!HU000008417T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 417
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 672876 2003. 09. 25.
(73) Jogosult: ALLERGAN, INC., Irvine, California 92612 (US)
(72) Feltaláló: DONOVAN, Stephen, Capistrano Beach, CA 92624 (US) (54)
HU 008 417 T2
C12N 9/64
(21) Magyar ügyszám: E 04 782286 (22) A bejelentés napja: 2004. 08. 25. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040782286 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1664292 A2 2005. 04. 21. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1664292 B1 2010. 05. 26.
US
(2006.01) C12N 1/20 (2006.01) C12P 21/02 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05035749 PCT/US 04/027775
(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Állati terméktõl mentes tápközeg és eljárások botulinum toxin elõállítására
A leírás terjedelme 14 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.
1
HU 008 417 T2
Háttér A találmány tárgya tápközeg és eljárás biológiailag aktív botulinum toxin elõállítására. Közelebbrõl a találmány tárgya állati terméktõl lényegében mentes tápközeg, organizmus, mint például Clostridium botulinum baktérium tenyésztési és anaerob fermentációs eljárásai, sok, biológiailag aktív botulinum toxin elõállítására. Humán vagy állati terápiás, diagnosztikus, kutatási vagy kozmetikai célokra szolgáló gyógyászati készítmény hatóanyagot tartalmazhat. A gyógyászati készítmény tartalmazhat egy vagy több excipienst, puffert, hordozót, stabilizálószert, tartósítószert és/vagy duzzasztószereket. A gyógyászati készítményben található hatóanyag biológiai lehet, mint például botulinum toxin. A botulinum toxin tenyésztési, fermentációs és elõkészítési folyamattal nyerhetõ, amely egy vagy több állati eredetû terméket (mint például húslé tenyésztõ tápközeget, és vérfrakciókat vagy vérszármazék-excipienst) hasznosíthat. Az olyan gyógyászati készítmény páciensnek történõ beadása, ahol a hatóanyag biológiai, és olyan eljárással nyerjük, amely állati eredetû termékeket használ, potenciálisan különféle patogének vagy fertõzõ ágensek elkapásának kockázatát jelentheti a páciens számára. Például prionok lehetnek jelen a gyógyászati készítményben. A prion egy fehérjetermészetû fertõzõ részecske, amelyrõl azt tételezik fel, hogy abnormális konformációs izoformaként keletkezik ugyanarról a nukleinsavról, mint ami a normális fehérjét hozza létre. Továbbá azt is feltételezték, hogy a fertõzõképesség a normál izoformájú fehérjének a prionfehérje izoformájú fehérjévé történõ poszttranszlációs szintû „toborzási reakciójában” rejlik. Látszólag a normál endogén celluláris fehérje indukálódik, hogy hibásan feltekerõdjön a patogén prion konformációvá. A Creutzfeldt-Jacob betegség a humán átvihetõ szivacsos enkefalopátia egyik ritka neurodegeneratív rendellenessége, ahol az átvivõ ágens feltehetõleg egy prion fehérje abnormális izoformája. Egy CreutzfeldtJacob betegségben szenvedõ egyén állapota hat hónapon belül leromolhat a látszólag teljesen egészséges állapotból akinetikus némaságba. Ily módon potenciális kockázat létezhet prionközvetített betegség, mint például a Creutzfeldt-Jacob betegség elkapására olyan gyógyászati készítmény beadásától, amely állati termékek alkalmazásával elõállított biológiai anyagot, mint például botulinum toxint tartalmaz. Botulinum toxin A Clostridium nemzetség több mint százhuszonhét fajból áll, amelyeket morfológia és funkció szerint csoportosítanak. Az anaerob, Gram-pozitív Clostridium botulinum baktérium egy hatásos polipeptid neurotoxint termel, a botulinum toxint, amely neuroparalitikus betegséget okoz emberekben és állatokban, amelyet botulizmus néven ismerünk. A Clostridium botulinum és a spórái általában a talajban fordulnak elõ, és a baktérium növekedhet házi tartósítóüzemek nem megfelelõen sterilizált és lezárt élelmiszer-tárolóin, amelyek sok botulizmus eset okozói. A botulizmus hatásai tipikusan 18–36 órával a Clostridium botulinum tenyészet-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
tel vagy spórákkal fertõzött élelmiszer elfogyasztása után jelentkeznek. A botulinum toxin látszólag legyengítetlenül képes átjutni a bél nyálkahártyáján és megtámadhatja a motoros neuronokat. A botulinum toxin mérgezés tünetei elõrehaladhatnak a nehéz járástól, nyeléstõl és beszédtõl a tüdõizmok paralíziséig és halálig. Az A¹típusú botulinum toxin az ember által ismert legletálisabb természetes biológiai ágens. Körülbelül 50 pikogramm A¹típusú botulinum toxin (tisztított neurotoxin komplex) az LD50 egerekben. Moláris alapon az A¹típusú botulinum toxin 1,8 milliárdszor letálisabb, mint a diftéria, 600 milliószor letálisabb mint a nátriumcianid, 30 milliószor letálisabb mint a kobratoxin és 12 milliószor letálisabb mint a kolera [Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, 63–84. old. (4. fejezet) „Natural Toxins II”, szerk: B. R. Singh és mtsai., kiad.: Plenum Press, New York (1976)] (ahol az A¹típusú botulinum toxin 1 egységként megjelölt 0,3 ng LD50értéke korrigálva van arra a tényre, hogy 0,05 ng BOTOX® 1 egységnek felel meg). A BOTOX® az A¹típusú botulinum toxin tisztított neurotoxin komplex védjegye, amely az Allergan, Inc. (Irvine, California.) cégtõl szerezhetõ be kereskedelmi forgalomban. Egy egység (U) botulinum toxin azon LD50-értékként van definiálva 18–20 g¹os nõstény Swiss Webster egereknek beadva. Más szóval egy egység botulinum toxin a botulinum toxin azon mennyisége, amely megöli nõstény Swiss Webster egerek csoportjának az 50%¹át. Hét általánosan elismert immunológiailag különbözõ botulinum neurotoxint jellemeztek, amelyeket rendre A, B, C1, D, E, F és G botulinum neurotoxin szerotípusoknak neveznek, amelyek típus specifikus ellenanyagokkal történõ semlegesítéssel különböztetnek meg. A botulinum toxin különbözõ szerotípusai eltérnek azon állatfajok szerint, amelyekre hatnak és a kiváltott paralízis súlyosságában és idõtartamában. Például meghatározták, hogy az A¹típusú botulinum toxin 500-szor hatásosabb, mint a B¹típusú botulinum toxin, a patkányokban mért paralízis arányával mérve. Emellett a B¹típusú botulinum toxinról meghatározták, hogy nem toxikus fõemlõsökben 480 U/kg dózisban, ami körülbelül 12¹szerese az A¹típusú botulinum toxin fõemlõsökbeli LD50értékének. A botulinum toxinok látszólag nagy affinitással kötõdnek a kolinerg motoros neuronokhoz, és transzlokálódnak a neuronokba és blokkolják az acetilkolin preszinaptikus felszabadulását. A botulinum toxinokat alkalmazták klinikai körülmények között például olyan neuromuszkuláris rendellenességek kezelésére, amelyeket hiperaktív vázizmok jellemeznek. Az A¹típusú botulinum toxint az USA Élelmiszer és Gyógyszer Hatósága engedélyezte esszenciális blefaroszpazmus, strabizmus és hemifaciális spazmus kezelésére 12 év feletti páciensekben, cervikális disztónia kezelésére és glabelláris vonal (arc)ráncok kezelésére. Az FDA engedélyezte a B¹típusú botulinum toxint cervikális disztónia kezelésére is. Az A¹típusú botulinum toxin perifériás (például intramuszkuláris vagy szubkután) injekciójának klinikai hatásait általában az injekció beadását követõ egy héten, de gyak-
1
HU 008 417 T2
ran néhány órán belül láthatjuk. A tüneti enyhítés (azaz a petyhüdt izmok paralízise) tipikus idõtartama A¹típusú botulinum toxin egyetlen intramuszkuláris injekciójától körülbelül 3 hónap és 6 hónap közötti lehet. Habár az összes botulinum toxin szerotípus látszólag gátolja az acetil-kolin neurotranszmitter felszabadulását a neuromuszkuláris kapcsolatban, azok azt különbözõ neuroszekréciós fehérjék befolyásolásával és/vagy ezen fehérjék különbözõ helyeken történõ hasításával érik el. Az A¹típusú botulinum toxin egy cink endopeptidáz, amely képes specifikusan hidrolizálni az SNAP–25 intracelluláris vezikulumasszociált fehérje egy peptidkötését. Az E¹típusú botulinum toxin is hasítja a 25 kilodaltonos (kD) szinaptoszómaasszociált fehérjét (SNAP¹25), de eltérõ aminosavszekvenciát céloz meg az A¹típusú botulinum toxinnal összehasonlítva. A B¹, D¹, F¹ és G¹típusú botulinum toxinok a vezikulumasszociált fehérjére (VAMP, másnéven szinaptobrevin) hatnak, és mindegyik szerotípus különbözõ helyen hasítja a fehérjét. Végezetül a C1-típusú botulinum toxinról kimutatták, hogy egyaránt hasítja a szintaxint és a SNAP–25¹öt is. Ezek a hatásmechanizmusbeli különbségek befolyásolhatják a különbözõ botulinum toxin szerotípusok hatásosságát és/vagy hatásidejét. Függetlenül a szerotípustól, a toxin méregtelenítésének molekuláris mechanizmusa hasonlónak tûnik és legalább három különbözõ lépést vagy stádiumot foglal magában. A folyamat elsõ lépésében a toxin kötõdik a célneuron preszinaptikus membránjához a nehézlánc (H¹lánc) és egy sejtfelszíni receptor közötti specifikus kölcsönhatás révén; azt gondolják, hogy a receptor különbözik a botulinum toxin mindegyik szerotípusa és a botulinum toxin esetében. A H¹lánc karboxilvégi szegmense, a HC fontosnak tûnik a toxin sejtfelszínre történõ célzásában. Egy második lépésben a toxin átjut a megmérgezett sejt plazmamembránján. A toxint elõször elnyeli a sejt receptorközvetített endocitózissal, és a toxint tartalmazó endoszóma alakul ki. Azután a toxin kiszabadul az endoszómából a sejt citoplazmájába. Errõl az utolsó lépésrõl azt gondolják, hogy a H¹lánc aminovégi szegmense, a HN közvetíti, ami a toxin konformációs változását váltja ki körülbelül 5,5 vagy alacsonyabb pH hatására. Az endoszómák ismert módon protonpumpát tartalmaznak, amely csökkenti az intraendoszomális pH¹t. A konformációs változás elõhozza a toxinban található hidrofób oldalláncokat, amelyek lehetõvé teszik, hogy toxin beágyazódjon az endoszóma membránjába. Azután a toxin transzlokálódik az endoszomális membránon keresztül a citoplazmába. A botulinum toxin-aktivitás mechanizmusának utolsó lépése látszólag a H¹ és L¹láncokat összekötõ diszulfidhidak redukcióját foglalja magában. A teljes botulinum toxinok toxikus aktivitása a holotoxin L¹láncában található; az L¹lánc egy cink (Zn++) endopeptidáz, amely szelektíven elhasít olyan fehérjéket, amelyek esszenciálisak a neurotranszmitter-tartalmú vezikulumok felismeréséért és dokkolásáért a plazmamembrán citoplazmás felszínére és a vezikulumoknak a plazmamembránnal történõ fúziójáért. A botulinum neurotoxin
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
B¹, D¹, F¹ és G¹típusú botulinum toxin a szinaptobrevin [másnéven vezikulumasszociált membránprotein (VAMP)] degradációját okozza, ami egy szinaptoszómális membránprotein. A szinaptikus vezikulumok citoplazmatikus felszínén jelen lévõ VAMP legnagyobb része eltávolítódik ezen hasítási események bármelyikének eredményeképpen. Mindegyik toxin különbözõ kötést hasít el specifikusan. A botulinumtoxin-molekula molekulatömege mind a hét ismert botulinumtoxin-szerotípus esetében körülbelül 150 kD. Érdekes, hogy a botulinum toxinokat a Clostridium baktériumok a 150 kD botulinum toxin fehérjemolekulát nem toxin fehérjéket asszociálva tartalmazó komplexekként szabadítják fel. Ily módon az A¹típusú botulinum toxin komplexet a Clostridium baktérium 900 kD, 500 kD és 300 formákban termelheti. A B¹ és C1-típusú botulinum toxin látszólag csak 500 kD komplexként termelõdik. A D¹típusú botulinum toxin 300 kD és 500 kD komplexekként termelõdik. Végezetül az E¹ és F¹típusú botulinum toxinok csak megközelítõleg 300 kD komplexekként termelõdnek. A komplexekrõl (amelyek körülbelül 150 kD molekulatömegnél nagyobbak) úgy vélik, hogy nem toxin hemagglutinin fehérjét és nem toxin nem hemagglutinin fehérjét tartalmaznak. Ez a két nem toxin fehérje (amelyek a botulinumtoxin-molekula mellett a releváns neurotoxin komplexet alkothatják) stabilitást biztosíthat a botulinumtoxin-molekula denaturációjával szemben és védelmet az emésztõsavakkal szemben, amikor a toxint lenyelik. Emellett az is lehetséges, hogy a nagyobb (nagyobb mint körülbelül 150 kD molekulatömegû) botulinum toxin komplexek alacsonyabb diffúziós sebességet eredményeznek a botulinum toxin számára a botulinum toxin komplex intramuszkuláris injekciós helytõl. A toxinkomplexek toxinfehérjére és hemagglutininfehérjékre disszociálódnak azok vörösvérsejtekkel való kezelésével pH 7,3 értéken. A toxinfehérje kifejezetten instabil a hemagglutininfehérje eltávolítása után. Az összes botulinum toxin szerotípust a Clostridium botulinum baktériumok termelik inaktív egyláncú peptidekként, amelyeknek el kell hasítódniuk vagy be kell hasítódniuk peptidázok által ahhoz, hogy neuroaktívakká váljanak. Az A és G szerotípusú botulinum toxinokat termelõ bakteriális törzsek endogén proteázokkal rendelkeznek és az A és G szerotípusok ezáltal fõként aktív formájukban nyerhetõk vissza bakteriális tenyészetekbõl. Ezzel ellentétben a C1, D és E botulinum toxin szerotípusok nem proteolitikus láncokként szintetizálódnak és ezért tipikusan inaktiváltak amikor kinyerjük a tenyészetbõl. A B és F szerotípust proteolitikus és nem proteolitikus törzsek is termelik és ezért vagy aktív, vagy inaktív formában nyerhetõk ki. Azonban még ha a proteolitikus törzsek is termelik, például a B¹típusú botulinum toxin csak a termelt toxin egy részét hasítja el. A behasított és behasítatlan molekulák pontos aránya a tenyészet inkubációjának hosszától és hõmérsékletétõl függ. Tehát a B¹típusú botulinum toxin bármilyen tenyészetének egy bizonyos százaléka valószínûleg inaktív lesz, ami feltehetõleg felelõs a B¹típusú botulinum toxin szignifikánsan alacsonyabb hatásossá-
1
HU 008 417 T2
gáért, összehasonlítva az A¹típusú botulinum toxinnal. Az inaktív botulinumtoxin-molekulák jelenléte a klinikai preparátumokban hozzájárulhat a preparátum teljes fehérjeterheléséhez, amit kapcsolatba hoztak a megnövekedett antigenitással, anélkül, hogy hozzájárulna a klinikai hatékonyságához. Emellett ismert, hogy a B¹típusú botulinum toxinnak intramuszkuláris injekció után rövidebb az aktivitási idõtartama, és kevésbé hatásos, mint az A¹típusú botulinum toxin ugyanolyan dózisszinten. In vitro vizsgálatok arra utalnak, hogy a botulinum toxin gátolja az acetil-kolin és norepinefrin káliumkation által indukált felszabadulását agytörzsi szövet elsõdleges sejttenyészeteibõl. Emellett arról is beszámoltak, hogy a botulinum toxin gátolja a glicin és glutamin kiváltott felszabadulását gerincvelõi neuronok elsõdleges tenyészeteibõl, és hogy az agyi szinaptoszóma preparátumokban a botulinum toxin gátolja az acetilkolin, dopamin, norepinefrin, CGRP és glutamát mindegyikének a felszabadulását. Jó minõségû kristályos A¹típusú botulinum toxin termelhetõ a Clostridium botulinum Hall¹A törzsébõl ³3×107 U/mg, A260/A278 kisebb mint 0,60 és megkülönböztethetõ gélelektroforetikus mintázat jellemzõkkel. Az ismert Schantz-eljárást alkalmazhatjuk kristályos A¹típusú botulinum toxin elõállítására, amint azt a Schantz, E. J., és mtsai., „Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine”, Microbiol Rev. 56: 80–99. old. (1992) irodalmi helyen ismertetik. Általában az A¹típusú botulinum toxin komplex anaerob fermentációval izolálható és tisztítható A¹típusú Clostridium botulinumból alkalmas tápközegben. A nyers toxint kénsavas kicsapással gyûjthetjük be és ultramikrofiltrációval koncentrálhatjuk. A tisztítást a savas csapadék kalcium-kloridban történõ feloldásával hajthatjuk végre. Azután a toxint kicsaphatjuk hideg etanolban. A csapadékot feloldhatjuk nátriumfoszfát-pufferben és centrifugálhatjuk. Szárítás után azután megközelítõleg 900 kD méretû kristályos A¹típusú botulinum toxin komplexet nyerhetünk 3×107 LD50 U/mg vagy nagyobb specifikus hatásossággal. Ezt az ismert eljárást alkalmazhatjuk – a nem toxin fehérjéktõl való elválasztás után – tiszta botulinum toxinok elõállítására, mint például: tisztított A¹típusú botulinum toxin megközelítõleg 150 kD molekulatömeggel és 1–2×108 LD50 U/mg vagy nagyobb specifikus hatásossággal; tisztított B¹típusú botulinum toxin megközelítõleg 156 kD molekulatömeggel és 1–2×108 LD50 U/mg vagy nagyobb specifikus hatásossággal, és tisztított F¹típusú botulinum toxin megközelítõleg 155 kD molekulatömeggel és 1–2×107 LD50 U/mg vagy nagyobb specifikus hatásossággal. Botulinum toxinok (150 kilodaltonos molekula) és botulinum toxin komplexek (300–900 kDa) beszerezhetõk a List Biological Laboratories, Inc., Campbell, California; a Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U. K.; Wako (Osaka, Japan), valamint a Sigma Chemicals St Louis, Missouri cégektõl. A kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ, botulinum toxint tartalmazható gyógyászati készítmények
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
közé tartozik a Botox® (A¹típusú botulinum toxin neurotoxin komplexe humán szérumalbuminnal és nátrium-kloriddal), ami beszerezhetõ az Allergan, Inc., Irvine, California cégtõl (100 egységes fiolákban liofilizált porként, amit 0,9% nátrium-kloriddal kell visszaoldani felhasználás elõtt), Dysport® (Clostridium botulinum A¹típusú toxin hemagglutinin komplex humán szérumalbuminnal és laktózzal a kiszerelésben), ami beszerezhetõ az Ipsen Limited, Berkshire, U. K. cégtõl, felhasználás elõtt 0,9% nátrium-kloridban feloldandó porként), és MyoBloc™ (B¹típusú botulinum toxin, humán szérumalbumin, nátrium-szukcinát és nátriumklorid injektálható oldata körülbelül pH 5,6 értéken, ami beszerezhetõ az Elan Corporation, Dublin, Ireland cégtõl). Az A¹típusú botulinum toxin sikere különféle klinikai állapotok kezelésére más botulinum toxin szerotípusok iránti érdeklõdéshez vezetett. Ily módon legalább az A¹, B¹, E¹ és F¹típusú botulinum toxinokat alkalmazták klinikailag emberekben. Emellett tiszta (megközelítõleg 150 kDa) botulinum toxint alkalmaztak emberek kezelésére. Lásd például Kohl A. és mtsai., „Comparison of the effect of botulinum toxin A [Botox (R)] with the highly-purified neurotoxin (NT 201) in the extensor digitorum brevis muscle test”, Mov Disord 2000; 15 (Suppl 3):165. old. Így gyógyászati készítményeket állíthatunk elõ tiszta (megközelítõleg 150 kDa) botulinum toxin alkalmazásával. Az A¹típusú botulinum toxin ismert módon oldható híg vizes oldatokban pH 4–6,8 értéken. Körülbelül pH 7 felett a stabilizáló nem toxikus fehérjék ledisszociálnak a neurotoxinról, ami a toxicitás fokozatos elvesztését eredményezi, különösen ahogy a pH és a hõmérséklet emelkedik [Schantz E. J., és mtsai., „Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment” (különösen a 44–45. old.)., ami a Jankovic, J., és mtsai., „Therapy with Botulinum Toxin” 3. fejezete, kiad.: Marcel Dekker, Inc (1994)]. Amint az enzimekkel általában, a botulinum toxinok (amelyek intracelluláris peptidázok) biológiai aktivitása függ – legalább részben – a háromdimenziós konformációjuktól. Ily módon az A¹típusú botulinum toxin detoxifikálható hõvel, különféle vegyszerekkel, nyújtással és felületi szárítással. Emellett ismert, hogy az ismert tenyésztési, fermentációs és tisztítási eljárásokkal kapott toxin komplex hígítása a gyógyászati készítmények kiszerelésekben alkalmazott sokkal alacsonyabb toxinkoncentrációra a toxin gyors detoxifikálását eredményezi, hacsak nem alkalmazunk megfelelõ stabilizálószereket. A toxin meghígítása milligramm mennyiségekrõl nanogramm per millilitereket tartalmazó oldatokká szignifikáns nehézséget jelent a specifikus toxicitás ilyen nagymértékû hígítás miatti gyors elvesztése miatt. Mivel a toxin hónapokig vagy évekig alkalmazható a toxint tartalmazó gyógyászati készítmény kiszerelése után, a toxin stabilizálható stabilizálószerekkel, mint például albuminnal és zselatinnal. Beszámoltak arról, hogy a botulinum toxint alkalmazták különféle klinikai körülmények között, beleértve a következõket:
1
HU 008 417 T2
(1) körülbelül 75–125 egység BOTOX® intramuszkuláris injekciókként (több izomba) cervikális disztónia kezelésére; (2) 5–10 egység BOTOX® intramuszkuláris injekciókként glabelláris vonalak (szemöldök) kezelésére (5 egység intramuszkulárisan injektálva a procerus izomba és 10 egység intramuszkuláris injektálva mindegyik corrugator supercilii izomba); (3) körülbelül 30–80 egység BOTOX® székrekedés kezelésére a puborectalis izom intraszfinkter injekciójával; (4) izmokként körülbelül 1–5 egység intramuszkulárisan injektált BOTOX® blefaroszpazmus kezelésére a felsõ szemhéj laterális pretarsal orbicularis oculi izmába és az alsó szemhéj laterális pretarsal orbicularis oculi izmába injektálva. (5) kancsalság kezelésére extraokuláris izmokba injektáltak intramuszkulárisan körülbelül 1–5 egység BOTOX®¹ot, az injektált mennyiség változott az injektálandó izom méretétõl és a kívánt izombénulás mértékétõl (azaz a kívánt dioptriakorrekció mennyiségétõl) függõen. (6) a felsõ végtag sztrókot követõ görcsének kezelése BOTOX® intramuszkuláris injekciójával a felsõ végtag öt különbözõ hajlítóizmába, a következõk szerint: (a) flexor digitorum profundus: 7,5–30 U, (b) flexor digitorum sublimus: 7,5–30 U, (c) flexor carpi ulnaris: 10–40 U, (d) flexor carpi radialis: 15–60 U, (e) biceps brachii: 50–200 U. Az öt jelzett izom mindegyikét ugyanazon kezelés alkalmával injektálták, oly módon, hogy a páciens 90–360 U felsõ végtagi hajlítóizom BOTOX®¹ot kapott intramuszkuláris injekcióval minden kezelés alkalmával. (7) migrén kezelésére perikraniálisan injektált (szimmetrikusan a glabelláris, frontális és temporális izmokba injektálva) 25 U BOTOX® injektálása szignifikánsan jó hatásúnak bizonyult migrén profilaktikus kezelésre, hordozóval összehasonlítva, amint a migrén gyakoriságának, maximális súlyosságának, a velejáró hányásnak és akut gyógyszerfelhasználás mérésével a 25 U injekció beadását követõ három hónapon keresztül alkalmazva. Ismert, hogy az A¹típusú botulinum toxin hatékony lehet akár 12 hónapig is [European J. Neurology 6 (Supp 4): S111–S1150:1999], és bizonyos körülmények között még akár 27 hónapon keresztül is (The Laryngoscope 109:1344–1346:1999). Azonban a Botox®
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
intramuszkuláris injekciójának a szokásos idõtartama tipikusan 3¹4 hónap. Egy kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ botulinum toxint tartalmazó készítményt a BOTOX® védjegy alatt árulnak (beszerezhetõ az Allergan, Inc., Irvine, California cégtõl). A BOTOX® tisztított A¹típusú botulinum toxinból, humán szérumalbuminból és nátriumkloridból áll, steril, vákuumszárított formában csomagolva. Az A¹típusú botulinum toxint Clostridium botulinum Hall¹A törzsének N–Z-amint és élesztõkivonatot tartalmazó tápközegen való tenyészetébõl készítik. Az A¹típusú botulinum toxin komplexet megtisztítják a tenyésztõoldatból savas kicsapások sorozatával olyan kristályos komplexszé, amely az aktív nagy molekulatömegû toxinfehérjébõl és a kapcsolódó hemagglutininfehérjébõl áll. A kristályos komplexet újra feloldják sóoldatot és albumint tartalmazó oldatban, és sterilre szûrik (0,2 mikron) a vákuumszárítást megelõzõen. A BOTOX®¹ot steril, tartósítószer nélküli sóoldatban lehet visszaoldani az intramuszkuláris injektálást megelõzõen. A BOTOX® mindegyik fiolája körülbelül 100 egység (U) Clostridium botulinum toxin A¹típusú komplexet, 0,5 milligramm humán szérumalbumint és 0,9 milligramm nátrium-kloridot tartalmaz steril, vákuumszárított formában tartósítószer nélkül. A vákuumszárított BOTOX® visszaoldásához tartósítószer nélküli steril normál sóoldatot (0,9% nátriumklorid-injekció) alkalmazunk az oldószer megfelelõ mennyiségének a felszívásával a megfelelõ méretû fecskendõbe. Mivel a BOTOX® denaturálódik a buborékolástól és hasonló erõteljes keveréstõl, az oldószert óvatosan injektáljuk a fiolába. Sterilitási okokból a BOTOX®¹ot a visszaoldást követõ négy órán belül be kell adni. Ezen idõszak alatt a visszaoldott BOTOX®¹ot hûtõszekrényben tároljuk (2–8 °C). A visszaoldott BOTOX® tiszta, színtelen és részecskéktõl mentes anyag. A vákuumszárított terméket fagyasztóban vagy –5 °C alatt tároljuk. Általában a C. botulinumnak négy fiziológiás csoportját ismerik el (I, II, III és IV). A szerológiailag különbözõ toxin termelésére képes organizmusok egynél több fiziológiás csoportból származhatnak. Például a B¹ és F¹típusú toxinokat az I. vagy II. csoportba tartozó törzsek termelhetik. Emellett más Clostridium fajokat (C. baratii, F¹típus; C. butyricum, E¹típus; C. novyi, C1¹ vagy D¹típus) is azonosítottak, amelyek képesek botulinum neurotoxinok termelésére. A Clostridium botulinum típusok fiziológiás csoportjait az 1. táblázatban soroljuk fel.
I. táblázat Clostridium botulinum fiziológiás csoportjai Csoport
Toxin szerotípus
Biokémia
Tejemésztés
Glükózfermentálás
Lipáz
Fágok & Plazmidok
Fenotípusosan rokon Clostridium (nem toxigenikus)
I
A, B, F
proteolitikus szacharolitikus
+
+
+
+
C. sporogenes
5
1
HU 008 417 T2
2
I. táblázat (folytatás) Csoport
Toxin szerotípus
Biokémia
Tejemésztés
Glükózfermentálás
Lipáz
Fágok & Plazmidok
II
B, E, F
nem proteolitikus szacharolitikus pszichotropikus
–
+
+
+
III
C, D
nem proteolitikus szacharolitikus
±
+
+
+
C. novyi
IV
G
proteolitikus nem szacharolitikus
+
–
–
–
C. subterminale
Ezeket a toxintípusokat a megfelelõ fiziológiás csoportba tartozó Clostridium botulinum organizmusok kiválasztásával állíthatjuk elõ. Az I. csoportnak nevezett organizmusokat általában proteolitikusnak nevezik, és A, B¹ és F¹típusú botulinum toxinokat termelnek. A II. csoportnak nevezett organizmusokat szacharolitikusnak nevezik, és B¹, E¹ és F¹típusú botulinum toxinokat termelnek. A III. csoportnak nevezett organizmusok csak C¹ és D¹típusú botulinum toxin-típusokat termelnek, és azokat az I. és II. csoportba tartozó organizmusoktól a szignifikáns mennyiségû propionsav termelésével különböztetjük meg. A IV. csoportba tartozó organizmusok csak G¹típusú neurotoxint termelnek. A tetanusz-toxin kinyerése ismert specifikus tápközegekkel, amelyek lényegében mentesek állati termékektõl. Lásd például az US 6 558 926 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot. De figyelemre méltó, hogy még az ebben a szabadalomban feltárt „állati terméktõl mentes” tápközeg is alkalmaz Bacto-peptont, ami egy húsemésztmény. Szignifikáns módon a tetanusz-toxin Clostridium tetani általi elõállítása szemben a botulinum toxin Clostridium botulinum baktérium általi elõállításával eltérõ tápközeg és fermentációs paraméterek és szempontok alkalmazásával jár együtt. Lásd például Johnson, E. A., és mtsai., „Clostridium botulinum and its neurotoxins: a metabolic and cellular perspective”, Toxicon 39 (2001), 1703–1722. old. Whitmer és mtsai., Appl. Env. Microbiol. 54 (1988), 753–759 meghatározott tápközeget ismertetnek C. Botulinum tenyésztésére, bár 5–50-szeres csökkenést találtak a toxin kitermelésében. Szükség van tehát tápközegre és eljárásokra, amelyek lényegében mentesek állati termékektõl, mint például állati eredetû fehérjéktõl, biológiailag aktív botulinum toxin termelésére.
Fenotípusosan rokon Clostridium (nem toxigenikus)
tulinum toxin alkalmazható botulinum toxin hatóanyagú gyógyászati készítmény elkészítésére. 20
25
30
35
40
45
50
55 Összefoglalás A találmány eleget tesz ennek a szükségletnek és olyan tápközegek és eljárások képezik a tárgyát, amelyek lényegében mentesek állati termékektõl, mint például állati eredetû fehérjéktõl, biológiailag aktív botulinum toxin termelésére vagy elõállítására. A kapott bo- 60 6
Definíciók A leírás szerinti értelemben az alábbi szavaknak és kifejezéseknek a következõ a definíciója. A „körülbelül” kifejezés alatt azt értjük, hogy az így meghatározott tétel, paraméter vagy kifejezés a megadott tétel, paraméter vagy kifejezés értéke felett és alatt tíz százalék tartományt foglal magában. A „beadás” vagy „beadni” kifejezések alatt gyógyászati készítmény alanynak történõ adását (azaz beadását) értjük. A találmány szerinti gyógyászati készítmények „lokálisan beadottak” például intramuszkuláris (i.m.), intradermális, szubkután beadással, intrathekális beadás, intrakraniális, intraperitoneális (ip.) beadással, topikális (transzdermális) és implantációval (azaz lassú felszabadulású eszközzel, mint például polimer implantátummal vagy miniozmotikus pumpával). A „ állati terméktõl mentes” vagy „ állati terméktõl lényegében mentes” kifejezések rendre magukban foglalják „állati fehérjétõl mentes” vagy „állati fehérjétõl lényegében mentes” kifejezéseket, és a véreredetû, vérbõl összeöntött és más állati eredetû termékek vagy vegyületek hiányát vagy lényegében hiányát értjük alattuk. Az „állat” kifejezés alatt emlõst (mint például embert), madarat, hüllõt, halat, rovart, pókot vagy más állatfajt értünk. Az „állat” nem foglalja magában a mikroorganizmusokat, mint például baktériumokat. Ily módon a találmány szerinti állati terméktõl mentes tápközeg vagy eljárás vagy az állati terméktõl lényegében mentes tápközeg vagy eljárás magában foglalhat botulinum toxint vagy Clostridium botulinum baktériumot. Például egy állati terméktõl mentes vagy állati terméktõl lényegében mentes eljárás olyan eljárást jelent, amely vagy lényegében mentes vagy alapvetõen mentes vagy teljesen mentes állati eredetû fehérjéktõl, mint például immunglobulinoktól, húsemésztménytõl, húsmelléktermékektõl, tejtõl vagy tejtermékektõl vagy emésztményektõl. Ily módon állati termékektõl mentes eljárás (mint például bakteriális tenyésztõ- vagy bakteriális fermentációs eljárás) egy példája olyan, amely nem tartalmaz hús- és tejtermékeket vagy hús- vagy tejmelléktermékeket.
1
HU 008 417 T2
A „botulinum toxin” kifejezés alatt Clostridium botulinum által termelt neurotoxint, valamint nem Clostridium-fajokban rekombináns úton termelt botulinum toxint (vagy annak könnyû láncát vagy nehéz láncát) értjük. A „botulinum toxin” kifejezés a leírás szerint értelemben magában foglalja az A, B, C, D, E, F és G szerotípusú botulinum toxinokat. A botulinum toxin a leírás szerint értelemben magában foglalja a botulinum toxin komplexet (azaz a 300, 600 és 900 kDa méretû komplexet), valamint a tisztított botulinum toxint (azaz körülbelül 150 kDa) is. A „tisztított botulinum toxint” olyan botulinum toxinként definiáljuk, amely izolálva van vagy lényegében izolálva van más fehérjéktõl, beleértve a botulinum toxin komplexet alkotó fehérjéket is. A tisztított botulinum toxin több mint 95% tiszta lehet, és elõnyösen több mint 99% tiszta. A botulinum C2 és C3 citotoxinok, amelyek nem neurotoxinok, ki vannak zárva a találmány tárgykörébõl. A „clostridium neurotoxin” kifejezés alatt Clostridium baktérium, mint például Clostridium botulinum, Clostridium butyricum vagy Clostridium beratti által termelt vagy abban natív, valamint nem Clostridium-fajban rekombináns úton termelt Clostridium neurotoxint értünk. A „teljesen mentes” (azaz „valamibõl áll” terminológia) kifejezés alatt azt értjük, hogy az alkalmazott készülék vagy eljárás detekciós határán belül az anyagot nem lehet detektálni vagy a jelenléte nem igazolható. Az „alapvetõen mentes” (vagy „alapvetõen valamibõl áll”) kifejezés alatt azt értjük, hogy az anyagnak csak nyomnyi mennyiségeit lehet detektálni. Az „immobilizálás” kifejezés alatt olyan lépést értünk, amely megakadályozza az alanynak, hogy mozgassa egy vagy több testrészét. Ha elegendõ számú testrészt immobilizálunk, ennek megfelelõen az alany immobilizált. Ily módon az „immobilizálás” magában foglalja egy testrész, mint például végtag és/vagy a teljes test immobilizálását. A „módosított botulinum toxin” olyan botulinum toxint jelent, amelynek legalább egy aminosava deletálva, módosítva vagy helyettesítve van, összehasonlítva a natív botulinum toxinnal. Emellett a módosított botulinum toxin rekombináns úton elõállított neurotoxin vagy rekombináns úton elõállított neurotoxin származéka vagy fragmense lehet. Egy módosított botulinum toxin megtartja a natív botulinum toxin legalább egy biológiai aktivitását, mint például a képességét botulinum toxin receptorhoz való kötõdésre, vagy a képességét neurotranszmitter neutronból való felszabadulásának gátlására. Módosított botulinum toxin egy példája olyan botulinum toxin, amelynek a könnyû lánca egyfajta botulinum toxin szerotípusból (például A szerotípusból) és a nehéz lánca egy másik botulinum toxin szerotípusból (mint például B szerotípusból) származik. Módosított botulinum toxin egy másik példája neurotranszmitterhez, mint például P¹anyaghoz kapcsolt botulinum toxin. A „páciens” kifejezés alatt orvosi vagy állatorvosi kezelést kapó humán vagy nem humán alanyt értünk. Ennek megfelelõen a találmány szerint a készítménye-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
ket bármilyen állat, mint például emlõsök kezelésére alkalmazhatjuk. A „gyógyászati készítmény” alatt olyan kiszerelést értünk, amelyben a hatóanyag botulinum toxin lehet. A „kiszerelés” szó azt jelenti, hogy legalább egy további alkotóelem van a gyógyászati készítményben a neurotoxin hatóanyag mellett. Egy gyógyászati készítmény tehát olyan kiszerelés, amely alkalmas alanynak, mint például emberi páciensnek történõ diagnosztikai vagy terápiás beadásra (azaz intramuszkuláris vagy szubkután injekcióval vagy depó vagy implantátum beillesztésével). A gyógyászati készítmény lehet: liofilizált vagy vákuumszárított állapotban; liofilizált vagy vákuumszárított gyógyászati készítmény sóoldattal vagy vízzel visszaoldott oldata formájában, vagy olyan oldat, amelyet nem kell visszaoldani. A hatóanyag az A, B, C1, D, E, F vagy G botulinum toxin szerotípusok egyike, vagy botulinum toxin lehet, amelyek mindegyike natívan lehet elõállítva Clostridium baktériumok által. Amint mondtuk, a gyógyászati készítmény lehet folyékony vagy szilárd, például vákuumszárított. A gyógyászati készítmény alkotóelemeit egyetlen készítménybe foglalhatjuk be (az összes alkotóelem, kivéve visszaoldásra szolgáló bármilyen folyadék, jelen van a gyógyászati készítmény kezdeti kiszerelésekor) vagy kétkomponensû rendszerként, például vákuumszárított készítmény oldószerrel, mint például sóoldattal visszaoldva, amely oldószer olyan alkotóelemet tartalmaz, amely nincs jelen a gyógyászati készítmény kezdeti kiszerelésekor. Egy kétkomponensû rendszernek az az elõnye, hogy lehetõvé teszi olyan alkotóelemek alkalmazását, amelyek nem megfelelõen kompatibilisek a kétkomponensû rendszer elsõ komponensének hosszú távú tárolhatóságával. Például a visszaoldó vivõanyag vagy oldószer tartósítószert tartalmazhat, amely elegendõ védelmet biztosít a mikrobiális növekedés ellen az alkalmazási idõszakban, például egyhetes hûtött tárolás alatt, de nincs jelen a kétéves fagyasztott tárolási idõszak alatt, amely idõ alatt lebonthatná a toxint. Más alkotóelemek, amely nem feltétlenül kompatibilisek hosszú idõn keresztül a Clostridium toxinnal vagy más alkotóelemekkel, alkalmazhatóik ily módon; azaz egy második vivõanyagban (azaz a visszaoldó folyadékban) vannak hozzáadva a felhasználás idejének közelében. Botulinum toxin hatóanyagú gyógyászati készítmény kiszerelésének eljárásait tárja fel az US 2003 0118598 A1 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés. A „lényegében mentes” olyan szinten való jelenlétet jelent, amely a gyógyászati készítmény egy tömegszázalékánál kisebb. A „terápiás kiszerelés” olyan kiszerelést jelent, amely alkalmazható rendellenesség vagy betegség, mint például a perifériás izom hiperaktivitásával (azaz görccsel) jellemzett rendellenesség vagy betegség kezelésére és ezáltal enyhítésére. A találmány tárgyát olyan tápközegek képezik, amelyek legalább csökkentett szintû állati vagy tejipari melléktermék szintet tartalmaznak, és elõnyösen lényegében mentesek állati vagy tejipari melléktermé-
1
HU 008 417 T2
kektõl. Az „állati vagy tejipari melléktermékek” kifejezés alatt bármilyen olyan vegyületet vagy vegyületek kombinációját értjük, amely állati (kizárva a bakteriálist) sejtben vagy azáltal lett termelve, akár in vivo, akár in vitro. A tápközeg-alkotóelemek, mint például fehérjék, aminosavak és nitrogén elõnyös nem állati forrásai közé tartoznak a növények, mikrobák (mint például élesztõ) és szintetikus vegyületek. A találmány tárgyát képezik eljárások is botulinum toxin kinyerésére legalább egy olyan tápközeg alkalmazásával, amely lényegében mentes állati és tejipari melléktermékektõl. Például a botulinum toxin kinyerhetõ Clostridium botulinum tenyésztésével olyan fermentációs tápközegben, amely lényegében mentes állati termékektõl. A találmány tárgykörébe tartozik a Clostridium botulinum olyan fermentációs tápközegben történõ tenyésztésével kapott botulinum toxin is, amely lényegében mentes állati termékektõl és amely növényi eredetû termékeket tartalmaz. Emellett botulinum toxin kinyerhetõ Clostridium botulinum tenyésztésével olyan fermentációs tápközegben, amely lényegében mentes állati termékektõl és valamilyen szójaalapú terméket tartalmaz. Egy másik elõnyös megvalósítási mód szerint a botulinum toxin kinyerhetõ Clostridium botulinum olyan fermentációs tápközegben történõ tenyésztésével, amely lényegében mentes állati termékektõl és amely hidrolizált szóját tartalmaz az állati eredetû termékek helyettesítõjeként. Elõnyösen a fermentációs tápközegben történõ növesztés legalább addig tart, amíg bekövetkezik a sejtek lízise. A fermentációs tápközeg beoltására alkalmazott Clostridium botulinum forrását Clostridium botulinumot tartalmazó oltótápközegbõl nyerhetjük. Elõnyösen az oltótápközegben növesztett és fermentációs tápközeg oltóanyagaként alkalmazott Clostridium botulinum nem ment át sejtlízisen. Az oltótápközeg beoltására alkalmazott Clostridium botulinum forrását liofilizált tenyészetbõl nyerhetjük. A Clostridium botulinum állati tejben vagy szójatejben való tenyészetként lehet liofilizálva. Elõnyösen a Clostridium botulinum szójatejben való tenyészetként van liofilizálva. A találmány tárgyát képezi Clostridium botulinum tenyésztésére szolgáló, állati eredetû termékektõl lényegében mentes tápközeget tartalmazó készítmény is. Egy megvalósítási mód szerint a készítmény állati termékektõl lényegében mentes tápközeget tartalmaz, miközben legalább egy nem állati eredetû terméket tartalmaz, és Clostridium botulinumot is tartalmaz. Egy másik megvalósítási mód szerint a készítmény állati termékektõl lényegében mentes tápközeget tartalmaz, miközben legalább egy növényi eredetû terméket tartalmaz, és Clostridium botulinumot is tartalmaz. Egy utolsó megvalósítási módjában a találmány olyan készítmény lehet, amely állati termékektõl lényegében mentes tápközeget tartalmaz, miközben legalább egy szójabab-eredetû terméket tartalmaz, és Clostridium botulinumot is tartalmaz.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
Leírás A találmány olyan tápközegek és eljárások felfedezésén alapszik, amelyek mentesek vagy lényegében mentesek állati termékektõl vagy állati melléktermékektõl és alkalmasak biológiailag aktív botulinum toxin termelésére képes organizmus (mint például Clostridium botulinum baktérium) tenyésztésére és fermentálására. A kapott botulinum toxin alkalmazható botulinum toxin hatóanyagú gyógyászati készítmény elkészítésére. Ily módon a találmány tárgyát képezik tenyésztési tápközegek, amelyeknek szignifikánsan alacsonyabb a húsvagy tejipari melléktermék szintje, és elõnyös tápközeg-megvalósítási módok lényegében mentesek ilyen állati termékektõl. A találmány tárgyát képezi az a meglepõ felismerés, hogy az állati eredetû termékek nem szükségesek Clostridium botulinum tenyésztésére szolgáló tápközegekben, és különösen hogy növényi alapú termékek képesek helyettesíteni az ilyen tápközegekben a Clostridium botulinum tenyésztéséhez tipikusan alkalmazott állati eredetû termékeket. A baktériumok tenyésztésére és fermentálására jelenleg alkalmazott tápközegek általában tartalmaznak egy vagy több állati eredetû alkotóelemet. A találmány szerinti a Clostridium botulinum tenyésztésére szolgáló elõnyös tápközegek annyi állati eredetû alkotóelemet tartalmaznak, ami nem képviseli több mint körülbelül 5–10 százalékát a tápközeg teljes tömegének. Elõnyösebben a találmány tárgykörébe tartozó tápközegek nem tartalmaznak körülbelül 1 és kevesebb mint 5 százalék közötti mennyiségnél több állati eredetû terméket a tápközeg teljes tömegére vonatkoztatva. Legelõnyösebben a botulinum toxin termelésére alkalmazott, Clostridium botulinum tenyésztésére szolgáló összes tápközeg és tenyészet teljesen mentes állati eredetû termékektõl. Ezen tápközegek nem korlátozó példái közé tartoznak Clostridium botulinum kis- és nagyléptékû fermentálására szolgáló tápközegek, az oltó (elsõ) tápközeg beoltására szolgáló Clostridium botulinum növesztésére és tenyésztésére szolgáló tápközegek, valamint Clostridium botulinum hosszú távú tárolási tenyészeteihez (például törzstenyészetek) alkalmazott tápközegek. A találmány bizonyos elõnyös megvalósítási módjai szerint a Clostridium botulinum tenyésztésére és botulinum toxin termelésére szolgáló tápközegek szójaalapú termékeket tartalmazhatnak az állati eredetû termékek helyettesítésére. Más megoldásképpen a szójaalapú termékek helyett Lupinus campestris keserítetlen magjait alkalmazhatjuk. Ismert, hogy a L. campestris magjának fehérjetartalma nagyon hasonló a szójababéhoz. Elõnyösen ezek a tápközegek szójabab vagy L. campestris eredetû termékeket tartalmaznak, amelyek hidrolizálva vannak és oldhatók vízben. Azonban oldhatatlan szója vagy L. campestris termékek is alkalmazhatók a találmány szerint állati termékek helyettesítésére. Gyakori állati eredetû termékek, amelyek helyettesíthetõk szója vagy L. campestris termékekkel, közé tartozik marhaszívfõzet (BHI), állati eredetû peptontermékek, mint például Bacto-pepton, hidrolizált kazeinek és tejipari termékek, mint például állati tej.
1
HU 008 417 T2
Elõnyösen a Clostridium botulinum növesztésére szolgáló szójaalapú vagy L. campestris alapú termékek hasonlóak a közönségesen alkalmazott, állati eredetû termékeket tartalmazó tenyésztési tápközegekhez, kivéve, hogy lényegében az összes állati eredetû termék helyettesítve van növényi eredetû termékekkel. Például a szójaalapú fermentációs tápközegek tartalmazhatnak szójaalapú terméket, szénforrást, mint például glükózt, sókat, mint például NaCl¹ot és KCl¹ot, foszfáttartalmú alkotórészeket, mint például Na 2 HPO 4 ¹t, KH2PO4¹t, divalens kationokat, mint például vasat és magnéziumot, vasport és aminosavakat, mint például L¹ciszteint és L¹tirozint. A fermentációs (második) tápközegek beoltására szolgáló Clostridium botulinum tenyésztésére való tápközegek (azaz oltó vagy elsõ tápközeg) elõnyösen legalább egy szójaalapú terméket, sóforrást, mint például NaCl¹ot és szénforrást, mint például glükózt tartalmaznak. A találmány tárgyát képezi eljárás Clostridium botulinum növesztésére, amely maximalizálja a botulinum toxin termelését olyan tápközegek alkalmazásával, amelyek lényegében mentesek állati eredetû termékektõl. A Clostridium botulinum és botulinum toxin elõállításához való tenyésztés fermentációval történhet olyan tápközegben, amely az állati melléktermékekbõl származó alkotóelemeket helyettesítõ szója melléktermékeket tartalmaz. A fermentációs tápközeg beoltására szolgáló oltvány kisebb léptékû tenyésztõ tápközegbõl (oltótápközeg) származhat. A fermentációs lépés méretétõl és térfogatától függõen az oltótápközegben való egymást követõ tenyésztések száma változhat a biomassza növelése érdekében. A fermentációs tápközeg beoltásához megfelelõ mennyiségû Clostridium botulinum növesztéséhez az oltótápközegben egy vagy több lépést lehet végrehajtani. A Clostridium botulinum állati eredetû termékektõl mentes tápközegen való növesztéséhez elõnyös, ha a Clostridium botulinum növesztése állati termékeket nem tartalmazó tápközegen tárolt tenyészetbõl indul. A tárolt tenyészetet, amely elõnyösen liofilizált, szójából származó fehérjét tartalmazó és állati termékeket nem tartalmazó tápközegben való tenyésztéssel állítjuk elõ. A Clostridium botulinum fermentációs tápközegben való tenyésztése közvetlenül a tárolt, liofilizált tenyészet beoltásával történhet. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a Clostridium botulinum növesztése két fázisban történik – oltvány tenyésztés és fermentáció. Mindkét fázist anaerob körülmények között hajtjuk végre. Az oltás tenyésztési fázist általában a tárolt tenyészetbõl származó mikroorganizmus mennyiségének léptéknövelésére alkalmazzuk. Az oltás tenyésztési fázis célja a fermentációhoz elérhetõ mikroorganizmusok mennyiségének növelése. Emellett az oltás tenyésztési fázis lehetõvé teszi a tárolt tenyészetben lévõ viszonylag nyugvó mikrobák megfiatalítását és aktívan növekvõ tenyészetté való felnövését. Ezenfelül a fermentációs tenyészet beoltására alkalmazott életképes mikroorganizmusok térfogata és mennyisége pontosabban szabályozható az aktívan növekvõ tenyészettel mint a tá-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
rolt tenyészettel. Ily módon elõnyös a fermentációs tápközeg beoltására szolgáló oltótenyészet felnövesztése. Emellett a Clostridium botulinum mennyiségének léptéknövelésére szolgáló, oltótápközegben való tenyésztés bármilyen számú egymást követõ lépését alkalmazhatjuk. Megjegyezzük, hogy a Clostridium botulinum fermentációs fázisban való növesztése közvetlenül a tárolt tenyészetbõl is történhet közvetlen leoltással. A fermentációs fázisban a Clostridium botulinumot tartalmazó oltótápközeg egy részét vagy az oltótápközeg egészét alkalmazzuk a fermentációs tápközeg beoltására. Elõnyösen megközelítõleg a Clostridium botulinumot tartalmazó oltótápközeg 2–4%¹át alkalmazzuk a fermentációs tápközeg beoltására. Fermentációt alkalmazunk mikroba maximális mennyiségének elõállítására nagyléptékû anaerob környezetben [Ljungdahl és mtsai., „Manual of industrial microbiology and biotechnology” (1986), szerk.: Demain és mtsai., kiad.: American Society for Microbiology, Washington, D. C., 84. old.]. A botulinum toxint izolálhatjuk és tisztíthatjuk a szakember számára jól ismert fehérjetisztítási eljárások alkalmazásával (Coligan és mtsai. „Current Protocols in Protein Science”, kiad.: Wiley & Sons; Ozutsumi és mtsai. Appl. Environ. Microbiol. 49; 939–943. old., 1985). A botulinum toxin termeléséhez Clostridium botulinum tenyészeteit fermentációs tápközeg beoltására szolgáló oltótápközegben növeszthetjük. Az oltótápközegben való növesztés egymást követõ lépéseinek száma változhat a botulinum toxin fermentációs fázisban való termelésének léptékétõl. Azonban amint korábban tárgyaltuk, a fermentációs fázisban való növesztés közvetlenül a tárolt tenyészetbõl való leoltásból is indulhat. Az állati alapú oltótápközegek általában BHI-ból, baktopeptonból, NaCl-ból és glükózból állnak a Clostridium botulinum növesztéséhez. Amint korábban tárgyaltuk, alternatív oltótápközegeket elõállíthatunk a találmány szerint, amelyekben az állati alapú komponensek helyettesítve vannak nem állati alapú komponensekkel. Nem korlátozó példaként szójaalapú termékekkel helyettesíthetjük a BHI¹t és baktopeptont a Clostridium botulinum növesztésére és a botulinum toxin elõállítására szolgáló oltótápközegben. Elõnyösen a szójaalapú termék vízoldható és hidrolizált szóját tartalmaz, habár Clostridium botulinum tenyészetei növekedhetnek oldhatatlan szóját tartalmazó tápközegben is. Azonban a növekedés és az azt követõ toxintermelés szintje nagyobb az oldható szójatermékekbõl származó tápközegekben. Bármilyen szójaalapú terméket alkalmazhatunk a találmány szerint. Elõnyösen a szója hidrolizált szója. A hidrolizált szója számos kereskedelmi forrásból beszerezhetõ. Ezek nem korlátozó példái közé tartozik a Hy¹Soy (Quest International), Soy peptone (Gibco) Bac-soytone (Difco), AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7, SE50M (DMV International Nutritionals, Fraser, N. Y.) és SE50MK (DMV). Legelõnyösebben a hidrolizált szója forrása Hy¹Soy vagy
1
HU 008 417 T2
SE50MK. A hidrolizált szója más potenciális forrásai ismertek. A Hy¹Soy koncentrációja a találmány szerinti oltótápközegben 25–200 g/L közötti. Elõnyösen a Hy¹Soy koncentrációja az oltótápközegben 50–150 g/L közötti. Legelõnyösebben a Hy¹Soy koncentrációja ezekben az oltótápközegekben megközelítõleg 100 g/L. Emellett a NaCl koncentrációja 0,1–2,0 g/L. Elõnyösen a NaCl koncentrációja 0,2–1,0 g/L. Legelõnyösebben a NaCl koncentrációja az oltótápközegben megközelítõleg 0,5 g/L. A glükóz koncentrációja 0,1 g/L és 5,0 g/L közötti. Elõnyösen a glükóz koncentrációja 0,5–2,0 g/L közötti. Legelõnyösebben a glükóz koncentrációja az oltótápközegben megközelítõleg 1,0 g/L. Az is elõnyös de nem szükségszerû a találmány szerint, hogy a glükózt autoklávozással sterilizáljuk együtt a oltótápközeg többi komponensével. Az oltótápközeg elõnyös pH¹szintje a tenyésztést megelõzõen 7,5–8,5 közötti. Legelõnyösebben az oltótápközeg pH¹ja a Clostridium botulinum tenyésztését megelõzõen megközelítõleg 8,1. A Clostridium botulinum oltótápközegben való tenyésztése egy vagy több stádiumban mehet végbe. Elõnyösen az oltótápközegben való tenyésztés két stádiumban megy végbe. Az elsõ stádiumban Clostridium botulinum tenyészetét felszuszpendáljuk oltótápközeg egy mennyiségében és 34±1 °C¹on inkubáljuk 24–48 órán keresztül anaerob körülmények között. Elõnyösen az elsõ stádiumbeli tenyésztés megközelítõleg 48 órán keresztül tart. A második stádiumban a Clostridium botulinumot tartalmazó elsõ stádiumbeli tápközeg egy részét vagy egészét alkalmazzuk a második stádiumbeli oltótápközeg beoltására a további tenyésztéshez. A leoltás után a második stádium tápközegét 34±1 °C¹on inkubáljuk megközelítõleg 1–4 napon keresztül, szintén anaerob körülmények között. Elõnyösen a második stádiumbeli tenyésztés megközelítõleg 3 napon keresztül tart. Az is elõnyös, ha a bármelyik stádiumbeli oltótápközegben történõ növesztés nem eredményez sejtlízist a fermentációs tápközeg utolsó oltótápközeggel történõ végsõ beoltása elõtt. A Clostridium botulinum tenyésztésére szolgáló, állati melléktermékeket tartalmazó szokásos fermentációs tápközegek Mueller és Miller (MM; J. Bacteriol. 67:271. old., 1954) receptjén alapulhatnak. Az MM tápközegben található, állati melléktermékeket tartalmazó alkotóelemek a BHI és NZ¹CaseTT. Az NZ¹CaseTT peptidek és aminosavak kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ forrása, amely a kazeinek, az állati tejben található fehérjecsoport enzimatikus emésztésébõl származik. A találmány demonstrálja, hogy a nem állati alapú termékek helyettesíthetik a BHI¹t és NZ¹CaseTT¹t a fermentációs tápközegekben. Nem korlátozó példaként a szójaalapú termékek helyettesíthetik a Clostridium botulinum fermentálásra alkalmazott MM tápközegek állati alapú komponenseit. Elõnyösen a szójaalapú termékek vízoldhatók és hidrolizált szójából származnak, habár amint korábban tárgyaltuk, oldhatatlan szójatermékeket is alkalmazhatunk a találmány gyakorlatbavételéhez.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 10
2
Bármilyen szójaalapú terméket alkalmazhatunk a találmány szerint. Elõnyösen a hidrolizált szóját a Quest International (Sheffield) cégtõl szerezzük be, a Hy¹Soy kereskedelmi név alatt, vagy a DMV International Nutritionals (Fraser, N. Y.) cégtõl, a SE50MK kereskedelmi név alatt. Oldható szója termékeket beszerezhetünk más különbözõ forrásokból is, nem korlátozó példaként Soy peptone (Gibco) Bac-soytone (Difco), AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7 és SE50MK (DMV International Nutritionals, Fraser, N. Y.). A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módja szerint a Clostridium botulinum fermentálására alkalmazott tápközeg mentes állati melléktermékektõl, és hidrolizált szóját, glükózt, NaCl¹ot, Na 2 HPO 4 ¹ot, MgSO47H2O¹ot, KH2PO4¹ot, L¹ciszteint, L¹tirozint és porított vasat tartalmaz. Amint feltártuk az oltótápközeg esetében, a hidrolizált szója helyettesítheti az állati melléktermékeket a fermentációs tápközegben. Ezen állati melléktermékek közé tartozik a BHI és NZ¹Case TT (enzimatikusan megemésztett kazein). A Hy¹Soy koncentrációja a botulinum toxin termelésére alkalmazott fermentációs tápközegben elõnyösen megközelítõleg 10–100 g/L közötti. Elõnyösen a Hy¹Soy koncentrációja megközelítõleg 20–60 g/L közötti. Legelõnyösebben a Hy¹Soy koncentrációja a fermentációs tápközegben megközelítõleg 35 g/L. A botulinum toxin maximális termeléséhez a fermentációs tápközeg komponenseinek különösen elõnyös koncentrációi megközelítõleg 7,5 g/L, glükóz; 5,0 g/L NaCl; 0,5 g/L Na 2 HPO 4 ; 175 mg/L KH 2 PO 4 ; 50 mg/L MgSO47H2O; 125 mg/L L¹cisztein és 125 mg/L L¹tirozin. Az alkalmazott porított vas mennyisége 50 mg/L és 2000 mg/L között változhat. Elõnyösen a porított vas mennyisége megközelítõleg 100 mg/L és 1000 mg/L közötti. Legelõnyösebben a fermentációs tápközegekben alkalmazott porított vas mennyisége megközelítõleg 200 mg/L és 600 mg/L közötti. A toxintermelés optimális szintjéhez a szójaalapú fermentációs tápközegek kezdeti pH¹ja (az autoklávozás elõtt) elõnyösen megközelítõleg 5,5 és 7,1 közötti. Elõnyösen a fermentációs tápközeg kezdeti pH¹ja megközelítõleg 6,0 és 6,2 közötti. Amint az oltótápközeg esetben ismertettük, a fermentációs tápközeg komponenseit, beleértve a glükózt és a vasat, elõnyösen együtt autoklávozzuk a sterilizálás érdekében. Elõnyösen a Clostridium botulinum tenyésztésére alkalmazott második stádiumbeli oltótápközeg egy részletét alkalmazzuk a fermentációs tápközeg beoltására. A fermentáció anaerob körülmények között történik megközelítõleg 34±1 °C¹on megközelítõleg 7–9 napon keresztül. A növekedést a tápközeg optikai denzitásának (O.D.) mérésével monitorozzuk. A fermentációt elõnyösen azután állítjuk le, hogy a sejtlízis 48 órán keresztül zajlott, amint a növekedés (optikai denzitás) mérésével meghatározzuk. Ahogy a sejtek lizálnak, a tápközeg O. D. értéke csökken. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint Clostridium botulinum hosszú távú tárolására alkalmazott Clostridium botulinum tenyészeteket és az oltó-
1
HU 008 417 T2
tápközeg beoltására való oltványt szójatejben tenyésztjük és liofilizáljuk a 4 °C¹on való tárolást megelõzõen. Állati tejben tárolásra liofilizált Clostridium botulinum tenyészeteket is alkalmazhatunk botulinum toxin elõállítására. Azonban az állati termékektõl lényegében mentes tápközegek botulinum toxin-termelése folyamán történõ megtartása érdekében elõnyös, ha a Clostridium botulinum kiindulási tenyészete szójatejben van tartósítva, ás nem állati tejben.
5
10 Szabadalmi példák A következõ példák a találmány oltalmi körébe tartozó specifikus eljárásokat mutatnak be, és nem tekintendõk a találmány oltalmi körét korlátozónak. Clostridium botulinum tenyészeteket számos forrásból beszerezhetünk, beleértve a List Laboratories céget (Campbell, California). Minden kísérletet és tápközeget kétszer desztillált vízzel állíthatunk elõ. Az összes alábbi példában a „Clostridium botulinum” az A¹típusú Clostridium botulinum Hall A (ATCC száma 3502) törzsét jelenti. 1. példa Állati terméktõl mentes oltótápközeg elõállítása Clostridium Botulinum számára Kontroll oltótápközeget elõállíthatunk a következõ alkotóelemekbõl a tápközeg minden 1 literére: NaCl (5 g), Bacto-peptone (10 g), glükóz (10 g), BHI (1 literre), pH 8,1 (5 N NaOH-dal beállítva). Teszt (állati termékektõl mentes) oltótápközeget elõállíthatunk a következõ alkotóelemekbõl a tápközeg minden 1 literére: NaCl (5 g), Soy-peptone (10 g), glükóz (10 g), Hy¹Soy (35 g/liter, a tápközeg 1 literére kiegészítve), pH 8,1 (5 N NaOH-dal beállítva).
15
20
25
30
35 2. példa Clostridium Botulinum tenyésztése állati terméktõl mentes oltótápközegben Clostridium botulinum liofilizált tenyészetét felszuszpendálhatjuk 1. példa szerinti 1 ml kontroll és teszt oltótápközegben, eloszthatjuk (mindkét oltótápközeget) két csõbe, amelyek mindegyike 10 ml megfelelõ oltótápközeget tartalmaz, és azután 34 °C¹on körülbelül 24–48 órán keresztül inkubálhatjuk. Azután 1 ml tenyészetet alkalmazhatunk 40 ml (a megfelelõ) oltótápközeget tartalmazó 125 ml DeLong Bellco Culture Flask beoltására. A beoltott tenyészetet 33±1 °C¹on inkubálhatjuk 24 órán keresztül Coy Anaerobic Chamber (Coy Laboratory Products Inc., Grass Lake, Mich.) készülékben. 3. példa Állati terméktõl mentes fermentációs tápközeg elõállítása Clostridium Botulinum számára Alap fermentációs tápközeget elõállíthatunk a következõ alkotóelemekbõl a tápközeg minden 2 literére: glükóz (15 g), NaCl (10 g), NaH2PO4 (1 g), KH2PO4 (0,350 g), MgSO47H2O (0,1 g), cisztein¹HC (0,250 g), tirozin-HCl (0,250 g), porított vas (1 g), ZnCl2 (0,250 g) és MnCl2 (0,4 g).
2
Kontroll fermentációs tápközeget elõállíthatunk a következõ alkotóelemekbõl a tápközeg minden 2 literére: BHI (500 ml; ez megfelel körülbelül 45,5 gramm száraz tömegû szív fõzetnek), NZ¹CaseTT (30 g) és alaptápközeg (2 literre), pH 6,8. Elõször az alap fermentációs tápközeget állíthatjuk elõ és beállíthatjuk a pH¹ját 6,8 értékre. Azután preparálhatjuk a szarvasmarhaszív-fõzetet (BHI) és beállíthatjuk a pH¹ját 6,8 értékre 5 N NaOH-dal. Azután a BHI¹t hozzáadhatjuk az alap tápközeghez. Ezután az NZ¹CaseTT preparálhatjuk. A NZ¹Case TT¹t azután hozzáadjuk az alaptápközeghez, amelyhez a marhaszív fõzetet már hozzáadtuk, és feloldjuk HCl hozzáadásával. Azután beállíthatjuk a pH¹t 6,8 értékre 5 N NaOH-dal. Ez a tápközeg azután elosztható 8 ml¹es részekre 16 db 100 mm¹es tesztcsõ mindegyikébe, majd autoklávozhatjuk 25 percen keresztül 120 °C¹on. Teszt fermentációs tápközeget (állati termékektõl mentes) a kontroll fermentációs tápközegben található BHI-teszt nitrogénforrásra történõ cserélésével állíthatunk elõ. Az alkalmas teszt fermentációs tápközeg nitrogénforrások közé tartozik: Hy¹Soy (Quest), AMI-Soy (Quest), NZ¹Soy (Quest), NZ¹Soy BL4 (Quest), NZ¹Soy BL7 (Quest), Sheftone D (Sheffield), SE50M (DMV), SE50 (DMV), SE%) MK (DMV), Soy Peptone (Gibco), Bacto-Soyton (Difco), Nutrisoy 2207 (ADM), Bakes Nutrisoy (ADM) Nutrisoy flour, Soybean meal, BactoYeast Extract (Difco) Yeast Extract (Gibco), Hy¹Yest 412 (Quest), Hy¹Yest 441 (Quest), Hy¹Yest 444 (Quest), Hy¹Yest (455 (Quest) Bacto-Malt Extract (Difco), Corn Steep és Proflo (Traders). A teszt fermentációs tápközeget a kontroll fermentációs tápközegre fent ismertetett módon állíthatjuk elõ, kivéve, hogy a BHI¹t nem alkalmazzuk, és a megfelelõ nitrogénforrást elõször beállítjuk pH 6,8 értékre, 3 N HCl-dal vagy 5 N NaOH-dal. A tápközeg azután elosztható 8 ml¹es részekre 16 db 100 mm¹es tesztcsõ mindegyikébe, majd autoklávozhatjuk 20–30 percen keresztül 120 °C¹on.
40
45
50
55
60 11
4. példa Clostridium Botulinum tenyésztése állati terméktõl mentes fermentációs tápközegben A teszt oltótápközeges (állati termékektõl mentes) tenyészet 40 ml¹es részletét alkalmazhatjuk az egyes 8 ml¹es kontroll vagy teszt fermentációs tápközegek beoltására 8 ml 16×100 mm tesztcsövekben. Azután a tenyészeteket 33±1 °C¹on inkubálhatjuk 24 órán keresztül. Azután a csöveket anaerob kamrában inkubálhatjuk a baktérium növekedésének biztosítására. Mindegyik tápközeg vizsgálati eljárást három párhuzamosban végezhetjük (azaz ugyanazon tápközeg három független leoltásán), és egy nem leoltott kontrollt is vizsgálhatunk, amelyet vakként alkalmazhatunk a spektrofotométerben. A növekedést (optikai denzitással, OD meghatározva) mérhetjük minden 24 órában Turner Spectrophotometer (Model 330) készülékkel 660 nm¹en. A tenyésztést le kell állítani miután a sejtlízis körülbelül 48 órán keresztül tartott és azután mérhetjük a botulinum toxin-termelést.
1
HU 008 417 T2
További kísérleteket hajthatunk végre a Hy¹Soy fermentációs tápközeggel, amely a következõ alkotóelemeket tartalmazza a tápközeg minden 500 ml¹ére: Hy¹Soy (17,5 g), glükóz (3,75 g); NaCl (2,5 g); Na2HPO 4 (0,25 g), MgSO 4 7H 2 O (0,025 g), KH 2 PO 4 (0,0875 g), L¹cisztein (0,0625 g), L¹tirozin (0,0625 g), porított vas (0,25 g), pH=6,8. 5. példa Állati terméktõl mentes fermentációs tápközegben tenyésztett Clostridium Botulinum által termelt botulinum toxin meghatározása A 4. példában tenyésztett sejteket lecentrifugálhatjuk, és meghatározhatjuk a felülúszó pH¹ját. Egy adott mintában a botulinum toxin szintjét standard antitoxin hozzáadásával és a flokkulálódás elõtti idõ mérésével mérhetjük. Mind a Kf (a flokkuláció bekövetkezéséhez szükséges idõ, percekben), mind az Lf (a flokkuláció korlátja, ekvivalens 1 nemzetközi egység standard antitoxinnak, flokkulációval meghatározva) értéket meghatározhatjuk. 4 ml fermentációs táplét vehetünk egy adott tenyészet mindegyik fermentációs csövébõl, és kombinálhatjuk oly módon, hogy összesen 12 ml¹t összekeverünk egy 15 ml¹es centrifugacsõben. A csöveket lecentrifugálhatjuk 5000 rpm¹en (3400 g) 30 percen keresztül 4 °C¹on. A felülúszó 1 ml¹es aliquotjait hozzáadhatjuk 0,1–0,6 ml standard botulinum toxin antiszérumot tartalmazó csövekhez, és a csöveket óvatosan felrázhatjuk a tartalmuk összekeverésére. Azután a csöveket vízfürdõbe helyezhetjük 45±1 °C¹on, és rögzíthetjük a kezdési idõt. A csöveket gyakran ellenõrizhetjük, és Kf¹ként rögzíthetjük azt az idõt, amikor megkezdõdik a flokkuláció. A toxin koncentrációját abban a csõben, amelyben elõször kialakul a flokkuláció, LfFF-nek nevezhetjük. A toxin koncentrációját abban a csõben, amelyben másodszor kialakul a flokkuláció, LfF-nek nevezhetjük. Párhuzamos fermentációs, növekedési és toxintermelési vizsgálati eljárásokat hajthatunk végre a következõkre: (a) a kontroll oltótápközeg (amit a kontroll fermentációs tápközeg beoltására alkalmazunk) és a kontroll fermentációs tápközeg, és; (2) az (állati terméktõl mentes) teszt oltótápközeg (amit a teszt fermentációs tápközeg beoltására alkalmazunk) és az (állati terméktõl mentes) teszt fermentációs tápközeg. Szignifikáns módon meghatározható, hogy a Clostridium botulinum állati termékektõl mentes tápközegben történõ fermentációja, amely szintén állati termékektõl mentes tenyészetekbõl van leoltva (amelyben szójaalapú termékek helyettesítik az állati termékeket) megközelítõleg 50 vagy nagyobb Lftoxin-értéket eredményezhet. Minimálisan az Lftoxin-érték megközelítõleg 10. Elõnyösen az Lftoxin-érték legalább 20. Legelõnyösebben az Lftoxin-érték több mint 50. Emellett meghatározható, hogy a különféle szójatermékek támogatják a Clostridium botulinum növekedését BHI-tõl mentes fermentációs tápközegben. Ily módon oldható szójapreparátumok helyettesíthetik a BHI¹t Clostridium botulinum tenyésztésére. A legjobb koncentráció 12,5 vagy 25 g/L lehet. A Hy¹Soy (Shef-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 12
2
field) adhatja a legmagasabb növekedést. Az oldhatatlan szójatermékek kevésbé hatékonyak lehetnek. Ezenfelül olyan eredményeket érhetünk el, amelyek azt mutatják, hogy a Quest Hy¹Soy, DMV SE50MK és Quest NZ¹Soy hatékony szójatermékek lehetnek azon képességük tekintetében, hogy képesek helyettesíteni a BHI¹t Clostridium botulinum növesztésére. Az eredmények feltárhatják, hogy a szója termékek (mint például Quest Hy¹Soy, DMV SE50MK és Quest NZ¹Soy), amelyek optimálisak lehetnek a tenyésztésre, hatékonyak lehetnek a BHI-helyettesítésre a toxintermelésre is. A toxintermelésre legjobb szójatermék a Quest Hy¹Soy lehet 22,75 g/l koncentrációban. Ezen termék magasabb koncentrációi jobb növekedést eredményezhetnek, de nem javítják a toxintermelést. Javaslatunk szerint hasonló eredményeket érhetünk el SE50MK-val, amely esetében magasabb koncentráció megnövekedett növekedést hozhat létre, de nem növeli a toxintermelést. Másrészrõl az NZ¹Soy jobb növekedést adhat és magasabb toxintermelést a magasabb koncentrációjánál. Végezetül az is meghatározható, hogy a szójatermékek hatékonyan helyettesíthetik a BHI¹t, valamint a NZ¹CaseTT¹t. Az NZ¹CaseTT eltávolítása a szójaalapú tápközegekbõl 2–4-szeresre csökkentheti a növekedést. Az NZ¹CaseTT jelenlétében és hiányában történõ tenyésztésére legjobb szójatermék az SE50MK lehet. A HY¹Soy helyettesítheti a BHI és az NZ¹CaseTT¹t egyaránt a toxintermelésében. Azonban 1 vagy 2 napos hosszabb fermentációs ciklusra lehet szükség. A HY¹Soy helyettesítheti a BHI és az NZ¹CaseTT¹t egyaránt a toxin termelésére szolgáló tápközegekben. Azonban meghatározható, hogy az élesztõkivonatok gátolják a toxintermelést. Meghatározó, hogy a HY¹Soy 22,75 g/l koncentrációban teljesen helyettesítheti a BHI¹t és a HY¹CaseTT¹t egyaránt a toxintermelésében. Ellentétben a növekedésre gyakorolt hatással, ahol 56,88 g/l HY¹Soy lehet a legjobb, 34,13 g/l HY¹Soy lehet a legjobb a toxintermelési fázisban. Ily módon meglepõ módon meghatároztam, hogy a Hy¹Soy vagy [Hy-Soy+Hy-Yest] képes helyettesíteni a BHI¹t és Bacto-peptont a Clostridium botulinum oltvány tenyésztési tápközegeiben. Emellett tervezhetõk kísérletek az oltótápközegben lévõ komponensek optimális koncentrációjának meghatározására a Clostridium botulinum általi maximális mennyiségû botulinum toxin termeléséhez. A BHI-tól és NZ¹CaseTT-tõl mentes oltótápközegben és fermentációs tápközegben tenyésztett Clostridium botulinum toxin termelése elérheti vagy meghaladhatja a BHI¹t és NZ¹CaseTT¹t tartalmazó tápközegekben elért szintet. Meghatározható a Hy¹Soy vagy [Hy-Soy+Hy-Yest] optimális koncentrációja az oltótápközegben való növekedéshez. Kísérletekkel igazolható, hogy a Hy¹Soy helyettesítheti a BHI¹t és baktopeptont nitrogénforrásként a Clostridium botulinum növesztésére szolgáló oltótápközegben és azt követõen a botulinum toxin elõállítására szolgáló fermentációs fázisban. Továbbá az oltótápközegben nitrogénforrásként szolgáló Hy¹Soy,
1
HU 008 417 T2
összehasonlítva Hy¹Soy plusz Hy¹Yest-tel, botulinum toxin magasabb szintjét termelheti a késõbbi fermentációs lépésben. A Hy¹Soy oltótápközegbeli koncentrációja a toxin legjobb termelésére megközelítõleg 62,5 g/L és 100 g/L közötti. Az oltótápközegbeli Hy¹Soy optimális koncentrációjának meghatározására tervezett további kísérleteket a botulinum toxin Clostridium botulinum fermentációjával történõ maximális termelésére. Ily módon az oltótápközegben lévõ 30 g, 50 g, 75 g és 100 g Hy¹Soy mindegyike botulinum toxin-termelést eredményezett Clostridium botulinum fermentációjával, és ez összehasonlítható vagy meghaladja a nitrogénforrásként BHI¹t és Bactopeptont tartalmazó oltótápközegben termelt toxin mennyiségét. Az található, hogy az oltótápközegben lévõ 100 g/L Hy¹Soy-koncentráció eredményezte a toxintermelés legmagasabb szintjét a késõbbi fermentációs lépésben. Emellett az adatok arra utalnak, hogy a Hy¹Soy oltótápközeg az I¹es oltási lépésben nagyobb növekedést eredményezett 48 óra elteltével, mint 24 óra elteltével. Habár a találmányt bizonyos elõnyös eljárásokra hivatkozva mutattuk be részletesen, lehetségesek a találmány oltalmi körébe tartozó más megvalósítási módok, verziók és módosítások. Például a találmány tárgykörébe tartozik állati termékektõl mentes eljárások széles köre.
5
10
15
20
25
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 30 1. Eljárás biológiailag aktív botulinum toxin elõállítására, amely eljárás magában foglalja a következõ lépéseket: (a) olyan fermentációs tápközeg biztosítása, amely állati eredetû terméktõl mentes, amely fermentációs tápközeg hidrolizált szóját tartalmaz; (b) Clostridium botulinum baktérium tenyésztése a fermentációs tápközegben olyan körülmények között, amelyek lehetõvé teszik botulinum toxin termelését; és (c) biológiailag aktív botulinum toxin kinyerése a fermentációs tápközegbõl. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a tenyésztési lépésben a tenyésztés addig van végezve, amíg a tenyészet denzitása csökken a sejtlízis miatt. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a tenyésztési lépésben a tenyésztés legalább 48 órán keresztül
35
40
45
13
2
van végezve a tenyészet denzitásának sejtlízis miatti kezdeti csökkenése után. 4. Eljárás botulinum toxin elõállítására, amely eljárás magában foglalja a következõ lépéseket: (a) olyan elsõ tápközeg biztosítása, amely állati eredetû terméktõl mentes, és amely hidrolizált szóját tartalmaz; (b) Clostridium botulinum baktérium tenyésztése az elsõ tápközegben olyan körülmények között, amelyek lehetõvé teszik a Clostridium botulinum növekedését; (c) olyan második tápközeg biztosítása, amely állati eredetû termékektõl mentes, és amely hidrolizált szóját tartalmaz; (d) a második tápközeg beoltása az elsõ tápközeggel; (e) Clostridium botulinum baktérium tenyésztése a második tápközegben olyan körülmények között, amelyek lehetõvé teszik botulinum toxin termelését; és (f) a botulinum toxin kinyerése. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, ahol a Clostridium elsõ tápközegben való tenyésztésének lépésében a körülmények körülbelül 34 Celsius-fokos hõmérsékletet foglalnak magukban, és nem foglalják magukban a sejtdenzitás csökkenését a tenyésztés folyamán, ahol a második tápközeg elsõ tápközeggel való beoltásának lépésében az elsõ tápközeg 2–4%¹a van alkalmazva a második tápközeg beoltására, és ahol a baktérium második tápközegben való tenyésztésének lépésében a növekedést lehetõvé tevõ körülmények megközelítõleg 34 Celsius-fokos hõmérsékletet foglalnak magukban, továbbá tenyésztést addig, amíg a sejtdenzitás csökken a tenyésztés folyamán a sejtlízis miatt. 6. Készítmény, amely (i) Clostridium botulinumot és (ii) botulinum toxin termelésére szolgáló tápközeget tartalmaz, ahol a tápközeg állati eredetû terméktõl lényegében mentes, és hidrolizált szóját tartalmaz. 7. Eljárás állati terméktõl mentes gyógyászati készítmény elõállítására, amelyben a hatóanyag botulinum toxin, amely eljárás magában foglalja a következõ lépéseket: (a) biológiailag aktív botulinum toxin elõállítása az 1–5. igénypontok bármelyikében definiált eljárással; és (b) a botulinum toxin kiszerelése alkalmas excipienssel, ezáltal olyan állati terméktõl mentes gyógyászati készítményt állítva elõ, amelyben a hatóanyag botulinum toxin.
Kiadja a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
