!HU000004684T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 004 684
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 38/19
(21) Magyar ügyszám: E 04 778434 (22) A bejelentés napja: 2004. 07. 16. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040778434 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1651247 A1 2005. 01. 27. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1651247 B1 2008. 09. 10.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 488263 P 2003. 07. 18.
(73) Jogosult: SCHERING CORPORATION, Kenilworth, New Jersey 07033-0530 (US)
US
(72) Feltaláló: OFT, Martin, San Francisco, CA 94122 (US)
(54)
(2006.01) G01N 33/574 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05007186 PCT/US 04/022928
(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest
Neoplazmák kezelése és diagnózisa csecsemõmirigy-stróma eredetû limfopoietin alkalmazásával
(57) Kivonat
HU 004 684 T2
A találmány tárgyát képezi tumorok kezelése csecsemõmirigy-stróma eredetû limfopoietin („Thymic Stromal Lymphopoietin”, TSLP) beadásával. Neoplazmák diag-
nosztizálása adott mintának TSLP elleni vagy TSLPR elleni ellenanyaggal történõ érintkeztetésével, valamint a képzõdött ellenanyag-antigén komplex detektálásával.
A leírás terjedelme 16 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 004 684 T2
A bejelentésben a 2003. július 18¹án benyújtott, 60/488,263 számú, USA-beli ideiglenes bejelentés elsõbbségét igényeljük. A találmány szakterülete A találmány tárgyát képezik emlõseredetû citokinmolekulák és hasonló reagensek általános alkalmazásai. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezi olyan, emlõseredetû citokinszerû proteinek és inhibitoraik azonosítása, amelyek alkalmazhatók rák kezelésére. A technika állása A rák progresszív betegség, amely jól körülírt lépések sorozatában nyilvánul meg, általában aktiváló vagy inaktiváló mutációk következményeként. Ezek a mutációk gyakran késztetnek proliferáló sejteket önálló szaporodásra, tesznek érzéketlenné szaporodást gátló szignálok iránt, rezisztenssé terminális differenciálódási, öregedési vagy apoptózis programok iránt, valamint ruházzák fel azokat a korlátlan önmegújulás képességével, fenntartott angiogenezis (érképzõdés) megszervezésének és irányításának a képességével, valamint ektópiás szöveti környezetbe való benyomulás és növekedés képességével [lásd például Hanahan és Weinberg: Cell. 100, 57–70 (2000)]. Emlõsök immunválasza komplex sejtes kölcsönhatások sorozatán alapszik, amelyet „immunhálózatnak” („immune network”-nek) nevezünk. A közelmúlt kutatásai új betekintést engedtek e hálózat belsõ mûködésébe. Míg egyfelõl világos, hogy az immunválasz nagy része limfociták, makrofágok, granulociták és más sejtek hálózatszerû kölcsönhatásai körül forog, immunológusok általános véleménye az, hogy ezen sejtes kölcsönhatások irányításában fontos szerepet játszanak oldható proteinek, ismert néven limfokinek, citokinek vagy monokinek. A limfokinek számos úton mediálnak sejtes aktivitásokat. Kimutatták róluk, hogy támogatják azt a folyamatot, amely során pluripotens hematopoietikus õssejtek komplex immunrendszert alkotó, eltérõ sejtvonalakat tartalmazó, nagyszámú progenitorsejtekké proliferálódnak, szaporodnak és differenciálódnak. Egészséges immunválaszhoz a sejtes komponensek közötti helyes és kiegyensúlyozott kölcsönhatásokra van szükség. A közelmúltban egy új, IL–7-szerû citokint klónoztak egéreredetû csecsemõmirigy-stróma sejtvonalból, amelyet csecsemõmirigy-stróma limfopoietinként („thymic stromal lymphopoietin”, TSLP) azonosítottak [lásd például J. E. Sims és mtsai.: J. Exp. Med. 192, 671–680 (2000); USSN 09/963 347, benyújtva 2000. szeptember 24; és az 1. és 2. azonosító számú szekvenciák]. A TSLP aktivitása átfedi az IL–7 aktivitását; mindkettõ stimulálja a timocitákat és érett T¹sejteket, és elõsegíti B¹limfociták képzõdését magzati máj- és csontvelõ-eredetû limfocita prekurzorok tenyészetében. Megállapították továbbá, hogy a TSLP receptora egy heterodimer, amely egy IL–7Ra láncot és egy közös g¹szerû receptorláncot tartalmaz [lásd például Reche és mtsai.: J. Immunol. 167, 336–343 (2001); Y. Tonozuka és mtsai.: Cytogenet. Cell. Genet. 93, 23–25
2
(2001); A. Pandey és mtsai.: Nat. Immunol. 1, 59–64 (2000); L. S. Park és mtsai.: J. Exp. Med. 192, 659–670 (2000); és a 3., 4., 5. és 6. azonosító számú szekvenciák]. Rák kialakulása és metasztázis képzõdése többlé5 péses folyamat, amely helyi neoplasztikus növekedést és inváziót tartalmaz, és amelyet távoli helyekre történõ disszemináció (szóródás) és újraképzõdés követ. A neoplazma vagy tumor tartalmazhat transzformált 10 sejteket, strómasejtes infiltrációt, valamint az immunrendszer sejtjeit. A rákbetegek mortalitásának sarkalatos meghatározója a tumor metasztatizáló tulajdonsága. Beszámoltak a TGF¹b tumorok szuppressziójában és progressziójában betöltött szerepérõl [lásd például 15 Oft és mtsai.: Nat. Cell Bio. 4, 487–494 (2002)]. Metasztázis, veleszületett immunitás és rák közötti összefüggést mediáló számos molekuláris és sejtes mechanizmus még nem tisztázott. TGF¹b expresszálódása tumorokban elõsegíti metasztázisok kialakulását. Talál20 mányunk arra utal, hogy a TSLP¹t a TGF¹b szuppresszálja.
25
30
35
40
45
50
A találmány összefoglalása Találmányunk azon a felismerésen alapul, hogy a TSLP immunmodulátor expresszálódása tumor progressziója alatt csökken, és exogén TSLP beadása tumor regresszióját eredményezi. A találmány tárgyát képezi TSLP vagy agonistájának alkalmazása gyógyászati készítmény elõállítására, amely alkalmas neoplazma kezelésére vagy neoplazma kialakulásának megelõzésére. A neoplazma olyan tumor, amely rákos és epithelialis eredetû, ilyen például az emlõtumor, vastagbéltumor, tüdõtumor, petefészektumor vagy prosztatatumor. A tumor progressziójának gátlása megnyilvánulhat a tumor rejekciója formájában. A tumor rejekciója a tumor méretének csökkenésében vagy metasztatizáló tulajdonságának elvesztésében nyilvánulhat meg. További megvalósítási módok szerint a neoplazma dendrikus sejteket tartalmaz, és az agonista lehet a TSLP muteinje, kis molekula vagy agonista ellenanyag (antitest). Bizonyos megvalósítási módok szerint, a TSLP vagy agonistája elõállítható vakcinaadjuvánsként. A találmány tárgyát képezi továbbá in vitro eljárás neoplazma diagnózisára, amely eljárás tartalmazza adott alanyból származó biológiai minta érintkeztetését TSLP vagy TSLPR elleni ellenanyaggal, olyan körülmények mellett, amelyek alkalmasak ellenanyag-antigén komplex képzõdésére, valamint a komplex kimutatását.
A megvalósítási módok részletes ismertetése I. Definíciók A „TSLP” kifejezés az 1. és 2. azonosító számú 55 szekvenciák szerinti nukleinsavakra és aminosavakra vonatkozik. A „TSLPR” (TSLP-receptor) két alegységet tartalmaz, a TSLPR és IL–7a alegységeket, a 4. és 6. azonosító számú szekvenciákat. Az alegységeket a TSLPR és IL–7a nukleinsavai kódolják, a 3. és 5. azo60 nosító számú szekvenciák. 2
1
HU 004 684 T2
A „hatékony mennyiség” kifejezés alatt olyan mennyiséget értünk, amely elegendõ egy adott kóros állapot tüneteinek vagy jeleinek a javításához. Jellemzõ emlõs gazdák közé tartoznak egerek, patkányok, macskák, kutyák és fõemlõsök, embereket beleértve. Adott beteg esetében a hatékony mennyiség olyan tényezõk szerint változhat, mint például a kezelt állapot, a beteg általános állapota, a beadás módja és adagja, valamint a mellékhatások súlyossága. Kombinációban adva, a hatékony mennyiség arányban áll az összetevõk kombinációjával, és a hatás nem korlátozódik kizárólag az egyedi összetevõk hatására. A gyógyászati készítmény hatékony adagja a tüneteket jellemzõen legalább 10%-kal, általában legalább 20%-kal, elõnyösen legalább 30%-kal, vagy még elõnyösebben legalább 50%-kal csökkenti. A találmány tárgyát képezik reagensek, amelyek a jövõben alkalmazást találnak olyan terápiás beavatkozásokban, amint azt a leírásban máshol ismertetjük, például a fent ismertetett javallatokkal összefüggõ rendellenességek kezelésének általános ismertetése során. [Berkow (szerk.) „The Merck Manual of Diagnosis and Therapy”, Merck & Co., Rahway, N. J.; Thorn és mtsai.: „Harrison’s Principles of Internal Medicine”, McGraw-Hill, N. Y.; Gilman és mtsai. (szerk.): „Goodman and Gilmans’s: The Pharmacological Bases of Therapeutics”, 8. kiadás, Pergamon Press (1990); Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17. kiadás (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn; Langer: Science 249, 1527–1533 (1990); Merck Index, Merck & Co., Rahway, N. J.; és „Physician’s Desk Reference (PDR); Cotran és mtsai (szerk.) fentebb; és Dale és Federman (szerk.), Scientific American Medicine, Healtheon/WebMD, N. Y. (2000)]. A „neoplazma” kifejezés alatt sejtek és/vagy infiltráló sejtek abnormális tömegét vagy kolóniáját értjük, amelyet viszonylag autonóm, új szövetnövekedés hozott létre vagy vonzott adott helyre. Az infiltráló sejtek lehetnek dendrikus sejtek, T¹sejtek vagy B¹sejtek. A legtöbb neoplazma neoplasztikus transzformáción átesett egyetlen sejt klonális expanziójából (kiterjedésébõl) származik. Normális sejt neoplasztikus sejtté történõ transzformálódását okozhatja kémiai, fizikai vagy biológiai ágens (vagy esemény), amely közvetlenül és visszafordíthatatlanul módosítja a sejt genomját. A neoplasztikus sejteket specializált funkciók elvesztése és új biológiai tulajdonságok szerzése jellemzik, elsõsorban a viszonylag autonóm (nem szabályozott) szaporodás tulajdonsága. A neoplasztikus sejtek örökletes biológiai jellemzõiket átadják az utódsejteknek. Adott neoplazma múltja, jelene és jövõbeli várható biológiai viselkedése tovább osztályozható jóindulatú vagy rosszindulatú kategóriába, amely megkülönböztetés nagy jelentõséggel bír a diagnózis, kezelés és prognózis szempontjából. Egy rosszindulatú neoplazma nagyobb fokú autonómiát mutat, képes invázióra és metasztatikus (áttétes) terjedésre, kezelésre rezisztens lehet és halált okozhat. Egy jóindulatú neoplazma kisebb fokú autonómiát mutat, általában nem invazív,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
nem metasztatizál (nem képez áttéteket) és megfelelõ kezelés mellett általában nem okoz súlyos károsodást. A „tumor progressziójának a gátlása” kifejezés alatt a tumorsejtek szaporodásának, inváziójának vagy áttétképzõdésének a leállását értjük, a tumor stádiumától függõen. A kifejezés magában foglalja a tumor fejlõdésének minden szükséges lépését, beleértve a neovaszkularizációt és az angiogenezist. A „metasztatizáló potenciál vagy metasztázis” kifejezés alatt azt a folyamatot értjük, amely révén a tumor a test egyik részébõl a másikba terjed, a módot, amely révén arról a helyrõl, ahol primer tumorként kialakult, eljut a szervezet távoli pontjaira. A metasztázis elõfordulásának a mértéke az egyedi tumorok típusa szerint változik. Melanoma, emlõrák, tüdõrák, vastagbélrák és prosztatarák olyan ráktípusok közé tartoznak, amelyek hajlamosak metasztatizálni. Amikor metasztázis történik, az áttétek a test különbözõ helyein képzõdnek, a leggyakoribb ilyen helyek a nyirokcsomók, tüdõ, máj, agy és csontvelõ. A „mutein” kifejezés alatt, vagy új mutáns proteinek alatt polipeptidek fragmenseit, származékait és analógjait értjük. A szakember számára jól ismert, rekombináns DNS-technológia alkalmazható új, mutáns proteinek vagy muteinek elõállítására, amelyek egyszeres vagy többszörös aminosavhelyettesítéseket, ¹deléciókat, ¹hozzáadásokat vagy fúziós proteineket tartalmaznak. Az ilyen módosított polipeptidek például megemelkedett aktivitást vagy fokozott stabilitást mutathatnak. Ezen túlmenõen, lehetnek nagyobb hatásfokkal tisztíthatók és mutathatnak jobb oldhatóságot, mint a megfelelõ természetes polipeptid, legalábbis bizonyos tisztítási és tárolási körülmények mellett. A rák vonatkozásában a „vakcinaadjuváns” kifejezés alatt olyan peptidet értünk, amelyet vagy önmagában, vagy különbözõ citokinekkel, nemspecifikus stimulátorokkal, tumorok egész sejtjeivel vagy antigént prezentáló sejtekkel, például dendrikus sejtekkel kombinálva alkalmazunk [lásd például Kochman és mtsai.: Current Medical Research and Opinion 15, 321–326 (1999); Jager és mtsai.: Current Opinion in Immunol. 14, 178–182 (2002); és Mendelsohn és mtsai.: „The Molecular Basis of Cancer”, 2. kiadás (2001)]. A vakcinaadjuváns adható tumorok megelõzésére, javítására vagy kezelésére.
II. Általános ismertetés A csecsemõmirigy-stróma eredetû limfopoietint („Thymic Stromal Lymphopoietin”, TSLP) eredetileg 50 egérben fedezték fel és azt tapasztalták, hogy hasonló szerepet játszik a korai B¹ és T¹sejt-fejlõdésben, mint IL–7 homológja (lásd például J. E. Sims, fentebb idézve; S. D. Levin és mtsai., fentebb idézve; és R. J. Ray, fentebb idézve). A TSLP egy új, epithelsejt-eredetû ci55 tokin, amely dendrikus sejt („dendritic cell”, DC) által mediált CD4+ és CD8+ T¹sejt választ indukál. A TSLP által aktivált CD11c+ DC¹k erõteljesen aktiválják és szaporodásra késztetik a CD8+ sejteket, és indukálják azok differenciálódását gyenge katalitikus aktivitást 60 mutató IL–5- és IL–6-termelõ effektor sejtekké. TSLP3
1
HU 004 684 T2
aktivált DC¹k további CD40L kiváltotta kioldás („triggering”) hatására potens citolitikus aktivitású CD8+ T¹sejteket indukálnak, amelyek nagy mennyiségû gammainterferont (IFN¹g) termelnek úgy, hogy megtartják IL–5- és IL–13-termelõ tulajdonságukat. A TSLP-rõl kimutatták, hogy szerepet játszik a T¹sejtes válaszok elindításában és feltételezik, hogy CD40L¹t expresszáló sejtek és a TSLP kombinációban mûködnek [lásd például Gilliet és mtsai.: J. Exp. Med. 197, 1059–1063 (2003)]. A találmány azokon a meglepõ eredményeken alapul, hogy a TSLP kritikus mediátor neoplazmák kialakulása során. A TSLP¹t vizsgáló tanulmányok arra utalnak, hogy a TSLP potens hatást gyakorol a DC¹k azon tulajdonságára, hogy naiv CD8+ T¹sejtes aktiválást, valamint IL–5- és IL–13-termelõ T¹sejtekké történõ differenciálódást indukáljanak [lásd például Gilliet és mtsai.: J. Exp. Med. 197, 1059–1063 (2003)]. A DC¹k aktiválódása kritikus lépésnek tûnik tumorokkal szemben megnyilvánuló, T¹sejt által közvetített válasz kórfejlõdésében. A DC¹k T¹sejtes betegségeket kiváltó szignálozása hátterében álló molekuláris mechanizmus nem egyértelmûen tisztázott. Az a jelen felfedezés, hogy a B9 egéreredetû laphámkarcinóma-sejtvonal erõsen expresszál TSLP¹t arra utal, hogy a TSLP kritikus tényezõ a rák megértésében. Egérmodelleken végzett vizsgálatok megerõsítik a TSLP szerepét tumorok szuppressziójában. B9 egéreredetû laphámkarcinóma-sejtvonalat és abból származtatott RS1 sejtvonalat, amely nagy mennyiségben expresszált és aktivált Smad2 és H¹ras molekulákat hordoz, vizsgáltunk a TSLP gyulladásos citokin mRNS expressziós szintjére nézve. Megfigyeltük, hogy a B9 sejtvonal a TSLP magas szintjét expresszálja, míg az RS1 sejtvonal erõsen csökkentett TSLP-szintet expresszál. További vizsgálatokat végeztünk tumorsejteket immunkompetens egerekbe juttatva abból a célból, hogy megfigyeljük a TSLP expresszióját. A TSLP expressziós szintjét mértük különbözõ normál, valamint tumort hordozó szövetekben. Proximális emlõkarcinóma-szövettel összehasonlítva, a TSLP expressziója jelentõsen magasabb volt normál emlõszövetben. Hasonló eredményeket kaptunk normál vastagbél¹, tüdõ¹, petefészek- és prosztataszövet, valamint proximális vastagbél¹, tüdõ¹, petefészek- és prosztatarákos szövet vizsgálata során. Érdekes megfigyelés volt, hogy nem transzformált szövetpárjukkal összehasonlítva, a humáneredetû tumorsejtek jelentõsen csökkentett mennyiségû TSLP¹t expresszáltak. Karcinogénnel (DMBA, amely helyspecifikus karcinogén, és TPA, amely egy tumorpromoter) kezelt egerek bõrében a TSLP expressziója az 5. és 24. órás idõpontokban kezdetben megemelkedett, majd ezt követõen a késõbbi idõpontokban visszaesett a kontroll szintre vagy az alá, ami ismét arra utal, hogy a proliferatív rendellenesség progressziója egybeesik a TSLP expressziójának a csökkenésével. Kimutatták, hogy a TSLP és IL–7 hasonló szignáltranszdukciós mechanizmusokat vesz igénybe. Mindkettõ a Stat5 transzkripciós faktor tirozin-foszforilezé-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
sét váltja ki. Míg az IL–7 által közvetített szignáltovábbítás a Jaki és Jak3 Janus kinázokon át történik, a TSLP egyik enzimet sem képes aktiválni, ezzel szemben kölcsönhatásba léphet a Jak2 molekulával. Kimutatták továbbá, hogy a TSLP funkcionális receptora, a TSLPR aktiválódása mind a Stat5, mind a Stat3 foszforilezéséhez vezet [lásd például Reche és mtsai.: J. Immunol. 167, 336–343 (2001)]. Tumorrejekciós in vivo modellben, Ep¹ras sejtekkel kiváltott tumorokat kezeltek mTSLP¹t tartalmazó adenovírus egyetlen adagjával (Ad-TSLP), vagy mTSLPprotein több adagjával. Mindkét esetben úgy tûnt, hogy az mTSLP jelentõsen gátolta a tumor növekedését a kontrollkezeléshez (Ad-GFP vagy PBS) képest. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a TSLP potens tumorrejekciós aktivitást mutat, valószínûleg a kialakult tumorral szemben megnyilvánuló immunválasz reaktiválása révén. Amint azt fentebb ismertettük, a gyulladás kritikus összetevõje a tumor progressziójának, mivel számos rák ered fertõzés, krónikus irritáció és gyulladás helyérõl. A tumor mikrokörnyezete feltétlen részt vevõje a neoplasztikus folyamatnak, amely segíti a proliferációt, a tumorszövet túlélését és migrációját. Ez a mikrokörnyezet nagymértékben gyulladásos sejtekbõl szervezõdik. Figyelembe véve a TSLP gyulladásos folyamatokban és endotheliális növekedési faktor aktivitásban betöltött kritikus szerepét, a fentebb ismertetett adatokkal kiegészítve, szakember számára nyilvánvaló, hogy a TSLP expressziójának és aktivitásának a módosítása lényeges összetevõ a tumorok progressziójában. A találmány tárgyát képezik eljárások és reagensek, amelyek alkalmasak Th2-közvetített válasz fokozására a TSLP aktivitás agonista támogatása révén. Az ilyen válasz fokozása elõnyös az immunrendszer szuppressziójának tulajdonítható rendellenességek, például rák kezelése során. A dendrikus sejtek aktivitásának TSLP által kiváltott fokozása elõnyösen alkalmazható rák kezelésére. A TSLP és/vagy agonistái elõnyösen alkalmazhatók továbbá vakcinaadjuvánsként. III. Agonisták és antagonisták Agonisták közé tartozik a teljes hosszúságú TSLP citokin protein (lásd például a 2. azonosító számú szekvenciát). Az ilyen szekvencia szerinti peptidek vagy variánsaik alkalmasak receptor szignálozás kiváltására. A variánsok közé tartoznak olyanok, amelyek konzervatív módon szubsztituáltak és felezési idejük hosszú. Agonisták módosíthatók úgy, hogy felezési idejük hosszabb legyen, például pegilezéssel (PEG), vagy IgG ellenanyag Fc¹részének hozzátoldásával [lásd például Karmonos: BioDrugs 15, 7005–711 (2001)]. Mindkét eljárás elkerüli az immunválaszt azáltal, hogy a degradálás nem olyan gyors. Például, adott agonista PEG-gel való konjugálása jelentõsen csökkenti annak kiürülését a plazmából. Mérlegelni kell továbbá olyan kis molekulák alkalmazását, amelyek szintén receptorszignálozást váltanak ki. Elõállíthatók ellenanyagok a TSLP-proteinek különbözõ epitópjai ellen, beleértve fajspecifikus, polimorf,
1
HU 004 684 T2
vagy allélikus variánsokat, és/vagy fragmenseiket, mind a természetben elõforduló formáik, mind rekombináns formáik ellen. Ezen túlmenõen, elõállíthatók ellenanyagok a TSLP aktív formái vagy inaktív formái ellen, beleértve natív vagy denaturált változatokat. Elõállíthatók továbbá idiotípus elleni ellenanyagok. Antigének elõre meghatározott fragmensei elleni ellenanyagok, kötõfragmenseket és egyláncú variánsokat beleértve, úgy állíthatók elõ, hogy állatokat immunizálnak immunogén proteinek és a fragmensek konjugátumával. A kívánt ellenanyagot szekretáló sejtekbõl monoklonális ellenanyagok állíthatók elõ. Ezek az ellenanyagok szûrhetõk normál vagy hibás TSLP-hez való kötõdésre nézve, vagy szûrhetõk például receptoron keresztül közvetített agonista vagy antagonista aktivitásra nézve. TSLP elleni ellenanyag alkalmas lehet például diagnosztikai alkalmazás céljára. Mint befogó, vagy nem neutralizáló ellenanyagok, szûrhetõk azon tulajdonságra nézve, hogy kötik az antigént anélkül, hogy a receptorhoz való kapcsolódását gátolnák. Neutralizáló ellenanyagokként alkalmazhatók lehetnek kompetitív kötési vizsgálatokban. Elõnyösek lehetnek továbbá TSLP-proteinek vagy receptoraiknak a detektálására vagy mennyiségi meghatározására [lásd például Chan (szerk.): „Immunology: A Practical Guide”, Academic Press, Orlando, FL (1987); Price and Newman (szerk.): „Principles and Practice of Immunoassay”, Stockton Press, N. Y. (1990); és Ngo (szerk.): „Nonisotopic Immunoassay”, Plenum Press, N. Y. (1988)]. Keresztabszorpciók, depletálások vagy más eljárások megadott szelektivitású készítményeket, például egyedi vagy közös fajspecificitásokat mutató készítményeket eredményezhetnek. Ezek olyan tesztek alapját képezhetik, amelyek az antigének különbözõ csoportjait azonosítják. Ezen túlmenõen, a találmány szerinti ellenanyagok, beleértve antigénkötõ fragmenseket, potens antagonisták lehetnek, amelyek az antigénhez kötõdve gátolják a funkcionális kapcsolódást, például biológiai választ kiváltó receptorhoz. Alkalmasak lehetnek továbbá, mint nem neutralizáló ellenanyagok, és kapcsolhatók toxinokhoz és izotópokhoz, így amikor az ellenanyag antigénhez kötõdik, a sejt, amely az antigént expresszálja például a felszínén, elpusztul. Ezen túlmenõen, az ellenanyagok konjugálhatók drogokhoz vagy más terápiás ágensekhez, akár közvetlenül, akár linkeren keresztül közvetve, és elvégezhetik a drog célbajuttatását. Kompetitív kötési elrendezésben az immunvizsgálatok alkalmazhatók keresztreaktivitás meghatározására. A találmány szerinti ellenanyagok alkalmazhatók továbbá diagnosztikai alkalmazásokra. Mint befogó vagy nem neutralizáló ellenanyagok, szûrhetõk azon tulajdonságra nézve, hogy kötik az antigént anélkül, hogy a receptorhoz való kapcsolódását gátolnák. Neutralizáló ellenanyagokként alkalmazhatók kompetitív kötési vizsgálatokban. Elõnyösek lehetnek továbbá TSLP-proteinek vagy receptoraiknak a detektálására vagy mennyiségi meghatározására [lásd például Chan (szerk.): „Immunology: A Practical Guide”, Academic Press, Orlando, FL (1987); Price and Newman (szerk.): „Principles and
2
Practice of Immunoassay”, Stockton Press, N. Y. (1990); és Ngo (szerk.): „Nonisotopic Immunoassay”, Plenum Press, N. Y. (1988)]. Keresztabszorpciók, depletálások vagy más eljárások megadott szelektivitású 5 készítményeket, például egyedi vagy közös fajspecificitásokat mutató készítményeket eredményezhetnek. Ezek olyan tesztek alapját képezhetik, amelyek az antigének különbözõ csoportjait azonosítják. Az egyes TSLP-proteinek ellen elõállított ellenanya10 gok alkalmazhatók idiotípus elleni ellenanyagok elõállítására. Ezek alkalmasak lehetnek a megfelelõ antigének expresszálódásával összefüggõ, különbözõ immunológiai állapotok detektálására vagy diagnosztizálására. 15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
IV. Terápiás készítmények és diagnosztikai eljárások Citokineket, mint például IL–7, IL–12 vagy IL–23 antagonistákat és agonistákat általában parenterálisan adják be, elõnyösen intravénásan. Mivel az ilyen proteinek vagy peptidek immunogének lehetnek, azokat elõnyösen lassan adják be, vagy hagyományos IV beadási rend szerint, vagy szubkután raktárból, például Tomasi és mtsai. kitanítása szerint (US 4 732 863 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Alkalmazhatók immunológiai reakciók minimalizálását célzó eljárások. Kis molekulatömegû egységek orálisan is aktívak lehetnek. Parenterális terápiás készítmények beadhatók vizes hordozókban, például vízben, fiziológiás konyhasóoldatban vagy pufferolt hordozókban, különbözõ adalékok és/vagy hígítóágensek hozzáadásával, vagy azok nélkül. Más megoldás szerint, elõállítható egy vakcinaadjuváns, szuszpenzió, például cinkszuszpenzió, amely a peptidet tartalmazza. Az ilyen szuszpenzió elõnyösen alkalmazható szubkután (SQ) vagy intramuszkuláris (IM) injektálásra [lásd például Avis és mtsai. (szerk): „Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications”, 2. kiadás, Dekker, N. Y. (1993); Lieberman és mtsai. (szerk): „Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets”, 2. kiadás, Dekker, N. Y. (1990); Lieberman és mtsai. (szerk): „Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems”, Dekker, N. Y. (1990); Fodor és mtsai.: Science 251, 767–773 (1991); Coligan (szerk): „Current Protocols in Immunology”; Hood és mtsai.. „Immunology”, Benjamin/Cummings; Paul (szerk): „Fundamental Immunology”, Academic Press; Parce és mtsai.: Science 246, 243–247 (1989); Owicki és mtsai.: Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 87, 4007–4011 (1990); és Blundell és Johnson: „Protein Crystallography”, Academic Press, N. Y. (1976)]. Adott terápiás készítmény beadási rendjének a kiválasztása számos tényezõtõl függ, így például az adott entitás szérumbeli vagy szöveti eliminációs („turnover”) sebességétõl[9], a tünetek súlyosságától, az entitás immunogenitásától, a célsejtek hozzáférhetõségétõl, a beadás idõzítésétõl, a hámrétegeken át történõ felszívódástól, és hasonlóktól. Elõnyösen, a beadási rend maximalizálja a betegnek beadott terápiás hatóanyagot a mellékhatások elfogadható szintje mellett. Ennek megfelelõen, a beadott biológiai hatóanyag mennyisége részben az adott hatóanyagtól és a kezelt
1
HU 004 684 T2
állapot súlyosságától függ. Citokinek vagy kis molekulák megfelelõ adagjának a kiválasztása szokásos eljárásokkal határozható meg. A megfelelõ dózis meghatározását klinikus végzi, például olyan paraméterek vagy tényezõk alkalmazásával, amelyekrõl a technika állása szerint ismert vagy feltételezett, hogy a kezelést befolyásolják vagy vélhetõen befolyásolják. Az adagolást általában az optimális dózisnál valamivel kisebb mennyiséggel kezdik, majd ezt követõen kis beosztásonként növelik, amíg elérik a kívánt vagy optimális hatást, bármely negatív mellékhatáshoz viszonyítva. Fontos diagnosztikai mércék közé tartoznak például gyulladások tünetei vagy a termelt gyulladásos citokinek szintjei. Elõnyösen, az alkalmazni kívánt biológiai hatóanyag ugyanabból a fajból származik, mint a kezelni célzott állat, ezáltal minimalizálva a reagens elleni humorális választ. Ellenanyagok, ellenanyagfragmensek, továbbá proteinek vagy polipeptidek beadhatók folyamatos infúzióban, vagy idõszakonkénti adagokban, például egy napon, egy héten, vagy hetente 1–7 alkalommal. Az adagok beadhatók intravénásan, szubkután, helyileg, orálisan, nazálisan, rektálisan, intramuszkulárisan, intracerebrálisan vagy inhalálással. Elõnyös dózisprotokoll az, amely maximális dózist vagy dózis gyakoriságot alkalmaz úgy, hogy elkerül minden jelentõs, nem kívánt mellékhatást. A teljes heti adag általában legalább 0,05 mg/testtömeg¹kg, általánosabban legalább 0,2 mg/kg, még általánosabban legalább 0,5 mg/kg, tipikusan legalább 1 mg/kg, még tipikusabban legalább 10 mg/kg, legtipikusabban legalább 100 mg/kg, elõnyösen legalább 0,2 mg/kg, elõnyösebben legalább 1,0 mg/kg, még elõnyösebben legalább 2,0 mg/kg, optimálisan legalább 10 mg/kg, még optimálisabban legalább 25 mg/kg és legoptimálisabban legalább 50 mg/kg [lásd például Yang és mtsai.: New Engl. J. Med. 349, 427–434 (2003); Herold és mtsai.: New Engl. J. Med. 346, 1692–1698 (2002); Liu és mtsai.: J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67, 451–456 (1999); Portielji és mtsai.: Cancer Immunol. Immunother. 52, 133–144 (2003)]. Kis molekulatömegû terápiás ágens, például peptid mimetikum, természetes készítmény vagy szerves vegyület kívánt adagja mol/kg viszonylatban körülbelül azonos, mint ellenanyag vagy polipeptid esetében. A találmány tárgyát képezi továbbá biológiai hatóanyagok ismert terápiás ágensekkel kombinációban történõ beadása, például szteroidokkal, közelebbrõl glukokortikoidokkal, amelyek enyhítik a tüneteket, például gyulladással összefüggõ tüneteket, vagy antibiotikumokkal, vagy fertõzés elleni ágensekkel. A glukokortikoidok napi adagja legalább naponta 1 mg¹tól, általában legalább 2 mg¹tól és elõnyösen legalább 5 mg¹tól terjed. A dózis általában kevesebb mint körülbelül 100 mg, jellemzõen kevesebb mint körülbelül 50 mg, elõnyösen kevesebb mint körülbelül 20 mg, és elõnyösebben kevesebb mint körülbelül 10 mg naponta. A dózis tartománya általában körülbelül legalább 1–100 mg, elõnyösen 2–50 mg naponta. Antibiotikumokkal, fertõzés elleni ágensekkel vagy gyulladásgátlókkal képezett
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
kombinációik megfelelõ adagjai szakember számára szintén ismertek. Olyan ellenanyagok, amelyek fajlagosan kötõdnek TSLP-hez vagy TSLPR-hez, alkalmazhatók olyan állapotok vagy betegségek diagnózisára, amelyeket TSLP vagy TSLPR expresszálódása jellemez, vagy TSLPvel, TSLPR-rel, agonistáikkal, antagonistáikkal vagy inhibitoraikkal kezelt betegek monitorozására. A diagnosztikai célra alkalmas ellenanyagok ugyanolyan eljárással állíthatók elõ, mint amelyeket terápiás szerként fentebb ismertettünk. TSLP és TSLPR kimutatására alkalmas diagnosztikai vizsgálatok közé tartoznak olyan eljárások, amelyek az ellenanyagot és jelölõágenst alkalmaznak TSLP vagy TSLPR detektálására humáneredetû testfolyadékokban, vagy sejtek vagy szövetek kivonatában. Az ellenanyagok alkalmazhatók módosítva, vagy anélkül, és jelölhetõk kovalens vagy nem kovalens módon kapcsolt riportermolekulával. A technika állása szerint ismert, számos riportermolekula alkalmazható, amelyek közül többet fentebb ismertettünk. Szakember számára számos eljárás ismert TSLP vagy TSLPR kimutatására, például ELISA, RIA és FACS eljárások, amelyek alapot szolgáltatnak TSLP vagy TSLPR expresszálódásának megváltozott, vagy abnormális szintjeinek a diagnózisához. A TSLP vagy TSLPR expresszálódás normál vagy standard értékei úgy határozhatók meg, hogy normál, emlõseredetû, elõnyösen humáneredetû testfolyadékot vagy sejtkivonatot érintkeztetünk TSLP vagy TSLPR elleni ellenanyaggal, komplex képzõdéséhez megfelelõ körülmények mellett. A képzõdött standard komplex mennyisége számos eljárással meghatározható, azonban a választott eljárás elõnyösen fotometriás eljárás. Kontroll és beteg alanyokban expresszált TSLP és TSLPR mennyiségeket, valamint biopsziás szövetekbõl származó mintákat hasonlítunk össze a standard értékekkel. Alanyok értékei és a standard érték közötti eltérések képezik a betegség diagnózisának a paramétereit. Alkalmazható polinukleotidok közé tartoznak oligonukleotidszekvenciák, komplementer RNS- és DNSmolekulák és PNS¹ek (protein-nukleinsav)[.10], A polinukleotidok alkalmazhatók génexpresszió detektálására és mennyiségi meghatározására olyan biopsziás szövetmintákból, amelyekben a TSLP vagy TSLPR expresszálódása betegséggel korreláltatható. A diagnosztikai vizsgálat alkalmazható arra a célra, hogy különbséget tegyünk TSLP vagy TSLPR hiányzó, jelen levõ vagy fölös expressziója között, valamint a TSLP vagy TSLPR szintek szabályozásának monitorozására terápiás beavatkozás során. Egyik nézõpontból, TSLP¹t vagy TSLPR¹t vagy közeli hasonlóságot mutató molekulákat kódoló polinukleotidszekvenciákat, például genomi szekvenciákat is detektálni képes PCR-próbákkal történõ hibridizálás alkalmazható TSLP¹t vagy TSLPR¹t kódoló nukleinsavszekvenciák azonosítására. A próba specificitása határozza meg, hogy a próba kizárólag természetben elõforduló, TSLP¹t vagy TSLPR¹t, allélokat vagy hasonló szekvenciákat kódoló szekvenciákat azonosít, attól függõen, hogy azt szigorúan specifikus régióból (pél-
1
HU 004 684 T2
dául az 5’ szabályozórégióból származó, 10 egyedi nukleotidból), vagy kevésbé specifikus régióból (például elsõsorban a 3’ kódolórégióból) állítjuk elõ, valamint a hibridizálás vagy amplifikálás stringenciájától (maximális, magas, közepes vagy alacsony) függõen. Rokon szekvenciák detektálására is alkalmazhatunk próbákat, és azoknak elõnyösen bármely, TSLP¹t vagy TSLPR¹t kódoló szekvencia nukleotidjainak 50%¹át kell tartalmazniuk. A találmány szerinti hibridizációs próbák származhatnak az 1. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciából, vagy genomi szekvenciából, amely a természetben elõforduló TSLP vagy TSLPR promoterét, enhancer elemeit és intronjait tartalmazza. TSLP¹t vagy TSLPR¹t kódoló DNS-szekvenciákat kimutató specifikus hibridizációs próbák elõállítási eljárásai közé tartozik TSLP vagy TSLPR vagy származékai nukleinsavszekvenciáinak vektorokba történõ klónozása, mRNS-próbák elõállítása céljából. Ilyen vektorok szakember számára ismertek, kereskedelmi forgalomban hozzáférhetõk, és megfelelõ RNS-polimeráz és megfelelõ jelölt nukleotidok hozzáadásával alkalmazhatók RNS-próbák in vitro szintézisére. Hibridizációs próbák riportercsoportok széles választékával jelölhetõk, például 32P vagy 35S izotópokkal, enzimes jelölõkkel, például avidin/biotin kötõrendszeren át kapcsolt alkalikus foszfatázzal, és hasonlókkal. Ellenanyagok, valamint TSLP¹t vagy TSLPR¹t kódoló polinukleotidszekvenciák alkalmasak olyan állapotok vagy rendellenességek diagnózisára, amelyek TSLP vagy TSLPR expresszálódásával járnak. Ilyen állapotok és rendellenességek közé tartoznak a karcinóma, leukémia, limfóma, melanoma, mielóma, szarkóma és teratokarcinóma, valamint elsõsorban a mellékvesék, hólyag, csont, csontvelõ, agy, emlõ, méhnyak, epehólyag, ganglionok, gyomor-bél traktus, szív, vesék, máj, tüdõ, izom, petefészek, hasnyálmirigy, mellékpajzsmirigy, hímvesszõ, prosztata, nyálmirigyek, bõr, lép, herék, csecsemõmirigy, pajzsmirigy és méh rákjai. A TSLP¹t vagy TSLPR¹t kódoló polinukleotidszekvenciák alkalmazhatók Southern- vagy Northern-vizsgálatban, dot blot vizsgálatban vagy más, membránon alapuló eljárásokban; PCR-eljárásokban; vagy dipstick¹, pin¹, ELISA-vizsgálatokban vagy mikromátrix („microarray”) vizsgálatban, amelyeken betegekbõl származó biopsziás folyadékot vagy szövetet alkalmazunk TSLP vagy TSLPR expressziójának a detektálására. Az ilyen kvalitatív vagy kvantitatív eljárások szakember számára jól ismertek. Rák tekintetében, adott egyénbõl származó biopsziás szövetben jelen levõ, viszonylag nagy mennyiségû transzkripciós termék betegség kialakulásának hajlamára utalhat, vagy eszközül szolgálhat a betegség detektálására a betegség valóságos klinikai tüneteinek megjelenése elõtt. Az ilyen típusú, még egyértelmûbb diagnózis egészségügyi szakember számára korábban tehet lehetõvé megelõzõ intézkedéseket vagy agresszív kezelés elrendelését, ezáltal megelõzve a rák kialakulását vagy további progresszióját. A találmány széles oltalmi körének jobb megértését szolgálják az alábbi példák, anélkül, hogy azok a specifikus megvalósítási módokra korlátozódnának.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
Példák I. Általános eljárások A szokásos eljárások egy részét az alábbi szakirodalmi helyek ismertetik vagy idézik: Maniatis és mtsai.: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press (1982); Sambrook és mtsai.: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, (2. kiadás), 1–3. kötet, CSH Press, N. Y. (1989); Ausubel és mtsai.: Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, N. Y.; vagy Ausubel és mtsai.: „Current Protocols in Molecular Biology” Greene/Wiley, N. Y. (1987 és kiegészítõ kiadványok). Proteinek tisztítására alkalmas eljárások közé tartoznak az ammónium-szulfát-precipitáció, oszlopkromatográfia, elektroforézis, centrifugálás, kristályosítás és más eljárások [lásd például Ausubel és mtsai. (1987 és idõszakos kiadványok); Deutscher: „Guide to Protein Purification”, Meth. Enzymol. 182, és a sorozat más köteteiben; és gyártók szakirodalmi ismertetése protein tisztítási termékek alkalmazására, például Pharmacia, Piscataway, N. J., vagy Bio-Rad, Richmond, C. A.]. Rekombináns eljárásokkal való kombinálás lehetõvé teszi megfelelõ szegmensekhez, például FLAG-szekvenciához vagy hasonlóhoz történõ fúziót, amely proteázzal eltávolítható szekvencián keresztül fuzionáltatható [lásd például Hochuli: „Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent”, Setlow (szerk.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12, 87–98, Plenum Press, N. Y. (1990); és Crowe és mtsai.: „QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System” QIAGEN Inc., Chatsworth, C. A. (1992)]. Számítógépes szekvenciaanalízist megfelelõ, hozzáférhetõ szoftverprogramokkal végeztünk, például GCG (U. Wisconsin) és GenBank forrásokból. Alkalmaztunk továbbá nyilvános szekvencia-adatbázisokat, például GenBank és más forrásokból. II. TSLP expressziója humáneredetû tumor- és normál sejtvonalakban Olyan humáneredetû karcinóma-sejtvonalakat alkalmaztunk, amelyek az NCI 60 gyûjteménybe tartoznak [http://dtp.nci.nih.gov/docs/misc/common files/cell list.html, A. Monks és mtsai.: J. Natl. Cancer Inst. 83, 757 (1991)] vagy amelyeket szakirodalomban gyakran alkalmaznak. Az egyes szerveknek vagy szervrendszereknek megfelelõ normál sejttípusokat az ATCC, Cascade Biologics (Portland, OR) vagy Clonetics (Division of Biowhittaker, Walkersville, M. D.) gyûjteményekbõl szereztük be. Ezek minden esetben normál, nem transzformált, nem immortalizált sejtek voltak, és amelyek az adott anatómiai régió sejttípusát képviselték, például fibroblasztokat, melanocitákat és keratinocitákat, melanóma-sejtvonalak normál kontrolljaként, vagy normál emlõ-epithelium sejteket képviseltek, emlõkarcinóma-sejtvonalak normál kontrolljaként stb. A sejteket tenyészetben szaporítottuk, szokásos sejttenyésztési körülmények mellett, majd összegyûjtöttük. Teljes RNS-tartalmukat szokásos guanidin[.11]izotiocianát/cézium-klorid gradiensen izoláltuk [Sambrook J., Fritsch E. F., és Maniatis T.: „Molecular Clo-
1
HU 004 684 T2
ning: A Laboratory Manual”, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. A teljes RNS-tartalmat DNáz-kezelésnek vetettük alá, az esetleges DNSkontamináció eltávolítása érdekében. A DNáz-zal kezelt teljes RNS reverz átiratát (transzkriptumát) állítottuk elõ, Superscript II (Gibco/BRL) reagenskészlet alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint. Láncindító oligonukleotidokat terveztünk, Primer Express (PE Biosystems, Forster City, CA) reagenskészlet alkalmazásával. Minden mintából 50 ng cDNS¹en végeztünk valós idejû kvantitatív PCR-vizsgálatot, Perkin Elmer SYBR zöld valós idejû kvantitatív PCR-vizsgálat alkalmazásával, ABI 5700 berendezésen. Minden mintában mértünk ubikitin szintet is, amelyet a kiindulási RNSmennyiség normalizálására alkalmaztunk. Az értékek ubikitinre normalizált adatokat képviselnek. III. TSLP mRNS expressziójának vizsgálata transzformált, egéreredetû tumorsejtekben A H¹Ras-transzformált, egéreredetû PDV keratinocita sejtvonalat és a H¹Ras-transzformált, egéreredetû EP2 emlõsejtvonalat kezeltük 5 napon át, 5 ng/ml TGFbéta1 (R&D systems) ágenssel, vagy hagytuk kezeletlenül. RNeasy oszlopok (Qiagen) alkalmazásával mRNS¹t állítottunk elõ [lásd például Oft és mtsai.: Genes and Dev. 10, 2462–2477 (1996)]. Mutáns H¹Ras¹t és mSmad2 aktivált mutánsát [lásd például Oft és mtsai.: Nature cell Biol. 4, 487–494 (2002)] fokozottan expresszáló B9 laphámsejtes karcinómasejtjeit és származékait tenyésztettük egyrétegû sejtszõnyeg (benõttség) állapotig. mRNS¹t izoláltunk, Qiagen RNAeasy RNS-izoláló reagenskészlet alkalmazásával. Ezt követõen, az RNS¹t valós idejû PCR-eljárassal vizsgáltuk, mTSLP RNS láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, és ubikitin mRNS-kontrollokra normalizáltuk. IV. Tumorok passzálása során a TSLP expressziója elveszik Ras-transzformált, egéreredetû EP2 emlõepithelsejtvonalat injektáltunk csecsemõmirigy-hiányos („nude”) egerekbe és szingenikus Balb/C egerekbe. A tumorokból tumorsejteket izoláltunk vissza, és szelektáltunk 0,8 mg/ml G418 reagens (Invitrogen) jelenlétében, 4 napon át. mRNS¹t izoláltunk a fentiek szerint [lásd például Oft és mtsai.: Genes and Dev. 10, 2462–2477 (1996)]. V. TGFb represszálja a TSLP mRNS expresszióját epitheliális tumorsejtvonalakban EP2- és PDV-sejtvonalakat (DMBA-transzformált, egéreredetû keratinociták) tenyésztettünk 60%¹os benõttség állapotig. A sejteket három egymást követõ napon át 5 ng/ml TGFb1 ágenssel kezeltük. A sejteket lekapartuk, centrifugáltuk és azonnal mélyhûtöttük folyékony nitrogénben. TSLP mRNS¹t izoláltunk és az expressziót valós idejû PCR-eljárással vizsgáltuk, mTSLPspecifikus RNS láncindító oligonukleotok alkalmazásával. Az expressziós szinteket ubikitin mRNS-kontrollokra normalizáltuk.
2
VI. TSLP mRNS expresszió és tumor progresszió Ras-transzformált epithelsejteket injektáltunk szubkután úton, majd miután a tumorok elérték az 1 cm3 5 térfogatot, azokat visszaizoláltuk [lásd például lásd például Oft és mtsai.: Genes and Dev. 10, 2462–2477 (1996)]. A sejteket 90%¹os benõttség állapotig tenyésztettük. A sejteket lekapartuk, centrifugáltuk és azonnal mélyhûtöttük folyékony nitrogénben. mRNS¹t 10 izoláltunk és az expressziót valós idejû PCR-eljárással vizsgáltuk. Az expressziós értékeket ubikitin mRNSkontrollokra normalizáltuk. VII. Tumornövekedés és TSLP mRNS expresszió Immunkompetens Balb/C egerekben tumort indukáltunk úgy, hogy az állatokba 1×106 EPXB tumorsejtet injektáltunk. Ezután, a testtömegvesztést követõen, a kísérleti csoportot 0,5 mg TSLP-vel injektáltuk, hetente két alkalommal [lásd például lásd például Oft és mtsai.: 20 Genes and Dev. 10, 2462–2477 (1996)]. 15
VIII. TSLP mRNS expresszió karcinogénnel kezelt egerek bõrében C57BL/6/129 egereket a hátuk felületén kezeltünk 25 200 ml acetonban oldott, 50 mg DMBA- vagy 30 mg TPA-reagenssel, vagy csak acetonnal (kontroll). Kis szövetbiopsziákat vettünk ugyanabból az egérbõl, különbözõ idõpontban (azaz DMBA esetében a 0., 5., 24., 48. és 120. órában, TPA esetében 0., 5., 24. és 72. 30 órában). A mintákat azonnal mélyhûtöttük folyékony nitrogénben. Ezt követõen, mRNS¹t izoláltunk és az expressziót valós idejû PCR-eljárással vizsgáltuk specifikus mTSLP RNS¹re specifikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával és az expressziós értékeket 35 ubikitin mRNS-kontrollokra normalizáltuk.
40
45
50
55
60 8
IX. TSLP és tumorral szembeni rezisztencia Primer NHEK sejteket (Clonetics, Cambrex) tenyésztettünk meghatározott kreatinocita növekedési tápközegben (Invitrogen), öt passzázson át. A sejteket 60%¹os benõttség állapotban GFP¹t (MOI 100) expresszáló adenovírussal fertõztük, vagy kezeletlenül hagytuk (kontroll). A sejteket lekapartuk, centrifugáltuk és azonnal mélyhûtöttük folyékony nitrogénben. Ezt követõen, az RNS¹t kivontuk és valós idejû PCR-eljárással vizsgáltuk, hTSLP RNS¹re specifikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, és ubikitin mRNS kontrollokra normalizáltuk. Az adenovírussal fertõzött keratinociták a TSLP mRNS expresszió jelentõs fokozódását mutatták. Abból a célból, hogy ellenõrizzük, vajon a fenti in vitro adatok érvényesek¹e in vivo elrendezésben, 106 Ep¹ras sejtet injektáltunk szubkután úton szingenikus Balb/C egerekbe. Amikor a tumorok elérték a 200 mm3 méretet, mTSLP¹t vagy GFP¹t expresszáló adenovírust injektáltunk az állatok farok vénájába, 1010 részecske/egér dózisban. Külön csoportokban, mTSLP-proteint vagy PBS¹t (kontroll) is injektáltunk farokvénán át, számos idõpontban, az 1–18. napokon. A tumorok méretét minden esetben 30 napon át mértük.
1
HU 004 684 T2
X. Szekvenciaazonosítók felsorolása 1. azonosító számú szekvencia: Humáneredetû TSLP nukleinsavszekvencia 2. azonosító számú szekvencia: Humáneredetû TSLP aminosavszekvencia 3. azonosító számú szekvencia: Humáneredetû IL–7Ra nukleinsavszekvencia
5
2
4. azonosító számú szekvencia: Humáneredetû IL–7Ra aminosavszekvencia 5. azonosító számú szekvencia: Humáneredetû TSLPR nukleinsavszekvencia 6. azonosító számú szekvencia: Humáneredetû TSLPR aminosavszekvencia
Szekvencialista <110> Schering Corporation <120> USES OF MAMMALIAN CYTOKINES AND AGONISTS; RELATED REAGENTS <130> DX06029K¹WI <140> <141> 2004–07–16 <150> US 60/488,263 <151> 2003–07–18 <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1419 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1
ctcgaggcca caacttaagg aacctggtgc gggaagagtt ttactatatg gtgttaactt actatttcta accgtctctt cccaccgccg ttagctatct aagaggagaa ggattgtggc gtcatatttc actgtgacaa cttttgtaag tgagggaagc gcataagcat aaggaaaaat ttctacatgt gcaaatgggg caaagtattg tatatacaag ttatagaatc aattgacact
agaattcggc caacagcatg ttgagcactg tagtgtgaaa ttctgtcagt acgacttcac aagacctgat gtagcaatcg gctgcgcgtc ggtgcccagg aaaggaaagt gtcgcttcaa acagcaccaa agaagaccac tttttattgt ttccataaca tgctcaagag attgaactca aatgacactt tttcacaaat tgaaagtatt tagatcctga tactttaatt atatatttct
acgagggcag ggtgaataag gcccctaagg ctggggtgga ttctttcagg taactgtgac tacatatatg gccacattgc gctcgccaaa ctattcggaa cacaaccaat tcgaccctta aataaatcat aaatagttat gtaagtttat ttgatgactg gaaaatccaa atgatagcac cttgtgttaa agttgtaaat ctaagccaag gaagtacctt tattttgtga taataaaata
ccagaaagct ggcttcctgt caggccttac attgggtgtc aaaatcttca tttgagaaga agtgggacca cttactgaaa gaaatgttcg actcagataa aaatgtctgg ctgaaacaac ctttattaag cttttaatta aatgcagggg gcttcatggc agtgcagcag ctaaacttac actaaaaatt atagtgaagc ttttaaatat tgttacagct acacttttga attctcaaa
<210> 2 <211> 159 9
ctggagcatc ggactggcaa agatctctta cacgtatgtt tcttacaact ttaaagcagc aaagtaccga tccagagcct ccatgaaaac atgctactca aacaagtgtc agtaaaccat tagatgaaac cagaagagtt aagtactact agtaattctc gagaactctt atttaaaaga tacaagagaa aatttgaaat tatctaacag actataaata aaatgtacat
agggagactc tgagaggcaa cactcgtggt cccttttgcc tgtagggctg ctatctcagt gttcaacaac aaccttcaat taaggctgcc ggcaatgaag acaattacaa ctttattatg attaactcta tcttaactta cctcaaatgt ggctgtagtt ttccctgaaa cagacattcc gaaagtgaaa aattttcaag acaagagtgg tacatataaa gttcctttgt
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1419
HU 004 684 T2
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Met Phe Pro Phe Ala Leu Leu Tyr Val Leu Ser Val Ser Phe Arg Lys 1 5 10 15 Ile Phe Ile Leu Gln Leu Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asp Phe Thr 20 25 30 Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Thr Ile Ser 35 40 45 Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser Thr Glu Phe Asn 50 55 60 Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu Thr Glu Ile Gln 65 70 75 80 Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu 85 90 95 Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly 100 105 110 Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg 115 120 125 Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu 130 135 140 Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln 145 150 155 <210> 3 <211> 1658 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3
ctctctctct tttacttcaa agaactggat ttcactgacc atgtggggcc catcgagaca aaagagtcta tgacctgagt acacttgcaa ggatgaaaac aaagctccaa taaaggcttc tagctcaggg cgctctgttg gcccagtctc tttaaatgtg cattcaagct agaatctgag
atctctctca gtcgtttctg gactactcat tgtgcttttg ctcgtggagg aagaaattct acctgcaaaa gtcatctatc aagaagtatg aaatggacgc ccggcagcaa tggagtgaat gagatggatc gtcatcttgg cccgatcata agtttcaatc agagatgaag aagcagaggc
gaatgacaat gagaaagtgg tctcatgcta aggacccaga taaagtgcct tactgattgg aaatagacct gggaaggagc taaaagtttt atgtgaattt tgtatgagat ggagtccaag ctatcttact cctgtgtgtt agaagactct ctgaaagttt tggaaggttt ttggagggga
tctaggtaca ctatgctcaa tagccagttg tgtcaacacc gaatttcagg aaagagcaat aaccactata caatgacttt aatgcatgat atccagcaca taaagttcga ttattacttc aaccatcagc atggaaaaaa ggaacatctt cctggactgc tctgcaagat tgtgcagagc 10
acttttggca aatggagact gaagtgaatg accaatctgg aaactacaag atatgtgtga gttaaacctg gtggtgacat gtagcttacc aagctgacac tccatccctg agaactccag attttgagtt aggattaagc tgtaagaaac cagattcata acgtttcctc cccaactgcc
tggttttttc tggaagatgc gatcgcagca aatttgaaat agatatattt aggttggaga aggctccttt ttaatacatc gccaggaaaa tcctgcagag atcactattt agatcaataa ttttctctgt ctatcgtatg caagaaaaaa gggtggatga agcaactaga catctgagga
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080
HU 004 684 T2
tgtagtcgtc tgtcagtgca tggcaagaat cacgctgccc gggtcagccc cagcttctac aagatgattt aattagcaaa cctgagttca gtcacaaggt
actccagaaa tgtgacgccc gggcctcatg cctccatttt attcttactt caaaaccagt aaaagggaag accccactac gtggcactca ttaaggtgac
gctttggaag ctattctctc tgtaccagga ctctccaatc ccctgggatc gaagtgtaag tctagagttc acagtctgca acatgagtca ccaatgattc
agattcatcc ctcttccagg cctcctgctt tggaatcctg aaatcaagaa aaacccagac ctagtctccc agattctgaa agagcatcct agctattt
ctcacatgcc tccctagact agccttggga acattgaacc gaagcatatg tgaacttacc tcacagcaca acattgcttt gcttctacca
tggctgggaa gcagggagag ctacaaacag cagttgctca tcaccatgtc gtgagcgaca gagaagacaa gaccactctt tgtggatttg
<210> 4 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln 1 5 10 15 Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp 20 25 30 Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val 35 40 45 Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val 50 55 60 Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val 65 70 75 80 Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr 85 90 95 Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly 100 105 110 Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys 115 120 125 Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn 130 135 140 Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val 145 150 155 160 Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn 165 170 175 Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln 180 185 190 Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile 195 200 205 Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr 210 215 220
11
1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1658
HU 004 684 T2
Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro 225 230 235 240 Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu 245 250 255 Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val 260 265 270 Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys 275 280 285 Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu 290 295 300 Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val 305 310 315 320 Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu 325 330 335 Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu 340 345 350 Asp Val Val Val Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser 370 375 380 Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val 385 390 395 400 Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro 405 410 415 Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala 420 425 430 Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala 435 440 445 Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 450 455 <210> 5 <211> 1557 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5
cggcacgagg ggctggatgg ttcaatttag actttccact caggaaggtc ttctccatca ctgaaaccca acgtgttctg
gcatggggcg ctttggggca aaaccgtgca acagattcaa acacttcggg ggaatgggac gttccccgaa acctgtccta
gctggttctg aggaggagca ggtgacatgg cggtgatgag gtgcctccta gcaccccgtt gcacgtgaga cggggatctc
ctgtggggag gcagaaggag aatgccagca gcctatgacc gacgcagagc ttcaccgcaa ttttcgtggc ctctatgagg 12
ctgccgtctt tacagattca aatactccag agtgcaccaa agcgagacga gtcgctggat atcaggatgc ttcagtaccg
tctgctggga gatcatctac gaccaacctg ctaccttctc cattctctat ggtttattac agtgacggtg gagccccttc
60 120 180 240 300 360 420 480
HU 004 684 T2
gacaccgagt gccgagaagt gacacatacc gcctgtgcag agcctggcca gtgaagaagt gagatacacc cacaagatgg gccaagactg tctgggggat gggggcttca tgtcaaagtc actccacacc gaagacccag ctctgtgttc gttccttttc taaaaccatc tggattctcg
ggcagtccaa gttactcttt caagcgactg agacaccaac tccttctgat ttctcattcc aagggaactt caggtgcaga aagccgagtc ccctccagct cctttgtgat aacgtcagga accatggatg cctcaccgcc aaaggcttga gtgcctgaac ttcccactct gaggattttt
acaggaaaat ctgggtcagg gtcagaggtg gcctcccaaa ggtgtctctc cagcgtgcca ccaggagtgg gcaagaaagt tcccaggatg tccccaccag gaatgaccgc tccacgttga ggaagtctcc taatgcggcc tggcagatgg gttgtcacat gtgagtcccc tgtctgtttt
acctgcaacg gtgaaggcta acatgctggc ccaaagctgt ctccttctgt gacccgaaat atcacagaca ggccccgagg ctggacccac cccctccaag tcctacgtgg catttaaaga acgccaatga actgccctgc gagccaattg aaaccccaag agttccgtcc gagactccaa
tcaccataga tggaggatgt agagaggcga ccaaatttat ctttatggaa ccatcttccc cccagaacgt agcccctggt agaccgagga gcggtgatgt cgttgtgatg cagaggggac tggtaggact taactttccc ctccaggaga gcagcacgtc atgtacctgt accacctcta
aggcttggat atatgggcca gattcgggat tttaatttcc attatggaga cgggctcttt ggcccacctc agtccagttg gaaagaggcc ggtcacaatc gacacaccac tgtcccgggg aggagactct ccacatgagt tttactccca caaaatgctg tccatagcat cccctac
<210> 6 <211> 371 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
Met Gly Arg Leu Val Leu Leu Trp Gly Ala Ala Val Phe Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Trp Met Ala Leu Gly Gln Gly Gly Ala Ala Glu Gly Val Gln Ile 20 25 30 Gln Ile Ile Tyr Phe Asn Leu Glu Thr Val Gln Val Thr Trp Asn Ala 35 40 45 Ser Lys Tyr Ser Arg Thr Asn Leu Thr Phe His Tyr Arg Phe Asn Gly 50 55 60 Asp Glu Ala Tyr Asp Gln Cys Thr Asn Tyr Leu Leu Gln Glu Gly His 65 70 75 80 Thr Ser Gly Cys Leu Leu Asp Ala Glu Gln Arg Asp Asp Ile Leu Tyr 85 90 95 Phe Ser Ile Arg Asn Gly Thr His Pro Val Phe Thr Ala Ser Arg Trp 100 105 110 Met Val Tyr Tyr Leu Lys Pro Ser Ser Pro Lys His Val Arg Phe Ser 115 120 125 Trp His Gln Asp Ala Val Thr Val Thr Cys Ser Asp Leu Ser Tyr Gly 130 135 140 Asp Leu Leu Tyr Glu Val Gln Tyr Arg Ser Pro Phe Asp Thr Glu Trp 145 150 155 160 Gln Ser Lys Gln Glu Asn Thr Cys Asn Val Thr Ile Glu Gly Leu Asp 165 170 175
13
540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1557
1
HU 004 684 T2
2
Ala Glu Lys Cys Tyr Ser Phe Trp Val Arg Val Lys Ala Met Glu Asp 180 185 190 Val Tyr Gly Pro Asp Thr Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Glu Val Thr Cys 195 200 205 Trp Gln Arg Gly Glu Ile Arg Asp Ala Cys Ala Glu Thr Pro Thr Pro 210 215 220 Pro Lys Pro Lys Leu Ser Lys Phe Ile Leu Ile Ser Ser Leu Ala Ile 225 230 235 240 Leu Leu Met Val Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Trp Lys Leu Trp Arg 245 250 255 Val Lys Lys Phe Leu Ile Pro Ser Val Pro Asp Pro Lys Ser Ile Phe 260 265 270 Pro Gly Leu Phe Glu Ile His Gln Gly Asn Phe Gln Glu Trp Ile Thr 275 280 285 Asp Thr Gln Asn Val Ala His Leu His Lys Met Ala Gly Ala Glu Gln 290 295 300 Glu Ser Gly Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Gln Leu Ala Lys Thr Glu 305 310 315 320 Ala Glu Ser Pro Arg Met Leu Asp Pro Gln Thr Glu Glu Lys Glu Ala 325 330 335 Ser Gly Gly Ser Leu Gln Leu Pro His Gln Pro Leu Gln Gly Gly Asp 340 345 350 Val Val Thr Ile Gly Gly Phe Thr Phe Val Met Asn Asp Arg Ser Tyr 355 360 365 Val Ala Leu 370
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. TSLP (csecsemõmirigy-stróma eredetû limfopoietin, „Thymic Stromal Lymphopoietin”) vagy agonistájának alkalmazása neoplazma kezelésére, vagy neoplazma kialakulásának megelõzésére szolgáló gyógyászati készítmények elõállítására. 2. TSLP¹t vagy agonistáját tartalmazó gyógyászati készítmény neoplazma kezelésére, vagy neoplazma kialakulásának a megelõzésére. 3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás vagy a 2. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a neoplazma tumor. 4. A 3. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a tumor rákos tumor. 5. A 3. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a neoplazma epitheliális eredetû tumor. 6. Az 5. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol az epitheliális eredetû tumor:
45
50
55
60
14
a) emlõtumor, b) vastagbéltumor, c) tüdõtumor, d) petefészektumor, vagy e) prosztatatumor. 7. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás vagy a 2. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a kezelés tartalmazza tumor progressziójának gátlását. 8. A 7. igénypont szerinti gyógyászati készítmény alkalmazása, ahol a tumor progressziójának gátlása tumorrejekció. 9. A 8. igénypont szerinti gyógyászati készítmény alkalmazása, ahol a tumorrejekció tartalmazza: a) a tumor méretének a csökkenését; vagy b) a tumor metasztatikus tulajdonságának az elvesztését. 10. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás vagy a 2. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a neoplazma dendrikus sejteket tartalmaz.
1
HU 004 684 T2
11. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás vagy a 2. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol az agonista: a) TSLP muteinje; b) kis molekula; vagy c) agonista ellenanyag. 12. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás vagy a 2. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a
5
15
2
TSLP vagy agonistája vakcinaadjuvánsként történõ alkalmazásra elõállított. 13. In vitro eljárás neoplazma alanyban történõ diagnosztizálására, amely tartalmazza az alanyból származó biológiai minta érintkeztetését TSLP elleni vagy TSLPR elleni ellenanyaggal, olyan körülmények mellett, amelyek alkalmasak ellenanyag-antigén komplex képzõdésére, valamint a komplex detektálását.
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
