vel jelzett, emberi IgE elleni antitestekkel mutattuk ki és autoradiográfiával tettük láthatóvá. A vad típusú rDer p 2 allergén IgE-kötõ képességét a két rDer p 2 fragmentuméval és az rDer p 2 hibridével hasonítottuk össze nem denaturáló dot-blot vizsgálatokban. Tizenhét, atkára allergiás egyed széruma (1–17. sorok) különbözõ IgE-reaktivitást mutatott a nitro-cellulózra cseppentett rDer p 2¹re, viszont az Der p 2 1. fragmentumára alig lehetett IgE-reaktivitást kimutatni. Csak 3 szérum esetében tapasztaltunk igen gyenge kötõdést az rDer p 2 2. fragmentumához, és 2 szérum reagált az rDer p 2 hibriddel (12. ábra). Nem allergiás személyektõl származó szérum és a szérumot nem tartalmazó puffer nem mutatott IgE-reaktivitást az rDer p 2¹re vagy rDer p 2 származékokra (12. ábra, 18., 19. sor). A kontroll-BSA¹ra sem találtunk IgE-reaktivitást (12. ábra). A konformáció, és így a konformációs IgE-epitópok elvesztésének következményeként (lásd 7. példa) kimutatható, hogy a vad típusú rDer p 2¹höz képest az rDer p 2 származékok csaknem teljesen elvesztették IgE-kötõ képességüket.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

2

8. példa: rDer p 2 származékok csökkent allergénaktivitása a CD 203c expressziójával meghatározva Allergén betegektõl heparinizált vérmintákat vettünk. Vérmintákat (100 ml) inkubáltunk különbözõ koncentrációjú rDer p 2¹vel, rDer p 2 fragmentumokkal, rDer p 2 hibriddel, IgE elleni monoklonális antitesttel (Immunotech, Marseille, Franciaország) vagy PBS-sel (15 perc, 37 °C). CD 203c-expressziót az irodalomban leírtak szerint határoztunk meg [Hauswirth és munkatársai, J Allergy Clin Immunol 110,102 (2002)]. A CD 203c fokozó szabályozását (upregulation) az allergén által indukált bazofilaktiváció és ¹degranuláció pótmarkereként írták le [Hauswirth és munkatársai (2002)]. Ennélfogva a CD 203c, poratkára allergiás betegek bazofiljaira gyakorolt fokozó szabályozásának mérésével összehasonlítottuk a rekombináns Der p 2, rDer p 2 fragmentumok és rDer p 2 hibrid allergénaktivitását (13. és 14. ábra). A 13. ábra 3 betegre kapott reprezentatív eredményeket mutat be. 10 mg/ml vad típusú rDer p 2¹vel való inkubálása minden tesztelt betegben jelentõs mértékben fokozólag szabályozta az CD 203c expresszióját, míg ugyanazon koncentrációban alkalmazott egyedi fragmentumok vagy a két fragmentumok ekvimoláris keveréke esetében nem kaptunk fokozó szabályozást (13. ábra). Továbbá ugyanezen 10 betegbõl származó bazofileket különbözõ koncentrációjú (5 mg/ml–0,32 ng/ml) rDer p 2¹nek és rDer p 2 hibridnek (1:5 hígítási lépések) tettünk ki. A 14. ábra mutat be 6 reprezentatív betegnél kapott eredményeket. rDer p 2 hibridnek kitett bazofileknél a CD 203c-expresszió fokozó szabályozására 40 ng/ml és 5000 ng/ml közötti koncentrációkat kaptunk, míg a CD 203c, vad típusú rDer p 2 által indukált fokozó szabályozása már a 8–200 ng/ml közötti koncentrációk közé esett. A tízbõl nyolc betegben az rDer p 2 hibrid bazofilaktiváló képessége az rDer p 2¹jének kevesebb mint a tizede. Emberi IgE elleni antitestek minden betegben indukálták a CD 203c fokozó szabályozását a bazofileken, míg önmagában a puffer nem váltott ki fokozó szabályozást (13+14. ábra). CD 203c expressziójának meghatározása az atkára allergiás betegek bazofiljein jelzik, hogy a vad típusú rDer p 2¹jéhez képest a rDer p 2 hibrid biológiai aktivitása lecsökkent, és az rDer p 2 fragmentumokkal nem lehet biológiai aktivitást megfigyelni. Továbbá RBL-sejtek alkalmazásával végzett bazofilaktiválási vizsgálatok jelzik, hogy a származékokkal indukált IgE antitestek kevésbé anafilaktikusak. Ezen eredmények jelzik, hogy immunterápiára való alkalmazáskor a hipoallergén rDer p 2 származékok kevesebb, IgE-által közvetített mellékhatást indukálnak, mint a vad típusú Der p 2 allergén.

9. példa: A vad típusú rDer p 2 allergénhez hasonlóan az rDer p 2 származékok rDer p 2¹re specifikus IgG antitesteket indukálnak egérben Öt, nyolchetes korú, nõstény BALB/c egerek csoportjait 5 mg, 200 ml AluGel-S¹re (SERVA Electrophore60 sis, Németország) abszorbeált tisztított (rDerp 2, rDer p 55

41

1

HU 005 333 T2

2 1. fragmentum, rDer p 2 2. fragmentum vagy rDer p 2 hibrid) fehérjével immunizáltunk négyhetente 20 hétig, a nyakon szubkután. Az egyes immunizálások elõtt egy nappal vérmintákat gyûjtöttünk, és 20 °C¹on tároltuk. ELISA-lemezeket (Greiner, Ausztria) PBS-ben hígított rDer p 2¹vel (c=5 mg/ml) vontunk be 12 órán át, 4 °C¹on. A lemezeket PBST-vel (PBS; 0,05% v/v Tween 20) kétszer mostuk, és blokkolópufferrel (PBST; 1% w/v BSA) 3 órán át, szobahõmérsékleten blokkoltuk. Derp 2¹re specifikus lgG1 méréséhez PBST-ben (+0,5% w/v BSA) egérszérumot hígítottunk 1:1000 arányban, és a lyukakhoz ebbõl az oldatból 100 ml¹t adtunk, és 12 órán át 4 °C¹on inkubáltuk. A lemezeket PBST-vel ötször mostuk, és a felkötött IgG1 antitesteket egér IgG1 elleni, patkányeredetû monoklonális antitestekkel (BD Pharmingen, USA), majd retek-peroxidázzal jelzett, patkány IgG elleni, kecskeeredetû antitestek (Amersham Bioscience, Svédország) hozzáadásával mutattuk ki [lásd Vrtala és munkatársai, J Allergy Clin Immunol 98, 913 (1996)]. rDer p 2¹vel és rDer p 2 származékokkal immunizált egerekbõl nyert szérummintákban meghatároztuk a Der p 2¹re specifikus IgG1 szinteket (15. ábra). Az rDer p 2, akárcsak az rDer p 2 származékok immunogének voltak, és egerekben a második immunizálás után (8. hét) IgG1 válaszokat indukáltak (15. ábra). A második immunizálás után az rDerp 2 1. fragmentumával és az rDer p 2 hibriddel indukált IgG1 válaszok még az rDerp 2¹vel indukáltnál is magasabbak voltak (15. ábra). Az utolsó immunizálási követõen az rDer p 2 származékokkal indukált IgG1 válaszok összehasonlíthatók voltak a vad típusú rDer p 2 molekulával indukáltakkal (15. ábra). 10. példa: rDer p 2 származékokkal végzett immunizálással indukált IgG1 antitestek gátolták az atkára allergiás betegekbõl származó IgE kötõdését a vad típusú rDer p 2¹höz ELISA-lemezeket (Greiner, Ausztria) vontunk be 100 ml, PBS-sel 5 mg/ml koncentrációra hígított, tisztí-

5

10

15

20

25

30

35

2

tott rDer p 2¹vel (12 óra, 4 °C). A lemezeket PBST-vel kétszer mostuk, és blokkolópufferrel (PBST, 1% w/v BSA) 3 órán át, szobahõmérsékleten blokkoltuk, majd a lemezeket rDer p 2 elleni, rDer p 2 2. fragmentuma elleni, rDer p 2 1. fragmentuma elleni vagy rDer p 2 hibrid elleni antiszérummal vagy a megfelelõ, immunizálás elõtti szérumokkal inkubáltuk (12 óra, 4 °C). Egéreredetû antiszérumot 1:20 arányban és nyúleredetû antiszérumot pedig 1:100 arányban hígítottunk PBST-ben (+0,5% w/v BSA). Mosás után a lemezeket atkára allergiás betegekbõl származó, 1:10 arányban hígított szérumokkal 4 °C¹on inkubáltuk, és a kötõdött IgE antitesteket 1:2500 arányban PBST-ben (+0,5% w/v BSA) hígított, HRP-vel kapcsolt, emberi IgE elleni, kecskeeredetû antitestekkel mutattuk az irodalomban leírtak szerinti módon [44, 45]. Az IgE-kötõdés százalékos gátlását az alábbiak szerint számítottuk ki: 100–(ODs/ODp)×100, ahol ODs az immunszérummal, az ODp pedig a megfelelõ, immunizálás elõtti szérummal való elõzetes inkubálás után extinkciós koefficienseket jelenti. rDer p 2¹vel és az rDer p 2 származékokkal végzett immunizálással indukált egéreredetû IgG1 antitesteket kompetíciós ELISA-vizsgálatokban tanulmányoztunk arra nézve, hogy képesek¹e gátolni atkára allergiás betegek IgE-jének rDer p 2¹höz való kötõdését. Az allergiás betegek IgE-jének vad típusú rDer p 2¹höz való kötõdésének egéreredetû IgG antitestekkel történõ gátlásának százalékos értékeit az 5. és 6. táblázat mutatja be. Az egéreredetû, rDer p 2 elleni antitestekkel elért gátlás mértéke 61% és 87% közé esett (átlag: 75%), míg az rDer p 2 hibrid elleni egéreredetû antitestek, rDer p 2 1. fragmentuma elleni antitestek és rDer p 2 2. fragmentuma elleni antitestek a szérumeredetû IgE vad típusú rDer p 2¹höz való kötõdését 47 és 76% közötti (átlag 62%), 48 és 66% közötti (átlag 54%), illetve 24 és 52% közötti (átlag 41%) mértékben (megfelelõen) gátolták (5. táblázat).

5. táblázat IgE-kötõdés gátlása (%) Antitestek

1. beteg

2. beteg

3. beteg

4. beteg

Átlag

rDer p 2 1. fragmentum

48

66

53

50

54


39

50

52

24

41

rDer p 2 hibrid

59

76

64

47

62

rDer p 2

61

87

11

73

75

További kísérletekben tisztított rDer p 2¹vel és a három rDer p 2 származékkal nyulakat immunizáltunk. A nyúleredetû antiszérum atkára allergiás betegek IgEjének rDer p 2¹höz való kötõdését gátló képességét is teszteltük ELISA gátlási vizsgálatokban, és az egérszérummal kapottakhoz hasonló eredményhez jutottunk (6. táblázat). Az rDer p 2 elleni nyúleredetû antitestek a betegek IgE-jének rDer p 2¹höz való kötõdését

47% és 89% közötti mértékben (átlag 66%) gátolták, míg az rDer p 2 hibrid elleni antitestek 20% és 86% kö55 zötti mértékben (átlag 59%) gátolták az emberi IgE kötõdését. Az rDer p 2 1. fragmentuma elleni nyúleredetû antitestekkel kapott gátlás mértéke 26% és 70% közé esett (átlag 52%), és az rDer p 2 2. fragmentuma elleni nyúleredetû antitestekkel elért gátlás pedig 32–54%¹os 60 (átlag 42%) volt. Az 1. fragmentum elleni antitestek és 42

1

HU 005 333 T2

a 2. fragmentum elleni antitestek keverékének alkalmazásával a betegek IgE-jének vad típusú rDer p 2¹höz

2

való kötõdésének gátlása csak kismértékben (55%¹os átlagra) emelkedett (6. táblázat).

6. táblázat IgE-kötõdés gátlása (%) Antitestek

1. beteg

2. beteg

3. beteg

4. beteg

5. beteg

Átlag


59

70

49

26

57

52


40

49

33

32

54

42

1. fragmentum+2. fragmentum

60

69

44

38

66

55

rDer p 2 hibrid

61

86

61

20

67

59

rDer p 2

60

89

53

47

78

66

Az egerek immunizálása megmutatta mindhárom rDer p 2 immunogenitását azok IgG antitest választ indukáló képességük révén. Atkára allergiás betegek IgE-jének Der p 2¹höz való kötõdését gátoltuk mindhárom rDer p 2 származékkal, ám az rDer p 2 hibrid által indukált IgG antitestek a két egyedi fragmentummal és még az 1. és 2. fragmentum által indukált IgG antitestek keverékével elértnél is jobb gátlóképességet jeleztek. Ezen eredmények igen jelentõsek, mivel a blokkoló antitestekrõl kimutatták, hogy fontos szerepet játszanak a rekombináns allergénekkel SIT-ben. Egerek immunizálásával indukált, rDer p 2 elleni és rDer p 2 származékok elleni antitestek gátolják az allergén betegek IgE-jének kötõdését az rDer p 2¹höz (lásd ELISA gátlási vizsgálat). A jelen egérmodellben a Der p 2 hibrid blokkoló antitesteket indukál. Az immunogenitás a fragmentumok újrakeverésével jelentõs mértékben fokozódik.

20

25

30

35 11. példa: rDer p 2 származékokon alapuló vakcinák allergén hatása alacsonyabb in vivo, mint a vad típusú rDer p 2¹n alapuló vakcináé Patkányeredetû bazofil leukémia (RBL)-sejteket (RBL-2H3 számú alvonal) sejttenyésztõ tápoldatban (100 ml RPMI 1649, 10% FCS, 4 mM L¹glutamin, 2 mM nátrium-piruvát, 10 mM HEPES, 100 mM 2¹merkaptoetanol, 1% Pen/Strep) ELISA-lemezekre (Nunc, Dánia) lemezeltünk ki (100 ml/4×104 sejt), és 12 órán át 37 °C, 5% CO2-tartalom mellett inkubáltuk. A sejtekhez rDerp 2¹vel, rDer p 2 1. fragmentummal, rDerp 2 2. fragmentummal és rDer p 2 hibriddel immunizált egerektõl vett 2 ml szérumot adtunk, és 2 órán át 37 °C¹on inkubáltuk, 200 ml Tyrode/BSA pufferrel [137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 5,6 mM D¹glükóz, 12 mM NaHCO3, 10 mM N¹2-hidroxi-etil-piperazin-N’2-etánszulfosav (HEPES), 0,1% borjúszérum-albumin, pH=7,2] (Sigma-Aldrich, Ausztria) kétszer mostuk és rDer p 2¹vel (c=0,3 mg/ml) stimuláltuk. A b¹hexózaminidáz teljes felszabadulását 10 ml 10%¹os Triton X¹100 (Merck, Németország) hozzáadásával indukáltuk. A b¹hexózaminidáz felszabadulásának méréséhez 50 ml vizsgálati oldatot (80 mM 4¹metilumbelliferil-N-

40

45

acetil-p-D-glükózaminid 0,1 M¹os citrátpufferben, pH=4,5) 50 ml felülúszóval inkubáltunk 1 órán át 37 °C¹on, 5% CO2-tartalom mellett. A reakciót 100 ml glicinpuffer (0,2 M glicin, 0,2 M NaCI, pH=10,7) hozzáadásával állítottuk le, és fluoreszcens mikrolemezleolvasó (Dynatech MR 7000, Dynatech Laboratories, USA) alkalmazásával fluoreszcenciát mértünk (lex: 360 nm lem: 465 nm). Az eredményeket a teljes b¹hexózaminidáz-felszabadulás százalékos arányai átlagaként adtuk meg. Annak vizsgálatára, hogy rDer p 2 származékokkal végzett vakcinálás indukál¹e allergiás immunválaszt a vad típusú Derp 2 allergénnel szemben, egereket immunizáltunk rDerp 2¹vel, rDer p 2 1. fragmentummal, rDerp 2 2. fragmentummal és rDer p 2 hibriddel. A vad típusú Derp 2 allergénnel szembeni allergiás immunválasz RBL degranulációs vizsgálattal történõ kvantifikálása céljából az egerekbõl vett szérummintákat RBL-sejtekhez adtuk. Az rDer p 2 1. fragmentuma elleni, rDerp 2 2. fragmentuma elleni és rDer p 2 hibrid elleni, egéreredetû antitestekkel inkubált RBL-eknél a vad típusú rDerp 2 allergénnel kapott felszabadulás 0% és 16,6% közötti (átlag 6,4%), 0,2% és 28,6% közötti (átlag 13,2%) és 4,7% és 37,1% közötti (átlag 18,3%) (megfelelõen) volt, míg a vad típusú rDerp 2 allergén elleni antitestekkel inkubált RBL-ekben a vad típusú rDerp 2 végzett stimulálás után a felszabadulás 35% és 39% közötti (átlag 37%) volt (16. ábra).

12. példa: Vad típusú Phl p 12¹t, más pollenekbõl származó profilineket és növényi eredetû élelmiszerekbõl származó profilineket felismerni 50 képes, MP12 által indukált IgG antitestek ELISA-vizsgálatokat végeztünk annak tesztelésére, hogy az MP12-vel végzett immunizálás után indukált antitestek felismernek¹e pollenekbõl és más növényi eredetû élelmiszerekbõl származó profilineket. 55 Réti komócsin pollenjébõl (Phl p 12), nyírpollenbõl (Bet v 2), fekete üröm pollenjébõl (Art v 4) és különféle növényi eredetû élelmiszerekbõl [kesudió (Ana c), zeller (Api g 4), banán (Mus xp 1), mogyoró (Cor a 2) és sárgarépa (Dau c 4)] származó profilinekkel (5 mg/ml) 60 ELISA-lemezeket vontunk be, és nyúleredetû antiszé43

1

HU 005 333 T2

rumból készült hígítási sorozatokkal (1:2000–1:64 000) inkubáltuk. A felkötõdött, nyúleredetû antitesteket POX-szal jelzett, szamáreredetû, nyúl elleni antiszérummal mutattuk ki. Az MP12 a vad típusú Phl p 12 által indukálttal összevethetõ mértékû IgG antitest választ indukált (17. ábra). A Phl p 12 és az MP12 által indukált IgG antitestek egyaránt keresztreagáltak a pollenekbõl (füvek, fák, gyomok) és növény eredetû élelmiszerekbõl származó profilinekkel (17. ábra). 13. példa: MP12 elleni antitestek gátolják a fûfélék pollenjére allergiás betegek szérumából származó IgE kötõdését a komplett Phl p 12¹höz, más pollenekbõl (fák és gyomok) származó profilinekhez és növényi eredetû élelmiszerek profilinjeihez Kompetíciós ELISA kísérletekkel megvizsgáltuk az MP12 által indukált, nyúleredetû IgG azon tulajdonságát, hogy képes¹e gátolni az allergiás betegek IgE-jének a Phl p 12¹höz, különféle pollenekbõl származó

2

profilinekhez és növényi eredetû élelmiszerek profilinjeihez való kötõdését. ELISA-lemezeket (NuncMaxisorp, Dánia) vontunk be réti komócsin pollenjébõl (rPhl p 12), nyírpollenbõl 5 (rBet v 1), sárgarépából (rDau c 4), mogyoróból (rCor a 2), banánból (rMus xp 1) és kesudióból (rAna c 1) származó profilinekkel, és 1:50 arányban hígított Phl p 12 elleni antiszérummal, MP12 elleni antiszérummal, és – kontrollcélokból – a megfelelõ, immunizálás elõtti 10 szérummal elõinkubáltuk. Mosás után a lemezeket nyolc, profilinre érzékenyített betegtõl vett, 1:3 arányban hígított szérumokkal inkubáltuk, majd a felkötõdött IgE antitesteket 1:2500 arányban hígított, HRP-vel jelzett, emberi IgE ellen kecskében készített szérummal 15 (KPL, USA) mutattuk ki. A Phl p 12 vagy MP12 elleni szérummal végzett elõinkubálással elért IgE-kötõdés százalékos gátlását az alábbiak szerint számítottuk ki. IgE-kötõdés %¹os gátlása=100–ODi/ODP×100. ODi és ODP=a nyúl immunszérumokkal és az immunizálás 20 elõtt gyûjtött megfelelõ antiszérummal végzett elõinkubálás után mért extinkciók (megfelelõen) (7. táblázat).

7. táblázat Az IgE-kötõdés százalékos gátlása Beteg

Phl p 12 aPhlp 12

Bet v 2

Cor a 2

Mus xp 1

Dau c 4

aMP12

aPhlp 12

aMP12

aPhlp 12

aMP12

aPhlp 12

aMP12

aPhlp 12

aMP12

Ana c 1 aPhlp 12

aMP12

1.

91

82,7

88,3

84,4

61,3

58,7

70,6

46,4

82,7

83,3

70

71,7

2.

82,5

72,8

74,9

77,6

73,3

60,3

74,4

50,8

75,5

83,2

62,3

45,1

3.

89,4

72,3

75,4

76,4

58,8

61,6

74,4

33,5

65,4

63,1

61,6

56

4.

77,4

72

69

69,6

56,00

52

57,2

39,8

65

66,8

71,5

41,5

5.

86,3

65,2

35

66,4

68,6

52

75,5

27,2

97,5

93,8

59,5

56,2

6.

71,2

84,7

54,4

72

57

62,7

73,9

25,6

58,5

68,3

44,3

42,6

7.

83,6

70,4

60,2

70,8

69,7

59,7

72,5

35,6

72,4

71,3

28,1

32,2

8.

89,1

57,4

61

79

57,8

57,8

73

29,6

70

67

Átlag

83,8

72,3

64,8

74,5

62,3

58,1

71,4

36,1

73,3

74,6

56,8

53,6

Az IgE réti komócsin pollenjébõl származó profilinhez való kötõdésének Phl p 12 (83,8%) és MP12 által indukált antitestekkel elért gátlásának átlaga (72,3%) összevethetõ volt (7. táblázat). Az IgE nyírfapollen-profilinhez (Bet 2 v) való kötõdését még a Phl p 12¹vel indukált antitesteknél (64,8%¹os átlagos gátlás) is jobban gátolták az MP12¹re specifikus antitestek (74,5%¹os átlagos gátlás). Az IgE növényi eredetû élelmiszerek profilinjeihez való kötõdését mindkét antiszérum nagyon hasonló mértékben gátolta (Cor a 2: Phl p 12 elleni IgG-vel 62,3%¹os átlagos gátlás, MP12 elleni IgGvel 58,1%¹os átlagos gátlás; Dau c 4: Phl p 12 elleni IgG-vel 73,3%¹os átlagos gátlás, MP12 elleni IgG-vel 7,6%¹os átlagos gátlás; Ana c 1: Phl p 12 elleni IgG-vel 56,8%¹os átlagos gátlás, MP12 elleni IgG-vel 53,6%¹os átlagos gátlás). Csak az IgE banáneredetû profilinhez (Mus xp 1) való kötõdését gátolta kevésbé az MP12 el-

leni IgG (36,1%) a Phl p 12 által indukált IgG-nél 45 (71,4%) (7. táblázat). A profilin minden eukarióta sejtben expresszálódó allergén, és így olyan pánallergén, amely érzékenyített betegekben belégzéses allergiákat (például rhinoconjunctivis, asztma) és orális felvétel esetén orális aller50 giás szindrómákat (az ajkak és a nyelv viszketése és duzzadása) indukálhat. Az újrakevert Phl p 12 származék (MP12) immunizálás után olyan IgG antitesteket indukál, amelyek a pollenekbõl és növényi eredetû táplálékból származó 55 profilineket egyaránt felismeri. MP12 által indukált antitestek gátolják a beteg szérumában lévõ IgE kötõdését a pollenekbõl és növényi eredetû táplálékból származó profilinhez. Eszerint az MP12 alkalmas a profilinnel szembeni allergiának tulajdonítható pollen-élelmiszer 60 keresztérzékenység kezelésére. 44

1

HU 005 333 T2

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás csökkent allergénaktivitású, vad típusú fehérjeallergén-származékok elõállítására, amelyet az alábbi lépések jellemeznek: – allergénaktivitású, vad típusú fehérjeallergént állítunk elõ, – a vad típusú fehérjeallergént két részre szabjuk, amely két rész csökkent allergénaktivitású, vagy allergénaktivitásuk hiányzik, és – a két fragmentumot fordított orientációban ismét összekapcsoljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a származékot rekombináns fehérjeként állítjuk elõ gazdában, különösen nagy expressziós kapacitású gazdával. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vad típusú allergén az alábbiak csoportjából választott: profilinek, különösen a Phl p 12, nyírfaallergének, különösen a Bet v 4, poratkaallergének, különösen a Der p 2, készletatka-allergének, különösen a Lep d 2, komócsinallergének, különösen a Phl p 7. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az allergénaktivitás csökkenését a vad típusú allergénnel összehasonlítva az IgE-kötõ képesség legalább 10%¹os, elõnyösen legalább 20%¹os, különösen legalább 30%¹os gátlásának megfelelõ csökkenésével mérjük. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az allergénaktivitás csökkenését allergénnel érzékenyített beteg szérumában lévõ IgE antitesteknek a származék dot-blotjához való kötõdésének hiányával mérjük. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a származékokat gyógyászatilag elfogadható vivõanyaggal kombináljuk, és kész gyógyászati készítményt állítunk elõ belõle. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a származékokat megfelelõ vakcinaadjuvánssal kombináljuk, és gyógyászatilag elfogadható kész vakcinakészítményt állítunk elõ belõle. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a származékokat további allergénekkel kombinálva kombinációs vakcinát állítunk elõ. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az allergén vad típusú allergén, különösen vad típusú allergének, rekombináns vad típusú allergének, vad típusú fehérjeallergén-származékok keveréke vagy azok keverékeinek keveréke. 10. A 6–9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítmény allergénkivonatot is tartalmaz. 11. Vad típusú fehérjeallergén allergénszármazéka, amely vad típusú fehérjeallergén l¹tõl Z¹ig terjedõ aminosavszekvenciájú, azzal jellemezve, hogy a származék egymás mellett – N¹terminális-C-terminális orientációban – tartalmazza a két vad típusú, X¹tõl Z¹ig terjedõ és l¹tõl X¹ig terjedõ allergénfragmentumot, és a két vad típusú allergénfragmentumnak csökkent allergénaktivitása van, vagy nincs allergénaktivitásuk.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 45

2

12. A 11. igénypont szerinti allergénszármazék, azzal jellemezve, hogy X–Z és l–X legalább 30 aminosav hosszúságú, elõnyösen legalább 50 aminosav hosszúságú, különösen legalább 60 aminosav hosszúságú. 13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti allergénszármazék, azzal jellemezve, hogy X–Z és l–X méretüket tekintve 50%-ban vagy annál kisebb mértékben, elõnyösen 30%-ban vagy annál kisebb mértékben, különösen 20%-ban vagy annál kisebb mértékben térnek el. 14. A 11–13. igénypontok bármelyike szerinti allergénszármazék, azzal jellemezve, hogy a vad típusú allergén az I¹es típusú allergének közül, elõnyösen az A) táblázatban felsorolt allergének közül választott; még elõnyösebben az alábbiak allergénjei közül választott: réti komócsin (Phelum pratense) pollenje, különösen a Phl p 12, nyír (Betula verrucosa) pollenje, különösen a Bet v 4, kecskedarázs (Vespula vulgaris) venomja, papírdarázs (Polistes annularis) venomja, Parietaria judaica pollenje, angolperje pollenje, poratkaallergének, különösen a Der p 2, vagy ezek keverékei. 15. Allergénkészítmény, amely a 11–14. igénypontok bármelyike szerinti allergénszármazékot és további allergéneket, elõnyösen vad típusú allergéneket tartalmaz, különösen vad típusú allergének, rekombináns vad típusú allergének, vad típusú fehérjeallergének származékai keverékét vagy azok keverékeinek keverékét tartalmazza. 16. A 15. igénypont szerinti allergénkészítmény, azzal jellemezve, hogy a készítmény allergénkivonatot is tartalmaz. 17. A 15. vagy 16. igénypont szerinti allergénkészítmény, azzal jellemezve, hogy a készítmény gyógyászatilag elfogadható vivõanyagot tartalmaz. 18. A 11–17. igénypontok szerinti allergénszármazék vagy allergénkészítmény alkalmazása allergénspecifikus immunterápiás gyógyszer elõállítására. 19. A 11–17. igénypontok szerinti allergénszármazék vagy allergénkészítmény alkalmazása passzív immunizálásra szolgáló gyógyszer elõállítására. 20. A 11–17. igénypontok szerinti allergénszármazék vagy allergénkészítmény alkalmazása megelõzõ immunizálásra szolgáló gyógyszer elõállítására. 21. A 18–20. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszer tartalmaz továbbá adjuvánsokat, hígítókat, tartósítószereket, vagy tartalmazza azok keverékeit. 22. A 18–21. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns allergénszármazék 10 ng–1 g, elõnyösen 100 ng–10 mg, különösen 0,5 mg–200 mg mennyiségét tartalmazza. 23. Eljárás a 11–17. igénypontok bármelyike szerinti allergénszármazék elõállítására, az alábbi lépésekkel jellemezve: – a 11–17. igénypontok bármelyike szerinti allergénszármazékot kódoló DNS-molekulát biztosítunk, – a DNS-molekulával gazdasejtet transzformálunk, és – a származékot a gazdasejtben expresszáljuk, és izoláljuk a származékot.

1

HU 005 333 T2

24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejt nagy expressziós kapacitású gazdasejt. 25. Eljárás a 11–17. igénypontok bármelyike szerinti allergénszármazék elõállítására, azzal jellemezve, hogy azt kémiai szintézissel állítjuk elõ. 26. Az 1–10. igénypontok vagy a 23–25. igénypontok bármelyike szerinti eljárással egy elsõ vad típusú profilinmolekulából elõállítható profilinszármazéknak vagy egy elsõ vad típusú profilinmolekula 11–14. igénypontok szerinti allergénszármazékának az alkalmazása egy második, vad típusú profilinmolekula által okozott allergiás betegségek megelõzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására.

2

27. A 26. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az elsõ és második profilinmolekula a Phl p 12, Bet v 2, Art v 4, Ana c, Api g 4, Mus xp 1, Cor a 2, és Dau c 4 alkotta csoportból választott. 28. A 26. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jelle5 mezve, hogy az elsõ profilinmolekula Phl p 12, és a második profilinmolekula pedig a Bet v 2, Art v 4, Ana c, Api g 4, Mus xp 1, Cor a 2, és Dau c 4 alkotta csoportból választott. 29. A 27. vagy 28. igénypont szerinti alkalmazás 10 profilinallergiának tulajdonítható pollen-élelmiszer keresztérzékenyítés kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló gyógyszer gyártására.

46

HU 005 333 T2 Int. Cl.: C07K 14/415

47

HU 005 333 T2 Int. Cl.: C07K 14/415

48

HU 005 333 T2 Int. Cl.: C07K 14/415

49

HU 005 333 T2 Int. Cl.: C07K 14/415

50

HU 005 333 T2 Int. Cl.: C07K 14/415

51

HU 005 333 T2 Int. Cl.: C07K 14/415

52

HU 005 333 T2 Int. Cl.: C07K 14/415

53

HU 005 333 T2 Int. Cl.: C07K 14/415

54

HU 005 333 T2 Int. Cl.: C07K 14/415

55

HU 005 333 T2 Int. Cl.: C07K 14/415

56

HU 005 333 T2 Int. Cl.: C07K 14/415

57

HU 005 333 T2 Int. Cl.: C07K 14/415

58

HU 005 333 T2 Int. Cl.: C07K 14/415

59

HU 005 333 T2 Int. Cl.: C07K 14/415

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest

(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Recommend Documents