!HU000008107T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 107
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C07K 1/113
(21) Magyar ügyszám: E 05 854704 (22) A bejelentés napja: 2005. 12. 20. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050854704 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1828225 A1 2006. 06. 29. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1828225 B1 2010. 03. 03.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 639349 P 2004. 12. 24.
(73) Jogosult: Insmed, Inc., Richmond, VA 23235 (US)
US
(72) Feltalálók: SLEEVI, Mark, C., Midlothian, VA 23113 (US); KELLEY, Glen, L., Glen Allen, VA 23059 (US) (54)
(2006.01) A61K 38/30 (2006.01) C07K 1/18 (2006.01) C07K 14/47 (2006.01) C07K 14/65 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06069029 PCT/US 05/046040
(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Tisztított RHIGF-I/RHIGFBP-3-komplexek és eljárás gyártásukra
(57) Kivonat
HU 008 107 T2
A találmány tárgyát olyan készítmények képezik, melyek l¹es számú inzulinszerû növekedési faktorból és 3¹as számú, inzulinszerû növekedési faktort kötõ fehér-
jébõl („insulin like growth factor binding protein¹3; IGFBP¹3”) álló, ultratiszta komplexeket tartalmaznak, továbbá eljárások ezek elõállítására.
A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 11 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 008 107 T2
A találmány mûszaki területe A találmány tárgyát készítmények képezik, melyek l¹es számú inzulinszerû növekedési faktorból és 3¹as számú, inzulinszerû növekedési faktort kötõ fehérjébõl („insulin like growth factor binding protein¹3; IGFBP-3”) álló, ultra-tiszta komplexeket tartalmaznak, valamint eljárások ezek elõállítására. A találmány mûszaki hátterének leírása IGF-I/IGFBP¹3 egy fehérjekomplex, amely l¹es számú inzulinszerû növekedési faktorból („IGF¹I”) és 3¹as számú, inzulinszerû növekedési faktort kötõ fehérjébõl („IGFBP¹3”) áll. Az IGF¹I egy kisméretû polipeptid, amely strukturálisan és funkcionálisan erõsen homológ a proinzulinnal. Mint ilyen, az IGF¹I sok olyan fiziológiai hatást képes elõidézni, mint az inzulin. Az IGF-I/IGFBP-3-komplexeket széles körben elõforduló rendellenességek kezelésére lehet alkalmazni (lásd például 5,681,818, 5,723,441, 5,948,757, 6,015,786, 6,017,885, 6,025,368, 6,514,937 és 6,518,238 számú USA-beli szabadalmi leírásokat). Egészséges személyekben IGF¹I a keringésben található, más fehérjék által kötve. Az IGF¹I például gyakran kötõdik IGFBP-3-hoz, amely a leggyakoribb IGF-Ikötõ fehérje. Az IGF-I/IGFBP-3-komplex egy savra labilis alegységfehérjével asszociált, 150 kD méretû komplexet képezve, lásd Adams és munkatársai, Prog. Growth Factor Res. 6, 347–56 (1995). Ez a nagyméretû, terner komplex szolgál a keringésben IGF-I-tartalékként, mivel az IGF-I/IGFBP-3-komplex hosszabb féléletidõvel és jobb stabilitással rendelkezik, mint a szabad IGF¹I. Lásd Adams és munkatársai, mint fent, és Blum és munkatársai, „Plasma IGFBP¹3 Levels as Clinical Indicators, in Modern Concepts of Insulin-like Growth Factors” címû könyvben 381–93. old, szerk. E. M. Spencer, Elsevier, New York. IGF-I-hez, IGFBP-3-hoz és IGF-I/IGFBP-3-komplexekhez természetes forrásokból vagy rekombináns technikákkal juthatunk. Rekombináns technológiát lehet alkalmazni IGF¹I, IGFBP¹3 és IGF-I/IGFBP-3komplexek elõállítására eukarióta és prokarióta organizmusokban (lásd például az 5,200,509, 5,670,341, 5,789,547 és 6,417,330 számú USA-beli szabadalmi leírásokat). Rekombináns IGF¹I, IGFBP¹3 és IGFI/IGFBP-3-komplexeket termelõ organizmusokat szakaszos („batch”) vagy folyamatos módszerrel lehet tenyészteni úgy, hogy elkülönítjük a sejttenyészet felülúszóját vagy magukat a rekombináns sejteket. IGF¹I, IGFBP¹3 és IGF-I/IGFBP-3-komplexeket tipikusan tisztítják rekombináns rendszerekben történõ expresszió után olyan technikák alkalmazásával, mint méretkizáráson alapuló kromatográfia, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia és ioncserélõ kromatográfia. Azonban ilyen technikák nem távolítanak el minden szennyezõdést. Például az IGF-I/IGFBP-3komplexek tipikusan fehérje-aggregátumokat tartalmazó, részlegesen tisztított készítmények formájában vannak jelen. Továbbá találtak újabb szennyezõdéseket, például az IGFB3 tömeg és töltés szerinti variánsait, amelyeket nem távolítanak el a technika jelenlegi
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
állása szerint alkalmazott eljárások. Az 1. ábrán bemutatunk egy kationcsere görbéjét, melyet minták karboximetil-ioncserélõ („CM-IEX”) kromatográfiájával kaptunk lineáris gradiens alkalmazásával IGP-I/IFGBP-3-komplexekre és fehérjeaggregátumokra. A 2. ábrán IGFI/IGFBP-3-komplexek LC/MS-analízise látható, amelyek CM¹IEX¹en lineáris gradiens alkalmazásával lettek tisztítva, ezen bemutatjuk az újonnan felfedezett tömeg- és töltésvariánsokat. Az 5,789,547 számú USAbeli szabadalmi leírásban l¹es számú inzulinszerû növekedési faktor (IGF¹I) és 3¹as számú, inzulinszerû növekedési faktort kötõ fehérje (IGFBP¹3) konformációjának helyreállítására szolgáló eljárást közölnek. A közölt eljárás két, külön expresszált, tisztított és denaturált fehérje konformációjának együttes helyreállítását tartalmazza, amely megoldja a rekombináns expresszióval, azaz a helytelen konformációval és kismértékû oldhatósággal kapcsolatos problémákat. A 6,417,330. számú USA-beli szabadalmi leírásban olyan IGFBP-variánsokat, különösen IGFBP¹3 töltés szerinti variánsait közlik, amelyek hidrolízisre rezisztensek, megváltoztatott sejtmag-lokalizációs szekvenciával vagy N¹terminális meghosszabbításokkal rendelkeznek. A fehérjevariánsokhoz rekombináns expresszióval és kationcserélõ kromatográfián történõ tisztítással jutnak, és leírják, hogy az említett fehérjék helyes konformációjának kialakulását segíti, ha a konformációt helyreállító reakció IGF¹el együtt megy végbe. Általánosan elfogadott a gyógyszerészeti tudományban, hogy tiszta gyógyszer nagyon kívánatos, és az, hogy egy gyógyszer tisztaságában elért akár kismértékû javítások is jelentõs javulásnak számítanak. Ennek oka az, hogy a szennyezõdések elõre nem látható hatással lehetnek a gyógyszer stabilitására, biztonságára vagy hatékonyságára. Ennek megfelelõen, IGF-I/IGFBP-3-komplexek tisztítására szolgáló eljárások eredendõen hasznosak és szükségesek. Összefoglalás A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya izolált fehérje, amely IGFI/GFBP¹3 l¹es számú inzulinszerû növekedési faktorból („IGF¹I”) és 3¹as számú, inzulinszerû növekedési faktort kötõ fehérjébõl („IGFBP¹3”) álló komplexet foglal magában, ahol az izolált fehérje legalább 96%¹os tisztaságú, legalább 97%¹os tisztaságú, legalább 98%¹os tisztaságú vagy legalább 99%¹os tisztaságú, analitikai CM¹HPLC-vel mérve. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a komplex IGF-I¹et és IGFBP-3¹at körülbelül 0,8:1 és körülbelül 1,2:1 közötti moláris arányban foglal magában. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módja szerint, a moláris arány körülbelül 1:1. A találmány tárgyát képezik gyógyászati készítmények is, amelyek IGF¹I és IGFBP¹3 komplexét tartalmazó izolált fehérjét és gyógyászatilag elfogadható hordozót foglalnak magukban, ahol a fehérje legalább 96%¹os tisztaságú, legalább 97%¹os tisztaságú, legalább 98%¹os tisztaságú vagy legalább 99%¹os tisztaságú, analitikai CM¹HPLC-vel mérve.
1
HU 008 107 T2
A találmány tárgyát képezik eljárások IGF¹I és IGFBP¹3 komplexének tisztítására, amelyek magukban foglalják IGF¹I és IGFBP¹3 komplexének elõállítását, az IGF-I/IGFBP-3-komplex részleges tisztítását, a komplex adszorbeálását stacionárius fázishoz, a komplex deszorbeálását több mobil fázis alkalmazásával, ahol a mobil fázisok fokozatosan növekvõ ionerõsségû oldószersorozatot foglalnak magukban, és a tisztított IGF¹I és IGFBP¹3 komplexének kinyerését. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a stacionárius fázis kationcserélõ gyanta. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, a kationcserélõ gyanta karboxi-metil funkciós csoportokat tartalmaz. Az rhIGF-I/rhIGFB-3-komplex töltéssel rendelkezõ fehérjekomplex, de a fehérjekomplex mérsékelt módosításaival megtörténhet, hogy a komplex töltése 1–5 pozitív egységgel csökken. Ezt úgy lehet elérni, hogy egy vagy több pozitív töltést semlegesítünk, vagy beviszünk egy vagy több negatív töltést. Módosítások, amelyek az általános töltöttséget a pozitív töltéseket érintve változtatják, anélkül, hogy csak ezekre korlátozódnánk, például N¹terminális aminkonjugálás, lizinkonjugálás, argininkonjugálás és deaminálás. Két izokratikus puffert alkalmazó körülményeket beállítva el lehet választani a natív rhIGF-I/rhIGBP-3-komplexet a csökkentett pozitív töltésû rhIGF-I/rhIGBP-3-komplextõl. Az elsõ izokratikus puffer olyan ionerõsséggel rendelkezik, amely elegendõ a csökkentett pozitív töltésû rhIGF-I/rhIGBP-3-komplex deszorbeálásához, miközben fennmarad a natív rhIGF-I/rhIGBP-3-komplex. A második izokratikus puffer olyan ionerõsséggel rendelkezik, amely elegendõ a natív rhIGF-I/rhIGBP-3komplex deszorbeálásához, miközben más szennyezõdések, például aggregált rhIGF-I/rhIGBP¹3 és rhIGFBP¹3 hibás konformációs formái fennmaradnak. A 6. ábrán bemutatunk két elválasztást, a felsõ ábrán preparatív gyanta alkalmazásával, és az alsó ábrán analitikai gyanta alkalmazásával. A komponensek azonosítása az UV¹görbe csúcsai felett található. Ezzel alternatív módon, az eljárást egyetlen pufferrel lehet végezni, amely egyaránt deszorbeálja a csökkentett pozitív töltésû rhlGF-I/rhIGBP-3-komplexet és a natív rhIGF-I/rhIGBP-3-komplexet, ahol egyetlen izokratikus pufferrel elérhetõ az elválasztás. Ezt az eljárást általában analitikai analízisre alkalmazzuk, és általában nem alkalmazzuk preparatív analízisre amiatt, mert nagy térfogatú pufferre van szükség, hogy elérjünk elválasztást. Más alternatív módszer szerint, egy elsõ izokratikus pufferrel deszorbeáljuk a csökkentett pozitív töltésû rhIGF-I/rhIGBP-3-komplexet, ezt követõen növekvõ ionerõsségû gradienssel eluáljuk a natív rhIGF-I/rhIGBP-3-komplexet és más szennyezõdéseket. A találmány tárgyát képezik olyan eljárások, ahol a több mobil fázis magában foglal egy elsõ mobil fázist és egy második mobil fázist. Az elsõ mobil fázisban lévõ NaCl-koncentráció legalább körülbelül 20 mM¹lal kevesebb, mint a második mobil fázisban, legalább körülbelül 30 mM¹lal kevesebb, mint a második mobil fázisban, vagy legalább körülbelül 40 mM¹lal kevesebb,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
mint a második mobil fázisban, vagy legalább körülbelül 50 mM¹al, kevesebb, mint a második mobil fázisban, vagy legalább körülbelül 60 mM¹lal kevesebb, mint a második mobil fázisban. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módja szerint, az elsõ mobil fázis legalább körülbelül 160 mM és körülbelül 185 mM közötti NaCl¹ot tartalmaz, és a második mobil fázis legalább körülbelül 200 mM és körülbelül 250 mM közötti NaCl¹ot tartalmaz. A második mobil fázis körülbelül 225 mM NaCl¹ot is tartalmazhat. A mobil fázis kiválasztása nagyrészt a csökkentett pozitív töltésû rhIGF/rhIGFBP-3-komplex mennyiségétõl függ, aminek eltávolítása szükséges, hogy a kívánt tisztaságot és a kationcserélõ gyanta relatív retencióját elérjük. Továbbá a találmány tárgyát képezik eljárások részlegesen tisztított, IGF-I-bõl és IGFBP-3-bõl álló komplex tisztítására, amely magában foglalja az IGFI/IGFBP-3-komplex adszorbeálását kationcserélõ gyantára, és a komplex deszorbeálását mobil fázisok lépcsõzetes sorozatának alkalmazásával. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a mobil fázisok magukban foglalnak egy elsõ mobil fázist, amely körülbelül 160 mM és körülbelül 185 mM közötti NaCl¹ot tartalmazó nátrium-acetát-puffer-rendszerrel rendelkezik körülbelül 5,4–5,6 pH¹n, és egy második mobil fázist, amely körülbelül 200 mM és körülbelül 250 mM közötti NaCl¹ot tartalmazó nátrium-acetát-puffer-rendszerrel rendelkezik körülbelül 5,4–5,6 pH¹n. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módja szerint, a második mobil fázis körülbelül 225 mM NaCl¹ot tartalmaz. A találmány szerinti eljárásokban, a lépcsõzetes izokratikus elúciós lépésekben 5–15 oszloptérfogat mobil fázist alkalmazunk lépésenként. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, az elsõ izokratikus lépésben 5–10 oszloptérfogat mobil fázist alkalmazunk. A találmány más céljai, jellemzõi és elõnyei nyilvánvalóak lesznek a következõ részletes leírás alapján. A részletes leírás és konkrét példák csak szemléltetésként vannak megadva. A példák továbbá bemutatják a találmány szerinti megoldás elvét. Az ábrák rövid leírása 1. ábra. (felsõ rész) Részlegesen tisztított rhIGF/rhIGFBP¹3 tisztítása ToyoPearl CM¹650 gyanta alkalmazásával, lineáris NaCl-gradienssel. (alsó rész) A lineáris gradienst alkalmazó tisztításból származó, egyesített frakciók (40–47) analitikai CM¹HPLC analízise. Az analízis szerint az rhIGF tisztasága 73,1% lett, az rhlGFI/rhIGFBP-3-komplex már töltésvariáns formáihoz viszonyítva. 2. ábra. (felsõ rész) Részlegesen tisztított rhIGF/rhIGFBP¹3 tisztítása ToyoPearl CM¹650 gyanta alkalmazásával, NaCl lépcsõs izokratikus elúciójával. (alsó rész) Az izokratikus tisztításból származó, egyesített frakciók (68–90) analitikai
1
3. ábra.
4. ábra.
5. ábra.
6. ábra.
7. ábra.
8. ábra.
9. ábra.
10. ábra.
11. ábra.
HU 008 107 T2
CM¹HPLC-analízise. Az analízis szerint az rhlGF tisztasága 99% lett, az rhlGFI/rhIGFBP-3-komplex már töltésvariáns formáihoz viszonyítva. Részlegesen tisztított rhIGF/rhIGFBP¹3 tisztítása ToyoPearl CM¹650 gyanta alkalmazásával (#1. „batch”), 175 mM és 225 mM NaCl lépcsõs izokratikus elúciójával. Részlegesen tisztított rhIGF/rhIGFBP¹3 tisztítása ToyoPearl CM¹650 gyanta alkalmazásával (#2. „batch”), 185 mM és 225 mM NaCl lépcsõs izokratikus elúciójával. A beszúrt görbék az egyesített frakciókban lévõ IGFBP-3-ionklaszter tömegspektrometriás analízisei: lásd a 8. ábrát is. Részlegesen tisztított rhIGF/rhIGFBP¹3 tisztítása ToyoPearl CM¹650 gyanta alkalmazásával (#3. „batch”), 165 mM és 225 mM NaCl lépcsõs izokratikus elúciójával. Elúciós profilok összehasonlítása, amelyeket preparatív CM¹650-gyanta (ToyoPearl CM¹650) alkalmazásával figyeltünk meg, analitikai CM¹gyantához (Tosho BioSep TSK Gel CM¹5PW) viszonyítva. (felsõ rész) A #2. tömeg/töltésvariáns egyesített frakcióinak („pool”) és (alsó rész) #1. tömeg/töltésvariáns egyesített frakcióinak RP¹HPLC-kromatogramja. (felsõ rész) A #2. tömeg/töltésvariáns egyesített frakcióinak („pool”) megfelelõ IGFBP-3-csúcs összegzett spektruma, (középsõ rész) #1. egyesített frakciókra, és (alsó rész) a natív rhIGF/rhIGFBP3¹ra. Bemutatjuk az IGFBP¹3 +18 töltésállapotának megfelelõ ionklasztert. A #2. tömeg/töltésvariáns egyesített frakcióinak („pool”) megfelelõ IGFBP-3csúcs MaxEnt-spektruma. Az IGFBP¹3 tömeg/töltésvariáns formájának tömege 28,988. A #1. tömeg/töltésvariáns egyesített frakcióinak („pool”) megfelelõ IGFBP-3csúcs MaxEnt-spektruma. Az IGFBP¹3 tömeg/töltésvariáns formájának tömege 28,909. Az #1. tömeg/töltésvariáns egyesített frakcióinak („pool”) megfelelõ IGFBP¹3 N¹terminális peptidjének spektruma, az rhIGF-I/rhIGFBP¹3 referenciastandardhez viszonyítva. Az #1. tömeg/töltésvariáns egyesített frakcióinak megfelelõ IGFBP¹3 N¹terminális peptidjére 2 peptidtömeget figyeltünk meg. Az IGFBP¹3 tömeg/töltésvariáns formájának tömege 1608,7576, a módosítatlan peptidre viszont a tömeg 1502,6998 amu (=atomi tömegegység).
5
10
15
20
25
30
35
40
2
Részletes leírás A találmány tárgyát képezik IGF¹I és IGFBP¹3 komplexei, amelyek egy új tisztasági szinttel rendelkeznek. Olyan kromatográfiás technikákat fejlesztettünk ki, amely eltávolítja a szennyezõdéseket, például az IGFBP¹3 tömeg és töltés szerinti variánsait. Az új technikákkal IGF-I/IGFBP-3-komplexeket tartalmazó, jó minõségû gyógyászati készítményeket lehet elõállítani. Meglepõ módon felismertük, hogy a technika állása szerint eddig alkalmazott gyártási módszerekkel olyan részlegesen tisztított IGF-I/IGFBP-3-komplexekhez jutottunk, amelyek IGFBP¹3 tömeg és töltés szerinti variánsait tartalmazták. Az 1. ábrán (felsõ rész) bemutatjuk a technika állása szerint eddig alkalmazott tisztítási módszert az rhIGF-I/rhIGFBP-3-komplexre, ahol a fehérjekomplex deszorbeálása lineáris NaCl-gradiens alkalmazásával történik. Az 1. ábrán (alsó rész) bemutatjuk az 1. ábrán (felsõ részen) látható lineáris gradiensbõl egyesített frakciók analízisét. Az 1. ábrán (alsó részen) látható, hogy a komplexnek töltésre nézve számos variánsformáját lehet detektálni izokratikus elúciós profil alkalmazásával, amely a leírásban ismertetett eljárás. Az anyag általános tisztasága csak 73%¹os, a natív rhIGF-I/rhIGFBP-3¹at viszonyítva más, töltésvariáns formáihoz. Tehát lineáris gradienst alkalmazó tisztítási módszer nem volt elég hatékony az rhIGF-I/rhIGFBP-3komplex kisebb mennyiségben jelen lévõ, töltésvariánsainak elválasztásához. Az ilyen variánsok és aggregátumok elválasztására fejlesztettünk ki kromatográfiás eljárásokat. Az új eljárások például részlegesen tisztított IGF-I/IGFBP-3-komplex adszorbeálását foglalják magukban kationcserélõ gyantára, és a komplex deszorbeálását kétlépcsõs elúciós technikával. A 2. ábrán (fent) látható, hogy a részlegesen tisztított IGF-I/IGFBP3-komplexek preparatív izokratikus elúciója olyan elúciós profilt eredményez, amely nagyon hasonlít analitikai módszer alkalmazásánál megfigyelt profilhoz. A csúcsból származó, egyesített frakciók, amik a 2. izokratikus lépésben eluálódtak (natív komplexként jelöljük), 99%¹os tisztaságúak analitikai CM¹módszerrel meghatározva (a 2. ábrán, lent látható).
Definíciók Hacsak másképpen nem korlátozzuk a leírásban konkrétan állítva, a következõ szakkifejezések a következõ jelentésekkel rendelkeznek: „IGF¹I” jelentése l¹es számú inzulinszerû növekedési faktor, ideértve korlátozás nélkül, a természetesen 50 elõforduló (azaz „natív”) IGF-I¹et, analógjait vagy variánsait, és IGF-I¹et és más aminosavszekvenciákat tartalmazó fúziókat. „IGFB¹3” jelentése humán 3¹as számú, inzulinszerû növekedési faktort kötõ fehérje. A leírásban 55 IGFBP¹3 utalhat IGFBP-3-analógokra, természetesen elõforduló allélvariánsokra és IGFBP-3¹at és más aminosavszekvenciákat tartalmazó fúziókra. A „komplex” kifejezés egy vagy több, társult (asszociált) fehérjék csoportját jelenti. A fehérjék a komplex60 ben több nemkovalens kölcsönhatás közül bármelyiken 45
4
1
HU 008 107 T2
keresztül asszociálódhatnak, például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk, ionos kötésekkel, hidrogénhídkötésekkel, van der Waals-erõkkel és hidrofób kölcsönhatásokkal. IGF¹I és IGFBP¹3 különbözõ moláris arányokban lehet jelen egy komplexben. Egy komplex IGF-I¹et és IGFBP-3¹at körülbelül 0,8:1 és 1,2:1 közötti moláris arányban tartalmazhat. Továbbá egy komplex körülbelül 1:1 moláris arányban tartalmazhat IGF-I¹et és IGFBP-3¹at. A „részlegesen tisztított” kifejezés egy olyan IGFI¹et és IGFBP-3¹at tartalmazó komplexet jelent, amelytõl bizonyos mértékig el lettek távolítva celluláris vagy fermentációs szennyezõdések, és/vagy töményítve van, és/vagy sómentesítve van. A „részlegesen tisztított” kifejezés jelenthet egy olyan IGF-I¹et és IGFBP3¹at tartalmazó komplexet, amelyen egy vagy több, elõzetes tisztítási lépés lett elvégezve, ideértve anélkül, hogy ezekre korlátozódnánk, olyan technológiákat, mint méretkizáráson alapuló kromatográfia, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia vagy ioncserélõ kromatográfia. A „részlegesen tisztított” utalhat arra, hogy IGF-I¹et és IGFBP-3¹at tartalmazó komplexet alávetünk egy vagy több tisztítási lépésnek. A „részlegesen tisztított” jelenthet olyan IGF-I¹et és IGFBP-3¹at tartalmazó komplexet is, amely lényegében tisztítva van, de „kisebb mértékû javítást” igényel rhIGF-I/rhIGFBP¹3 aggregált formáinak, helytelen konformációt felvett IGFBP¹3 vagy rhlGF-I/rhIGFBP-3komplex tömeg/töltésvariáns formáinak eltávolítása céljából. A „preparatív kromatográfia” kifejezésen tiszta vagy részlegesen tiszta termékek elõállítását értjük technikai méretben. A „gradienselúció vagy lineáris elúció” kifejezések azt a gyakorlatot jelentik, amelyben a mobil (mozgó) fázis összetételét folyamatosan változtatjuk a teljes kromatográfiás analízis alatt. Az „izokratikus elúció” és „izokratikusan” kifejezések azt a gyakorlatot jelentik, amelyben a mobil (mozgó) fázis alkotórészei állandóak egy idõtartam alatt. A „mobil (mozgó) fázis” specifikált pufferkapacitású és ionerõsségû vizes oldatokat jelent. Gyógyászatilag elfogadható pufferelõ sókat alkalmazunk rhIGFI/rhIGFBP¹3 gyártásában. Gyógyászatilag elfogadható kationokat, például nátriumionokat alkalmazunk az ionerõsség beállítására. A mobil fázis tartalmazhat egymással elegyedõ oldószereket. A „stacionárius fázis” kifejezése olyan szerves polimer kromatográfiás anyagokat jelent, amelyek hatékonyan képesek kötni (azaz adszorbeálni) egy analitot (azaz a vizsgálandó anyagot) a kiválasztott mobil fázis által biztosított körülmények között, és elengedik az analitot olyan körülmények között, amit más, kiválasztott mobil fázis biztosít. A „szerves polimer kromatográfiás anyagokhoz” tartoznak kationcserélõ gyanták. Az ilyen anyagok közé tartoznak gyenge kationcserélõ gyanták, és karboxilát funkciós csoporttal rendelkezõ gyanták. „Karboxilát funkciós csoportok” például karboxil- és karboximetil-vegyületek.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
A „lépcsõs elúció” kifejezés azt a gyakorlatot jelenti, amelyben a mobil fázis körülményeit úgy változtatjuk, hogy az egyik izokratikus mobil fázisról áttérünk egy második mobil fázisra, az ionerõsség tipikusan növekszik az egyes lépésekben. A kérdéses fehérje elúcióját (deszorpcióját) olyan izokratikus mobil fázis kiválasztásával érjük el, amely szelektíven deszorbeálja a fehérjét az izokratikus lépésben. Diszkusszió Az rhIGF-I-bõl és rhIGFBP-3-bõl álló komplexeket új tisztasági szinten izoláltunk olyan kromatográfiás technikák alkalmazásával, amelyek IGFBP¹3 és IGFI/IGFBP-3-komplex aggregátumok tömeg és töltés szerinti variánsainak eltávolítására lettek tervezve. Ezek a kromatográfiás technikák alkalmasak analitikai, félpreparatív és preparatív kromatográfiára. IGF¹I és IGFBP¹3 komplexének tisztítására szolgáló eljárás magában foglalja IGF-I-bõl és IGFBP-3-bõl álló komplex elõállítását, a komplex részleges tisztítását, a komplex adszorbeálását egy stacionárius fázishoz, a komplex deszorbeálását több mobil (mozgó) fázis alkalmazásával, ahol a mobil fázisok egymást követõ, növekvõ ionerõsségû oldószersorozatot foglalnak magukban, és a tisztított komplex kinyerését. Továbbá részlegesen tisztított IGF-I-bõl és IGFBP3-ból álló komplex tisztítása magában foglalja az IGF-Ibõl és IGFBP-3-ból álló komplex adszorbeálását egy stacionárius fázishoz, és a komplex deszorbeálását mobil fázisok lépcsõzetes sorozatának alkalmazásával, ezáltal jutunk a tisztított komplexhez. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, részlegesen tisztított, IGF-I-bõl és IGFBP-3-ból álló komplex tisztítására szolgáló, ioncserélõ kromatográfiával végzett eljárásban, amelyben karboxi-metil-gyantát alkalmazunk, a javítás azt jelenti, hogy a komplexet a karboxi-metil-gyantáról egy olyan elsõ mobil fázis alkalmazásával deszorbeáljuk, amely körülbelül 160 mM és körülbelül 185 mM közötti NaCl¹ot tartalmaz, ezt követõen egy olyan második mobil fázist alkalmazunk, amely körülbelül 200 mM és körülbelül 250 mM közötti NaCl¹ot tartalmaz, ezáltal kinyerjük az IGF-I-bõl és IGFBP-3-ból álló komplexet a második mobil fázisban. Ilyen technikákban különféle stacionárius fázist alkalmazhatunk. Alkalmas stacionárius fázisok lehetnek szerves polimer kromatográfiás anyagok, például kationcserélõ gyanták. Alkalmas stacionárius fázisok lehetnek karboxilátfunkcióval, például karboxi-metil-csoportokkal rendelkezõ, gyenge kationcserélõ gyanták is. Ezekben a technikákban különféle mobil fázisokat alkalmazunk. Ezekben a kromatográfiás technikákban legalább két mobil fázist alkalmazunk, de annyi mobil fázist alkalmazhatunk, amennyi szükséges egy tisztított analit (vizsgálandó anyag), vagy több, kérdéses tisztított analit elõállításához. A mobil fázisok különbözõ ionerõsségû oldatból állnak, amelyeket egyenként viszünk fel a stacionárius fázisra, lépésenként (eltérõen egy gradiens alkalmazásától), ami szakember által néha „lépcsõs elúció”-ként ismeretes. Miután hozzájutottunk a tisztított analithoz vagy analitokhoz, lépcsõs
1
HU 008 107 T2
elúcióra már nincs szükség, és például nagy sókoncentrációhoz vezetõ gradienst lehet alkalmazni a stacionárius fázis tisztítására vagy regenerálására. Ezzel alternatív módon, nagy sókoncentrációjú, például 1 M NaCl¹ot tartalmazó, egyetlen mobil fázis felvitele is tisztíthatja vagy regenerálhatja a stacionárius fázist, miután hozzájutottunk a tisztított analithoz. A mobil fázis sûrûségét a vízalapú oldatokban lévõ sókoncentráció beállításával lehet variálni. Alkalmas mobil fázisokban a NaCl-koncentrációja legalább körülbelül 60 mM, kevesebb mint a közvetlenül soron következõ, második mobil fázisban. A mobil fázisokban a NaCl-koncentrációja legalább körülbelül 50 mM is lehet, kevesebb mint a közvetlenül soron következõ, második mobil fázisban, vagy legalább körülbelül 40 mM, kevesebb mint a közvetlenül soron következõ, második mobil fázisban, vagy legalább körülbelül 30 mM, kevesebb mint a közvetlenül soron következõ, második mobil fázisban, vagy legalább körülbelül 20 mM, kevesebb mint a közvetlenül soron következõ, második mobil fázisban, vagy legalább körülbelül 10 mM, kevesebb mint a közvetlenül soron következõ, második mobil fázisban. Preparatív kationcserélõ gyanta esetén, az elsõ mobil fázisban körülbelül 160 mM és körülbelül 185 mM közötti NaCl van. A második mobil fázist közvetlenül az elsõ mobil fázis után lehet felvinni a stacionárius fázisra. Preparatív kationcserélõ gyanták esetén, a második mobil fázisban körülbelül 200 mM és körülbelül 250 mM közötti NaCl van. A második mobil fázis körülbelül 225 mM NaCl¹ot is tartalmazhat. Ezekkel a módszerekkel IGF-I-bõl és IGFBP-3-ból álló komplexeket magában foglaló, tiszta fehérjéket állítunk elõ. Az IGF-I-bõl és IGFBP-3-ból álló komplexek legalább körülbelül 96%¹os tisztaságúak. A komplexek lehetnek legalább körülbelül 97% tisztaságúak is, vagy legalább körülbelül 98% tisztaságúak, vagy legalább körülbelül 99% tisztaságúak. Egy izolált fehérje IGF¹I és IGFBP¹3 komplexét körülbelül 0,8:1 és körülbelül 1,2:1 közötti moláris arányban foglalhatja magában. Egy izolált fehérje továbbá IGF¹I és IGFBP¹3 komplexét körülbelül 1:1 moláris arányban foglalhatja magában. Ezek az izolált fehérjék olyan rendellenességek kezelésére alkalmasak, amelyeket leírtak például az 5,681,818, 5,723,441, 5,948,757, 6,015,786, 6,017,885, 6,025,368, 6,514,937 és 6,518,238 számú USA-beli szabadalmi leírásokban. Egy gyógyászati készítmény magában foglalhat IGF¹I és IGFBP¹3 komplexét tartalmazó izolált fehérjét és gyógyászatilag elfogadható hordozót, ahol a fehérje legalább körülbelül 96%¹os tisztaságú. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, a gyógyászati készítményben olyan fehérje van, amely legalább körülbelül 97%¹os tisztaságú, legalább körülbelül 98%¹os tisztaságú, vagy legalább körülbelül 99%¹os tisztaságú. A gyógyászati készítmény magában foglalhat IGF¹I és IGFBP¹3 komplexét tartalmazó izolált fehérjét, amelyben a moláris arány körülbelül 0,8:1 és körülbelül 1,2:1 közötti. A gyógyászati készítmény továbbá magában foglalhat IGF¹I és IGFBP¹3 komplexét tartalmazó izolált fehérjét, amelyben a moláris arány körülbelül 1:1.
2
Példák A következõ példákkal a találmány szerinti megoldást szemléltetjük, amelyekkel azonban nem kívánjuk korlátozni a találmány által igényelt oltalmi kört. 5
10
15
20
25
30
35
40
1. példa. Tisztítási módszerek Preparatív CM¹tisztítás A kísérleteket úgy végeztük, hogy Toyopearl™ CM¹650 gyantából (Tosoh Biosciences LLC, Montgomeryville, PA, katalógusszám: 14696) 3 gyártási lotot alkalmaztunk. A kromatográfia általános folyamatát lentebb definiáljuk. Az elsõ izokratikus elúciós puffer ionerõsségét úgy alakítottuk ki, hogy elérjük a kívánt elúciós profilt. A preparatív kromatogramokat bemutatjuk a 3., 4. és 5. ábrán. Mintafelvivõ puffer – 50 mM nátrium-acetát, 50 mM NaCl, pH=5,5 Mosópuffer – 50 mM nátrium-acetát, 125 mM NaCl, pH=5,5 Elsõ izokratikus puffer – 50 mM nátrium-acetát, 165–186 mM NaCl, pH=5,5 Második izokratikus puffer – 50 mM nátrium-acetát, 225 mM NaCl, pH=5,5 Gradiens – 50 mM nátrium-acetát, 225 mM NaCl, pH=5,5 keverve 1 M NaCl-hoz Az elsõ izokratikus lépést 6–9 oszloptérfogattal végeztük, futtatástól függõen. A második izokratikus lépést addig futtattuk, amíg a natív rhIGF-3/rhIGFB¹3 csúcsa visszatért az alapvonal-abszorbancia 5%¹áig. A gyanta regenerálására 225 mM NaCl és 1 M NaCl közötti gradienst alkalmaztunk. Az #1. lot esetén 175 mM NaCl¹re volt szükség az rhIGF-3/rhIGFB-3-komplex tömeg/töltésvariánsainak eluálásához. A #2. lot esetén 185 mM NaCl¹re volt szükség az rhIGF-3/rhIGFB-3-komplex tömeg/töltésvariánsainak eluálásához. A #3. lot esetén 165 mM NaCl¹re volt szükség az rhIGF-3/rhIGFBP-3-komplex tömeg/töltésvariánsainak eluálásához. Valamennyi lot esetén hatékonyan deszorbeálható volt a natív rhIGF-3/rhIGFBP-3-komplex 225 mM NaClnál, egy kívánt minimális térfogatban. Továbbá a sógradiens alatt eluálódott egyik szennyezõdés sem eluálódott a 225 mM NaCl¹os mosási lépésben, a 3 gyanta-lot egyike esetén sem.
45 Analitikai CM¹HPLC Reagensek Oszlop: Tosoh Biosep TSK Gel CM¹5PW, 10 m, 100 A, 7,5 mm×7,5 cm (Kat. sz. 13068) A-oldószer=50 mM nátrium-acetát/50 mM nátrium50 klorid pH=5,5; 27,2 g nátrium-acetát+11,69 g nátriumklorid+4 liter víz, pH=5,5 B-oldószer=50 mM nátrium-acetát/550 mM nátrium-klorid pH=5,5; 27,2 g nátrium-acetát+128,6 g nát55 rium-klorid+4 liter víz, pH=5,5 C-oldószer=50 mM nátrium-acetát/1000 mM nátrium-klorid pH=5,5; 27,2 g nátrium-acetát+233,76 g nátrium-klorid+4 liter víz, pH=5,5 A puffereket úgy készítettük, hogy elõször az elõírt 60 mennyiségû sókat hozzáadtuk a vízhez, és feloldódá6
1
HU 008 107 T2
sig kevertettük. Azután a pH¹t beállítottuk 5,5–5,6¹re ecetsav hozzáadásával. Miután stabil pH¹t kaptunk, az oldat térfogatát kiegészítettük vízzel és a pH¹t ellenõriztük. Valamennyi oldatot átszûrtünk 0,22 m¹os vagy 0,45 m¹os szûrõn felhasználás elõtt. LC (folyadékkromatográfiás) körülmények Hullámhossz=276 nm AUFS=2 Idõállandó=1
5
2
Pumpa: Áramlási sebesség=1 ml/perc A-oldószer=50 mM nátrium-acetát, 50 mM NaCl, pH=5,5 B-oldószer=50 mM nátrium-acetát, 550 mM NaCl, pH=5,5 C-oldószer=50 mM nátrium-acetát, 1000 mM NaCl, pH=5,5 D-oldószer=víz
10
Gradiensgörbe: #2. oszlop (Lot# F0045–101C) Lépés
Idõ
Áramlás
%A
%B
%C
%D
Görbe
1
0
1
100
2
7,0
1
100
3
7,1
1
57
43
6
4
42,0
1
57
43
6
5
58,5
1
100
6
6
65,0
1
100
6
7
66,0
1
8
82,5
1
9
83,0
1
100
10
99,0
1
100
6
100
6
100
6
Megjegyzés – az A¹puffer és a B¹puffer arányát a 3. és 4. mosási lépésben a oszloptöltet-lot retenciós tulajdonságai alapján állítottuk be, például a natív rhIGF-3/rhIGFBP¹3 retenciós ideje a 30,0. és 41,0. perc között volt.
Ha a tömegvariáns csúcsa jelen van a mintában, ezek a natív rhIGF-3/rhIGFBP¹3 csúcsa elõtt eluálódnak az izokratikus lépés alatt. Az analitikai CM¹elválasztás és a preparatív 35 CM¹elválasztás összehasonlítása A 6. ábrán (alsó rész) látható egy analitikai CM¹HPLC-futtatás kromatogramja, ahol a csúcsok azonosítva vannak a megfelelõ komponensekhez. Preparatív CM¹elválasztást (felsõ rész) a megfelelõ analitikai CM¹hez (alsó rész) hasonlítva látható, hogy 40 ugyanazok a komponensek eluálódnak ugyanolyan retenciós sorrendben, és azonosítani lehet ezeket ilyen alapon. Az 1. ábrán (alsó rész) és a 2. ábrán (alsó rész) analitikai CM¹HPLC eredményei láthatók olyan minták- 45 ra, amelyek az rhIGF-I/rhIGFBP-3-komplex tömeg/töltésvariáns formáit tartalmazzák (1. ábra), és egy olyan mintára, amely az rhIGF-I/rhIGFBP-3-komplex tö-
meg/töltésvariáns formáiból keveset tartalmaz (2. ábra). 2. példa. rhIGF-I/rhIGFBP¹3 tömeg/töltésvariáns formáinak jellemzése C18 fordított fázisú HPCL (Vydac-módszer) +/– MS detektálás LC körülményei: Oszlop: Vydac218TP54 fordított fázisú C18 4,6×250 mm id. (belsõ átmérõ) A-eluens: 50% acetonitril, 0,15 TFA B-eluens:0,1% TFA C-eluens: 100% acetonitril, 0,1% TFA Áramlási sebesség: 0,9 ml/perc Injektálási térfogat: max. 100 ml Oszlop hõmérséklete: szobahõmérséklet Detekciós hullámhossz: 210 nm Futtatási idõ: 95 perc
Gradienstáblázat Idõ, perc
Áramlás
%A
%B
%C
Változás
0
0,9
10
90
–
8
0,9
10
90
6
25
0,9
52
48
6
55
0,9
68
32
60
0,9
100
70
0,9
6 6 100
7
6
1
HU 008 107 T2
2
Táblázat (folytatás) Idõ, perc
Áramlás
%A
%B
80
0,9
85
0,9
10
90
6
95
0,9
10
90
6
Az LCMS-analíziseket Waters Alliance 2695 HPLC- 10 rendszer alkalmazásával végeztük, ami MicroMass LCT (TOF) tömegspektrométerhez és Waters 2996 fotodiódasoros (PDA) detektorhoz volt kapcsolva. A kromatográfiás elválasztást Vydac 218TP (250×4,6 mm, 300A) C18 fordított fázisú oszlopon végeztük, olyan 15 H 2 O-acetonitril-gradiens alkalmazásával, amely 0,1 térf.% trifluor-ecetsavat (TFA) tartalmazott. A fordított fázisú oszlopról lejövõ eluenst szétosztottuk (4:1 arányban), az eluens nagyobb része a PDA-detektorra ment, a maradék része az elektrosprayforráshoz. 20 AspN peptidtérkép LCMS vizsgálata Az #1. egyesített frakciókból vett tömegvariáns-mintákat peptidemésztéssel analizáltuk, azt követõen RP¹LC-analízissel. A proteolitikus fragmenseket Ceden- 25 za (kat.sz. CD026) 1 mm (2×250 mm) C18 RP¹HPLCoszlopon választottuk el, 0,2 ml/perc áramlási sebesség, és 2% acetonitriltõl 98% acetonitrilig tartó gradiens alkalmazásával. A csúcsokat az eluens-áram abszorbanciája alapján detektáltuk 210 nm¹en, fotodiódasoros 30 detektorban, amelyeket azután MicroMass LCT tömegspektorméterbe injektáltunk, amely pozitív ion elektrospray ionizációs módban mûködött. A peptidcsúcsmintázatot (azaz a peptidtérképet) egy referenciastandardhez viszonyítottuk az azonosság megállítása 35 céljából. Ezt követõen a csúcsokat úgy azonosítottuk, hogy összegeztük az egyes csúcsok alá tartozó összes ionáramot és monoizotopikus. M2+- vagy M3+-ionokat mértünk. 40 Minták és injektálási paraméterek A gyártási eljárás közben gyártásközi mintákat vettünk. A mintákat lefagyasztottuk, és –20 °C¹on tároltuk a vizsgálatig. 45 Az izokratikus lépés szennyezõdései Mintákat vettünk az izokratikus mosási lépés alatt, a natív komplex elúciója elõtt, a 4. ábrán bemutatott futtatásban. A minták két széles csúcsnak feleltek meg, amelyek ebben a lépésben eluálódtak, és egyesítve 50 lettek. Az egyes frakciókból azonos térfogatokat egyesítettünk („pool”¹ba), és az egyesített frakciókat 10 kD ultraszûrõ membrán alkalmazásával betöményítettük (Centricon YM¹10; Amicon kat.sz. 4206). Összehasonlítás alapjául frakciót vettünk a csúcs 55 legfelsõ részébõl a natív rhIGF-I/rhIGFBP-3-komplex elúciójakor is, a 225 mM¹os izokratikus elúciós lépésben. Mintát vettünk a 225 mM¹os izokratikus csúcs vállából is (amit a vezetõképességben egy rövid fluxus okozott a lépés közben), és a pufferbõl. 60 8
%C
Változás
100
6
Ezeket a mintákat LCMS-analízisre vittük, és egy mintát peptidtérképezéssel analizáltunk. Eredmények az izokratikus mosáskor vett mintákban lévõ szennyezõdésekre RP-HPLC MS¹jellemzéssel A 7. ábrán bemutatjuk a #2. tömeg/töltésvariáns egyesített frakcióinak és az #1. tömeg/töltésvariáns egyesített frakcióinak kromatogramjait, Vydac RP¹HPLC-vel mérve. Az 1. ábrán a natív IGF¹I a 41,8–42. percnél lévõ csúcsként eluálódik, az oxidált IGF¹I közvetlenül a natív IGF-I-csúcs elõtt eluálódik. Az IGFBP¹3 a 48–48,7. percnél lévõ csúcsként eluálódik. Nem figyeltünk más, szignifikáns mennyiségben jelen lévõ szennyezõdést ezekben a mintákban. A spektrumokat összegeztük az IGFBP-3-csúcson az egyes mintákban, valamint egy olyan mintában, amely megfelelt a 225 mM NaCl¹os izokratikus lépés csúcsának. A 8. ábrán bemutatjuk az IGFBP-3-csúcsra összegzett tömegspektrumok kifejtéseit, és a natív rhIGF-I/rhIGFBP-3¹ra az 1597 m/z¹érték körül, ami megfelel az IGFBP¹3 ionklaszter +18 töltésállapotának. Ez azt mutatja, hogy az IGFBP¹3 jelentõsen módosítva van az #2. egyesített frakciókban lévõ tömegvariánsban, és az #2. egyesített frakciókban lévõ tömegvariáns-mintákban, de viszonylag kevés IGFBP¹3 van módosítva a 225 mM sóval eluált csúcsban. Megjegyezzük, hogy ezek ugyanazok a spektrumok, amelyek a 4. ábrán beszúrva láthatók. Számos módosítás látható az #2. egyesített frakciókban lévõ tömegvariánsban, de egy szembetûnõ ion látható 1611,3 amu-nál (=atomi tömegegységnél). A 9. ábrán bemutatjuk a minta MaxEnt-spektrumát, ami egy 28988,5313 molekulatömegû fehérjére utal, amely 257,03¹al nagyobb az rhIGFBP¹3 számított tömegénél (28731,5). Számos módosított forma látható az #1. egyesített frakciókban lévõ tömegvariánsban, de egy szembetûnõ ion látható 1606,9 amu-nál. A 10. ábrán bemutatjuk a minta MaxEnt-spektrumát, ami egy 28909,5547 molekulatömegû fehérjére utal, amely 178,05¹al nagyobb az rhIGFBP¹3 számított tömegénél. Az #1. egyesített frakciókban („pool”) lévõ tömegvariáns peptidtérképezése Az #1. egyesített frakciókban lévõ tömegvariáns AspN-peptid UV¹kromatogramját az rhIGF-I/rhIGFBP¹3 referenciastandardhez viszonyítottuk, és nem tapasztaltuk észlelhetõ csúcs megjelenését vagy eltûnését. Tehát a megfigyelt tömegvariánsok nem eredményeztek egyetlen csúcs esetén sem észrevehetõen eltérõ migrációt.
1
HU 008 107 T2
A spektrumokat összegeztük a kromatogram 46,1–46,5. perceinél megjelenõ csúcsokat magában foglaló régiójában, ami megfelel az rhIGFBP¹3 N¹terminális peptidjéhez rendelhetõ retenciós idõnek. A 11. ábrán bemutatjuk azokat a monoizotopikus ionklasztereket, amelyek megfelelnek az IGFBP¹3 (felsõ rész) és az rhlGF-I/rhIGFBP¹3 referenciastandard (alsó rész) N¹terminális peptidjének. Az #1. egyesített frakciókban lévõ tömegvariáns mintája 1502,6997-nél mutatott egy ionklasztert, ami megfelel az IGFBP¹3 natív N¹terminális peptidjének, valamint 1680,7576-nál, amely +178,0579 a szülõi peptidhez viszonyítva. Ez a megfigyelt tömegnövekedés összhangban van azzal a tömegnövekedéssel, amit a teljes fehérjére MaxEnt¹el számítottunk (+178,05). Tehát egyetlen tömegadduktum hozzáadása felelõs az IGFBP¹3 módosításáért. Az 1680,7576-nak megfelelõ peptid nem volt jelen a referenciastandardben, amint látható, ha a felsõ ionklaszterábrát összehasonlítjuk az alsó ionklaszterábrával, a peptidtérképezési módszer nem kielégítõ érzékenysége miatt. IGFBP¹3 tömegvariánsainak azonosítása A +18 töltésállapotú IGFBP¹3 körüli bõvített spektrumokban a legszembetûnõbb ionok az 1611,3 (#2. tömegvariáns egyesített frakciók) és 1606,9 (#1. tömegvariáns egyesített frakciók) értéknél figyelhetõk meg, amelyek megfelelnek körülbelül 258 és 178 amu tömegnövekedésnek, sorrendben. A peptid peptidszekvenciája *GASSAGLGPWRCEPC (1. azonosító számú szekvencia), ahol az 1. glicin megfelel az IGFBP¹3 N¹terminálisának. A peptid számított monoizotopikus tömege 1502,7090. Áttekintettük azokat a potenciális módosításokat, amelyek felelõsek lehetnek 178 amu-nál és 258 amunál a tömegnövekedésért. A legvalószínûbb lehetõség N¹terminális glükonilálás (178 amu) és N¹terminális alfaN-6-foszfoglükonilálás (258 amu). Georghegan és munkatársai leírták E. coli által expresszált fehérje módosítását GSS[His]6 N¹termális szekvenciájával (2. azonosító számú szekvencia), amelyben az N¹terminális glicinen történik a módosítás [Geoghegan és mtsai., Anal. Biochem. 267, 169–84 (1999)]. Az N¹terminális glükonilálás C6H10O6-csoportot (178,0477 amu) konjugálna a peptiden lévõ aminocsoporthoz. A megfigyelt módosítás tömege 1680,7576–1502,6997=178,0579 amu. Tehát a megfigyelt adduktum összhangban van ezzel a módosítással (178,0477–178,0579=-0,0102), amely a
2
kísérleti hibahatáron és az adott tömegspektrométer korlátain belül van. Két lehetséges módosítási hely jöhet szóba, a glicinen lévõ N¹terminális aminocsoport és az argininen lévõ guanidinilcsoport. 5
10
15
20
25
3. példa. A régebben elõállított rhIGF-I/rhIGFBP-3lotok analitikai CM¹HPLC-vizsgálata Az rhIGFBP¹3 töltés szerinti variánsait detektáltuk rhIGF-I/rhIGFBP-3-komplex tömeg/töltésvariánsainak elválasztásával, nátrium-klorid izokratikus gradiensének alkalmazásával TSK-GEL CM¹5PW ioncserélõ oszlopon, melynek mérete 7,5 cm×7,5 mm, belsõ átmérõje (ID) 10 mm volt, a fentebb leírt teszteljárás szerint. Ezeket a szennyezéseket elõzõleg nem detektáltuk a drogtermék-lotokban olyan módszerekkel, amelyek rendelkezésre álltak a gyártás idõpontjában. Ahol rendelkezésre állt, mintákat vettünk a félretett anyagokból, hogy megállapítsuk a régebben elõállított mintákban lévõ szennyezõdések körét. Az 1. táblázatban látható eredmények mutatják a natív rhIGF-I/rhIGFBP¹3 tisztaságát azzal a különbséggel, ami a két tömeg/töltésvariánsnak megfelelõ két csúcshoz társul. A legnagyobb mértékû tisztaságot 95,4%-nak figyeltük meg ezzel a módszerrel. 1. táblázat Az rhIGF-I/rhIGFBP¹3 töltés/tömegvariánsok analízise régebben elõállított drogtermék-lotokban
30 Drogterméklot
35
40
45
2. variáns (terület%)
1. variáns (terület%)
rhIGFI/rhIGFB¹3 (terület%)
#1
1,7
5,3
93,1
#2
0,6
6,3
93,1
#3
1
7,2
91,8
#4
0,7
5,3
94
#5
0,4
5,9
93,6
#6
0,2
4,3
95,4
#7
0,5
5,2
94,2
#8
0,4
5,2
94,3
A szekvencialistában található szabad szövegek fordítása: 1–2. azonosító számú szekvenciáknál: Mesterséges szekvencia leírása: szintetikus peptid
Szekvencialista <110> SLEEVI, MARK C. KELLEY, GLEN L. <120> PURIFIED RHIGF-I/RHLIGRBP¹3 COMPLEXES AND THEIR METHOD OF MANUFACTURE <130> 057491–0870 <140> 11/311,633 <141> 2005–12–20 <150> 60/639,349 <151> 2004–12–24 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 3.3 9
1
HU 008 107 T2
2
<210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1
Gly Ala Ser Ser Ala Gly Leu Gly Pro Val Val Arg Cys Glu Pro Cys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2
Gly Ser Ser His His His His His His 1 5 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Izolált fehérje, amely l¹es számú inzulinszerû növekedési faktorból (IGF¹I) és 3¹as számú, inzulinszerû növekedési faktort kötõ fehérjébõl (IGFBP¹3) álló komplexet foglal magában, ahol az izolált fehérje legalább 96%¹os tisztaságú, analitikai CM¹HPLC-vel mérve. 2. Az 1. igénypont szerinti fehérje, ahol a fehérje legalább 97%¹os tisztaságú, analitikai CM¹HPLC-vel mérve. 3. Az 1. igénypont szerinti fehérje, ahol a fehérje legalább 98%¹os tisztaságú, analitikai CM¹HPLC-vel mérve. 4. Az 1. igénypont szerinti fehérje, ahol a fehérje legalább 99%¹os tisztaságú, analitikai CM¹HPLC-vel mérve. 5. Az 1. igénypont szerinti fehérje, ahol a komplex az IGF-I¹et és az IGFBP-3¹at körülbelül 0,8:1 és körülbelül 1,2:1 közötti moláris arányban foglalja magában. 6. Az 1. igénypont szerinti fehérje, ahol a komplex az IGF-I¹et és az IGFBP-3¹at körülbelül 1:1 moláris arányban foglalja magában. 7. Gyógyászati készítmény, amely IGF¹I és IGFBP¹3 komplexét tartalmazó izolált fehérjét és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz, ahol a fehérje legalább 96%¹os tisztaságú, analitikai CM¹HPLCvel mérve. 8. A 7. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a fehérje legalább 97%¹os tisztaságú, analitikai CM¹HPLC-vel mérve. 9. A 7. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a fehérje legalább 98%¹os tisztaságú, analitikai CM¹HPLC-vel mérve. 10. A 7. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a fehérje legalább 99%¹os tisztaságú, analitikai CM¹HPLC-vel mérve. 11. Eljárás IGF¹I és IGFBP¹3 komplexének elõállítására, amely magában foglalja az IGF-I/IGFBP-3komplex elõállítását;
25
30
35
40
45
50
55
60 10
a komplex részleges tisztítását; a komplex adszorbeálását kationos stacionárius fázishoz; a komplex deszorbeálását több mobil fázis alkalmazásával, ahol a mobil fázisok fokozatosan növekvõ ionerõsségû oldószersorozatot foglalnak magukban; és a tisztított komplex kinyerését. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, ahol a stacionárius fázis kationcserélõ gyanta. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol a kationcserélõ gyanta karboxi-metil funkciós csoportokat tartalmaz. 14. A 11. igénypont szerinti eljárás, ahol a több mobil fázis egy elsõ mobil fázist és egy második mobil fázist foglal magában. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol az elsõ mobil fázis NaCl-koncentrációja legalább körülbelül 10 mM¹lal kevesebb, mint a második mobil fázisé. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol az elsõ mobil fázis NaCl-koncentrációja legalább körülbelül 20 mM¹lal kevesebb, mint a második mobil fázisé. 17. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol az elsõ mobil fázis NaCl-koncentrációja legalább körülbelül 40 mM¹lal kevesebb, mint a második mobil fázisé. 18. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol az elsõ mobil fázis legalább körülbelül 160 mM és körülbelül 185 mM közötti NaCl¹ot tartalmaz, és a második mobil fázis legalább körülbelül 200 mM és körülbelül 250 mM közötti NaCl¹ot tartalmaz. 19. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol a második mobil fázis körülbelül 225 mM NaCl¹ot tartalmaz. 20. Eljárás részlegesen tisztított, IGF-I-bõl és IGFBP-3-ból álló komplex tisztítására, amely magában foglalja a komplex adszorbeálását kationcserélõ gyantára, és a komplex deszorbeálását mobil fázisok lépcsõzetes sorozatának alkalmazásával. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, ahol a mobil fázisok magukban foglalnak egy elsõ mobil fázist, amely körülbelül 160 mM és körülbelül 185 mM közötti
1
HU 008 107 T2
NaCl¹ot tartalmaz, és egy második mobil fázist, amely körülbelül 200 mM és körülbelül 250 mM közötti NaCl¹ot tartalmaz. 22. Eljárás részlegesen tisztított, IGF-I-bõl és IGFBP-3-ból álló komplex tisztítására ioncserélõ kromatográfiával, karboxi-metil-gyanta alkalmazásával, ahol a tisztítás magában foglalja a komplex deszorbeálását a karboxi-metil-gyantáról egy elsõ mobil fá-
5
11
2
zis alkalmazásával, amely körülbelül 160 mM és körülbelül 185 mM közötti NaCl¹ot tartalmaz, ezt követõen egy második mobil fázis alkalmazásával, amely körülbelül 200 mM és körülbelül 250 mM közötti NaCl¹ot tartalmaz, miáltal kinyerjük a tisztított terméket. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, ahol a második mobil fázis körülbelül 225 mM NaCl¹ot tartalmaz.
HU 008 107 T2 Int. Cl.: C07K 1/113
12
HU 008 107 T2 Int. Cl.: C07K 1/113
13
HU 008 107 T2 Int. Cl.: C07K 1/113
14
HU 008 107 T2 Int. Cl.: C07K 1/113
15
HU 008 107 T2 Int. Cl.: C07K 1/113
16
HU 008 107 T2 Int. Cl.: C07K 1/113
17
HU 008 107 T2 Int. Cl.: C07K 1/113
18
HU 008 107 T2 Int. Cl.: C07K 1/113
19
HU 008 107 T2 Int. Cl.: C07K 1/113
20
HU 008 107 T2 Int. Cl.: C07K 1/113
21
HU 008 107 T2 Int. Cl.: C07K 1/113
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
