(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000008015T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 008 015

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 39/085

(21) Magyar ügyszám: E 04 778847 (22) A bejelentés napja: 2004. 07. 22. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040778847 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1651166 A2 2005. 02. 03. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1651166 B1 2010. 02. 17.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 489840 P 2003. 07. 24. 520115 P 2003. 11. 14.

(73) Jogosult: Merck Sharp & Dohme Corp., Rahway, New Jersey 07065 (US)

US US

(72) Feltalálók: ANDERSON, Annaliesa, S., Rahway, New Jersey 07065-0907 (US); JANSEN, Kathrin Ute, Rahway, New Jersey 07065-0907 (US); KELLY, Rosemarie, Rahway, New Jersey 07065-0907 (US); SCHULTZ, Loren, D., Rahway, New Jersey 07065-0907 (US); MONTGOMERY, Donna, L., Rahway, New Jersey 07065-0907 (US); MCCLEMENTS, William, L., Rahway, New Jersey 07065-0907 (US) (54)

(2006.01) C07K 14/31 (2006.01) C12N 15/31 (2006.01) C12N 15/81 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05009379 PCT/US 04/023523

(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest

Polipeptidek Staphylococcus aureus elleni, védelmet eredményezõ immunválasz indukálására

(57) Kivonat

HU 008 015 T2

A találmány tárgyát S. aureus ellen védelmet eredményezõ immunválaszt elõidézni képes, S. aureus eredetû polipeptidek képezik, valamint ilyen polipeptidek al-

kalmazásai és expressziós rendszerek ilyen polipeptidek elõállítására.

A leírás terjedelme 60 oldal (ezen belül 29 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 008 015 T2

A találmány mûszaki háttere A bejelentésben idézett hivatkozások puszta idézése nem jelenti annak elismerését, hogy azok az igényelt találmány vonatkozásában relevánsak lennének. Staphylococcus aureus egy patogén, amely széles körben elõforduló betegségekért és állapotokért felelõs. S. aureus által okozott betegségek és állapotok például bakterémia, fertõzõ endokarditisz, follikulitisz, furunkulus, karbunkulus, ótvar (impetigo), hólyagos ótvar (bullózus impetigo), cellulitisz, botryomycosis, toxikus sokk szindróma, ótvaros bõr szindróma, központi idegrendszer fertõzései, fertõzõ és gyulladásos szembetegség, oszteomielitisz, valamint az ízületek és csontok más fertõzései, és a légzési traktus fertõzései [„The Staphylococci in Human Disease”, szerk. Crossley és Archer, Churchill Livingstone Inc. (1997)]. Immunológiai alapú stratégiákat lehet alkalmazni S. aureus fertõzések legyõzésére és S. aureus terjedésének megállítására. Immunológiai alapú stratégia lehet passzív és aktív immunizálás. Passzív immunizálásban S. aureusra specifikus ellenanyagokat alkalmaznak. Aktív immunizálásban immunválaszt indukálnak S. aureus ellen. Potenciális S. aureus vakcinák S. aureusban található poliszacharidokat és polipeptideket céloznak meg. A célbavétel elérhetõ úgy, hogy vakcinakomponensként S. aureusból származó, alkalmas poliszacharidokat és polipeptideket alkalmazunk. Potenciálisan alkalmazható poliszacharid vakcinakomponensek lehetnek S. aureusból származó, 5. típusú és 8. típusú, kapszuláris poliszacharidok [Shinefield és munkatársai, N. Eng. J. Med. 346, 491–496 (2002)]. Polipeptidek, amelyeket lehetséges vakcinakomponensként lehet alkalmazni, például kollagén, adhezin, fibrinogénkötõ fehérjék és endokoaguláz („clumping factor”) [Mamo és munkatársai, FEMS Immunology and Medical Microbiology 10, 47–54 (1994); Nilsson és munkatársai, J. Clin. Invest. 101, 2640–2649 (1998); Josefsson és munkatársai, The Journal of Infectious Diseases 184, 1572–1580 (2001)]. S. aureus polipeptidszekvenciáira vonatkozó információkhoz az S. aureus genom szekvenálásával lehet jutni [Kuroda és munkatársai, Lancet 357, 1225–1240 (2001); Baba és munkatársai, Lancet 359, 1819–1827 (2000); Kunsch és munkatársai, EP 0 786 519 számú európai közzétételi irat, közzétéve 1997. július 30.]. Bizonyos mértékig bioinformatikai módszereket is alkalmaztak a genom szekvenálásából nyert polipeptidszekvenciák jellemzésére [Kunsch és munkatársai, EP 0 786 519 számú európai közzétételi irat, közzétéve 1997. július 30.]. „Display” technológiát alkalmazó technikákat és fertõzött páciensekbõl származó szérumokat lehet alkalmazni olyan erõfeszítésekhez, amelyekben potenciális antigéneket kódoló gének azonosítását kísérelték meg [Foster és munkatársai, WO 01/98499 számú nemzetközi közzétételi irat, közzétéve 2001. december 27.; Meinke és munkatársai, WO 02/059148 számú nemzetközi közzétételi irat, közzétéve 2002. augusztus 1.].

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

A találmány összefoglalása A találmány tárgyát olyan polipeptidek képezik, amelyek az 1. azonosító számú szekvenciával rokon szerkezetû aminosavszekvenciát foglalnak magukban, ilyen polipeptidek alkalmazása és expressziós rendszerek ilyen polipeptidek elõállítására. Az 1. azonosító számú szekvencia a teljes hosszúságú S. aureusból származó polipeptid rövidített származéka. A teljes hosszúságú polipeptidet a leírásban teljes hosszúságú „ORF0657n”-ként jelöljük. Az 1. azonosító számú szekvenciát tartalmazó polipeptidekrõl azt találtuk, hogy védelmet eredményezõ immunválaszt képesek elõidézni S. aureus ellen. A „védelmet eredményezõ” immunitás vagy immunválasz kifejezés kimutatható szintû védettséget jelent S. aureus fertõzése ellen. A védettség szintjét állatmodellek alkalmazásával lehet meghatározni, például olyanokkal, amelyeket a leírásban ismertetünk. Tehát a találmány tárgyát képezi immunogén polipeptid, amely az 1. azonosító számú szekvenciával legalább 90%-ban azonos aminosavszekvenciát tartalmaz, ahol a polipeptid nem tartalmaz a 2. azonosító számú szekvencia 609–645. aminosavai által meghatározott karboxiterminálist, és a polipeptid védelmet eredményezõ immunitást képes biztosítani S. aureus ellen. A 2. azonosító számú szekvencia teljes hosszúságú ORF0657n-polipeptidnek felel meg, ahol a 609–645. aminosavak képezik a karboxiterminális domént, LPXTG-motívummal kezdve (a leírásban „sejtfalszortírozó szignál”-ként jelöljük). A leírásban az „immunogén” kifejezés azt a képességet jelenti, hogy védelmet eredményezõ immunitást biztosít. A leírásban „az 1. azonosító számú szekvenciával legalább 90%-ban azonos aminosavszekvenciát tartalmaz” kifejezés azt jelenti, hogy 1. azonosító számú szekvenciával rokon szerkezetû régió van jelen, és további polipeptidrégiók lehetnek jelen. Ha további polipeptidrégiók vannak jelen, akkor a polipeptid nem rendelkezik a 2. azonosító számú szekvencia 609–645. aminosavai által meghatározott LPXTG-motívummal. A találmány tárgya egy másik szempont szerint egy immunogén, amely S. aureus ellen védelmet eredményezõ immunitást biztosítani képes aminosavszekvenciát tartalmaz. Az immunogén az 1. azonosító számú szekvenciával legalább 90%-ban azonos aminosavszekvenciát tartalmaz, és egy vagy több további hozzáadott régiót vagy csoportot foglal magában a karboxiterminálisnál vagy aminoterminálisnál kovalensen kapcsolódva, a régiók vagy csoportok nem részei a 2. azonosító számú szekvencia 609–645. aminosavai által alkotott karboxiterminálisnak, ahol az egyes régiók vagy csoportok egymástól függetlenül olyan régiók vagy csoportok közül vannak kiválasztva, amelyek a következõ tulajdonságok közül legalább eggyel rendelkeznek: immunválaszt fokoznak, tisztítást elõsegítenek vagy a polipeptid stabilitását elõsegítik. A „további régiók vagy csoportok” kifejezés olyan régiót vagy csoportot jelent, amely eltér egy olyan ORF0657n-polipeptidtõl, amelyet egy biológiai gazda-

1

HU 008 015 T2

szervezet, például prokarióta vagy eukarióta gazdaszervezet képes lenne elõállítani. A további régió vagy csoport lehet például további polipeptidrégió vagy nem peptidrégió. A találmány tárgya egy másik szempont szerint egy készítmény, amely védelmet eredményezõ immunitást képes indukálni S. aureus ellen egy páciensben. A készítmény gyógyászatilag elfogadható hordozót és fentebb leírt immunogénbõl immunológiailag hatásos mennyiséget tartalmaz, S. aureus ellen védelmet eredményezõ immunitást biztosítva. Immunológiailag hatásos mennyiség egy olyan mennyiség, amely elegendõ S. aureus ellen védelmet eredményezõ immunitás biztosítására. A mennyiségnek elegendõnek kell lennie ahhoz, hogy jelentõs mértékben megelõzze S. aureus fertõzésének valószínûségét vagy súlyosságát. A találmány tárgya egy másik szempont szerint egy nukleinsav, amely fentebb leírt, olyan polipeptidet kódoló, rekombináns gént foglal magában, amely S. aureus ellen védelmet eredményezõ immunitást biztosít. Egy rekombináns gén polipeptidet kódoló, rekombináns nukleinsavat tartalmaz szabályozóelemekkel a megfelelõ transzkripció és érés (processzálás) céljából (amely magában foglalhat transzlációs és poszttranszlációs elemeket). A rekombináns gén létezhet függetlenül a gazdaszervezetben, vagy része lehet a gazdaszervezet genomjának. Egy rekombináns nukleinsav olyan nukleinsav, amely szekvenciája és/vagy formája következtében természetes körülmények között nem fordul elõ. Rekombináns nukleinsav lehet tisztított nukleinsav, két vagy több nukleinsavrégió összekombinálva, amelybõl egy olyan nukleinsav jön létre, ami különbözik egy természetben elõforduló nukleinsavtól, és egy vagy több olyan nukleinsavrégió hiányozhat belõle (például 5’¹végi vagy 3’¹végi régiók), amelyek természetes körülmények között társultak egymással. A találmány tárgya egy másik szempont szerint rekombináns sejt. A sejt fentebb leírt, olyan polipeptidet kódoló rekombináns gént tartalmaz, amely S. aureus ellen védelmet eredményezõ immunitást biztosít. A találmány tárgya egy másik szempont szerint eljárás fentebb leírt, olyan polipeptid elõállítására, amely S. aureus ellen védelmet eredményezõ immunitást biztosít. Az eljárás magában foglalja a polipeptidet kódoló, rekombináns nukleinsavat tartalmazó, rekombináns sejt növesztését és a polipeptid tisztítását. A találmány tárgya egy másik szempont szerint fentebb leírt, S. aureus ellen védelmet eredményezõ immunitást biztosító polipeptid olyan eljárással elõállítva, amely magában foglalja a polipeptidet kódoló, rekombináns nukleinsavat tartalmazó, rekombináns sejt növesztésének lépését egy gazdaszervezetben és a polipeptid tisztításának lépését. Különbözõ gazdaszervezeteket lehet alkalmazni. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a gazdaszervezet élesztõsejt. A találmány tárgya egy másik szempont szerint fentebb leírt immunogén S. aureus ellen védelmet eredményezõ immunitás biztosítára egy páciensben. Az immunogént olyan immunológiailag hatásos mennyiség-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

ben adjuk be a páciensnek, amely S. aureus ellen védelmet eredményezõ immunitást biztosít. A találmány tárgya egy másik szempont szerint egy fentebb leírt immunogén anamnesztikus válasz indukálására egy páciensben. Az eljárás hatásos mennyiségû immunogén beadásának lépését foglalja magában egy páciensnek az anamnesztikus válasz létrehozása céljából. A találmány tárgya egy másik szempont szerint ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidet kódoló nukleinsav, amely élesztõben történõ expresszióra van optimalizálva. Egy vagy több kodon élesztõben történõ expresszióra van optimalizálva. A találmány tárgya egy másik szempont szerint eljárás fentebb leírt, olyan polipeptid elõállítására rekombináns élesztõsejtben, amely S. aureus ellen védelmet eredményezõ immunitást biztosít. Az eljárás a következõ lépéseket foglalja magában: (a) rekombináns élesztõsejt növesztése olyan körülmények között, ahol a polipeptid expresszálódik, ahol a rekombináns élesztõsejt magában foglalja a polipeptidet kódoló, rekombináns gént, és a polipeptid teljes hosszúságú, ORG0657n-nel rokon szerkezetû polipeptid, amely védelmet eredményezõ immunitást biztosít S. aureus fertõzése ellen, vagy fragmense, amely 1. azonosító számú szekvenciával legalább 90%-osan azonos aminosavszekvenciát tartalmaz; és (b) a polipeptid tisztítása. Hacsak adott kifejezések kölcsönösen nem zárják egymást ki, a „vagy” kifejezés utalhat az „egyik” vagy „mindkettõ” lehetõségére. Adott esetben kifejezéseket, például „és/vagy” kifejezést alkalmazunk az egyik vagy mindkét lehetõség hangsúlyozására. Nyitott kifejezések, például „magában foglal”, lehetõvé teszi további elemek vagy lépések bevonását. Adott esetben olyan kifejezéseket, mint például „egy vagy több” kifejezést a nyitott kifejezésekkel együtt vagy nélkülük alkalmazzuk, hogy további elemek vagy lépések bevonása hangsúlyozva legyen. Hacsak kifejezetten másképpen nem hangsúlyozzuk, az olyan kifejezések, mint a határozatlan névelõként szereplõ „egy”, nem korlátozódik az „egy” számnévre. Például „egy sejt” nem zárja ki a „sejtek” értelmezést. Adott esetekben olyan kifejezéseket, mint például „egy vagy több”, használunk a többes szám hangsúlyozására. A találmány szerinti megoldás más jellemzõi és elõnyei nyilvánvalóak a különbözõ példákat tartalmazó, további leírásból. A bemutatott példák a találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezésében hasznos, különbözõ komponenseket és módszereket szemléltetnek. A példákkal nem kívánjuk korlátozni a találmány által igényelt oltalmi kört. A leírás alapján szakember képes azonosítani más komponenseket és módszereket, amelyek felhasználhatók a találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezésében. Ábrák rövid leírása Az 1A., 1B., 1C. és 1D. ábra vázlatosan szemlélteti az ORF0657n-nel rokon szerkezetû poli-

1

HU 008 015 T2

peptidrégiókat, amelyeket állatokban védettség kialakítása céljából szkríneltünk, és néhány különbözõ ORF0657n-szekvenciát. Az 1A. ábrán vázlatosan ábrázolunk olyan polipeptideket, amelyeket teszteltünk, és azt találtuk, hogy védettséget biztosítanak (kitöltött négyszögekkel jelölve), olyan polipeptideket, amelyeket teszteltünk, és azt találtuk, hogy nem biztosítanak védettséget (üres négyszögekkel jelölve), és olyan polipeptideket, amelyeket nem teszteltünk (vonalkázott bokszok). Az 1B. ábrán bemutatjuk a teljes hosszúságú szekvenciát, ami referenciaként szolgált az 1A. ábrához (2. azonosító számú szekvencia). Az 1C. ábrán szemléltetjük a 28. azonosító számú szekvenciát. A 28. azonosító számú szekvencia karboxil „His-toldalékot” (LEHHHHHH, 64. azonosító számú szekvencia) tartalmaz. A karboxil His-toldalékot tartalmazó 28. azonosító számú szekvenciát a leírásban „His-toldalék ORF0657n”-ként is jelöljük. Az 1D. ábra szemlélteti az ORF0657nl-szekvenciát. A 2A–2E. ábrákon bemutatjuk különbözõ ORF0657n-nel rokon szerkezetû szekvenciák összehasonlítását az ORF0657nH-régióban. A szekvenciaazonosító számokat az ábrán „ID”-vel jelöljük. A 3A., 3B. és 3C. ábra azt szemlélteti, hogy ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidek, a teljes hosszúságú szekvencia, az ORF0657nH-régió és az ORF0657nl-régió védelmet eredményezõ immunitást képesek biztosítani S. aureus Becker-törzs ellen. A polipeptideket alumínium-hidroxi-foszfátadjuvánssal (AHP) alkalmaztuk. A 3A. ábra szemlélteti a 28. azonosító számú szekvenciával kapott eredményeket, a 3B. ábra szemlélteti a karboxil His-toldalékot tartalmazó, 4. azonosító számú szekvenciával kapott eredményeket, 3C. ábra szemlélteti a karboxil His-toldalékot tartalmazó, 5. azonosító számú szekvenciával kapott eredményeket. A „karboxil His-toldalék” azt jelenti, hogy His-toldalék-csoport, LEHHHHHH (64. azonosító számú szekvencia) van jelen a karboxiterminálisnál. A 4A–4H. ábrák azt szemléltetik, hogy ORF0657nnel rokon szerkezetû polipeptidek védelmet eredményezõ immunitást képesek biztosítani különbözõ S. aureus fertõzések ellen. A 28. azonosító számú szekvenciával rendelkezõ polipeptidet alkalmaztuk immunogénként. A 4A. ábrán a CL¹10 fertõzõ törzzsel (2,2×108 CFU/ml) kapott eredmények láthatók. A 4B. ábrán a CL¹10 fertõzõ törzzsel (2,1×108 CFU/ml) kapott eredmények láthatók. A 4C. ábrán a CL¹13 fertõzõ törzzsel (2,9×108 CFU/ml) kapott eredmények láthatók. A 4D. ábrán a CL¹13 fertõzõ

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 4

2

törzzsel (2,8×108 CFU/ml) kapott eredmények láthatók. A 4E. ábrán a CL¹30 fertõzõ törzzsel (3,1×108 CFU/ml) kapott eredmények láthatók. A 4F. ábrán a CL¹30 fertõzõ törzzsel (3,0×108 CFU/ml) kapott eredmények láthatók. A 4G. ábrán a CL¹18 fertõzõ törzzsel (1,0×108 CFU/ml) kapott eredmények láthatók. A 4H. ábrán a CL¹21 fertõzõ törzzsel (1,6×108 CFU/ml) kapott eredmények láthatók. Az 5A. és 5B. ábra S. cerevisiae expressziós plazmidok plazmidtérképét szemlélteti. Az 5A. ábrán bemutatjuk a pGAL110-vektor plazmidtérképét. Az 5B. ábrán bemutatjuk a piUC¹1 plazmidtérképét, bemutatva élesztõkodonra optimalizált szekvenciát, amelyet a pGAL110-vektor GAL1-promotere vezérel. A 6A. és 6B. ábrán Western-blotok láthatók, amelyek a 28. azonosító számú szekvencia (28. azonosító számú szekvencia a karboxil Histoldalék nélkül) 1–646. aminosavaival rendelkezõ, teljes hosszúságú ORF0657n intramolekuláris expresszióját ábrázolják. 1. sáv: molekulaméret-standardek; 2. sáv: tisztított, E. coliban termelõdött, rekombináns, teljes hosszúságú ORF0657n-régió (28. azonosító számú szekvencia), 100 ng; 3–6. sávok: 20 mg élesztõsejt-lizátumot tartalmaznak; 3. és 4. sávok: sejtlizátumok az olyan 1260. számú (6A. ábra) és 1309. számú (6B. ábra) transzformánsok párhuzamos fermentációjából, amelyek csak pGAL110-vektort tartalmaznak; 5. és 6. sávok: sejtlizátumok az olyan 1260. számú (6A. ábra) és 1309. számú (6B. ábra) transzformánsok párhuzamos fermentációjából, amelyek pRUnkC-pGAL110¹et tartalmaznak, amely teljes hosszúságú ORF0657n-régiót (28. azonosító számú szekvencia a karboxil His-toldalék nélkül) expresszál. A 7A. és 7B. ábrán bemutatjuk egy SDS-PAGE-gél Coomassie-festését és Western-blotot, sorrendben, ami 3. azonosító számú nukleinsav intracelluláris expresszióját mutatja S. cerevisiae-ben. 1. sáv: A. panel: BSA, 1,25 mg, B. panel: tisztított E. coliban termelt, rekombináns, teljes hosszúságú ORF0657n (28. azonosító számú szekvencia), 100 ng; 2. sáv: sejtlizátum egy E. coli ORF0657nH-termelõ törzsbõl (4. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalékkal); A. panel: 1,25 mg, B. panel: 0,5 mg. 3–7. sávok: A. és B. panel: 1,25 mg és 0,5 mg élesztõsejt-lizátum, sorrendben; 3. sáv: a transzformáns csak pGAL110-vektort tartalmaz; 4. sáv: a transzformáns teljes hosszúságú ORF0657n¹t (28. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalék nélkül) tartalmaz; 5., 6. és 7. sávok: 1–1-jelû transzfor-

1

HU 008 015 T2

máns, amely piUC¹S(–)¹t tartalmaz, ami érett ORF0657nH-régiót (3. azonosító számú szekvencia) expresszál; 7. sáv: olyan sejtlizátumot tartalmaz (1–1-jelû transzformánsból), amit lefagyasztottunk és azt követõen felolvasztottunk. A 8. sáv molekulaméret-standardeket tartalmaz. A 8A–8U. ábrákon bemutatunk ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptideket kódoló, különbözõ nukleinsavszekvenciákat. A 8A. ábrán bemutatjuk a 2. azonosító számú szekvenciát plusz karboxil His-toldalékot kódoló (29. azonosító számú) nukleinsavszekvenciát. A 8B. ábrán bemutatjuk a 4. azonosító számú szekvenciát plusz karboxil His-toldalékot kódoló (30. azonosító számú) nukleinsavszekvenciát. A 8C. ábrán bemutatjuk a karboxil His-toldalék nélküli, 28. azonosító számú szekvenciát kódoló, élesztõre optimalizált (31. azonosító számú) nukleinsavszekvenciát. A 8D. ábrán bemutatjuk a 3. azonosító számú szekvenciát kódoló, élesztõre optimalizált (32. azonosító számú) nukleinsavszekvenciát. A 8E. ábrán bemutatjuk az 1. azonosító számú szekvenciát kódoló, élesztõre optimalizált (33. azonosító számú) nukleinsavszekvenciát. A 8F–8M. ábrákon bemutatjuk aminoterminálison metionint tartalmazó, 7. azonosító számú szekvenciát kódoló, élesztõre optimalizált (34–41. azonosító számú) nukleinsavszekvenciákat. A 8N–8U. ábrákon bemutatjuk a 17. vagy 20. azonosító számú szekvenciára alapozott, különbözõ ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidet kódoló, élesztõre optimalizált (46–53. azonosító számú) nukleinsavszekvenciákat. A 9. ábrán bemutatjuk ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidek intracelluláris expressziójának összehasonlítását S. cerevisiae-ben, Western-blot alkalmazásával. Az 1. és 18. sáv: MW¹méret-standardek. A 2. és 3. sáv: 50 ng és 100 ng, sorrendben, E. coliban termelõdött, tisztított ORF0657nH (4. azonosító számú szekvencia plusz karboxil His-toldalék), 5. sáv: 500 ng fehérjét tartalmaz olyan S. cerevisiae sejtlizátumából, amely kontrollvektorral transzformált, 7., 8. és 9. sáv: 1,0, 2,0 és 4,0 mg sejtlizátum-fehérjét tartalmaz olyan S. cerevisiae transzformánsból, amely karboxil His-toldalék nélküli, 28. azonosító számú szekvenciával rendelkezõ fehérjét termel. A 11. és 12. sávok 50 és 100 ng, sorrendben, sejtlizátum-fehérjét tartalmaznak ORF0657n¹t (3. azonosító számú szekvencia) termelõ S. cerevisiae transzformánsból. A 14. és 15. sávok 250 és 500 ng, sorrendben, sejtlizátum-fehérjét tartalmaznak ORF0657nG¹t (44. azonosító számú szekvencia) termelõ S. cerevisiae transzfor-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

mánsból. A 17. sáv 250 sejtlizátum-fehérjét tartalmaz ORF0657nG¹t (44. azonosító számú szekvencia plusz karboxil His-toldalék) termelõ E. coliból. A 4., 6., 10., 13. és 16. sávok üresek. A 10. ábra védelmet eredményezõ immunitásra vonatkozó adatokat szemléltet E. coliban és élesztõben termelõdött, ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidekre. „ORF0657nH (E. coli)” megfelel a 4. azonosító számú szekvenciának karboxil His-toldalékkal, „ORF0657nl (E. coli)” megfelel az 5. azonosító számú szekvenciának karboxil His-toldalékkal, „ORF0657nC (E. coli)” megfelel a 28. azonosító számú szekvenciának, „ORF0657nH (élesztõ)” megfelel a 3. azonosító számú szekvenciának. A 11. ábrán példaként bemutatott Western-blot-kísérletek láthatók ORF0657nl intracelluláris expressziójára S. cerevisiae-ben. Az 1. és 25. sáv: MW¹méret-standardek. 2., 3. és 24. sávok: 25, 50 és 100 ng, sorrendben, E. coliban termeltetett tisztított ORF0657nH-régió (4. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalékkal). A 4–23. sávok élesztõtranszformánsokból származó sejtlizátumfehérjét tartalmaznak. A 13–12. sávok párhuzamos sejtlizátumoknak felelnek meg, amelyeket ugyanabból a fermentációs mintából készítettünk, mint a 4–12. sávokban lévõket. A 4. és 13. sáv 200 ng fehérjét tartalmaz kontrollvektorból, ami pGAL110¹et tartalmazó transzformáns. Az 5. és 14. sáv 100 ng fehérjét tartalmaz az 1–1-jelû transzformánsból, amely ORF0657nH-régiót (3. azonosító számú szekvencia) termel. A 6. és 15. sáv 200 ng fehérjét tartalmaz az 1–1jelû transzformánsból. A 7. és 16. sáv 100 ng fehérjét, és a 8. és 17. sáv 200 ng fehérjét tartalmaz az l1¹jelû transzformánsból. A 9. és 18. sáv 100 ng fehérjét, és a 10. és 19. sáv 200 ng fehérjét tartalmaz az l2¹jelû transzformánsból. A 11. és 20. sáv 100 ng fehérjét, és a 12. és 21. sáv 200 ng fehérjét tartalmaz az l3¹jelû transzformánsból. A 22. és 23. sáv 100 ng és 200 ng sejtlizátum-fehérjét az 1–1-jelû transzformáns egy korábbi fermentációjából. A 12. ábrán bemutatjuk rhesusmajmok immunizálásának adatait. Rhesusmajmokat élesztõben termeltetett ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptiddel (ORF0657nH, 3. azonosító számú szekvencia) vagy E. coliban expresszált ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptiddel (teljes hosszúságú ORF0657nC, 28. azonosító számú szekvencia) immunizáltunk, AHP-vel vagy anélkül kiszerelve. A vakcinával beoltott majmok 50 mg ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidet kaptak intramuszkulárisan.

1

HU 008 015 T2

A találmány részletes leírása ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidek közé tartoznak teljes hosszúságú és az ORF0657nl-régiót tartalmazó, rövidebb hosszúságú származékok, amelyekrõl azt találtuk, hogy védelmet eredményezõ immunitást biztosítanak S. aureus ellen, állatmodell alkalmazásával. Az 1A. ábra szemlélteti a különbözõ ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidrégiókat, amelyek védelmet eredményezõ immunitást biztosítanak S. aureus fertõzése ellen. Az 1A. ábrán ORF0657n jelentése a 2. azonosító számú szekvenciának megfelelõ, teljes hosszúságú szekvencia, ORF0657nl az 1. azonosító számú szekvencia egy régióját (az aminoterminális metionin nélkül) jelenti, és az ORF0657nH a 3. azonosító számú szekvencia egy régióját (az aminoterminális metionin nélkül) jelenti. ORF0657n-nel „rokon szerkezetû” polipeptid olyan régiót tartalmaz, amely strukturálisan rokon a teljes hosszúságú ORF0657n-nel vagy fragmensével. Az ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidek olyan polipeptidek, amelyek szekvenciája legalább körülbelül 90%-ban azonos egy természetesen elõforduló ORF0657n megfelelõ régiójának szekvenciájával. Az 1. ábrán szemléltetett, referencia ORF0657n megfelel S. aureus COL-ból származó ORF0657n-nek (2. azonosító számú szekvencia).

5

10

15

20

25

2

Egy referenciaszekvenciához viszonyított, százalékos azonosságot úgy határozunk meg, hogy a polipeptidszekvenciát és a referenciaszekvenciát egymás alá rendezzük, és meghatározzuk az azonos aminosavak számát. Ezt a számot elosztjuk a referenciaszekvenciában lévõ összes aminosav számával, és azután megszorozzuk 100-zal, és a legközebbi egész számra kerekítjük. Az 1A. ábra segít szemléltetni a magrégió jelentõségét, amely az 1. azonosító számú szekvenciával rokon szerkezetû aminosavszekvenciát tartalmaz. Az 1. azonosító számú szekvencia a COL-ból származó ORF0657n 42–486. aminosavait foglalja magában. Az 1. azonosító számú szekvencia aminoterminális metionint is tartalmaz az expresszió elõsegítésére. A 2. azonosító számú szekvencia 461–609. aminosavaiból, 82–486. aminosavaiból vagy 42–196. aminosavaiból felépülõ polipeptidfragmensek nem biztosítanak védelmet. A bejelentésben különbözõ aminosav- és nukleinsavszekvenciákra hivatkozunk. Az 1. táblázatban összefoglalunk néhány polipeptidszekvenciát, feltüntetve az 1. ábrán bemutatott régiót és további módosításokat. A 2. táblázatban összefoglalunk néhány nukleinsavszekvenciát.

1. táblázat Szek. az. sz.

ORF0657n-régió

További módosítás/további információ

1.

ORF0657nl

2.

teljes hossz.

aminoterminális metionin

3.

ORF0657nH

aminoterminális metionin

4.

ORF0657nH

aminoterminális metionin-glicin

5.

ORF0657nl

aminoterminális metionin-glicin

6.

ORF0657nH

7.

ORF0657nH

8.

ORF0657nH

9.

ORF0657nH

10.

ORF0657nH

11.

ORF0657nH

12.

ORF0657nH

13.

ORF0657nH

14.

ORF0657nH

15.

ORF0657nH

16.

ORF0657nH

17.

ORF0657nH

18.

ORF0657nH

19.

ORF0657nH

20.

ORF0657nH

21.

ORF0657nH

22.

ORF0657nH

23.

ORF0657nH

6

HU 008 015 T2

1. táblázat (folytatás) Szek. az. sz.

ORF0657n-régió

További módosítás/további információ

24.

ORF0657nH

25.

ORF0657nH

26.

ORF0657nH

27.

ORF0657nH

28.

teljes hossz.

2. az. sz. sz. úgy módosítva, hogy glicint tartalmaz az aminoterminális metionin után, és karboxil His-toldalékot tartalmaz

42.

ORF0657nl+

3. az. sz. sz. 1–481. aminosavai

44.

ORF0657nG

aminoterminális metionin plusz 2. az. sz. sz. 42–645. aminosavai

54–63.

ORF0657nH

különbözõ S. aureusból

106. és 107.

teljes hossz.

különbözõ S. aureusból

2. táblázat Szek. az. sz.

Régió

Más információk

29.

teljes hossz.

30.

ORF0657nH

4. az. sz. sz.¹t kódol (1–1710. nukleotidok+karboxil His-toldalék)

31.

teljes hossz.

28. az. sz. sz.¹t kódol karboxil His-toldalék nélkül, és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra (28. az. sz. sz. 1–646. aminosavai)

32.

ORF0657nH

3. az. sz. sz.¹t kódol és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra

33.

ORF0657nl


34.

ORF0657nH

7. az. sz. sz.¹t kódol aminoterminális metionint tartalmaz, és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra

35.

ORF0657nH


36.

ORF0657nH


37.

ORF0657nH


38.

ORF0657nH


39.

ORF0657nH


40.

ORF0657nH


41.

ORF0657nH


43.

ORF0657nl+


45.

ORF0657nG

44. az. sz. sz.¹t kódol, aminoterminális metionint tartalmaz, és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra

46.

ORF0657nH

17. az. sz. sz.¹t kódol, aminoterminális metionint tartalmaz, és kodon optimalizált élesztõexpresszióra

47.

ORF0657nl+

17. az. sz. sz. 1+-régiót kódol, kodonoptimalizált élesztõexpresszióra, és metionin iniciációs kodont kódol

48.

ORF0657nl

17. az. sz. sz. 1¹régiót kódol, kodonoptimalizált élesztõexpresszióra, és metionin iniciációs kodont kódol

49.

teljes hossz.

17. az. sz. sz.¹t tartalmazó, teljes hossz. ORF0657n¹t (106. az. sz. sz.) kódol, módosítva van úgy, hogy glicint tartalmaz az aminoterminális metionin után, és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra

50.

ORF0657nH

20. az. sz. sz.¹t kódol, kodonoptimalizált élesztõexpresszióra, és metionin iniciációs kodont kódol

2. az. sz. sz.¹t kódol (1–1935. nukleotidok+karboxil His-toldalék)

7

1

HU 008 015 T2

2

2. táblázat (folytatás) Szek. az. sz.

Régió

Más információk

51.

ORF0657nl+

20. az. sz. sz. 1+-régiót kódol, kodonoptimalizált élesztõexpresszióra, és metionin iniciációs kodont kódol

52.

ORF0657nl

20. az. sz. sz. 1¹régiót kódol, kodonoptimalizált élesztõexpresszióra, és metionin iniciációs kodont kódol

53.

teljes hossz.

20. az. sz. sz.¹t tartalmazó, teljes hossz. ORF0657n¹t (107. az. sz. sz.) kódol, módosítva van úgy, hogy glicint tartalmaz az aminoterminális metionin után, és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra

1. azonosító számú szekvenciával rokon szerkezetû polipeptidek Az 1. azonosító számú szekvenciával rokon szerkezetû polipeptidrégió legalább 90%-ban azonos az 1. azonosító számú szekvenciával. Az 1. azonosító számú szekvenciával rokon szerkezetû polipeptideket a leírásban ismertetett útmutatás alapján lehet tervezni, S. aureus ellen védelmet eredményezõ polipeptidek elõállítása céljából. Az 1. azonosító számú szekvenciát vonatkoztatási rendszerként alkalmazva változtatásokat lehet tenni, különbözõ természetesen elõforduló ORF0657n-polipeptidek aminosavszekvenciáját és aminosavak ismert tulajdonságait figyelembe véve. Változtatás lehet egy vagy több aminosav hozzáadása, deléciója és/vagy szubsztituálása. Különbözõ változtatások átfogó hatását a leírásban ismertetett technikák alkalmazásával lehet értékelni annak megerõsítése céljából, hogy egy adott polipeptid képes¹e védelmet eredményezõ immunitást biztosítani. ORF0657n-rõl azt találtuk, hogy meglehetõsen konzervatív patológiailag és taxonómiailag eltérõ S. aureus klinikai izolátumok készletében (lásd lentebb az 5. példában leírtakat). A 2. ábrán bemutatjuk az 1. azonosító számú szekvenciát tartalmazó, különbözõ aminosavszekvenciák összehasonlítását. A szemléltetett szekvencia-összehasonlítás az ORF0657nH-régióra vonatkozik. Az ORF0657nH-régió kisebb méretû ORF0657nI-régiót tartalmaz. A 2. ábrán bemutatjuk az 1. és 3–27. azonosító számú szekvenciák összehasonlítását. Az összehasonlítás S. aureus klinikai izolátumok közötti aminosavkülönbségeket szemlélteti, amelyet vezérfonalként lehet alkalmazni potenciális változtatások tervezésére S. aureus eredetû polipeptidekben, például az 1. és 3. azonosító számú szekvenciákban. Továbbá változtatásokat lehet tenni az aminosavak ismert tulajdonságait figyelembe véve. Az 1., 3–6. és 8–26. azonosító számú szekvenciák olyan természetesen elõforduló szekvenciákat szemléltetnek, amelyek a 3. számú helyzetben kezdõdnek, az 1. számú és 2. számú helyzet felel meg az N¹terminálisnál hozzáadott metioninnak vagy metionin-glicinnek néhány szekvenciában. A 11–26. azonosító számú szekvenciákat különbözõ klinikai izolátumokból állítottuk elõ. A 7. és 27. azonosító számú szekvenciák a 4. azonosító számú szekvenciával rendelkezõ ORF0657nH-régió variánsai, amely öt aminosavszubsztitúciót tartalmaz az 1. azo-

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 8

nosító számú szekvenciával rendelkezõ, magrégión kívüli régióban. További ORF0657n-szekvenciákat lehet alkalmazni a szekvencia-összehasonlításban, amely segít a változtatásokhoz. S. aureus eredetû ORF0657nH-régió további szekvenciái például az 54–63. azonosító számú szekvenciák, a 17. és 20. azonosító számú szekvencia teljes hosszúságú szekvenciáinak a 106. és 107. azonosító számú szekvencia felel meg. Különbözõ aminosavak szubsztituálásakor, az aktivitás megtartása céljából általában elõnyös hasonló tulajdonságú aminosavakat cserélni. Aminosavszubsztitúcióknál figyelembe vehetõ faktorok közé tartozik az aminosav mérete, töltése, polaritása és hidrofobicitása. Különbözõ aminosavak R¹csoportjainak hatása az aminosav tulajdonságaira szakember által jól ismert [lásd például Ausubel, „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley (1987–2002), 1.C függelék]. Aminosavak cseréjekor, az aktivitás megtartása céljából a csereaminosavnak egy vagy több tulajdonságának hasonlónak kell lennie, például körülbelül ugyanolyan töltéssel és/vagy mérettel és/vagy polaritással és/vagy hidrofobicitással kell rendelkeznie. Például valin szubsztituálása leucinra, arginin lizinre és aszparagin glutaminra jó lehetõségek, amelyek nem okoznak változást a polipeptid funkciójában. Egy konkrét cél elérése érdekében végzett változtatások olyanok, amelyek elõsegítik a polipeptid termeltetését vagy hatékonyságát; vagy a kódoló nukleinsav klónozását. Polipeptid termeltetését elõ lehet segíteni rekombináns expresszióra alkalmas, iniciációs kodon (például ami metionin kódol) alkalmazásával. A metionin késõbb eltávolítható a celluláris érés folyamán. Klónozás elõsegíthetõ például olyan restrikciós hasítóhelyek bevitelével, amely aminosav hozzáadásával vagy megváltoztatásával jár. Egy polipeptid immunválaszt indukáló képességének hatékonyságát az epitóphatás-fokozáson keresztül lehet növelni. Az epitóphatást különbözõ technikák alkalmazásával lehet fokozni, például olyanokkal, amelyekben megváltoztatnak horgonyzócsoportokat a peptid MHC-molekulák irányában mutatott affinitásának javítása céljából, és olyanokkal, amelyek a peptid-MHCkomplex affinitását növelik T¹sejt-receptor felé [Berzofsky és munkatársai, Nature Review 1, 209–219 (2001)]. A találmány különbözõ elõnyös megvalósítási módjai szerint, az 1. azonosító számú szekvenciával rokon

1

HU 008 015 T2

szerkezetû polipeptidrégió vonatkozásában, a régió legalább 90%-ban, legalább 94%-ban vagy legalább 99%ban azonos az 1. azonosító számú szekvenciával; az 1. azonosító számú szekvenciától 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 vagy 25 változtatással, maximum 50 változtatással különbözik, vagy az ORF0657nl-lel rokon szerkezetû régió alkotja a következõk által alkotott csoportból kiválasztva (az. sz. szek.=azonosító számú szekvencia): 1–442. aminosavak a 11., 15., 16., 18. vagy 54. az. sz. szek.¹ban; 1–443. aminosavak a 63. az. sz. szek.¹ban; 1–444. aminosavak az 57. vagy 59. az. sz. szek.¹ban; 1–445. aminosavak a 7., 8., 9., 10., 12., 13., 14., 17., 19., 20., 55., 56. vagy 58. az. sz. szek.¹ban; 1–446. aminosavak a 23. vagy 24. az. sz. szek.¹ban; 1–446. vagy 2–446. aminosavak az 1. vagy 3. az. sz. szek.¹ban; 1–447. aminosavak a 25. vagy 26. az. sz. szek.¹ban; 1–447. vagy 2–447. vagy 3–447. aminosavak a 4., 5. vagy 27. az. sz. szek.¹ban; 1–449. aminosavak a 61. vagy 62. az. sz. szek.¹ban; 1–453. aminosavak a 60. az. sz. szek.¹ban; és 1–454. aminosavak a 6., 21. vagy 22. az. sz. szek.¹ban. Jelen lehetnek további hozzáadott aminosavak. A hozzáadott aminosavak lehetnek a karboxil- vagy az aminoterminálisnál. A találmány különbözõ elõnyös megvalósítási módjai szerint 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 vagy 20 további aminosav van jelen. A találmány elõnyös megvalósítási módjai szerint metionin van az aminoterminálisnál; vagy metionin-glicin van az aminoterminálisnál. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a polipeptid, amit a 42. azonosító számú szekvenciával legalább 90%-ban azonos aminosavszekvencia vagy fragmense alkot, 1. azonosító számú szekvenciával rokon szerkezetû aminosavszekvenciát tartalmaz. A 42. azonosító számú szekvencia vonatkozásában, a találmány egy különbözõ elõnyös megvalósítási módja szerint, a polipeptid legalább 94%-ban vagy legalább 99%-ban azonos a 42. azonosító számú szekvenciával; a 42. azonosító számú szekvenciához képest 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 vagy 25, maximum 50 változtatást vagy maximum 65 változtatást tartalmaz; vagy a 42. azonosító számú szekvencia vagy ORF0657nl*-lel rokon szerkezetû régió alkotja, a következõk által alkotott csoportból kiválasztva: 1–477. aminosavak a 11., 15., 16., 18. vagy 54. az. sz. szek.¹ban; 1–478. aminosavak a 63. az. sz. szek.¹ban; 1–479. aminosavak az 57. vagy 59. az. sz. szek.¹ban; 1–480. aminosavak a 7., 8., 9., 10., 12., 13., 14., 17., 19., 20., 55., 56. vagy 58. az. sz. szek.¹ban;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 9

2

1–481. aminosavak a 23. vagy 24. az. sz. szek.¹ban; 1–481. vagy 2–481. aminosavak az 1. vagy 3. az. sz. szek.¹ban; 1–482. aminosavak a 25. vagy 26. az. sz. szek.¹ban; 1–482. vagy 2–482. vagy 3–482. aminosavak a 4., 5. vagy 27. az. sz. szek.¹ban; 1–484. aminosavak a 61. vagy 62. az. sz. szek.¹ban; 1–488. aminosavak a 60. az. sz. szek.¹ban; és 1–489. aminosavak a 6., 21. vagy 22. az. sz. szek.¹ban. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint a polipeptidet a 3. azonosító számú szekvenciával legalább 90%-ban azonos aminosavszekvencia vagy fragmense alkotja, magában foglalva 1. azonosító számú szekvenciával rokon szerkezetû aminosavszekvenciát. A 3. azonosító számú szekvencia vonatkozásában, a találmány különbözõ elõnyös megvalósítási módjai szerint, a polipeptid legalább 94%-ban vagy legalább 99%-ban azonos a 3. azonosító számú szekvenciával; a 3. azonosító számú szekvenciához képest 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 vagy 25, maximum 50 változtatást vagy maximum 65 változtatást tartalmaz; vagy a következõk által alkotott csoportból kiválasztott aminosavszekvencia építi fel: 3., 4., 6., 7., 8., 9., 10., 11., 12., 13., 14., 15., 16., 17., 18., 19., 20., 21., 22., 23., 24., 25., 26., 27., 54., 55., 56., 57., 58., 59., 60., 61., 62. és 63. azonosító számú szekvenciák. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint a 2. azonosító számú szekvenciával rendelkezõ polipeptid által alkotott polipeptid glicin inszerciójával van módosítva a kezdõ metionin után, vagy az ilyen polipeptid a kezdõ metionin nélkül fordul elõ. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint a polipeptid egy tisztított polipeptid. Egy „tisztított polipeptid” olyan környezetben van jelen, amelyben nincsen jelen egy vagy több, más olyan polipeptid, amely természetes körülmények között társul, és/vagy a jelen lévõ összfehérje legalább körülbelül 10%¹át reprezentálja. A találmány eltérõ elõnyös megvalósítási módjai szerint a tisztított polipeptid egy mintában vagy preparátumban jelen lévõ összfehérje legalább körülbelül 50%¹át, legalább körülbelül 75%¹át vagy legalább körülbelül 95%¹át reprezentálja. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint a polipeptid „lényegileg tisztított”. Egy lényegileg tisztított polipeptid olyan környezetben van, amelyben nincsen jelen az összes olyan polipeptid vagy ezek többsége, amelyek természetes körülmények között társulnak. Lényegileg tisztított S. aureus polipeptid például olyan környezetben van, amelyben nincsen jelen az összes többi S. aureus polipeptid vagy azok többsége. A környezet lehet például minta vagy preparátum. A „tisztított” vagy „lényegileg tisztított” megjelöléshez nem szükséges, hogy a polipeptid bármilyen tisztítási folyamaton átmenjen, ilyen lehet például egy ké-

1

HU 008 015 T2

miailag szintetizált polipeptid, amelyet elõzõleg nem tisztítottak. A polipeptid stabilitását úgy lehet fokozni, hogy a polipeptid karboxil- vagy aminoterminálisát módosítjuk. Lehetséges módosítások például aminoterminálist védõ csoportok, például acetil, szukcinil, benzil, benziloxi-karbonil vagy t¹butil-oxi-karbonil; és karboxiterminálist védõ csoportok, például amid, metil-amid és etilamid. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a védelmet eredményezõ polipeptid olyan immunogén része, amit a polipeptid és a polipeptidhez a karboxiterminálisnál vagy aminoterminálisnál a polipeptidhez kovalensen kapcsolt, egy vagy több, további régió vagy csoport épít fel. Az egyes régiók vagy csoportok egymástól függetlenül olyan régiók vagy csoportok közül vannak kiválasztva, amelyek a következõ tulajdonságok közül legalább eggyel rendelkeznek: immunválaszt fokoznak, tisztítást elõsegítenek vagy a polipeptid stabilitását elõsegítik. A polipeptid stabilitását például olyan csoportok alkalmazásával lehet fokozni, mint polietilénglikol, ami az amino- vagy karboxiterminálisnál lehet jelen. A polipeptid tisztítását úgy lehet javítani, hogy a karboxil- vagy aminoterminálishoz hozzáadunk egy csoportot a tisztítás elõsegítése céljából. A tisztítás elõsegítésére alkalmazható csoportok lehetnek például olyan polipeptidek, amelyek affinitástoldalékkal vannak ellátva. Affinitástoldalék lehet például hat hisztidinbõl álló toldalék, trpE, glutation és maltózkötõ fehérje. A polipeptid immunválaszt elõidézõ képességét olyan csoportok alkalmazásával lehet javítani, amelyek általában immunválaszt fokoznak. Csoportok, amelyeket egy polipeptidhez lehet kapcsolni a polipeptid elleni immunválasz fokozása céljából, lehetnek például citokinek, például IL–2 [Buchan és munkatársai, Molecular Immunology 37, 545–552 (2000)]. Polipeptidtermelés Polipeptideket standard technikák alkalmazásával lehet termeltetni, például kémiai szintézissel és olyanokkal, amelyek a polipeptidet termelõ sejtbõl történõ tisztításra szolgálnak. Polipeptidek kémiai szintézisére szolgáló technikák szakember által jól ismertek [lásd például Vincent, „Peptide and Protein Drug Delivery”, New York, N.Y., Decker (1990)]. Polipeptidek egy sejtbõl történõ tisztítására szolgáló technikákat lentebb, a példákban szemléltetünk. Tisztításra szolgáló további példák szakember által jól ismertek [lásd például Ausubel, „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley (1987–2002)]. Polipeptidek sejtbõl való kinyerését elõsegítik a polipeptid termeltetésére szolgáló, rekombináns nukleinsav technikák. Polipeptid elõállítására szolgáló, rekombináns nukleinsav technikák közé tartozik a polipeptidet kódoló, rekombináns gén bevitele egy sejtbe, vagy elõállítása egy sejtben, és a polipeptid expresszálása. Egy rekombináns gén polipeptidet kódoló nukleinsavat tartalmaz a polipeptid expressziójához szükséges szabályozóelemekkel. A rekombináns gén a cellu-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 10

2

láris genomban lehet jelen, vagy egy expressziós vektor része lehet. A szabályozóelemek, amelyek egy rekombináns gén részeként lehetnek jelen, azok, amelyek természetes körülmények között társultak a polipeptidet kódoló szekvenciával, és exogén szabályozóelemek, amelyek természetes körülmények között nem társultak a polipeptidet kódoló szekvenciával. Exogén szabályozóelemek, például exogén promoter hasznos lehet egy rekombináns gén expresszálására egy konkrét gazdaszervezetben vagy az expresszió mértékének növelésére. A szabályozóelemek, amelyek általában jelen lehetnek egy rekombináns génben: transzkripciós promoter, riboszóma-kötõhely, terminátor és adott esetben jelen lévõ operátor. Eukarióta sejtekben végbemenõ éréshez („processzáláshoz”) szükséges, elõnyösen alkalmazott elem egy poliadenilálási szignál. Egy rekombináns gén sejtben történõ expressziója elõsegíthetõ expressziós vektor alkalmazásával. Egy expressziós vektor rekombináns génen kívül tartalmaz replikációs origót is autonóm replikációhoz egy gazdasejtben, szelektálható markert, korlátozott számban használható restrikciós enzimek hasítóhelyeit, és lehetõséget nagy kópiaszámhoz. Expressziós vektorok például klónozóvektorok, módosított klónozóvektorok, speciálisan tervezett plazmidok és vírusok. A genetikai kód degeneráltsága miatt nagyszámú, különbözõ kódoló nukleinsavszekvenciákat lehet alkalmazni egy adott polipeptid kódolására. A genetikai kód degeneráltságának oka az, hogy szinte valamennyi aminosavat különbözõ nukleotidtriplettek vagy „kodonok” kódolnak. Az aminosavakat a következõ kodonok kódolják: A=Ala=alanin: GCA, GCC, GCG, GCH kodonok C=Cys=cisztein: UGC, UGU kodonok D=Asp=aszparaginsav: GAC, GAU kodonok E=Glu=glutaminsav: GAA, GAG kodonok F=Phe=fenil-alanin: UUC, UUU kodonok G=Gly=glicin: GGA, GGC, GGG, GGU kodonok H=His=hisztidin: CAC, CAU kodonok I=Ile=izoleucin: AUA, AUC, AUU kodonok K=Lys=lizin: AAA, AAG kodonok L=Leu=leucin: UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU kodonok M=Met=metionin: AUG kodonok N=Asn=aszparagin: AAC, AAU kodonok P=Pro=prolin: CCA, CCC, CCG, CCU kodonok Q=Gln=glutamin: CAA, CAG kodonok R=Arg=arginin: AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU kodonok S=Ser=szerin: AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU kodonok T=Thr=treonin: ACA, ACC, ACG, ACU kodonok V=Val=valin: GUA, GUC, GUG, GUU kodonok W=Trp=triptofán: UGG kodon Y=Tyr=tirozin: UAC, UAU kodonok ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidek rekombináns nukleinsavval végzett expressziójára alkalmas sejtek lehetnek prokarióták és eukarióták. Prokarióta sejtek például E. coli; Staphylococcus nemzetség

1

HU 008 015 T2

tagjai, például S. aureus; Lactobacillus nemzetség tagjai, például L. plantarum; Lactococcus nemzetség tagjai, például L. lactis; és a Bacillus nemzetség tagjai, például B. subtilis. Eukarióta sejtek például emlõsszervezet sejtjei; rovarsejtek; élesztõsejtek, például Saccharomyces nemzetség tagjai (például S. cerevisiae), Pichia nemzetség tagjai (például P. pastoris), Hansenula nemzetség tagjai (például H. polymorpha), Kluyveromyces nemzetség tagjai (például K. lactis vagy K. fragilis) és Schizosaccharomyces nemzetség tagjai (például S. pombe). Rekombináns gén elõállítására, sejtbe való bevitelére és rekombináns gén expressziójára alkalmas technikák szakember által jól ismertek. Ilyen technikákra leírnak példákat hivatkozásokban, például Ausubel, „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley (1987–2002), és Sambrook és munkatársai, „Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Kívánt esetben egy adott gazdaszervezetben történõ expresszió mértékét növelni lehet kodonoptimalizálással. A kodonoptimalizálás több, elõnyös kodon alkalmazását jelenti. Kodonoptimalizálásra szolgáló technikák különféle gazdaszervezetekben szakember által jól ismertek. ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidek tartalmazhatnak poszttranszlációs módosításokat, például N¹kapcsolt glikozilálást, O¹kapcsolt glikozilálást vagy acetilálást. A „polipeptid” vagy egy polipeptid „aminosav”-szekvenciája kifejezésen olyan polipeptidet értünk, amely egy vagy több olyan aminosavat tartalmaz, amely(ek) gazdasejttõl, például emlõs¹, rovarvagy élesztõgazdasejttõl származó, poszttranszlációs módosítással rendelkezik(nek). Poszttranszlációs módosításokat elõ lehet állítani kémiailag vagy alkalmas gazdaszervezet alkalmazásával. Például úgy tûnik, hogy S. cerevisiae-ben az utolsó elõtti aminosav természete határozza meg, hogy az N¹terminális metionin el lesz¹e távolítva. Továbbá úgy tûnik, hogy az utolsó elõtti aminosav természete azt is meghatározza, hogy az N¹terminális aminosav Na-acetilált lesz¹e [Huang és munkatársai, Biochemistry 26, 8242–8246 (1987)]. Egy másik példa szerint egy polipeptidet szekrécióra terveznek azzal, hogy szekréciós vezetõszekvencia (például szignálpeptid) van jelen, ahol a polipeptid N¹kapcsolt vagy O¹kapcsolt glikozilálással van módosítva [Kukuruzinska és munkatársai, Ann. Rev. Biochem. 56, 915–944 (1987)]. Expresszió élesztõben ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptideket elõnyösen élesztõben expresszálunk olyan kódoló nukleinsav alkalmazásával, amely élesztõben történõ expresszióra optimalizált kodonokat tartalmaz. Expressziót élesztõben ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidet kódoló rekombináns gén és élesztõben történõ expresszióra alkalmas szabályozórégiók alkalmazásával lehet végezni. Az alkalmazott expressziós rendszertõl függõen a termelõdött fehérje maradhat intracelluláris, vagy kiválasztódhat a sejten kívülre.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 11

2

Rekombináns gén expresszióját vezérlõ promoter elõnyösen indukálható promoter, például egy olyan promoter, amely az élesztõben elõforduló galaktózgénklaszterbõl származik (GAL-promoter, például GAL1, GAL7, GAL10, MEL1) vagy a savas foszfatáz PHO5-promotere vagy az alkohol-dehidrogenáz¹II ADH2-promotere vagy a rézszabályozott metallotionein CUP1-promotere. „Konstitutív” promoterek, amelyeket alkalmazni lehet, például GAP- (TDH)¹), PGKvagy TPI-promoterek [Romanos és munkatársai, Yeast 8, 423–488 (1992)]. Rekombináns expresszióra alkalmazott élesztõgazdasejtet szelektálni vagy géntechnológiailag tervezni lehet rekombináns gén expressziójára. Mutációk, például mnn9¹, prb1- és/vagy pep4-mutációk tipikusan kívánatosak. GAL-promoterekbõl kiinduló expresszió fokozása céljából GAL4 transzkripciós faktort lehet túltermeltetni [Hopper és munkatársai, 5,068,185 számú USA-beli szabadalmi leírás]. Egy adott gazdasejthez kodonoptimalizálás úgy történik, hogy az alig vagy mérsékelten használt kodonokat kicseréljük olyan kodonokra, amelyek expressziója nagymértékû. Egy kódolószekvenciában jelen lévõ, optimális kodonok százalékos aránya változó lehet. A találmány különbözõ elõnyös megvalósítási módjai szerint az optimális (eredetileg jelen lévõ és a bevitt) kodonok száma legalább 50%¹a, legalább 75%¹a vagy legalább 100%¹a az összes kodon számának. A kodonoptimalizálást a következõk szerint végezhetjük: (1) Egy adott kodon esetén összehasonlítjuk a vad típusú kodon gyakoriságát az élesztõgének által használt, általános kodongyakorisággal. (2) Ha a kodon nem olyan, ami élesztõben általánosan alkalmazott, helyettesítjük egy optimális kodonnal élesztõsejtekben nagymértékû expresszióhoz. (3) Megismételjük az (1) és (2) lépéseket különbözõ kodonokra, amíg elérjük a kívánt szintû kodonoptimalizálást. (4) Megvizsgáljuk az új kódolószekvenciát az így létrehozott nem kívánt szekvenciákra, amelyek például nem kívánt restrikciós enzimes hasítóhelyek, „spicing” hasítóhelyek, promoterek, nem kívánt palindrom vagy ismétlõdõ szekvenciák, transzkripciós terminátor szekvenciák és nagy gyakoriságú GC¹bázisok. Eltávolítjuk a nem kívánt szekvenciákat alternatív kodon alkalmazásával. Az alternatív kodonhasználatot Lathe, J. írta le [J. Molec. Biol. 183, 1–12 (1985)]. A kodonhasználat különbözõ élesztõ-gazdaszervezetekben szakember által jól ismert. Például Sharp és munkatársai [Yeast 7, 657–678 (1991)] leírtak egy szinonim kodonhasználatot Saccharomyces cerevisiae-ben. A 8C–8M. ábrákon bemutatunk élesztõre optimalizált nukleinsavszekvenciákat. A 8C. ábrán bemutatjuk a karboxil His-toldalék nélküli, 28. azonosító számú szekvenciát kódoló, élesztõre optimalizált (31. azonosító számú) nukleinsavszekvenciát. A 8D. ábrán bemutatjuk a 3. azonosító számú szekvenciát kódoló, élesztõre optimalizált (32. azonosító számú) nukleinsavszek-

1

HU 008 015 T2

venciát. A 8E. ábrán bemutatjuk az 1. azonosító számú szekvenciát kódoló, élesztõre optimalizált (33. azonosító számú) nukleinsavszekvenciát. A 8F–8M. ábrákon bemutatunk aminoterminálison metionint tartalmazó, 7. azonosító számú szekvenciát kódoló, élesztõre optimalizált (34–41. azonosító számú) nukleinsavszekvenciákat. A 8N–8U. ábrákon bemutatjuk a 17. vagy 20. azonosító számú szekvenciára alapozott, különbözõ ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidet kódoló, élesztõre optimalizált (46–53. azonosító számú) nukleinsavszekvenciákat. Expressziót élesztõben optimalizált szekvenciák és élesztõben történõ expresszióra nem optimalizált szekvenciákkal (például a 29. azonosító számú szekvencia 1–1935. vagy 124–1458. nukleotidjai, vagy a 30. azonosító számú szekvencia 1–1710. nukleotidjai) lehet elérni. Technikákat élesztõben történõ expresszióra optimalizált és nem optimalizált szekvenciák alkalmazásával a példákban lentebb szemléltetünk. Az ORF0657n egy felszíni fehérje, amely 36 aminosavból álló, C¹terminális sejtfalszortírozó szignált tartalmaz, egy konzervatív „LPXTG” motívummal [Schneedwind és munkatársai, EMBO 12, 4803–4811 (1993)]. Sejtfalszortírozó szignált tartalmazó fehérjék a sejtfalburokhoz kötõdnek transzpeptidációs mechanizmussal, amit szortáz, egy membránkötött fehérje katalizál [Mazmanian és munkatársai, Science 299, 906–909 (2001)]. A kötõdéshez a felszíni fehérjének N¹terminális szignálpeptidet is kell tartalmaznia a szekréciós folyamatsorba való exporthoz. A szekréciós folyamatsorban a szignálpeptid lehasad, és a sejtfalszortírozó szignál elõsegíti a szekréciós folyamatsorban a retenciót. A szortáz ezután az LPXTG-motívumban lévõ treonin és glicin között hasít, és amidkötés kialakulását katalizálja a treonin karboxilcsoportja és peptidoglikán-keresztkötések aminocsoportjai között. Azt találtuk, hogy az expresszió mértékét élesztõben jelentõsen megnöveli a sejtfalszortírozó szekvencia eltávolítása. A találmány különbözõ elõnyös megvalósítási módjai szerint a polipeptidet kódoló konstrukciók nem tartalmaznak funkcionális sejtfalszortírozó szignált kódoló szekvenciát, és elõnyösebben nem tartalmaznak funkcionális sejtfalszortírozó szignált és szignálpeptidet kódoló szekvenciát. Megfelelõ, elõnyös ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidek nem tartalmaznak funkcionális sejtfalszortírozó szekvenciát, vagy sejtfalszortírozó és szignálpeptid-szekvencia egyaránt nincs jelen a polipeptidben vagy a polipeptidet kódoló nukleinsavban. A találmány különbözõ elõnyös megvalósítási módjai szerint a fehérjeexpresszió mértéke legalább körülbelül 10¹szeresére, legalább körülbelül 15¹szeresére vagy legalább körülbelül 20¹szorosára növekszik, ha a sejtfalszortírozó szekvencia, vagy mind a sejtfalszortírozó, mind a szignálpeptid-szekvencia egyaránt eltávolításra került, legalább lényegileg teljes mértékben. A kódolókonstrukció elõnyösebben egy vagy több olyan kodont tartalmaz, amely élesztõben (például S. cerevisiae-ben) való expresszióra van optimalizálva. ORF0657n sejtfalszortírozó és szignálpeptid-szekvenciák közelítõ régióit például a 2. azonosító számú

2

szekvenciával lehet szemléltetni. Az 1–42. aminosavak tartalmazzák a szignálpeptid-szekvenciát. A 609–645. aminosavak tartalmazzák a sejtfalszortírozó szekvenciát. 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 12

Adjuvánsok Az adjuvánsok olyan anyagok, amelyek egy immunogént segíthetnek immunválasz kialakítására. Adjuvánsok különféle mechanizmusok útján képesek mûködni, amely lehet például egy vagy több a következõk közül: növelik az antigén biológiai vagy immunológiai féléletidejét; javítják az antigén eljuttatását az antigénbemutató sejtekhez; javítják az antigén processzálását és bemutatását az antigénbemutató sejtek által; és immunmodulátor citokinek termelõdését indukálják [Vogel, Clinical Infectious Diseases 30, (suppl. 3.) S266–270 (2000)]. Sokféle, különbözõ típusú adjuvánst lehet alkalmazni egy immunválasz elõállításának segítésére. Konkrét adjuvánsok például alumínium-hidroxid, alumínium-foszfát vagy más alumíniumsók, kalcium-foszfát, DNS¹CpG-motívumok, monofoszforil-lipid¹A, kolera-toxin, E. coliból származó hõlabilis toxin, pertussis toxin, muramil-dipeptid, Freund-féle inkomplett adjuváns, MF59, SAF, immunstimulátor komplexek, liposzómák, biológiailag lebontható mikrorészecskék, szaponinok, nemionos blokk-kopolimerek, muramil-peptid-analógok, polifoszfazén, szintetikus polinukleotidok, IFN¹g, IL–2, IL–12 és ISCOM¹ok [Vogel, Clinical Infectious Diseases 30 (suppl 3) S266–270 (2000); Kleim és munkatársai, Journal of Pharmaceutical Sciences 89, 311–321 (2000); Rimmelzwaan és munkatársai, Vaccine 19, 1180–1187 (2001); Kersten, Vaccine 21, 915–920 (2003); O’Hagen, Curr. Drug Target Infect. Disord. 1, 273–286 (2001)]. Páciensek védelmet eredményezõ immunitás kialakításához A „páciens” kifejezés olyan emlõsszervezetet jelent, amelyet S. aureus képes megfertõzni. Egy pácienst profilaktikusan vagy terápiásan lehet kezelni. Profilaktikus kezelés elegendõ mértékben biztosít védelmet eredményezõ immunitást S. aureus fertõzés valószínûségének vagy súlyosságának csökkentésére. Terápiás kezelést S. aureus fertõzés súlyosságának csökkentésére lehet alkalmazni. Profilaktikus kezelést a leírásban ismertetett immunogént tartalmazó vakcina alkalmazásával lehet végezni. Ilyen kezelést elõnyösen emberen végeznek. Vakcinákat be lehet adni az általános populációnak, vagy olyan személyeknek, akikre nézve fokozott S. aureus fertõzés kockázata. S. aureus fertõzés kockázatának fokozottan kitett személyek lehetnek egészségügyi dolgozók; kórházban lévõ páciensek; legyengült immunitással rendelkezõ páciensek; mûtéten átesett páciensek; testidegen implantátumot, például katétert vagy vaszkuláris eszközt kapott páciensek; legyengült immunitáshoz vezetõ terápia elõtt álló páciensek; égési vagy egyéb sérüléseket szenvedett páciensek; és olyan területen dolgo-

1

HU 008 015 T2

zó személyek, ahol fokozott a kockázata égésnek vagy sebesülésnek [„The Staphylococci in Human Disease”, Crossley and Archer (szerk.), Churchill Livingstone Inc. (1997)]. Nem humán páciensek, amelyek megfertõzõdhetnek S. aureusszal, szarvasmarhák, sertések, juhok, kecskék, nyulak, lovak, kutyák, macskák és egerek. Nem humán páciensek kezelése hasznos kedvtelésbõl tartott állatok és háziállatok védelmére és egy konkrét kezelés hatékonyságának elemzésére. Anamnesztikus válasz ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidekrõl azt találtuk, hogy gyors és hatékony immunválaszt idéznek elõ rhesusmajmokban egyetlen dózis után (lásd lentebb a 17. példában leírtakat). A megfigyelt válasz összhangban volt anamnesztikus válasszal. Anamnesztikus válasz kialakítása jelentõs elõnyökkel jár, például egyetlen dózis alkalmazása hatékony immunitást biztosít, és a hatékony immunitás rövid idõtartam alatt kialakul. A találmány különbözõ elõnyös megvalósítási módjai szerint az anamnesztikus válasz az elõzõleg fennálló titerek legalább 3¹szoros, legalább 5¹szörös vagy legalább 6¹szoros növekedését eredményezik; és a növekedés 3, 5, 7, 9, 14 vagy 21 nap alatt alakul ki. Hatékony immunválasz gyors kialakításának lehetõsége költségkímélõ megoldás a többdózisos vakcinációkkal szemben, és olyan páciensek vakcinációjára lehet alkalmazni, akikre nézve fokozott S. aureus fertõzés kockázata. S. aureus fertõzés kockázatának fokozottan kitett személyek lehetnek egészségügyi dolgozók; kórházban lévõ páciensek; legyengült immunitással rendelkezõ páciensek; mûtéten átesett páciensek; testidegen implantátumot, például katétert vagy vaszkuláris eszközt kapott páciensek; legyengült immunitáshoz vezetõ terápia elõtt álló páciensek; égési vagy egyéb sérüléseket szenvedett páciensek; és olyan területen dolgozó személyek, ahol fokozott a kockázata égésnek vagy sebesülésnek [„The Staphylococci in Human Disease”, Crossley and Archer (szerk.), Churchill Livingstone Inc. (1997)]. A találmány különbözõ elõnyös megvalósítási módjai szerint egy pácienst azonnal, vagy 3, 5, 7, 9, 14 vagy 21 napos orvosi procedúrával oltunk. Kombinációs vakcinák ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptideket védelmet eredményezõ immunitás kialakítására lehet alkalmazni egymagukban, vagy kombinációban más immunogénekkel, immunválasz elõidézése céljából. További immunogének, amelyek jelen lehetnek: egy vagy további S. aureusból származó immunogén, például azok, amelyekre hivatkozunk fentebb, „A találmány mûszaki háttere” címû részben; vagy egy vagy több olyan immunogén, amely egy vagy több más Staphylococcus organizmust, például S. epidermidist, S. haemolyticust, S. warnerit vagy S. lugunensist céloz meg; és egy vagy több olyan immunogén, amely más fertõzõ organizmust céloz meg.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

2

Modellrendszerek állatban Állatban kialakított modellrendszert alkalmaztunk S. aureus ellen, védelmet eredményezõ immunválaszt elõidézni képes polipeptid hatékonyságának elemzésére. Két akadály merül fel a védelem állatban kialakított modelljében: (1) nagyon magas fertõzõ dózis szükséges, hogy legyõzzük a veleszületett immunitást, és (2) az elhalálozás sebessége túl gyors ahhoz, hogy kimutassunk védettséget. Konkrétan, egerek 24 órával a bakteriális fertõzés után elpusztultak, ami nem biztosít elegendõ idõt a specifikus immunválasznak a fertõzés leküzdésére. Ha alacsonyabb dózist adunk be, a kontroll- és az immunizált egerek egyaránt túlélik a fertõzést. Ezeket az akadályokat lassú kinetikájú letális modell alkalmazásával próbáltuk megoldani, amelyben S. aureust stacionáriusan növekvõ sejtekbõl preparáltunk, megfelelõen megtitráltunk és intravénásan adtunk be. A pusztulás lassú kinetikája elegendõ idõt biztosított a specifikus immunológiai védelem számára, hogy legyõzze a bakteriális fertõzést (például 10 nap alatt, 24 óra helyett). Stacionárius növekedési fázisban lévõ S. aureus sejteket szilárd táptalajon növesztett sejtekbõl nyertünk ki. Folyékony tápközegbõl is ki lehet ezeket nyerni, azonban a szilárd táptalajon növesztett sejtekkel kapott eredmények reprodukálhatóbbak. Sejteket kényelmesen lehet növeszteni szilárd táptalajon. S. aureust például körülbelül 18–24 óra hosszáig lehet növeszteni olyan körülmények között, ahol a megduplázódási idõ körülbelül 20–30 perc. Staphylococcust szilárd vagy folyékony tápközegbõl lehet izolálni standard technikák alkalmazásával, a Staphylococcus potenciál fenntartása céljából. Izolált Staphylococcust például –70 °C¹on lehet tárolni, mosott, nagy sûrûségû szuszpenzióként (>109 kolóniaformáló egység, CFU/ml) glicerintartalmú, nátrium-kloridot tartalmazó foszfátpufferben. A Staphylococcus fertõzésnek olyan hatékonysággal kell rendelkeznie, hogy állatmodellben körülbelül 80–90%¹os pusztulást okozzon körülbelül 7–10 napos idõtartamon át, az elsõ vagy a második napon kezdve. Titrálási kísérleteket lehet végezni állatmodell alkalmazásával a Staphylococcus oltóanyag potenciájának követésére. A titrálási kísérleteket körülbelül 1¹2 hétig lehet végezni az oltási kísérlet elõtt. Titrálási kísérletekhez a kezdeti potenciál elõzõ kísérletekre alapulhat. Azt találtuk, hogy Becker állatmodelltörzsre alkalmas S. aureus fertõzés általában 5×108 és 8×108 CFU/ml között van.

Beadás Immunogéneket a leírásban ismertetett útmutatás és szakember által jól ismert technikák alkalmazásá55 val lehet kiszerelni és egy páciensnek beadni. Gyógyszerek beadására szolgáló útmutatást általánosságban leírtak Plotkin és Orenstein (szerk.), „Vaccines”, W. B. Sanders Company (1999); „Reminton’s Pharmaceutical Sciences”, 20. kiadás, szerk. Gennaro, Mack 60 Publishing (2000); és „Modern Pharmaceutics”, 2. ki13

1

HU 008 015 T2

adás, szerk. Banker és Rhodes, Marcel Dekker, Inc. (1990). Gyógyászatilag elfogadható hordozók elõsegítik egy immunogén tárolását és páciensnek történõ beadását. Gyógyászatilag elfogadható hordozók különbözõ komponenseket tartalmazhatnak, például puffert, steril vizet injekcióra, normál sóoldatot vagy foszfátpufferolt sóoldatot, cukrot, hisztidint, sókat és poliszorbátot. Immunogéneket különbözõ módszerekkel lehet beadni, például szubkután, intramuszkulárisan vagy mukozálisan. Szubkután és intramuszkuláris beadást lehet végezni például injekciós tûk vagy jetinjektorok alkalmazásával. Alkalmas dózisbeadási rendeket elõnyösen szakember által jól ismert faktorok figyelembevételével lehet meghatározni, ilyen például a páciens kora, tömege, neme és egészségi állapota; a beadás módja; a kívánt hatás; és a konkrétan alkalmazott vegyület. Az immunogént több dózist tartalmazó vakcinaformákban lehet alkalmazni. Várható, hogy egy dózist alkotó összes polipeptid mennyisége 1,0 mg és 1,0 mg közötti tartományban van. A találmány különbözõ elõnyös megvalósítási módjai szerint a tartomány 0,01 mg és 1,0 mg közötti, és 0,1 mg és 1,0 mg közötti. A dózisok idõzítése szakember által jól ismert faktoroktól függ. A kezdõ beadás után, ha egy adott egyén erre rászorul, ezt követõen egy vagy több ismétlõ dózist lehet adni az ellenanyagtiterek fenntartása vagy növelése céljából. A dózisadagolási rend lehet például 1 nap, 1 hónap, a harmadik dózis 4, 6 vagy 12 hónap, és további ismétlõ dózisok kellõ idõ elteltével, szükséges esetben. Ellenanyagok elõállítása Védelmet eredményezõ immunitást indukálni képes, ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidet lehet alkalmazni olyan ellenanyagok és ellenanyagfragmensek elõállítására, amelyek a polipeptidhez vagy S. aureushoz képesek kötõdni. Ilyen ellenanyagokat és ellenanyagfragmenseket különféleképpen lehet alkalmazni, például polipeptid tisztítására, S. aureus azonosítására, vagy S. aureus fertõzése elleni terápiás vagy profilaktikus kezelésre. Az ellenanyagok lehetnek poliklonálisak vagy monoklonálisak. Ellenanyagok elõállítására és alkalmazására szolgáló technikák szakember által jól ismertek. Ilyen technikákat leírt például Ausubel, „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley (1987–1998); Harlow és munkatársai, „Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory” (1988); és Kohler és munkatársai, Nature 256, 495–497 (1975). Példák A következõkben bemutatott példák tovább szemléltetik a találmány szerinti megoldás különbözõ jellemzõit. A példák hasznos módszereket is szemléltetnek a találmány gyakorlati kivitelezésére. Ezekkel a példákkal nem kívánjuk korlátozni a találmány által igényelt oltalmi kört.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 14

2

1. példa: ORF0657n-régió alkalmazása védelmet eredményezõ immunitás biztosítására A példában leírtak azt szemléltetik, hogy teljes hosszúságú ORF0657n-régió védelmet eredményezõ immunitást képes biztosítani. ORF0657n klónozása és expresszálása PCR láncindító oligonukleotidokat terveztünk ORF0657n¹t kódoló gén amplifikálására, az elsõ aszparagintól kezdve és a stopkodon elõtt befejezve a terminális aszparaginnál. Ezek a PCR láncindító oligonukleotidok hozzáadott NcoI- (elõremenõ láncindító oligonukleotid) és XhoI- (reverz láncindító oligonukleotid) hasítóhelyeket tartalmaznak, az expressziós vektorba való klónozás elõsegítése céljából. A kódolt fehérjét úgy terveztük, hogy a pET28-vektorból expresszálódjon terminális His-aminosavval, és a stopkodont a vektor kódolja. Továbbá hozzáadtunk egy glicint a fehérjéhez, a metionin iniciátor után. Az eredményül kapott, amplifikált DNS-szekvencia karboxil His-toldalékkal ellátott ORF0657n¹t (28. azonosító számú szekvencia) kódolt. A PCR-rel amplifikált szekvenciát a pET28-vektorba (Novagen) ligáltuk, olyan NcoI/XhoI hasítóhelyek felhasználásával, amelyeket beterveztünk a PCR láncindító oligonukleotidokba, és hõsokkal bevittük E. coli DH5a¹ba (Invitrogen). A transzformációs keveréket egy éjszakán át növesztettük Luria-Bertani (LB)-agartálcákon, 100 mg/ml kanamicinnel, 37 °C¹on. Kolóniákat szelektáltunk, 30 mg/ml kanamicint tartalmazó LB¹ben növesztettük, DNS-mikropreparátumokat (Promega) készítettünk, és az inszert integritását restrikciós emésztéssel és PCR-rel határoztuk meg. Négy, helyes inszertméretû minipreparátumot szekvenáltunk M13F (65. azonosító számú szekvencia), M13R (66. azonosító számú szekvencia), ORF0657nF (67. azonosító számú szekvencia) és ORF0657nR (68. azonosító számú szekvencia) láncindító oligonukleotidok alkalmazásával. Egy klónt szelektáltunk, amely nem tartalmazott DNS-változásokat a kívánt szekvenciában. E. coli HMS174 (DE3) sejteket (Novagen) transzformáltunk, és 30 mg/ml kanamicint tartalmazó LB¹tálcákon növesztettük; 3 kolóniát (UnkC-1, UnkC¹2 és UnkC¹3) választottunk ki az expresszió tesztelésére. Folyékony LB¹ (kanamicinnel) tenyészeteket inkubáltunk 37 °C¹on, 250 rpm¹en, amíg az A600-érték 0,6 és 1,0 közötti lett, azután IPTG hozzáadásával indukáltuk 1 mM végkoncentrációban, azután további 3 óra hosszáig inkubáltuk. A tenyészetekbõl a sejteket centrifugálással különítettük el 5000×g¹n, 5 percig, 4 °C¹on. A sejteket 500 ml lízispufferben (Bug Buster, proteázinhibitorokkal, Novagen) felszuszpendáltuk. Hozzáadtunk egyezõ térfogatú mintafelviteli puffert (b-merkapto-etanollal kiegészítve 5% végtérfogatig), azután 70 °C¹on hevítettük a mintákat 5 percig. Az extraktumokat Novex 4–20%¹os Tris-glicin-géleken megfuttattuk, és a fehérjéket elõhívtuk (Coomassie Blue festés), és nitro-cellulózra blottoltuk, és próbaként anti-HIS6-ellenanyagokat (Zymed) alkalmaztunk.

1

HU 008 015 T2

ORF0657n tisztítása A fentebb említett, kis méretben végzett eljárás közvetlen méretnövelését kevertetett tankfermentorban (75 literes méretben), 50 literes munkatérfogatban végeztük. Inokulumot 50 ml Luria-Bertani (LB)-tápközeget (plusz kanamicint) tartalmazó, 250 ml¹es lombikokban tenyésztettünk, és 1 ml fagyasztott oltóanyagtenyészettel oltottuk be, és 3 óra hosszáig tenyésztettük. Ebbõl az oltóanyagból 1 ml¹t használtunk 500 ml LB¹tápközeget (plusz kanamicint) tartalmazó, 2 literes lombikba, és 16 óra hosszáig inkubáltuk. A tenyésztést nagyméretû fermentorban (75 literes méretben), 50 liter LB¹tápközegben (plusz kanamicin) végeztük. A fermentor fermentációs paraméterei a következõk voltak: nyomás=5 psi, kevertetési sebesség=300 rpm, levegõ áramlási sebessége=15 liter/perc és hõmérséklet=37 °C. A sejteket a 600 nm¹en mért, 0,8 optikai denzitás egységig (OD) inkubáltuk, és izopropil-b-K-tiogalaktoziddal (IPTG) indukáltuk 1 mM koncentrációban. Az indukció ideje IPTG-vel három óra volt. A sejteket úgy különítettük el, hogy a hõmérsékletet 15 °C¹ra csökkentettük, átvittük 500 KMWCO üreges szálas („hollow fiber”) kazettán töményítés céljából, és 9000×g¹n centrifugáltuk 4 °C¹on, 20 percig. A felülúszókat dekantáltuk, és a rekombináns E. coli nedves sejtüledéket –70 °C¹ra fagyasztottuk. Rekombináns E. coli-sejteket (19,2 g nedves sejttömeg) felszuszpendáltunk lízispufferben (50 mM TrisHCl, pH=8,0, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM imidazol, 0,1% Tween™¹80 és 6 M guanidin-HCl), 8 ml/gramm nedves sejttömeg koncentrációban. A szuszpenzióhoz hozzáadtunk proteázinhibitor-koktélt, amely poli-(Hisztidin)-toldalékkal ellátott fehérjékhez használatos (Sigma, P8849), 0,05 ml/gramm sejtpaszta koncentrációban. Továbbá hozzáadtunk lizozimot 1 mg/ml¹ig és Benzonase™¹t (EM ind.) 1 ml/ml¹ig. A sejtlízist úgy végeztük, hogy a szuszpenziót átnyomtuk mikrofluidizálón 14 000 PSI nyomáson (Microfluidics Model 110S), négyszer, 4 °C¹on. A sejttörmeléket 11 000×g¹n ülepítettük, 30 percig, 4 °C¹on, és a felülúszót megtartottuk. His-toldalékot tartalmazó fehérjéket tisztítottunk a felülúszóból. A felülúszót összekevertük 20 ml Ni+¹NTA-agarózzal (Qiagen), 4 °C¹on, enyhe forgatással, 2 óra hosszáig. A keveréket egy nyitott oszlopba öntöttük (1,5 cm×20 cm), és a nem kötõdött frakciót egybegyûjtöttük. Az oszlopot mosópufferrel mostuk (20 mM Tris-HCl, pH=8,0, 0,15 M NaCl, 0,1% Tween™¹80). His-toldalékkal ellátott ORF0657n¹t 300 mM imidazol, 20 mM Tris-HCl, pH=7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Tween™¹80 lépcsõs gradiensével eluáltuk. His-toldalékkal ellátott ORF0657n¹t (28. azonosító számú szekvencia) tartalmazó frakciókat Coomassiefestett SDS-PAGE-val detektáltunk és egyesítettünk. Az egyesített frakciókat 0,2 mikronos szûrõn szûrtük a részecskés anyag eltávolítása céljából, és méretkizáráson alapuló oszlopra (Sephacryl S¹300 26/60 oszlop, Amersham Biosciences) vittük, és 1 ml/perc áramlási sebességgel eluáltuk 150 mM NaCl¹ot tartalmazó, 10 mM MOPS-pufferrel (pH=7,1). A His-toldalékkal el-

5

2

látott ORF0667n¹t tartalmazó frakciókat Coomassiefestett SDS-PAGE-val detektáltuk és Western-blottoltuk (anti-tetra His Mab, Qiagen). Endotoxint szûréssel távolítottuk el Zeta-Phis™ Biofilter (CUNO) alkalmazásával. A fehérjekoncentrációt BCA-val (Pierce) határoztuk meg. A tisztaságot a Coomassie-val festett gélek denzitometriájával határoztuk meg.

2. példa: S. aureus fertõzés elõkészítése S. aureust „Tryptic Soy Agar” (TSA, Becton Dickinson, Sparks, MD) táptalajon, tálcákon növesztettünk 37 °C¹on, egy éjszakán át. A baktériumokat lemostuk a TSA-tálcákról 5 ml PBS hozzáadásával, és finoman felszuszpendáltuk a baktériumokat egy steril oltókaccsal. 15 A baktériumszuszpenziót 6000 rpm¹en, 20 percig centrifugáltuk, Sorvall RC¹5B-centrifugában (DuPont Instruments). Az üledéket felszuszpendáltuk 16%¹os glicerinben, és aliquotokat –70 °C¹on tároltunk. Felhasználás elõtt az oltóanyagot felolvasztottuk, 20 megfelelõen hígítottuk és fertõzésre alkalmaztuk. Az egyes készleteket legalább 3¹szor titráltuk, hogy meghatározzuk azt a dózist, amely alkalmas naiv egerek lassú kinetikával történõ elpusztításához. A bakteriális oltóanyagot (amely az egerek 90%¹át képes elpusztíta25 ni) folyamatosan figyeltük, hogy megbizonyosodjunk a modell reprodukálhatóságáról. Az egyes fertõzési kísérletek elõtt 10 nappal 10 kontrollállatból álló csoportot (csak adjuvánssal immunizáltuk) fertõztünk, és követtük azokat. 30 3. példa: Védettség vizsgálata His-toldalékkal ellátott ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidek alkalmazásával Huszonöt BALB/c¹egeret immunizáltunk három dó35 zis His-toldalékkal ellátott ORF0657n-nel (28. azonosító számú szekvencia), dózisonként 20 mg-mal, alumínium-hidroxi-foszfát- (450 mg dózisonként) adjuvánson. Az alumínium-hidroxi-foszfátot (AHP¹t) Klein és munkatársai írták le [Journal of Pharmaceutical Sciences 40 89, 311–321 (2000)]. A dózisokat két 50 ml¹es intramuszkuláris injekcióként adtuk be a 0., 7. és 21. napon. Az egereket a 28. napon elvéreztettük, és szérumukat ELISA-val szkríneltük, His-toldalékos ORF0657n¹re adott reaktivitásukra. A kísérlet 35. napján az egereket növesztett S. au45 reus intravénás injekciójával fertõztük olyan dózisban (7,3×108 CFU/ml), ami titrálási kísérletekkel meghatározva körülbelül 2–7 napos idõtartam alatt pusztulásukat okozta. Ebben a lassú pusztulási kinetikájú letális 50 modellben a túlélést elemeztük kontrollegércsoporthoz, amelyeket csak álimmunizáltuk AHP-vel. Az egerek túlélését 14 napos idõtartamig követtük (3A. ábra). A kísérlet végén 11 egér életben maradt az ORF0657n-nel immunizált csoportban, ahhoz viszonyítva, hogy három 55 állat maradt életben az AHP kontrollcsoportban. A 3B. és 3C. ábrán szemléltetjük a védettség kialakítását az ORF0657nH- és ORF0657nl-régióknak megfelelõ polipeptidek alkalmazásával. A 3B. ábrán szemléltetjük a karboxiterminálisnál His-toldalékot tartalma60 zó, 4. azonosító számú szekvenciával kialakított vé10

15

1

HU 008 015 T2

dettséget. A 3C. ábrán szemléltetjük a karboxiterminálisnál His-toldalékot tartalmazó, 5. azonosító számú szekvenciával kialakított védettséget. 4. példa: ORF0657n-szekvenciák létrehozása Azt a következtetést vonták le, hogy ORF0657n szerepet játszik S. aureus vasfelvételében [Andrade és munkatársai, Genome Biology 3, 47.1–47.5 (2003)]. ORF0657n-szekvenciákat, amelyek közül néhány különbözõ forrásokból származik, különbözõ szakirodalmakban különféleképpen jelölték [lásd például Etz és munkatársai, PNAS USA 99, 6573–6578 (2002) (LPXTGVI); Baba és munkatársai, The Lancet 359, 1819–1827 (2002) (MW1011); Kuroda és munkatársai, The Lancet 357, 1225–1240 (2001) (SA0976); Andrade és munkatársai, Genome Biology 3, 47.1–47.5 (2003) (S_aur2); Mazmanian és munkatársai, Science 299, 906–909 (2003) (isdB); Mazmanian és munkatársai, Molecular Microbiology 40, 1049–1057 (2001) (sasJ); és Taylor és munkatársai, Mol. Microbiol. 43, 1603–1614 (2002) (sirH)]. Úgy tûnik, hogy az ORF0657n fehérjeszekvenciának megfelelõ polipeptidszekvenciát különbözõ szabadalmi közleményekben leírták [Meinke és munkatársai, WO 02/059148 számú nemzetközi közzétételi irat, közzétéve 2001. augusztus 1.; Wang és munkatársai, WO 02/077183 számú nemzetközi közzétételi irat, közzétéve 2002. október 3.; Masignani és munkatársai, WO 02/094868 számú nemzetközi közzétételi irat, közzétéve 2002. november 28.; Foster és munkatársai, WO 02/102829 számú nemzetközi közzétételi irat, közzétéve 2002. december 27.; és Foster és munkatársai, WO 03/011899 számú nemzetközi közzétételi irat, közzétéve 2003. február 13.]. Genomi DNS¹t különbözõ S. aureus izolátumokból nyertünk ki. Klinikai izolátumokat adtunk 3 ml „Difco Tryptic Soy Broth” (Becton Dickinson, Sparks, MD), és egy éjszakán át inkubáltuk 37 °C¹on és 150 rpm¹en. Egyéjszakás tenyészeteket lecentrifugáltunk 1,5 ml¹es Eppendorf-csövekben, 14 000 rpm¹en, 5 percig. A te-

5

10

15

20

25

30

2

nyészet felülúszóját dekantáltuk, és az üledékeket felszuszpendáltuk 500 ml reszuszpenziós pufferben (25% szacharóz, 10 mM Tris, pH=7,5). 2 mg/ml¹es lizosztafinoldatból (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 5 ml¹es aliquotokat adtunk minden felszuszpendált üledékhez. A szuszpenziókat azután 37 °C¹on inkubáltuk 1 óra hosszáig. Az inkubációs idõ végén 250 ml, 2%¹os SDS¹t adtunk az egyes csövekbe, és vortexen addig kevertettük, amíg a viszkozitása észrevehetõen csökkent. Hozzáadtunk 250 ml fenol-kloroform-izoamil-oldatot (25:24:1 térfogatarányban) (Gibco/Invitrogen Corporation, Grand Island, NY). A keveréket vortexen kevertettük 30 másodpercig, és 5 percig centrifugáltuk 14 000 rpm¹en. A felsõ vizes fázist eltávolítottuk, és a kicsapási lépéseket addig ismételtük, amíg bármilyen kevés határréteg maradt. Az egyes csövekhez hozzáadtunk 0,1 térfogat, 3 M nátrium-acetátot (pH=4,8), és összekevertük. Azután hozzáadtunk egy térfogat izopropanolt, és újra összekevertük. A csöveket 5 percig inkubálni hagytuk szobahõmérsékleten, és azután 14 000 rpm¹en centrifugáltuk 15 percig. A felülúszót dekantáltuk, és a csöveket száradni hagytuk tetejükkel lefelé egy törlõruhán. Az üledéket újra felszuszpendáltuk 50 ml steril vízben. Az izolált DNS¹t templátként alkalmaztuk PCR-ben. A gént elõremenõ (ORF0657nF, 67. azonosító számú szekvencia) és reverz (ORF0657nR, 68. azonosító számú szekvencia) láncindító oligonukleotidok alkalmazásával amplifikáltuk. A PCR-termékeket standard „Big Dye” eljárások szerint szekvenáltuk.

5. példa: Különbözõ S. aureus izolátumokból származó ORF0657n¹ek összehasonlítása Az ORF0657n¹t meglehetõsen konzervatívnak ta35 láltuk patológiailag és taxonómiailag sokféle S. aureus klinikai izolátumok készletében. A 3. táblázatban bemutatjuk a százalékos azonosság összefoglalását a különbözõ izolátumokban, beleértve klinikai izolátumo40 kat is.

3. táblázat Törzs

MLST

Forrás

Ország

CP

ORF0657n %ID

CL-1

1

hipervirulens, közösségi vérizolátum

UK

MSSA

8

99

MW2

1

hipervirulens, közösségi vérizolátum

USA

MSSA

8

99

CL-2

1

seb bal alsókaron

USA

MSSA

8

99

CL-3

1

seb karon

USA

MSSA

8

99

CL-4

5

bal láb

USA

MRSA

5

99

CL-5

5

seb

USA

MRSA

5

100

Mu 50

5

genny, operációs seb fertõzése

Japán

VISA

5

100

N315

5

garatkenet

Japán

MRSA

5

100

16

1

HU 008 015 T2

2

3. táblázat (folytatás) Törzs

MLST

Forrás

Ország

CP

ORF0657n %ID

CL-6

5

CDC3

USA

MRSA/VISA

5

97

CL-7

8

vér

Németo.

MRSA

5

98

25

8

MSSA lab. törzs

USA

MSSA

5

99

CL-8

8

seb jobb lábszáron

USA

MRSA

5

99

CL-90

9

orrlyuk

UK

MSSA

5

97

CL-10

9

vér

UK

MSSA

5

97

CL-11

12

vér

Hollandia

MSSA

8

97

CL-12

12

orrlyuk

UK

MSSA

8

97

CL-13

15

bõr bal ujjon

USA

MSSA

8

99

CL-14

15

genny bal anaresle

USA

MSSA

8

99

CL-15

15

vér

UK

MSSA

8

99

CL-16

22

vér

Kanada

MSSA

5

99

CL-17

22

Barnin MRSA

Németo.

MRSA

5

98

CL-18

25

vér

Kanada

MRSA

5

97

CL-19

25

vér

UK

MSSA

5

97

CL-20

25

orrlyuk

UK

MSSA

5

97

CL-21

30

forrás nem ismert mecIV

Svédo.

MRSA

8

94

CL-22

30

forrás nem ismert mecIV

Németo.

MRSA

8

94

CL-23

36

epidémiás MRSA vér

UK

MRSA

8

94

CL-24

45

genny bal lábszárcsonk

USA

MRSA

8

95

CL-25

45

orrlyuk

USA

MRSA

8

95

Becker

45

prototípus kapszula 8. törzs

USA

MSSA

8

95

COL

88

MRSA lab. törzs

USA

MRSA

5

100

CL-26

97

vér

Hollandia

MSSA

5

98

CL-27

97

vér

Kanada

MSSA

5

99

CL-28

97

orrlyuk

UK

MSSA

5

99

CL-29

121

orrlyuk, közösségben terjedõ betegség

UK

MSSA

8

96

CL-30

121

vér

UK

MSSA

8

96

NCZC83

CP: kapszulatípus; MLSDT: multilokusz szekvenciatipizáló taxonómiás csoportosítás; MRSA: meticillinrezisztens S. aureus; MSSA: meticillinszenzitív S. aureus; „CL”: klinikai izolátum; „ID”: azonosság; „VISA”: vankomicin intermedier S. aureus

A százalékos azonosságot (%ID) úgy határoztuk meg, hogy a polipeptidszekvenciát a 2. azonosító szá- 55 mú szekvencia alá rendeztük, és meghatároztuk az azonos aminosavak számát. A számot elosztottuk a (2. azonosító számú szekvenciában lévõ) összes aminosav számával, és azután elosztottuk 100-zal, és a leg60 közelebbi egész számra kerekítettük. 17

6. példa: Védettség különbözõ S. aureus klinikai izolátumokkal szemben Az ORF0657n immunogénként vett hatékonyságát különbözõ S. aureus klinikai izolátumokkal szemben úgy határoztuk meg, hogy immunogénként His-toldalékkal ellátott ORF0657n¹t (28. azonosító számú szekvencia) alkalmaztunk. A 3. táblázatban bemutatott, ta-

1

HU 008 015 T2

xonómiailag különféle izolátumok alkészletét alkalmaztuk fertõzõ oltóanyagként. Az ORF0657n-szekvenciák ezekben a különféle izolátumokban eltértek a vakcinában alkalmazott ORF0657n-szekvenciától. A beszerzett, fertõzõ törzseket a 2. példában leírt technikák alkalmazásával készítettük elõ. Egereket a 3. példában leírtak szerint immunizáltunk és fertõztünk, és 10 napig követtük azokat. A modellekben rutinszerûen alkalmazott, fertõzõ oltóanyagok messze meghaladták azokat, amelyek tipikusan elõfordulnak emberi fertõzésekben. Kimutattunk védettséget meticillinérzékeny és meticillinrezisztens törzsekkel szemben. Az eredményeket bemutatjuk a 4A–4H. ábrákon.

5

10

15 7. példa: A 28. azonosító számú szekvencia kodonoptimalizálása élesztõexpresszióra A 28. azonosító számú szekvencia 1–646. aminosavait kódoló nukleinsavszekvenciát kodonoptimalizáltuk élesztõben történõ expresszióra. A 28. azonosító számú szekvencia 1–646. aminosavait kódoló, kodonoptimalizált szekvenciát bemutatjuk a 8C. ábrán (31. azonosító számú szekvencia). A karboxil His-toldalék nélküli, 29. azonosító számú szekvenciát kódoló régiót alkalmaztuk kiindulási konstrukcióként optimalizáláshoz. A kódolószekvenciában az általános kodonhasználat az optimalizálás elõtt a következõ volt: a kodonok 28%¹a (179) nagyon ritka volt, vagy soha nem fordult elõ nagymértékben expresszáló élesztõgénben, és 20%¹a (126) mérsékelten ritka volt. A 28. azonosító számú szekvencia 1–646. aminosavait kódoló nukleinsav kodonoptimalizálását úgy végeztük, hogy kismértékû vagy mérsékelt expresszióval rendelkezõ kodonokat kicserélünk olyan kodonokra, amelyekkel az expresszió nagymértékû. Továbbá egy glicinkodont viszünk a második helyzetbe. A kodonoptimalizálást MacDNAsis Pro V3.0 szoftver alkalmazásával végeztük. Fehérjék visszafordítására („back”transzlációra) alkalmazott paramétertábla nagymértékben expresszáló S. cerevisiae kodonokat mutat. MacDNAsis Pro szoftverben alkalmazott funkció „Translate>[Protein®DNA]”. A kimenet „Amino Acid Conversion”. Néhány esetben egynél több nagymértékben expresszáló kodon létezik egy adott aminosavra. Például szerint „TCT” vagy „TCC” is kódolhat. Ezekben az esetekben a két különbözõ kodont körülbelül azonos elõfordulási számban alkalmazzuk. A 4. táblázatban bemutatott kodontáblázatban nagymértékben expresszáló S. cerevisiae kodonok szerepelnek.

20

25

30

35

40

45

50

4. táblázat Aminosav

Optimális kodon(ok)

Phe

TTC

Leu

TTG

Ile

ATT, ATC

55

60 18

2

Aminosav

Optimális kodon(ok)

Met

ATG

Val

GTT, GTC

Ser

TCT, TCC

Pro

CCA

Thr

ACT, ACC

Ala

GCT

Tyr

TAC

His

CAC

Gln

CAA

Asn

AAC

Lys

AAG

Asp

GAC

Glu

GAA

Cys

TGT

Trp

TGG

Arg

AGA

Gly

GGT

Minden olyan kodont, amely nem volt optimális, megváltoztattunk olyan kodonra, amit nagymértékben expresszáló élesztõgénekben találtunk, kivéve a két alaninkodont, amelyeket olyan kodonokra változtattunk, amiket a 31. azonosító számú szekvencia mérsékelten expresszáló génjeiben találtunk (GCG-vel kezdve az 505. és 1546. nukleotidnál). ORF0657n¹t kódoló, átfogó szekvenciát állítottunk elõ olyan 25 oligomer (69–93. azonosító számú szekvenciák) összehibridizálásával és lánchosszabbításával, amelyeket a végsõ, kívánt szekvencia kódolására terveztünk. Az oligomerek 85–110 bp hosszúságúak voltak. Az oligomerek alternáló, ORF0657n¹t kódoló szekvenciák voltak. Az egyes oligomerek 25–29 bp méretû, komplementer átfedéssel rendelkeztek a szomszédos oligomerrel, és a duplex Tm¹je 80–84 °C volt. Ezt manuálisan számítottuk úgy, hogy egy GC¹bázispár 4 °C volt, egy AT¹bázispár 2 °C volt. Hét külön lánchosszabbító reakciót végeztünk három vagy négy szomszédos átfedõ oligomer, és szensz és antiszensz PCR láncindító oligonukleotidok (23–26 nt hosszúságúak) alkalmazásával, a duplex Tm¹je 70–72 °C volt. Natív Pfu-DNS-polimerázt (STRATAGENE, La Jolla, CA) alkalmaztunk a PCRreakciókba, „touch down” stratégiában a következõk szerint: 95 °C, 90 másodpercig, 1 ciklus; 95 °C, 30 másodpercig, 55 °C, 30 másodpercig, 68 °C, 3 percig, 5 ciklus; közvetlenül ezt követõen egy második reakciósorozat: 95 °C, 30 másodpercig, 52 °C, 30 másodpercig, 68 °C 3 percig, 20 ciklus. A reakciót 68 °C¹on, 7 perces inkubálással fejeztük be. A PCR-reakciók eredményeként elõállítottuk a gén hét kolineáris (egy vonalba esõ) fragmensét (a leírásban az egyszerûség kedvéért jelölésük: 1, 2, 3, 4, 5, 6 és 7). A fragmenseket agaróz-gélelektroforézissel izoláltuk, és az alkalmas méretû termékeket kivágtuk és tisz-

1

HU 008 015 T2

títottuk GENE CLEAN® II módszer (QBIOgene, Carlsbad, CA) alkalmazásával, a gyártó által adott útmutatás szerint. Az 1., 2. és 3. kolineáris fragmenseket, a 4. és 5. kolineáris fragmenseket és a 6. és 7. kolineáris fragmenseket kombináltuk ezt követõ PCR-reakcióban, alkalmas láncindító oligonukleotidokkal, az A¹, B¹ és C¹fragmensek elõállítása céljából, sorrendben. Azután összeállítottuk az ORF0657n teljes gént egy további PCR-reakcióban, amelyben az A¹, B¹ és C¹fragmenseket kombináltuk, disztális szensz és antiszensz láncindító oligonukleotidokkal. A végsõ PCR-terméket gélben izoláltuk, és pCR®-Blunt II¹TOPO®¹ba (INVITROGEN, Carlsbad, CA) klónoztuk, a gyártó által adott útmutatás szerint. Néhány független klón DNS-szekvenciáját kinyertük, és hibákat azonosítottunk. A hibákat kijavítottuk három független klón, pUC3, pUC4 és pUC6 különbözõ szegmensein, egymás után QUIK-CHANGE helyspecifikus mutagenezis készlet („Site-directed Mutagenesis Kit”) alkalmazásával, vagy egyidejûleg QUIK-CHANGE „Site-directed Mutagenesis Kit” alkalmazásával (STRATAGENE, La Jolla, CA) a gyártó által adott útmutatás szerint. A végsõ javított szekvenciához úgy jutottunk, hogy felcseréltük a három klónból származó, javított restrikciós fragmenseket. A pUC4-klón, javított 1,1 kb méretû XmnI-fragmensét kicseréltük a pUC3 megfelelõ XmnI-fragmensére, így elõállítottuk a pUnkC13¹at. A pUC6 javított 456 bp méretû AccI-fragmensét kicseréltük a pUnk13 megfelelõ fragmensére, így jutottunk a pUnkCR1-hez, és a DNS-szekvenciát igazoltuk. 8. példa: Saccharomyces cerevisiae törzsek elõállítása rekombináns génexpresszióra Ebben a példában olyan technikákat szemléltetünk, amelyeket Saccharomyces cerevisiae törzsek elõállítására lehet alkalmazni rekombináns génexpresszió céljából. Az 1260. és 1309. jelû törzsek elõállítását lentebb ismertetjük. Mivel egy törzs genetikai hátterét nagymértékben befolyásolhatják heterológ fehérjeexpresszióra szolgáló törzs tulajdonságai, kívánatos volt olyan eltérõ genetikai hátterû élesztõtörzsek elõállítása, amelyek néhány kívánt genetikai markert is tartalmaznak: (1) mnn9-mutáció a kiválasztott fehérje hiperglikozilálásának megakadályozására, (2) prb1 és/vagy pep4-proteáz mutációk a proteolízissel kapcsolatos problémák csökkentésére, és (3) GAL4 transzkripciós faktor túltermelése GAL-promoterbõl kiinduló expresszió mértékének növelésére. 1260. jelû S. cerevisiae törzs elõállítása Kiindulási S. cerevisiae törzset a következõ módon állítottunk elõ. Az Y379–5D-jelû S. cerevisiae törzset (MATa, cyh2, nib1, rho–, cir°) [Livingston, Genetics 86, 73–84 (1977)] kereszteztük a DC04-jelû törzzsel (MATa, adel, adeX, leu2–04, cir°) [Broach és munkatársai, Cell 21, 501–508 (1980)]. Az eredményül kapott diploid törzset spóráztattuk, és a tetrádokat kivágtuk standard eljárások szerint. Az egyik haploid spórából jött létre a 2150–2–3-törzs (MATa, adel, leu2–04, cir°). Az a¹párosodó típusú, LB¹347–1C-jelû S. cerevisiae törzs (MATa,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 19

2

mnn9) egy mnn9-mutációt tartalmazó, X2180–1B-jelû S. cerevisiae törzs (MATa, SUC2, mal, mel, gal2, CUP1; ATCC nyilvántartási száma 204504). LB¹347–1C¹t párosítottunk a 2150–2–3-típusú törzzsel (MATa, leu2–04, ade1) úgy, hogy a törzseket összekevertük YEHD komplett táptalajt tartalmazó agartálcán [Carty és munkatársai, J. Ind. Micro 2, 117–121 (1987)]. Diploidok szelektálása céljából a párosított törzseket ismét szélesztettük leucin nélküli minimáltáptalajra, amely egyetlen szénforrásként 2% glükózt tartalmazott. Egyedi kolóniák izolálása után a diploidokat spóráztattuk, és a tömlõket (ascus) kivágtuk standard technikákkal. A KHY-107-törzset egyetlen haploid spóraként izoláltuk, és jellemzése ADE1, Ieu2 és mnn9 (Schiff festési technikával). Megállapodott, fagyasztott törzsoldatot készítettünk glicerinben, és –70 °C¹on tároltuk. KHY-107 (cir+)¹t növesztettünk a –70 °C¹on tárolt törzsoldatból, és olyan pC1/1¹jelû élesztõvektorral transzformáltuk, amely élesztõeredetû LEU2-d-gént és a pJDB219-cel rokon szerkezetû [Beggs, Nature 275, 104–109 (1978)], kivéve azt, hogy a pMB9-DNS helyettesítve van pBR322-DNS-sel. Az izolált transzformánst szelektív folyékony tápközegben növesztettük (leucin nélkül és 1 M szorbitot tartalmazott), azután többszöri passzálással gazdag tápközegben (1 M szorbitot tartalmazott), hogy elveszítse mind a pC1/1¹et, mind a 2 m DNS¹t. Azokat a kolóniákat, amelyek elvesztették a pC1/1¹et (nem képesek növekedni leucin nélküli tápközegben), DNS-DNS-hibridizációval teszteltük 2 m DNS jelenlétére. Kiválasztottunk egy izolált klónt, KHY107(cir°)-1¹et, amelyben nem mutattunk ki 2 m DNS¹t, és ebbõl megállapodott, fagyasztott (–70 °C) törzsoldatot készítettünk glicerinben. KHY-107(cir°)-1-ben ura3 génmegszakítást végeztünk. Elõállítottunk egy plazmidot, amelyben az S. cerevisiae-bõl származó URA3-gén meg volt szakítva 2 kópia, Tn903-ból származó Aph3’1-génnel. Az 5’¹URA3-Aph3’1-URA3–3’-kazettát kivágtuk a vektorból, és KHY-107(cir°)¹1 transzformálására alkalmaztuk. Azokat a transzformánsokat, amelyek integrálták a megszakított ura3-kazettát, 5¹fluor-orotsavas tálcákon [Kaiser és munkatársai, „Methods in Yeast Genetics”, 1994. évi kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1994), 214–215. oldal] kiszelektáltuk, és ezt követõen kimutattuk, hogy nem képesek növekedni uracil nélküli táptalajon. Egy izolált klónt, KHY-107ura3(PN2)¹t kiválasztottunk, és megállapodott, fagyasztott (–70 °C) törzsoldatot készítettünk glicerinben. KHY-107ura3(PN2)¹t komplex tápközegben növesztettünk (1 M szorbitot tartalmazott), azután arginin helyett kanavanint tartalmazó, szintetikus táptalajra szélesztettük, és kanavaninrezisztens (canR) mutánsokat kaptunk. Spontán canR-mutánsokat szélesztettünk izolált kolóniák elõállítása céljából szilárd, szintetikus táptalajra, amely arginin helyett kanavanint tartalmazott. Izolált kolóniákról standard genetikai komplementációs teszt alkalmazásával kimutattuk, hogy can1¹ek. Egy izolált can1-kolóniát, DMY10¹et kiválasztottunk, és fagyasztott (–70 °C) törzsoldatként tároltuk glicerinben.

1

HU 008 015 T2

Az élesztõeredetû GAL4-jelû transzkripciós faktor túltermelése céljából a GAL10p-GAL4 fúziós gént a DMY10-ben lévõ HIS3-génbe integráltuk. Az 5’-HIS3GAL10p-GAL4-URA3-HIS3–3’ kazettát kivágtuk pKHint-C-bõl [Schultz és munkatársai, Gene 61, 123–133 (1987)], és DMY10 transzformálására alkalmaztuk. Azokat a transzformánsokat, amelyek integrálták a kazettát, uracil nélküli, szilárd szintetikus táptalajon kiszelektáltuk, és ezt követõen kimutattuk, hogy nem képesek növekedni hisztidin nélkül. Southern-hibridizációval igazoltuk, hogy a kazetta csak a HIS3-lokusznál integrálódott. Egy izolált integránst, DMY10int3¹at kiválasztottunk, és megállapodott, fagyasztott (–70 °C) törzsoldatként tároltuk glicerinben. A törzset CF52-ként jelöltük. Az S. cerevisiae-bõl származó PRBI-gént [Moehle és munkatársai, Genetics 115, 255–263 (1987)] tartalmazó, FP8DH-plazmidot HindIII/XhoI-enzimekkel emésztettük, és a PRB1-gént tartalmazó, 3,2 kbp méretû DNS-fragmenst gélen tisztítottuk, és tompa végûvé alakítottuk T4¹DNS-polimerázos kezeléssel. Az eredményül kapott vektorfragmenst a fentebb leírt PRB1-génfragmenssel ligáltuk, így jutottunk a pUC18PRB1-plazmidhoz. Az YEp6-plazmidot [Struhl és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1035 (1979)], amely a HIS3-gént tartalmazta, BamHI-enzimmel emésztettük. Az eredményül kapott, funkcionális HIS3gént tartalmazó, 1,7 kbp méretû BamHI-fragmenst gélen tisztítottuk, és tompa végûvé alakítottuk T4¹DNSpolimerázos kezeléssel. A pUC18-PRB1-vektort EcoRV/NcoI-enzimekkel emésztettük, amelyek a PRB1 kódolószekvenciában hasítanak, és eltávolítják a proteáz¹B aktív helyet és szegélyezõ szekvenciát. Az 5,7 kbp méretû, EcoRV/NcoI fragmenst, ami a pUC18ban a PRB1 kódolószekvencia maradék 5’¹ és 3’¹végi részeit tartalmazza, tisztítottuk, és tompa végûvé alakítottuk T4¹DNS-polimerázos kezeléssel, defoszforiláltuk alkalikus foszfatázzal, és ligáltuk a fentebb leírt, tompa végûvé alakított HIS3-fragmenssel. Az eredményül kapott plazmid (jelölése pUC18-prb1::HIS3, #1245. készlet) tartalmazta a funkcionális HIS3-gént a PRB1-gén részlete helyett, amit a fentebb leírtak szerint deletáltunk. A PRB1-génben megszakított vektort (pUC18prb1::HIS3) SacI/XbaI-enzimekkel emésztettük, lineáris prb1::HIS3 megszakított kazetta elõállítása céljából, és CF52-törzs transzformálására alkalmaztuk lítiumacetátos módszerrel [Ito és munkatársai, J. Bacteriol. 153, 163 (1983)]. His+-transzformánsokat szelektáltunk hisztidint nem tartalmazó, szintetikus agar táptalajon, és újra szélesztettük ezeket ugyanerre a táptalajra klonális izolátumokhoz. Genomi DNS¹t preparáltunk számos, eredményül kapott His+-izolátumokból, EcoRI-enzimmel emésztettük, és azután elektroforetizáltuk 0,8%¹os agarózgélen. Southern-blot-analízisekkel igazoltuk a kívánt prb1D::HIS3 génmegszakítás jelenlétét. Az egyik izolátumot, amely tartalmazta a kívánt prb1D::HIS3 génmegszakítást, kiválasztottuk további alkalmazásra, és #1260. törzsnek jelöltük. Glicerinben fagyasztott törzsoldatokat készítettünk a #1260. törzs-

2

bõl, –70 °C¹os tárolásra. A #1260. törzs eredményül kapott genotípusa a következõ: MTTa, Ieu2–2,112, mnn9, ura3D, can1, his3D::GAL10p-GAL4-URA3, prb1D::HIS3, cir°. 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 20

1309. jelû S. cerevisiae törzs elõállítása A BJ1995-jelû S. cerevisiae törzset (MATa, Ieu2, trp1, ura3–52, prb1-1122, pep4–3, gal2) elõzõleg már leírták [Jones, E. W., „Tackling the Protease Problem in Saccharomyces cerevisiae”, Methods in Enymology 194, 428–453 (1991)]. A BJ1995 cir°-származékát, amely nem tartalmazott endogén 2 m¹os DNS-plazmidot, az 1260. törzs elõállítására leírt eljárás alkalmazásával izoláltuk. Az eredményül kapott cir°-izolátumot 91. törzsnek jelöltük, és fagyasztott (–70 °C) törzsoldatként tároltuk glicerinben. A 91. törzs származékát azután úgy állítottuk elõ, hogy túltermelje a GAL4 transzkripciós faktort, GALpromoterekbõl kiinduló transzkripció mértékének növelése céljából. A pKHint-C-plazmidot [Schultz és munkatársai, Gene 61, 123–133 (1987)] BamHI-enzimmel emésztettük, és az eredményül kapott 5’-HIS3GAL10p-GAL4- ¹URA3-HIS3–3’ kazettát alkalmaztuk a 91. törzs transzformálására. A kazettát integrált transzformánsokat leucint nem tartalmazó, szilárd szintetikus táptalajon szelektáltuk ki, és azután kimutattuk, hogy nem képesek növekedni hisztidin nélküli táptalajon. A kazetta kívánt integrálása a HIS3-lokusznál történt, amit Southern-hibridizációval igazoltunk, próbaként élesztõeredetû HIS3-gén alkalmazásával. Kiválasztottunk egy izolált integránst, BJ1995cir°int#22-jelût, és fagyasztott (–70 °C) megállapodott törzsoldatként glicerinben tároltuk. Az izolátumot 1282. számú törzsnek jelöltük. Az 1282. törzs egy származékát, amely az MNN9génben megszakítást tartalmazott, azután a következõ lépések szerint izoláltuk. Az MNN9-gén megszakítása céljából az MNN9-gént elõször klónozni kell S. cerevisiae genomi DNS-bõl, hogy elõállítsuk a génmegszakító vektort. Ezt standard PCR-technológiával végeztük. 5’¹végi szensz láncindító oligonukleotidot és 3’¹végi antiszensz láncindító oligonukleotidot terveztünk a teljes hosszúságú MNN9¹et kódoló szekvencia PCR-jéhez, az élesztõeredetû MNN9-gén közölt szekvenciáira alapozva (MacKay és munkatársai, EP0314096 számú európai közzétételi irat, nemzetközi közzététel dátuma 1989. május 3.). A következõ láncindító oligodezoxinukleotidokat alkalmaztuk, amelyek szegélyezõ HindIII-hasítóhelyeket (aláhúzva) tartalmaztak: szensz láncindító oligonukleotid (94. azonosító számú szekvencia): 5’¹CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G¹3’ antiszensz láncindító oligonukleotid (95. azonosító számú szekvencia): 5’¹TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC¹3’. Az MNN9-génhez a kezdõ metioninkodont vastag betûvel kiemeltük. PCR¹t úgy végeztünk, hogy templátként S. cerevisiae-bõl származó, genomi DNS¹t alkalmaztunk. Az eredményül kapott, MNN9-gént tartalmazó, 1,2 kbp méretû PCR-fragmenst HindIII-enzimmel emésztettük, gélen tisztítottuk, és HindIII-enzimmel emésztett, alkali-

1

HU 008 015 T2

kus foszfatázzal kezelt pUC13-mal ligáltuk. Az eredményül kapott plazmidot p1183-nak jelöltük. Az élesztõeredetû TRP1-gént YRp7-bõl izoláltuk [Struhl és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1035–1039 (1979)] 0,85 kb méretû EcoRI/BglII fragmensként, amelyet tompa végûvé alakítottunk, és azután a p1183 PmlI-hasítóhelyébe inszertáltuk. A PmlI-hasítóhely az MNN9 kódolószekvencia közepén van, ezáltal a TRP1-gén inszerciója ezen a hely a gén megszakítását eredményezi. Az eredményül kapott pUC13mnn9:TRP1-plazmidot (pH11885–239–1) azután HpaI/EcoRI-enzimekkel emésztettük, és az 5’¹mnn9TRP1-mnn9¹3’ kazettát alkalmaztuk az 1282. törzs transzformálására lítium-acetátos módszerrel [Ito és munkatársai, J. Bacteriol. 153, 163 (1983)]. Trp+-transzformánsokat szelektáltunk triptofán nélküli, szintetikus agar tálcákon, és ugyanerre a tálcára újra szélesztettük egyedi kolóniaizolátumok elõállítása céljából. Genomi DNS¹t preparáltunk számos, eredményül kapott Trp+-izolátumból, HindIII-enzimmel emésztettük, és azután 0,8%¹os agarózgéleken elektroforézisnek vetettük alá. Southern-blot-analízisekkel igazoltuk a kívánt mnn9::TRP1 génmegszakítás jelenlétét. A kívánt mnn9::TRP1 megszakítást tartalmazó egyik ilyen izolátumot kiválasztottuk további felhasználásra, és 1309. törzsként jelöltük a következõk szerint: MATa, Ieu2, mnn9::TRP1, trp1, ura3–52, his3D::GAL10pGAL4-URA3, prb1-1122, pep4-3, gal2, cir°. 9. példa: Teljes hosszúságú ORF0657n-régió expresszálása A teljes hosszúságú ORF0657n¹t E. coliban (28. azonosító számú szekvencia; His-toldalékkal ellátott ORF0657n) és S. cerevisiae-ben (28. azonosító számú szekvencia 1–646. aminosavai) expresszáltuk, és összehasonlítottuk az expressziós termékeket. S. cerevisiae expresszió Élesztõben történõ expresszióra optimalizált kodonokat tartalmazó, ORF0657n-fehérjét kódoló DNS¹t a végsõ javított klónból, pUnkCR1-bõl (7. példa) amplifikáltunk, az alábbi szensz és antiszensz oligonukleotidok alkalmazásával, sorrendben, UnkCY¹F (96. azonosító számú szekvencia), 5’¹AAC CGG TTT GGA TCC CAC AAA ACA AAA TGG GTA ACA AGC AAC AAA AGG AAT TC3’ és UnkCY¹R (97. azonosító számú szekvencia) 5’AAC CGG TTT GGA TCC TTA GTT CTT TCT CTT TCT TGG CAA GAC3’, szegélyezõ BamHI-enzim restrikciós hasítóhelyeit tartalmazva. A szensz láncindító oligonukleotid 5’¹végi nem transzlálódó szekvenciát és ATG-kodont tartalmazott, és az antiszensz láncindító oligonukleotid TAA¹t tartalmazott stopkodonként. Az eredményül kapott 1,9 kb méretû terméket gélben izoláltuk, és TOPO TA pCR2.1-vektorba klónoztuk (INVITROGEN CORPORATION, Carlsbad, CA), a gyártó által adott útmutató alapján, az UnkC-B1-plazmid elõállítása céljából. Ezt követõen az inszert DNS-szekvenciáját igazoltuk. A BamHI-fragmenst gélben izoláltuk, és ezt követõen alkalmas orientációban élesztõvektorba (pGAL110, 5A. ábra) klónoz-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 21

2

tuk, a pRUnkC-pGAL110-konstrukció elõállítása céljából. Az inszert szekvenciáját DNS-szekvenálással igazoltuk. A pRUnkC-pGAL110-bõl izolált plazmid DNS¹t alkalmaztuk olyan S. cerevisiae törzsek transzformálására, amelyek leu2-mutációt tartalmaztak leucinprototrófiához (Leu+), szferoplaszt traszformációs eljárás alkalmazásával [Hinnen és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929–33 (19789]. Az 1260. és 1309. törzsek konstrukcióit bemutattuk fentebb, a 8. példában. Transzformánsokat szelektáltunk olyan szintetikus agar táptalajon, amely nem tartalmazott leucint, és 1 M szorbitot tartalmazott. A felsõ és alsó, szintetikus agar táptalajt, amely nem tartalmazott leucint és 1 M szorbitot tartalmazott, REMEL cégtõl szereztük be, Lenexa, KS (kat.#09459 és 92155), sorrendben. Klonális Leu+izolátumokat SD mínusz leucin tálcákon (KD MEDICAL, Columbia, MD) való sorozatnövesztéssel állítottunk elõ. Többszörös transzformánsok szkrínelése céljából 5,0 ml termelési tenyészetet növesztettünk tenyésztõ csövekben, amelyeket lassan forgattunk 30 °C¹on. Ezt követõen a termelést szelektált transzformánsokra 125 ml¹es lombikban lévõ, 25 ml tenyészetekben igazoltuk. Mindkét esetben öt ml oltóanyagot növesztettünk 30 °C¹on, 5X mínusz leucin tápközegben, amely 4,0% glükózt és 0,1 M szorbitot tartalmazott, 18–24 óra hosszáig, 1,5–3,0/ml OD600¹ig. Az 5X mínusz leucin tápközeg a következõ komponenseket tartalmazza literenként: élesztõ-nitrogén-alapoldat, hozzáadott aminosavak és ammónium-szulfát nélkül, 8,5 g; adenin, 0,40 g; L¹tirozin, 0,25 g; uracil, 0,20 g; borostyánkõsav, 10,0 g; ammónium-szulfát, 5,0 g és 50 ml leucin-mínusz oldat #3. Leucin-mínusz #3 oldat egy liter desztillált vízben a következõket tartalmazza: L¹arginin, 2 g; L¹hisztidin, 1,0 g; L¹izoleucin, 6 g; L¹lizin, 4,0 g; L¹metionin, 1,0 g; L¹fenil-alanin, 6,0 g; L¹triptofán, 4,0 g. A tápközeg pH¹ját 5,3¹re állítottuk 50% nátrium-hidroxiddal. Csövekben való tenyésztéshez az oltóanyag-tenyészetbõl 0,3 ml¹es aliquotot adtunk 5,0 ml, 2% glükózt, 4% galaktózt tartalmazó, 5X mínusz leucin tápközegbe, vagy YEHDG-tápközegbe, 72 óra hosszáig tenyésztettük 5–16,0/ml végsõ OD600¹ig. YEHDG-tápközeg literenként a következõket tartalmazta: L¹Hy-Soy peptone-Sheffield, 10 g; élesztõkivonat, 20 g; L¹dextróz, 16 g; D(+)-galaktóz, 40 g. Lombikos tenyészetekhez az oltóanyag-tenyészetbõl 1,5 ml aliquotot adtunk 25 ml tápközegbe, és a fentebb leírtak szerint növesztettük, 220 rpm¹en rázatva. 10 OD¹egységes minták elkülönítése után a sejtüledéket üveggyöngyökkel összetörtük, 0,3 ml lízispufferben (0,1 M nátrium-foszfát-puffer, pH=7,2, 0,5 NaCl, 2 mM PMSF). A lizátumot centrifugálással kinyertük, az ép sejteket/gyöngyöket 0,3 ml lízispufferrel mostuk, és a tisztázott felülúszókat egyesítettük. A fehérjekoncentrációt BIO¹RAD „Protein Assay Dye” reagensrendszerrel (BIO¹RAD, Hercules, CA) határoztuk meg, a gyártó által adott utasítások alapján. A sejtlizátumokat ORF0657n-expresszióra analizáltuk immunoblot analí-

1

HU 008 015 T2

zissel, miután elektroforézissel vizsgáltuk 4–20%-gradiens Tris-glicin-gélekben (INVITROGEN, Carlsbad, CA), 1X Tris-glicin SDS-pufferben (BIO¹RAD), redukáló és denaturáló körülmények között. A minták 20 mg celluláris összfehérjét tartalmaztak. A géleket 0,45 mikronos nitro-cellulóz-membránszûrõkre (Optitran, Schleicher and Schuell, Keene, NH) elektroblottoltuk. A fehérje méretének becslése céljából 6,4 és 203 kDa közötti méretû, elõfestett standardeket (Broad Range Prestained SDS-PAGE Standard, BIO¹RAD) futtattunk párhuzamosan a lizátumokkal. E. coli standard His-toldalékkal ellátott, ORF0657n¹t (28. azonosító számú szekvencia) tisztítottunk E. coli termelõtenyészetbõl [E. coli gazdaszervezet HMS 174(DE3), NOVAGEN, Madison, WI], amit ORF0657n termelésére indukáltunk, és a sejtlizátumot alkalmaztuk standardként. E. coli His-toldalékkal ellátott ORF0657n¹t expresszáló, expressziós vektorral volt transzformálva. Az E. coli tenyészetet egy éjszakán át növesztettük 30 mg/ml kanamicint tartalmazó LB¹tápközegben, 37 °C¹on. A következõ napon 60 ml, egyéjszakás tenyészetet alkalmaztunk 6,0 ml, 30 mg/ml kanamicint tartalmazó LB¹tápközeg oltására. A tenyészetet 37 °C¹on növesztettük körülbelül 3 óra hosszáig, amíg az OD600 0,4–1,0 között lett. Az expressziót 1 mM IPTG-vel indukáltuk 2 óra hosszáig, 37 °C¹on. A sejteket elkülönítettük, és a sejtüledéket –80 °C¹on tároltuk. E. coli lizátumot készítettünk „Bugbuster Protein Extraction Reagent” (NOVAGEN, Madison, WI) alkalmazásával, a gyártó által adott eljárást követve. A fehérjéket immunológiailag detektáltuk Western-blotban, primer ellenanyagként ORF0657n¹re specifikus egéreredetû monoklonális ellenanyag (jelölése „2H2B8”), és szekunder ellenanyagként kecskében termeltetett, antiegér IgG (H+L), tormából származó peroxidázzal jelölt, egész ellenanyag (ZYMED LABORATORIES, South San Francisco, CA) alkalmazásával. 2H2B8-jelû monoklonális ellenanyagot (Mab) úgy állítottunk elõ, hogy tisztított, E. coliban termeltetett, teljes hosszúságú ORF0657n-nel immunizáltunk egereket. Mab2H2B8¹at ELISA-val szelektáltuk, és kimutattuk, hogy ORF0657n¹re specifikus. A szûrõket peroxidáz szubsztrát (BIO¹RAD HRP Conjugate Substrate Kit) alkalmazásával kezeltük. Expressziós termékek E. coliból és S. cerevisiaebõl Az élesztõtranszformánsok kezdeti szkrínelésébõl, az 1260-jelû, illetve 1309-jelû élesztõtörzsek közül kiválasztottunk egy-egy transzformánst, mint a teljes hosszúságú ORF0657n-régió (28. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalék nélkül) legjobb termelõjét. A teljes hosszúságú ORF0657n-régió termelésére példaként szolgált a törzs 72 órás fermentációja után kapott érték, komplex YEHDG-tápközegben, amit E. coli által termelt ORF0657n-régió (28. azonosító számú szekvencia) mennyiségéhez viszonyítottunk, a 6A. és 6B. ábrán bemutatottak szerint.

5

10

15

20

25

30

35

40

2

Western-blot-analízissel, mAb-2H2B8-jelû ellenanyaggal detektált, fõ fehérje molekulatömege körülbelül 105–110 kDa volt, ami a 6A. ábrán (1260. törzs) és 6B. ábrán (1309. törzs) látható: 5. és 6. sávban. A körülbelül 105–110 kDa méretû fehérje megfelelt az E. coliban expresszált, tisztított, rekombináns ORF0657nmintában (28. azonosító számú szekvencia; 2. sáv), vagy ORF0657n¹t termelõ, indukált E. coli tenyészet extraktumában detektált legnagyobb fehérje méretének (az utóbbi nem látható a 6. ábrán bemutatott géleken). A 105–110 kDa méretû, E. coli és az S. cerevisiae által termelt fehérjék molekulatömege egyaránt nagyobb volt, mint a gélelektroforézis-rendszerünkben elõre jelzett méret. Meg kell jegyeznünk, hogy az E. coli kontrollokban detektált, túlnyomó többséget alkotó fehérjefajta kisebb, körülbelül 95 kDa volt, és együtt vándorolt élesztõben termelõdött, kisebb mennyiségû fehérjével. Feltételezzük, hogy a körülbelül 105–110 kDa méretû fehérje megfelel a teljes hosszúságú ORF0657n-nek, ami E. coliban és S. cerevisiae-ben egyaránt az E. coli eredetû szekréciós vezetõszekvenciával expresszálódik, és feltételezzük, hogy a 95 kDa méretû fehérje lebomlási termék. Nem történt detektálás olyan kontroll transzformáns extrakrumával, amelyet csak a pGAL110-vektorral állítottunk elõ (3. és 4. sávok). Az ORF0657n-régió (28. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalék nélkül) becsült mennyisége, amit az 1260. és 1309. törzs traszformánsai termeltek, körülbelül 10 mikrogramm ORF0657n 1 ml YEHDG-tápközegben, ahol az ORF0657n-régió az összfehérje körülbelül 2%¹ának felelt meg, félkvantitatív Western-blotban meghatározva, 100 ng tisztított ORF0657n¹t (28. azonosító számú szekvencia) alkalmaztunk standardként. Az ORF0657n-régió (28. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalék nélkül) expresszált mennyisége és az összfehérjére vonatkoztatott %¹os aránya egyaránt nagyobb volt 72 óra elteltével, mint 48 óra után, mindkét törzs esetén (az adatokat nem mutatjuk). Az 1260. törzs transzformánsa által termelt ORF0657n-régió (28. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalék nélkül) titere 2% glükózt, 4% galaktózt tartalmazó 5X leucin tápközegben körülbelül 8,0 mg/ml volt, és az összfehérje 2,0%¹a.

45 10. példa: ORF0657nH-régiót kódoló, szekretált, kodonoptimalizált szekvencia expressziója A pKH4–3B-vektor [Carty és munkatársai, Biotechnol. Lett. 12, 879–884 (1990)] élesztõbõl származó al50 fa-faktor (MFa1) pre-pro szekréciós vezetõszekvenciát tartalmaz. Egy kívánt fehérje fúziója ehhez a vezetõszekvenciához olyan transzlációs terméket eredményez, amelyet elõször S. cerevisiae eredetû szignálpeptidáz hasít. Ezt követõen a Kex2-proteáz a „Lys55 Arg” után hasít a szekréciós vezetõszekvenciában, és felszabadul az érett fehérje. Az S. cerevisiae-bõl származó, indukálható GAL10-promotert alkalmaztuk a fehérjeexpresszió vezérlésére. A pKH4–3B-vektort alkalmaztuk a megváltoztatott 60 3. azonosító számú szekvenciát kódoló, kodonoptimali22

1

HU 008 015 T2

zált gén expresszálására. A 3. azonosító számú szekvenciát úgy változtattuk meg, hogy eltávolítottak az aminoterminális metionint, és hozzáadtunk egy aminoterminális vezetõszekvenciát. A kodonoptimalizált 3. azonosító számú szekvenciát kódoló régiót a 32. azonosító számú szekvencia 4–1710. nukleotidjai biztosították, és a vezetõszekvenciát kódoló szekvenciát a pKH4–3B-vektor biztosította, a lentebb leírtak szerint elõállítva. A pKH4–3B-bõl származó alfa-faktor pre-pro szekréciós vezetõszekvenciáját a 3. azonosító számú szekvencia ORF0657nH-régiójához egy fázisban fuzionáltuk. Ezt úgy végeztük, hogy a pKH4–3B-vektort SphIenzimmel emésztettük, azután T4¹DNS-polimerázzal kezeltük az SphI túlnyúló szakasz eltávolítása céljából, tompa végûvé alakítva az 5’¹végen, és a vezetõszekvencia alkalmas kodonjaival. Ezt követõen a vektort BamHI-enzimmel emésztettük 3’¹végi klónozóhely elõállítása céljából. Ehhez a konstrukcióhoz olyan PCRtermék szükséges, amely 5’¹végen tompa véggel megfelel az újjáalakított ORF0657nH-régió (32. azonosító számú szekvencia) második kodonjának, és a 3’¹végen stopkodonnal és BamHI-jelû restrikciós hasítóhellyel van ellátva. Élesztõben történõ expresszióra optimalizált kodonokat tartalmazó, ORF0657nH-régiót kódoló DNS¹t pUnkCR1-bõl (7. példa) amplifikáltunk, az alábbi szensz és antiszensz oligonukleotidok alkalmazásával, sorrendben, UCKHS2 (98. azonosító számú szekvencia), 5’¹GCTGAAGAAACTGGTGGTACCAAC¹3’ és UCKHA2 (99. azonosító számú szekvencia) 5 ’ ¹ G T C A C G G A T G G T T A A G A C T T A G C C T TGTTTTCTTGAGTGTTC¹3’. A szensz láncindító oligonukleotid 5’¹vége, GCT, alanint kódol, ami az ORF0657nH-régió elõre jelzett N¹terminálisa. Az antiszensz láncindító oligonukleotid TAA stopkodont és BamHI-jelû restrikciós hasítóhelyet tartalmazott (aláhúzva). Az eredményül kapott 1,7 kb méretû PCR-terméket gélben izoláltuk, és pH4–3B¹be (a fentebb leírtak szerint állítottuk elõ) klónoztuk, így jutottunk a pUS38-hoz. Az inszert egész DNS-szekvenciáját és a vektor részleges szekvenciáját igazoltuk, és kimutattuk, hogy a szekréciós szekvencia kívánt fúziója megtörtént. Ha ebbõl a konstrukcióból elõször expresszált fehérjét Kex2p-vel alkalmasan hasítjuk, akkor N¹terminális nélkül, a 3. azonosító számú szekvenciának megfelelõ fehérjéhez jutunk. A pUS38-plazmidot alkalmaztuk az 1260. és 1309. jelû S. cerevisiae törzsek transzformálására leucinprototrófiához (Leu+), szferoplaszt traszformációs eljárás alkalmazásával [Hinnen és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929–33 (19789]. Transzformánsokat szelektáltunk olyan szintetikus agar táptalajon, amely nem tartalmazott leucint, és 1 M szorbitot tartalmazott. A felsõ és alsó, szintetikus agar táptalajt, amely nem tartalmazott leucint és 1 M szorbitot tartalmazott, REMEL cégtõl szereztük be, Lenexa, KS (kat.#09459 és 92155), sorrendben. Klonális Leu+-izolátumokat SD mínusz leucin tálcákon (KD MEDICAL, Columbia, MD) való sorozatnövesztéssel állítottunk elõ.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 23

2

Többszörös transzformánsok szkrínelése céljából öt ml oltóanyag-tenyészeteket növesztettünk 30 °C¹on, 5X mínusz leucin tápközegben, amely 4,0% glükózt és 0,1 M szorbitot tartalmazott, 18–24 óra hosszáig, 1,5–3,0/ml OD600¹ig. Az 5X mínusz leucin tápközeg a következõ komponenseket tartalmazza literenként: élesztõ-nitrogén-alap, hozzáadott aminosavak és ammónium-szulfát nélkül, 8,5 g; adenin, 0,40 g; L¹tirozin, 0,25 g; uracil, 0,20 g; borostyánkõsav, 10,0 g; ammónium-szulfát, 5,0 g és 50 ml leucin-mínusz oldat #3. Leucin-mínusz #3 oldat egy liter desztillált vízben a következõket tartalmazza: L¹arginin, 2 g; L¹hisztidin, 1,0 g; L¹izoleucin, 6 g; L¹lizin, 4,0 g; L¹metionin, 1,0 g; L¹fenil-alanin, 6,0 g; L¹triptofán, 4,0 g. A tápközeg pH¹ját 5,3¹re állítottuk 50% nátrium-hidroxiddal. 0,3 ml¹es aliquotot adtunk 5,0 ml, 2% glükózt plusz 4% galaktózt tartalmazó, 5X mínusz leucin tápközegbe, vagy YEHDG-tápközegbe, 72 óra hosszáig tenyésztettük 5–16,0/ml végsõ OD600¹ig. YEHDG-tápközeg literenként a következõket tartalmazta: L¹Hy-Soy peptoneSheffield, 10 g; élesztõkivonat, 20 g; L¹dextróz, 16 g; D(+)-galaktóz, 40 g. A fermentációt úgy állítottuk le, hogy az élesztõsejteket eltávolítottuk, és a felülúszókat közvetlenül ORF0657nH-régió (3. azonosító számú szekvencia) expressziójára analizáltuk Western-blot-analízissel vagy SDS-PAGE-gélek Coomassie-festésével. Immunoblot analízishez 10–25 ml mintákat elektroforézisnek vetettünk alá 4–15% gradiens Tris-HCl-géleken (BIO¹RAD, Hercules, CA), 1X Tris-glicin-SDS-pufferben (BIORAD, Hercules, CA) redukáló és denaturáló körülmények között. A géleket elektroblottoltuk 0,2 mikronos PVDF-membránszûrökre. A fehérjéket immunológiailag detektáltuk primer ellenanyagként 2H2B8-jelû monoklonális ellenanyag, és szekunder ellenanyagként kecskében termeltetett, antiegér IgG (H+L), tormából származó peroxidázzal jelölt, egész ellenanyag (ZYMED LABORATORIES, South San Francisco, CA) alkalmazásával. 2H2B8-jelû monoklonális ellenanyagot (Mab) leírtuk a 9. példában. A szûrõket WESTERN LIGHTNING™ kemilumineszcenciás reagens (Chemiluminescence Reagent Plus kit, PERKIN-ELMER, Wellesley, MA) alkalmazásával kezeltük. Abból a célból, hogy rekombináns élesztõ ORF0657nH-régiójának (3. azonosító számú szekvencia) expresszióját analizáljuk, a mintákat elektroforézisnek vetettük alá 4–15% gradiens Tris-HCl-géleken (BIO¹RAD, Hercules, CA), 1X Tris-glicin-SDS-pufferben (BIO¹RAD, Hercules, CA) redukáló és denaturáló körülmények között. A géleket „Bio-Safe” Coomassieval (egy Coomassie G250 festék) festettük a gyártó (BIO¹RAD) által adott használati útmutató alapján. Kvalitatív standardként ORF0657nH¹t (4. azonosító számú szekvencia, karboxil His-toldalékkal) termelõ E. coli tenyészetbõl származó sejtlizátumot alkalmaztunk. Az E. coli által expresszált ORF0657nH-régió elõre jelzett aminosavszekvenciája megegyezik S. cerevisiae által internálisan expresszált ORF0657nH-régió elõre jelzett aminosavszekvenciájával (3. azonosító számú szekvencia), kivéve azt, hogy glicin van jelen az N¹ter-

1

HU 008 015 T2

minális metionin után az E. coliból származó konstrukcióban. ORF0657nH-régió E. coliban történõ termeltetése céljából a termelõtörzset egy éjszakán át növesztettük 50 mg/ml kanamicint tartalmazó, LB¹tápközegben, 37 °C¹on. A karboxil His-toldalék nélküli, 4. azonosító számú szekvenciát kódoló pET28¹at alkalmaztuk fehérjeexpresszióra. A következõ napon 500 ml, egyéjszakás tenyészettel beoltottunk 5,0 ml, 50 mg/ml kanamicint tartalmazó LB¹tápközeget. A tenyészetet 37 °C¹on növesztettük körülbelül 3 óra hosszáig, OD600 0,6¹ig. Az expressziót 1 mM IPTG hozzáadásával indukáltuk 3,5 óra hosszáig, 37 °C¹on. A sejteket elkülönítettük, és a sejtüledéket –80 °C¹on tároltuk. Az E. coliból lizátumot „Bugbuster Protein Extraction Reagent” (NOVAGEN, Madison, WI) alkalmazásával készítettünk, a gyártó által adott útmutató alapján. ORF0657nH-régiót (3. azonosító számú szekvencia) internálisan expresszáló, 1–1-jelû S. cerevisiae transzformáns sejtlizátumából származó fehérjét is felhasználtunk standardként, amit a 11. példában lentebb ismertetünk és a példában leírtak szerint preparáltunk. A fehérje méretének becslése céljából elõfestett standardeket futtattunk 10 és 250 kDa között (BIO¹RAD), párhuzamosan a mintákkal SDS-PAGE-géleken, Coomassie festéshez és Western-kiértékeléshez. A kívánt fehérjefajták termelését 2% glükózt plusz 4% galaktózt tartalmazó, 5X leucin nélküli tápközegben végeztük. A pUS38¹at tartalmazó transzformánsai egy körülbelül 80 kDa méretû fehérjét szekretáltak, amely nagyon közel vándorolt az élesztõben internálisan expresszált ORF0657nH-régióval (3. azonosító számú szekvenciát kódoló nukleinsavból) és az E. coliban expresszált ORF0657nH-val (karboxil His-toldalékkal ellátott, 4. azonosító számú szekvenciát kódoló nukleinsavból), amelyet Western-blotban és Coomassie festéssel mutattunk ki. Egy tipikus kísérletben ezekbõl a kontroll-lizátumokból 500 ng¹ot és 25 ml tápközeg-felülúszót vetettünk alá elektroforézisnek. A detektálás specifikus volt; a 80 kDa méretû fehérjét nem mutattuk ki a vektort egyedül tartalmazó transzformáns felülúszójában, Western-blottal és Coomassie festéssel sem. A szekretált, körülbelül 80 kDa méretû fehérje az érett, nem glikozilált ORF0657nH-régiónak (3. azonosító számú szekvencia) felelhet meg, vagy alternatív módon, tartalmazhat néhány glikozilcsoportot is. A felülúszókban nagyobb molekulatömegû fehérjefajtákat detektáltunk az ellenanyaggal, valamint két kisebb molekulatömegû fehérjét, amelyek mind festõdtek Coomassie Blue-val. A nagyobb molekulatömegû fehérjefajták érés nélküli (nem processzált) vezetõszekvenciát tartalmazhatnak és/vagy glikoziláltak lehetnek. Az alacsony MW fehérjefajták valószínûleg lebomlási termékek. Mindkét törzs, az 1260-jelû és az 1309-jelû törzs transzformánsai által szekretált, 80 kDa méretû fehérjefajta becsült mennyisége körülbelül 2 mg/ml volt a tenyésztési tápközegben. Ezt úgy határoztuk meg, hogy a 80 kDa-nál észlelt Western-jelet az ORF0657nH-régiót (3. azonosító számú szekvencia) tartalmazó élesz-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 24

2

tõsejt-lizátumból vett minta jeléhez hasonlítottuk, ami alapján feltételezzük, hogy az ORF0657nH-régió az összfehérje legalább 50%¹át foglalja magában. A maradék ORF0657n-régió összesített titerét körülbelül 50 mg/ml¹re becsültük a tenyésztési tápközegben. 11. példa: ORF0657nH-régiók (3. azonosító számú szekvencia) intracelluláris expressziója S. cerevisiae-ben Diszkrét méretekkel rendelkezõ fehérje nagymértékû termelõdését kaptuk a 3. azonosító számú szekvencia intracelluláris expressziójával S. cerevisiae-ben. Az expressziót élesztõre optimalizált kódoló nukleinsavszekvencia alkalmazásával értük el. Élesztõben történõ expresszióra optimalizált kodonokat tartalmazó, ORF0657nH-régiót kódoló DNS¹t pUnkCR1-bõl (7. példa) amplifikáltunk, az alábbi szensz és antiszensz oligonukleotidok alkalmazásával, sorrendben: (100. azonosító számú szekvencia), 5’¹GGGG GGATCC CACAAAACAAA ATG GCT GAA GAA ACT GGT GG3’ és (101. azonosító számú szekvencia) 5’GGG GGG GGATCC TTA AGA CTT AGC CTT GTT TTC TTG AGT3’ szegélyezõ BamHI-enzim restrikciós hasítóhelyeit tartalmazva (aláhúzva). A szensz láncindító oligonukleotid 5’¹végi nem transzlálódó vezetõszekvenciát és ATG-kodont tartalmazott, és az antiszensz láncindító oligonukleotid TAA¹t tartalmazott stopkodonként. Az eredményül kapott, pCR_iUC¹S2.2 1,3 kb méretû fragmensét és pCR_iUC¹S2.4 4,3 kb méretû fragmensét gélben izoláltuk, és ligáltuk. A kívánt fragmenseket tartalmazó klónt, pCR_iUC¹S¹t kiszelektáltuk, meghatároztuk az alkalmas orientációt, és a nukleotidszekvenciát DNS-szekvenálással igazoltuk. Ezt követõen az 1,7 kb méretû BamHI-fragmenst pGAL110¹be (5A. ábra) szubklónoztuk, a piUCS¹S(–)-konstrukció elõállítása céljából. A piUC¹S(–)-ból izolált plazmid DNS¹t alkalmaztuk 1260. és 1309. jelû S. cerevisiae törzsek transzformálására leucinprototrófiához (Leu+), szferoplaszt traszformációs eljárás alkalmazásával [Hinnen és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929–33 (19789]. Transzformánsokat szelektáltunk olyan szintetikus agar táptalajon, amely nem tartalmazott leucint, és 1 M szorbitot tartalmazott. A felsõ és alsó, szintetikus agar táptalajt, amely nem tartalmazott leucint és 1 M szorbitot tartalmazott, REMEL cégtõl szereztük be, Lenexa, KS (kat.#09459 és 92155), sorrendben. Klonális Leu+-izolátumokat SD mínusz leucin tálcákon (KD MEDICAL, Columbia, MD) való sorozatnövesztéssel állítottunk elõ. Többszörös transzformánsokat szkríneltünk ORF0657nH-régió termeltetéséhez, a 9. példában leírt fermentációs körülmények alkalmazásával. A sejtlizátumokat ORF0657nH-régió termelésére analizáltuk Western-blot-analízissel, vagy Coomassie Blue-val festett SDS-PAGE-gélekkel. Western-blot-analízishez mintákat elektroforézisnek vetettünk alá 4–15% gradiens Tris-HCl-géleken (BIO¹RAD, Hercules, CA), 1X Tris-glicin-SDS-puffer-

1

HU 008 015 T2

ben (BIO¹RAD, Hercules, CA) redukáló és denaturáló körülmények között. A géleket elektroblottoltuk 0,2 mikronos PVDF-membránszûrõkre. A fehérjéket immunológiailag detektáltuk primer ellenanyagként 2H2B8-jelû monoklonális ellenanyag, és szekunder ellenanyagként kecskében termeltetett, antiegér IgG (H+L), tormából származó peroxidázzal jelölt, egész ellenanyag (ZYMED LABORATORIES, South San Francisco, CA) alkalmazásával. 2H2B8-jelû monoklonális ellenanyagot (Mab) leírtuk a 9. példában. A szûrõket WESTERN LIGHTNING™ kemilumineszcenciás reagens (Chemiluminescence Reagent Plus kit, PERKIN-ELMER, Wellesley, MA) alkalmazásával kezeltük. Abból a célból, hogy rekombináns élesztõ ORF0657nH-régiójának (3. azonosító számú szekvencia) expresszióját analizáljuk, a mintákat elektroforézisnek vetettük alá 4–15% gradiens Tris-HCl-géleken (BIO¹RAD, Hercules, CA), 1X Tris-glicin-SDS-pufferben (BIO¹RAD, Hercules, CA) redukáló és denaturáló körülmények között. A géleket „Bio-Safe” Coomassieval (egy Coomassie G250 festék) festettük a gyártó (BIO¹RAD) által adott használati útmutató alapján. Élesztõsejt-lizátumból vett mintákat elektroforézisnek vetettünk alá, ahol a minták 0,5 és 1,25 mg, sorrendben, élesztõeredetû, celluláris összfehérjét tartalmaztak Western-blotban és Coomassie-festéshez. Coomassie-festéshez kvantitatív standardként tisztított BSA¹t (100X, NEW ENGLAND BIOLABS, Beverly, MA) alkalmaztunk. Kvalitatív standardként mindkét elemzéshez ORF0657nH-régiót (4. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalékkal) termelõ, E. coliból készített sejtlizátumot alkalmaztunk, amit ORF0657nHrégió termelésére indukáltunk. ORF0657nH-régió (4. azonosító számú szekvencia plusz karboxil His-toldalék) E. coliban történõ termeltetése céljából a termelõtörzset egy éjszakán át növesztettük 50 mg/ml kanamicint tartalmazó, LB¹tápközegben, 37 °C¹on. A következõ napon 500 ml, egyéjszakás tenyészettel beoltottunk 5,0 ml, 50 mg/ml kanamicint tartalmazó LB¹tápközeget. A tenyészetet 37 °C¹on növesztettük körülbelül 3 óra hosszáig, OD600 0,6¹ig. Az expressziót 1 mM IPTG hozzáadásával indukáltuk 3,5 óra hosszáig, 37 °C¹on. A sejteket elkülönítettük, és a sejtüledéket –80 °C¹on tároltuk. Az E. coliból lizátumot „Bugbuster Protein Extraction Reagent” (NOVAGEN, Madison, WI) alkalmazásával készítettünk, a gyártó által adott útmutató alapján. A fehérje méretének becslése céljából elõfestett standardeket futtattunk 10 és 250 kDa között (BIO¹RAD) párhuzamosan a lizátumokkal. A kezdeti szkríneléssel az 1260-jelû élesztõtörzs egyik transzformánsát, amit 1–1-ként jelöltünk, választottuk ki, mint az ORF0657nH-régió (3. azonosító számú szekvencia) legjobb termelõjét. Egy példát bemutatunk a 7A. és 7B. ábrán ORF0657nH-régió termelésére 72 órás fermentáció után, komplex YEHDG-tápközegben, rázott lombikokban. Coomassie-festéssel (A) és az ellenanyaggal (B) egyaránt detektált, fõ fehérje molekulatömege körülbelül 85 kDa (lásd az 5., 6. és 7. sávokat), és az E. coliból származó ORF0657nH-val (4. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalékkal;

5

10

15

20

25

30

35

40

2

2. sáv) vándoroltak együtt. Az E. coli által expresszált ORF0657n és az élesztõvel expresszált ORF0657n molekulatömege egyaránt nagyobb volt, mint a gélelektroforézis-rendszerünkben elõre jelzett méret. A körülbelül 85 kDa méretû fehérje detektálása specifikus volt; nem detektáltunk semmit a csak pGAL110vektort tartalmazó transzformánsból készült sejtlizátumban (3. sáv). Jelentõsen több ORF0657nH-régió (3. azonosító számú szekvencia) termelõdött, mint teljes hosszúságú ORF0657n-régió (28. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalék nélkül), az 5., 6. és 7. sávokat a 4. sávval összehasonlítva. A teljes hosszúságú ORF0657n¹t tartalmazó transzformánst egyidejûleg fermentáltuk, és ugyanolyan körülmények között, mint az ORF0657nH-régiót (3. azonosító számú szekvencia) tartalmazó transzformánst. Alig figyeltünk meg arra utaló jeleket, hogy az érett, élesztõben expresszált ORF0657nH-régió bomlana. A fehérje stabilitásának elemzése céljából az 1–1jelû transzformáns sejtlizátumából vett mintát, amit néhány napra lefagyasztottunk, és azt követõen felolvasztottunk, gélre vittük (7. ábra, 7. sáv). Látni lehet, hogy a minta integritása és mennyisége hasonló a friss mintákhoz (5. és 6. sávok). Az ORF0657nH-régióra (3. azonosító számú szekvencia) vonatkozóan a lebomlás hiányát és a stabilitást Western-blot alkalmazásával igazoltuk, a teljes hosszúságú, E. coli által termelt ORF0657n (28. azonosító számú szekvencia) ellen kecskében termeltetett, poliklonális ellenanyag alkalmazásával. Az ORF0657nH-régió (3. azonosító számú szekvencia) mennyiségének becslése Western-blot és Coomassie gél alapján körülbelül 360 mg volt 1 ml YEHDFtápközegben, és az összfehérje körülbelül 50%-ának becsülhetõ. Definiált tápközegben termelõdött mennyiség 225 mg volt 1 ml tenyésztési tápközegben, és az összfehérje körülbelül szintén 50%-ának becsülhetõ. Az ORF0657nH-régió mennyisége (3. azonosító számú szekvencia) a teljes hosszúságú ORF0657n-régió (28. azonosító számú szekvencia a karboxil His-toldalék nélkül) mennyiségéhez viszonyítva több volt (350 mg/ml a 10 mg/ml-hez képest, sorrendben), és az összfehérjére vonatkoztatott %¹os aránya szintén magasabb volt (50% a 20%-kal szemben).

45 12. példa: ORF0657nG-régiók (44. azonosító számú szekvencia) intracelluláris expressziója S. cerevisiae-ben ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidek exp50 resszióját elemeztük a következõ példában, ORF0657nG-régiót (44. azonosító számú szekvencia) kódoló DNS-konstrukció alkalmazásával. Az ORF0657nG (44. azonosító számú szekvencia) a 2. azonosító számú szekvencia rövidített változata, 55 amelybõl hiányzik az aminoterminális szignálszekvencia. A 44. azonosító számú szekvenciában megtalálható a 2. azonosító számú szekvenciában lévõ N¹terminális metionin és a 42–645. számú aminosavak. Élesztõben történõ expresszióra optimalizált kodo60 nokat tartalmazó, ORF0657nG-régiót (44. azonosító 25

1

HU 008 015 T2

számú szekvencia) kódoló DNS¹t pUnkCR1-bõl (7. példa) amplifikáltunk, az alábbi szensz és antiszensz oligonukleotidok alkalmazásával, sorrendben, 5’GGGGGGATCCCACAAAACAAAATGGCTGAAGAAACTG GTGG3’ (102. azonosító számú szekvencia), és 5’GGGGGGGATCCTTAGTTCTTTCTCTTTCTTGG¹3’ (103. azonosító számú szekvencia), szegélyezõ BamHI-enzim restrikciós hasítóhelyekkel. A szensz láncindító oligonukleotid 5’¹végi nem transzlálódó szekvenciát és ATG-kodont tartalmazott, és az antiszensz láncindító oligonukleotid TAA¹t tartalmazott stopkodonként. Az eredményül kapott 1,8 kb méretû terméket gélben izoláltuk, és TOPO TA pCR2.1-vektorba klónoztuk (INVITROGEN CORPORATION, Carlsbad, CA), a gyártó által adott útmutató alapján, így elõállítottuk a pCR_iUC-L4-plazmidot. Ezt követõen DNS-szekvencia-analízissel igazoltuk, hogy egyetlen deléció történt az 5’¹végen. Helyes szekvenciával rendelkezõ klónhoz úgy jutottunk, hogy a helyes szekvenciát tartalmazó, pCR_iUC¹S2.2 1,3 kb méretû HindIII/HindIII-fragmensét (lásd 11. példában leírtakat) kicseréltük a pCR_iUC¹L4 megfelelõ fragmensére. A pCR_iUCS2.2 1,3 kb méretû fragmensét és a pCRi_UC¹LA 4,4 kb méretû fragmensét gélben izoláltuk, és ligáltuk. A kívánt fragmenseket tartalmazó klónt, pCR_iUC-L¹t kiszelektáltuk, és az alkalmas orientációt és a nukleotidszekvenciát DNS-szekvenálással igazoltuk. Ezt követõen az 1,8 kb méretû BamHI-fragmenst szubklónoztuk pGAL110-vektorba, így elõállítottuk a piUC-L(–)¹t, és DNS-szekvenciáját igazoltuk. piUC-L(–)-ból származó plazmid DNS¹t alkalmaztunk 1260-jeIû S. cerevisiae törzs transzformálására leucinprototrófiára (Leu+), a 9. példában leírtak szerint. Számos élesztõtranszformánst szkríneltünk ORF0657nG-régió (44. azonosító számú szekvencia) intracelluláris termeltetésére, a 11. példában leírt fermentációs és sejtfeltárási körülmények között. 0,25–0,5 mg sejtlizátum-fehérjét analizáltunk ORF0657nG-termelésre Western-blot-analízissel, a 11. példában leírtak szerint. Kvantitatív standardként tisztított, E. coliból származó ORF0657nH¹t (4. azonosító számú szekvencia, karboxil His-toldalékkal) alkalmaztunk, és kvalitatív standardként ORF0657nG-régiót (44. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalékkal) termelõ, E. coliból készített sejtlizátumot alkalmaztunk, amit ORF0657nG-régió termelésére indukáltunk. A mintákat elektroforézisnek vetettük alá 4–15% gradiens Tris-HCl Criterion-géleken (BIO¹RAD, Hercules, CA), 1X Tris-glicin-SDS-pufferben (BIO¹RAD) redukáló és denaturáló körülmények között. A géleket elektroblottoltuk 0,2 mikronos PVDF-membránszûrõkre (BIO¹RAD). A fehérjéket immunológiailag detektáltuk Westernblotban, primer ellenanyagként tisztított, E. colival termeltetett, teljes hosszúságú ORF0657n (28. azonosító számú szekvencia a karboxil His-toldalék nélkül) elleni poliklonális ellenanyag, és szekunder ellenanyagként kecskében termeltetett, antiegér IgG (H+L), tormából származó peroxidázzal jelölt, egész ellenanyag (ZY-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2

MED LABORATORIES, South San Francisco, CA) alkalmazásával. A poliklonális ellenanyagot tisztított, E. coliban termeltetett, teljes hosszúságú ORF0657n-nel (28. azonosító számú szekvencia) végzett immunizálással állítottuk elõ. A szûrõket WESTERN LIGHTNING™ kemilumineszcenciás reagens (Chemiluminescence Reagent Plus kit, PERKIN-ELMER, Wellesley, MA) alkalmazásával kezeltük. Összehasonlítási célokból ORF0657nG-régiót (44. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalékkal) klónoztuk E. coli expressziós vekorba az 1. példában leírtak szerint, és expresszáltuk. Az ORF0657nG-régió E. coliban történõ termeltetése céljából a termelõtenyészetet egy éjszakán át növesztettük 50 mg/ml kanamicint tartalmazó, LB¹tápközegben, 37 °C¹on. A következõ napon 500 ml, egyéjszakás tenyészettel beoltottunk 5,0 ml, 50 mg/ml kanamicint tartalmazó LB¹tápközeget. A tenyészetet 37 °C¹on növesztettük körülbelül 3 óra hosszáig, OD600 0,6¹ig. Az expressziót 1 mM IPTG hozzáadásával indukáltuk 3,5 óra hosszáig, 37 °C¹on. A sejteket elkülönítettük, és a sejtüledéket –80 °C¹on tároltuk. Az E. coliból lizátumot készítettünk „Bugbuster Protein Extraction Reagent” (NOVAGEN, Madison, WI) alkalmazásával, a gyártó által adott útmutató alapján. A fehérje méretének becslése céljából elõfestett standardeket futtattunk 10 és 250 kDa között (BIO¹RAD) párhuzamosan a lizátumokkal. A kezdeti szkríneléssel az 1260-jelû élesztõtörzs egyik transzformánsát, amit iUC-L3-ként jelöltünk, választottuk ki, mint az ORF0657nG-régió legjobb termelõjét 72 órás fermentáció után, komplex YEHDG-tápközegben, tenyésztõcsövekben, a 11. példában leírtak szerint. Coomassie-festéssel vagy az ellenanyaggal egyaránt detektált, fõ fehérje molekulatömege körülbelül 85 kDa volt, és az E. coliban expresszált ORF0657nG-vel (44. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalékkal) vándorolt együtt. Az E. coli által expresszált ORF0657nG-régió és az élesztõvel expresszált ORF0657nG-régió molekulatömege egyaránt nagyobb volt, mint a gélelektroforézis-rendszerünkben elõre jelzett méret. A körülbelül 85 kDa méretû fehérje detektálása specifikus volt; nem detektáltunk semmit a csak pGAL110-vektort tartalmazó transzformánsból készült sejtlizátumban. Az ORF0657nG átlagos titerét három Western-blot-kísérletbõl határoztuk meg, ami 30 mg volt 1 ml YEHDG-tápközegben, és a fehérje %¹os arányát az összfehérje 10%-ának becsültük (lásd 13. példában lentebb leírtakat).

13. példa: A sejtfalszortírozó szignál eltávolítása növeli az intracelluláris expresszió mértékét Azt vizsgáltuk kodonoptimalizált, 31., 32. és 45. azonosító számú szekvenciával rendelkezõ, ORF0657n-gének alkalmazásával, hogy milyen hatást 55 fejt ki az ORF0657n karboxilsejt-szortáz C¹terminálisát kódoló régió eltávolítása egymagában, vagy kombinációban a szignálrégió N¹terminálisával. A 31. azonosító számú szekvencia kódolja a teljes hosszúságú ORF0657n-régiót. A 32. azonosító számú szekvencia 60 kódolja az ORF0657nH-régiót, amelybõl egyaránt 50

26

1

HU 008 015 T2

hiányzik az N¹terminális szekvencia és a C¹terminális sejtfalszortírozó régió. A 45. azonosító számú szekvencia kódolja az ORF0657nG-régiót, amelybõl csak a szignálpeptid-szekvencia hiányzik. Egy-egy transzformánst, amelyek egyenként a teljes hosszúságú ORF0657n-régiót (28. azonosító számú szekvencia a karboxil His-toldalék nélkül; rUnkC1transzformáns), az ORF0657nH-régiót (3. azonosító számú szekvencia; 1–1-transzformáns) és az ORF0657nG-régiót (44. azonosító számú szekvencia; iUC-L3-transzformáns) expresszálták, fermentáltunk, sejtlizátumokat készítettünk belõlük, és analizáltuk a 11. példában leírtak szerint. Egy reprezentatív Western-blotot bemutatunk a 9. ábrán. A különbözõ transzformánsokból készült, gélekre felvitt fehérje-sejtlizátum mennyisége nem volt ugyanannyi abból a célból, hogy kompenzálja a három, ORF0657n-régiókat kódoló konstrukció expressziójának eltérõ szintjeit. Az egyes esetekben legalább két különbözõ mennyiségû fehérje-sejtlizátumot vittünk fel az egyes ORF0657n-tartalmú transzformánsokból. Az eredmények tipikusan azt mutatták, hogy az ORF0657nH-régió (3. azonosító számú szekvencia) szignifikánsan jobban expresszálódott, mint a teljes hosszúságú ORF0657n-régió (28. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalék nélkül) vagy ORF0657nG-régió (44. azonosító számú szekvencia), a 9. ábrán bemutatottak szerint. Lényegi jel volt detektálható mindössze 50 és 100 ng sejtlizátum-fehérjével az ORF0657nH-régiót termelõ törzzsel, ami a 11. és 12. sávban látható. Ezzel ellentétben, a teljes hosszúságú ORF0657nG-régiót termelõ törzsbõl 1,0 és 2,0 mg sejtlizátum-fehérjét alkalmaztunk, 7. és 8. sáv, sorrendben. Az ORF0657nG-régióra kevesebb fehérjével is megfelelõ jelet detektáltunk, 250 és 500 ng fehérjét vittünk fel, a 14. és 15. sávban látható. A 4. táblázatban bemutatjuk az átlagos titer összehasonlítását a három ORF¹re, és az összfehérje %¹át három független Western-blot-kísérletbõl meghatározva. A sejtlizátumokat frissen készítettük az egyes Western-blotokhoz. Az átlagok két független fermentációból származó eredményeket tartalmaznak. Az ORF0657n specifikus mennyiségét a tisztított, E. coliból származó ORF0657nH-standardhez (4. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalékkal) viszonyítva határoztuk meg.

szekvencia a karboxil His-toldalék nélkül) és az ORF0657nG-régió (44. azonosító számú szekvencia) expressziójához viszonyítottan meghatározva. A szignálpeptid és a sejtfalszortírozó szekvencia (mindkettõ) 5 eltávolítása 8–14-szeresére növelte az expresszió mértékét ahhoz képest, ha csak a szignálpeptid-szekvenciát távolítottuk el (G¹ és H¹régió összehasonlítása), és 20–42,5-szeresére növelte az expresszió mértékét a teljes hosszúságú fehérjéhez képest (C¹ és 10 H¹régió összehasonlítása). Az expresszió fokozódása a sejtfalszortírozó szekvencia eltávolításának hatására nem volt várható ilyen nagyságrendben.

15

20

25

30

35

40

45

4. táblázat Termelt ORF0657n

Titer, mg/ml, YEHD G-tápközeg

% összfehérje

C

10,0

4,0

G

30,0

10,0

H

425,0

80,0

A szignálpeptid eltávolítása 2,5–3-szorosára növelte az összfehérje (%) mennyiségét és a titert, a teljes hosszúságú ORF0657n-régió (28. azonosító számú

2

50

55

60 27

14. példa: ORF0657nl-régió intracelluláris expressziója S. cerevisiae-ben ORF0657nl-régiót kódoló, élesztõben történõ expresszióra optimalizált kodonokat tartalmazó DNS¹t (33. azonosító számú szekvencia) pUnkCR-1-bõl (7. példa) amplifikáltunk, a következõ szensz és antiszensz láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, 5’CTCCGGATCCCACAAAACAAAATGGCTGAAGAAACTGGT3’ (104. azonosító számú szekvencia) és 5’GCTGCCGGGATCCTTATGGGGTTGGCTTAGATGGGGTAG3’ (105. azonosító számú szekvencia), szegélyezõ BamHI-enzim restrikciós hasítóhelyekkel (aláhúzva). A szensz láncindító oligonukleotid 5’¹végi nem transzlálódó vezetõszekvenciát és ATG-kodont tartalmazott, és az antiszensz láncindító oligonukleotid TAA¹t tartalmazott stopkodonként. Az eredményül kapott 1,3 kb méretû terméket gélben izoláltuk, és pGAL110¹be klónoztuk (5A. ábra), a piUC-I-plazmid (5B. ábra) elõállítása céljából, és DNS-szekvenciáját igazoltuk. piUC-I-bõl származó plazmid DNS¹t alkalmaztunk az 1260. jelû S. cerevisiae törzs transzformálására leucinprototrófiához (Leu+), a 9. példában leírtak szerint. Három Leu+-transzformánst szkríneltünk ORF0657nIrégió (1. azonosító számú szekvencia) intracelluláris termelésére, kis méretben végzett (5,0 ml¹es tenyészet) fermentáció alkalmazásával, a 9. példában leírtak szerint. A termelést olyan ORF0657nH-régió (3. azonosító számú szekvencia) termeléséhez viszonyítottuk, amit az 1–1-jelû S. cerevisiae transzformáns termelt (lásd 11. példát). Sejtlizátumokat preparáltunk a 9. példában leírtak szerint, és 100 és 200 ng élesztõ-sejtlizátumfehérjét analizáltunk ORF0657nI és ORF0657nH termelésére félkvantitatív Western-blot-analízissel, a 11. példában leírtak szerint. Tisztított E. coliból származó ORF0657nH¹t (4. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalékkal) alkalmaztunk kvantitatív standardként. A mintákat elektroforézisnek vetettük alá 10–20% gradiens Tris-HCl Criterion-géleken (BIO¹RAD, Hercules, CA), 1X Tris-glicin-SDS-pufferben (BIO¹RAD) redukáló és denaturáló körülmények között. A géleket elektroblottoltuk 0,2 mikronos PVDF-membránszûrõkre (BIO¹RAD). A fehérjéket immunológiailag detektáltuk Western-blotban, primer ellenanyagként E. coliból származó teljes hosszúságú ORF0657n (28. azonosító számú szekvencia) elleni poliklonális ellenanyag, és

1

HU 008 015 T2

szekunder ellenanyagként kecskében termeltetett, antiegér IgG (H+L), tormából származó peroxidázzal jelölt, egész ellenanyag (ZYMED LABORATORIES, South San Francisco, CA) alkalmazásával. A poliklonális ellenanyagot E. coliban termeltetett, teljes hosszúságú ORF0657n-nel (28. azonosító számú szekvencia) végzett immunizálással állítottuk elõ. A szûrõket WESTERN LIGHTNING™ kemilumineszcenciás reagens (Chemiluminescence Reagent Plus kit, PERKIN-ELMER, Wellesley, MA) alkalmazásával kezeltük. A fehérje méretének becslése céljából elõfestett standardeket futtattunk 10 és 250 kDa között (BIO¹RAD), párhuzamosan a lizátumokkal. A 11. ábrán bemutatjuk a komplex YEHDG-tápközegben, tenyésztõcsövekben végzett, 72 órás fermentációból származó eredményeket. Élesztõvel expresszált ORF0657nH-régió (3. azonosító számú szekvencia) kimutathatósága erõs volt, az 5., 6., 14., 15., 21. és 22. sávokban látható. ORF0657nl (1. azonosító számú szekvencia) expresszálására tervezett transzformánsokban egy körülbelül 60 kDa méretû fehérje szintén könnyen detektálható volt, a 7–12. és 16–21. sávokban látható. Az élesztõben expresszált ORF0657nl (1. azonosító számú szekvencia) együtt vándorolt az E. coliban expresszált és abból tisztított ORF0657nl-lel (5. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalékkal) (az adatokat nem mutatjuk). Az E. coliban expresszált ORF0657nl-régió és az élesztõben expresszált ORF0657nl-régió molekulatömege egyaránt nagyobb volt, mint a gélelektroforetikus rendszerünkben elõre jelzett méret. A 60 kDa méretû fehérje detektálása ORF0657nl-régió (1. azonosító számú szekvencia) expresszálására tervezett transzformánsokban specifikus volt; nem detektáltunk fehérjét olyan sejtlizátumban, amely kontrollvektor transzformánsaiból származott (4. és 13. sávok). Az ORF0657nH-régió (3. azonosító számú szekvencia) és az ORF0657nl-régió (1. azonosító számú szekvencia) mennyiségét gélen félkvantitatív Westernblotból becsültük, ismert mennyiségû, tisztított ORF0657nH-val (4. azonosító számú szekvencia karboxil His-toldalékkal). A titereket és az összfehérjére vonatkoztatott százalékos fehérjetartalmat átlagként határoztuk meg két lizátumból, amely két különbözõ fehérjemennyiséget tartalmazott a gélen. Az ORF0657nH-régió (3. azonosító számú szekvencia) volumetrikus titere frissen fermentált mintából és fagyasztott sejtlizátumból meghatározva összehasonlítható volt, körülbelül 500 mg/ml és körülbelül 550 mg/ml a tenyésztési tápközegben, és 320 mg ORF0657nl-régió (1. azonosító számú szekvencia) termelõdött 1 ml tenyésztési tápközegben (ORF0657nl-régióra a titert az l1¹transzformánsra kaptuk). Az ORF0657nl-régió (3. azonosító számú szekvencia) százalékos aránya az összfehérjére vonatkoztatva 78% és 80%, sorrendben, míg az ORF0657nl (1. azonosító számú szekvencia) az összfehérje 45%¹a volt. Tehát az ORF0657nl-régió jól expresszálódott S. cerevisiae-ben, körülbelül 1,5-szer alacsonyabb titerrel, mint az ORF0657nH (3. azonosító számú szekven-

2

cia), és az összfehérjére vonatkoztatott %¹a körülbelül 1,3-szer alacsonyabb volt. ORF0657nl-régió jól expresszálódott élesztõben, amit a sejtlizátumokat tartalmazó SDS-PAGE-gél Coomassie-festésével igazol5 tunk. ORF0657nl-régió YEDHG-tápközegben méretnövelhetõ volt: 125 ml¹es vagy 2 literes rázott lombikokban a termelés összehasonlítható volt kisebb léptékû tenyésztõcsövekben kapott expresszióval. ORF0657nl-régió (1. azonosító számú szekvencia) 10 jól expresszálódott leucin nélküli, 5X definiált tápközegben (a 9. példában leírt tápközeg). A titer csak körülbelül 1,5-szer volt alacsonyabb, mint a titer YEHDG komplex tápközegben, míg az összefehérjére vonatkoztatott %¹os arány összehasonlítható volt a két táp15 közegben. Az ORF0657nl integritása jó volt mindkét tápközegben, jelentõs bomlást nem detektáltunk. ORF0657nl termelése 72 óra elteltével nagyobb volt, mint 96 óra után a komplex és a leucin nélküli 5X tápközegben, ha rázott lombikos fermentációkban tesztel20 tük.

25

30

35

40

45

50

55

60 28

15. példa: ORF0657nH¹t (3. azonosító számú szekvencia) termelõ élesztõtörzs nagyméretû fermentációja Az 1–1-jelû élesztõtörzs fagyasztott oltóanyagtörzsoldatát [piUC¹S(–)-plazmiddal transzformált 1260. törzs; a 11. példában leírtak szerint] alkalmaztuk nagyméretû fermentációra és tisztításra. Az oltóanyagtörzsoldatot tartalmazó edény tartalmát felolvasztottuk, és 1,0 ml¹t használtunk fel egy 250 ml¹es Erlenmeyerlombik beoltására, amelyben 50 ml leucinmentes, 5% glükózt tartalmazó, szelektív tápközeg volt [5X Leu– tápközeg; Bayne és munkatársai, Gene 66, 235–44 (1988)]. A lombikot 28 °C¹on, 250 rpm¹en inkubáltuk rotációs rázógépen. 24 óra elteltével (maradék glükóz 23,5 g/l) 13 ml térfogatú tenyészetet adagoltunk egy 2 literes lombikba, amely 877 ml ugyanilyen tápközeget tartalmazott. A lombikot ismét 28 °C¹on inkubáltuk, és 250 rpm¹en kevertettük. 24 óra elteltével (maradék glükóz 4,04 g/l) a 2 literes lombik tartalmát használtuk egy 20 literes reaktor beoltására, amely kémiailag definiált tápközeget tartalmazott [Oura, Biotechnol. Bioengineer 16, 1197 (1974)], amely az alkalmazott törzsre volt optimalizálva. Ez a tápközeg 20 g/l glükózt tartalmazott, amelyet 25 g/l galaktóz követett indukcióhoz. A reaktor üzemeltetési körülményei 28 °C, 4,7 liter/perc, 15 psig és 300 rpm volt. Ilyen körülmények között az oldott oxigén szintjét nagyobb mint 30%¹os telítettségen tartottuk. A celluláris növekedést a glükóz fogyasztásával, optikai sûrûség (A600 nm, 1 cm¹es küvetta), száraz sejttömeg, galaktózfelhasználás és etanoltermelés mérésével követtük. A tenyésztést 90 óráig végeztük, amire az A600 33,9¹et és a száraz sejttömeg 17,5 g/l értéket elért. A tenyészetet üreges szálas („hollow fiber”) tangenciális szûrõrendszerrel (AMICON Hump01–43 kazetta) különítettük el, AMICON DC¹10 „harvest skid” (NELLEPORE, Billerica, MA) alkalmazásával. A permeátumot kidobtuk, és a sejteket töményítettük, diafiltráltuk PBS-sel, és centrifugálással ülepítettük

1

HU 008 015 T2

8000 rpm¹en, 4 °C¹on, 20 percig, Sorvall Evolution RC (SLA 3000 rotor) alkalmazásával. A sejteket –70 °C¹on tároltuk. Az 1–1-jelû törzs által, nagyméretû fermentációban az ORF0657nH-termelés elemzéséhez sejtlizátumokat készítettünk a 10 OD600-egységes sejttenyészetbõl, és a 11. példában részletesen leírtak szerint elemeztük (az eredményeket nem mutatjuk be). Az ORF0657nH termelését rázott lombikban végzett fermentációkból (72 órás, komplex YEHDG-tápközeg) is meghatároztuk. Western-blot-analízisek (a 11. példában leírtak szerint végezve) eredményei azt mutatják, hogy a nagyméretû fermentációban termeltetett fehérje együtt vándorolt a rázott lombikban végzett fermentációban termelõdött ORF0657nH-val (az eredményeket nem mutatjuk). Nagyméretû fermentációból (20 literes) származó ORF0657nH titerét 739 mg/ml-nek és az összefehérje 55%-ának becsültük, ahhoz képest, hogy a rázott lombikban végzett fermentációból ORF0657nH titerét 732 mg/ml-nek és az összefehérje 58%-ának becsültük (a 11. példában leírt, félkvantitatív Western-blot-módszer alkalmazásával). Ezek az eredmények igazolják, hogy az élesztõvel végzett ORF0657n-termelést méretnövelni lehet.

tern-blotban, ORF0657n-fehérjére specifikus antiszérum (28. azonosító számú szekvenciával rendelkezõ, teljes hosszúságú ORF0657n ellen termeltetett) alkalmazásával. A terméket tartalmazó frakciókat egyesí5 tettük. A SEC-terméket sterilre szûrtük 0,2 mikronos cellulóz-acetáton, steril körülmények között. A sterilre szûrt termék tisztasága 94% ³ vagy nagyobb volt SDS-PAGE és Western-blot alkalmazásával kimutatva. A steril10 re szûrt terméket 0,2 mg/ml koncentrációban szereltük ki AHP-vel és timerozállal. Azt, hogy élesztõben termeltetett, ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidek képesek védelmet eredményezõ immunitást biztosítani, a 10. ábrán szemlél15 tetjük. Élesztõben expresszált ORF0657nH (3. azonosító számú szekvencia) az E. coliban expresszált polipeptiddel egyenértékû, védelmet eredményezõ immunitást biztosított. 20

25 16. példa: Élesztõben termeltetett, ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidek védelmet eredményezõ immunitása Élesztõben termeltetett ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidek védelmet eredményezõ immunitást biztosító képességét elemeztük úgy, hogy a 3. azonosító számú polipeptidet expresszáltuk élesztõben. E. coliban expresszált teljes hosszúságú ORF0657nC¹t (28. azonosító számú szekvencia), ORF0657nH¹t (4. azonosító számú szekvencia, karboxiterminális His-toldalékkal), ORF0657nl¹t (5. azonosító számú szekvencia karboxiterminális His-toldalékkal) és kontrollként adjuvánst egymagában alkalmaztunk. A 3. azonosító számú, ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidet élesztõbõl nyertük ki, és állatmodellben védelmet eredményezõ immunitás kialakítására alkalmaztuk. A 3. azonosító számú polipeptidet a 11. példában leírtak szerint expresszáltuk. Fagyasztott, rekombináns (3. azonosító számú szekvenciával rendelkezõ) ORF0657nH¹t expresszáló S. cerevisiae sejteket újra felszuszpendáltunk 5 ml/gramm nedves sejttömeg sûrûségben 0,2 M MOPS, pH=7,0 pufferben, amely proteázinhibitorokat tartalmazott (EDTA-mentes). Lizátumot úgy készítettünk, hogy átnyomtuk négyszer mikrofluidizálón 14 000 psi nyomáson (Microfluidics Model 110S). A lizátumot centrifugálással tisztítottuk (10 000×g, 20 percig, 2–8 °C), ezt követõen durva szûréssel (üvegszálas elõszûrõ, Millipore) és finom szûréssel (0,2 mm cellulóz-acetát, Whatman) tisztítottuk. A tisztított lizátumot méretkizáráson alapuló kromatográfiás (SEC) oszlopon (Pharmacia HiPrep 20/60 Sephacryl S¹300 HR, mozgófázis: 0,2 M MOPS, pH=7,0) frakcionáltuk. A frakciókat SDS-PAGE-val analizáltuk, Coomassie-detektálással és Wes-

2

30

35

40

45

50

55

60 29

17. példa: Anamnesztikus válasz nem humán fõemlõsökben Három csoport rhesusmajmot immunizáltunk élesztõben termeltetett, ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptiddel (ORF0657nH, 3. azonosító számú szekvencia) vagy E. coliban expresszált, ORF0657-tel rokon szerkezetû polipeptiddel (teljes hosszúságú ORF0657n, 28. azonosító számú szekvencia), AHP-vel vagy anélkül kiszerelve. A vakcinát kapott csoportban lévõ majmok 50 mg ORF0657n-nel rokon szerkezetû polipeptidet kaptak intramuszkulárisan. A 12. ábrán bemutatottak szerint a vakcinát kapott állatok egyetlen dózis után választ adtak, amelyben a titerek geometriai középértéke az elõzetesen meglévõ, mérsékelt titerek 3–6-szorosára növekedtek, ami alapján feltételezzük, hogy anamnesztikus válasz alakult ki. Ezzel ellentétben a kontrollcsoportban lévõ állatokban a titerek geometriai középértéke ugyanakkora maradt (az ellenanyagot vizsgáló eljárás variabilitásával). A vakcina második dózisa után az elsõ dózis után mért titerek geometriai középértéke a vakcinát kapott csoportban és a kontrollcsoportban nagyon kis mértékben változtak az elsõ dózis után mért titerekhez képest. Az elsõ dózis utáni ellenanyagválaszok kialakulásának megfigyelése céljából az élesztõben expresszált ORF0657H-régiót (3. azonosító számú szekvencia) kapott csoport megfigyelését 3 hónapig (az utolsó tesztelt pont) végeztük. Az ellenanyagtiterek folyamatosan emelkedtek, amíg 9 nap után elértek egy olyan szintet, ami nem növekedett 2 vagy 3 vakcinadózis után sem. A megfigyelések alapján feltételezzük, hogy egy dózis vakcina képes lényegi és tartós ellenanyagválaszt kiváltani az immunrendszer természetesen kialakult memóriája („prime”) után, ami valószínûleg a környezetben jelen lévõ S. aureus hatásának következménye. Elõzetesen fennálló ellenanyagtiterek átvizsgálása emberekben azt mutatta, hogy ORF0657n-nel szemben mérsékelt ellenanyagtiterek valamennyi tesztelt mintában voltak (az adatokat nem mutatjuk).

1

HU 008 015 T2

A szekvencialistában található szabad szövegek (223. kód) fordítása sz.=azonosító számú szekvencia 1. sz.: ORF0657nl aminoterminális metioninnal 3. sz.: ORF0657nH aminoterminális metioninnal 4–5. sz.: ORF0657nH aminoterminális metionin-glicinnel 6–27. sz.: ORF0657nH 28. sz.: 2. sz. szekvencia úgy módosítva, hogy glicint tartalmaz az aminoterminális metionin után, és karboxil His-toldalékot tartalmaz 29. sz.: teljes hosszúságú ORF0657n+karboxil Histoldalék 30. sz.: ORF1657nH+karboxil His-toldalék 31. sz.: 28. sz. szekvenciát kódol karoboxil His-toldalék nélkül, és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra 32. sz.: 3. sz. szekvenciát kódol, és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra 33. sz.: 1. sz. szekvenciát kódol, és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra 34–41. sz.: 7. sz. szekvenciát kódol, aminoterminális metionint tartalmaz, és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra 42. sz.: ORF0657nl+ 43. sz.: 42. sz. szekvenciát kódol, és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra 44. sz.: ORF0657nG 45. sz.: 44. sz. szekvenciát kódol, aminoterminális metionint tartalmaz, és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra 46. sz.: 17. sz. szekvenciát kódol, aminoterminális metionint tartalmaz, és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra 47. sz.: 17. sz. szekvencia 1+régiót kódol, kodonoptimalizált élesztõexpresszióra, és metionin iniciációs kodont kódol 48. sz.: 17. sz. szekvencia 1¹régiót kódol, kodonoptimalizált élesztõexpresszióra, és metionin iniciációs kodont kódol 49. sz.: 17. sz. szekvenciát tartalmazó, teljes hosszúságú ORF0657n¹t kódol, módosítva van úgy, hogy glicint tartalmaz az aminoterminális metionin után, és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra 50. sz.: 20. sz. szekvenciát kódol, kodonoptimalizált élesztõexpresszióra, és metionin iniciációs kodont kódol 51. sz.: 20. sz. szekvencia 1+régiót kódol, kodonoptimalizált élesztõexpresszióra, és metionin iniciációs kodont kódol 52. sz.: 20. sz. szekvencia 1¹régiót kódol, kodonoptimalizált élesztõexpresszióra, és metionin iniciációs kodont kódol 53. sz.: 20. sz. szekvenciát tartalmazó, teljes hosszúságú ORF0657n¹t kódol, módosítva van úgy, hogy glicint tartalmaz az aminoterminális metionin után, és kodonoptimalizált élesztõexpresszióra 54–63. sz.: ORF0657nH 64. sz.: His-toldalék 65–68. és 94–105. sz.: láncindító oligonukleotid 69–93. sz.: ORF0657n-oligomer

2

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 30

1. Immunogén polipeptid, amely az 1. azonosító számú szekvenciával (SEQ ID NO: 1) legalább 90%osan megegyezõ aminosavszekvenciát tartalmaz, ahol a polipeptid védelmet eredményezõ immunitást biztosít S. aureus ellen, és ahol, ha egy vagy több további polipeptidrégió van jelen, ezek a további régiók nem képezik a 2. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 2) 609–645. aminosavait tartalmazó karboxiterminális véget. 2. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, ahol a polipeptid a 3. azonosító számú szekvenciával (SEQ ID NO: 3) legalább 90%-osan megegyezõ aminosavszekvenciából vagy fragmensébõl áll, amely az 1. azonosító számú szekvenciával (SEQ ID NO: 1) legalább 90%osan megegyezõ aminosavszekvenciát tartalmaz. 3. A 2. igénypont szerinti polipeptid, ahol a polipeptid 3. azonosító számú szekvenciával (SEQ ID NO: 3) legalább 94%-osan megegyezõ aminosavszekvenciából vagy fragmensébõl áll, amely az 1. azonosító számú szekvenciával (SEQ ID NO: 1) legalább 94%-osan megegyezõ aminosavszekvenciát tartalmaz. 4. A 3. igénypont szerinti polipeptid, ahol a polipeptid 1., 3. vagy 42. azonosító számú szekvenciával (SEQ ID NO: 1, 3 vagy 42) legalább 94%-osan megegyezõ aminosavszekvenciából vagy fragmensébõl áll. 5. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, ahol a polipeptid az 1., 3. vagy 42. azonosító számú szekvenciával (SEQ ID NO: 1, 3 vagy 42) rendelkezik; vagy maximum 25 aminosav megváltoztatásával különbözik a szekvenciáktól. 6. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, ahol a polipeptid az 1., 3. vagy 42. azonosító számú szekvenciával (SEQ ID NO: 1, 3 vagy 42) rendelkezik; vagy maximum 10 aminosav megváltoztatásával különbözik a szekvenciáktól. 7. A 6. igénypont szerinti polipeptid, ahol a polipeptid az 1., 3. vagy 42. azonosító számú szekvenciával (SEQ ID NO: 1, 3 vagy 42) rendelkezik; vagy maximum 5 aminosav megváltoztatásával különbözik a szekvenciáktól. 8. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, ahol a polipeptid az 1., 3. vagy 42. azonosító számú szekvenciával (SEQ ID NO: 1, 3 vagy 42) rendelkezik. 9. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, ahol a polipeptid az 1., 3., 7., 17., 20. vagy 42. azonosító számú szekvenciából (SEQ ID NO: 1, 3, 7, 17, 20 vagy 42) és maximum 20 további aminosavból áll. 10. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, ahol a polipeptidet az 1., 17. vagy 20. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 1, 17 vagy 20) építi fel. 11. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, amely mentes minden vagy legtöbb olyan más polipeptidtõl, melyekkel a polipeptid természetes körülmények között asszociálva van. 12. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti polipeptidekbõl álló immunogén, ahol az immunogén az aminosavszekvenciából és egy vagy több olyan további régióból vagy csoportból áll, amely kovalensen kap-

1

HU 008 015 T2

csolódik a szekvenciához a karboxiterminálisnál vagy az aminoterminálisnál, ahol az egyes régiók vagy csoportok egymástól függetlenül olyan régiók vagy csoportok közül vannak kiválasztva, amelyek a következõ tulajdonságok közül legalább eggyel rendelkeznek: fokozzák az immunválaszt, elõsegítik a tisztítást vagy elõsegítik a polipeptid stabilitását. 13. Védelmet eredményezõ immunválaszt egy páciensben indukálni képes készítmény, amely az 1–12. igénypontok bármelyike szerinti immunogén immunológiailag hatásos mennyiségét és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz. 14. A 13. igénypont szerinti készítmény, ahol a készítmény adjuvánst is tartalmaz. 15. Rekombináns gént tartalmazó nukleinsav, amely 1–10. igénypontok bármelyike szerinti, immunogén polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz. 16. A 15. igénypont szerinti nukleinsav, ahol a rekombináns gén nem tartalmaz sejtszignálpeptidet kódoló szekvenciát, és nem kódol sejtfalszortírozó szignálszekvenciát. 17. A 16. igénypont szerinti nukleinsav, ahol a rekombináns gén tartalmaz egy vagy több, élesztõben történõ expresszióra optimalizált kodont. 18. A 17. igénypont szerinti nukleinsav, ahol a nukleotidszekvencia legalább 50%-ban olyan kodon, amely élesztõben történõ expresszióra van optimalizálva. 19. A 16. igénypont szerinti nukleinsav, ahol a nukleotidszekvencia a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 és 53. 20. A 15. vagy 19. igénypont szerinti nukleinsav, ahol a nukleinsav egy expressziós vektor. 21. Rekombináns sejt, amely 15–20. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavat tartalmaz.

5

10

15

20

25

30

35

31

2

22. Eljárás S. aureusból származó, védelmet eredményezõ immunitást biztosítani képes polipeptid elõállítására, amely tartalmazza a következõ lépéseket: a) a 21. igénypont szerinti, rekombináns sejtet olyan körülmények között növesztjük, ahol az 1–11. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid expresszálódik; és b) tisztítjuk a polipeptidet. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, ahol a rekombináns sejt S. cerevisiae. 24. Az 1–12. igénypontok bármelyike szerinti immunogén emberi test terápiás kezelésére szolgáló eljárásban történõ alkalmazásra. 25. A 24. igénypont szerinti immunogén, S. aureus elleni védelmet eredményezõ immunitás biztosítására. 26. A 25. igénypont szerinti immunogén, ahol a páciens ember. 27. A 25. igénypont szerinti immunogén, ahol a pácienst profilaktikusan kezeljük S. aureus fertõzés ellen. 28. A 24. igénypont szerinti immunogén, anamnesztikus válasz indukálására. 29. A 28. igénypont szerinti immunogén, ahol az anamnesztikus válasz a geometriai titer legalább 3¹szoros növekedését eredményezi 3 napon belül, az elõzõleg fennálló titerhez képest. 30. Az 1–12. igénypontok bármelyike szerinti immunogén alkalmazása a 25–29. igénypontok bármelyikében definiált eljárásban történõ alkalmazásra szolgáló gyógyszer gyártására. 31. Az 1–12. igénypontok bármelyike szerinti immunogén a következõk közül kiválasztott, további immunogénekkel kombinációban: egy vagy több további, S. aureusból származó immunogén; egy vagy több immunogén, amely egy vagy több, más Staphylococcus organizmust képes célba venni; és egy vagy több immunogén, amely más fertõzõ organizmusokat képes célba venni.

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

32

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

33

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

34

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

35

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

36

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

37

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

38

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

39

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

40

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

41

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

42

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

43

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

44

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

45

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

46

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

47

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

48

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

49

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

50

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

51

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

52

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

53

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

54

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

55

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

56

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

57

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

58

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

59

HU 008 015 T2 Int. Cl.: A61K 39/085

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest

(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Recommend Documents