!HU000005354T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 005 354
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C08B 37/00
(21) Magyar ügyszám: E 03 748126 (22) A bejelentés napja: 2003. 10. 10. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030748126 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1560854 2004. 04. 29. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1560854 B1 2009. 01. 07.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: PD20020271 2002. 10. 18.
(73) Jogosult: FIDIA FARMACEUTICI S.p.A., 35031 Abano Terme (Padova) (IT)
IT
(72) Feltalálók: DE LUCA, Gilda, I-35100 Padova (IT); MARINI BETTOLO, Rinaldo, I-00193 Roma (IT); MIGNECO, Luisa, Maria, I-00136 Roma (IT) (54)
(2006.01) A61K 47/36 (2006.01) C08L 5/08 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04035629 PCT/EP 03/011239
(74) Képviselõ: dr. Kiss Ildikó, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Hialuronsavhoz vagy hialuronsavszármazékokhoz kovalensen kötött taxánok
(57) Kivonat
HU 005 354 T2
A találmány vízoldható, hialuronsavhoz vagy hialuronsavszármazékhoz kovalensen kötött taxánokra és különösen paclitaxelre és docetaxelre vonatkozik, amelyek az onkológia területén, az autoimmun rendellenességek és a resztenózis kezelésében alkalmazható gyógyszerkészítmények elõállítására alkalmazhatók. A talál-
mány tárgyát képezi továbbá a hialuronsavhoz vagy hialuronsavszármazékokhoz kovalensen kötött taxánok elõállítására szolgáló eljárás a hialuronsav és a taxánmolekulák közötti direkt szintézissel vagy indirekt szintézissel, spacercsoport bevezetésével a hialuronsav vagy hialuronsavszármazék és a taxán közé.
A leírás terjedelme 16 oldal (ezen belül 4 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 005 354 T2
A találmány mûszaki területe A jelen találmány hialuronsavhoz vagy hialuronsavszármazékokhoz kovalensen kötött taxánokra, különösen paclitaxelre és docetaxelre, az elõállításukra szolgáló eljárásra és alkalmazásukra vonatkozik az onkológia területén, az autoimmun rendellenességek és a resztenózis kezelésében. A technika állása A taxánok, és különösen a jelenleg Taxol® és Taxotere® márkanéven forgalmazott paclitaxel és docetaxel rákellenes anyagok [Huizing M. T. és munkatársai, Cancer Inv. 13, 381–404 (1995)], amelyek antiproliferatív hatásukat a celluláris sejtvázrendszerben lévõ mikrotubulusok szervezõdésére hatva fejtik ki. Valójában az említett mikrotubulusok depolarizációjának gátlása révén megakadályozzák azok normális dinamikus újraszervezõdését, amely a mitotikus sejtosztódás során megy végbe [Manfredi J. J. és munkatársai, J. Cell Biol. 94, 688–696 (1982)]. A paclitaxelre a fõ terápiás indikációk a következõk: elõrehaladott mellrák terápiája; Kaposi-féle szarkóma terápiája; tüdõkarcinóma (nem mikrocitóma) terápiája; a petefészek szokásos kemoterápiás kezelésre rezisztens karcinómája. Ezenkívül, a fenti kemoterápiát a hólyag, prosztata és méh karcinómájának kezelésére is alkalmazzák. Tekintettel arra, hogy a paclitaxel vízben oldhatatlan, a rák kemoterápiájában jelenleg alkalmazott gyógyszerkészítményekben 1:1 arányú Cremophor® EL (ricinusolaj)–etil-alkohol eleggyel keverik [Pfeifer R. W. és munkatársai, Am. J. Hosp. Pharm. 50, 2520–2521 (1993)]. Ezt a készítményt rendszerint folyamatos intravénás infúzióra (3 és 24 óra közötti idõre) alkalmazzák 135–175 mg/m2 dózisban. A Cremophor® EL jelenléte a fent említett készítményben a fõ oka az ártalmas reakcióknak, amelyek a paclitaxel adagolása során rendszerint fellépnek, és az egyszerû csalánkiütéstõl a légzési zavarokig és hörgõgörcsig terjednek, sõt még anafilaxiás sokk is felléphet [Weiss, R. B. és munkatársai, J. Clin. Oncol. 8, 1263–1268 (1990)]. Fenti okból minden betegen, akit paclitaxel–Cremophor® EL gyógyszerkészítménnyel kívánnak kezelni, elõször el kell végezni egy gyógyszerelést megelõzõ protokollt, dexametazon adagolásával, lehetõleg egy antihisztaminnal együtt. A fenti óvintézkedések ellenére az intravénás paclitaxelinfúzióval kezelt betegek akár 40%-ában még mindig elõfordulhatnak súlyosabb vagy kevésbé súlyos, ártalmas reakciók. Ezért elmondható, hogy a jelenleg klinikailag alkalmazott Taxol® összetétele és az adagolására alkalmazott módszerek határt szabnak a hatékonyságának. Ez az oka annak, amiért a kutatások jelenleg a fenti rákellenes szer olyan új gyógyszerkészítményeinek és/vagy új kémiai összetételeinek szintézisére irányul, amelyek vízoldhatók.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
Például a kutatók megkísérelték a paclitaxelt kapszulázni liposzómákba, nanokapszulákba és mikrogömbökbe, amelyeket biológiailag lebontható kopolimerekbõl, például politejsavból és biológiailag nem lebontható kopolimerekbõl, például etilén-vinil-acetátból kialakított polimer fal alkot. Ezenkívül elõállítottak olyan biológiailag lebontható polimerbõl, például polifoszfoészterbõl kialakított mikrogömböket, amelyek paclitaxellel vannak töltve, így olyan rendszert kaptak, amely a hatóanyag tartós felszabadulását biztosítja a kezelés helyén a tüdõkarcinóma terápiájában [Nuijen, B. és munkatársai, Investigational New Drugs 19, 143–153 (2001)]. Kísérletek folytak továbbá a fent említett rákellenes szer micelláinak elõállítására oly módon, hogy a paclitaxelt szerves oldószerben foszfatidilkolin/epesav-sókkal kicsapták [Nuijen, B. és munkatársai, Investigational New Drugs 19, 143–153 (2001)]. Azonban a paclitaxel kapszulázására kifejlesztett fenti új rendszerek problémásnak bizonyulhatnak a stabilitás, elõállítás és reprodukálhatóság tekintetében. Ezenkívül számos próbálkozás történt annak érdekében, hogy a hatóanyagot ciklodextrinnel oldják, azonban az új készítmények nem hozták a kívánt eredményeket [Nuijen, B. és munkatársai, Investigational New Drugs 19, 143–153 (2001)]. A kémiai kutatások, amelyek a paclitaxel olyan új formuláira irányultak, amelyekben a hatóanyag vízoldhatóbbá válik, miközben hatékonyságát mint rákellenes anyag megtartja, a C2’- és C7¹helyzetben módosított új analógok szintéziséhez (US 2001/0018531 számú szabadalmi bejelentés), valamint új prodrogok elõállításához vezettek. A prodrogok terápiásan inert hatóanyag-származékok, amelyek a szervezetbe való bejutás után aktiválódnak. Ott a spontán hidrolízis és/vagy enzimatikus lebontási folyamatok után szabaddá válik a hatóanyag. Fentiek tükrében, és a fent említett okok miatt számos kísérletet tettek új prodrogok szintézisére, amelyek például olyan hatóanyagok elõállításához vezettek, mint az acetil-paclitaxel [Mellado, W. és munkatársai, Biochem. Biophys. Res. Commun. 124 (2), 329–336 (1984)], vagy a fent említett hatóanyag C2’helyzetû szénatomján borostyánkõsavval, glutársavval és szulfonsavval alkotott új észtereinek szintéziséhez. Ezek az észterek azonban vizes környezetben instabilnak bizonyultak. Ezenkívül elõállítottak C2’- vagy C7¹helyzetben foszfonooxifenilpropionát észtercsoportot tartalmazó néhány származékot, például paclitaxel-2’-karbonátot, és a paclitaxel és C2’-helyzetben glutarilcsoportot tartalmazó származékai új aminosav-észtereinek sorozatát. A glutaril-paclitaxel-aszparagin és glutaril-paclitaxel-glutamin bizonyult a két legvízoldhatóbb terméknek, amelyet a fenti típusú szintézissel kaptak, azonban ezek kevésbé voltak hatékonyak, mint maga a paclitaxel [Nuijen, B. és munkatársai, Investigational New Drugs 19, 143–153 (2001)]. Ismert az is, hogy a paclitaxel poli-L-glutaminsavval észterezve a fent említett kemoterápiás anyag olyan új
1
HU 005 354 T2
vízoldható származékát kapták, amelynek jelentõsen nagyobb a felezési ideje plazmában, mint a nem konjugált paclitaxelé [Li C. és munkatársai, Cancer Research 58 (11), 2404–2409 (1998)]. A paclitaxelt PEG-gel [poli(etilén-glikol)-lal] is derivatizálták a kemoterápiás hatóanyag C2’-helyzetében történõ észterezéssel; az új molekula erõsen vízoldhatónak bizonyult, azonban nem volt túl stabil. Végül, egy új szállítórendszert fejlesztettek ki újabban a hatóanyag számára, oly módon, hogy a paclitaxelt humán szérumalbuminnal (HSA) konjugálták. A paclitaxel-HSA konjugátum nagyon vízoldhatónak bizonyult, és a kemoterápiás hatóanyag akár 30 molekuláját is hordozhatta. Azonban az in vitro végzett kísérletek azt mutatták, hogy kevésbé hatékony rák ellen, mint maga a paclitaxel [Nuijen, B. és munkatársai, Investigational New Drugs 19, 143–153 (2001)]. Újabban a kutatók egy új szállítórendszert szintetizáltak a paclitaxel számára elõzetesen módosított hialuronsavval (továbbiakban rövidítve HA) – azaz a HA karboxilcsoportjához amidkötéssel kötött hidrazidmolekulákat tartalmazó HA¹val – történõ észterezéssel [Luo Y. és munkatársai, Biomacromolecules 1 (2), 208–218 (2000); US 5874417 számú szabadalmi irat]. Ez az új szállítórendszer a paclitaxel számára lehetõvé teszi, hogy a hatóanyag közvetlenül a célzott ráksejt membránfelületéhez jusson, amelyre a HA receptor, a CD44 túlexpresszálása jellemzõ. Ennek következtében a hidraziddal funkcionalizált HA¹hoz kötött paclitaxel képes specifikusan a ráksejt CD44 receptorához kötõdni, és így képes (az endocitózis folyamatának köszönhetõen) a sejtcitoplazmába bejutni, ahol enzimatikusan felszabadulhat és aktiválódhat, beindítván a tubulin depolarizációjának és ezáltal a sejtosztódásnak gátlását. A hatóanyag szelektív transzportjának ezt a mechanizmusát „sejt-targeting”-nek nevezik. Ezenkívül ismert, hogy a HA rákellenes hatóanyagok számára hordozóként alkalmazható gyógyszerkészítményekben, ahol a HA a kemoterápiás hatóanyagokkal, például paclitaxellel asszociált (és nem kovalensen kötött), hogy azok terápiás hatékonyságát fokozza a fent említett „targeting” jelenségnek köszönhetõen (WO 00/41730 számon publikált nemzetközi szabadalmi bejelentés), és hogy lehetõvé tegye a normális kemoterápiás protokollokban szokásosan alkalmazott dózisok csökkentését (WO 99/02151 számon publikált nemzetközi szabadalmi bejelentés). Végül ismert a kis moltömegû HA és/vagy annak lipidszármazékai alkalmazása hatóanyagok szállítására alkalmazott liposzómák elõállítására, beleértve a rákellenes szereket, például a paclitaxelt (WO 01/39815 számon publikált nemzetközi szabadalmi bejelentés). A fentiek ismeretében még mindig szükség van új taxánszármazékokra, amelyek stabilak és vízoldhatóak, és terápiásan legalább olyan mértékben hatékonyak, mint a nem módosított taxánok. A találmány összefoglalása Azt találtuk, hogy ha a taxánokat kovalensen kötjük HA¹hoz vagy HA¹származékokhoz, adott esetben egy
5
10
15
20
25
30
35
2
távolságtartó csoport (spacer) segítségével, stabil, és vízoldható termékeket kapunk, amelyek tumorok, autoimmun rendellenességek és resztenózis kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények elõállítására alkalmazhatók. A találmány tárgya ennek megfelelõen HA¹hoz vagy egy HA¹származékhoz kovalensen kötött taxán, ahol a kovalens kötés a taxán hidroxilcsoportjai és a HA vagy HA¹származék karboxilcsoportjai között van kialakítva egy, a taxánt a HA¹hoz vagy HA¹származékhoz kapcsoló spacer segítségével, ahol a hialuronsav karboxilcsoportja és a spacer közötti kovalens kötés észterkötés. A jelen találmány továbbá eljárásokra vonatkozik a fenti, HA¹hoz vagy HA¹származékokhoz kovalensen kötött taxánok elõállítására. A találmány további tárgya gyógyszerkészítmény, amely hatóanyagként legalább egy fenti, HA¹hoz vagy HA¹származékokhoz kovalensen kötött taxánt tartalmaz, valamint ennek alkalmazása tumorok, autoimmun rendellenességek és resztenózis kezelésében. A találmány szerinti, HA¹hoz vagy HA¹származékokhoz kovalensen kötött taxánok számos elõnnyel bírnak, amelyeket az alábbiakban foglalhatunk össze: 1) ezek azonnal oldódnak a véráramban; 2) ezeket nem kell Cremophor® EI¹vel összekeverni a készítmények elõállításához, ezáltal a túlérzékenységre és anafilaxiára vonatkozó fent említett problémákat kiküszöböljük; 3) a plazmában szokásosan jelen lévõ enzimek, például észterázok enzimatikus hatásának köszönhetõen a taxánokat HA vagy HA¹származék hordozóik azonnal szabadon engedik a találmány szerinti készítményekbõl a vérbe, ezáltal szabadon kifejthetik rákellenes aktivitásukat; 4) lehetõvé teszik egy új gyógyszer elõállítását, amely bizonyos ráktípusok esetében meglepõ kemoterápiás aktivitást mutathatnak, ami szignifikánsan nagyobb, mint a nem konjugált taxán adagolásával elért, ha ugyanazon hatóanyagdózisokat tekintjük.
40
45
50
55
60 3
Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra mutatja a daganatsejtek 1. példában leírtak szerinti implantálása után a túlélési százalékot a kontrollokra (fekete hisztogram), a paclitaxellel kezelt egerekre (szürke hisztogram) és HA¹észterhez kovalensen kötött paclitaxel esetén 16% észterezéssel (fehér hisztogram), amelyet a 7. példa szerint állítottunk elõ. A 2. ábra mutatja a 2. példa szerinti kísérletekbõl származó, és IC50-ként kifejezett farmakológiai erõt a HA¹észter-származékokhoz kovalensen kötött paclitaxelre 16% észterezéssel (szürke hisztogram), 22% észterezéssel (fekete hisztogram) és 6,8% észterezéssel (fehér hisztogram) négy mellráksejtvonal esetén, a paclitaxel referenciavegyülettel szemben. A 3. ábra mutatja a 3. példában ismertetett daganatsejt-implantáció utáni százalékos túl-
1
HU 005 354 T2
élést a kontrollegerekben (szaggatott vonal) és az ACP® géllel kezelt egerekben (folyamatos vonal). A 4. ábra mutatja a 7. példa szerint elõállított, HA¹észterhez kovalensen kötött paclitaxel humán plazmában felszabadult százalékos mennyiségét a 13. példában ismertetett tesztben, az idõ függvényében. A találmány részletes ismertetése A jelen találmányban taxáncsaládba tartozó vegyületeket, elõnyösen az alábbiakban (I) képlettel jelölt paclitaxelt és (II) képlettel jelölt docetaxelt ismertetjük, amelyek HA¹hoz vagy HA¹származékokhoz kovalensen vannak kötve a taxánkomponens és a HA vagy HA¹származék között egy spacercsoport segítségével, köztes csoportként, amely kovalensen kötõdik mind a két molekulához.
5
10
15
20
25
30
(I) 35
40
45
(II) A HA egy, a D¹glükuronsav és N¹acetil-D-glükózamin váltakozó egységeibõl álló heteropoliszacharid, amely a következõ ismétlõdõ egységet tartalmazza:
50
55
60 4
2
A HA egy egyenes láncú polimer, amelynek molekulatömege 50 000 és 13×106 Da között változhat, forrásától és az elõállítására alkalmazott eljárástól függõen. A természetben ez a pericelluláris gélekben, a gerincesek kötõszövetének alapvetõ anyagában (amelyben ez a fõ komponensek egyike), az ízületek szinoviális folyadékában, a csarnokvízben és a köldökzsinórban van jelen. A HA fontos szerepet játszik az élõ szervezetben, számos szövet, például a bõr, az inak, az izmok és a porc sejtjeinek mechanikai támasztékaként. Ez az extracelluláris mátrix fõ komponense, azonban egyéb funkciói is vannak, például a szövetek hidratálása, kenés és a sejtek vándorlása és differenciálódása. A találmány szerint alkalmazott HA bármely forrásból kivonható, például kakastaréjból, vagy fermentációs úton vagy technológiai eszközökkel állítható elõ, és molekulatömege 400 és 3×106 Da, különösen 400 és 1×106 Da, és elõnyösen 400 és 230 000 Da közötti lehet. A találmány szerinti HA¹származékokat elõnyösen a következõ HA¹származékok csoportjából választjuk: – szerves és/vagy szervetlen bázisokkal sóvá alakított HA; – Hyaff®: alifás, aralifás, cikloalifás, aromás, ciklusos és heterociklusos alkoholokkal alkotott HA¹észterek, amelyek észterezési foka az alkalmazott alkohol típusától és hosszúságától függõen változhat, és mindenesetre soha nem nagyobb 50% észterezésnél, elõnyösen 0,1 és 20% közötti, mivel az így kapott végsõ polimernek mindig vízoldhatónak kell lennie, miközben a nem észterezett HA fennmaradt százaléka szerves és/vagy szervetlen bázisokkal sóvá alakítható, az US 4851521 számú szabadalmi iratban leírtak szerint, amelynek tartalma referenciaként leírásunk részét képezi; – Hyadd™: a HA alifás, aralifás, cikloalifás, aromás, ciklusos és heterociklusos aminokkal alkotott amidjai, ahol az amidálás százalékos értéke 0,1 és 10% közötti, mivel a végsõ polimernek mindig vízoldhatónak kell lennie, míg a HA fennmaradó százaléka, amely nincs amidálva, szerves és/vagy szervetlen bázisokkal sóvá alakítható, az EP 1095064 számú szabadalmi bejelentésben leírtak szerint, amelynek tartalma referenciaként leírásunk részét képezi; – O¹szulfatált HA¹származékok, a szulfatálás 4. fokozatáig, amelyeket az US 6027741 számú szabadalmi leírásban ismertetnek, amelynek tartalma referenciaként leírásunk részét képezi; – ACP®: a HA belsõ észterei, legfeljebb 15% észterezési százalékkal, mivel a polimernek mindig vízoldhatónak kell lennie, elõnyösen 0,05 és 10% közötti észterezéssel, míg a nem észterezett HA fennmaradó százaléka szerves és/vagy szervetlen bázisokkal sóvá alakítható, ezeket az EP 0341745 B1 számú szabadalmi iratban ismertetik, amelynek tartalma referenciaként leírásunk részét képezi;
1
HU 005 354 T2
– dezacetilezett HA: ezek az N¹acetil-glükózamin egység dezacetilezésébõl származnak, a dezacetilezés százaléka elõnyösen 0,1 és 30% közötti, míg a HA összes karboxilcsoportja szerves és/vagy szervetlen bázisokkal sóvá alakítható, a következõ (A) szerkezeten bemutatott módon:
5
10
(A) A HA dezacetilezett származékait a WO 02/18450 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetik, amelynek tartalma referenciaként leírásunk részét képezi; – Hyoxx™: perkarboxilezett HA¹származékok, amelyek az N¹acetil-glükózamin egység primer hidroxilcsoportjának oxidálásával kaphatók, a perkarboxilezés foka 1 és 100% közötti, elõnyösen 25 és 75% közötti. A HA összes karboxilcsoportja sóvá alakítható szerves és/vagy szervetlen bázisokkal a következõ (B) szerkezeten bemutatott módon:
15
20
25
30
35
(B) 40 A perkarboxilezett HA¹származékokat az US 2003281689 számú szabadalmi bejelentésben ismertetik. Ezenkívül a jelen vegyületeket, amelyekben a taxán, és különösen a paclitaxel kovalensen van kötve egy HA¹észterhez, elõállíthatjuk kémiailag nem módosított HA¹molekulákból kiindulva, és csak a kemoterápiás hatóanyaggal való szintézis után módosítjuk a HA¹t észterezéssel a Hyaff® termékekre fentiekben felsorolt alkoholokkal, vagy alakítjuk ki a belsõ észtereket, mint az ACP® esetében (lásd 8. példát). A fent említett HA¹származékok, amelyek különösen fontosak a HA¹taxán prodrog, és különösen a HA¹paclitaxel prodrog szintézisének folyamatában, a dezacetilezett és szulfatált származékok, mivel az elõzetesen nem módosított hialuronsavhoz kötött paclitaxel azonos százalékos mennyiségei mellett ezek a végterméket a véráramban oldhatóbbá teszik. Ismeretes, hogy a CD44 membrán receptor segítségével a HA sok különbözõ folyamatot módosít a sejt
45
50
55
60 5
2
fiziológiája és biológiája vonatkozásában, például a rákos sejtek és egyéb sejtek proliferációját, differenciálódását és helyzetváltoztatását. A szakirodalomban újabban bizonyították a HA hatékonyságát rák ellen, amikor a HA¹t mint olyant közvetlenül injektálták a kifejlõdött rákba. Bizonyították, hogy ez a tumorok 30%-ában képes megállítani a teljes regressziót [Herrera-Gayol, A. és munkatársai, Experimental and Molecular Pathology 72, 179–185 (2002)]. Ismeretes az is, hogy a HA bármely kemoterápiás hatóanyaggal társítható különféle gyógyszerkészítmények elõállítására, mivel második antineoplasztikus anyagként képes hatni, amely szinergetikusan növeli a vele társított hatóanyag rákellenes hatását (WO 01/47561 számon publikált nemzetközi szabadalmi bejelentés); alternatív módon a HA¹t rákellenes szerként önmagában beadva különféle klinikai protokollok esetén a rák növekedésének csökkentésére/regressziójára igénylik (WO 97/40841 számon publikált nemzetközi szabadalmi bejelentés). A fent említett, HA¹hoz vagy HA¹származékokhoz kovalensen kötött taxán az összes taxán formuláktól különbözik, közelebbrõl a paclitaxel kovalens kötõdése HA¹val vagy HA¹származékokkal, adott esetben egy spacer (távolságtartó) csoport segítségével, a paclitaxelt vízoldhatóvá teszi anélkül, hogy farmakológiai hatékonysága csökkenne. Ténylegesen az 1. példában leírt in vivo kísérlet világosan bizonyítja a találmány szerinti konjugált paclitaxel és a nem konjugált paclitaxel azonos rákellenes hatékonyságát azonos dózisokban adagolva. Ezenkívül, a HA¹paclitaxel meglepõ farmakológiai tulajdonságokat mutathat, amelyek eltérnek a nem konjugált paclitaxelétõl, különösen bizonyos típusú daganatok esetében. Ténylegesen a 2. példa világosan bizonyítja, hogy a találmány szerinti, paclitaxelhez kötött HA észterszármazék új antineoplasztikus farmakológiai aktivitást mutat: a citotoxicitás alábbiakban leírt in vitro modelljeiben a jelen HA¹paclitaxel meglepõ rákellenes aktivitást mutat, amely messze meghaladja maga a nem konjugált paclitaxel által kifejtett aktivitást. Ez az új antineoplasztikus tulajdonság azt jelenti, hogy a találmány szerinti taxánok, és különösen a HA¹val vagy HA¹származékokkal konjugált paclitaxel kemoterápiás hatóanyagként gyógyszerkészítmények elõállítására alkalmazható, nemcsak a tumor összes formájának kezelésére, amelyre a Taxol®¹t adják, hanem a tumor egyéb formáira is, amelyeket rendszerint nem kezelnek Taxol®-lal, mint például a gyomorrák és májrák, a vastagbélrák, a melanóma és a leukémia. Ezenkívül alkalmazható szisztémás autoimmun rendellenességek, például reumatoid artritisz, szisztémás lupus erythematosus, autoimmun glomerulonefritisz és végül Hashimoto-féle tiroiditisz esetén is. A találmány szerinti termékek alkalmazása a fent említett patológiák új gyógyszeres terápiájában azért lehetséges, mivel az új HA¹paclitaxel vegyület csökkenti a Taxol® szisztémás toxicitását, ezáltal növekedik
1
HU 005 354 T2
magának a hatóanyagnak a terápiás hatékonysága, mivel az: – vízoldékony; – nem társul Cremophor® EL¹lel, és ezért mentes a fenti által kiváltott toxikus hatásoktól; – ugyanolyan hatékony a klinikai protokollokban szokásosan alkalmazott dózisoknál kifejezetten alacsonyabb (vagy azokkal azonos) dózisokban. Ismert továbbá a paclitaxel mint hatóanyag alkalmazása a resztenózis folyamatának gátlására, amely általában érplasztikák (elsõdlegesen arteriális), szívkoszorúér bypass mûtétek és szervtranszplantációk után lép fel. A jelen taxánok, és különösen a HA¹hoz vagy HA¹származékokhoz kovalensen kötött paclitaxel a resztenózis megelõzésére is alkalmazható, vagy alkalmazható a fent említett érmûtéteket követõen implantált sztentek és eszközök belsõ bevonására, mivel bizonyított, hogy képes kémiailag kötõdni az említett sztentek felületéhez vagy könnyen tud azokon adszorbeálódni. Akármelyik esetben a jelen termékek tartózkodási ideje a sztent felületén, és ennek következtében fokozatos felszabadulásuk a véráramba nagyobb, mint a nem konjugált paclitaxelé, mivel a HA kémiai-fizikai jellemzõi kedveznek a Taxol® progresszív, lassú, de folyamatos felszabadulásának az eszköz felületérõl. A találmány szerinti, HA¹hoz vagy HA¹származékokhoz kovalensen kötött taxánokat tartalmazó gyógyszerkészítmények beadhatók szisztémásan (intravénás vagy arteriális, intramuszkuláris, intraperitoneális, szubkután vagy orális módon), alkalmazhatók helyi adagolásra (transzdermális abszorpcióval) vagy beadhatók közvetlenül a rákos helyre injekció segítségével. A paclitaxelhez kovalensen kötött HA vagy annak származéka maga is mûködhet rákellenes anyagként. A 3. példában alább bemutatjuk, hogyan állítja meg csupasz egerekben a kísérletesen indukált tumornövekedést egy kovalensen kötött HA¹származékkal, az ACP®-vel végzett kezelés, amely a tumor szignifikáns regresszióját eredményezi a nem kezelt kontrollokhoz viszonyítva. Tehát elõször mi írtuk le a találmány szerinti taxán¹HA vagy taxán-HA-származék termékek részét képezõ HA és annak származékai új szerepét antineoplasztikus anyagként, és ezzel kapcsolatos alkalmazásukat az onkológia területén. A HA¹hoz vagy HA¹származékokhoz kovalensen kötött találmány szerinti taxánok ezenkívül különféle biológiailag és farmakológiailag hatásos molekulákkal kombinálhatók, például szteroidokkal, hormonokkal, proteinekkel, trófiás faktorokkal, vitaminokkal, nem szteroid gyulladásgátló hatóanyagokkal, kemoterápiás
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
hatóanyagokkal, kalciumantagonistákkal, antibiotikumokkal, antivirális anyagokkal, interleukinekkel és citokinekkel, például interferonnal. Ily módon a fent említett gyógyszerek számos különbözõ kombinációi és a megfelelõ különbözõ gyógyszerkészítmények kaphatók, amelyek találmány szerinti taxánokat tartalmaznak. A jelen találmány tárgyát képezi továbbá eljárás a találmány szerinti, HA¹hoz vagy HA¹származékokhoz kovalensen kötött taxánok, különösen paclitaxel elõállítására; a jelen termékeket elõállíthatjuk indirekt szintézissel, amelynek során a taxán és a HA vagy a HA¹származék közé egy távolságtartó csoportot (spacer) vezetünk be. A HA vagy HA¹származékok funkciós csoportjai, amelyek a taxánnal közvetve, egy spacer segítségével reagálhatnak a karboxilcsoportok. A spacert például egyenes vagy elágazó alifás vagy aralifás láncok közül választhatjuk, amelyek hidroxil¹, karboxil- vagy karbonilcsoportok, epoxidok, savkloridok, merkaptánok, nitrilek, halogének, anhidridek, izocianátok és izotiocianátok és aminocsoportok közül választott egy vagy több csoporttal vannak szubsztituálva. A lehetséges spacerek közül a 2–18 szénatomot tartalmazó, és különösen a 3–10 szénatomot tartalmazó karbonsavak bromidjai elõnyösek, még elõnyösebb a 3¹brómpropionsav és 4¹brómvajsav. Az indirekt szintézis a kovalens észterkötés következõ típusainak kialakulását eredményezi a spacer és a HA vagy HA¹származékok között, ahol a megfelelõen megválasztott spacer, például 4¹brómvajsav karboxilcsoportja egy aktiválószerrel, például karbodiimiddel van aktiválva, és ezáltal alkalmassá téve a taxán, például a paclitaxel hidroxilcsoportjával (elõnyösen a C2’ szénatomon lévõvel) történõ reakcióhoz. Ezt követõen egy vízmentes oldószerben a HA vagy HA¹származék kvaterner ammóniumsójával, különösen tetrabutil-ammónium (TBA)-sójával közvetlenül érintkeztetve nukleofil szubsztitúció megy végbe a HA vagy HA¹származék karboxilcsoportján a spacer brómatomjához. Ily módon észterkötés alakul ki a HA vagy HA¹származék és a spacer között, ami viszont a paclitaxelhez van kötve. Alternatív módon a HA vagy HA¹származék karboxilcsoportjának nukleofil szubsztitúciója a spacer brómatomjához megelõzheti maga a spacer és a taxán közötti kötés kialakítását (lásd az 1. reakcióvázlatot). – A HA vagy HA¹származék karboxilcsoportjának aktiválószerei, például karbodiimid alkalmazásával észterkötés alakítható ki az említett csoport és a megfelelõen megválasztott spacer hidroxil funkciója között, a paclitaxelhez való kötést megelõzõen vagy azután (lásd 2. reakcióvázlatot).
1. és 2. reakcióvázlat
6
2
1
HU 005 354 T2
Hasonló módon a spacer és egy taxán, például paclitaxel közötti kötés lehet észter, például a 3. reakcióvázlaton alább bemutatott, uretán vagy tiouretán,
2
acetál vagy ketál típusú, és egy aktiválószer jelenlétére lehet szükség, különösen az észter- és uretánkötések kialakításához.
3. reakcióvázlat
A spacer a taxánhoz, például paclitaxelhez köthetõ a HA vagy HA¹származékok funkciós csoportjaival való kapcsolódás kialakítása elõtt vagy azután, a megfelelõen megválasztott spacer funkciós csoportjainak típusától függõen. A taxán, például paclitaxel HA¹val vagy HA¹származékkal való közvetlen vagy közvetett kapcsolódásának százaléka 0,1% és 100% között, elõnyösen 0,1% és 35% között változhat. A találmányt közelebbrõl, a korlátozás szándéka nélkül, a következõ példákkal szemléltetjük. 1. példa A HA paclitaxellel alkotott új észterszármazékának hatása csupasz egéren, neoplasztikus sejtek implantálása után Ebben a kísérletben humán petefészek-adenokarcinómasejteket, OVCAR¹3 sejteket használtunk thymushiányos CD¹1 fajhoz tartozó, lecsökkentett immunitású csupasz egerekben. Minden egyes egérbe intraperitoneálisan 5×106 ráksejtet oltottunk. Kísérleti terv: Vizsgált hatóanyagok: Taxol®, 5 állatot kezeltünk HYTAD1p20: HA paclitaxelhez kovalensen kötött észterszármazéka, a karboxilcsoport észterezettsége 16 tömeg%. A fenti új hatóanyag szintézisére alkalmazott HA moltömege 200 000 Da (az elõállítás részleteit lásd a 7. példában). A fenti hatóanyagot is öt állaton teszteltük. Kezelt állatok: 10 állatba elõször OVCAR¹3 sejteket oltottunk. Ötöt használtunk fel a Taxol®-lal végzett kísérlethez és a másik ötöt a HYTAD1p20-szal végzett kísérlethez: mind a 10 állat ezután intraperitoneális injekcióval 3 dózis farmakológiai kezelést kapott (a ráksejtek in-
25 okulálása utáni 6., 13. és 20. napon), 20 mg/testtömeg¹kg Taxol® vagy 125 mg/testtömeg¹kg HYTAD dózisban (20 mg/egér paclitaxeldózisnak felel meg). Kontrollállatok: 5 állatot elõször az OVCAR¹3 sejtek rákot kiváltó szuszpenziójával oltottunk be, ami után 30 ezek nem kaptak semmiféle kezelést. A túlélési görbe meghatározása A túlélési görbét a beavatkozás idõpontjától a ráksejtek intraperitoneális inokulálása utáni 92. napig számítottuk ki. 35 Eredmények: az eredményeket az 1. ábrán mutatjuk be. Három kontrollállatban adenokarcinóma fejlõdött ki a petefészekben, és a ráksejtek beoltása utáni 70. és 75. nap között pusztultak el. 40 A beavatkozás utáni 92. napon, a kísérlet utolsó napján, egyetlen állat sem pusztult el azok közül, amelyek paclitaxellel vagy HYTAD-dal farmakológiai kezelést kaptak. 45
2. példa In vitro kísérlet Az in vitro kísérlet célja fõleg az volt, hogy meghatározzuk a HA paclitaxelhez kötött új észterszármazékainak aktivitási profilját, és megbecsüljük/összeha50 sonlítsuk a HYTAD-származékok antineoplasztikus aktivitását a paclitaxelével, ezáltal meghatározzuk a farmakológiai potenciált az antineoplasztikus hatóanyaghoz viszonyítva. Kísérleti terv: 55 Vizsgált termékek: Taxol®: referenciatermék HYTAD1p20 – HYTAD2p20 – HYTAD2p10: a HA paclitaxelhez kovalensen kötött észterszármazékai, a karboxilcsoport észterezése 16 tömeg% (a 60 HYTAD1p20 esetében, a fenti új hatóanyag szintézisé7
1
HU 005 354 T2
hez alkalmazott HA molekulatömege 200 000 Da) (az elõállítás részleteit lásd a 7. példában), vagy 22 tömeg% (a HYTAD2p20 esetében, az alkalmazott HA molekulatömege 39 000 Da), vagy 6,8 tömeg% (a HYTAD2p10 esetében, az alkalmazott HA molekulatömege 39 000 Da). Sejtvonalak Humán eredetû sejtvonalak Humán mellrákból eredõ négy sejtvonalat alkalmaztunk. Mind a négy vizsgált sejtvonal normálisan érzékeny paclitaxelre, és láthatólag azonos erõsséggel expresszálja a CD44 receptort. MCF-7 MDA-MB-231 MDA-MB-468 SKBR-3 Kísérleti protokoll: A vizsgált sejtvonalat 3000 sejt/rezervoár koncentrációban oltottuk le egy lapos fenekû, 96 rezervoáros lemezre; 24 óra elteltével a sejtekhez hozzáadtuk a tenyésztõközeggel megfelelõen hígított vizsgálati oldatokat;
2
újabb 72 óra elteltével a sejteket kolorimetriásan vizsgáltuk 3¹(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólium-bromiddal (MTT); a sejt életképességének vizsgálata révén ez a teszt a sejtek vizsgált hatóanyaggal szem5 beni eltérõ érzékenységét is mutatja. A vizsgálat alapja az, hogy a mitokondriális dehidrogenáz a tetrazólium-sókat (sárga) kék formazánkristályokká képes redukálni. Az erõsebb vagy gyengébb színintenzitást spektrofotometriával határoztuk meg [Dezinot, F. és munkatársai, J. 10 Immunol. Methods 22 (89); 271–277 (1986)]. Eredmények Az alábbiakban táblázatosan és grafikus formában a 2. ábrán megadjuk a kapott eredményeket IC50-értékként (a sejtszaporodás 50%¹os gátlásához szüksé15 ges hatóanyag-koncentráció) az egyes vizsgált termékekre és különféle sejtvonalakra. A 2. ábrán az abszcisszatengely a IC50-ként kifejezett és a moláris koncentrációk közötti arányként kiszámított farmakológiai erõt jelenti a referenciatermékkel 20 (paclitaxel) szemben, amelynek értékét konvencionálisan nullának vesszük. Ennek következtében a vonalak a referenciatermékénél nagyobb farmakológiai erõt mutatják.
IC50 (a paclitaxel vagy annak HYTAD-származékai nmol/l vagy mmol/l koncentrációjaként kifejezve a tenyésztõközegben) Taxol®
HYTAD2p20
HYTAD1p20
HYTAD2p10
MCF/7
3,5 nmol/l
0,86 nmol/l
0,024 nmol/l
0,68 nmol/l
MDA/MB/231
0,35 nmol/l
2,58 nmol/l
–
0,24 mmol/l
MDA/MB/468
9,4 nmol/l
–
0,18 nmol/l
–
SKBR/3
0,23 nmol/l
–
–
0,14 nmol/l
Sejtvonalak
Mellráksejtvonalak
Következtetések Amint az a szakirodalomból ismert, az összes alkalmazott sejtvonal érzékeny a mell és a petefészek metasztázisos karcinómájának kezelésére szokásosan alkalmazott hatóanyagra, a taxolra. Ami a mellráksejtvonalakat illeti, a különféle HYTAD termékek lényegesen erõsebbnek bizonyultak, mint a paclitaxel, a HYTAD1p20 MCF¹7 ráksejtvonalon +150-szeres hatást mutatott.
40
3. példa ACP® gél hatása csupasz egéren neoplasztikus sejtek implantálása után. Ebben a kísérletben thymushiányos Nude¹nu (nu/nu) fajtához tartozó, lecsökkentett immunitású csupasz egerekben humán vastagbél-karcinóma HT29 sejteket alkalmaztunk. Az egyes állatokat elaltattuk, és 0,3 ml HT29 sejtszuszpenziót injektáltunk a hasüregükbe 166 000 sejt/ml koncentrációban. Így minden egyes egér 50 000 rákos sejtet kapott.
50
45
55
60 8
Kísérleti terv: Kezelt állatok: 113 állatot elõször beoltottunk HT29cel, és közvetlenül ezután 0,2 ml ACP gél egyetlen dózisával kaptak kezelést, 40 mg/ml dózisban; Kontrollállatok: 117 állatot beoltottunk HT29 ráksejtszuszpenzióval, azonban nem kaptak kezelést. Túlélési görbe: a túlélési görbét az inokulálás napjától a pusztulás napjáig számítottuk. A pusztulásokat vagy tényként megállapítottuk, vagy mi idéztük elõ azáltal, hogy azokat az állatokat, amelyek kiindulási tömege több mint 20%-kal csökkent, feláldoztuk, és diffúz metasztázisokat mutató hemoperitoneum esetén ezeket elpusztultnak tekintettük. A két csoportban naponta meghatároztuk a túlélési százalékot, és grafikusan kifejezve kaptuk a 3. ábrán bemutatott görbét. A kísérlet 120 napon át tartott, amely után az összes túlélõ állatot leöltük, és nekroszkóposan megvizsgáltuk, hogy a hasi tumorok jelenlétét ellenõrizzük. Eredmények: a 230 állat közül 32 állatban nem fejlõdött ki észrevehetõ neoplázia. Ezek közül az állatok
1
HU 005 354 T2
közül 22 az ACP® géllel kezelt csoportba tartozott, 10 a kontrollcsoportba. ACP® gél: a kezelt állatok 19,5%-ában nem fejlõdött ki neoplázia; Kontroll: a kontrollállatok 8,5%-ában nem fejlõdött ki neoplázia. 4. példa 5000 és 10 000 Da közötti molekulatömegû HA elõállítása (az alacsony móltömegû HA¹t tartalmazó HA¹paclitaxel lehetséges szintéziséhez) 2,40 g nátrium-HA¹t, amelynek móltömege 990 000 Da, 240 ml 0,15 mol/l NaCl-oldatban oldunk. Azután hozzáadunk 7,9 ml 15%¹os NaOCl-oldatot. Állandó +4 °C hõmérsékleten az oldatot 120 percen keresztül szonikáljuk 20 Hz frekvenciánál, 150 W¹on. A reakció befejezõdése után a pH¹t 0,1 N HCl-lel 6,5¹re állítjuk, majd az oldatot 1000 ml 2:1 arányú metanol/aceton eleggyel kicsapjuk. A terméket szûréssel összegyûjtjük, és vákuumban 45 °C¹on 48 órán keresztül szárítjuk. Ily módon 1,65 g nátriumsót kapunk. Nagy nyomású folyadékkromatográfiás (HPLC)-GPC analízissel kimutattuk, hogy a kapott HA frakció átlagos móltömege 5850, szám szerinti átlagos móltömege (MN) 3640 és polidiszperzitási indexe 1,61. 5. példa HA paclitaxelhez kötött észterszármazékának elõállítása a karboxilcsoportok körülbelül 4 tömeg%-ának észterezésével 51 mg paclitaxelt CH2Cl2-ben oldunk, és az oldathoz 104 mg 1¹(3¹dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimidet (EDC) és 20 mg 4¹brómvajsavat adunk. Ezután az oldatot vízzel megosztjuk. A karbodiimid- és bromidmaradékok eltávolítása után a reakció oldószerét vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, és rotációs bepárlóval eltávolítjuk. Az így kapott 21 mg terméket N¹metilpirrolidonban (NMP) oldjuk, és tetrabutil-ammónium (TBA) sóvá alakított HA 20 mg/ml koncentrációjú, NMP-vel készült oldatához adjuk (200 mg 10 ml NMPben). Szobahõmérsékleten 7 napos reagáltatás után az oldatot 5 ml vízzel és 1 ml telített NaCl-oldattal hígítjuk. Az így kapott oldatot 1 órán keresztül keverjük, hogy lehetõvé tegyük a TBA-ion kicserélõdését nátriumra. Ezután lassan, cseppenként etanolt adunk hozzá, és az így kapott szálas terméket vízben oldjuk, dializáljuk, végül fagyasztva szárítjuk. 6. példa HA paclitaxellel alkotott észterszármazékának elõállítása a karboxilcsoportok mintegy 10 tömeg%-ának észterezésével Az 5. példához hasonlóan 308,7 mg paclitaxelt 15 ml diklór-metánban oldunk, hozzáadunk 117,2 mg 4¹brómvajsavat és 614,1 mg EDC¹t. Ezután az oldathoz vizet adunk, hogy az összes bromidot és karbodiimidet elimináljuk. Az így kapott szerves oldathoz nátrium-szulfátot adunk, amellyel dehidratáljuk, miközben az oldószert rotációs bepárlóval eltávolítjuk. Végül 363 mg köztiterméket kapunk.
5
2
175 mg így kapott köztiterméket adunk vízmentes NMP-ben oldott 1 g HA¹TBA-hoz. Az oldatot szobahõmérsékleten 7 napon keresztül keverjük, majd 20 ml vizet és 4 ml telített NaCl-oldatot adunk hozzá. Az elegyet 1 órán keresztül keverve a TBA-iont nátriumra cseréljük. Ezután lassan, cseppenként etanolt adunk hozzá, és a kapott szálas terméket vízben oldjuk, dializáljuk, végül fagyasztva szárítjuk.
7. példa HA paclitaxellel alkotott észterszármazékának elõállítása a karboxilcsoportok mintegy 16 tömeg%-ának észterezésével Az elõzõ 5. és 6. példákban leírtak szerint elõállított 15 köztitermékbõl 164 mg¹ot adunk 680 mg HA¹TBA 25 ml vízmentes NMP-vel készült oldatához. A reakciót szobahõmérsékleten 7 napon keresztül lejátszatjuk, majd az oldathoz 20 ml vizet és 4 ml telített NaCl-oldatot adunk. 1 óra elteltével lassan, cseppenként etanolt 20 adunk hozzá. A kapott terméket szûréssel összegyûjtjük, és vízben oldjuk, dializáljuk, és amikor a dialízisoldat vezetõképessége 10 mS alá csökkent, lefagyasztjuk. A fagyasztott oldatot ezután fagyasztva szárítjuk. 10
8. példa (referenciapélda) HA paclitaxellel alkotott észterszármazékának elõállítása a hidroxilcsoportok mintegy 10 tömeg%ának észterezésével 102,6 mg paclitaxelt 5 ml diklór-metánban oldunk, 30 és az oldathoz 20,4 mg borostyánkõsav-anhidridet adunk. 3 óra elteltével az oldószert rotációs bepárló alkalmazásával elpárologtatjuk. A kapott terméket 5 ml alacsony víztartalmú dimetil-szulfoxidban (DMSO) oldjuk, és 27,3 mg diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá. 35 Körülbelül 5 perc múlva az oldathoz HA¹TBA-oldatot adunk, amelyet úgy állítunk elõ, hogy 327 mg polimert 15 ml alacsony víztartalmú DMSO-ban oldunk. Az oldatot szobahõmérsékleten körülbelül 24 órán keresztül keverjük. Ezután néhány ml vizet és 3 ml telített NaCl40 oldatot adunk az oldathoz. 1 óra elteltével etanollal kicsapjuk. A szálas terméket szûréssel összegyûjtjük, vízben oldjuk, dializáljuk, végül fagyasztva szárítjuk. 25
9. példa HA paclitaxellel alkotott észterszármazékának elõállítása a karboxilcsoportok mintegy 4 tömeg%ának észterezésével 510,1 mg paclitaxel 6 ml diklór-metánnal készült oldatához 95,4 mg 3–3-brómpropionsavat és 525,0 mg 50 EDC¹t adunk. Ezt követõen az oldathoz vizet adunk, hogy a bromidot és a karbodiimidet megosztással eltávolítsuk, miközben 10 térfogat vizet alkalmazunk a reagensek eliminálására. A szerves oldatot nátrium-szulfáttal dehidratáljuk, és az oldószert rotációs bepárlóval 55 eltávolítjuk. 155,5 mg így kapott köztiterméket hozzáadunk 1,46 g HA¹TBA vízmentes NMP-vel készült oldatához, és a kapott oldatot szobahõmérsékleten 7 napon keresztül keverjük. Ezután 20 ml vizet és 4 ml telített 60 NaCl-oldatot adunk hozzá. Az oldatot 1 órán keresztül 45
9
1
HU 005 354 T2
keverjük, hogy a TBA-ionokat nátriumra cseréljük. Ezután lassan, cseppenként etanolt adunk hozzá, és a kapott szálas terméket vízben oldjuk, dializáljuk, végül fagyasztva szárítjuk. 5 10. példa Hialuronsav észterszármazékának elõállítása a karboxilcsoportok mintegy 30 tömeg%-ának észterezésével 500 mg paclitaxelt CH2Cl2-ben oldunk, és az oldathoz 397,6 mg 1¹(3¹dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimidet (EDC) és 300,9 mg 4¹brómvajsavat adunk. Ezután az oldatot vízzel megosztjuk. A karbodiimid és bromid maradékának eltávolítása után a reakció oldószerét vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, és rotációs bepárlóval eltávolítjuk. A kapott terméket NMP-ben oldjuk, és hozzáadjuk ~20 mg/ml TBA-val sóvá alakított hialuronsavat tartalmazó, NMP-vel készült oldathoz (1,95 g 100 ml NMP-ben). Az oldatot szobahõmérsékleten tartjuk 7 napon keresztül, majd 20 ml vízzel és 4,5 ml telített NaCl-oldattal hígítjuk. A kapott oldatot 1 órán keresztül keverjük, hogy a nátriumion-cserét TBA-ionnal lehetõvé tegyük. Ezután lassan, cseppenként etanolt adunk hozzá, és az így kapott szálas terméket vízben oldjuk és dializáljuk, és végül fagyasztva szárítjuk. 11. példa A HA 8 tömeg% paclitaxellel alkotott, részlegesen öntérhálósodott észterének (körülbelül 10% szubsztitúció) elõállítása 3,10 g, TBA-val sóvá alakított HA¹t 150 ml alacsony víztartalmú DMSO-ban szobahõmérsékleten szolubilizálunk. Az oldathoz ezután az 5., 6. és 7. példában ismertetett eljárás szerint elõállított 541,0 mg köztitermék paclitaxelt adunk. A reakcióelegyet 7 napon keresztül szobahõmérsékleten tartjuk, majd hozzáadunk 126,5 g trietil-amint, és az egészet 30 percen keresztül keverjük. Az elegyhez cseppenként, 45 perc alatt lassan hozzáadjuk 319,5 g 2¹klór-1-metil-piridin-jodid 30 ml DMSO-val készült oldatát, és 30 °C¹on tartjuk 15 órán keresztül. 1,7 g nátrium-klorid 50 ml vízzel készült oldatát adjuk hozzá, és a kapott elegyet lassan 400 ml acetonba öntjük folyamatos keverés közben. A képzõdött csapadékot leszûrjük, és háromszor 50 ml aceton/víz 5:1 eleggyel és háromszor 50 ml acetonnal mossuk. Az így kapott végterméket vákuumban 38 °C¹on szárítjuk. 12. példa 5. példa szerint elõállított HA¹paclitaxel észter oldhatóságának vizsgálata 5%¹os glükózoldatban A 7. példa szerinti észterezéssel elõállított 14,6 mg HA¹paclitaxel terméket (200 kDa molekulatömegû HA¹ból kiindulva), amelynek szubsztitúciós foka a karboxilcsoporton 16,3 tömeg%, 1 ml 5%¹os vizes glükózoldatban oldottunk. A mágneses keverõvel kevert oldat átszûrhetõ egy fecskendõre illesztett 0,20 mm steril szûrõn. A paclitaxel koncentrációja az oldatban 2,38 mg/ml.
10
15
20
25
30
35
2
Megpróbáltuk megtalálni a termék maximális koncentrációját 1 ml 5%¹os vizes glükózoldatban. 32,8 mg HA¹paclitaxel termék per ml glükózoldat koncentrációnál viszkózus oldatot kapunk, amelyben a paclitaxel koncentrációja 5,35 mg/ml. 13. példa Paclitaxel visszanyerése humán plazmából 101,3 mg HA¹paclitaxelbõl és 10 ml vízbõl oldatot készítünk. A HA¹paclitaxelt a 7. példában leírtak szerint állítjuk elõ. A visszanyerési vizsgálatot úgy végeztük, hogy 40 mg fent említett oldatot 2 ml humán plazmával érintkeztetünk 37 °C¹on. A HA¹tól való szétválással a plazmában felszabadult paclitaxel meghatározására három kontaktidõt állítottunk be: 6, 30 és 60 perc. Az egyes érintkezési intervallumok végén a paclitaxelt a plazma-HA-paclitaxel oldatból háromszor 1,5 ml (terc-butil)-metil-éterrel (TBME) végzett mosással extraháltuk, a mosófolyadékokat összegyûjtöttük, természetes párologtatással 60 °C¹on szárazra pároltuk, és 400 ml abszolút etanolban újra szuszpendáltuk, hogy a hatóanyag-tartalmat HPLC-vel (nagy nyomású folyadékkromatográfia) meghatározzuk. A kapott eredmények a 4. ábrán láthatók: 6 perc után a paclitaxel több mint 80%¹a elvált a HA¹tól, és a százalékos mennyiség nem növekedett a késõbbi megfigyelési idõkkel. Miután a találmányt a fentiekben ismertettük, nyilvánvaló, hogy ezek a módszerek különféle módokon módosíthatók. Az ilyen módosításokat nem tekintjük a találmány szellemétõl és céljától való eltérésnek, és bármely ilyen módosítás, amely szakember számára nyilvánvaló, a következõ igénypontok tárgykörébe tartozik.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 40
45
50
55
60 10
1. Hialuronsavhoz vagy egy hialuronsavszármazékhoz kovalensen kötött taxán, ahol a kovalens kötés egy spacer segítségével a taxán hidroxilcsoportjai és a hialuronsav vagy hialuronsavszármazék karboxilcsoportjai között van kialakítva, és a hialuronsav vagy annak származéka karboxilcsoportjai és a spacer közötti kötés egy észterkötés. 2. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a taxán paclitaxel és docetaxel közül van megválasztva. 3. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a taxán paclitaxel. 4. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsav molekulatömege 400 és 3×106 dalton közötti. 5. A 4. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsav molekulatömege 400 és 1×106 dalton közötti. 6. A 4. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsav molekulatömege 400 és 230 000 dalton közötti. 7. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsav szerves és/vagy szervetlen bázisokkal sóvá van alakítva. 8. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsavszármazék a hialuronsav alifás, aralifás, cikloalifás,
1
HU 005 354 T2
aromás, ciklusos és heterociklusos alkoholokkal alkotott észterei csoportjából van megválasztva, ahol az észterek észterezési foka egyenlõ vagy kisebb mint 50%. 9. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsavszármazék a hialuronsav alifás, aralifás, cikloalifás, aromás, ciklusos és heterociklusos aminokkal alkotott amidjai csoportjából van megválasztva, ahol az amidok amidálási foka 0,1% és 10% közötti. 10. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsavszármazék a hialuronsav O¹szulfatált származékai csoportjából van megválasztva, ahol a szulfatálás elérheti a 4. fokozatot. 11. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsavszármazék a hialuronsav egyenlõ vagy kisebb, mint 15% észterezési fokú belsõ észterei közül van megválasztva. 12. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsavszármazék a hialuronsav dezacetilezett származékai közül van megválasztva, amelyek az N¹acetil-glükózamin egység dezacetilezésébõl származnak, és a dezacetilezés foka 0,1% és 30% közötti. 13. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsavszármazék a hialuronsav perkarboxilezett származékai közül van megválasztva, amelyek az N¹acetil-glükózamin egység primer hidroxilcsoportjainak oxidálásából származnak, a perkarboxilezés foka 1 és 100% közötti. 14. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a taxánt a hialuronsavval vagy hialuronsavszármazékkal összekötõ spacer hidroxil¹, karboxil¹, karbonil¹, epoxid¹, acilklorid¹, tiol¹, nitril¹, halogén¹, anhidrid¹, izocianát¹, izotiocianát- és aminocsoportok közül megválasztott egy vagy több csoporttal szubsztituált, egyenes vagy elágazó alifás vagy aralifás láncok csoportjából van megválasztva. 15. A 14. igénypont szerinti taxán, ahol a spacer alifás vagy aralifás láncában 2–18 szénatomot tartalmazó, brómatommal szubsztituált karbonsavak közül van megválasztva. 16. A 14. igénypont szerinti taxán, ahol a spacer alifás vagy aralifás láncában 3–10 szénatomot tartalmazó, brómatommal szubsztituált karbonsavak közül van megválasztva. 17. A 14. igénypont szerinti taxán, ahol a spacer 3¹brómpropionsav és 4¹brómvajsav közül van megválasztva. 18. A 8. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsav a taxánnal való kovalens kötés kialakítása után van észterezve. 19. A 11. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsav a taxánnal való kovalens kötés kialakítása után van észterezve. 20. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a kovalens kötés a taxán és a spacer között egy észter kötés. 21. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a kovalens kötés a taxán és a spacer között egy acetál vagy ketál kötés. 22. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a kovalens kötés a taxán és a spacer között egy uretán vagy tiouretán kötés.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 11
2
23. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsav és a taxán közötti kötés százaléka 0,1% és 100% közötti. 24. A 23. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsav és a taxán közötti kötés százaléka 0,1% és 35% közötti. 25. Gyógyszerkészítmény, amely hatóanyagként az 1–24. igénypontokban megadott legalább egy, hialuronsavhoz vagy hialuronsavszármazékhoz kovalensen kötött taxánt tartalmaz gyógyszerészetileg elfogadható segédanyagokkal és hígítóanyagokkal kombinációban. 26. A 25. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, orális, intravénás, arteriális, intramuszkuláris, szubkután, intraperitoneális vagy transzdermális módon, vagy a tumoros helyre közvetlen injektálással történõ adagolásra. 27. A 25. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, orális úton történõ adagolásra. 28. A 25. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, ahol a hialuronsav vagy hialuronsavszármazék elõsegíti a taxánnak az adagolási helyen történõ felszabadulását. 29. A 25–28. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, amely továbbá egy vagy több biológiailag vagy farmakológiailag hatásos anyagot tartalmaz. 30. A 29. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, ahol a biológiailag vagy farmakológiailag hatásos anyagok szteroidok, hormonok, trófiás faktorok, proteinek, vitaminok, nem szteroid gyulladásgátló hatóanyagok, kemoterápiás hatóanyagok, kalciumblokkolók, antibiotikumok, antivirális hatóanyagok, interleukinek és citokinek csoportjából vannak megválasztva. 31. A 29. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, ahol a biológiailag vagy farmakológiailag hatásos anyag interferon. 32. Az 1–24. igénypontokban megadott, hialuronsavhoz vagy hialuronsavszármazékhoz kovalensen kötött taxán alkalmazása tumorok kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény elõállítására. 33. A 32. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a tumorok kezelése mellrák, a petefészek és/vagy méh rákja, melanóma, tüdõrák, a máj, a prosztata és/vagy a hólyag rákja, gyomor- és/vagy bélrák, leukémia és Kaposi-féle szarkóma kemoterápiáját foglalja magában. 34. Az 1–24. igénypontokban megadott, hialuronsavhoz vagy hialuronsavszármazékhoz kovalensen kötött taxán alkalmazása autoimmun patológiák kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény elõállítására. 35. A 34. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az autoimmun patológiák reumatoid artritisz, Hashimoto-féle tiroiditisz, szisztémás lupus erythematosus és autoimmun glomerulonefritisz csoportjából van megválasztva. 36. Az 1–24. igénypontokban megadott, hialuronsavhoz vagy hialuronsavszármazékhoz kovalensen kötött taxán alkalmazása resztenózis kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény elõállítására. 37. Az 1–24. igénypontokban megadott, hialuronsavhoz vagy hialuronsavszármazékhoz kovalensen kö-
1
HU 005 354 T2
tött taxán alkalmazása sztentek és orvosi eszközök bevonására. 38. Sztentek és orvosi eszközök, amelyek az 1–24. igénypontban megadott, hialuronsavhoz vagy hialuronsavszármazékhoz kovalensen kötött taxánnal vannak bevonva. 39. Eljárás az 1–24. igénypontokban megadott, spacer segítségével hialuronsavhoz vagy hialuronsavszármazékhoz kovalensen kötött taxán elõállítására, amely a következõ lépéseket tartalmazza: a) hialuronsavat vagy hialuronsavszármazékot tartalmazó oldathoz egy aktiválószert adunk; b) az a) lépésbõl származó oldathoz hozzáadjuk az adott esetben elõzetesen a taxánhoz kötött spacert; c) az így kapott terméket adott esetben tisztítjuk, és a taxánnal reagáltatjuk, ha azt elõzetesen nem kötöttük a spacerhez. 40. Eljárás az 1–24. igénypontokban megadott, spacer segítségével hialuronsavhoz vagy hialuronsav-
2
származékhoz kovalensen kötött taxán elõállítására, ahol a spacer legalább egy halogénatomot tartalmaz, és a hialuronsav vagy hialuronsavszármazék karboxilcsoportjához kötõdik észterkötéssel, ahol az eljárás a 5 következõ lépéseket tartalmazza: a’) a spacert, amelyet adott esetben elõzetesen a taxánhoz kötöttünk, hozzáadjuk a hialuronsav vagy hialuronsavszármazék oldatához; b’) az így kapott terméket adott esetben tisztítjuk, és a taxánnal reagáltatjuk, ha azt elõzetesen nem kötöt10 tük a spacerhez. 41. A 40. igénypont szerinti eljárás, ahol a spacer halogénatomja brómatom. 42. Az 1. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuron15 sav vagy annak származéka a taxán rákellenes hatását fokozza. 43. A 11. igénypont szerinti taxán, ahol a hialuronsav belsõ észtere a taxán rákellenes hatását fokozza.
12
HU 005 354 T2 Int. Cl.: C08B 37/00
13
HU 005 354 T2 Int. Cl.: C08B 37/00
14
HU 005 354 T2 Int. Cl.: C08B 37/00
15
HU 005 354 T2 Int. Cl.: C08B 37/00
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
