!HU000007949T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 949
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 07 835738 (22) A bejelentés napja: 2007. 04. 27. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20070835738 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 2012822 A2 2008. 01. 24. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 2012822 B1 2010. 01. 20.
(51) Int. Cl.: A61K 39/12 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 08010864 PCT/US 07/010347
(30) Elsõbbségi adatok: 796078 P 2006. 04. 28.
(73) Jogosult: The Trustees of the University of Pennsylvania, Philadelphia, PA 19104 (US)
US
(72) Feltalálók: ROY, Soumitra, Wayne, PA 19087 (US); WILSON, James, M., Gladwyne, PA 19035 (US)
HU 007 949 T2
(54)
(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Módosított adenovírushexon-fehérje és alkalmazásai
A leírás terjedelme 62 oldal (ezen belül 5 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 949 T2
A találmány háttere A találmány tárgyát immunogenikus beadási rendekben hasznos módosított adenovírushexon-fehérjék képezik. Az adenovírus kétszálú DNS-vírus, amelynek a genomja körülbelül 36 kilobázis (kb) méretû, és amelyet széles körben alkalmaznak géntranszfer-alkalmazásokban azon képessége miatt, hogy nagy hatékonyságú géntranszferre képes különféle célszövetekben, és nagy transzgénkapacitása miatt. Hagyományosan az adenovírus E1 génjeit deletálják és helyettesítik a kiválasztott promoterbõl, a jelentõséggel bíró gén cDNSszekvenciájából és poli-A-szignálból álló transzgénkazettával, ami replikációdefektív rekombináns vírust eredményez. Az adenovírusoknak jellegzetes morfológiája van három fõ fehérjébõl álló ikozahedrális kapsziddal, amelyek a hexon (II), pentonalap (III) és egy kidudorodó rost (IV), együtt számos kisebb fehérjével, amelyek a VI, VIII, IX, IIIa és IVa2 [W. C. Russell, J. Gen Virol., 81: 2573–2604. old. (2000. nov.)]. A vírus genomja lineáris kétszálú DNS, terminális kovalensen kapcsolódó fehérjével az 5’¹végen, amelynek invertált terminális ismétlõdései (ITR) vannak. A vírus DNS közvetlenül kapcsolódik az erõsen bázikus VII¹es fehérjéhez és egy kicsi, mu nevû peptidhez. Egy másik fehérje, az V¹ös, bepakolódik ebbe a DNS-fehérje komplexbe, és szerkezeti kapcsolatot biztosít a kapsziddal a VI¹os fehérjén keresztül. A vírus tartalmaz továbbá víruskódolt proteázt is, amely szükséges a szerkezeti fehérjék némelyikének feldolgozásához az érett fertõzõ vírus kialakítására. Az adenovírusok alkalmazását génbejuttató és vakcinázási rendekben már ismertették. A rekombináns adenovírusokat leírták molekulák gazdasejtekbe történõ bejuttatására. Lásd az US 6,083,716 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot, amely két csimpánz adenovírus, a C1 és C68 (Pan9) genomját ismerteti. Lásd még a WO 02/33645 számú nemzetközi közzétételi iratot is, amely a SAd22/Pan5, Pan6, Pan 7 csimpánz adenovírusok, valamint az SV1, SV25 és SV39 majom adenovírusok genomjából létrehozott vektorokat ismertet; és a WO 04/16614 számú nemzetközi közzétételi iratot, amely hibrid adenovírusvektorokat és a SA18 majom adenovírusból létrehozott vektorokat ismertet. Korábban javasolták az adenovírus különféle módosításait. Az ilyen módosítások közé tartozik inszerció az adenovírus rostfehérjéjébe [Curiel, D. T., Ann. N. Y. Acad. Sci., 886:158–171. old. (1999)]; inszerciók a pentonfehérjébe célzás érdekében [Einfeld, D. A. és mtsai., J. Virol. 73:9130–9136. old. (1999)]; inszerciók az adenovírus IX¹es fehérjébe célzás érdekében [Dmitriev, I. P. és mtsai., (2002) J. Virol. 76:6893–6899. old. (2002)] és az adenovírushexon módosítása célzás érdekében [Vigne, E. és mtsai., J Virol. 73:5156–5161. old. (1999); US2003143209 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (Latta, Martine, és mtsai.)], valamint antigenikus epitóp beinszertálására.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
Közelebbrõl, Crompton és mtsai. ismertették idegen peptidek beinszertálását a 2¹es szerotípusú humán adenovírus (HAdV–2) hexonfehérjéjébe [(1994) J. Gen. Virol. 75:133–139. old. (1994)]. A HAdV–2 Roberts és mtsai. [Roberts és mtsai., (1986), Science. 232:1148–1151. old.] által ismertetett szerkezetéhez képest a szerzõk a HAdV–2 hexon 17 aminosavát (281–297) helyettesítették egy poliovírusdeterminánst hordozó 17 aminosavas peptiddel. A hexon azon régióját, ahol ezt a helyettesítést elvégezték, most DE1 huroknak nevezik a b7 és b8 béta redõs elemek között [Rux J. J., és mtsai., (2003) J. Virol. 77:9553–9566. old.]. Crompton és mtsai. (1994) munkáját Vigne és mtsai. (fent idézve) reprodukálták 5¹ös humán adenovírus-szerotípusban (HAdV–5), amely ugyanabba a szerológiai alcsoportba tartozik, mint a HAdV–2, és közeli rokona annak. Közelebbrõl Vigne és mtsai. peptideket inszertáltak be a HAdV–5 hexonjába a Crompton és mtsai. által alkalmazottal megegyezõ helyen (a HAdV–2 hexon és a HAdV–5 hexon egymás alá rendezése alapján). Vigne és mtsai. 14 HAdV–5 hexon oldalláncot (269–281) helyettesítettek poliovírus peptiddel, valamint integrint célzó ligandummal. Az adenovírushexon hipervariábilis régióit olyan régiókként írták le, amelyekben a szekvenciák jelentõsen eltérnek a szerotípusok között (Crawford-Miksza és Schnurr D. P., „Analysis of 15 adenovírushexon proteins reveals the location and structure of seven hypervariable regions containing serotype-specific residues”, J. Virol. 1996 70:1836–1844. old.; Rux és mtsai., 2003). A WO 2005/026337 számú nemzetközi közzétételi irat Car-sejtek iránti tropizmusú és géntranszferre alkalmazott adenovirális vektort ismertet. A vektor kapszidfehérje legalább egy enyhén feszült szerkezeti területét, és (W/R) X1X2D egységet tartalmazó heterológ peptidet tartalmaz. A vektort rákok, izombetegségek és mukoviszcidózis kezelésre alkalmazzák. Amire szükség van az alternatív eljárások molekulák gazdasejtekbe történõ bejuttatására. A találmány összefoglalása Egy megvalósítási mód szerint a találmány tárgya módosított adenovírushexon-fehérjét tartalmazó kapszidú adenovírus, amely módosított adenovírushexonfehérje az 1¹es hipervariábilis régió és/vagy a 4¹es hipervariábilis régió közül kiválasztott legalább egy hipervariábilis régióban deléciót, és a hipervariábilis régióba beinszertált immunogenikus aminosavszekvenciát tartalmazó exogén aminosavszekvenciát tartalmaz, azzal a kikötéssel, hogy az exogén aminosavszekvencia nem adenovírusszekvencia. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás adenovírusvektor specifitásának megváltoztatására, amely eljárás tartalmazza fent ismertetett adenovírus biztosításának lépését, és az adenovírus módosított adenovírushexon-fehérjéje a hipervariábilis régió deléciójába beinszertált célzószekvenciát tartalmaz.
1
HU 007 949 T2
A találmány lehetõvé teszi az adenovirális vektor által bejuttatott immunogenikus molekulára adott immunválasz fokozását azáltal, hogy alanynak fent ismertetett módosított adenovírushexon-fehérjét tartalmazó kapszidú adenovírust biztosítunk, amely adenovírus továbbá a kapszidba bepakolt, immunogenikus molekulát kódoló nukleinsavmolekulát is tartalmaz. Egy még másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya önmagát beindító immunogenikus készítmény, amely tartalmazza a következõket: módosított adenovírushexon-fehérjét tartalmazó kapszidú adenovírus, amint fent ismertettük, ahol az exogén aminosavszekvencia egy elsõ aminosavszekvencia; ahol az adenovírus továbbá egy második immunogenikus aminosavszekvenciát kódoló nukleinsavszekvenciát is tartalmaz. A találmány más megvalósítási módjai és elõnyei nyilvánvalóak a találmány következõ részletes leírásából.
5
10
15
20 Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra a pNEBAsc plazmid térképe, amely a hexon kódolórégiót hordozó 5¹ös típusú humán adenovírus (HAdV–5) genomjának a pNEB1893¹ba (a New England Biolabs cégtõl vásároltuk) történõ szubklónozásának az eredménye. A 2A. ábra a (p) SRAd5eGFP plazmid térképe, amely egy E1¹ és E3¹deletált HAdV–5 vektor molekuláris klónja, amely natív adenovírushexont és zöld fluoreszcens fehérjemarkergént tartalmaz. A 2B. ábra a pH5sCD4eGFP térképe, amely a HAdV–5 gerincet és a SARS koronavírus tüskefehérjébõl származó CD4 epitópot tartalmazó mutáltatott hexont tartalmazó plazmidmolekula-klón. A 2C. ábra a pH5sCD8eGFP térképe, amely az E1,E3-deletált HAdV–5 genomot és a SARS koronavírus tüskefehérjébõl származó CD8 epitópot tartalmazó mutáltatott hexont tartalmazó plazmidmolekula-klón. A 2D. ábra a pH5–2F5eGFP térképe, amely az E1,E3-deletált HAdV–5 genomot és a HIV 2F5 epitóprégiót tartalmazó mutáltatott hexont tartalmazó plazmidmolekula-klón. A 2E. ábra a pH5-hexBspeE1 térképe, amely az E1,E3-deletált HAdV–5 genomot és inszertet nem tartalmazó mutáltatott hexont tartalmazó plazmidmolekula-klón. A 3. ábra az adenovírushexon-fehérje 1., 2., 3., 4., 5., 6. és 7. hipervariábilis régióit (HVR) tartalmazó adenovírushexon-fehérje részletek egymás alá rendezése a majom SAdV–23 adenovírussal (a régi nómenklatúra szerint Pan6 vagy C6); SAdV–22-vel (a régi nómenklatúra
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
szerint SAd22/Pan5 vagy C5); SAdV–24-gyel (a régi nómenklatúra szerint Pan7 vagy C7); és SAdV–25-tel (a régi nómenklatúra szerint C68). Bemutatjuk a HVR elhelyezkedését ezekben a szekvenciákban, a számozást az egyes bemutatott szekvenciákra vonatkoztatva. Az SAdV–23 esetében a fragmens a 3. azonosító számú szekvencia 131–495. aminosavai; az SAdV–22 esetében a fragmens a 4. azonosító számú szekvencia 131–486. aminosavai; az SAd24 esetében a fragmens az 5. azonosító számú szekvencia 131–485. aminosavai; az SAd25 esetében a fragmens a 6. azonosító számú szekvencia 131486. aminosavai; a hAd5 esetében a fragmens a 2. azonosító számú szekvencia 131–509. aminosavai. A találmány részletes leírása A találmány tárgya módosított adenovírushexon-fehérje. Az ilyen módosított adenovírushexon-fehérje részleges vagy teljes deléciót tartalmaz a HVR1 és HVR4 közül kiválasztott hipervariábilis régiók legalább egyikében. A módosított adenovírushexon-fehérjében egy vagy több függetlenül kiválasztott exogén molekula lehet. Egy megvalósítási mód szerint exogén molekulát inszertálunk be a legalább az 1¹es hipervariábilis régió vagy 4¹es hipervariábilis régió deléció helyére, azzal a kikötéssel, hogy az exogén molekula nem adenovírusból származik. Más megoldásképpen a módosított adenovírushexon-fehérje nem tartalmaz inszertet a specifikus deléció helyén. A módosított adenovírushexon-fehérje alkalmazható adenovíruskapszid és/vagy fertõzõ adenovírusrészecske elõállítására. Ily módon a módosított adenovirális kapszid alatt a leírás szerint olyan adenovíruskapszidot értünk, amely találmány szerinti módosított adenovírushexon-fehérjét tartalmaz. Egy megvalósítási mód szerint a találmány szerinti módosított adenovírushexon-fehérje üres lehet, azaz nem tartalmaz virális genomot és/vagy nem tartalmaz expressziós kazettát. Az ilyen módosított adenovirális kapszidot fehérje formában történõ bejuttatásra szolgáló készítménynek szerelhetjük ki. Más megoldásképpen az ilyen módosított adenovirális kapszidot gazdasejtben alkalmas vektor expresszáltatására történõ bejuttatásra szolgáló készítménynek szerelhetjük ki. Egy másik megvalósítási mód szerint a módosított adenovirális kapszidot adenovirális részecske formájában állítjuk elõ, amelynek módosított adenovirális kapszidjába egy vagy több heterológ molekula van bepakolva sejtbe történõ bejuttatás céljából. Kivéve amikor máshogy határozzuk meg, a találmány szerint alkalmazott módosított adenovirális vektorok ilyen adenovirális részecskéket jelentenek. Az 1¹es hipervariábilis régiót (HVR1) és a 4¹es (HVR4) hipervariábilis régiót az adenovírusok humán C
1
HU 007 949 T2
alcsoportjában azonosították. Ezen régiók szerkezete nem definiált, amint az adenovírus C alcsoport genomjában található más hipervariábilis régiók szerkezete sem, azaz HVR2, HVR3, HVR5, HVR6 és HVR7. A humán 2¹es szerotípusú adenovírushexon-fehérjéjét az 1. azonosító számú szekvencián mutatjuk be a kényelem kedvéért. A humán 5¹ös szerotípusú adenovírushexon-fehérjéjét a 2. azonosító számú szekvencián mutatjuk be a kényelem kedvéért. Anélkül hogy elméletileg korlátozni kívánnánk magunkat, a feltalálók úgy vélik, hogy a találmány szerinti módosított adenovírushexon-fehérjék azért elõnyösek, mert a hexon ezen HVR-régióinak hosszúsága és szekvenciája szignifikánsan változik a különbözõ adenovírusokban, ezáltal flexibilis konstrukciót biztosítanak, amely toleráns különbözõ hosszúságú molekulák széles körének beinszertálására. Ily módon a találmány tárgya rendkívül flexibilis konstrukció, amely megengedi különféle heterológ molekulák beinszertálását, amelyek hasznosak célzásra és immunválaszok fokozására. A „funkcionális” kifejezés olyan termékre (például fehérjére vagy peptidre) vonatkozik, amely a natív funkcióját végzi, habár nem szükségszerûen ugyanolyan szinten, mint a natív termék. A „funkcionális” kifejezés vonatkozhat olyan génre is, amely terméket kódol, és amelyrõl kívánt termék expresszáltatható. A „funkcionális deléció” kifejezés alatt olyan deléciót értünk, amely tönkreteszi a termék azon képességét, hogy a natív funkcióját végrehajtsa. A leírás szerinti értelemben a HVR találmány szerinti deléciói magukban foglalhatják a hexonfehérjében található HVR aminosavszekvenciájának részleges vagy teljes eltávolítását. Például egy 45 aminosavnyi HVR (például az Ad2 vagy Ad5 HVR1¹e) esetében, 1–45 aminosavat deletálhatunk, például 1–5¹öt, legalább 10¹et, legalább 25¹öt, legalább 30¹at, legalább 35¹öt, vagy több aminosavat. Egy megvalósítási mód szerint legalább egy aminosavat a natív hipervariábilis régió N¹terminálisáról és legalább egy aminosavat a C¹terminálisáról megtartunk. Amint a leírásban és az igénypontokban alkalmazzuk, a „tartalmaz” és „magában foglal” kifejezésekbe és variánsaikba, beleértve a „tartalmazza”, „tartalmazó”, „magában foglalja” és „magában foglaló” – a többi variáns mellett – beleértendõk más komponensek, elemek, számok, lépések és hasonlók. Az „áll vmibõl” vagy „vmibõl álló” kifejezések kizárnak más komponenseket, elemeket, számokat, lépéseket és hasonlókat. Egy megvalósítási a módosított adenovírusnak a HVR l¹ben és/vagy HVR4-ben deléciót tartalmazó a kapszidja. Egy másik megvalósítási mód szerint a módosított adenovírusnak ezen régiók egyikében vagy mindkettõjében módosítást tartalmazó a kapszidja, valamint egy másik HVR-ben is, például a HVR2, HVR3, HVR5, HVR6 vagy HVR7 közül választva. Az 1¹es hipervariábilis régió a hexonfehérje 139–167. oldalláncai vagy 147–162. oldalláncai között helyezkedik el a HAdV-5-ben (2. azonosító számú szekvencia) és a HAdV-2-ben (1. azonosító számú
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
szekvencia), a HAdV–2 oldallánc-számozása alapján (1. azonosító számú szekvencia, R. J. Roberts és mtsai., „A consensus sequence for the adeno vírus¹2 genome”, 1–51. old., szerk.: W. Doerfler, „Adeno virus DNA.”, kiad.: Martinus Nijhoff Publishing, Boston). A 4¹es hipervariábilis régió a HAdV–2 hexonfehérjéjének 222–271. oldalláncai között helyezkedik el ugyanazon számozási rend alapján. Lásd például a 3. ábrát a HVR helyek szemléltetõ egymás alá rendezéséért más adenovírusokkal azok saját számozásához viszonyítva. Az ilyen egymás alá rendezések elõállítása jól ismert a szakember számára. Ezen információ alapján a szakember könnyen meghatározhatja a megfelelõ hipervariábilis régiókat a különbözõ adenovírusszekvenciák – beleértve a humán C alcsoportból származó különbözõ szekvenciákat vagy a C alcsoporttól eltérõeket – hexonfehérjéinek egymás alá rendezésének alkalmazásával. Lásd például Crawford-Miksza és Schnurr, amint fent idéztük, és Rux J. J., és mtsai., (2003), amint fent idéztük, számos adenovírusszekvenciáinak szemléltetõ egymás alá rendezéséért és azok hipervariábilis régióinak elhelyezkedéséért. Más alkalmas adenovírusszekvenciák könnyen kiválaszthatók a többi humán és nem humán szekvenciák közül, amelyeket már leírtak. Amint ismertetjük, az egymás alá rendezéseket különféle nyilvános vagy kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ többszörös szekvencia egymás alá rendezõ programok bármelyikével végrehajthatjuk, mint amilyen például a „Clustal W”, amely hozzáférhetõ az Interneten található Web szervereken. Más megoldásképpen a Vector NTI alkalmazásokat is alkalmazhatjuk. Számos algoritmus ismert a szakterületen, amelyek alkalmazhatók a nukleotidszekvencia-azonosság mérésére, beleértve a fent ismertetett programokban találhatókat. Egy másik példaként polinukleotidszekvenciákat a Fasta alkalmazásával hasonlíthatunk össze, amely a GCG Version 6.1 csomagban található program. A Fasta megadja a lekérdezett és keresési szekvenciák között a legjobban átfedõ régiók egymás alá rendezését és a százalékos szekvenciaazonosságát. Például nukleotidszekvenciák közötti százalékos szekvenciaazonosságot meghatározhatjuk a Fasta alkalmazásával az alapértelmezett paraméterekkel (szóméret: 6 és a NOPAM faktor az értékelési mátrixhoz), amint a GCG Version 6.1 részét képezi. Hasonlóképpen elérhetõk programok aminosav egymás alá rendezések végrehajtására. Általában ezeket a programokat az alapértelmezett beállításokkal alkalmazzuk, habár a szakember szükség szerint megváltoztathatja ezeket a beállításokat. Más megoldásképpen a szakember más algoritmust vagy számítógépi programot alkalmazhat, amely megadja legalább az azonosság mértékét vagy az egymás alá rendezést, mint ahogyan a hivatkozott algoritmusok és programok. Alkalmas adenovírusok hozzáférhetõk az ’American Type Culture Collection’ intézettõl (Manassas, Virginia, US, ATCC), különféle akadémiai és kereskedelmi forrásokból, vagy a kívánt régiókat megszintetizálhatjuk ismert módszerek alkalmazásával a szakirodalomban
1
HU 007 949 T2
publikált vagy az adatbázisokból (például GenBank stb.) hozzáférhetõ szekvenciák alapján. Az alkalmas adenovírusok nem korlátozó példái közé tartozik a humán adenovírus 2¹es szerotípus (a szekvenciáját publikálták R. J. Roberts és mtsai., „A consensus sequence for the adenovírus¹2 genome”, 1–51. old., szerk.: W. Doerfler, „Adenovirus DNA”, kiad.: Martinus Nijhoff Publishing, Boston), 3¹as, 4¹es típus (a HAdV¹4 genom szekvenciájáról beszámoltak S. Jacobs és mtsai., J. Gen. Virol. 85 (2004), 3361–3366. old., a GenBank/EMBL/DDBJ AY487947 hozzáférési száma alatt), az 5¹ös típus (a szekvenciát publikálták R. Kinlock és mtsai., 1984. „Adenovirus hexon: sequence comparison of subgroup C serotypes 2 and 5”, J. Biol. Chem. 259:6431–6436. old.), AV1 és AV6 (P. Pring-Akerblom és T. Adrian, 1993, Res. Virol, 144:117–121. old.), 7,12 [a szekvenciát publikálták J. Sprengel és mtsai., J. Virol., 68:379–389. old. (1994)], 40 [a szekvenciát publikálták C. I. Toogood és mtsai., J. Gen. Virol., 70:3203–3214. old. (1989)] és továbbá beleértve a jelenleg azonosított bármely humán típust [lásd például Horwitz, „Adenoviridae and Their Replication”, VIROLOGY, 2. kiadás, 1679–1721. old. (1990)], amelyeket a kívánt sejtekben tenyészteni lehet. Hasonlóképpen a nem humán fõemlõsöket (például csimpánzokat, rhesusmakákókat és más majomfajokat) vagy más nem humán emlõsöket ismert módon megfertõzõ és a kívánt sejttípusban növekvõ adenovírusokat is alkalmazhatunk a találmány szerinti vektorkonstrukciókban. Az ilyen szerotípusok nem korlátozó példái közé tartoznak a következõ csimpánz adenovírusok: SAd22/Pan5 (VR–591), SAd23/Pan6 (VR–592), Sad24/Pan7 (VR–593) és SAd25/C68 (Pan9, GenBank hozzáférési szám: AF394196) és US 6 083 716 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat); és majom adenovírusok, nem korlátozó példaként az SV1 (VR–195); SV25 (SV–201); SV35; SV15; SV–34; SV–36; SV–37, és pávián adenovírus (VR–275), többek között. Az SAd22/Pan5 (más néven C5), SAd23/Pan 6 (más néven C6), SAd24/Pan 7 (más néven C7), SV1, SV25, és SV39 szekvenciáit ismertették (WO 03/046124 számú nemzetközi közzétételi irat, közzétéve 2003. június 5¹én, szintén közzétéve mint US–2005–0069866–A1, 2005. március 31). Lásd még a WO 04/16614 számú nemzetközi közzétételi iratot, amely hibrid adenovírusvektorokat és az SA18 majom adenovírusból létrehozott vektorokat ismertet. Az SAd22/Pan5 (4. azonosító számú szekvencia), SAd23/Pan6 (3. azonosító számú szekvencia), SAd24/Pan7 (5. azonosító számú szekvencia), SV1 (10. azonosító számú szekvencia), (SV25 7. azonosító számú szekvencia), SV39 (8. azonosító számú szekvencia) és SA18 (9. azonosító számú szekvencia) hexon fehérjéinek szekvenciáit bemutatjuk a leírásban. Azonban a szakember számára nyilvánvaló, hogy a más adenovirális törzsekbõl származó összehasonlítható régiók könnyedén kiválaszthatók és alkalmazhatók a találmányban ezen szerotípusok helyett (vagy azokkal kombinációban). Ezen módszerek alkalmazásával a C alcsoportba tartozó, HVR1-gyel és/vagy HVR4-gyel analóg hiper-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
variábilis régiók azonosíthatók más adenovírusszekvenciákból is. A találmány szerinti módosított adenovírushexonok ezen módosítások mellett a többi hipervariábilis régió (HVR) közül egy vagy több módosítását is tartalmazzák. Egy megvalósítási mód szerint funkcionális deléciót készítünk egy kiválasztott HVR-ben és nem inszertálunk bele molekulát. Ez több okból is kívánatos lehet, például hogy egy nagy inszertet építsünk be egy másik HVR¹be vagy a kapszid egy másik helyére. Az ilyen funkcionálisan deletált adenovírushexon-fehérje alkalmazható adenovirális részecske elõállítására, valamint más célokra. Egy másik megvalósítási mód szerint a módosított adenovírushexon-fehérje exogén molekulát tartalmaz a HVR-régióban található delécióba inszertálva. Az ilyen exogén molekula hasznos lehet a módosított adenovírushexon-fehérje (vagy az azt virális részecske formájában vagy üresen tartalmazó kapszid) célpontjának megváltoztatására, a módosított adenovíruskapszid immunogenitásának megváltoztatására és/vagy immunválasz indukálására az exogén aminosavszekvencia vagy immunológiailag keresztreagáló molekula ellen. Egy megvalósítási mód szerint az adenovírushexon-fehérjébe inszertált exogén molekula legalább két, legalább négy, legalább nyolc, legalább tíz, legalább tizenöt, legalább húsz, legalább huszonöt, vagy több aminosav-oldallánc hosszúságú vagy hosszabb exogén aminosavszekvencia, amelynek a teljes szekvenciája nem található meg funkcionálisan ekvivalens pozícióban a vad típusú adenovírus aminosavszekvenciájában, vagy elõnyösebben a létrehozandó vad típusú virális komponens fehérjében. Bizonyos megvalósítási módok szerint az exogén aminosavszekvencia lehet nem natív abban az értelemben is, hogy nem fordul elõ a természetben, azaz hogy szintetikusan vagy mesterségesen megtervezett és elõállított polipeptid. Nyilvánvaló, hogy a hexonfehérjét kódoló nukleotidszekvencia vonatkozásában az exogén molekula lehet kívánt aminosavszekvenciát kódoló nukleinsavszekvencia formájában. Egy megvalósítási mód szerint az exogén molekula célzásra hasznos aminosavszekvencia. A leírás szerint „célzószekvencia” alatt specifikus aminosavszekvenciát értünk, amely szignálként szolgál a módosított adenovírus irányítására. Ily módon egy megvalósítási mód szerint az adenovíruskapszid módosítva lehet, hogy kívánt célsejthez kötõdjön, amelyhez a natív (vad típusú) vírus amelybõl származik, nem kötõdik, vagy úgy lehet módosítva, hogy korlátozottabb a kötõspecifitása, mint a vad típusú vírusé, más szóval, csak a célsejtek egy adott szûkebb alkészletéhez kötõdik a célsejttípusok tágabb körébõl, amelyhez a vad típusú vírus kötõdik. Egy másik alternatíva szerint az adenovírus megtartja a képességét az eredeti célpontjához való kötõdésre, és az exogén aminosavszekvencia egy további célpontot biztosít. Ily módon megváltoztatjuk a vírus tropizmusát. Ily módon a „megváltoztatott tropizmus” kifejezés alatt azt értjük, hogy a módosított vírus
1
HU 007 949 T2
olyan célsejtkötési specifitást mutat, amely megváltozott vagy különbözik attól, mint amilyen a vad típusú vírusé, amelybõl származik. A hasznos exogén molekulák példái közé tartoznak például pozitívan töltött aminosavak (például lizin oldalláncok vagy cisztein oldalláncok), citokinek, mint például interferonok és interleukinok; limfokinok; membránreceptorok, mint például kórokozó organizmusok (vírusok, baktériumok vagy paraziták), elõnyösen a HIV-vírus (humán immundeficiencia-vírus) által felismert receptorok; koagulációs faktorok, mint például VIII¹as faktor vagy IX¹es faktor; disztrofinok; inzulin; a celluláris ioncsatornákban közvetlenül vagy közvetetten részt vevõ fehérjék, mint például a CFTR (cisztás fibrózis transzmembrán-vezetõképesség regulátor) fehérje; antiszensz RNS¹ek, vagy kórokozó organizmus genomjában lévõ patogenikus gén által termelt fehérje aktivitásának gátlására képes fehérjék, vagy olyan celluláris gének aktivitását gátolni képes fehérjék (vagy az azokat kódoló gének), amelyek expressziója deregulált, például egy onkogén; enzim aktivitását gátló fehérje, mint például a1-antitripszin vagy például virális proteázinhibitor; patogenikus fehérjék variánsai, amelyek úgy lettek mutáltatva, hogy elromoljon a biológiai funkciójuk, mint például a HIV-vírus tat fehérjéjének transzdomináns variánsai, amelyek képesek versengeni a természetes fehérjével a célszekvencia kötéséért, ezáltal megakadályozzák a HIV aktiválódását; antigenikus epitópok, a gazdasejt immunitásának fokozása érdekében; fõ hisztokompatibilitási komplex I¹es és II¹es osztályába tartozó fehérjék, valamint az ezeket a géneket indukáló fehérjék; ellenanyagok; immunotoxinokat kódoló gének; toxinok; növekedési faktorok vagy növekedési hormonok; sejtreceptorok és ligandumjaik; tumorszuppresszorok; kardiovaszkuláris betegségben részt vevõ fehérjék, nem korlátozó példaként onkogének; növekedési faktorok, nem korlátozó példaként fibroblaszt növekedési faktor (FGF), vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) és idegi növekedési faktor (NGF); e¹nos, tumorszuppresszorgének, nem korlátozó példaként az Rb (retinoblasztóma) gén; lipoprotein-lipáz; szuperoxid-diszmutáz (SOD); kataláz; oxigén és szabad gyök ’scavenger’¹ek; apolipoproteinek; és pai¹1 (plazminogén aktivátor inhibitor¹1); celluláris enzimek vagy kórokozó organizmusok által termeltek; öngyilkos gének; hormonok, T¹sejt-receptorok (epitópok) ellenanyag-epitópok, affitestek és különféle fehérjekönyvtárakból azonosított ligandumok. Egy megvalósítási mód szerint az exogén fehérje sejtfelszíni receptor liganduma. Az alkalmas ligandumok közé tartoznak például ellenanyagok vagy ellenanyagfragmensek vagy ¹származékok, egyláncú ellenanyagok (ScFv), egydoménes ellenanyagok, és ellenanyagok minimális felismerési egységei, mint például Fv fragmensek komplementaritást meghatározó régiói (CDR). Ilyen aminosavszekvencia ellenanyag antigénkötõ helyébõl vagy kötõ- vagy felismerõrégióiból nyerhetõ vagy származhat, és az ilyen ellenanyag természetes vagy szintetikus lehet.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
Egy másik megvalósítási mód szerint az exogén molekula virális fehérje. Például a HSV–1 TK enzimnek nagyobb az affinitása összehasonlítva a celluláris TK enzimmel bizonyos nukleozidanalógok (mint például aciklovir vagy ganciklovir) irányába. Egy még másik megvalósítási mód szerint az exogén molekula immunogén. „Immunogenikus” molekulák közé tartozhatnak olyanok, amelyek celluláris immunválaszt, ellenanyagválaszt, vagy mindkettõt indukálnak. Vakcinamolekulák közé olyanok tartoznak, amelyek olyan immunválaszt indukálnak, amely véd a kórokozóval történõ további fertõzés ellen, és/vagy véd a betegség vagy más állapotok tünetei ellen. Antigén alatt olyan molekulát értünk, amely humorális (ellenanyag) immunválasz indukálására képes. Tipikusan az immunogenikus molekulák specifikus immunválaszt indukálnak egy specifikus vírus, organizmus (például baktériumok, gombák, élesztõ), vagy más források (például daganat) vagy keresztreagáló organizmus vagy forrás ellen. Azonban bizonyos megvalósítási módok szerint kívánatos lehet olyan immunogenikus molekulák alkalmazása, amelyek nemspecifikus immunmoduláns választ indukálnak, például immunválasz megerõsítésével. Például ilyen molekulát alkalmazhatunk beindításra vakcinarendben vagy adjuvánsként, attól függõen, hogy azt azelõtt vagy együtt juttatjuk be azzal a molekulával, amely ellen immunválaszt kívánunk. Az alkalmas immunogének közé tartozik például T¹sejt-epitóp (például CD4 vagy CD8 epitóp), ellenanyag-epitóp, vagy baktériumokból, gombákból, élesztõbõl és/vagy vírusokból származó peptid, polipeptid, enzim vagy más fragmens. Az immunogének alkalmas forrásai közé tartoznak többek között az itt ismertetett immunogenikus transzgének. Még más immunogének nyilvánvalóak a szakember számára. Ily módon egy aspektusában a találmány tárgya módosított adenovírushexon-fehérje, amely úgy lett módosítva, hogy egy vagy több exogén molekulát tartalmaz. Ahol egynél több exogén molekulát alkalmazunk, a molekulák azonosak lehetnek. Egy másik megvalósítási mód szerint az exogén molekulák különbözõk lehetnek. Például egy módosított adenovírushexon-fehérje az egyik régióban olyan exogén molekulát tartalmazhat, amely a natív célzást módosítja, és egy másik régióban olyan exogén molekulát, amely natív semlegesítõ epitópokat módosít és/vagy immunválaszt indukál. Egy másik példában módosított adenovírushexon-fehérje egynél több típusú exogén immunogént tartalmazhat. Az alkalmas exogén molekulák sok kombinációja nyilvánvaló a szakember számára, amelyet egymástól függetlenül megválaszthatók. Amint az nyilvánvaló a szakember számára, bizonyos molekulák célzó molekulákként és immunogénekként egyaránt mûködnek. Ilyen exogén molekulák (például aminosavszekvenciák) elõállítására és azok vírusokba vagy virális komponensekbe történõ bejuttatására szolgáló módszerek jól ismertek a szakterületen és széles körben ismertetve vannak a szakirodalomban. Ily módon például mole-
1
HU 007 949 T2
kuláris biológiai és génsebészeti módszerek könnyen hozzáférhetõek, olyan genetikai szekvenciák elõállítására vagy létrehozására, amelyek képesek módosított vírusként vagy virális komponensként való expresszáltatásra a találmány szerint. Például virális komponens fehérjét kódoló nukleinsavmolekulát vagy nukleotidszekvenciát úgy módosíthatunk, hogy bejuttatjuk az exogén aminosavszekvenciát kódoló nukleotidszekvenciát, például hogy egy adenovirális fehérje egészét vagy részét és az exogén aminosavszekvenciát tartalmazó fúziós fehérjét kódolja. Kényelmes vagy szükséges lehet bármilyen ilyen további vagy külsõ motívum vagy jellegzetesség beépítése a vírusba „kapcsolómolekula” szekvencia alkalmazásával. A DNS- vagy aminosavszekvenciák beépítésére szolgáló ilyen konstrukciós módszerek – kapcsolómolekula szekvencia hozzákapcsolásával – ismertek a szakterületen és a fehérje/génsebész szakember köteles tudásához tartozik. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány az exogén molekulát tartalmazó adenovíruskapszidot fertõzõ adenovirális részecske elõállítására alkalmazza, amely a kívánt molekulát hordozó expressziós kazettát tartalmazhat. Megfelelõ módon az expressziós kazettán hordozott molekula a termék vagy azzal keresztreagáló molekula elleni immunválasz indukálására hasznos terméket kódol. Egy példában ez a megvalósítási mód lehetõvé teszi a módosított adenovirális kapszid számára, hogy adjuvánsként mûködjön az expressziós kazetta által bejuttatott molekula számára. Egy másik példában ez a megvalósítási mód lehetõvé teszi a módosított adenovirális kapszid számára, hogy saját magát beindító konstrukcióként mûködjön az expressziós kazetta által bejuttatott molekula számára. Módosított adenovirális vektorok Egy megvalósítási mód szerint a találmány tárgya módosított adenovirális kapszidot tartalmazó készítmény. A leírás szerint a módosított adenovirális kapszid alatt olyan adenovirális kapszidot értünk, amely a leírásban ismertetett módon módosított adenovírushexon-fehérjét tartalmaz. Emellett a módosított adenovíruskapszid más módosításokat is tartalmazhat. Ilyen más módosítások közé tartozhatnak a hexonfehérje vagy más kapszidfehérjék, például a rostfehérje vagy a penton más módosításai. Például egy módosított adenovírushexon továbbá tartalmazhat az US 5 922 315 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban ismertetett megváltoztatott hexonfehérjéket is. Ebben az eljárásban az adenovírushexon legalább egy hurokrégióját lecserélik egy másik adenovírus-szerotípus legalább egy hurokrégiójára. Még más alkalmas módosításokat is ismertetnek (US 20040171807 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, közzétéve 2004. szeptember 2¹án). Más megoldásképpen vagy emellett a módosított kapszidhoz egy másik molekula kapcsolódhat, például lipid, fúziós fehérje.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
Egy aspektusában a találmány szerinti készítmények közé módosított adenovírusvektorok tartoznak. Kivéve amikor másképpen határozzuk meg, a találmány szerinti módosított adenovirális vektor alatt olyan adenovírusrészecskét értünk, amelynek módosított adenovírus kapszidja van, és amely esetében a kapszidba a sejtbe egy vagy több heterológ molekulát bejuttató expressziós kazetta van becsomagolva. Az adenovirális vektorban alkalmazott adenovíruskomponenseket különbözõ adenovírusokból nyerhetjük, mint például amelyeket a leírásban ismertetünk és amelyek hozzáférhetõk a szakember számára. Mivel az adenovírusgenom mindkét szálon tartalmaz nyílt leolvasási fázisokat, sok esetben hivatkozunk a leírásban a különféle régiók 5’¹ és 3’¹végeire, hogy elkerüljük a specifikus nyílt leolvasási fázisok és génrégiók összetévesztését. Ily módon amikor az adenovirális genom „bal „és „jobb” végére hivatkozunk, ez a megközelítõleg 36 kb méretû adenovirális genom végeire vonatkozik, amikor azt sematikusan ábrázoljuk amint az hagyományosan ismert a szakterületen [lásd például Horwitz, „Adenoviridae and Their Replication”, VIROLOGY, 2. kiadás., 1679–1721. old. (1990)]. Ily módon leírás szerinti értelemben az adenovirális genom „bal terminális vége” kifejezés alatt az adenovirális genom azon részletét értjük, amely amikor a genom sematikusan lineáris formában van ábrázolva, az ábra legtávolabbi bal oldali végén található. Tipikusan a bal vég a genomnak a 0 térképezési egységnél kezdõdõ és jobbra terjedõ részletére utal, amely magában foglalja legalább az 5’¹invertált terminális ismétlõdéseket (ITR), és nem tartalmazza a genomnak a szerkezeti géneket kódoló belsõ régióit. A leírás szerinti értelemben az adenovirális genom „jobb terminális vége” kifejezés alatt az adenovirális genom azon részletét értjük, amely amikor a genom sematikusan lineáris formában van ábrázolva, az ábra legtávolabbi jobb oldali végén található. Tipikusan az adenovirális genom jobb vége a genomnak a 36 térképezési egységnél kezdõdõ és balra terjedõ részletére utal, amely magában foglalja legalább a 3’¹ITR-eket, és nem tartalmazza a genomnak a szerkezeti géneket kódoló belsõ régióit. A „minigén” kifejezés alatt egy kiválasztott heterológ gén és a génterméknek gazdasejtben való transzlációjának, transzkripciójának és/vagy expressziójának irányításához szükséges szabályozóelemek kombinációját értjük. Tipikusan egy adenovirális vektor úgy van megtervezve, meg, hogy a minigén olyan nukleinsavmolekulában legyen található, amely más natív adenovirális szekvenciákat tartalmaz a kiválasztott adenovirális gén régiójában. A minigént egy létezõ génrégióba inszertálhatjuk be, hogy kívánt esetben megzavarjuk annak a régiónak a mûködését. Más megoldásképpen a minigént egy részlegesen vagy teljesen deletált adenovirális gén helyébe inszertálhatjuk be. Például a minigén egy funkcionális E1 deléció vagy funkcionális E3 deléció helyében helyezkedhet el, többek között. A „funkcionálisan deletált” vagy „funkcionális deléció” kifejezés alatt azt értjük, hogy a génrégiónak elegendõ részét el-
1
HU 007 949 T2
távolítjuk vagy másképpen károsítjuk, például mutációval vagy módosítással, hogy a génrégió ne legyen többé képes génexpresszió funkcionális termékeinek elõállítására. Kívánt esetben a teljes génrégiót eltávolíthatjuk. A génzavarásra és delécióra alkalmas más helyeket máshol is tárgyalunk a leírásban. Például rekombináns vírus létrehozására alkalmas termelõvektor a minigént az adenovirális genomnak az 5’¹végén vagy az adenovirális genomnak a 3’¹végén tartalmazhatja, vagy az adenovirális genomnak az 5’¹ és 3’¹végein egyaránt. Az adenovirális genom 5’¹vége tartalmazza a pakolódáshoz és replikációhoz szükséges cisz-elemeket; azaz az 5’¹invertált terminális ismétlõdõ (ITR) szekvenciákat (amelyek replikációs origóként mûködnek) és a natív 5’ pakolási enhanszer doméneket (amelyek a lineáris Ad genomok pakolásához szükséges szekvenciákat és az E1 promoter enhanszerelemeit tartalmazza). Az adenovirális genom 3’¹vége tartalmazza a pakolódáshoz és enkapszidációhoz szükséges cisz-elemeket (beleértve a 3’¹ITR-eket). Megfelelõ módon a rekombináns adenovírus tartalmazza mind az 5’, mind a 3’ adenovirális cisz-elemeket és a minigén az 5’ és 3’ adenovirális szekvenciák között helyezkedik el. A találmány szerinti bármilyen adenovirális vektor tartalmazhat további adenovirális szekvenciákat is. A találmány szerinti vektorok létrehozásában alkalmazott virális szekvenciákat, szükség esetén segítõ vírusokat, és rekombináns virális részecskéket és más vektorkomponenseket és ¹szekvenciákat a fent ismertetett módon nyerhetjük. Az adenovírusszekvenciák DNSszekvenciáit alkalmazzuk az ilyen vektorok elõállítására hasznos vektorok és sejtvonalak létrehozására. A találmány szerinti vektorokat alkotó nukleinsavszekvenciák módosításait, beleértve a szekvenciadeléciókat, ¹inszerciókat és más mutációkat szokásos molekuláris biológiai módszerekkel hozhatjuk létre, amelyek a találmány oltalmi körébe tartoznak. A transzgén kiválasztására, a minigén létrehozására és a virális vektorba történõ beinszertálására alkalmazott eljárások a szakember köteles tudásához tartoznak a leírásban megadott kitanítás alapján. I. A transzgén A transzgén olyan nukleinsavszekvencia, amely heterológ a transzgént szegélyezõ vektorszekvenciákhoz képest, és amely jelentõséggel bíró polipeptidet, fehérjét, vagy más terméket kódol. A nukleinsavkódoló szekvencia mûködõképesen kapcsolva van szabályozókomponensekhez oly módon, ami lehetõvé teszi a transzgén transzkripcióját, transzlációját és/vagy expresszióját a gazdasejtben. A transzgénszekvenciák összetétele függhet attól az alkalmazástól, amelyben a kapott vektort alkalmazzuk. Például egyfajta transzgénszekvencia jelzõszekvenciát tartalmaz, amely az expressziója után detektálható jelet produkál. Ilyen jelzõszekvenciák nem korlátozó példái közé tartoznak az alábbiakat kódoló DNS-szekvenciák: b¹laktamáz, b¹galaktozidáz (LacZ), alkalikus foszfatáz, timidin-kináz, zöld fluoreszcens fehérje (GFP), klór-amfenikol-acetil-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
transzferáz (CAT), luciferáz, membránkötött fehérjék, mint például CD2, CD4, CD8, az influenza hemagglutinin fehérje, és a szakterületen jól ismert más fehérjék, amelyekhez léteznek vagy hagyományos úton elõállíthatók magas affinitású ellenanyagok, és fúziós fehérjék, amelyek membránkötött fehérjét tartalmaznak megfelelõen fuzionáltatva antigén-címke doménhez, többek között hemagglutininbõl vagy Myc-bõl. Ezek a kódolószekvenciák – amikor kapcsolódnak az expressziójukat irányító szabályozóelemekhez – olyan hagyományos eszközökkel detektálható jelt biztosítanak, amelyek közé tartoznak enzimatikus, radioaktív, kolorimetriás, fluoreszcens vagy másféle spektrográfiás vizsgálati eljárások, fluoreszcens aktivált sejtválogatási vizsgálati eljárások és immunológiai vizsgálati eljárások, köztük enzimkapcsolt immunoszorbens vizsgálati eljárás (ELISA), radioaktív immunológiai vizsgálati eljárás (RIA) és immunhisztokémia. Például amikor a markerszekvencia a LacZ gén, a szignált hordozó vektor jelenlétét a b¹galaktozidázaktivitás mérésére szolgáló vizsgálati eljárással detektáljuk. Ahol a transzgén a GFP vagy luciferáz, a szignált hordozó vektort szín alapján vizuálisan, vagy luminométerben fénytermelés alapján mérjük. Azonban elõnyösen a transzgén egy nem marker szekvencia, amely olyan terméket kódol, amely hasznos biológiában vagy gyógyászatban, mint például fehérjék, peptidek, RNS, enzimek vagy katalitikus RNS¹ek. Kívánt RNS-molekulák közé tartozik a tRNS, dsRNS, riboszómális RNS, katalitikus RBS és antiszensz RNS. Hasznos RNS-szekvencia egy példája olyan szekvencia, amely kioltja a célzott nukleinsavszekvencia expresszióját a kezelt állatban. A transzgént kezelésre alkalmazhatjuk, például rákterápiaként vagy vakcinaként, immunválasz indukálására és/vagy profilaktikus vakcina céljára. A leírás szerinti értelemben immunválasz alatt molekula (például géntermék) azon képességét értjük, hogy képes a molekula elleni T¹sejtes és/vagy humorális immunválasz indukálására. A találmány tárgyát képezi továbbá több transzgén alkalmazása. Bizonyos helyzetekben különbözõ transzgéneket alkalmazhatunk a fehérje egyes alegységeinek kódolására, vagy különbözõ peptidek vagy fehérjék kódolására. Ez akkor elõnyös, amikor a fehérjealegységet kódoló DNS mérete nagy, például immunglobulin, vérlemezke-eredetû növekedési faktor vagy disztrofinfehérje esetében. Annak érdekében, hogy a sejt termelje a többalegységes fehérjét, a sejtet megfertõzzük a különbözõ alegységek mindegyikét kódoló rekombináns vírussal. Más megoldásképpen fehérje különbözõ alegységeit ugyanazon a transzgénen kódolhatjuk. Ebben az esetben egyetlen transzgén tartalmazza az egyes alegységeket kódoló DNS¹t, és az egyes alegységek DNS¹ét belsõ riboszómabelépési hely (IRES) választja el. Ez akkor elõnyös, amikor az egyes alegységeket kódoló DNS mérete kicsi, például amikor az alegységeket és az IRES¹t kódoló DNS teljes mérete kisebb, mint 5 kb. Az IRES alternatívájaként a DNS¹t 2A¹peptidet kódoló szekvenciák választhatják el, amelyek poszttranszlációsan elhasítják saját magu-
1
HU 007 949 T2
kat. [Lásd például M. L. Donnelly, és mtsai., J. Gen. Virol., 78(Pt 1):13–21. old. (1997. jan.); Furler, S. és mtsai., Gene Ther. 8, 864–873. old. (2001); Klump, H. és mtsai., Gene Ther. 8, 811–817. old. (2001).] Ez a 2A¹peptid szignifikánsan kisebb az IRES-nél, ami jól alkalmazhatóvá teszi akkor, amikor a hely korlátozó tényezõ. Azonban a kiválasztott transzgén bármilyen biológiailag aktív terméket vagy más terméket is kódolhat, például tanulmányozni kívánt terméket. Megfelelõ transzgéneket a szakember könnyen kiválaszthat. A transzgén kiválasztását nem tekintjük a találmányt korlátozónak. 2. Szabályozóelemek A minigén fent ismertetett fõ elemei mellett a vektor tartalmazza a szükséges hagyományos szabályozóelemeket is, amelyek mûködõképesen kapcsoltak a transzgénhez oly módon, hogy lehetõvé teszik a transzkripcióját, transzlációját és/vagy expresszióját a plazmidvektorral transzfektált vagy a találmány szerint elõállított vírussal megfertõzött sejtben. A leírás szerinti értelemben „mûködõképesen kapcsolt” szekvenciák közé tartoznak expressziós szabályozószekvenciák, amelyek egybefüggõek a jelentõséggel bíró nukleinsavszekvenciákkal, és olyan expressziós szabályozószekvenciák, amelyek transz- vagy távoli helyzetben hatnak a jelentõséggel bíró nukleinsavszekvencia szabályozására. Az expressziós szabályozószekvenciák közé tartoznak azok, amelyek megfelelõ transzkripciós iniciációs, terminációs, promoter- és enhanszerszekvenciák; hatékony RNS-feldolgozó szignálok, mint például ’splicing’ és poliadenilációs (poli¹A) szignálok; citoplazmás RNS¹t stabilizáló szekvenciák; a transzláció hatékonyságát fokozó szekvenciák (azaz Kozak konszenzusszekvencia); a fehérje stabilitását fokozó szekvenciák; és kívánt esetben a kódolt fehérje szekrécióját fokozó szekvenciák. Nagyszámú expressziós szabályozószekvencia, beleértve natív, konstitutív, szabályozható és/vagy szövetspecifikus ismert a szakterületen, és alkalmazható. A konstitutív promoterek nem korlátozó példái közé tartozik a retrovirális Rous-szarkóma-vírus (RSV) LTR promoter (adott esetben az RSV-enhanszerrel), a citomegalovírus (CMV) promoter (adott esetben a CMVenhanszerrel) [lásd például Boshart és mtsai., Cell, 41:521–530. old. (1985)], az SV40 promoter, a dihidrofolát-reduktáz promoter, a b¹aktin promoter, a foszfoglicerol-kináz (PGK) promoter és az EF1a promoter (Invitrogen). A szabályozható promoterek lehetõvé teszik a génexpresszió szabályozását és indukálhatók, aktiválhatók, represszálhatók vagy kikapcsolhatók exogén úton adott vegyületekkel, környezeti faktorokkal, mint például hõmérséklettel vagy egy specifikus fiziológiai állapot jelenlétével például akut fázis, a sejt egy adott differenciációs stádiumával, vagy csak replikálódó sejtekben. Szabályozható promoterek és szabályozható rendszerek különféle kereskedelmi forrásokból beszerezhetõk, nem korlátozó példaként az Invitrogen, Clon-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
tech és Ariad cégektõl. Sok más rendszert leírtak és könnyedén kiválaszthatók a szakember által. Például az indukálható promoterek közé tartozik a cink-indukálható juh metallotionin (MT) promoter, a dexametazon(Dex) indukált egér emlõdaganat-vírus (MMTV) promoter. Más szabályozható rendszer a T7 polimeráz-promoter rendszer (WO 98/10088 számú nemzetközi közzétételi irat); az ekdizon rovar promoter [No és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346–3351. old. (1996)], a tetraciklin-represszálható rendszer [Gossen és mtsai., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:5547–5551. old. (1992)], a tetraciklin-indukálható rendszer [Gossen és mtsai., Science, 268:17661769. old. (1995), lásd még Harvey és mtsai., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512–518. old. (1998)]. Más rendszerek közé tartozik az FK506 dimer, VP16 vagy p65 kasztradiol, difenolmuriszleron alkalmazásával, az RU486-indukálható rendszer [Wang és mtsai., Nat. Biotech., 15:239–243. old. (1997) és Wang és mtsai., Gene Ther., 4:432–441. old. (1997)] és a rapamicin-indukálható rendszer [Magari és mtsai., J. Clin. Invest., 100:2865–2872. old. (1997)]. Némely szabályozható promoter hatékonysága idõvel növekszik. Bizonyos esetekben fokozhatjuk az ilyen rendszerek hatékonyságát több represszor tandem történõ beinszertálásával, például TetR összekapcsolva TetR-rel egy IRES¹en keresztül. Más megoldásképpen várhatunk legalább 3 napig a kívánt funkció szkrínelése elõtt. A kívánt fehérje expresszióját fokozhatjuk a rendszer hatékonyságának fokozására ismert módszerekkel. Például a „Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element” (WPRE) alkalmazásával. Egy másik megvalósítási mód szerint a transzgén natív promoterét alkalmazhatjuk. A natív promoter elõnyös lehet, amikor az kívánatos, hogy a transzgén expressziója utánozza a natív expressziót. A natív promotert akkor alkalmazhatjuk, amikor a transzgén expresszióját idõlegesen vagy fejlõdésileg kell szabályozni, vagy szövetspecifikus módon, vagy specifikus transzkripciós stimulusokra válaszul. Egy további megvalósítási mód szerint más natív expressziós szabályozóelemeket, mint például enhanszerelemeket, poliadenilációs helyeket vagy Kozak-féle konszenzusszekvenciákat is alkalmazhatunk a natív expresszió utánzására. A transzgén egy másik megvalósítási módja szerint a transzgén mûködõképesen van kapcsolva szövetspecifikus promoterhez. Például ha vázizomban való expresszió kívánatos, az izomban aktív promotert kell alkalmazni. Ezek közé tartoznak azon gének promoterei, amelyek az alábbiakat kódolják: vázizom b¹aktin, miozin 2A¹könnyû lánc, disztrophin, izom kreatin-kináz, valamint szintetikus izom promoterek, amelyeknek magasabb az aktivitása, mint a természetben elõforduló promotereknek [lásd Li és mtsai., Nat. Biotech., 17:241–245. old. (1999)]. Szövetspecifikus promoterek példái ismertek a májban [albumin, Miyatake és mtsai., J. Virol., 71:5124–5132. old. (1997); hepatitis B vírus mag promoter, Sandig és mtsai., Gene Ther., 3:1002–1009. old. (1996); alfa-fetoprotein (AFP), Arbuthnot és mtsai., Hum. Gene Ther., 7:1503–1514. old.
1
HU 007 949 T2
(1996)], csont oszteokalcin [Stein és mtsai., Mol. Biol. Rep., 24:185–196. old. (1997)]; csont szialoprotein [Chen és mtsai., J. Bone Miner. Res., 11:654–664. old. (1996)], limfociták [CD2, Hansal és mtsai., J. Immunol., 161:1063–1068. old. (1998); immunglobulin nehéz lánc; T¹sejt-receptor lánc], idegi, mint például neuronspecifikus enoláz (NSE) promoter [Andersen és mtsai., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503–515. old. (1993)], neurofilamentum könnyû lánc gén [Piccioli és mtsai., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 88:5611–5615. old. (1991)] és a neuronspecifikus vgf gén [Piccioli és mtsai., Neuron, 15:373–384. old. (1995)], többek között. Adott esetben terápiásan hasznos vagy immunogenikus termékeket kódoló transzgéneket hordozó vektorok szelektálható markert vagy riportergéneket tartalmazhatnak, mint például geneticin¹, higromicin- vagy purimicinrezisztenciát kódoló szekvenciákat, többek között. Az ilyen szelektálható riporterek vagy markergének (elõnyösen a virális részecskébe pakolandó virális genomon kívül elhelyezve) alkalmazhatók a plazmid jelenlétének jelzésére bakteriális sejtekben, mint például az ampicillinrezisztencia. A vektor más komponensei közé tartozik a replikációs origó. Ezek és más általános vektorelemek kiválasztása hagyományos, és sok ilyen szekvencia áll rendelkezésre (lásd például Sambrook és mtsai., és az abban idézett referenciák). Ezeket a vektorokat a leírásban megadott módszerek és szekvenciák alkalmazásával hozzuk létre, a szakember számára ismert módszerek alapján. Ilyen módszerek közé tartoznak cDNS hagyományos klónozási módszerei, mint például a kézikönyvekben ismertetettek (Sambrook és mtsai., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, kiad.: Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), az adenovírusgenomok átfedõ oligonukleotidszekvenciáinak az alkalmazása, polimeráz-láncreakció, és bármilyen alkalmas eljárás, amellyel a kívánt nukleotidszekvenciát elõállíthatjuk. A módosított adenovirális részecske elõállítása Minimális követelményként expressziós kazettát hordozó módosított adenovirális vektor tartalmazza a replikációhoz és a virion enkapszidációjához szükséges adenovírus cisz-elemeket, amely cisz-elemek szegélyezik a heterológ gént. Azaz a vektor tartalmazza az adenovírusok 5’ invertált terminális ismétlõdõ (ITR) szekvenciáit (amelyek a replikáció origójaként funkcionálnak), a natív 5’ csomagoló/enhanszer doméneket (amelyek a lineáris Ad genomok csomagolásához szükséges szekvenciákat és az E1 promoter enhanszerelemeit tartalmazzák), a heterológ molekulát, és az 5’¹ITR szekvenciákat. Lásd például a „minimális” humán Ad vektor elõállítására feltárt módszereket az US 6 203 975 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban, amelyek könnyedén adaptálhatók a rekombináns majom adenovírus esetére. Adott esetben a módosított adenovírusok a fent definiált minimális majom adenovírusszekvenciáknál többet tartalmaznak. Egy megvalósítási mód szerint az adenovírusok funkcionálisan deletáltak az E1a vagy E1b génekben,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 10
2
és adott esetben más mutációkat is hordoznak, például hõmérséklet-érzékeny mutációkat vagy deléciókat más génekben. Más megvalósítási módok szerint kívánatos megtartani az intakt E1a és/vagy E1b régiókat a rekombináns adenovírusokban. Az ilyen intakt E1 régió a natív helyén helyezkedhet el az adenovirális genomban, vagy a natív adenovirális genom egy deléciója helyére helyezhetõ (például az E3 régióba). Gén humán (vagy más emlõs) sejtbe történõ bejuttatására hasznos adenovírusvektorok létrehozásához számos adenovírus nukleinsavszekvenciát alkalmazhatunk a vektorokban. Például eliminálhatjuk az adenovírus késleltetett korai E3 génjének egészét vagy részletét a rekombináns vírus részét képezõ adenovírusszekvenciából. Az E3 funkciójáról úgy vélik, hogy nem szükséges a rekombináns vírusrészecske elõállításához. Módosított adenovírusvektorokat elõállíthatunk úgy is, hogy funkcionális deléciót tartalmazzanak az E4 génnek legalább az ORF6 régiójában; és kívánatosabb módon – az ezen régióban lévõ redundancia miatt – a teljes E4 régióban. Egy még másik találmány szerinti vektor deléciót tartalmaz a késleltetett korai E2a génben. Deléciót végrehajthatunk az adenovírusgenom L1–L5 késõi génjeinek bármelyikében is. Hasonlóképpen az IX és IVa2 közbülsõ génjeiben végrehajtott deléciók is hasznosak lehetnek bizonyos célokra. Más deléciókat végrehajthatunk más szerkezeti vagy nem szerkezeti adenovírusgénekben. A fent tárgyalt deléciókat egyedileg alkalmazhatjuk, azaz a találmány szerint alkalmazható adenovírusszekvencia csak egyetlen régióban tartalmazhat deléciókat. Más megoldásképpen teljes gének vagy azok részleteinek a deléciói, amelyek a biológiai aktivitás tönkretételére szolgálnak, hatásosak lehetnek bármilyen kombinációban. Például egy szemléltetõ vektorban az adenovírusszekvencia tartalmazhat deléciókat az E1 génekben és az E4 génben, vagy az E1, E2a és E3 génekben, vagy az E1 és E3 génekben, vagy az E1, E2a és E4 génekben, az E3 deléciójával vagy anélkül, és így tovább. Amint fent tárgyaltuk, az ilyen deléciókat más mutációkkal, mint például hõmérséklet-érzékeny mutációkkal kombinálva alkalmazhatjuk a kívánt eredmény elérésére. Az esszenciális adenovirális szekvenciák bármelyikére (például E1a, E1b, E2a, E2b, E4 ORF6, L1, L2, L3, L4 és L5) nézve hiányos adenovirális vektort a hiányzó adenovirális géntermékek jelenlétében tenyészthetjük, amelyek szükségesek a virális fertõzõképességhez és az adenovirális részecske szaporításához. Ezeket a segítõ funkciókat az adenovirális vektornak egy vagy több segítõ konstrukció (például plazmid vagy vírus) vagy pakoló sejtvonal jelenlétében történõ tenyésztésével biztosíthatjuk. Lásd például a „minimális” humán Ad vektor elõállítására feltárt módszereket az US 6 203 975 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban (publikálva 1996. május 9¹én). Függetlenül attól, hogy a módosított adenovírus csak a minimális Ad szekvenciákat tartalmazza¹e vagy a teljes Ad genomot csak funkcionális deléciókkal az E1 és/vagy E3 régiókban, a módosított vírus humán vagy majom adenovírusból származó kapszidot tartal-
1
HU 007 949 T2
maz. Más megoldásképpen más megvalósítási módok szerint pszeudotípusú adenovírusokat alkalmazhatunk a találmány szerinti eljárásokban. Az ilyen pszeudotípusú adenovírusok olyan adenovírus kapszidfehérjéket alkalmaznak, amelyekbe az eredeti adenovíruskapszid-forrásától eltérõ forrásból származó adenovírusszekvenciákat hordozó nukleinsavmolekula lett becsomagolva. Ezeket az adenovírusokat a szakember számára ismert eljárások alkalmazásával állíthatjuk elõ. 1. Segítõ vírusok Ily módon a minigén hordozására alkalmazott virális vektorok adenovírusgén tartalmától függõen segítõ adenovírus vagy nem replikálódó vírusfragmens lehet szükséges a minigént tartalmazó rekombináns fertõzõ virális részecske elõállításához elégséges majom adenovírus génszekvenciák biztosítására. Hasznos segítõ vírusok olyan kiválasztott adenovírus génszekvenciákat tartalmaznak, amelyek nincsenek jelen az adenovírusvektor-konstrukcióban és/vagy nem expresszálódnak a pakoló sejtvonalban, amelybe a vektort transzfektáltuk. Egy megvalósítási mód szerint a segítõ vírus replikációdefektív és különféle adenovírus géneket tartalmaz a fent említett szekvenciák mellett. Ilyen segítõ vírus kívánt esetben kombinálva alkalmazunk E1¹et expresszáló sejtvonallal. Segítõ vírusokat létrehozhatunk polikationos konjugátumokkal, amint azt Wu és mtsai., J. Biol. Chem., 264:16 985–16 987. old. (1989); K. J. Fisher és J. M. Wilson, Biochem. J., 299:49. old. (1994. április 1.) ismertetik. A segítõ vírus adott esetben egy második minigént tartalmazhat. Számos ilyen riportergén ismert a szakterületen. Az adenovírusvektoron lévõ transzgéntõl különbözõ riportergén jelenléte a segítõ víruson lehetõvé teszi az Ad vektor és a segítõ vírus egymástól független monitorozását. Ezt a második riportert a kapott rekombináns vírus és a segítõ vírus egymástól történõ elválasztására alkalmazzuk a tisztítás során.
5
10
15
20
25
30
35
40 2. Komplementációs sejtvonalak A fent ismertetett gének bármelyikére deletált módosított adenovírusok (Ad) létrehozásához a deletált génrégió funkcióját – ha esszenciális a vírus replikációjához és fertõzõképességéhez – biztosítani kell a rekombináns vírus számára segítõ vírussal vagy sejtvonallal, azaz komplementáló vagy pakoló sejtvonallal. Sok esetben humán E1¹et expresszáló sejtvonalat alkalmazhatunk az Ad vektor komplementálására. Ez különösen elõnyös, mert a találmány szerinti Ad szekvenciák és a jelenleg elérhetõ pakoló sejtekben található humán AdE1 szekvenciák közötti diverzitás miatt a jelenlegi humán E1¹et tartalmazó sejtek alkalmazása megakadályozza replikációkompetens adenovírusok kialakulását a replikáció és termelési folyamat alatt. Azonban bizonyos körülmények között kívánatos lehet E1 génterméket expresszáló sejtvonal alkalmazása az E1¹deletált adenovírus termelésére. Ilyen sejtvonalakat leírtak. Lásd például US 6 083 716 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok.
45
50
55
60 11
2
Kívánt esetben találmány szerinti szekvenciákat alkalmazhatunk pakoló sejtvonal vagy olyan sejtvonal létrehozására, amely minimálisan az alkalmas szülõi forrásból vagy transzkomplementáló adenovírusforrásból származó adenovírus E1 gént expresszálja, a kiválasztott szülõi sejtvonalban történõ expresszióra szolgáló promoter transzkripciós szabályozása alatt. Szabályozható vagy konstitutív promotereket alkalmazhatunk erre a célra. Ilyen promoterek példáit részletesen ismertetjük másutt a leírásban. Szülõi sejtet választunk ki a bármilyen kívánt AdSAd22/Pan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 vagy SV39 gént expresszáló új sejtvonal létrehozására. Korlátozás nélkül az ilyen szülõi sejtvonal lehet HeLa (ATCC hozzáférési száma: CCL 2), A549 (ATCC hozzáférési száma: CCL 185), HEK 293, KB (CCL 17), Detroit (például Detroit 510, CCL 72) és WI–38 (CCL 75) sejt, többek között. Ezek a sejtvonalak elérhetõk az ’American Type Culture Collection’ intézettõl (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110–2209). Más alkalmas szülõi sejtvonalakat is beszerezhetünk más forrásokból. Ilyen E1¹et expresszáló sejtvonalak hasznosak adenovírus E1¹re deletált vektorok létrehozására. Ezenfelül vagy más megoldásképpen a találmány tárgyát egy vagy több majom adenovirális génterméket – például E1a, E1b, E2a és/vagy E4 ORF6 – expresszáló sejtvonalak képezik, amelyeket lényegében a rekombináns majom virális vektorok létrehozására szolgáló ugyanezen eljárásoknak az alkalmazásával lehet elõállítani. Ilyen sejtvonalakat az esszenciális génekre deletált és a termékeket kódoló adenovirális vektorok transzkomplementálására alkalmazhatunk, vagy a segítõ-függõ vírus (például adenoasszociált vírus) pakolásához szükséges funkciók biztosítására. Találmány szerinti gazdasejt elõállítása olyan módszereket foglal magában, mint például kiválasztott DNS-szekvenciák összeállítása. Ezt az összeállítást hagyományos módszerek alkalmazásával érhetjük el. Ilyen módszerek közé tartoznak a cDNS- és genomiális klónozás, amelyek jól ismertek és a fent idézett Sambrook és mtsai. irodalmi helyen vannak ismertetve, az adenovírusgenomok átfedõ oligonukleotidszekvenciáinak az alkalmazása, polimeráz-láncreakcióval kombinálva, szintetikus eljárások, és bármilyen alkalmas eljárás, amellyel a kívánt nukleotidszekvenciát elõállíthatjuk. Egy még másik alternatíva szerint az esszenciális adenovirális géntermékeket transz-helyzetben biztosítjuk az adenovirális vektoron és/vagy segítõ víruson. Ilyen esetben alkalmas gazdasejtet bármilyen biológiai organizmusból kiválaszthatunk, beleértve prokarióta (például bakteriális) sejteket, és eukarióta sejteket, beleértve rovarsejteket, élesztõsejteket és emlõssejteket. Különösen kívánatos gazdasejteket választhatunk ki bármilyen emlõsfajból, nem korlátozó példaként beleértve olyan sejtek közül, mint például az A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, HEK 293-sejtek vagy PERC6 (amely mindkettõ funkcionális adenovirális E1¹et expresszál) [Fallaux, F. J. és mtsai., (1998), Hum Gene Ther, 9:1909–1917. old.], Saos, C2C12, L¹sejtek, HT1080, HepG2 és emlõsökbõl, beleértve emberbõl, majomból,
1
HU 007 949 T2
egérbõl, patkányból, nyúlból és hörcsögbõl származó primer fibroblasztok, hepatociták és mioblaszt sejtek. A sejtet biztosító emlõsfaj kiválasztása nem korlátozza találmányt; sem az emlõssejt típusa azaz hogy az fibroblaszt, hepatocita, daganatsejt stb. 3. A virális részecske összeállítása és sejtvonal transzfektálása Általában amikor a minigént tartalmazó vektort transzfekcióval juttatjuk be, a vektort körülbelül 5 mg és körülbelül 100 mg DNS közötti mennyiségben juttatjuk be, és elõnyösen körülbelül 10 és körülbelül 50 mg DNS és körülbelül 1×104 sejt és körülbelül 1×1013 sejt közötti, és elõnyösen körülbelül 105 sejt mennyiségben. Azonban a vektor DNS és a gazdasejt viszonylagos mennyiségét beállíthatjuk, olyan faktorokat figyelembe véve, mint például a kiválasztott vektor, a bejuttatás eljárás és a kiválasztott gazdasejtek. A vektor a szakterületen ismert és fent feltárt bármilyen vektor lehet, beleértve csupasz DNS, plazmid, fág, transzpozon, kozmidok, episzómák, vírusok stb. A vektor gazdasejtbe történõ bejuttatását a szakterületen ismert bármilyen módszerrel elérhetjük, amint fent feltártuk, beleértve a transzfekciót és fertõzést. Egy vagy több adenovirális gént stabilan integrálhatunk a gazdasejt genomjába, stabilan expresszálódó episzómákba vagy tranziensen expresszálhatjuk azokat. Az összes génterméket tranziensen expresszáltathatjuk, episzómán vagy stabilan integrálva lehet, vagy a géntermékek némelyikét stabilan expresszáltathatjuk és másokat tranziensen expresszáltathatunk. Ezenkívül az adenovirális gének mindegyikének a promotereit egymástól függetlenül választhatjuk ki konstitutív promoter, indukálható promoter vagy natív adenovirális promoter közül. A promotereket az organizmus vagy sejt specifikus fiziológiás állapota szabályozhatja (azaz a differenciációs stádium vagy replikálódó vagy nyugalmi sejtekben) vagy például exogén módon hozzáadott faktorok. A molekulák gazdasejtbe történõ bejuttatását (plazmidokként vagy vírusokként) elérhetjük a szakember számára ismert módszerek alkalmazásával is, amint a leírásban mindenütt tárgyaljuk. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint szokásos transzfekciós módszereket alkalmazunk, például CaPO4-transzfekciót vagy elektroporációt. Az adenovírus kiválasztott DNS-szekvenciáinak (valamint a transzgénnek és más vektorelemeknek) az összeszerelése különféle köztes plazmidokba, és a plazmidok és vektorok alkalmazása rekombináns virális részecske elõállítására hagyományos módszerek alkalmazásával érhetõ el. Ilyen módszerek közé tartoznak cDNS hagyományos klónozási módszerei, mint például a kézikönyvekben ismertetettek (Sambrook és mtsai., fent idézve), az adenovírusgenomok átfedõ oligonukleotidszekvenciáinak az alkalmazása, polimerázláncreakció, és bármilyen alkalmas eljárás, amellyel a kívánt nukleotidszekvenciát elõállíthatjuk. Szokásos transzfekciós és együtt transzfekciós módszereket alkalmazunk, például CaPO4-kicsapásos módszereket.
2
Az alkalmazott egyéb hagyományos eljárások közé tartozik a virális genomok homológ rekombinációja, vírusok szélesztése agarrétegben, jelgenerálást mérõ eljárások, és hasonlók. Például a kívánt minigént tartalmazó virális vektor 5 elõállítását és összeszerelését követõen a vektort in vitro a csomagolásra szolgáló sejtvonalba transzfektáljuk segítõ vírus jelenlétében. Homológ rekombináció megy végbe a segítõ- és vektorszekvenciák között, ami 10 lehetõvé teszi a vektorban található adenovírus-transzgén szekvenciák replikálódását és virion kapszidokba történõ csomagolását, ami rekombináns virális vektorrészecskéket eredményez. A jelenlegi eljárás ilyen vírusrészecskék elõállítására transzfekcióalapú, azon15 ban a találmány nincs korlátozva ilyen eljárásokra. A kapott rekombináns módosított adenovírusok hasznosak a kiválasztott transzgén kiválasztott sejtbe történõ átvitelére. 20
25
30
35
40
45
50
55
60 12
A módosított adenovírusvektorok alkalmazása A találmány szerinti módosított adenovírusvektorok hasznosak géntranszferre humán vagy állatorvosi alanyba (beleértve nem humán fõemlõsöket, és más emlõsöket) in vitro, ex vivo és in vivo. Egy megvalósítási mód szerint a találmány szerinti módosított adenovírusvektorokat expressziós vektorokként alkalmazhatjuk a heterológ gének által kódolt termékek in vitro elõállítására. Például alkalmas sejtvonalat megfertõzünk vagy transzfektálunk a módosított adenovírusokkal és hagyományos módon tenyésztjük azokat, lehetõvé téve a módosított adenovírusnak, hogy expresszálja a promoterrõl a génterméket. A génterméket azután visszanyerhetjük a tenyésztõ tápközegbõl fehérjetenyészetbõl történõ izolálásának és visszanyerésének ismert hagyományos eljárásaival. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti módosított adenovirális vektor hatékony géntranszferhordozó eszközt biztosít, amely bejuttathatja a kiválasztott transzgént kiválasztott gazdasejtbe in vivo vagy ex vivo. Például a találmány szerinti módosított adenovirális vektorokat terápiás vagy immunogenikus molekulák bejuttatására alkalmazhatjuk, amint alább ismertetjük. Egy megvalósítási mód szerint a terápiás vagy vakcina beadási rend rekombináns adenovirális vektorok ismételt bejuttatását tartalmazhatja. Az ilyen beadási rendek tipikusan virális vektorok sorozatának bejuttatását foglalják magukban, amelyekben a virális kapszid váltakozik. A virális kapszidot változtathatjuk mindegyik egymást követõ beadáshoz, vagy egy adott szerotípusú kapszid elõre meghatározott számú (például egy, kettõ, három, négy vagy több) beadása után. Ily módon egy beadási rend magában foglalhatja egy elsõ kapszidú Ad bejuttatását, egy második kapszidú Ad bejuttatását és egy harmadik kapszidú Ad bejuttatását. Más megvalósítási módok szerint olyan beadási rendet választhatunk ki, amely a találmány szerinti módosított Ad kapszidokat önmagukban alkalmazza, egymással kombinálva, vagy más Ad szerotípusú Ad¹okkal kombinálva, amint az nyilvánvaló a szakember számára. Adott esetben egy ilyen beadási rend magában fog-
1
HU 007 949 T2
lalja nem humán fõemlõs adenovírusok, humán adenovírusok vagy mesterséges (például kiméra) szerotípusok kapszidjainak a beadását, amint a leírásban ismertetjük. A beadási rend mindegyik fázisa magában foglalhatja injekciók sorozatát (vagy más beadási útvonalakat) egyetlen Ad szerotípusú kapsziddal, amit egy sorozat követ egy másik Ad szerotípusú kapsziddal. Más megoldásképpen a találmány szerinti módosított Ad vektorokat olyan beadási rendben alkalmazhatjuk, amely más nem adenovirális-közvetített bejuttatási rendszereket foglalnak magukban, beleértve más virális rendszereket, nem virális bejuttatás rendszereket, fehérjéket, peptideket, és más biológiailag aktív molekulákat. A következõ részekben olyan szemléltetõ molekulákra koncentrálunk, amelyek bejuttathatók a találmány szerinti módosított adenovirális kapszidokkal (például fehérje formában) vagy módosított adenovirális vektorokkal. Egy megvalósítási mód szerint a találmány szerinti módosított Ad vektorokat embereknek adjuk be génterápia publikus eljárásai szerint, A kiválasztott transzgént hordozó találmány szerinti virális vektort beadhatjuk páciensnek, elõnyösen felszuszpendálva biológiailag kompatibilis oldatban vagy gyógyászatilag elfogadható bejuttató vivõanyagban. Alkalmas vivõanyag a steril sóoldat. Más, ismert módon gyógyászatilag elfogadható, és a szakember számára jól ismert vizes és nemvizes izotóniás steril injekciós oldatok és vizes és nemvizes steril szuszpenziók is alkalmazhatók erre a célra. A módosított adenovirális vektorokat a kívánt biológiai hatás eléréséhez elegendõ mennyiségben adjuk be. A beadás hagyományos és gyógyászatilag elfogadható útjainak a nem korlátozó példái közé tartozik a közvetlen beadás a retinára, és más intraokuláris bejuttatási eljárások, közvetlen beadás a májba, inhalálás, intranazális, intravénás, intramuszkuláris, intratracheális, szubkután, intradermális, rektális, orális, intracochleáris és más parenterális beadási utak. A beadási utakat kívánt esetben kombinálhatjuk vagy módosíthatjuk az transzgéntõl és az állapottól függõen. A beadás útja elsõdlegesen a kezelt állapot természetétõl függ. A virális vektor adagolása elsõdlegesen olyan tényezõktõl függ, mint például a kezelt állapot, a páciens kora, tömege és egészsége, és ily módon változhat a páciensek között. Például a virális vektor felnõtt humán vagy állatorvosi dózisa általában a körülbelül 100 ml és körülbelül 100 ml közötti mennyiségû hordozó, amely körülbelül 1×106 és körülbelül 1×1015 közötti koncentrációjú részecskét, körülbelül 1×1011 és 1×1013 közötti koncentrációjú részecskét, vagy körülbelül 1×109 és 1×1012 közötti koncentrációjú vírus részecskét tartalmaz. A dózistartományok függenek az állat méretétõl és a beadás útjától. Például alkalmas humán vagy állatorvosi dózis (egy körülbelül 80 kg tömegû állatnak) intramuszkuláris injekció esetében a körülbelül 1×109 és körülbelül 5×1012 részecske per ml tartományban van, egyetlen helyre bejuttatva. Adott esetben több beadási helyen is bejuttathatjuk. Egy másik példában az
2
alkalmas humán vagy állatorvosi dózis a körülbelül 1×1011 és körülbelül 1×1015 közötti mennyiségû részecske tartományban van orális kiszerelés esetében. A szakember megváltoztathatja ezeket a dózisokat, a 5 beadás útjától, és az alkalmazott terápiás vagy vakcinázási alkalmazástól függõen, amelyre a rekombináns vektort alkalmazzuk. A transzgén expressziójának szintjét, vagy egy immunogén esetében a keringõ ellenanyag szintjét monitorozhatjuk, hogy meghatároz10 zuk a dózis beadásának gyakoriságát. A beadás gyakoriságának meghatározására szolgáló más eljárásokat nyilvánvalóak a szakember számára.
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 13
1. Terápiás molekulák Egy aspektus szerint a módosított adenovírushexon-fehérjék egy vagy több terápiás transzgén inszertjét tartalmazhatják, hogy elõsegítsék a célzást, és/vagy terápiás rendben történõ alkalmazásra, amint a leírásban ismertetjük. Egy másik aspektusban a találmány szerinti módosított adenovirális vektorok egy vagy több terápiás transzgént hordozhatnak beléjük pakolva. A transzgén által kódolt hasznos terápiás termékek közé tartoznak hormonok és növekedési és differenciálódási faktorok, amelyek nem korlátozó példái közé tartoznak az alábbiak: inzulin, glukagon, növekedési hormon (GH), paratiroid hormon (PTH), növekedési hormont felszabadító faktor (GRF), follikulus stimulálóhormon (FSH), luteinizálóhormon (LH), humán koriogonadotropin (hCG), vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF), angiopoietinek, angiosztatin, granulocita kolóniastimuláló faktor (GCSF), eritropoietin (EPO), kötõszöveti növekedési faktor (CTGF), bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bFGF), savas fibroblaszt növekedési faktor (aFGF), epidermális növekedési faktor (EGF), transzformáló növekedési faktor a (TGF a), vérlemezke-eredetû növekedési faktor (PDGF), inzulin növekedési faktor I és II (IGF¹I és IGF¹II), a transzformáló növekedési faktor szupercsalád bármelyik tagja, köztük a TGF, aktivinek, inhibinek, vagy BMP 1–15 csont morfogenikus fehérjék (BMP) bármelyike, a heregluin/neuregulin/ARIA/neu differenciációs faktor (NDF) növekedési faktorok családjának bármelyik tagja, idegi növekedési faktor (NGF), agyi eredetû neurotrofikus faktor (BDNF), NT–3 és NT–4/5 neurotrofinok, ciliáris neurotrofikus faktor (CNTF), gliasejtvonal-eredetû neurotrofikus faktor (GDNF), neurturin, agrin, szemaforin/kollapszin család bármelyik tagja, netrin¹1 és netrin-2, hepatocita növekedési faktor (HGF), efrinek, noggin, „sonic hedgehog” és tirozin-hidroxiláz. Más hasznos transzgéntermékek közé tartoznak azok a fehérjék, amelyek az immunrendszert szabályozzák, nem korlátozó példaként citokinek és limfokinek, mint például trombopoietin (TPO), interleukinek (IL) IL–1-tõl IL–25¹ig (beleértve például IL–2, IL–4, IL–12 és IL–18), monocita kemoattraktáns fehérje, leukémia inhibitoros faktor, granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktor, Fas ligandum, tumornekrózis-faktorok, interferonok és õssejtfaktor, flk-2/flt3 ligandum. Az immunrendszer által termelt géntermék is alkalmazhatók a találmány szerint. Ezek nem korlátozó példái közé
1
HU 007 949 T2
tartoznak az IgG, IgM, IgA, IgD és IgE immunglobulinok, kiméra immunglobulinok, humanizált ellenanyagok, egyláncú ellenanyagok, T¹sejt-receptorok, kiméra T¹sejt-receptorok, egyláncú T¹sejt-receptorok, I. és II. osztályba tartozó MHC-molekulák, valamint génsebészeti úton módosított immunglobulinok és MHC-molekulák. Hasznos géntermékek közé tartoznak a komplementet szabályozó fehérjék, mint például komplementszabályozó fehérjék, membrán-kofaktorfehérje (MCP), lebomlást gyorsító faktor (DAF), CR1, CF2 és CD59. Még más hasznos géntermékek közé tartoznak a különféle hormonok, növekedési faktorok, citokinek, limfokinek, szabályozófehérjék és immunrendszeri fehérjék receptorai. A találmány tárgykörébe tartoznak a koleszterin szabályozásának a receptorai, mint például az alacsony sûrûségû lipoprotein (LDL) receptor, magas sûrûségû lipoprotein (HDL) receptor, a nagyon alacsony sûrûségû lipoprotein (VLDL) receptor, a lipidek szabályozásában hasznos fehérjék, beleértve például az apolipoprotein (apo) A és izoformái (például ApoAI), apoE és izoformái (beleértve E2, E3 és E4), SRB1, ABC1, és a „scavenger” receptor. A találmány tárgykörébe tartoznak olyan géntermékek is, mint például a szteroidhormon-receptor szupercsalád tagjai, közöttük a glukokortikoidreceptorok és ösztrogénreceptorok, D¹vitamin-receptorok és más sejtmagi receptorok. Ezenfelül hasznos géntermékek közé tartoznak a transzkripciós faktorok, mint például jun, fos, max, mad, szérumreakciós faktor (SRF), AP–1, AP2, myb, MyoD és miogenin, ETS-boxot tartalmazó fehérjék, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF–4, C/EBP, SP1, CCAAT-boxot kötõ fehérjék, interferont szabályozó faktor (IRF–1), Wilms-tumorfehérje, ETS-kötõ fehérje, STAT, GATA-boxot kötõ fehérjék, például GATA-3, és a szárnyashélix-fehérjék villásfejû családja. Más hasznos géntermékek közé tartozik a karbamoil-szintetáz¹I, ornitin-transzkarbamiláz, arginoszukcinát-szintetáz, arginoszukcinát-liáz, argináz, fumarilacetacetát-hidroláz, fenil-alanin-hidroxiláz, alfa¹1 antitripszin, glükóz-6-foszfatáz, porfobilinogén-deamináz, cisztation-béta-szintáz, elágazó láncú ketoacid-dekarboxiláz, albumin, izovaleril-coA-dehidrogenáz, propionil-CoA-karboxiláz, metil-malonil-CoA-mutáz, glutarilCoA-dehidrogenáz, inzulin, béta-glükozidáz, piruvátkarboxilát, májbeli foszforiláz, foszforiláz-kináz, glicindekarboxiláz, H¹fehérje, T¹fehérje, cisztás fibrózis transzmembrán regulátor (CFTR) szekvencia és disztrofin cDNS-szekvencia. Más hasznos géntermékek közé tartoznak a hemofilia A kezelésre hasznosak (például VIII¹as faktor és variánsai, beleértve a heterodimer könnyû láncát és nehéz láncát, adott esetben mûködõképesen kapcsoltan kapcsolórégióval, és a VIII¹as faktor B¹doménja, lásd az US 6 200 560 és 6 221 349 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat), és a hemofilia B kezelésére hasznosak (például IX¹es faktor). Még más hasznos géntermékek közé tartoznak természetben nem elõforduló polipeptidek, mint például kimérák vagy hibrid polipeptidek, amelyek aminosavak
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 14
2
inszercióit, delécióit vagy szubsztitúcióit tartalmazó természetben nem elõforduló aminosavszekvenciákat tartalmaznak. Például génsebészeti úton módosított egyláncú immunglobulinok hasznosak lehetnek bizonyos hibás immunrendszerû páciensekben. Más típusú természetben nem elõforduló génszekvenciák közé tartoznak antiszensz molekulák és katalitikus nukleinsavak, mint például ribozimok, amelyek alkalmazhatók egy célpont túltermelésének csökkentésére. Egy gén expressziójának csökkentése és/vagy modulálása különösen elõnyös hiperproliferatív állapotok kezelésére, amelyeket hiperproliferáló sejtek jellemeznek, mint például rákok és pszoriázis. A célpolipeptidek közé tartoznak azok a polipeptidek, amelyek kizárólag hiperproliferáló sejtekben termelõdnek, vagy normális sejtekkel összehasonlítva magasabb szinten termelõdnek azokban. A célantigének közé tartoznak onkogének mint például myb, myc, fyn és a bcr/abl transzlokációs gén, ras, src, P53, neu, trk és EGRF által kódolt polipeptidek. Az onkogéntermékek mint célantigének mellett a rákellenes kezelések és védõ kezelések célpolipeptidjei közé tartoznak béta-sejtes limfómák által termelt ellenanyagok variábilis régiói és T¹sejtes limfómák T¹sejt-receptorainak variábilis régiói, amelyek bizonyos megvalósítási módok szerint szintén alkalmazhatók autoimmun betegség célantigénjeként. Más daganattal kapcsolatos polipeptideket is alkalmazhatunk célpolipeptidként, mint például azokat a polipeptideket, amelyek magasabb koncentrációban találhatunk meg daganatsejtekben, beleértve a 17¹A1 monoklonális ellenanyag és folátkötõ polipeptidek által felismert polipeptidet. Más alkalmas terápiás polipeptidek és fehérjék közé tartoznak azok, amelyek hasznosak lehetnek autoimmun betegségekben és rendellenességekben szenvedõ személyek kezelésére, és amelyek széles körû védõ immunválaszt biztosítanak olyan célpontok ellen, amelyek autoimmunitással kapcsolatosak, beleértve sejtreceptorokat és olyan sejteket, amelyek saját anyagok ellen irányuló ellenanyagokat termelnek. T¹sejt-közvetített autoimmun betegségek közé tartozik a reumatoid arthritisz (RA), sclerosis multiplex (MS), Sjögren-szindróma, szarkoidózis, inzulinfüggõ diabetes mellitus (IDDM), autoimmun tiroiditisz, reaktív arthritisz, merev szpondilitisz, szkleroderma, polimiozitisz, dermatomiozitisz, pszoriázisz, vaszkulitisz, Wegener-féle granulomatózis, Crohn-féle betegség és ulceratív kolitisz. Ezen betegségek mindegyikét olyan T¹sejt-receptorok (TCR) jelenléte jellemzi, amelyek endogén antigénekhez kötõdnek, és az autoimmun betegséghez kapcsolódó gyulladásos kaszkádreakciót váltanak ki. A találmány szerinti módosított adenovirális vektorok különösen alkalmasak olyan terápiás beadási rendekben, amelyekben több adenovirális közvetítéssel bejuttatott transzgén kívánatos, például ugyanannak a transzgénnek az újbóli bejuttatását vagy más transzgénekkel kombinálva való bejuttatást magában foglaló beadási rendekben. Az ilyen beadási rendek módosított adenovirális vektor beadását foglalhatják magukban, majd a vektor újbóli beadását ugyanabba a szero-
1
HU 007 949 T2
típusba tartozó adenovírusból származó vektorral. Különösen kívánatos beadási rendek olyan találmány szerinti módosított adenovirális vektor beadását foglalják magukban, amelyben az elsõ beadásnál bejuttatott virális vektor szerotípusa különbözik az egy vagy több késõbbi beadásban alkalmazott virális vektor szerotípusától. Például egy terápiás beadási rend módosított adenovirális vektor beadását foglalja magában, és ismételt beadást egy vagy több, ugyanabba vagy eltérõ szerotípusba tartozó módosított adenovírussal. Egy másik példában a terápiás beadási rend adenovirális vektor beadását foglalja magában, majd találmány szerinti módosított adenovírusvektor ismételt beadását, amelynek a szerotípusa különbözik az elsõnek bejuttatott adenovirális vektor szerotípusától, és adott esetben egy további beadást egy másik vektorral, amely ugyanaz, vagy elõnyösen különbözõ a korábbi beadási lépésekben alkalmazott vektor szerotípusától. Ezek a beadási rendek nem korlátozódnak a találmány szerinti kiméra szerotípusok alkalmazásával létrehozott adenovirális vektorok bejuttatására. Sõt, ezek a beadási rendek könnyen alkalmazhatják más adenovirális szerotípusok vektorait (akár módosítottak, akár nem), amelyek lehetnek mesterségesek, humán vagy nem humán fõemlõs, vagy más emlõsforrásból származók, kombinációban egy vagy több találmány szerinti kiméra vektorral. Ilyen szerotípusok példáit részletesen tárgyaljuk másutt a leírásban. Továbbá ezek a terápiás beadási rendek magukban foglalhatják a találmány szerinti módosított adenovirális vektorok egyidejû vagy egymás utáni bejuttatását kombinációban nem adenovírusvektorokkal, nem virális vektorokkal és/vagy különféle egyéb terápiásan hatásos vegyületekkel vagy molekulákkal. A találmány nem korlátozódik ezekre a terápiás beadási rendekre, amelyek közül számos nyilvánvaló a szakember számára. 2. Immunogenikus transzgének bejuttatása Amint korábban ismertettük, a módosított adenovírushexon-fehérje önmagában módosított lehet, hogy kiválasztott peptidet, polipeptidet vagy fehérjét tartalmazzon, amely immunválasz indukál egy kiválasztott immunogén ellen. Az ilyen módosított adenovírushexon-fehérjét önmagában olyan adenovíruskapszid létrehozására alkalmazhatjuk, amely önmagában hasznos célzásra, adjuvánsként és/vagy specifikus immunválasz indukálására. Egy további megvalósítási mód szerint az ilyen módosított adenovíruskapszid virális részecske létrehozására alkalmazható, amelybe alkalmas expressziós kazetta vagy minigén van pakolva. Ily módon egy megvalósítási mód szerint találmány szerinti módosított adenovirális vektor továbbá az adenovíruskapszidba pakolva olyan peptidet, polipeptidet vagy fehérjét kódoló transzgént tartalmaz, amely kiválasztott immunogén elleni immunválaszt indukál. Az ilyen találmány szerinti módosított adenovírusok önbeindító hatást, adjuváns hatást biztosíthatnak és/vagy nagyon hatékonyak lehetnek a vektor által expresszált beinszertált heterológ fehérjék elleni citolitikus T¹sejtek és/vagy ellenanyagok indukálására.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 15
2
A találmány szerinti adenovírusokat alkalmazhatjuk immunogenikus készítményekként is. A rekombináns adenovírusokat profilaktikus vagy terápiás vakcinákként alkalmazhatjuk bármilyen olyan kórokozó ellen, amelyre az immunválasz indukálására kulcsfontosságú és a kórokozó elterjedését limitálni képes antigén(eke)t azonosítottak Is, amelyekre a cDNS hozzáférhetõ. Az ilyen vakcina (vagy más immunogenikus) készítményeket alkalmas bejuttatási hordozóban szereljük ki, amint fent ismertetjük. Általában az immunogenikus készítmények dózisai a terápiás készítményekre fent megadott tartományokba esnek. Követhetjük a kiválasztott gén immunitásának a szintjét, hogy meghatározzuk a megerõsítõ oltások szükségességét, ha kellenek egyáltalán. Az ellenanyagtiterek szérumbeli meghatározását követõen adott esetben megerõsítõ immunizációkra lehet szükség. Adott esetben a találmány szerinti vakcinakészítményt úgy szerelhetjük ki, hogy más komponenseket is tartalmazzon, például adjuvánst, stabilizálószert, pH¹beállító ágenst, vagy tartósítószert, és hasonlókat. Ilyen komponensek jól ismertek a vakcinák területén járatos szakember számára. Az alkalmas adjuvánsok nem korlátozó példái közé tartoznak a liposzómák, alum, monofoszforil-lipid¹A, és bármilyen biológiailag aktív faktor, mint például citokin, interleukin, kemokin, ligandumok, és optimális esetben ezek kombinációi. Ezen biológiailag aktív faktorok némelyikét expresszáltathatjuk in vivo, például plazmid vagy virális vektorral. Például egy ilyen adjuvánst beadhatunk antigént kódoló beindító DNS-vakcinával, hogy fokozzuk az antigénspecifikus immunválaszt, összehasonlítva a csak az antigént kódoló DNS-vakcinával történõ beindítással létrehozott immunválasszal. Az adenovírusokat „immunogenikus mennyiségben” adjuk be, azaz olyan mennyiségben, amely hatásos a beadás útján a kívánt sejtek transzfektálására és a kiválasztott gén elegendõ szintû expresszióját biztosítják immunválasz indukálására. Ahol védõ immunitást biztosítunk, az adenovírusokat fertõzés és/vagy visszatérõ betegség megakadályozására hasznos vakcinakészítményeknek tekintjük. Például az immunogének különféle víruscsaládokból származhatnak. A kívánatos víruscsaládok, amelyek ellen immunválasz lehet kívánatos: picornavíruscsalád, amelybe tartozik a Rhinovirusok nemzetsége, amelyek a közönséges megfázásos esetek körülbelül 50%-áért felelõsek; az Enterovirusok nemzetsége, amelybe tartoznak a Poliovirusok, Coxsackievirusok, Echovirusok és humán enterovírusok, mint például a hepatitis A vírus; és az Apthovirusok nemzetsége, amelyek a száj- és körömfájás betegségekért felelõsek, elsõsorban nem humán állatokban. A vírusok picornavírus családjában a célantigének közé tartozik a VP1, VP2, VP3, VP4 és VPG. Egy másik víruscsalád a Calcivirusok családja, amelybe tartozik a vírusok Norwalk csoportja, amelyek a járványos gasztroenteritisz fontos kórokozói. Még másik víruscsalád az immunválaszt indukáló célantigénekként történõ alkalmazásra emberekben és nem humán állatokban a Togavirusok
1
HU 007 949 T2
családja, amelybe tartozik az Alfavirusok nemzetsége, amelybe tartoznak a Sindbis-vírusok, RossRiver-vírus, és a venezuelai, keleti és nyugati lóenkefalitisz, és a Rubivirusok, köztük a Rubella-vírus. A Flaviviridae családba tartoznak a dengue, sárgaláz, japán enkefalitisz, St. Louis enkefalitisz és kullancs által hordozott enkefalitiszvírusok. Más célantigéneket állíthatunk elõ a Hepatitis C vagy a koronavirus családból, amelyek tagjai közé tartoznak különféle humán és nem humán vírusok, mint például fertõzõ bronchitisz vírus (baromfi), sertés átvihetõ gasztroenterikus vírus (sertés), sertés hemagglutinációs enkefalomielitisz vírus (sertés), macska fertõzõ peritonitisz vírus (macskák), macska enterikus koronavírus (macska), kutya koronavírus (kutya) és humán respiratorikus koronavírusok, amelyek közönséges megfázást és/vagy nem A, B vagy C hepatitiszt okozhatnak. Emellett a humán koronavírusok közé tartozik a hirtelen akut respiratorikus szindróma (SARS) feltételezett kórokozója. A koronavírus családban a célantigének közé tartozik az E1 (más néven M vagy mátrix fehérje), E2 [más néven S vagy tüske („Spike”) fehérje], E3 (más néven HE vagy hemagglutin-elteróz) glikoprotein (nincs jelen minden koronavírusban) vagy N (nukleokapszid). Még más antigéneket is célozhatunk a Rhabdovirus család ellen, amelyek közé tartozik a Vesiculovirus család (például vezikuláris sztomatitisz vírus), és az általános Lyssavirus nemzetség (például veszettség). A Rhabdovirus családban a megfelelõ antigéneket a G fehérjébõl vagy N fehérjébõl származtathatjuk. A Filoviridae család, amelybe tartoznak a hemorrágiás láz vírusok, mint például a Marburg- és ebolavírus, antigének megfelelõ forrásai lehetnek. A Paramyxovirusok családjába tartozik a parainfluenzavírus 1¹es típusa, parainfluenzavírus 3¹as típusa, szarvasmarha parainfluenzavírus 3¹as típusa, rubulavírus (mumpszvírus, parainfluenzavírus 2¹es típusa, parainfluenzavírus 4¹es típusa, Newcastle-betegség vírusa (csirkék), marhavész, Morbillivirusok, amelyek közé tartozik a kanyaró és szopornyica, és Pneumovirusok, amelyek közé tartozik a respiratorikus szinciciális vírus. Az influenzavírust az Orthomyxovirusok családjába soroljuk, és antigének alkalmas forrása (például a HA fehérje, az N1 fehérje). A Bunyavirusok családjába tartoznak a Bunyavirus (kaliforniai enkefalitisz, La Crosse), Phlebovirus (Rift Valley láz), Hantavirus (a puremala egyfajta hemorrágiás láz vírus), Nairovírus (Nairobi juhbetegség) nemzetségek és különféle nem osztályozott Bungavirusok. Az Arenavírusok családja LCM és Lassa láz vírusok elleni antigének forrása. A Reovirusok családjába tartoznak a Reovirus, Rotavirus (amely akut gasztroenteritiszt okoz gyermekekben), Orbivirus és Cultivirus [Colorado kullancs láz, Lebombo (emberek), lóenkefalózis, kék nyelv] nemzetségek. A retrovírusok családjába tartozik az Oncorivirinal alcsalád, amely olyan humán és állatorvosi betegségeket tartalmaz, mint például macska leukémiavirus, HTLV–I és HTLV–II, Lentivirinal [amely tartalmazza a humán immundeficiencia-vírust (HIV), majom immundeficiencia-vírust (SIV), macska immundeficiencia-vírust (FIV), ló fertõzõ anémiavírust], és a Spumavirinal.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 16
2
A lentivírusok között sok alkalmas antigént feltártak és könnyen kiválaszthatók. Az alkalmas HIV- és SIV-antigének nem korlátozó példái közé tartoznak a gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat, Nef és Rev fehérjék, valamint azok különféle fragmensei. Például az Env fehérje alkalmas fragmensei közé tartozhat bármelyik alegysége, mint például a gp120, gp160, gp41, vagy kisebb fragmensei, például a legalább körülbelül 8 aminosav hosszúságúak. Hasonlóképpen a tat fehérje fragmenseit is kiválaszthatjuk (lásd az US 5 891 994 és az US 6 193 981 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat). Lásd még a D. H. Barouch és mtsai., J. Virol., 75(5):2462–2467. old. (March 2001), és R. R. Amara, és mtsai., Science, 292:69–74. old. (6 April 2001) irodalmi helyeken ismertetett HIV- és SIV-fehérjéket. Egy másik példában a HIV és/vagy SIV immunogenikus fehérjéket vagy peptideket fúziós fehérjék vagy más immunogenikus molekulák kialakítására alkalmazhatjuk. Lásd például a O 01/54719 számú nemzetközi közzétételi iratban (publikálva 2001, augusztus 2.) és WO 99/16884 számú nemzetközi közzétételi iratban (publikálva 1999. április 8.) ismertetett HIV–1 Tat és/vagy Nef fúziós fehérjéket és immunizációs beadási rendeket. A találmány nem korlátozódik a leírásban ismertetett HIV és/vagy SIV immunogenikus peptidekre. Ezenfelül ezen fehérjék különféle módosításait is ismertették vagy könnyen elvégezhetõk a szakember számára. Lásd például a módosított gag protein fehérjét, amelyet az US 5 972 596 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban ismertetnek. Továbbá bármely kívánt HIV és/vagy SIV immunogén bejuttatható egyedül vagy kombinációban. Az ilyen kombinációk közé tartozhat expresszió egyetlen vektorról vagy több vektorról. Adott esetben egy másik kombináció magában foglalhatja egy vagy több expresszált immunogén bejuttatását egy vagy több fehérje formában lévõ immunogén bejuttatásával együtt. Az ilyen kombinációkat részletesen ismertetjük alább. A Papovavirus családba tartozik a Polyomavirusok alcsaládja (BKU és JCU vírusok) és a Papillomavirusok alcsaládja (amelyek rákokkal és papilloma rosszindulatú kialakulásával kapcsolatosak). Az Adenovirusok családjában olyan vírusok (EX, AD7, ARD, O.B.) tartoznak, amelyek respiratórikus betegséget és/vagy enteritiszt okoznak. A Parvovirusok családjába tartozik a macska parvovírus (macska enteritisz), macska panleucopenia vírus, kutya parvovírus és sertés parvovírus. A Herpeszvirus családba tartozik az Alphaherpesvirinae alcsalád, amelybe beletartozik a Simplexvirus (HSVI, HSVII) és Varicellovirus nemzetség (álveszettség, Varicella zoster) és a Betaherpesvirinae alcsalád, amelybe beletartozik a Cytomegalovirus nemzetség (HCMV, muromegalovírus), és a Gammaherpesvirinae alcsalád, amelybe beletartozik a Lymphocryptovirus nemzetség, EBV (Burkitts-limfóma), fertõzõ rinotracheitisz, Marek-féle betegség vírusa és a Rhadinovirus. A Poxvirus családba tartozik a Chordopoxvirinae alcsalád, amelybe beletartozik az orthopoxvírus nemzetség [Variola (himlõ) és Vaccinia (tehénhimlõ)], Para-
1
HU 007 949 T2
poxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus, Leporipoxvirus, Suipoxvirus, és az Entomopoxvirinae alcsalád. A Hepadnavirus családba tartozik a Hepatitis B vírus. Egy nem osztályozott vírus, amely alkalmas lehet antigének forrásaként a Hepatitis delta vírus. Még további vírusforrások közé tartozik a madár fertõzõ burzális betegség vírusa és a sertés respiratórikus és reproduktív szindróma vírus. Az Alphavirus családba tartozik a ló arteritiszvírus és különféle enkefalitiszvírusok. A találmány szerinti vírusok hordozhatnak olyan immunogéneket is, amelyek hasznosak humán vagy nem humán állat immunizálására más patogének ellen, mint például baktériumok, gombák, parazita mikroorganizmusok vagy többsejtû paraziták ellen, amelyek humán és nem humán gerinceseket fertõznek meg, vagy ráksejtekbõl vagy daganatsejtekbõl származnak. A bakteriális patogének példái közé tartoznak a patogén Gram-pozitív kokkuszok, például pneumokokkuszok; sztafilokokkuszok; és sztreptokokkuszok. Patogén Gram-negatív kokkuszok közé tartoznak a meningokokkusz; gonokokkusz. Patogén enterikus Gram-negatív bacillusok közé tartoznak az Enterobacteriaceae; pseudomonas, acinetobacteria és eikenella; melioidosis; salmonella; shigella; haemophilus; moraxella; H. ducreyi (ami kankroidot okoz); brucella; Franisella tularensis (ami tularémiát okoz); yersinia (pasteurelia); streptobacillus moniliformis és spirillum; Gram-pozitív bacillusok közé tartozik a listeria monocytogenes; erysipelothrix rhusiopathiae; Corynebacterium diphtheria (diftéria); cholera; B. anthracis (anthrax); donovanosis (granuloma inguinale); és bartonellosis. Patogén anaerob baktériumok által okozott betegségek közé tartozik a tetanusz; botulizmus; más Clostridiumok; tuberkulózis; lepra; és más Mycobacteriumok. Patogén spirochetás betegségek közé tartozik a szifilisz; treponematózis: yaws, pinta és endemikus szifilisz; és leptospirózis. Más, magasabb rendû baktériumok és patogén gombák által okozott betegségek közé tartozik az aktinomikózis; nokardiózis; kriptokokkózis, blasztomikózis, hisztoplazmózis és kokcidioidomikózis; kandidiázis, aszpergillózis és mukormikózis; sporotrichózis; parakokcidiodomikózis, petriellidiózis, torulopszózis, micetóma és kromomikózis; és dermatofitózis. Rickettsiafertõzések közé tartozik a tífuszos láz, Rocky Mountain foltos láz, Q láz és Rickettsia-himlõ. Mycoplasma- és Chlamydia-fertõzések példái közé tartozik: Mycoplasma pneumoniae; Lymphogranuloma venereum; pszittakózis; és születés körüli Chlamydia-fertõzések. Patogén eukarióták közé tartoznak a patogén egysejtûek és bélférgek, és az általuk okozott fertõzések közé tartozik: amebiázis; malária; leishmaniázis; tripanoszomiázis; toxoplazmózis; Pneumocystis carinii; Trichans; Toxoplasma gondii; babeziózis; giardiázis; trichinózis; filariázis; schistoszomiázis; hengeresférgek; bélgiliszták vagy mételyek; és galandféreg-fertõzések. Ezen organizmusok és/vagy toxinok közül sokat biológiai támadásokra alkalmasnak nyilvánított a Centers for Disease Control intézet [(CDC), Department of Heath and Human Services, USA]. Például ezen biológiai ágensek közé tartozik a Bacillus anthracis (anthrax), Clostridium
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2
botulinum és a toxinja (botulizmus), Yersinia pestis (pestis), variola major (himlõ), Francisella tularensis (tularémia), és virális hemorrágiás lázak [filovíruses (például Ebola, Marburg)], és arenavírusok (például Lassa, Machupo), amelyek mindegyikét A kategóriás ágensnek sorolták be; Coxiella burnetti (Q¹láz); Brucella species (brucellózis), Burkholderia mallei (takonykór), Burkholderia pseudomallei (meloidózis), Ricinus communis és a toxinja (ricin toxin), Clostridium perfringens és a toxinja (epszilon toxin), Staphylococcus fajok és toxinjaik (enterotoxin B), Chlamydia psittaci (pszittakózis), vízbiztonsági fenyegetések (például Vibrio cholerae, Crytosporidium parvum), tífuszos láz (Richettsia powazekii), és virális enkefalitisz (alphavírusok, például Venezuelan equine encephalitis; keleti equine encephalitis; nyugati equine encephalitis); amelyek mindegyike jelenleg B kategóriás ágensként vannak besorolva; és a Nipan-vírus és hantavírusok, amelyek jelenleg C kategóriás ágensként vannak besorolva. Emellett más organizmusok, amelyeket így osztályoznak vagy eltérõen osztályoznak, azonosíthatók és/vagy alkalmazhatók ilyen célra a jövõben. Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti virális vektorok és más konstrukciók hasznosak ezekbõl az organizmusokból, vírusokból, toxinjaikból vagy más melléktermékeikbõl származó antigének bejuttatására, ami megelõzheti és/vagy kezelheti az ezen biológiai ágensek általi fertõzést vagy más káros reakciókat. A találmány szerinti vektorok beadása a T¹sejtek variábilis régiója elleni immunogének bejuttatására citotoxikus limfocitákat (CTL) magában foglaló immunválaszt vált ki ezen T¹sejtek eliminálására. A reumatoid arthritiszben (RA) T¹sejt-receptorok (TCR) betegségben részt vevõ számos specifikus variábilis régióját jellemezték. Ezen TCR¹ek közé tartozik a V–3, V–14, V–17 és Va–17. Ily módon az ezen polipeptidek legalább egyikét kódoló nukleinsavszekvencia bejuttatása olyan immunválaszt vált ki, amelyik az RA¹ban részt vevõ T¹sejteket céloz. A sclerosis multiplexben (MS) TCR¹ek betegségben részt vevõ számos specifikus variábilis régióját jellemezték. Ezen TCR¹ek közé tartozik a V–7 és Va–10. Ily módon az ezen polipeptidek legalább egyikét kódoló nukleinsavszekvencia bejuttatása olyan immunválaszt vált ki, amelyik az MS¹ben részt vevõ T¹sejteket céloz. A szklerodermában TCR¹ek betegségben részt vevõ számos specifikus variábilis régióját jellemezték. Ezen TCR¹ek közé tartozik a V–6, V–8, V–14 és Va–16, Va–3C, Va–7, Va–14, Va–15, Va–16, Va–28 és Va–12. Ily módon az ezen polipeptidek legalább egyikét kódoló kiméra adenovírus bejuttatása olyan immunválaszt vált ki, amelyik a szklerodermában részt vevõ T¹sejteket céloz.
3. Bejuttatási eljárások Követhetjük a kiválasztott gén terápiás szintjét, vagy az immunitás szintjét, hogy meghatározzuk a megerõsítõ oltások szükségességét, ha kellenek egyáltalán. A CD8+ T¹sejtes válasz vagy adott esetben az ellenanyagtiterek szérumbeli meghatározását köve60 tõen adott esetben megerõsítõ oltásokra lehet szük55
17
1
HU 007 949 T2
ség. Adott esetben a találmány szerinti adenovirális vektorokat egyetlen beadással juttathatjuk be vagy különféle kombinációs beadási rendekben, például más hatóanyag beadását magában foglaló beadási renddel vagy kezelési móddal kombinálva vagy beindító-megerõsítõ beadási rendben. Különféle ilyen adagolási rendeket írtak le a szakirodalomban, amelyek közül könnyen választhatunk. Például beindítási-megerõsítési rendszerben egy DNS-alapú (például plazmid) vektort adhatunk be az immunrendszer beindítására egy második vagy további, hagyományos antigénnel végzett megerõsítõ beadás számára, mint például fehérjével vagy ilyen antigént kódoló szekvenciákat hordozó rekombináns vírussal. Lásd például a WO 00/11140 számú nemzetközi közzétételi iratot (publikálva 2000. március 2¹án). Más megoldásképpen egy immunizációs beadási rend magában foglalhatja találmány szerinti módosított adenovirális vektor beadását az immunválasz beindítására egy antigént vagy fehérjét hordozó vektor (akár virális akár DNS-alapú) számára. Egy még másik alternatívában egy immunizációs rend magában foglalja fehérje beadását, amit az antigént kódoló vektorral végzett megerõsítés követ. Egy megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás egy kiválasztott antigén elleni immunválasz beindítására és megerõsítésére olyan beadási rendben, amely a találmány szerinti módosított adenovirális vektor bejuttatását foglalja magában. Az ilyen beadási rend magában foglalhatja kiválasztott immunogént hordozó plazmid DNS-vektor bejuttatását és/vagy multiproteinek expresszáltatását a beindító és/vagy megerõsítõ hordozóeszközrõl. Lásd például R. R. Amara, Science, 292:69–74. old. (2001. április 6.), amely multiprotein beadási rendet ismertet HIV és SIV elleni immunválasz létrehozására alkalmas fehérjealegységek expresszáltatására. Például egy beindítás bejuttathatja a Gag, Pol, Vif, VPX és Vpr és Env, Tat, és Rev fehérjéket egyetlen transzkriptumról vagy több transzkriptumról. Más megoldásképpen a SIV Gag, Pol és HIV–1 Env fehérjéket juttatjuk be egyetlen konstrukción. Még más beadási rendeket ismertetnek a WO 99/16884 és WO 01/54719 számú nemzetközi közzétételi iratokban. Azonban a beindítás-megerõsítés rendszerek nem korlátozódnak HIV elleni immunizálásra vagy ezen antigének bejuttatására. Például a beindítás magában foglalhatja egy elsõ vektor bejuttatását, majd megerõsítést egy második vektorral, vagy magát az antigént fehérje formában tartalmazó készítménnyel. Egy példában a beindítási-megerõsítési beadási rend védõ immunválaszt biztosíthat a vírus, baktériumok vagy más organizmus ellen, amelybõl az antigén származik. Egy másik elõnyös megvalósítási mód szerint a beindításimegerõsítési beadási rend terápiás hatást biztosíthat, amelyet hagyományos vizsgálati eljárásokkal mérhetünk azon állapot jelenlétének detektálására, amelyre a terápiát alkalmazzuk. A beindító készítményt különféle helyekre adhatjuk be a testben dózisfüggõ módon, amely attól az antigéntõl függ, amelyre a kívánt immunválaszt célozzuk.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 18
2
A találmány nem korlátozódik az injekció(k) mennyiségére és helyére, vagy a gyógyászati hordozóra. Sõt, a beadási rend magában foglalhat olyan beindítási és/vagy megerõsítési lépést, amelyek mindegyike egyetlen dózist tartalmazhat, vagy olyan dózisokat, amelyeket óránként, naponta, hetente vagy havonta, vagy évente adunk be. Például az emlõsök egy vagy két dózist kaphatnak, amelyek körülbelül 10 mg és körülbelül 50 mg közötti mennyiségû plazmidot tartalmaznak hordozóban. A DNS-készítmény kívánatos mennyisége körülbelül 1 mg és körülbelül 10 000 mg közötti mennyiségû DNS-vektor. Az adagolás változhat körülbelül 1 mg és 1000 mg DNS/testtömeg¹kg mennyiség között. A bejuttatás mennyiségét vagy helyét elõnyösen az emlõs fajától és állapotától függõen választjuk ki. Az antigén emlõsbe történõ bejuttatására alkalmas vektor egységdózisát ismertetjük a leírásban. A vektort gyógyászatilag vagy fiziológiailag elfogadható hordozóban szuszpendálva vagy feloldva készítjük elõ a beadásra, például izotóniás sóoldatban; vagy olyan másféle kiszerelésben, amely nyilvánvaló az ilyen beadásban járatos szakember számára. A megfelelõ hordozó nyilvánvaló a szakember számára, és nagymértékben a beadás útjától függ. A találmány szerinti készítményeket a fent ismertetett utakon adhatjuk be emlõsnek, fenntartott felszabadulású kiszerelésben biodegradábilis biokompatibilis polimer alkalmazásával, vagy helyszínre történõ bejuttatással micellák, gélek és liposzómák alkalmazásával. Adott esetben a találmány szerinti beindítási lépés magában foglalja adjuváns megfelelõ mennyiségének a beadását is a beindító készítménnyel együtt, amint azt a leírásban definiáljuk. Elõnyösen a megerõsítõ készítményt körülbelül 2 hét és körülbelül 27 hét közötti idõvel a beindító készítmény beadása után adjuk be az emlõs alanynak. A megerõsítõ készítmény beadását megerõsítõ készítmény hatásos mennyiségének az alkalmazásával érjük el, amely a beindító DNS-vakcinával megegyezõ antigént tartalmaz vagy annak bejuttatására képes. A megerõsítõ készítmény rekombináns virális vektorból állhat, amely azonos virális forrásból származik (például találmány szerinti adenovirális szekvenciák), vagy egy másik forrásból származik. Más megoldásképpen a „megerõsítõ készítmény” olyan készítmény lehet, amely a beindító DNS-vakcina által kódolt antigénnel megegyezõ antigént tartalmaz, de fehérje vagy peptid formájában, amely készítmény immunválaszt indukál a gazdában. Egy másik megvalósítási mód szerint a megerõsítõ készítmény az antigént kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz az expresszióját emlõssejtben irányító szabályozószekvencia irányítása alatt, például vektorokat, mint például jól ismert bakteriális vagy virális vektorokat. A megerõsítõ készítménnyel szemben az elsõdleges követelmény az, hogy a vakcinakészítményben lévõ antigén ugyanaz az antigén, vagy keresztreagáló antigén legyen, mint a beindító készítmény által kódolt antigén. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti módosított adenovirális vektorok jól alkalmaz-
1
HU 007 949 T2
ható különféle más immunizációs és terápiás beadási rendekben történõ alkalmazásra. Ilyen beadási rendek magukban foglalhatják találmány szerinti adenovirális vektor egyidejû vagy egymást követõ beadását eltérõ szerotípusba tartozó kapszidú Ad vektorokkal, olyan beadási rendeket, amelyekben a találmány szerinti adenovirális vektorokat egyidejûleg vagy egymás után juttatjuk be nem Ad vektorokkal, olyan beadási rendeket, amelyekben a találmány szerinti adenovirális vektorokat egyidejûleg vagy egymás után juttatjuk be fehérjékkel, peptidekkel, és/vagy más biológiailag hasznos terápiás vagy immunogenikus vegyületekkel. Az ilyen alkalmazások nyilvánvalóak szakember számára. Ily módon a találmány tárgyát képezik immunogenikus készítmények különféle kezelési és vakcinázási beadási rendekben történõ alkalmazásra, amelyek a találmány szerinti módosított adenovírushexon-fehérjét tartalmazzák. Egy megvalósítási mód szerint a módosított adenovírushexont bejuttathatjuk alanyba üres módosított adenovirális kapszid formájában (azaz a módosított adenovírushexont tartalmazó adenovíruskapszidban, amelybe nincs semmilyen minigén pakolva a célsejtre célzott bejuttatás céljából). Egy másik megvalósítási mód szerint az ezt a hexont a célsejtben expresszáló vektort alkalmazhatunk. Egy még másik megvalósítási mód szerint minigént hordozó módosított adenovirális részecskét juttatunk be alanynak. Ilyen módosított adenovirális részecske célzószekvenciát tartalmazhat a módosított kapszidjában. Azonban az ilyen módosított adenovirális részecske önbeindító immunogenikus készítmény alapját képezheti. Az ilyen önbeindító készítményt akkor állíthatunk elõ, amikor egy exogén aminosavszekvencia az adenovíruskapszidban immunogén, és a kapszidba szintén immunogént kódoló nukleinsavszekvencia van bepakolva. Amint ismertetjük a leírásban, a kapszidfehérje és a kapszidba pakolt molekulában található immunogén ugyanaz lehet, és ugyanazon vírus vagy organizmus elleni immunválaszt indukálhat. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti önbeindító adenovirális részecske a kapszidjában olyan immunogént tartalmazhat, amely nemspecifikus immunválaszt indukál és egy olyan második immunogén lehet bele pakolva, amely egy kiválasztott sejttípus, molekula vagy organizmus elleni specifikus vagy keresztreagáló immunválaszt indukál.
2
HIV burokfehérje egy HlV-semlegesítõ epitópját hordozó szakaszának) inszertálható be a deléció helyére.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Szabadalmi példák A következõ példák csak szemléltetõk, és nem tekinthetõk a találmányt a bemutatott megvalósítási mó- 50 dokra korlátozónak. A feltalálók demonstrálták, hogy életképes adenovírus mutánst lehet létrehozni, amely 25 aminosavméretû deléciót (ALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQK, 11. azonosító számú szekvencia) tartalmaz a hexonban [a 55 Rux, és mtsai., (2003, fent idézve) által definiált HVR1]. A feltalálók továbbá demonstrálták, hogy kívánt peptidszekvenciát kódoló exogén DNS-szegmens (ebben a példában a EQELLELDKWASLW peptidszekvencia, 12. azonosító számú szekvencia – amely megfelel a 60 19
1. példa: A HAdV–5 hexon inszerciós mutagenezise A hexon DNS-szekvenciájának idegen peptidet kódoló mutáltatására végrehajtott lépések a következõk voltak. Az HAdV–5 genom hexont kódoló régióját hordozó AscI fragmenst szubklónoztuk a pNEB193 plazmidba (a New England Biolabs cégtõl vásárolva), létrehozva pNEBAsc¹t (lásd az 1. ábrát). PCR (polimeráz-láncreakció) mutagenezist hajtottunk végre a hexonon egy új SpeI hely létrehozására az inszerciós helyen. Az SpeI-hely létrehozására szolgáló PCR-mutagenezis részletei a következõk. Az 1. és 2. reakció PCR-templátja a pNEBAsc (a hexon régiót tartalmazó Ad5 AscI fragmens a pNEB193 plazmidba klónozva). Az 1. és 2. reakciók termékeit kombináltuk és a 3. reakció templátjaként alkalmaztuk. A PCR-enzim a Tgo polimeráz volt. A ciklizálás mindhárom reakció esetében a következõ volt: 94° – 30 mp., 45° – 60 mp., 72° – 60 mp., 40 alkalommal. Az 1. reakcióhoz az „5hex1” (GACCGCCGTTGTTGTAACCC, 13. azonosító számú szekvencia) és az „lt rev” (GTTGTCATCGTCCACTAGTCCCTCTTCTTCTAGGTTTATTTCAAG, 14. azonosító számú szekvencia) láncindítókat alkalmaztuk egy 713 bp méretû fragmens amplifikálására. A 2. reakcióhoz az „rt fwd” (GGACTAGTGGACGATGACAACGAAGACGA, 15. azonosító számú szekvencia) és az „rt rev” (ATGGTTTCATTGGGGTAGTC, 16. azonosító számú szekvencia) láncindítókat alkalmaztuk egy 259 bp méretû fragmens amplifikálására. A 3. reakcióhoz az 1. reakcióból és a 2. reakcióból származó fragmenseket összefûztük az „5hex1” és az „rt rev” láncindítók alkalmazásával, ami egy 951 bp méretû terméket eredményezett. Az összefûzött 951 bp méretû terméket elhasítottuk BlpI-gyel; a kapott 518 bp méretû fragmenst alkalmaztuk a pNEBAsc natív BlpI fragmensének helyettesítésére, ami a pNEBAscSpe¹et adta. Ez beinszertálja a GGACTAGTG¹t (a 15. azonosító számú szekvencia 1–9. nt¹jai) (ami a GLV aminosavakat kódolja), ami egy SpeI-helyet tartalmaz az EEE és DDD között (a 149. és 150. aminosav között) a hexon aminosavszekvenciájába. A kívánt peptidszekvenciát kódoló szintetikus DNSszekvenciákat inszertáltunk be az SpeI-helyre. Az eljárás részletei a következõk voltak. A „CD4 top” (CTAGGCTGCTACGGCGTGAGCGCCACCAAGCTGGGG, 18. azonosító számú szekvencia) és „CD4 bot” (CTAGCCCCAGCTTGGTGGCGCTCACGCCGTAGCAGC, 19. azonosító számú szekvencia) oligomerek anneálását követõen, a SARS koronavírus tüskefehérjéjébõl származó Balb/c egér CD4 epitópot inszertáltuk be a pNEBAscSpe SpeI-helyére, ami a pNEBAscSpe-spikeCD4¹t adta. Ez GLGCYGVSATKLGLV¹t (20. azonosító számú szekvencia) rak be a hexon EEE és DDD közé (a 149. és 150. aminosav közé).
1
HU 007 949 T2
A SARS koronavírus tüske fehérjéjébõl származó Balb/c egér CD8 epitóp beinszertálásához a „CD8 top” (CTAGGGACCAGCACCGGCAACTACAACTACAAGTACCGCTACCTGCGCCACGGC AAGCTGCGCCCCGGG, 21. azonosító számú szekvencia) és a „CD8 bot” (CTAGCCCGGGGCGCAGCTTGCCGTGGCGCAGGTAGCGGTACTTGTAGTTGTAGT TGCCGGTGCTGGTCC, 22. azonosító számú szekvencia) oligomereket anneáltuk és inszeráltuk be a pNEBAscSpe SpeI-helyére, ami a pNEBAscSpe-spikeCD8¹at adta. Ez a GLGTSTGNYNYKYRYLRHGKLRPGLV (23. azonosító számú szekvencia) aminosavszekvenciát rakja be a hexon EEE és DDD közé (a 149. és 150. aminosav közé). E1 és E3 deletált HAdV–5 vektor (pSRAd5eGFP) natív hexont tartalmazó molekuláris klónját helyettesítettük az idegen szekvenciákat beinszertálva tartalmazó hexont tartalmazókkal, hogy a mutáltatott hexont tartalmazó új plazmid molekuláris klónokat (rendre pH5sCD4 és pH5sCD8) hozzunk létre. PCR- (polimeráz-láncreakció) mutagenezist hajtottunk végre a hexonon egy új BspEI-hely létrehozására az inszerciós helyen. A BspEI-hely létrehozására szolgáló PCR-mutagenezis részletei a következõk. A pNEBAsc (a hexonrégiót tartalmazó Ad5 AscI fragmens a pNEB193 plazmidba klónozva) volt az 1. és 2. reakció PCR-templátja. Az 1. és 2. reakciók termékeit kombináltuk és a 3. reakció templátjaként alkalmaztuk. Phusion™ nagy pontosságú PCR-reagenskészletet vettünk a NEB cégtõl, és azt alkalmaztuk a gyártó utasításai szerint. A ciklizálás mindhárom reakció esetében a következõ volt: 98° – 5 mp., 55° – 15 mp., 72° – 60 mp., 25 alkalommal. Az 1. reakcióhoz az 5hex1” (GACCGCCGGTTGTAACCC, 24. azonosító számú szekvencia) és a BspSOErev (CGTGAGTTCCGGAAGTAGCAGCTTCATCCCATTCG, 25. azonosító számú szekvencia) láncindítókat alkalmaztuk egy 678 bp méretû fragmens amplifikálására. A 2. reakcióhoz a BspSOEfwd ( T G C T A C T T C C G G A A C T C A C G T A T T T G G GCAGGCG, 26. azonosító számú szekvencia) és az 5hex4 (GGAAGAAGGTGGCGTAAAGG, 27. azonosító számú szekvencia) láncindítókat alkalmaztuk egy 1379 bp méretû fragmens amplifikálására. A 3. reakcióhoz az 1. reakcióból és a 2. reakcióból származó fragmenseket összefûztük az 5hex1 és az 5hex4 láncindítók alkalmazásával, és a 2037 méretû terméket elhasítottuk RsrII+AvrII enzimekkel; a kapott the 1908 bp méretû fragmenst beligáltuk a pNEBAsc/RsrII+AvrII plazmidba, ami a pNEBAseBspEI¹et adta. Ez deletálja az ALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQK¹t (11. azonosító számú szekvencia) kódoló 75 bp¹t, és beinszertálja a TCCGGA¹t (a 27. azonosító számú szekvencia 71–73 nt¹i, ami SG¹t kódol), és egy BspEI-helyet visz be a hexon szekvenciájába. A kívánt peptidszekvenciát kódoló szintetikus DNSszekvenciákat inszertáltunk be az BspEI-helyre. Az eljárás részletei a következõk voltak. A HIV 2F5 epitóp régió pNEBAscBspE1¹be történõ beinszertálásához a ’2F5 top’ (CCGGCGAGCAGGAGCTGCTGGAGCTG-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 20
2
GACAAGTGGGCCAGCCTGTGGT, 28. azonosító számú szekvencia) és ’2F5 bot’ (CCGGACCAC A G G C T G G C C C A C T T G T C C A G C T C C A GCAGCTCCTGCTCG, 17. azonosító számú szekvencia) oligomereket anneáltuk, és beinszertáltuk a BspEIhelyre, ami a pNEBAsc 2F5 plazmidot eredményezte. Ez az ALEINLEEEDDDNBDEVDEQAEQQK (11. azonosító számú szekvencia) aminosavszekvenciát rakja be a fent végrehajtott 25 aminosavnyi deléció helyére. E1 és E3 deletált HAdV–5 vektor (pSRAd5eGFP) natív hexont tartalmazó molekuláris klónját helyettesítettük az idegen szekvenciákat beinszertálva tartalmazó hexont tartalmazókkal, hogy a mutáltatott hexont tartalmazó új plazmid molekuláris klónokat (rendre pH5hexBspeI és pH5 2F5) hozzunk létre. Fertõzõ rekombináns HAdV–5 vektort hoztunk létre mutáltatott hexonnal a mutáltatott hexont tartalmazó új plazmid molekuláris klónoknak (PacI-gyel linearizálva) HEK 293-sejtekbe történõ transzfektálásával. Ez az új, módosított hexonfehérjét tartalmazó HAdV–5 vektor különféle alkalmazásokra alkalmazható, amint ismertetjük a leírásban. Míg a találmányt egy különösen elõnyös megvalósítási módra történõ hivatkozással írtuk le, nyilvánvaló, hogy végrehajthatók módosítások a mellékelt igénypontok oltalmi körén belül. A szekvencialistában található szabad szövegek fordítása: 6. azonosító számú szekvenciához: <223> bármilyen aminosav lehet <223> bármilyen aminosav lehet 13. azonosító számú szekvenciához: <223> 5hex1 láncindító 14. azonosító számú szekvenciához: <223> lt rev láncindító 15. azonosító számú szekvenciához: <223> rt forward láncindító 16. azonosító számú szekvenciához: <223> rt rev láncindító 17. azonosító számú szekvenciához: <223> 2F5 bot oligomer 18. azonosító számú szekvenciához: <223> CD4 top oligomer 19. azonosító számú szekvenciához: <223> CD4 bot oligomer 21. azonosító számú szekvenciához: <223> CD8 top oligomer 22. azonosító számú szekvenciához: <223> CD8 bot oligomer 24. azonosító számú szekvenciához: <223> 5hex1 láncindító 25. azonosító számú szekvenciához: <223> BspSOErev láncindító 26. azonosító számú szekvenciához: <223> BspSOEfwd láncindító 27. azonosító számú szekvenciához: <223> 5hex4 láncindító 28. azonosító számú szekvenciához: <223> 2F5 top oligomer
HU 007 949 T2
Szekvencialista <110> The Trustees of the University of Pennsylvania Roy, Soumitra Wilson, James M. <120> MODIFIED ADENOVIRUS HEXON PROTEIN AND USES THEREOF <130> UPN¹R3807PCT <150> US 60/796,078 <151> 2006–04–28 <160> 28 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 968 <212> PRT <213> Human adenovirus type 2 <400> 1
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ser Tyr Met His Ile Ser 1 5 10 15 Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala 20 25 30 Arg Ala Thr Glu Thr Tyr Phe Ser Leu Asn Asn Lys Phe Arg Asn Pro 35 40 45 Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 50 55 60 Thr Leu Arg Phe Ile Pro Val Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Ala Arg Phe Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Thr 100 105 110 Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Leu Ala Pro Lys Gly 115 120 125 Ala Pro Asn Ser Cys Glu Trp Glu Gln Thr Glu Asp Ser Gly Arg Ala 130 135 140 Val Ala Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu 145 150 155 160 Glu Glu Gln Asn Ala Arg Asp Gln Ala Thr Lys Lys Thr His Val Tyr 165 170 175 Ala Gln Ala Pro Leu Ser Gly Glu Thr Ile Thr Lys Ser Gly Leu Gln 180 185 190
21
HU 007 949 T2
Ile Gly Ser Asp Asn Ala Glu Thr Gln Ala Lys Pro Val Tyr Ala Asp 195 200 205 Pro Ser Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Ile Gly Glu Ser Gln Trp Asn Glu 210 215 220 Ala Asp Ala Asn Ala Ala Gly Gly Arg Val Leu Lys Lys Thr Thr Pro 225 230 235 240 Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala Arg Pro Thr Asn Pro Phe Gly 245 250 255 Gly Gln Ser Val Leu Val Pro Asp Glu Lys Gly Val Pro Leu Pro Lys 260 265 270 Val Asp Leu Gln Phe Phe Ser Asn Thr Thr Ser Leu Asn Asp Arg Gln 275 280 285 Gly Asn Ala Thr Lys Pro Lys Val Val Leu Tyr Ser Glu Asp Val Asn 290 295 300 Met Glu Thr Pro Asp Thr His Leu Ser Tyr Lys Pro Gly Lys Gly Asp 305 310 315 320 Glu Asn Ser Lys Ala Met Leu Gly Gln Gln Ser Met Pro Asn Arg Pro 325 330 335 Asn Tyr Ile Ala Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr Asn 340 345 350 Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn 355 360 365 Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu 370 375 380 Leu Leu Asp Ser Ile Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn 385 390 395 400 Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His 405 410 415 Gly Thr Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Gly Gly Ile 420 425 430 Gly Val Thr Asp Thr Tyr Gln Ala Ile Lys Ala Asn Gly Asn Gly Ser 435 440 445 Gly Asp Asn Gly Asp Thr Thr Trp Thr Lys Asp Glu Thr Phe Ala Thr 450 455 460 Arg Asn Glu Ile Gly Val Gly Asn Asn Phe Ala Met Glu Ile Asn Leu 465 470 475 480 Asn Ala Asn Leu Trp Arg Asn Phe Leu Tyr Ser Asn Ile Ala Leu Tyr 485 490 495 Leu Pro Asp Lys Leu Lys Tyr Asn Pro Thr Asn Val Glu Ile Ser Asp 500 505 510
22
HU 007 949 T2
Asn Pro Asn Thr Tyr Asp Tyr Met Asn Lys Arg Val Val Ala Pro Gly 515 520 525 Leu Val Asp Cys Tyr Ile Asn Leu Gly Ala Arg Trp Ser Leu Asp Tyr 530 535 540 Met Asp Asn Val Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Ala Gly Leu Arg 545 550 555 560 Tyr Arg Ser Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val Pro Phe His Ile 565 570 575 Gln Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala Ile Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro 580 585 590 Gly Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Asn Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Val 595 600 605 Leu Gln Ser Ser Leu Gly Asn Asp Leu Arg Val Asp Gly Ala Ser Ile 610 615 620 Lys Phe Asp Ser Ile Cys Leu Tyr Ala Thr Phe Phe Pro Met Ala His 625 630 635 640 Asn Thr Ala Ser Thr Leu Glu Ala Met Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp 645 650 655 Gln Ser Phe Asn Asp Tyr Leu Ser Ala Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile 660 665 670 Pro Ala Asn Ala Thr Asn Val Pro Ile Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp 675 680 685 Ala Ala Phe Arg Gly Trp Ala Phe Thr Arg Leu Lys Thr Lys Glu Thr 690 695 700 Pro Ser Leu Gly Ser Gly Tyr Asp Pro Tyr Tyr Thr Tyr Ser Gly Ser 705 710 715 720 Ile Pro Tyr Leu Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Lys 725 730 735 Val Ala Ile Thr Phe Asp Ser Ser Val Ser Trp Pro Gly Asn Asp Arg 740 745 750 Leu Leu Thr Pro Asn Glu Phe Glu Ile Lys Arg Ser Val Asp Gly Glu 755 760 765 Gly Tyr Asn Val Ala Gln Cys Asn Met Thr Lys Asp Trp Phe Leu Val 770 775 780 Gln Met Leu Ala Asn Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Ile Pro 785 790 795 800 Glu Ser Tyr Lys Asp Arg Met Tyr Ser Phe Phe Arg Asn Phe Gln Pro 805 810 815 Met Ser Arg Gln Val Val Asp Asp Thr Lys Tyr Lys Glu Tyr Gln Gln 820 825 830
23
HU 007 949 T2
Val Gly Ile Leu His Gln His Asn Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr Leu 835 840 845 Ala Pro Thr Met Arg Glu Gly Gln Ala Tyr Pro Ala Asn Val Pro Tyr 850 855 860 Pro Leu Ile Gly Lys Thr Ala Val Asp Ser Ile Thr Gln Lys Lys Phe 865 870 875 880 Leu Cys Asp Arg Thr Leu Trp Arg Ile Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met 885 890 895 Ser Met Gly Ala Leu Thr Asp Leu Gly Gln Asn Leu Leu Tyr Ala Asn 900 905 910 Ser Ala His Ala Leu Asp Met Thr Phe Glu Val Asp Pro Met Asp Glu 915 920 925 Pro Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu Val Phe Asp Val Val Arg Val 930 935 940 His Gln Pro His Arg Gly Val Ile Glu Thr Val Tyr Leu Arg Thr Pro 945 950 955 960 Phe Ser Ala Gly Asn Ala Thr Thr 965 <210> 2 <211> 952 <212> PRT <213> Human adenovirus type 5 <400> 2
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ser Tyr Met His Ile Ser 1 5 10 15 Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala 20 25 30 Arg Ala Thr Glu Thr Tyr Phe Ser Leu Asn Asn Lys Phe Arg Asn Pro 35 40 45 Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 50 55 60 Thr Leu Arg Phe Ile Pro Val Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Ala Arg Phe Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Thr 100 105 110 Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Leu Ala Pro Lys Gly 115 120 125 Ala Pro Asn Pro Cys Glu Trp Asp Glu Ala Ala Thr Ala Leu Glu Ile 130 135 140 24
HU 007 949 T2
Asn Leu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asn Glu Asp Glu Val Asp Glu Gln 145 150 155 160 Ala Glu Gln Gln Lys Thr His Val Phe Gly Gln Ala Pro Tyr Ser Gly 165 170 175 Ile Asn Ile Thr Lys Glu Gly Ile Gln Ile Gly Val Glu Gly Gln Thr 180 185 190 Pro Lys Tyr Ala Asp Lys Thr Phe Gln Pro Glu Pro Gln Ile Gly Glu 195 200 205 Ser Gln Trp Tyr Glu Thr Glu Ile Asn His Ala Ala Gly Arg Val Leu 210 215 220 Lys Lys Thr Thr Pro Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala Lys Pro 225 230 235 240 Thr Asn Glu Asn Gly Gly Gln Gly Ile Leu Val Lys Gln Gln Asn Gly 245 250 255 Lys Leu Glu Ser Gln Val Glu Met Gln Phe Phe Ser Thr Thr Glu Ala 260 265 270 Thr Ala Gly Asn Gly Asp Asn Leu Thr Pro Lys Val Val Leu Tyr Ser 275 280 285 Glu Asp Val Asp Ile Glu Thr Pro Asp Thr His Ile Ser Tyr Met Pro 290 295 300 Thr Ile Lys Glu Gly Asn Ser Arg Glu Leu Met Gly Gln Gln Ser Met 305 310 315 320 Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Ala Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu 325 330 335 Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala 340 345 350 Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu 355 360 365 Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp Ser Ile Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe 370 375 380 Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile 385 390 395 400 Ile Glu Asn His Gly Thr Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro 405 410 415 Leu Gly Gly Val Ile Asn Thr Glu Thr Leu Thr Lys Val Lys Pro Lys 420 425 430 Thr Gly Gln Glu Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Thr Glu Phe Ser Asp 435 440 445 Lys Asn Glu Ile Arg Val Gly Asn Asn Phe Ala Met Glu Ile Asn Leu 450 455 460
25
HU 007 949 T2
Asn Ala Asn Leu Trp Arg Asn Phe Leu Tyr Ser Asn Ile Ala Leu Tyr 465 470 475 480 Leu Pro Asp Lys Leu Lys Tyr Ser Pro Ser Asn Val Lys Ile Ser Asp 485 490 495 Asn Pro Asn Thr Tyr Asp Tyr Met Asn Lys Arg Val Val Ala Pro Gly 500 505 510 Leu Val Asp Cys Tyr Ile Asn Leu Gly Ala Arg Trp Ser Leu Asp Tyr 515 520 525 Met Asp Asn Val Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Ala Gly Leu Arg 530 535 540 Tyr Arg Ser Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val Pro Phe His Ile 545 550 555 560 Gln Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala Ile Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro 565 570 575 Gly Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Asn Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Val 580 585 590 Leu Gln Ser Ser Leu Gly Asn Asp Leu Arg Val Asp Gly Ala Ser Ile 595 600 605 Lys Phe Asp Ser Ile Cys Leu Tyr Ala Thr Phe Phe Pro Met Ala His 610 615 620 Asn Thr Ala Ser Thr Leu Glu Ala Met Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp 625 630 635 640 Gln Ser Phe Asn Asp Tyr Leu Ser Ala Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile 645 650 655 Pro Ala Asn Ala Thr Asn Val Pro Ile Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp 660 665 670 Ala Ala Phe Arg Gly Trp Ala Phe Thr Arg Leu Lys Thr Lys Glu Thr 675 680 685 Pro Ser Leu Gly Ser Gly Tyr Asp Pro Tyr Tyr Thr Tyr Ser Gly Ser 690 695 700 Ile Pro Tyr Leu Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Lys 705 710 715 720 Val Ala Ile Thr Phe Asp Ser Ser Val Ser Trp Pro Gly Asn Asp Arg 725 730 735 Leu Leu Thr Pro Asn Glu Phe Glu Ile Lys Arg Ser Val Asp Gly Glu 740 745 750 Gly Tyr Asn Val Ala Gln Cys Asn Met Thr Lys Asp Trp Phe Leu Val 755 760 765 Gln Met Leu Ala Asn Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Ile Pro 770 775 780
26
HU 007 949 T2
Glu Ser Tyr Lys Asp Arg Met Tyr Ser Phe Phe Arg Asn Phe Gln Pro 785 790 795 800 Met Ser Arg Gln Val Val Asp Asp Thr Lys Tyr Lys Asp Tyr Gln Gln 805 810 815 Val Gly Ile Leu His Gln His Asn Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr Leu 820 825 830 Ala Pro Thr Met Arg Glu Gly Gln Ala Tyr Pro Ala Asn Phe Pro Tyr 835 840 845 Pro Leu Ile Gly Lys Thr Ala Val Asp Ser Ile Thr Gln Lys Lys Phe 850 855 860 Leu Cys Asp Arg Thr Leu Trp Arg Ile Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met 865 870 875 880 Ser Met Gly Ala Leu Thr Asp Leu Gly Gln Asn Leu Leu Tyr Ala Asn 885 890 895 Ser Ala His Ala Leu Asp Met Thr Phe Glu Val Asp Pro Met Asp Glu 900 905 910 Pro Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu Val Phe Asp Val Val Arg Val 915 920 925 His Arg Pro His Arg Gly Val Ile Glu Thr Val Tyr Leu Arg Thr Pro 930 935 940 Phe Ser Ala Gly Asn Ala Thr Thr 945 950 <210> 3 <211> 942 <212> PRT <213> Simian adenovirus <400> 3
Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile Ala 1 5 10 15 Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala 20 25 30 Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro 35 40 45 Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 50 55 60 Thr Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser 100 105 110 27
HU 007 949 T2
Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly 115 120 125 Ala Pro Asn Ser Ser Gln Trp Glu Gln Ala Lys Thr Gly Asn Gly Gly 130 135 140 Thr Met Glu Thr His Thr Tyr Gly Val Ala Pro Met Gly Gly Glu Asn 145 150 155 160 Ile Thr Lys Asp Gly Leu Gln Ile Gly Thr Asp Val Thr Ala Asn Gln 165 170 175 Asn Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Phe Gln Pro Glu Pro Gln Val 180 185 190 Gly Glu Glu Asn Trp Gln Glu Thr Glu Asn Phe Tyr Gly Gly Arg Ala 195 200 205 Leu Lys Lys Asp Thr Asn Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala Arg 210 215 220 Pro Thr Asn Glu Lys Gly Gly Gln Ala Lys Leu Lys Val Gly Asp Asp 225 230 235 240 Gly Val Pro Thr Lys Glu Phe Asp Ile Asp Leu Ala Phe Phe Asp Thr 245 250 255 Pro Gly Gly Thr Val Asn Gly Gln Asp Glu Tyr Lys Ala Asp Ile Val 260 265 270 Met Tyr Thr Glu Asn Thr Tyr Leu Glu Thr Pro Asp Thr His Val Val 275 280 285 Tyr Lys Pro Gly Lys Asp Asp Ala Ser Ser Glu Ile Asn Leu Val Gln 290 295 300 Gln Ser Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe 305 310 315 320 Ile Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala 325 330 335 Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn 340 345 350 Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr 355 360 365 Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp 370 375 380 Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr 385 390 395 400 Cys Phe Pro Leu Asp Gly Ser Gly Thr Asn Ala Ala Tyr Gln Gly Val 405 410 415 Lys Val Lys Asp Gly Gln Asp Gly Asp Val Glu Ser Glu Trp Glu Asn 420 425 430
28
HU 007 949 T2
Asp Asp Thr Val Ala Ala Arg Asn Gln Leu Cys Lys Gly Asn Ile Phe 435 440 445 Ala Met Glu Ile Asn Leu Gln Ala Asn Leu Trp Arg Ser Phe Leu Tyr 450 455 460 Ser Asn Val Ala Leu Tyr Leu Pro Asp Ser Tyr Lys Tyr Thr Pro Thr 465 470 475 480 Asn Val Thr Leu Pro Thr Asn Thr Asn Thr Tyr Asp Tyr Met Asn Gly 485 490 495 Arg Val Thr Pro Pro Ser Leu Val Asp Ala Tyr Leu Asn Ile Gly Ala 500 505 510 Arg Trp Ser Leu Asp Pro Met Asp Asn Val Asn Pro Phe Asn His His 515 520 525 Arg Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg Ser Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg 530 535 540 Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala Ile Lys 545 550 555 560 Ser Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Asn Phe Arg 565 570 575 Lys Asp Val Asn Met Ile Leu Gln Ser Ser Leu Gly Asn Asp Leu Arg 580 585 590 Thr Asp Gly Ala Ser Ile Ala Phe Thr Ser Ile Asn Leu Tyr Ala Thr 595 600 605 Phe Phe Pro Met Ala His Asn Thr Ala Ser Thr Leu Glu Ala Met Leu 610 615 620 Arg Asn Asp Thr Asn Asp Gln Ser Phe Asn Asp Tyr Leu Ser Ala Ala 625 630 635 640 Asn Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ala Asn Ala Thr Asn Val Pro Ile Ser 645 650 655 Ile Pro Ser Arg Asn Trp Ala Ala Phe Arg Gly Trp Ser Phe Thr Arg 660 665 670 Leu Lys Thr Arg Glu Thr Pro Ser Leu Gly Ser Gly Phe Asp Pro Tyr 675 680 685 Phe Val Tyr Ser Gly Ser Ile Pro Tyr Leu Asp Gly Thr Phe Tyr Leu 690 695 700 Asn His Thr Phe Lys Lys Val Ser Ile Thr Phe Asp Ser Ser Val Ser 705 710 715 720 Trp Pro Gly Asn Asp Arg Leu Leu Thr Pro Asn Glu Phe Glu Ile Lys 725 730 735 Arg Thr Val Asp Gly Glu Gly Tyr Asn Val Ala Gln Cys Asn Met Thr 740 745 750
29
HU 007 949 T2
Lys Asp Trp Phe Leu Val Gln Met Leu Ala His Tyr Asn Ile Gly Tyr 755 760 765 Gln Gly Phe Tyr Val Pro Glu Gly Tyr Lys Asp Arg Met Tyr Ser Phe 770 775 780 Phe Arg Asn Phe Gln Pro Met Ser Arg Gln Val Val Asp Glu Val Asn 785 790 795 800 Tyr Lys Asp Tyr Gln Ala Val Thr Leu Ala Tyr Gln His Asn Asn Ser 805 810 815 Gly Phe Val Gly Tyr Leu Ala Pro Thr Met Arg Gln Gly Gln Pro Tyr 820 825 830 Pro Ala Asn Tyr Pro Tyr Pro Leu Ile Gly Lys Ser Ala Val Ala Ser 835 840 845 Val Thr Gln Lys Lys Phe Leu Cys Asp Arg Val Met Trp Arg Ile Pro 850 855 860 Phe Ser Ser Asn Phe Met Ser Met Gly Ala Leu Thr Asp Leu Gly Gln 865 870 875 880 Asp Met Leu Tyr Ala Asp Ser Ala His Ala Leu Asp Met Asn Phe Glu 885 890 895 Val Asp Pro Met Asp Glu Ser Thr Leu Leu Tyr Val Val Phe Glu Val 900 905 910 Phe Asp Val Val Arg Val His Gln Pro His Arg Gly Val Ile Glu Ala 915 920 925 Val Tyr Leu Arg Thr Pro Glu Ser Ala Gly Asn Ala Thr Thr 930 935 940 <210> 4 <211> 933 <212> PRT <213> Simian adenovirus <400> 4
Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile Ala 1 5 10 15 Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala 20 25 30 Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro 35 40 45 Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 50 55 60 Thr Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 30
HU 007 949 T2
Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser 100 105 110 Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly 115 120 125 Ala Pro Asn Thr Cys Gln Trp Thr Tyr Lys Ala Asp Gly Asp Thr Gly 130 135 140 Thr Glu Lys Thr Tyr Thr Tyr Gly Asn Ala Pro Val Gln Gly Ile Ser 145 150 155 160 Ile Thr Lys Asp Gly Ile Gln Leu Gly Thr Asp Thr Asp Asp Gln Pro 165 170 175 Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Val Gly Asp Ala 180 185 190 Glu Trp His Asp Ile Thr Gly Thr Asp Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Ala 195 200 205 Leu Lys Pro Asp Thr Lys Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Phe Ala Lys 210 215 220 Pro Thr Asn Lys Glu Gly Gly Gln Ala Asn Val Lys Thr Glu Thr Gly 225 230 235 240 Gly Thr Lys Glu Tyr Asp Ile Asp Met Ala Phe Phe Asp Asn Arg Ser 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn 260 265 270 Val Asp Leu Glu Thr Pro Asp Thr His Ile Val Tyr Lys Ala Gly Thr 275 280 285 Asp Asp Ser Ser Ser Ser Ile Asn Leu Gly Gln Gln Ser Met Pro Asn 290 295 300 Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr 305 310 315 320 Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln 325 330 335 Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr 340 345 350 Gln Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met 355 360 365 Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu 370 375 380 Asn His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asp 385 390 395 400 Ala Val Gly Arg Thr Asp Thr Tyr Gln Gly Ile Lys Ala Asn Gly Ala 405 410 415
31
HU 007 949 T2
Asp Gln Thr Thr Trp Thr Lys Asp Asp Thr Val Asn Asp Ala Asn Glu 420 425 430 Leu Gly Lys Gly Asn Pro Phe Ala Met Glu Ile Asn Ile Gln Ala Asn 435 440 445 Leu Trp Arg Asn Phe Leu Tyr Ala Asn Val Ala Leu Tyr Leu Pro Asp 450 455 460 Ser Tyr Lys Tyr Thr Pro Ala Asn Ile Thr Leu Pro Thr Asn Thr Asn 465 470 475 480 Thr Tyr Asp Tyr Met Asn Gly Arg Val Val Ala Pro Ser Leu Val Asp 485 490 495 Ala Tyr Ile Asn Ile Gly Ala Arg Trp Ser Leu Asp Pro Met Asp Asn 500 505 510 Val Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg Ser 515 520 525 Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro 530 535 540 Gln Lys Phe Phe Ala Ile Lys Ser Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr 545 550 555 560 Thr Tyr Glu Trp Asn Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Ile Leu Gln Ser 565 570 575 Ser Leu Gly Asn Asp Leu Arg Thr Asp Gly Ala Ser Ile Ala Pro Thr 580 585 590 Ser Ile Asn Leu Tyr Ala Thr Phe Phe Pro Met Ala His Asn Thr Ala 595 600 605 Ser Thr Leu Glu Ala Met Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp Gln Ser Phe 610 615 620 Asn Asp Tyr Leu Ser Ala Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ala Asn 625 630 635 640 Ala Thr Asn Val Pro Ile Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp Ala Ala Phe 645 650 655 Arg Gly Trp Ser Phe Thr Arg Leu Lys Thr Arg Glu Thr Pro Ser Leu 660 665 670 Gly Ser Gly Phe Asp Pro Tyr Phe Val Tyr Ser Gly Ser Ile Pro Tyr 675 680 685 Leu Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Lys Val Ser Ile 690 695 700 Thr Phe Asp Ser Ser Val Ser Trp Pro Gly Asn Asp Arg Leu Leu Thr 705 710 715 720 Pro Asn Glu Phe Glu Ile Lys Arg Thr Val Asp Gly Glu Gly Tyr Asn 725 730 735
32
HU 007 949 T2
Val Ala Gln Cys Asn Met Thr Lys Ala Trp Phe Leu Val Gln Met Leu 740 745 750 Ala His Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Val Pro Glu Gly Tyr 755 760 765 Leu Asp Arg Met Tyr Ser Phe Phe Arg Asn Phe Gln Pro Met Ser Arg 770 775 780 Gln Val Val Asp Glu Val Asn Tyr Lys Asp Tyr Gln Ala Val Thr Leu 785 790 795 800 Ala Tyr Gln His Asn Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr Leu Ala Pro Thr 805 810 815 Met Arg Gln Gly Gln Pro Tyr Pro Ala Asn Tyr Pro Tyr Pro Leu Ile 820 825 830 Gly Lys Ser Ala Val Ala Ser Val Thr Gln Lys Lys Phe Leu Cys Asp 835 840 845 Arg Val Met Trp Arg Ile Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met Ser Met Gly 850 855 860 Ala Leu Thr Asp Leu Gly Gln Asn Met Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His 865 870 875 880 Ala Leu Asp Met Asn Phe Glu Val Asp Pro Met Asp Glu Ser Thr Leu 885 890 895 Leu Tyr Val Val Phe Glu Val Phe Asp Val Val Arg Val His Gln Pro 900 905 910 His Arg Gly Val Ile Glu Ala Val Tyr Leu Arg Thr Pro Phe Ser Ala 915 920 925 Gly Asn Ala Thr Thr 930 <210> 5 <211> 932 <212> PRT <213> Simian adenovirus <400> 5
Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile Ala 1 5 10 15 Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala 20 25 30 Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro 35 40 45 Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 50 55 60 Thr Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 33
HU 007 949 T2
Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser 100 105 110 Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly 115 120 125 Ala Pro Asn Thr Cys Gln Trp Thr Tyr Lys Ala Gly Asp Thr Asp Thr 130 135 140 Glu Lys Thr Tyr Thr Tyr Gly Asn Ala Pro Val Gln Gly Ile Ser Ile 145 150 155 160 Thr Lys Asp Gly Ile Gln Leu Gly Thr Asp Ser Asp Gly Gln Ala Ile 165 170 175 Tyr Ala Asp Glu Thr Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Val Gly Asp Ala Glu 180 185 190 Trp His Asp Ile Thr Gly Thr Asp Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Ala Leu 195 200 205 Lys Pro Asp Thr Lys Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Phe Ala Lys Pro 210 215 220 Thr Asn Lys Glu Gly Gly Gln Ala Asn Val Lys Thr Glu Thr Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Glu Tyr Asp Ile Asp Met Ala Phe Phe Asp Asn Arg Ser Ala 245 250 255 Ala Ala Ala Gly Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Val 260 265 270 Asp Leu Glu Thr Pro Asp Thr His Ile Val Tyr Lys Ala Gly Thr Asp 275 280 285 Asp Ser Ser Ser Ser Ile Asn Leu Gly Gln Gln Ser Met Pro Asn Arg 290 295 300 Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu 325 330 335 Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln 340 345 350 Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp 355 360 365 Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn 370 375 380 His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asp Ala 385 390 395 400
34
HU 007 949 T2
Val Gly Arg Thr Asp Thr Tyr Gln Gly Ile Lys Ala Asn Gly Asp Asn 405 410 415 Gln Thr Thr Trp Thr Lys Asp Asp Thr Val Asn Asp Ala Asn Glu Leu 420 425 430 Gly Lys Gly Asn Pro Phe Ala Met Glu Ile Asn Ile Gln Ala Asn Leu 435 440 445 Trp Arg Asn Phe Leu Tyr Ala Asn Val Ala Leu Tyr Leu Pro Asp Ser 450 455 460 Tyr Lys Tyr Thr Pro Ala Asn Ile Thr Leu Pro Thr Asn Thr Asn Thr 465 470 475 480 Tyr Asp Tyr Met Asn Gly Arg Val Val Ala Pro Ser Leu Val Asp Ala 485 490 495 Tyr Ile Asn Ile Gly Ala Arg Trp Ser Leu Asp Pro Met Asp Asn Val 500 505 510 Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg Ser Met 515 520 525 Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro Gln 530 535 540 Lys Phe Phe Ala Ile Lys Ser Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr Thr 545 550 555 560 Tyr Glu Trp Asn Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Ile Leu Gln Ser Ser 565 570 575 Leu Gly Asn Asp Leu Arg Thr Asp Gly Ala Ser Ile Ala Phe Thr Ser 580 585 590 Ile Asn Leu Tyr Ala Thr Phe Phe Pro Met Ala His Asn Thr Ala Ser 595 600 605 Thr Leu Phe Ala Met Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp Gln Ser Phe Asn 610 615 620 Asp Tyr Leu Ser Ala Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ala Asn Ala 625 630 635 640 Thr Asn Val Pro Ile Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp Ala Ala Phe Arg 645 650 655 Gly Trp Ser Phe Thr Arg Leu Lys Thr Arg Glu Thr Pro Ser Leu Gly 660 665 670 Ser Gly Phe Asp Pro Tyr Phe Val Tyr Ser Gly Ser Ile Pro Tyr Leu 675 680 685 Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Lys Val Ser Ile Thr 690 695 700 Phe Asp Ser Ser Val Ser Trp Pro Gly Asn Asp Arg Leu Leu Thr Pro 705 710 715 720
35
HU 007 949 T2
Asn Glu Phe Glu Ile Lys Arg Thr Val Asp Gly Glu Gly Tyr Asn Val 725 730 735 Ala Gln Cys Asn Met Thr Lys Asp Trp Phe Leu Val Gln Met Leu Ala 740 745 750 His Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Val Pro Glu Gly Tyr Lys 755 760 765 Asp Arg Met Tyr Ser Phe Phe Arg Asn Phe Gln Pro Met Ser Arg Gln 770 775 780 Val Val Asp Glu Val Asn Tyr Lys Asp Tyr Gln Ala Val Thr Leu Ala 785 790 795 800 Tyr Gln His Asn Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr Leu Ala Pro Thr Met 805 810 815 Arg Gln Gly Gln Pro Tyr Pro Ala Asn Tyr Pro Tyr Pro Leu Ile Gly 820 825 830 Lys Ser Ala Val Ala Ser Val Thr Gln Lys Lys Phe Leu Cys Asp Arg 835 840 845 Val Met Trp Arg Ile Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met Ser Met Gly Ala 850 855 860 Leu Thr Asp Leu Gly Gln Asn Met Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His Ala 865 870 875 880 Leu Asp Met Asn Phe Glu Val Asp Pro Met Asp Glu Ser Thr Leu Leu 885 890 895 Tyr Val Val Phe Glu Val Phe Asp Val Val Arg Val His Gln Pro His 900 905 910 Arg Gly Val Ile Glu Ala Val Tyr Leu Arg Thr Pro Phe Ser Ala Gly 915 920 925 Asn Ala Thr Thr 930 <210> 6 <211> 933 <212> PRT <213> Simian adenovirus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (826)..(826) <223> can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (922).. (922) <223> can be any amino acid
36
HU 007 949 T2
<400> 6
Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile Ala 1 5 10 15 Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala 20 25 30 Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro 35 40 45 Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 50 55 60 Thr Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser 100 105 110 Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly 115 120 125 Ala Pro Asn Thr Cys Gln Trp Thr Tyr Lys Ala Asp Gly Glu Thr Ala 130 135 140 Thr Glu Lys Thr Tyr Thr Tyr Gly Asn Ala Pro Val Gln Gly Ile Asn 145 150 155 160 Ile Thr Lys Asp Gly Ile Gln Leu Gly Thr Asp Thr Asp Asp Gln Pro 165 170 175 Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Val Gly Asp Ala 180 185 190 Glu Trp His Asp Ile Thr Gly Thr Asp Glu Lys Tyr Gly Gly Arg Ala 195 200 205 Leu Lys Pro Asp Thr Lys Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Phe Ala Lys 210 215 220 Pro Thr Asn Lys Glu Gly Gly Gln Ala Asn Val Lys Thr Gly Thr Gly 225 230 235 240 Thr Thr Lys Glu Tyr Asp Ile Asp Met Ala Phe Phe Asp Asn Arg Ser 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn 260 265 270 Val Asp Leu Glu Thr Pro Asp Thr His Ile Val Tyr Lys Ala Gly Thr 275 280 285 Asp Asp Ser Ser Ser Ser Ile Asn Leu Gly Gln Gln Ala Met Pro Asn 290 295 300
37
HU 007 949 T2
Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr 305 310 315 320 Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln 325 330 335 Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr 340 345 350 Gln Leu Leu Leu Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met 355 360 365 Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu 370 375 380 Asn His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Asp 385 390 395 400 Ala Val Gly Arg Thr Asp Thr Tyr Gln Gly Ile Lys Ala Asn Gly Thr 405 410 415 Asp Gln Thr Thr Trp Thr Lys Asp Asp Ser Val Asn Asp Ala Asn Glu 420 425 430 Ile Gly Lys Gly Asn Pro Phe Ala Met Glu Ile Asn Ile Gln Ala Asn 435 440 445 Leu Trp Arg Asn Phe Leu Tyr Ala Asn Val Ala Leu Tyr Leu Pro Asp 450 455 460 Ser Tyr Lys Tyr Thr Pro Ala Asn Val Thr Leu Pro Thr Asn Thr Asn 465 470 475 480 Thr Tyr Asp Tyr Met Asn Gly Arg Val Val Ala Pro Ser Leu Val Asp 485 490 495 Ser Tyr Ile Asn Ile Gly Ala Arg Trp Ser Leu Asp Pro Met Asp Asn 500 505 510 Val Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg Ser 515 520 525 Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro 530 535 540 Gln Lys Phe Phe Ala Ile Lys Ser Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr 545 550 555 560 Thr Tyr Glu Trp Asn Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Ile Leu Gln Ser 565 570 575 Ser Leu Gly Asn Asp Leu Arg Thr Asp Gly Ala Ser Ile Ser Phe Thr 580 585 590 Ser Ile Asn Leu Tyr Ala Thr Phe Phe Pro Met Ala His Asn Thr Ala 595 600 605 Ser Thr Leu Glu Ala Met Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp Gln Ser Phe 610 615 620
38
HU 007 949 T2
Asn Asp Tyr Leu Ser Ala Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ala Asn 625 630 635 640 Ala Thr Asn Val Pro Ile Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp Ala Ala Phe 645 650 655 Arg Gly Trp Ser Phe Thr Arg Leu Lys Thr Lys Glu Thr Pro Ser Leu 660 665 670 Gly Ser Gly Phe Asp Pro Tyr Phe Val Tyr Ser Gly Ser Ile Pro Tyr 675 680 685 Leu Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Lys Val Ser Ile 690 695 700 Thr Phe Asp Ser Ser Val Ser Trp Pro Gly Asn Asp Arg Leu Leu Thr 705 710 715 720 Pro Asn Glu Phe Glu Ile Lys Arg Thr Val Asp Gly Glu Gly Tyr Asn 725 730 735 Val Ala Gln Cys Asn Met Thr Lys Asp Trp Phe Leu Val Gln Met Leu 740 745 750 Ala His Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Val Pro Glu Gly Tyr 755 760 765 Lys Asp Arg Met Tyr Ser Phe Phe Arg Asn Phe Gln Pro Met Ser Arg 770 775 780 Gln Val Val Asp Glu Val Asn Tyr Lys Asp Tyr Gln Ala Val Thr Leu 785 790 795 800 Ala Tyr Gln His Asn Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr Leu Ala Pro Thr 805 810 815 Met Arg Gln Gly Gln Pro Tyr Pro Ala Xaa Tyr Pro Tyr Pro Leu Ile 820 825 830 Gly Lys Ser Ala Val Thr Ser Val Thr Gln Lys Lys Phe Leu Cys Asp 835 840 845 Arg Val Met Trp Arg Ile Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met Ser Met Gly 850 855 860 Ala Leu Thr Asp Leu Gly Gln Asn Met Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His 865 870 875 880 Ala Leu Asp Met Asn Phe Glu Val Asp Pro Met Asp Glu Ser Thr Leu 885 890 895 Leu Tyr Val Val Phe Glu Val Phe Asp Val Val Arg Val His Gln Pro 900 905 910 His Arg Gly Val Ile Glu Ala Val Tyr Xaa Arg Thr Pro Phe Ser Ala 915 920 925 Gly Asn Ala Thr Thr 930
39
HU 007 949 T2
<210> 7 <211> 921 <212> PRT <213> Simian adenovirus <400> 7
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ser Tyr Met His Ile Ala 1 5 10 15 Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala 20 25 30 Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro 35 40 45 Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 50 55 60 Thr Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser 100 105 110 Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly 115 120 125 Ala Pro Asn Pro Ser Glu Trp Thr Asp Thr Ser Asp Asn Lys Leu Lys 130 135 140 Ala Tyr Ala Gln Ala Pro Tyr Gln Ser Gln Gly Leu Thr Lys Asp Gly 145 150 155 160 Ile Gln Val Gly Leu Val Val Thr Glu Ser Gly Gln Thr Pro Gln Tyr 165 170 175 Ala Asn Lys Val Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Ile Gly Glu Asn Gln Tyr 180 185 190 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Lys Ala Ala Gly Arg Val Leu Lys Lys Asp 195 200 205 Thr Pro Met Phe Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala Arg Pro Thr Asn Glu 210 215 220 Gln Gly Gly Gln Ala Lys Asn Gln Glu Val Asp Leu Gln Phe Phe Ala 225 230 235 240 Thr Pro Gly Asp Thr Gln Asn Thr Ala Lys Val Val Leu Tyr Ala Glu 245 250 255 Asn Val Asn Leu Glu Thr Pro Asp Thr His Leu Val Phe Lys Pro Asp 260 265 270 Asp Asp Ser Thr Ser Ser Lys Leu Leu Leu Gly Gln Gln Ala Ala Pro 275 280 285
40
HU 007 949 T2
Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met 290 295 300 Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser 305 310 315 320 Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser 325 330 335 Tyr Gln Leu Met Leu Asp Ala Leu Gly Asp Arg Ser Arg Tyr Phe Ser 340 345 350 Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile 355 360 365 Glu Asn His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu 370 375 380 Gly Gly Met Val Val Thr Asp Asn Tyr Asn Ser Val Thr Pro Gln Asn 385 390 395 400 Gly Gly Ser Gly Asn Thr Trp Gln Ala Asp Asn Thr Thr Phe Ser Gln 405 410 415 Arg Gly Ala Gln Ile Gly Ser Gly Asn Met Phe Ala Leu Glu Ile Asn 420 425 430 Leu Gln Ala Asn Leu Trp Arg Gly Phe Leu Tyr Ser Asn Ile Gly Leu 435 440 445 Tyr Leu Pro Asp Ser Leu Lys Ile Thr Pro Asp Asn Ile Thr Leu Pro 450 455 460 Glu Asn Lys Asn Thr Tyr Gln Tyr Met Asn Gly Arg Val Thr Pro Pro 465 470 475 480 Gly Leu Ile Asp Thr Tyr Val Asn Val Gly Ala Arg Trp Ser Pro Asp 485 490 495 Val Met Asp Ser Ile Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Ala Gly Leu 500 505 510 Arg Tyr Arg Ser Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val Pro Phe His 515 520 525 Ile Gln Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala Ile Lys Asn Leu Leu Leu Leu 530 535 540 Pro Gly Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Asn Phe Arg Lys Asp Val Asn Met 545 550 555 560 Ile Leu Gln Ser Ser Leu Gly Asn Asp Leu Arg Val Asp Gly Ala Ser 565 570 575 Ile Arg Phe Asp Ser Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Phe Phe Pro Met Ala 580 585 590 His Asn Thr Ala Ser Thr Leu Glu Ala Met Leu Arg Asn Asp Thr Asn 595 600 605
41
HU 007 949 T2
Asp Gln Ser Phe Asn Asp Tyr Leu Cys Ala Ala Asn Met Leu Tyr Pro 610 615 620 Ile Pro Ala Asn Ala Thr Ser Val Pro Ile Ser Ile Pro Ser Arg Asn 625 630 635 640 Trp Ala Ala Phe Arg Gly Trp Ser Phe Thr Arg Leu Lys Thr Lys Glu 645 650 655 Thr Pro Ser Leu Gly Ser Gly Phe Asp Pro Tyr Phe Val Tyr Ser Gly 660 665 670 Ser Ile Pro Tyr Leu Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys 675 680 685 Lys Val Ser Ile Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Trp Pro Gly Asn Asp 690 695 700 Arg Leu Leu Thr Pro Asn Glu Phe Glu Ile Lys Arg Ser Val Asp Gly 705 710 715 720 Glu Gly Tyr Asn Val Ala Gln Ser Asn Met Thr Lys Asp Trp Phe Leu 725 730 735 Ile Gln Met Leu Ser His Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Val 740 745 750 Pro Glu Asn Tyr Lys Asp Arg Met Tyr Ser Phe Phe Arg Asn Phe Gln 755 760 765 Pro Met Ser Arg Gln Val Val Asp Thr Val Thr Tyr Thr Asp Tyr Lys 770 775 780 Asp Val Lys Leu Pro Tyr Gln His Asn Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr 785 790 795 800 Met Gly Pro Thr Met Arg Glu Gly Gln Ala Tyr Pro Ala Asn Tyr Pro 805 810 815 Tyr Pro Leu Ile Gly Glu Thr Ala Val Pro Ser Leu Thr Gln Lys Lys 820 825 830 Phe Leu Cys Asp Arg Val Met Trp Arg Ile Pro Phe Ser Ser Asn Phe 835 840 845 Met Ser Met Gly Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gln Asn Met Leu Tyr Ala 850 855 860 Asn Ser Ala His Ala Leu Asp Met Thr Phe Glu Val Asp Pro Met Asp 865 870 875 880 Glu Pro Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu Val Phe Asp Val Val Arg 885 890 895 Ile His Gln Pro His Arg Gly Val Ile Glu Ala Val Tyr Leu Arg Thr 900 905 910 Pro Phe Ser Ala Gly Asn Ala Thr Thr 915 920
42
HU 007 949 T2
<210> 8 <211> 917 <212> PRT <213> Simian adenovirus <400> 8
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ser Tyr Met His Ile Ala 1 5 10 15 Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala 20 25 30 Arg Ala Thr Glu Thr Tyr Phe Ser Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro 35 40 45 Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 50 55 60 Thr Ile Arg Phe Val Pro Val Asp Lys Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Thr Arg Phe Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn. Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Ile Asp Arg Gly Pro Ser 100 105 110 Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly 115 120 125 Ala Pro Asn Asn Ser Gln Trp Asn Ala Thr Asp Asn Gly Asn Lys Pro 130 135 140 Val Cys Phe Ala Gln Ala Ala Phe Ile Gly Gln Ser Ile Thr Lys Asp 145 150 155 160 Gly Val Gln Ile Gln Asn Ser Glu Asn Gln Gln Ala Ala Ala Asp Lys 165 170 175 Thr Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Ile Gly Val Ser Thr Trp Asp Thr Asn 180 185 190 Val Thr Ser Asn Ala Ala Gly Arg Val Leu Lys Ala Thr Thr Pro Met 195 200 205 Leu Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala Asn Pro Thr Asn Pro Asn Gly Gly 210 215 220 Gln Ala Lys Thr Glu Gly Asp Ile Ser Leu Asn Phe Phe Thr Thr Thr 225 230 235 240 Ala Ala Ala Asp Asn Asn Pro Lys Val Val Leu Tyr Ser Glu Asp Val 245 250 255 Asn Leu Gln Ala Pro Asp Thr His Leu Val Tyr Lys Pro Thr Val Gly 260 265 270 Glu Asn Val Ile Ala Ala Glu Ala Leu Leu Thr Gln Gln Ala Cys Pro 275 280 285 43
HU 007 949 T2
Asn Arg Ala Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met 290 295 300 Thr Thr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser 305 310 315 320 Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser 325 330 335 Tyr Gln Leu Met Leu Asp Ala Leu Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser 340 345 350 Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile 355 360 365 Glu Asn His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu 370 375 380 Pro Gly Met Gly Ile Phe Asn Ser Tyr Lys Gly Val Lys Pro Gln Asn 385 390 395 400 Gly Gly Asn Gly Asn Trp Glu Ala Asn Gly Asp Leu Ser Asn Ala Asn 405 410 415 Glu Ile Ala Leu Gly Asn Ile Phe Ala Met Glu Ile Asn Leu His Ala 420 425 430 Asn Leu Trp Arg Ser Phe Leu Tyr Ser Asn Val Ala Leu Tyr Leu Pro 435 440 445 Asp Ser Tyr Lys Phe Thr Pro Ala Asn Ile Thr Leu Pro Ala Asn Gln 450 455 460 Asn Thr Tyr Gly Tyr Ile Asn Gly Arg Val Thr Ser Pro Thr Leu Val 465 470 475 480 Asp Thr Phe Val Asn Ile Gly Ala Arg Trp Ser Pro Asp Pro Met Asp 485 490 495 Asn Val Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg 500 505 510 Ser Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg Val Val Pro Phe His Ile Gln Val 515 520 525 Pro Gln Lys Phe Phe Ala Ile Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser 530 535 540 Tyr Thr Tyr Glu Trp Ser Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Ile Leu Gln 545 550 555 560 Ser Thr Leu Gly Asn Asp Leu Arg Val Asp Gly Ala Ser Val Arg Ile 565 570 575 Asp Ser Val Asn Leu Tyr Ala Asn Phe Phe Pro Met Ala His Asn Thr 580 585 590 Ala Ser Thr Leu Glu Ala Met Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp Gly Ser 595 600 605
44
HU 007 949 T2
Phe Asn Asp Tyr Leu Ser Ala Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ala 610 615 620 Asn Ala Thr Asn Val Pro Ile Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp Ala Ala 625 630 635 640 Phe Arg Gly Trp Ser Phe Thr Arg Leu Lys Ala Lys Glu Thr Pro Ser 645 650 655 Leu Gly Ser Gly Phe Asp Pro Tyr Phe Val Tyr Ser Gly Thr Ile Pro 660 665 670 Tyr Leu Asp Gly Ser Phe Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Arg Leu Ser 675 680 685 Ile Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Trp Pro Gly Asn Asp Arg Leu Leu 690 695 700 Thr Pro Asn Glu Phe Glu Ile Lys Arg Ile Val Asp Gly Glu Gly Tyr 705 710 715 720 Asn Val Ala Gln Ser Asn Met Thr Lys Asp Trp Phe Leu Ile Gln Met 725 730 735 Leu Ser His Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Val Pro Glu Gly 740 745 750 Tyr Lys Asp Arg Met Tyr Ser Phe Phe Arg Asn Phe Gln Pro Met Ser 755 760 765 Arg Gln Val Pro Asp Pro Thr Ala Ala Gly Tyr Gln Ala Val Pro Leu 770 775 780 Pro Arg Gln His Asn Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr Met Gly Pro Thr 785 790 795 800 Met Arg Glu Gly Gln Pro Tyr Pro Ala Asn Tyr Pro Tyr Pro Leu Ile 805 810 815 Gly Ala Thr Ala Val Pro Ala Ile Thr Gln Lys Lys Phe Leu Cys Asp 820 825 830 Arg Val Met Trp Arg Ile Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met Ser Met Gly 835 840 845 Ala Leu Thr Asp Leu Gly Gln Asn Met Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His 850 855 860 Ala Leu Asp Met Thr Phe Glu Val Asp Pro Met Asn Glu Pro Thr Leu 865 870 875 880 Leu Tyr Met Leu Phe Glu Val Phe Asp Val Val Arg Val His Gln Pro 885 890 895 His Arg Gly Ile Ile Glu Ala Val Tyr Leu Arg Thr Pro Phe Ser Ala 900 905 910 Gly Asn Ala Thr Thr 915
45
HU 007 949 T2
<210> 9 <211> 917 <212> PRT <213> Simian adenovirus <400> 9
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ser Tyr Met His Ile Ala 1 5 10 15 Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala 20 25 30 Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro 35 40 45 Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 50 55 60 Thr Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Val Arg Phe Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser 100 105 110 Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly 115 120 125 Ala Pro Asn Pro Ser Glu Trp Lys Gly Ser Asp Asn Lys Ile Ser Val 130 135 140 Arg Gly Gln Ala Pro Phe Phe Ser Thr Ser Ile Thr Lys Asp Gly Ile 145 150 155 160 Gln Val Ala Thr Asp Thr Ser Ser Gly Ala Val Tyr Ala Lys Lys Glu 165 170 175 Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Val Gly Gln Glu Gln Trp Asn Ser Glu Ala 180 185 190 Ser Asp Ser Asp Lys Val Ala Gly Arg Ile Leu Lys Asp Thr Thr Pro 195 200 205 Met Phe Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala Lys Pro Thr Asn Glu Gln Gly 210 215 220 Gly Gln Gly Thr Asn Thr Val Asp Leu Gln Phe Phe Ala Ser Ser Ser 225 230 235 240 Ala Thr Ser Thr Pro Lys Ala Val Leu Tyr Ala Glu Asp Val Ala Ile 245 250 255 Glu Ala Pro Asp Thr His Leu Val Tyr Lys Pro Ala Val Thr Thr Thr 260 265 270 Thr Thr Ser Ser Gln Asp Leu Leu Thr Gln Gln Ala Ala Pro Asn Arg 275 280 285 46
HU 007 949 T2
Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu 305 310 315 320 Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln 325 330 335 Leu Met Leu Asp Ala Leu Gly Asp Arg Ser Arg Tyr Phe Ser Met Trp 340 345 350 Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn 355 360 365 His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Gly Gly 370 375 380 Ser Leu Val Thr Glu Thr Tyr Thr Gly Leu Ser Pro Gln Asn Gly Ser 385 390 395 400 Asn Thr Trp Thr Thr Asp Ser Thr Thr Tyr Ala Thr Arg Gly Val Glu 405 410 415 Ile Gly Ser Gly Asn Met Phe Ala Met Glu Ile Asn Leu Ala Ala Asn 420 425 430 Leu Trp Arg Ser Phe Leu Tyr Ser Asn Val Ala Leu Tyr Leu Pro Asp 435 440 445 Glu Tyr Lys Leu Thr Pro Asp Asn Ile Thr Leu Pro Asp Asn Lys Asn 450 455 460 Thr Tyr Asp Tyr Met Asp Gly Arg Val Ala Ala Pro Ser Ser Leu Asp 465 470 475 480 Thr Tyr Val Asn Ile Gly Ala Arg Trp Ser Pro Asp Pro Met Asp Asn 485 490 495 Val Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg Ser 500 505 510 Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro 515 520 525 Gln Lys Phe Phe Ala Ile Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr 530 535 540 Thr Tyr Glu Trp Asn Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Ile Leu Gln Ser 545 550 555 560 Ser Leu Gly Asn Asp Leu Arg Val Asp Gly Ala Ser Val Arg Phe Asp 565 570 575 Ser Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Phe Phe Pro Met Ala His Asn Thr Ala 580 585 590 Ser Thr Leu Glu Ala Met Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp Gln Ser Phe 595 600 605
47
HU 007 949 T2
Asn Asp Tyr Leu Cys Ala Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ala Asn 610 615 620 Ala Thr Ser Val Pro Ile Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp Ala Ala Phe 625 630 635 640 Arg Gly Trp Ser Phe Thr Arg Leu Lys Thr Lys Glu Thr Pro Ser Leu 645 650 655 Gly Ser Gly Phe Asp Pro Tyr Phe Thr Tyr Ser Gly Ser Ile Pro Tyr 660 665 670 Leu Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Lys Val Ser Ile 675 680 685 Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Trp Pro Gly Asn Asp Arg Leu Leu Thr 690 695 700 Pro Asn Glu Phe Glu Ile Lys Arg Thr Val Asp Gly Glu Gly Tyr Asn 705 710 715 720 Val Ala Gln Cys Asn Met Thr Lys Asp Trp Phe Leu Ile Gln Met Leu 725 730 735 Ser His Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln Gly Pro Tyr Val Pro Glu Gly Tyr 740 745 750 Lys Asp Arg Met Tyr Ser Phe Phe Arg Asn Phe Gln Pro Met Ser Arg 755 760 765 Gln Val Val Asp Thr Thr Thr Tyr Thr Asp Tyr Lys Asn Val Thr Leu 770 775 780 Pro Phe Gln His Asn Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr Met Gly Pro Thr 785 790 795 800 Met Arg Glu Gly Gln Ala Tyr Pro Ala Asn Tyr Pro Tyr Pro Leu Ile 805 810 815 Gly Lys Thr Ala Val Pro Ser Leu Thr Gln Lys Lys Phe Leu Cys Asp 820 825 830 Arg Thr Met Trp Arg Ile Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met Ser Met Gly 835 840 845 Ala Leu Thr Asp Leu Gly Gln Asn Met Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His 850 855 860 Ala Leu Asp Met Thr Phe Glu Val Asp Pro Met Asp Glu Pro Thr Leu 865 870 875 880 Leu Tyr Val Leu Phe Glu Val Phe Asp Val Val Arg Ile His Gln Pro 885 890 895 His Arg Gly Val Ile Glu Ala Val Tyr Leu Arg Thr Pro Phe Ser Ala 900 905 910 Gly Asn Ala Thr Thr 915
48
HU 007 949 T2
<210> 10 <211> 931 <212> PRT <213> Simian adenovirus <400> 10
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ser Tyr Met His Ile Ala 1 5 10 15 Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala 20 25 30 Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro 35 40 45 Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 50 55 60 Thr Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser 100 105 110 Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly 115 120 125 Ala Pro Asn Pro Ala Glu Trp Thr Asn Ser Asp Ser Lys Val Lys Val 130 135 140 Arg Ala Gln Ala Pro Phe Val Ser Ser Tyr Gly Ala Thr Ala Ile Thr 145 150 155 160 Lys Glu Gly Ile Gln Val Gly Val Thr Leu Thr Asp Ser Gly Ser Thr 165 170 175 Pro Gln Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Ile Gly Glu 180 185 190 Leu Gln Trp Asn Ser Asp Val Gly Thr Asp Asp Lys Ile Ala Gly Arg 195 200 205 Val Leu Lys Lys Thr Thr Pro Met Phe Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala 210 215 220 Arg Pro Thr Asn Glu Lys Gly Gly Gln Ala Thr Pro Ser Ala Ser Gln 225 230 235 240 Asp Val Gln Asn Pro Glu Leu Gln Phe Phe Ala Ser Thr Asn Val Ala 245 250 255 Asn Thr Pro Lys Ala Val Leu Thr Ala Glu Asp Val Ser Ile Glu Ala 260 265 270 Pro Asp Thr His Leu Val Phe Lys Pro Thr Val Thr Glu Gly Ile Thr 275 280 285 49
HU 007 949 T2
Ser Ser Glu Ala Leu Leu Thr Gln Gln Ala Ala Pro Asn Arg Pro Asn 290 295 300 Tyr Ile Ala Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala 325 330 335 Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Met 340 345 350 Leu Asp Ala Leu Gly Asp Arg Ser Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln 355 360 365 Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly 370 375 380 Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Gly Gly Met Ala 385 390 395 400 Val Thr Asp Thr Tyr Ser Pro Ile Lys Val Asn Gly Gly Gly Asn Gly 405 410 415 Trp Glu Ala Asn Asn Gly Val Phe Thr Glu Arg Gly Val Glu Ile Gly 420 425 430 Ser Gly Asn Met Phe Ala Met Glu Ile Asn Leu Gln Ala Asn Leu Trp 435 440 445 Arg Ser Phe Leu Tyr Ser Asn Ile Gly Leu Tyr Leu Pro Asp Ser Leu 450 455 460 Lys Ile Thr Pro Asp Asn Ile Thr Leu Pro Glu Asn Lys Asn Thr Tyr 465 470 475 480 Gln Tyr Met Asn Gly Arg Val Thr Pro Pro Gly Leu Val Asp Thr Tyr 485 490 495 Val Asn Val Gly Ala Arg Trp Ser Pro Asp Val Met Asp Ser Ile Asn 500 505 510 Pro Phe Asn His His Arg Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg Ser Met Leu 515 520 525 Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro Gln Lys 530 535 540 Phe Phe Ala Ile Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr Thr Tyr 545 550 555 560 Glu Trp Asn Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Ile Leu Gln Ser Ser Leu 565 570 575 Gly Asn Asp Leu Arg Val Asp Gly Ala Ser Ile Arg Phe Asp Ser Ile 580 585 590 Asn Leu Tyr Ala Asn Phe Phe Pro Met Ala His Asn Thr Ala Ser Thr 595 600 605
50
HU 007 949 T2
Leu Glu Ala Met Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp Gln Ser Phe Asn Asp 610 615 620 Tyr Leu Cys Ala Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ala Asn Ala Thr 625 630 635 640 Ser Val Pro Ile Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp Ala Ala Phe Arg Gly 645 650 655 Trp Ser Phe Thr Arg Leu Lys Thr Lys Glu Thr Pro Ser Leu Gly Ser 660 665 670 Gly Phe Asp Pro Tyr Phe Val Tyr Ser Gly Ser Ile Pro Tyr Leu Asp 675 680 685 Gly Thr Phe Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Lys Val Ser Ile Met Phe 690 695 700 Asp Ser Ser Val Ser Trp Pro Gly Asn Asp Arg Leu Leu Thr Pro Asn 705 710 715 720 Glu Phe Glu Ile Lys Arg Ser Val Asp Gly Glu Gly Tyr Asn Val Ala 725 730 735 Gln Ser Asn Met Thr Lys Asp Trp Phe Leu Ile Gln Met Leu Ser His 740 745 750 Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Val Pro Glu Asn Tyr Lys Asp 755 760 765 Arg Met Tyr Ser Phe Phe Arg Asn Phe Gln Pro Met Ser Arg Gln Ile 770 775 780 Val Asp Ser Thr Ala Tyr Thr Asn Tyr Gln Asp Val Lys Leu Pro Tyr 785 790 795 800 Gln His Asn Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr Met Gly Pro Thr Met Arg 805 810 815 Glu Gly Gln Ala Tyr Pro Ala Asn Tyr Pro Tyr Pro Leu Ile Gly Ala 820 825 830 Thr Ala Val Pro Ser Leu Thr Gln Leu Leu Phe Leu Cys Asp Arg Val 835 840 845 Met Trp Arg Ile Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met Ser Met Gly Ser Leu 850 855 860 Thr Asp Leu Gly Gln Asn Met Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His Ala Leu 865 870 875 880 Asp Met Thr Phe Glu Val Asp Pro Met Asp Gln Pro Thr Leu Leu Tyr 885 890 895 Val Leu Phe Glu Val Phe Asp Val Val Arg Ile His Gln Pro His Arg 900 905 910
51
HU 007 949 T2
Gly Val Ile Glu Ala Val Tyr Leu Arg Thr Pro Phe Ser Ala Gly Asn 915 920 925 Ala Thr Thr 930 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Human adenovirus type 1 hexon region <400> 11
Ala Leu Glu Ile Asn Leu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asn Glu Asp Glu 1 5 10 15 Val Asp Glu Gln Ala Glu Gln Gln Lys 20 25 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 12
Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp 1 5 10 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 5hex1 <400> 13
gaccgccgtt gttgtaaccc
20
<210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, lt rev <400> 14
gttgtcatcg tccactagtc cctcttcttc taggtttatt tcaag <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, rt forward 52
45
HU 007 949 T2
<400> 15
ggactagtgg acgatgacaa cgaagacga
29
<210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, rt rev <400> 16
atggtttcat tggggtagtc
20
<210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligomer, 2F5 bot <400> 17
ccggaccaca ggctggccca cttgtccagc tccagcagct cctgctcg
48
<210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligomer, CD4 top <400> 18
ctaggctgct acggcgtgag cgccaccaag ctgggg
36
<210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligomer CD4 bot <400> 19
ctagccccag cttggtggcg ctcacgccgt agcagc <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Human adenovirus type 5
53
36
HU 007 949 T2
<400> 20
Gly Leu Gly Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Gly Leu Val 1 5 10 15 <210> 21 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligomer, CD8 top <400> 21
ctagggacca gcaccggcaa ctacaactac aagtaccgct acctgcgcca cggcaagctg cgccccggg
60 69
<210> 22 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligomer, CD8 bot <400> 22
ctagcccggg gcgcagcttg ccgtggcgca ggtagcggta cttgtagttg tagttgccgg tgctggtcc
60 69
<210> 23 <211> 26 <212> PRT <213> Human adenovirus type 5 <400> 23
Gly Leu Gly Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Gly Leu Val 20 25 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, 5hex1 <400> 24
gaccgccgtt gttgtaaccc
20
<210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial 54
1
HU 007 949 T2
2
<220> <223> primer, BspSOErev <400> 25
cgtgagttcc ggaagtagca gcttcatccc attcg
35
<210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, BspSOEfwd <400> 26
tgctacttcc ggaactcacg tatttgggca ggcg
34
<210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, 5hex4 <400> 27
ggaagaaggt ggcgtaaagg
20
<210> 28 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligomer, 2F5 top <400> 28
ccggcgagca ggagctgctg gagctggaca agtgggccag cctgtggt
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Módosított adenovírushexon-fehérjét tartalmazó kapszidú adenovírus, amely módosított adenovírushexon-fehérje az 1¹es hipervariábilis régió és a 4¹es hi- 50 pervariábilis régió közül kiválasztott legalább egy hipervariábilis régióban deléciót, és az 1¹es hipervariábilis régióba és/vagy a 4¹es hipervariábilis régióba beinszertált immunogenikus aminosavszekvenciát tartalmazó exogén aminosavszekvenciát tartalmaz, azzal a 55 kikötéssel, hogy az exogén aminosavszekvencia adenovírusszekvenciától eltérõ szekvencia. 2. Az 1. igénypont szerinti adenovírus, ahol a hexonfehérje egynél több deléciót és/vagy részleges de60 léciót tartalmaz. 55
48
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti adenovírus, ahol a deléció a natív hipervariábilis régió legalább 25 aminosavát tartalmazza. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti adenovírus, ahol a natív hipervariábilis régió N¹terminálisáról legalább egy aminosav és a C¹terminálisáról legalább egy aminosav meg van tartva. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti adenovírus, ahol a módosított adenovírushexon-fehérje egynél több exogén aminosavszekvenciát tartalmaz beinszertálva. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti adenovírus, ahol az exogén aminosavszekvencia hosszúsága 5–45 aminosav-oldallánc, vagy körülbelül 25 aminosav.
1
HU 007 949 T2
7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti adenovírus, ahol az exogén aminosavszekvencia célzószekvenciát tartalmaz. 8. A 7. igénypont szerinti adenovírus, ahol a célzószekvencia celluláris receptor liganduma és ellenanyag vagy fragmense epitópja által alkotott csoportból van kiválasztva. 9. A 8. igénypont szerinti adenovírus, ahol a célzószekvencia bispecifikus ellenanyag, antirost-dudor Fab és antireceptor ellenanyag által alkotott csoportból van kiválasztva. 10. Az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti adenovírus, ahol az immunogenikus aminosavszekvencia a T¹sejt-epitóp, ellenanyag epitóp és HIV-fehérjébõl származó antigén által alkotott csoportból van kiválasztva. 11. A 10. igénypont szerinti adenovírus, ahol a T¹sejt-epitóp semlegesítõ epitóp. 12. A 10. igénypont szerinti adenovírus, ahol az aminosavszekvencia a tat fehérje vagy burokfehérje által alkotott csoportból kiválasztott HIV-fehérjébõl származik. 13. A 12. igénypont szerinti adenovírus, ahol az exogén aminosavszekvencia EQELLELDKWASLW, SEQ ID NO: 12. 14. Eljárás adenovírusvektor specifitásának megváltoztatására, amely eljárás tartalmazza 1. igénypont szerinti adenovírus biztosításának lépését, és az adenovírus módosított adenovírushexon-fehérjéje a hipervariábilis régió deléciójába beinszertált célzó szekvenciát tartalmaz. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol pozitívan töltött aminosavszekvencia van a deléció helyére beinszertálva.
5
10
15
20
25
30
56
2
16. Az 1–13. igénypontok bármelyike szerinti adenovírus alkalmazása gyógyszer elõállítására. 17. Immunogenikus készítmény, amely gyógyászatilag elfogadható hordozót és 1–13. igénypontok bármelyike szerinti készítményt tartalmaz. 18. Önbeindító immunogenikus készítmény, amely tartalmazza a következõket: az 1. igénypont szerinti módosított adenovírushexon-fehérjét tartalmazó kapszidú adenovírus, ahol az exogén aminosavszekvencia egy elsõ immunogén aminosavszekvencia; ahol az adenovírus továbbá egy második immunogenikus aminosavszekvenciát kódoló nukleinsavszekvenciát is tartalmaz. 19. A 18. igénypont szerinti önbeindító immunogenikus készítmény, ahol az elsõ immunogenikus vagy antigenikus aminosavszekvencia és a második immunogenikus vagy antigenikus aminosavszekvencia azonos. 20. A 18. igénypont szerinti önbeindító immunogenikus készítmény, ahol az elsõ immunogenikus vagy antigenikus aminosavszekvencia és a második immunogenikus vagy antigenikus aminosavszekvencia eltérõ, és ugyanazon vírus vagy organizmus elleni immunválaszt indukál. 21. A 18. igénypont szerinti önbeindító immunogenikus készítmény, ahol az elsõ immunogenikus vagy antigenikus aminosavszekvencia nemspecifikus immunválaszt indukál, és a második immunogenikus vagy antigenikus aminosavszekvencia vírus vagy organizmus elleni immunválaszt indukál. 22. A 18–21. igénypontok bármelyike szerinti önbeindító immunogenikus készítmény alkalmazása gyógyszer elõállítására.
HU 007 949 T2 Int. Cl.: A61K 39/12
57
HU 007 949 T2 Int. Cl.: A61K 39/12
58
HU 007 949 T2 Int. Cl.: A61K 39/12
59
HU 007 949 T2 Int. Cl.: A61K 39/12
60
HU 007 949 T2 Int. Cl.: A61K 39/12
61
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
