(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000003689T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 003 689

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 35/68

(21) Magyar ügyszám: E 05 717409 (22) A bejelentés napja: 2005. 01. 13. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050717409 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1703914 A1 2005. 08. 11. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1703914 B1 2008. 04. 16.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 20040000260 2004. 01. 13.

(73) Jogosultak: Institut National de la Recherche Agronomique, Paris (FR); Centre National de la Recherche Scientifique, Paris (FR); Universite Francois Rabelais de Tours, Tours Cedex 1 (FR)

FR

(72) Feltalálók: Dubremetz, Jean-Francois, Montpellier (FR); Bout, Daniel, Cerelles (FR); Lebrun, Maryse, Jacou (FR); Crede, Odile, Montpellier (FR)

(2006.01) A61K 39/002 (2006.01) A61P 33/02 (2006.01) C12N 1/11 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05072754 PCT/FR 05/000074

(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest (54)

Sacrocystidae családba tartozó, inaktivált MIC1 és inaktivált MIC3 adhezint tartalmazó apicomplexa vonalak és vakcinaként történõ alkalmazásuk

(57) Kivonat

HU 003 689 T2

A találmány tárgyát képezik Sarcocystidae családba tartozó Apicomplexa attenuált mutáns törzsek, amelyek inaktivált MIC1 adhezint és inaktivált MIC3 adhe-

zint tartalmaznak, valamint azok vakcinaként történõ alkalmazása.

A leírás terjedelme 20 oldal (ezen belül 6 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 003 689 T2

A találmány tárgyát képezik Sarcocystidae családba tartozó Apicomplexák, például Toxoplasma és Neospora fajokhoz tartozó, attenuált, mutáns törzsek és azok vakcinaként történõ alkalmazása. Az Apicomplexák törzse[.1] (Apicomplexa ág) nagyszámú, elsõsorban intracelluláris (sejten belül élõsködõ) parazitafajt foglal magában. Ezek a paraziták olyan betegségekért felelõsek, mint például toxoplazmózis, malária, neosporózis, kokcidiózis és kriptosporidiózis. Közös jellemzõjük a gazdasejtek inváziójának jellegzetes, több szakaszból álló módja, amely során parazitofor vakuolum képzõdik, amelyben a parazita kifejlõdik [Menard és munkatársai: Cell Microbiol. 3, 63–73 (2001); Soldati és munkatársai: Int. J. Parasitol. 31, 1293–1302 (2001)]. A Toxoplasma gondii obligát (feltétlen) intracelluláris protozoon (egysejtû) parazita, amely emberi és állati toxoplazmózis kialakulásáért felelõs. A Sarcocystidae családba tartozik, amelybe további fontos emberi és állati kórokozók, így például a Neospora vagy Sarcocystis fajok is tartoznak [Levine: The Protozoan Phylum Apicomplexa, 1. kötet, CRC Press, Boca Raton, FL, 203 oldal (1988); Tenter és munkatársai: Int. J. Parasitol. 32 (5), 595–616 (2002)]. Életciklusa két, egymástól elkülönülõ szakaszt mutat: köztigazdában, például emberben, egérben, birkában és sertésben lezajló, „aszexuális” ciklust, amely során tachyzoiták, majd bradyzoitákat tartalmazó ciszták képzõdnek; valamint macskában egy „szexuális” ciklust, amely során a széklettel ürülõ, (sporozoitákat tartalmazó) oocysták képzõdnek. Az állatok toxoplazmózisa jelentõs gazdasági veszteséget okoz az állattenyésztési ágazatban. Minden haszonállatot érint. Az állatok fertõzõdése oocysták, egy rezisztens forma felvételével történik, amelyeket patogén toxoplazmával fertõzött macskák ürítenek a környezetükbe. Vemhességük alatt fertõzõdõ birkákban, kecskékben és sertésekben vetélést okoznak. Az Európai Közösségben, ahol a birkaállomány becsült egyedszáma 100 millió, évente 1 millió bárányt vesztenek el toxoplazmára visszavezethetõ vetélés miatt. Az emberi fertõzések legfõbb forrása például bradyzoitákkal fertõzött (elsõsorban bárány- és sertés¹) hús fogyasztása. A terhesség alatt történõ fertõzõdés miatt, a toxoplazmózis a veleszületett rendellenességek második leggyakoribb oka. Ezenkívül, az utóbbi húsz év során, ez a parazita opportunista kórokozóként tûnt fel, mint AIDS-betegek enkefalitiszének okozója. Apicomplexa parazitózisok ellen védelmet nyújtó vakcinák elõállítása számos kutatás célkitûzése volt. Két fõ stratégiát alkalmaztak: 1) olyan parazitaantigének azonosítását, amelyek képesek védelmet nyújtó immunválasz kiváltására, és ilyen antigének vakcinakészítményekben történõ alkalmazását; és 2) attenuált parazitatörzsek szelekcióját. Például toxoplazmózis esetében, a Toxoplasma gondii (US 5 045 313 és US 4 473 549 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások; US 2002/0164754 és GB 2 204 323 számú közzétételi iratok[.2]) különbözõ attenuált törzseinek az alkalmazását javasolták abból a célból, hogy emlõsökben Toxoplazmák elleni védelmet váltsanak ki.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

Napjainkban egyetlen, attenuált törzsön alapuló, toxoplazmózis elleni vakcina van kereskedelmi forgalomban. Ez a vakcina a TOXOVAX®, amely Toxoplasma gondii S48 törzsbõl származó, élõ tachyzoitákon alapul. A törzs attenuálásáért felelõs mutáció természete nem ismert. Apicomplexákkal, különösen Toxoplasma gondii organizmussal történõ fertõzés kulcsfontosságú lépése a parazita gazdasejtekhez történõ kötõdése, amelyet azok inváziója követ. Az Apicomplexák invazív eszköze két típusú szekréciós organellum, mikonemák és rhoptriák egymást követõ exocitózisa. Újabb kutatások bizonyítják a mikronemák gazdasejtek felismerésében és azokhoz történõ adhézióban betöltött központi szerepét. A mikronemák proteinjei, generikus nevükön „MIC” proteinek, a magasabb rendû eukarióták proteinjeinek adhéziós doménjaival homológ modulokat tartalmaznak [Tomley és Soldati: Trends Parasitol. 17, 81–88 (2001)]. Jelenleg a Toxoplasma gondii mintegy tucatnyi MIC proteinje ismeretes [Soldati és munkatársai: Int. J. Parasitol. 31, 1293–1302 (2001)]. Ezek közül néhány transzmembrán-protein, mint például Toxoplasma gondii esetében a MIC2, amelyet plasmodium esetében TRAP proteinnek hívnak [Matuschewski és munkatársai: EMBO J. 21, 1597–1606 (2002)]; mások oldható proteinek, amelyek a mikronemák felé irányulnak és az invázió során transzmembrán-proteinekkel kapcsoltan átrendezõdnek a parazita felszínén. A közelmúltban a T. gondii két, gazdasejtek felszínéhez kötõdni képes, oldható proteinjét, a MIC1 és MIC3 proteineket jellemezték [Achbarou és munkatársai: Mol. Biochem. Parasitol. 47, 223–233 (1991); Fourmaux és munkatársai: Mol. Biochem. Parasitol. 83, 201–210 (1996); Garcia-Reguet és munkatársai: Cell. Microbiol. 2, 353–364 (2002)]. A MIC1 protein tartalmaz egy tandem módon ismétlõdõ domént, amely távoli homológiát mutat a TSP¹1 típusú TRAP proteinnel, és laktózt kötõ specificitást mutat [Lourenco és munkatársai: Glycobiol. 11, 541–547 (2001)]. A MIC3 protein egy körülbelül 90 kDa molekulatömegû dimer, amelyet diszulfid-hidakkal összekapcsolt, két, 38 kDa tömegû alegység alkot. A MIC3 öt EGF típusú domént tartalmaz, amelybõl kettõ átfedi egymást, valamint tartalmaz egy „kitin kötõ domén” típusú domént, amely diszulfid-hidakban gazdag, és amely szükségesnek tûnik a gazdasejt felszínéhez való kötõdéshez [Garcia-Reguet és munkatársai: Cell. Microbiol. 2, 353–364 (2002); Cerede és munkatársai: EMBO J. 21, 2526–2536 (2002)]. A MIC1 és MIC3 kapcsolódnak más MIC proteinekkel, ezáltal két független komplexet képeznek, a MIC1/4/6 és MIC 3/8 komplexeket. A MIC6 és MIC8 transzmembrán-proteinek a transzporter szerepét játszák a MIC1/4 és a MIC3 megcélzásához a mikronemák irányába. A MIC1 protein elengedhetetlen ahhoz, hogy a MIC1/4/6 komplex elhagyhassa a szekréciós út korai kompartmentjeit [Reiss és munkatársai: J. Cell Biol. 152, 563–578 (2001)].

1

HU 003 689 T2

A közelmúltban kimutatták, hogy a Toxoplasma gondii eredetû MIC3 protein major vakcinaantigént képez, amely korai és nagyon erõs humorális választ vált ki [WO 01/64243 számú nemzetközi közzétételi irat]. A MIC1 és MIC3 proteineknek a Toxoplasma gondii virulenciájában és inváziós tulajdonságában betöltött szerepének vizsgálata során a Toxoplasma gondii olyan mutáns törzseit állítottuk elõ, amelyekben a MIC1 és MIC3 adhezinek közül az egyiket vagy mindkettõt inaktiváltuk. Megállapítottuk, hogy a MIC1 inaktiválása in vitro 50%-kal csökkenti az organizmus fibroblasztok irányába mutatott inváziós képességét, míg a MIC3 inaktiválása nem módosítja az inváziós tulajdonságot; a két protein egyidejû inaktiválása nem módosítja jelentõsen az inváziós tulajdonságot, a MIC1 protein egymagában történõ inaktiválásához képest. Az in vivo virulenciát a MIC1 és MIC3 külön-külön történõ inaktiválása csak kismértékben befolyásolja; ezzel szemben, a virulencia jelentõsen csökken a két protein egyidejû inaktiválásával. Ezen túlmenõen megállapítottuk, hogy a MIC1 és MIC3 proteineket felépítõ, major antigének hiánya ellenére, a Toxoplasma gondii kétszeres mutáns törzse, amelyben ezt a két proteint inaktiváltuk, lehetõvé teszi olyan, vakcinán alapuló védelem elérését, amely toxoplazmózis ellen hatékony. Ezt követõen, állatokon, közelebbrõl egereken és birkákon tanulmányoztuk a fenti törzs fertõzési és védõ jellemzõit. Így kimutattuk, hogy a fenti törzzsel történõ vakcinázás, a Toxoplasma gondii vad, patogén törzsével történõ ráfertõzõdés esetén megvédi az állatokat cerebralis ciszták kialakulásától; hogy jelentõsen enyhíti a vad kórokozóval történõ fertõzés lefolyását, hogy vemhes nõstényekben csökkenti a placentán át, magzatba történõ átjutás (transplacentaris passage) kockázatát, a vakcinázott állatok húsának a fogyasztása csökkenti a továbbterjedés (transzmisszió) valószínûségét, és ez idõvel lehetõvé teszi a fertõzés általános prevalenciájának a csökkenését. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezi Sarcocystidae családba tartozó Apicomplexa organizmus mutáns törzse, amely MIC1 adhezint inaktiváló mutációt tartalmaz, valamint MIC3 adhezint inaktiváló mutációt tartalmaz. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a fenti Sarcocystidae a Toxoplasma és Neospora organizmusok közül választatott. A találmány megvalósítási módjának egyik elõnyös elrendezése szerint a fenti mutáns törzs toxoplazma törzs, elõnyösen Toxoplasma gondii törzs. A leírásban alkalmazott kifejezések meghatározása: „MIC1 adhezint inaktiváló mutáció” kifejezés alatt minden olyan mutációt értünk, amely a MIC1 expresszálódásának a hiányát, vagy nem funkcionáló MIC1 protein expresszálódását eredményezi, azaz amely nem képes komplexet képezni a MIC4 és MIC6 proteinekkel, vagy nem képes laktózhoz kötõdni. „MIC3 adhezint inaktiváló mutáció” kifejezés alatt minden olyan mutációt értünk, amely a MIC3 exp-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2

resszálódásának a hiányát, vagy nem funkcionáló MIC3 protein expresszálódását eredményezi, azaz amely elvesztette a gazdasejt felszínéhez való kötõdés funkcióját. A MIC1 vagy MIC3 expresszálódásának a hiányát eredményezõ mutációkra példák a megfelelõ gén vagy kódolórégiójának vagy promoter régiójának a teljes deléciója. Nem funkcionáló MIC3 protein expresszálódását eredményezõ mutációkra példák a mic3 gén azon régióját érintõ mutációk, amelyek a „MIC3 protein kitinkötõ doménje” típusú domént, azaz a fenti protein 84–144. pozíciójú aminosavjait kódolják. Elsõsorban olyan mutációk alkalmazhatók elõnyösen, amelyek a MIC3 protein 126. pozícióban levõ triptofánját és 128. pozícióban levõ fenil-alaninját érintik. Ezek a mutációk elõidézhetõk klasszikus eljárásokkal, például inszertálással, deletálással vagy a kérdéses szekvenciában egy vagy több bázis helyettesítésével. Toxoplazmák esetében alkalmazható mutagenezis és transzformációs eljárások, anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk, például az alábbi szakirodalmi helyeken találhatók: [Kim és munkatársai: Science 262, 911–914 (1993); Donald és Roos: Mol. Biochem. Parasitol. 63, 243–253 (1994); Soldati és munkatársai: Mol. Biochem. Parasitol. 74, 87–97 (1995); Donald és Roos: Mol. Biochem. Parasitol. 91, 295–305 (1998)]. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti mutáns Apicomplexa törzs, elõnyösen toxoplazma törzs alkalmazása olyan vakcina elõállítására, amely alkalmas védõ immunitás kiváltására Apicomplexa parazitózis, elõnyösen toxoplazmózis ellen. A találmány tárgyát képezi továbbá vakcina, amely aktív hatóanyagként a találmány szerinti, fent ismertetett mutáns Apicomplexa törzset, elõnyösen toxoplazma törzset tartalmaz. A találmány jobban érthetõvé válik az alábbi, kiegészítõ ismertetés révén, amely olyan Toxoplasma gondii mutánsok elõállításának példáit ismerteti, amelyekben a MIC1 és/vagy MIC3 proteineket inaktiváltuk, valamint olyan kétszeres mutáns variáns vakcinaként történõ alkalmazását ismerteti, amelyben a MIC1 és MIC3 proteinek mindegyikét inaktiváltuk. Nyilvánvaló, hogy ezek a példák kizárólag a találmány tárgyát illusztrálják és semmilyen módon nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.

1. példa: Toxoplasma gondii MIC1 és/vagy MIC3 proteinek inaktiválása Alkalmazott plazmidok 50 A pmic3KO¹1 plazmidot alkalmaztuk a mic3KO egyszeres mutáns elõállítására az RHhxgprt– törzsbõl, és a pmic3KO¹2 plazmidot alkalmaztuk a mic1–3KO kétszeres mutáns elõállítására a mic1KO törzsbõl. 55 A pM3MIC3ty plazmidot alkalmaztuk a MIC3 expresszálódásának a helyreállításához a mic3KO mutánsban (mic3KO+MIC3 törzs), és a pM2MIC1myc+pM3MIC3 plazmidot alkalmaztuk a MIC1 és MIC3 expresszálódásának a helyreállításához a mic1–3KO kétszeres mu60 tánsban (mic1–3KO+MIC1–3 törzs). 3

1

HU 003 689 T2

Pmic3KO¹1 plazmid A Mic3[.3] gén (2136 bp) 3’UTR régióját PCR-eljárással amplifikáltuk pBlueMIC3 plazmidból [Cerede és munkatársai, (2002), fentebb idézve], amely a Toxoplasma gondii 2247 bp genomiális DNS-fragmensének (GenBank AJ 132530) az inszertálását eredményezte a pBluescript II®SK(–) plazmid NotI helyére. Az amplifikáláshoz az ML9: 5’TGTAAGCTTCAGCGAGTCTCTGAGAG¹3’ (1. azonosító számú szekvencia) és az ML10: 5’GGGTACCGAGCTCATGAGCAGAAGCTGCCAG¹3’ (2. azonosító számú szekvencia) láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk. Az amplifikált zónát a pminiHXGPRT plazmid [Donald és Roos, (1998), fentebb idézve] HindIII és KpnI restrikciós helyei közé klónoztuk. A Mic3 5’UTR régiójának 1977 bp méretû egyik DNS-fragmensét úgy állítottuk elõ, hogy a Mic3 géntõl 5’ irányban levõ 3,5 kb genomiális szekvencia EcoRI fragmensét XbaI/NheI emésztésnek vetettük alá, majd pminiHXGPRT plazmid XbaI helyére klónoztuk. Az így elõállított plazmidot, amely a Mic3 gén nyitott leolvasási keretét szegélyezõ 3’ és 5’ régióktól körülvéve[.5] HXGPRT (hipoxantin-xantin-guanin-foszforiboziltranszferáz) szelekciós markert hordoz, pmic3KO¹1 plazmidnak neveztük.

5

2

5¹’GCACAATTGAGATCTAAAATGCGAGGCGGGACGTCC¹3’ (5. azonosító számú szekvencia) láncindító oligonukleotiddal, ezáltal BgIII restrikciós helyet vittünk be, és ML15: 5’¹TGCTATGCATTCCTAGGCTGCTTAATTTTCTCACACGTCAC¹3’ (6. azonosító számú szekvencia) láncindító oligonukleotiddal, amely révén NsiI restrikciós helyet vittünk be.

pM2MIC1myc és pM3MIC3 plazmidok A pM2MIC1myc plazmid [Reiss és munkatársai: J. Cell Biol: 152, 563–578 (2001)] MIC1 proteint expresszál, amelyet C¹terminális végén myc epitóp jelöl, és amelynek az expresszálódása a Mic2 gént 5’¹ és 3’¹irányban szegélyezõ szekvenciák irányítása alatt áll. A pM3MIC3 plazmidot pBlueMIC3 vektor 2072 bp 15 méretû PvuI/SacI fragmensének klónozásával állítottuk elõ, amely vektor tartalmazza a Mic3 gént, valamint annak 5’¹ és 3’¹irányú szegélyezõ régióit, a pT/230TUB5/BLE vektor [Soldati és munkatársai: Mol. Bio20 chem. Parasitol. 74, 87–97 (1995)] SacI és PacI helyei között, amely vektor fleomicin szelekciós markert expresszáló expressziós kazettát tartalmaz. 10

A mic3KO és mic1–3KO mutáns törzsek, valamint mic3KO+MIC3 és mic1–3KO+MIC1–3 komplementer[.8] mutáns törzsek elõállítása Az Apicomplexák genomjának a proliferatív fázisban mutatott haploiditása lehetõvé teszi a Mic3 gén ki30 iktatását egyetlen homológ rekombinációval. Minden alkalmazott Toxoplasma gondii törzset humáneredetû fibroblaszt (HFF) sejtekben állítottuk elõ, amelyeket 10% magzati borjúszérummal („foetal calf serum”, FCS), 2 mmol/l glutaminnal, 50 E/ml penicillin35 nel és 50 mg/ml streptomicinnel kiegészített Dulbecco minimal (DMEM) tápközegben tenyésztettünk. Az organizmusokat a gazdasejtek lízise révén gyûjtöttük be. 25

pmic3KO¹2 plazmid A Mic3 gén fenti eljárással elõállított 3’UTR és 5’UTR régióit a pTUB/CAT [Kim és munkatársai, (1993), fentebb idézve] plazmidba inszertáltuk, a klóramfenikol-acetiltranszferáz (CAT) szelekciós markert kódoló szekvencia két oldalára, ugyanazon restrikciós helyekre, mint amelyeket a pminiHXPRT plazmid esetében ismertettünk. Az így kapott plazmidot, amely a Mic3 gén nyitott leolvasási keretét szegélyezõ 3’ és 5’ régióktól körülvéve[.6] CAT szelekciós markert hordoz, pmic3KO¹2 plazmidnak neveztük. pM3MIC3ty plazmid Ezt a plazmidot a pT8GFPPfmyoAtail plazmidból [Hetmann és munkatársai: MoI. Biol. Cell 11, 1385–1400 (2000)] állítottuk elõ, amelybe egy TY epitópot adtunk [Bastin és munkatársai: MoI. Biochem. Parasitol. 77 (2), 235–239 (1996)], az NsiI és PacI helyek közé. Ez a plazmid KpnI és EcoRI helyek között tubulin promotert, és az EcoRI és NsiI helyeket szegélyezõ, GFP¹t kódoló gént tartalmaz. A Mic3 (562 bp) promoter régiót PCR-eljárással amplifikáltuk a pBlueMIC3 plazmidból az ML23: 5’CTGAATTCAGATCTTACCAGTGTTGGACAAGG¹3’ (3. azonosító számú szekvencia) és ML24: GGGGTACCCCTTGCTAGGTAACCACTCGTGC¹3’ (4. azonosító számú szekvencia) láncindító oligonukleotidokkal, majd a tubulin promoter helyére inszertáltuk, a KpnI és EcoRI helyekre. Az ML24 láncindító oligonukleotid lehetõvé tette egy BgIII restrikciós hely bevitelét az EcoRI helytõl 5’ irányban és ezt követõen a Mic3 gén klónozását a GFP¹t kódoló gén helyére, a BglII és NsiI helyekre. A MIC3 proteint kódoló szekvenciát PCR-eljárással amplifikáltuk a pBlueMIC3 plazmidból az ML11:

40

45

50

55

60 4

mic3KO törzs A mutagenezishez alkalmazott törzs az RHhxgprt– [Donald és Roos, (1998), fentebb idézve] Toxoplasma gondii törzs volt, amely hipoxantin-xantin-guanin-foszforibozil-transzferáz (HXGPRT) génjében deficiens, és amely deficiencia érzékennyé teszi mikofenolsavra. Tisztított, majd KpnI kezeléssel linearizált pmic3KO plazmid 80–100 mg-ját adtuk CITOMIX elektroporációs közegben [Van den Hoff és munkatársai: Nucleic Acids Res. 20, 2902 (1992)] szuszpendált, 107 RHhxgprt – tachyzoitához, és az elektroporációt 4 mm¹es küvettában, 800 ml térfogatban végeztük, BTX Electrocell Manipulator készülékkel (paraméterek: 2 kV, R=48 Ohm). Az elektroporálást követõen, a tachyzoitákat HFFsejtek egyrétegû tenyészetére helyeztük. A mutánsok szelektálása céljából, az elektroporálás másnapján a tápközeget szelekciós ágenssel egészítettük ki (25 mg/ml mikofenolsav és 50 mg/ml xantin), és ebben a közegben három passzázst végeztünk. Öt nappal az utolsó passzázst követõen a parazitákat 96 vályulatú lemezen tenyésztett HFF-sejteken, ha-

1

HU 003 689 T2

tárhígításos eljárással klónoztuk, szelekciós ágens jelenlétében, és az így kapott klónokat felszaporítottuk. mic1–3KO törzs A mutagenezishez alkalmazott Toxoplasma gondii törzs a mic1KO[.9] törzs [Reiss és munkatársai: J. Cell Biol. 152, 563–578 (2001)] volt, amelyet a fent ismertetett RHhxgprt– törzsbõl származtattak úgy, hogy a Mic1 gént deletálták és a mic1KO törzsben a HXGPRT enzimet kódoló génnel helyettesítették. Tisztított, majd KpnI kezeléssel linearizált pmic3KO¹2 plazmid 80–100 mg-ját adtuk 107 mic1KO tachyzoitához, a fent ismertetett körülmények között végzett elektroporálás céljából. A mutánsokat a fentiek szerint szelektáltuk és klónoztuk, szelekciós ágensként 20 mmol/l klór-amfenikol jelenlétében. Azokat a mutánsokat, amelyekben a MIC3 proteint inaktiváltuk, mic3KO törzseknek neveztük, és amelyekben a MIC1 és MIC3 proteineket inaktiváltuk, mic1–3KO [.10]törzseknek neveztük.

5

10

15

20

mic3KO+MIC3 törzs A MIC3 expresszálódását a mic3KO parazitáknak pM3MIC3ty vektor 100 mg-jával és pTUB/CAT plazmid 25 10 mg-jával történõ kotranszfektálásával állítottuk helyre. A szelekciót a fentiek szerint, 20 mmol/l klór-amfenikol jelenlétében végeztük. A MIC3 proteinnel komplementált mic3KO törzset mic3KO+MIC3 törzsnek neveztük el. 30 mic1–3KO+MIC1–3 törzs A MIC1 és MIC3 expresszálódását a mic1–3KO parazitáknak pM2MIC1myc vektor 100 mg-jával és pM3MIC3 plazmid 10 mg-jával történõ kotranszfektálásával állítottuk helyre. A mutánsok szelekcióját és klónozását a fentiek szerint végeztük, szelekciós ágensként 10 mg/l fleomicin jelenlétében. A MIC1 és MIC3 proteinekkel komplementált mic1–3KO törzset mic1–3KO+MIC1–3 törzsnek neveztük. A mic3KO, mic1–3KO, mic3KO+MIC3 és mic1–3KO+MIC1–3 mutánsok összes proteinjét SDSPAGE és Western-blot-eljárásokkal vizsgáltuk. Miután az összes proteineket SDS pufferben történõ forralással kivontuk (0,1 mol/l DTT jelenlétében, vagy anélkül) és 10%¹os poliakrilamid-gélen elválasztottuk, a proteineket nitrocellulóz-membránra vittük át. A Western-blot-eljárással átvitt proteineket Garcia-Reguet és munkatársai [1998, fentebb idézve] által ismertetett eljárással hívtuk elõ, MIC3 elleni (T42F3, 1:400 hígítás) és MIC1 elleni (T101F7) monoklonális ellenanyag alkalmazásával, amit alkalikus foszfatázzal jelölt, egéreredetû ellenanyag elleni, kecskeeredetû IgG-vel (1:1000 hígítás) detektáltunk. Az eredményeket az 1. ábra szemlélteti. Az 1. ábra magyarázata: 1=Toxoplasma gondii RH vad törzs 2=mic3KO mutáns 3=mic3KO+MIC3 mutáns

35

2

4=mic1KO mutáns (Reiss és munkatársai, 2001) 5=mic1KO+MIC1 mutáns (Reiss és munkatársai, 2001) 6=mic1–3KO mutáns 7=mic1–3KO+MIC1–3 mutáns Az eredmények azt mutatják, hogy a MIC3 protein expresszálódása nem detektálható a mic3KO (2) és mic1–3KO (6) törzsekben, azonban helyreáll a mic3KO+MIC3 (3) és mic1–3KO+MIC1–3 (7) törzsekben. A MIC1 expresszálódása nem detektálható a mic1KO (4) és mic1–3KO (6) törzsekben, azonban helyreáll a mic1KO+MIC1 (5) és mic1–3KO+MIC1–3 törzsekben (7). Ezeket az eredményeket immunfluoreszcenciás vizsgálatokkal erõsítettük meg. A tachyzoitákat éjszakán át tenyésztettük egyrétegû HFF sejtkultúrán, PBS-ben mostuk, majd 20 percen át fixáltuk 4%¹os formalinnal. Három mosást követõen, a fertõzött HFF-sejteket PBSben oldott, 0,1%¹os Triton X¹100 reagenssel, 10 percen át permeabilizáltuk, a reakciót 10%¹os magzati borjúszérummal (FBS) állítottuk le, 30 percen át, majd a sejteket 2%¹os FBS-ben hígított primer ellenanyaggal inkubáltuk (TI01F7 MIC1 elleni mAb és T42F3 MIC3 elleni mAb), mostuk, és ezt követõen szekunder ellenanyaggal inkubáltuk (FITC¹el jelölt, egéreredetû ellenanyag elleni kecskeszérummal, és Texas-vörössel jelölt, nyúl elleni [.11]kecskeszérummal). A megfigyeléseket epifluoreszcenciás vizsgálatra felszerelt Leica DMRA2 mikroszkóppal végeztük és a képeket Princeton coolSnap CCD-kamerával rögzítettük. Az eredmények azt mutatják, hogy a mic3KO tachyzoitákban nem detektálható MIC3 protein, míg a komplementer törzsek (mic3KO+MIC3 és mic1–3KO+MIC1–3) mikronemáiban a vad típusú MIC3 expresszálódása figyelhetõ meg. A mic1KO+MIC1 és mic1–3KO+MIC1–3 törzsekben a MIC1 komplementáció a MIC1 protein bizonyos mértékû akkumulációjához vezet a parazitofor vakuolumokban és a perinukleáris térben.

2. példa: A MIC1 és/vagy MIC3 inaktiválásának hatása Toxoplasma gondii fertõzési tulajdonságaira Minden mutáns Toxoplasma gondii törzset humáneredetû fibroblaszt (HFF) sejtekben végzett, rendsze45 res passzálással tartottunk fenn, amely sejteket 10% magzati borjúszérummal („foetal calf serum”, FCS), 2 mmol/l glutaminnal, 50 E/ml penicillinnel és 50 mg/ml streptomicinnel kiegészített Dulbecco minimal (DMEM) tápközegben tenyésztettünk. 50 Inváziós tulajdonság mic1KO, mic1KO+MIC1, mic3KO és mic1–3KO [.12]törzshöz tartozó, tisztított, 2×10x5 tachyzoitát adtunk üveg-tárgylemezfedõkön tenyésztett HFF-sejtek55 hez. A sejteket 12 órán át fixáltuk, majd metilénkékeozin festék (RAL 555 reagenskészlet) alkalmazásával festettük, és véglegesen tárgylemezre helyeztük (PERTEX, Microm, Franciaország). Lemezenként 10, random kiválasztott látótérben megszámoltuk a parazita60 eredetû vakuolumokat, amelyek a parazita inváziós tu40

5

1

HU 003 689 T2

2

lajdonságára utalnak, és az adatokat 4 lemezen megfigyelt, látóterenként észlelt vakuolumok számának átlagával fejeztük ki, öt, egymástól függetlenül ismételt vizsgálat alapján. A kontrollvizsgálatot ugyanolyan körülmények mellett végeztük az RHhxgprt– törzzsel, amelynek az inváziós tulajdonsága hasonló volt a Toxoplasma gondii vad RH törzséhez. Az eredményeket a 2. ábra mutatja (***=szignifikáns mértékben csökkent invázió, p<0,001) Az eredmények azt mutatják, hogy a mic1KO paraziták inváziós tulajdonsága körülbelül 50%-kal csökken az RHhxgprt– kontrolltörzshöz képest. Ezzel szemben, a mic3KO paraziták és a kontrolltörzs inváziós tulajdonsága hasonló volt (2A. ábra). A mic1–3KO paraziták inváziós tulajdonsága nem tért el szignifikáns mértékben a mic1KO mutánsokétól (2A. ábra), ami arra utal, hogy a MIC1 és MIC3 proteineknek nincs additív szerepük fibroblasztok Toxoplasma gondii általi inváziójában. A mic1KO mutáns MIC1 proteinnel történõ komplementálása a kontrolltörzséhez hasonló szintre állítja vissza az inváziós tulajdonságot (2B. ábra).

Ezzel szemben, a mic1–3KO törzzsel fertõzött egerek esetében, majdnem teljes túlélés figyelhetõ meg (a fertõzést követõ 40. napon 90%¹os túlélés). A mic1–3KO mutáns MIC1 és MIC3 proteinekkel 5 történõ komplementálása (mic1–3KO+MIC1–3 törzsek) teljes mértékben helyreállítja a paraziták virulenciáját. Az egereket fertõztük továbbá a mic1–3KO kétszeres mutáns különbözõ mennyiségeivel, és a letális dó10 zist (LD 100) összehasonlítottuk a kontroll RHhxgprt– törzsével. Míg a kontrolltörzs 9. napi LD100 értéke 20 tachyzoita volt, a mic1–3KO törzs esetében ez az érték 2×103 nagyságrendû tachyzoita volt.

Virulencia A Toxoplasma gondii vad RH törzsébõl intraperitoneális úton beadott 20 tachyzoita által kiváltott fertõzést követõen az egerek általában 9 nap elteltével elpusztulnak. A mic1KO, mic3KO, mic1–3KO, mic1KO+MIC1, mic3KO+MIC3 és mic1–3KO+MIC1–3 mutánsok virulenciájának vizsgálatát OF1 hím egerek 10 egyedbõl álló csoportjain végeztük, egerenként 20 mic1–3KO tachyzoita intraperitoneális injektálásával, majd követtük a fertõzött egerek sorsát. A kontrollvizsgálatot ugyanolyan körülmények mellett végeztük OF1 hím egerek 9 egyedbõl álló csoportján, RHhxgprt– törzset alkalmazva, amelynek a virulenciája hasonló a Toxoplasma gondii vad RH törzséhez. Az eredményeket a 3. ábra szemlélteti. A 3A., 3B. és 3C. ábra magyarázata: =mic1KO törzs (A); mic3KO törzs (B); mic1–3KO (C) =mic1KO+MIC1 törzs (A); mic3KO+MIC3 törzs (B); mic1–3KO+MIC1–3 (C) =RHhxgprt– törzs (A, B és C) Az RHhxgprt– törzzsel megfertõzött egerek mindegyike elpusztult 9 nappal a fertõzést követõen. A mic1KO vagy mic3KO mutánsokkal fertõzött egerek mortalitása mérsékelten késleltetett volt (az egerek a fertõzést követõ 9–22. napon pusztultak el), ami nem volt megfigyelhetõ mic1KO+MIC1 és mic3KO+MIC3 komplementált mutánsokkal fertõzött egerek esetében. A mic3KO mutánssal fertõzött egerek egyetlen példánya a fertõzést követõ 44. napon múlt ki, és ez az állat specifikus ellenanyagválaszt mutatott Toxoplasma gondii ellen (nem ábrázolt eredmény). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Mic1 vagy Mic3 gének izolált inaktiválása a virulencia mindössze mérsékelt csökkenését váltja ki egerekben.

25

15

20

30

35

40

45

50

55

60 6

3. példa: A MIC3 protein adhéziós funkciójának a szerepe a Toxoplasma gondii virulenciájában A MIC3 adhéziós funkciójában szerepet játszó csoportok meghatározása Kimutatták [Cerede és munkatársai, (2002), fentebb idézve], hogy a MIC3 „kitin kötõ domén” típusú doménje elengedhetetlen a gazdasejt felszínéhez történõ kötõdéshez. Különbözõ mutációkat vittünk be ebbe a doménbe abból a célból, hogy meghatározzuk a MIC3 funkcionalitásához elengedhetetlen csoportokat. A bevitt mutációk az alábbiak voltak: – a ciszteincsoportok egyikének a szubsztituálása glicinnel a 102. pozícióban (C102G mutáns), 107. pozícióban (C107G) vagy a 108. pozícióban (C108G mutáns); – prolincsoport szubsztituálása alaninnal a 103. pozícióban (P103A mutáns); – a szerincsoportok egyikének a szubsztituálása alaninnal a 109. pozícióban (S109A mutáns) vagy 130. pozícióban (S130A); – a tirozincsoportok egyikének a szubsztituálása alaninnal a 96. pozícióban (Y96A mutáns), 135. pozícióban (Y135A mutáns) vagy 141. pozícióban (Y141A mutáns); – a fenil-alanin-csoportok egyikének a szubsztituálása alaninnal a 97. pozícióban (F97A mutáns), 121. pozícióban (F121A mutáns) vagy 128. pozícióban (F128A mutáns); – triptofáncsoport szubsztituálása alaninnal a 126. pozícióban (W126A mutáns). A mutációk pozícióját a MIC3 prekurzorának polipeptidszekvenciája alapján választottuk (Genbank CAB56644). A mutációkat irányított mutagenezissel végeztük, PCR-eljárással (Quickchange ® , Stratagene), a MIC3 érett formáját kódoló szekvencián, amelyet a pOC2 plazmid tartalmaz [Cerede és munkatársai, (2002), fentebb idézve]. Az így kapott plazmidokat pC102 (C102G mutáns), pC107 (C107G mutáns), pC108 (C108G mutáns), pP103 (P103A mutáns), pS109 (S109A mutáns), pS130 (S130A mutáns), pY96 (Y96A mutáns), pF97 (F97A mutáns), pF121 (F121A mutáns), pW126 (W126A mutáns), pF128 (F128A mutáns), pY135 (Y96A mutáns) és pY141 (Y141A mutáns) plazmidnak neveztük el.

1

HU 003 689 T2

A plazmidokat Qiagen kit® (Qiagen) alkalmazásával tisztítottuk és a várt mutációk jelenlétét szekvenálással erõsítettük meg. A mutáns MIC3 proteineket BHK¹21 („Baby Hamster Kidney”, ATCC CCL¹10) sejtek transzfektálásával expresszáltattuk, amely sejteket 5% FCS-sel, 2 mmol/l triptózzal, 100 E/ml penicillinnel és 100 mg/ml streptomicinnel kiegészített BHK¹21 tápközegben (GibcoBRL) tenyésztettünk. Minden egyes plazmid esetében, 3×105, elõzõleg 24 órán át, 24 vályulatú lemez vályulataiban, tárgylemezfedõn tenyésztett BHK¹21 sejtet transzfektáltunk a tisztított plazmiddal, Lipofectamine® alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint (Gibco-BRL). Az értékelés elõtt a sejteket további 24 órán át tenyésztettük. A mutáns MIC3 proteinek kötõdési tulajdonságait úgy tanulmányoztuk, hogy vizsgáltuk lokalizálódásukat a transzfektált BHK¹21 sejtekben. A transzfektált BHK¹21 sejteket 3% paraformaldehidet tartalmazó PBSsel fixáltuk 15 percen át, ezt követõen mostuk és 0,1% Triton X¹100 reagenst tartalmazó PBS-sel permeabilizáltuk, 10 percen át. A sejteket hordozó lemezeket újra mostuk 0,5% SAB reagenst tartalmazó PBS-sel, majd 1 órán át inkubáltuk ugyanebben a pufferben hígított MIC3 elleni (T82C10, 1:200) vagy V5 elleni (1:500) ellenanyaggal, majd ezt követõen 1 órán át TRITC reagenssel konjugált, kecskeeredetû IgG-vel (Sigma, 1:400), az egyes inkubációk közé számos, PBS-sel történõ mosást iktatva. A lemezeket ismét mostuk és mikroszkóptárgylemezekre helyeztük. A vizuális értékelést epifluoreszcens mikroszkóppal végeztük. A lokalizáció szerint négy mutáns kategóriát különböztettünk meg. Az elsõ kategóriában (C102G, C107G, C108G, Y141A, F121A) a protein a szekréciós rendszerben visszamarad; a második kategóriában (Y135A, Y96A, F97A, S109A, P103A) a protein normálisan szekretálódik és kötõdik a transzfektált sejtek felszínéhez, amint azt a vad típusú, érett MIC3 protein teszi; a harmadik kategóriában (W126A, Y128A) a protein normálisan szekretálódik, azonban nem kötõdik a transzfektált sejtek felszínéhez; a negyedik kategóriában (S130A) a protein normálisan szekretálódik és háló formájában kötõdik a sejtekrõl az üveglapra lerakódott sejtes anyagra. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy ciszteincsoportot érintõ minden mutáció a szekréció major hibáját váltja ki; a megfelelõ MIC3 protein mutánsok nagy, perinukleáris vezikulumok formájában akkumulálódnak, ami arra utal, hogy ezek a proteinek rosszul hajtogatódnak vagy felépítésük hiányos (nem teljes). Ez az eredmény összhangban van a ciszteincsoportoknak a domének hajtogatódásában betöltött szerepével. Ami a többi szubsztitúciót illeti, az F121A és Y141A jelû két mutáció szintén érinti a proteinek kijutását. A többi mutáns (Y135A, Y96A, F97A, S109A, P103A, W126A, F128A, S130A) mind dimer formában expresszálódik és szekretálódik. Közülük kettõ (W126A és Y128A) nem kötõdik a transzfektált BHK¹21 sejtekhez. A kötõdési tulajdonság elvesztése miatt, ez a két mu-

2

táns bõségesen szekretálódik a felülúszóba. Az S130A mutáns esetében a MIC3 elleni ellenanyaggal történõ jelölés nem a transzfektált sejtek plazmatikus membránjával asszociálódik, mint a vad típusú MIC3 esetében, ha5 nem az intercelluláris térrel, mintha az R¹MIC3 S130A protein a lemezre rakódott sejtes anyaghoz kötõdne. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a W126 és Y128 aromás csoportok részt vesznek a gazdasejt felszínén található receptorral való kölcsönhatásban, és 10 hogy az S130 csoport szintén hozzájárulhat a MIC3 kötõdési tulajdonságaihoz, amellyel részt vesz a kölcsönhatás specificitásában.

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 7

A W126 és Y128 csoportok szerepe a Toxoplasma gondii virulenciájában Abból a célból, hogy tanulmányozzuk a MIC3 adhéziós funkciójának a Toxoplasma gondii virulenciájában betöltött szerepét, komplementációs vizsgálatokat végeztünk a mic1–3KO kétszeres mutáns törzzsel és a W126A és F128A mutánsokkal. A pM3MIC3 plazmidból elõállítottuk a pM3MIC3W126A, pM3MIC3F128A és pM3MIC3Y135A plazmidokat. Ezek a plazmidok hordozzák a fleomicin szelekciós gént, és expresszálják a megfelelõ W126A, F128A vagy Y135A mutánst. A mutációk jelenlétét szekvenálással ellenõriztük. A mic1–3KO törzset pM3MIC3W126A (mic1–3KO+MIC3W126A törzs) vagy pM3MIC3F128A (mic1–3KO+MIC3F128A törzs) plazmiddal transzfektáltuk. A pozitív kötõdés kontrolljaként mic1–3KO+MIC3 törzset és pM3MIC3Y135A plazmiddal transzfektált mic1–3KO törzset (mic1–3KO+MIC3Y135A) alkalmaztunk. A MIC3 proteinek különbözõ törzsekben történõ expresszálódását Western-blot vizsgálattal, míg kötõdési tulajdonságukat sejtes blot vizsgálattal elemeztük. A sejtes blot vizsgálatot a Western-blot vizsgálathoz alkalmazott nitrocellulóz dupla lapjának az alkalmazásával végeztük, amelyet Mode¹K sejtek szuszpenziójával inkubáltunk [Vidal és munkatársai: J. Immunol. Methods 166, 63–73 (1993)]. A sejteket 5% FCS-sel, 25 mmol/l glutaminnal, 100 E/ml penicillinnel és 100 mg/ml streptomicinnel kiegészített RPMI tápközegben (Bio Whitaker) tenyésztettük. Az eredményeket a 4A. (Western-blot) és 4B. (sejtes blot) ábrák szemléltetik. Magyarázat a 4A. és 4B. ábrához: 1=Toxoplasma gondii RH vad törzs 2=mic1–3KO+MIC3 törzs 3=mic1–3KO+MIC3W126A törzs 4=mic1–3KO+MlC3F128A törzs 5=mic1–3KO+MIC3Y135A törzs A Western-blot vizsgálat eredményei minden törzsben mutatták a MIC3 proteinek expresszálódását. Mindegyik protein dimer esetében és redukáló körülmények mellett elvárt távolságra migrált. A W126A és Y135A proteinek azonban a többieknél gyorsabban migráltak, ami konformációbeli módosulásra utal. A sejtes blot vizsgálat a várt eredményt mutatta, a sejtek erõsen kötõdtek a natív MIC3 proteinhez (1),

1

HU 003 689 T2

MIC3myc proteinhez (2) és M1C3Y135A proteinhez (5). Ezzel szemben a sejtek nem kötõdtek a MIC3W126A proteinhez (3) és a MIC3F128A proteinhez (4). Másrészrõl a MIC3Y135A protein konformációbeli módosulása nem befolyásolta a kötõdési tulajdonságát. A mic1–3KO+MIC3W126A és mic1–3KO+F128A törzseket, valamint kontrollként a mic1–3KO+MIC3Y135A törzset alkalmaztuk a MIC3 adhéziós funkciójának virulenciában betöltött szerepének a vizsgálatára egerekben. A törzsek virulenciájának a vizsgálata A virulencia vizsgálatát a 2. példában ismertetettek szerint végeztük: az egyes paraziták 20 tachyzoita formáját intraperitoneális úton hím OF1 egerekbe injektáltuk (11–20 egyedbõl álló csoportokba), amelyeknek a túlélését 40 napon át követtük. Az eredményeket az 5. ábra szemlélteti. Az 5. ábra magyarázata: =mic1–3KO törzs =mic1KO törzs =mic1–3KO+MIC3 törzs O=mic1–3KO+MIC3Y135A törzs +=mic1–3KO+MIC3F128A törzs ×=mic1–3KO+MIC3W126A törzs Amint várható volt, a mic1–3KO+MIC3 parazitákkal fertõzött egerek ugyanúgy viselkedtek, mint a mic1KO törzzsel fertõzöttek, hasonló kinetika szerint hullottak el a 9–26. napon. A mic1–3KO+MIC3Y135A törzzsel fertõzött egerek túlélése jobb volt (ez tulajdonítható a MIC3Y135A protein részlegesen hibás címkézésének[.13] a parazitofor vakuolákban). Ezzel szemben a fertõzést követõ 40. napon a mic1–3KO+MIC3W126A törzzsel fertõzött egerek 83,3%¹os, a mic1–3KO+MIC3F128A törzzsel fertõzött egerek 95%¹os túlélését figyeltük meg. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a MIC3 protein gazdasejtekhez való kötõdési funkciója elengedhetetlen a parazita virulenciájához. 4. példa: Egerek vakcinázása mic1–3KO mutáns törzzsel Vizsgálati protokoll Kilenc és fél hetes életkorú, hím OF1 egerek csoportjait az alábbiak szerint kezeltük: – 21 egér (1. csoport) mic1–3KO mutáns törzset kapott; – 21 egérnek (2. csoport) mic1–3KO mutáns törzset adtunk be, majd körülbelül 1 hónap elteltével ráfertõztünk cisztogén Toxoplasma gondii 76k törzzsel; – 10 egeret (3. csoport) cisztogén Toxoplasma gondii 76K törzzsel fertõztünk, a 2. csoport ráfertõzésének az idõpontjában. A 0. napon (J0) az 1. és 2. csoport egyedeinek intraperitoneális úton a mic1–3KO mutáns 20 tachyzoita formáját adtuk be. A 14. napon az egerek fertõzõdését úgy ellenõriztük, hogy azokat Toxoplasma gondii elleni IgG jelenlétére vizsgáltuk, toxoplazma (RH törzs) teljes protein-kivonat alkalmazásával.

2

A 37. napon, a 2. csoport (8 egér) és a 3. csoport (8 egér) hatékonyan immunizált egyedeibe (toxoplazma elleni IgG jelenléte) Toxoplasma gondii 76K törzs 70 db. ciszta formáját adtuk be. A 61. napon az egerek mindhárom csoportját felál5 doztuk. Vizsgáltuk Toxoplasma gondii 76K fertõzésnek tulajdonítható, MIC3 elleni IgG jelenlétét (mivel a mic1–3KO vakcinatörzs nem expresszálja ezt a proteint), valamint cerebralis cisztákat számoltunk az ege10 rek homogenizált agyában (Malassez-kamrában; a detektálás alsó határa agyanként 30 ciszta). Tizenöt hetes életkorú hím OF1 intakt egerek 8 egyedbõl álló csoportjának a 2. csoport (kontroll a cerebrális paraziták hiányára) mind a 8 egyedébõl szár15 mazó agy egyharmadát adtuk be. Egy kontrollegér Toxoplasma gondii 76K törzs 60 darab ciszta formáját kapta, amelyet a 3. csoport (pozitív kontroll) egyik egyedébõl vettünk ki. A 82. napon, MIC3 elleni IgG jelenlétére vizsgáltuk 20 a 61. napon fertõzött egereket. A 103. napon az egereket feláldoztuk, és cerebrális cisztákat számoltunk. Eredmények 14. nap Az 1. és 2. csoportba tartozó 42 egérbõl 8 pusztult el a 10. nap elõtt, a fertõzés akut fázisában (ez az egerek fokozott érzékenységét tükrözi a mic1–3KO mutáns reziduális virulenciájával szemben). A fertõzés pa30 razitaantigének elleni IgG detektálásával történõ ellenõrzése azt mutatta, hogy 16 egér maradt negatív, azaz nem fertõzõdött. Az 1. csoport egyedszáma tehát 10¹re, a 2. csoporté 8¹ra csökkent. 25

61. nap MIC3 elleni IgG vizsgálata Az 1. csoport egereiben nem detektáltunk MIC3 elleni IgG¹t (negatív kontroll), míg a 3. csoport (pozitív kontroll) egereiben MIC3 elleni IgG jelenlétét állapítot40 tuk meg. MIC3 elleni IgG jelenlétét detektáltuk a 2. csoport egereinek a szérumában, egy egér kivételével, amely nagyon gyenge választ mutatott. 35

Cerebralis ciszták számolása Mikroszkópos vizsgálattal az 1. csoportba tartozó egerek agya nem tartalmazott cerebralis cisztákat (negatív kontroll), míg a 3. csoport egereinek az agya 2250–7250 cisztát, átlagosan agyanként 4037 cisztát tartalmazott (pozitív kontroll). A 2. csoport esetében, 50 7 egér nem hordozott cerebralis cisztát és egy egér agya 30 cisztát tartalmazott (egyetlen cisztát észleltünk 10 ml térfogatban végzett 16 számolással, Malassezkamrában). 45

82. nap Az intakt egerek, amelyek a 2. csoportba tartozó egerek agyát kapták, MIC3 elleni IgG¹t termeltek. A kontrollegerek, amelyek Toxoplasma gondii 76K törzs 60 db ciszta formáját kapták, amelyet a 3. csoport egyik 60 egerébõl vettünk ki, szintén mutattak MIC3 elleni IgG¹t. 55

8

1

HU 003 689 T2

103. nap Az intakt állatok, amelyek a 2. csoportba tartózó egerek agyát kapták, sorrendben 500, 375, 1000, 250, 165, 125, 310 és 375 cerebralis cisztát hordoztak. Összehasonlításul, a Toxoplasma gondii 76K törzs 60 darab ciszta formáját kapott kontrollegerek 2250 cerebralis cisztát hordoztak. Következtetés A mic1–3KO mutánssal immunizált egerek gyakorlatilag nem képeznek cerebrális cisztát Toxoplasma gondii 76K törzzsel történõ ráfertõzés során (99,9%¹os védettség). Ezzel szemben, számos ráfertõzött egér agya szájon át fertõzõképes, tehát a mic1–3KO vakcinatörzzsel történõ immunizálás ráfertõzés esetén nem teljesen sterilizáló hatású. 5. példa: Birkák vakcinázása mic1–3KO mutáns törzzsel Állatok Több mint 70, „déli pre-alpesi” fajtájú birka toxoplazma elleni immunstátusát mértük fel. Toxoplazmózissal szemben mutatott szeronegativitás szempontjából mindössze 36 állat bizonyult a vizsgálatra alkalmasnak. A birkákat mindvégig a nouzilly¹i (Indre-et-Loire) INRA telepen levõ zárt juhászatban tartottuk, hogy minél jobban csökkentsük a természetes fertõzõdés kockázatát. Hogy elkerüljük a környezet kontaminálódását, kizárólag a juhászat munkaruházatát viselõ, az állatokat ellátó és a vizsgáló személyzetnek volt bejárása a telepre, akik csak zuhanyozást követõen hagyhatták el a zárt zónát. Az alkalmazott eszközök és a biológiai maradványok nem távozhattak, amíg fertõtlenítõfürdõn nem haladtak át, és a híg trágyát elégettük. A vakcinázást követõen, az állatokat természetes ugratással tenyésztésbe vettük, miután hormonnal impregnált szivacs hüvelybe helyezésével ivarzásszinkronizáláson estek át. Toxoplasma gondii törzsek RH törzs Teljes parazita-kivonat („extrait total”, ET) elõállításához az RH (1¹es típusú) virulens törzset alkalmaztuk. Ezt a törzset nõstény OF1 egerekben történõ, egymást követõ passzálással tartottuk fenn, 106 tachyzoita intraperitoneális injektálásával. Három nap múlva az egereket feláldoztuk és a tachyzoitákat az intraperitoneális üreg 5 ml RPMI tápközeggel történõ átmosásával összegyûjtöttük. A tachyzoiták számolását Malassezkamrában végeztük, a törzs fenntartása céljából 106 tachyzoitát egészséges egerekbe intraperitoneálisan újra injektáltuk. Teljes parazita-kivonat elõállítása céljából az RH tachyzoitákat mostuk, háromszor 10 percen át, ultrahangos kezelésnek vetettünk alá (60 watt/mp.), majd centrifugáltuk (2000 g, 30 perc, 4 °C). A felülúszót koncentráltuk és kis adagokban szétosztottuk. A koncentrációt mérõkészlettel határoztuk meg (Micro BGA), amely standardként BSA¹t („bovine serum albumin”) alkalmaz. A szétosztott adagokat –20 °C¹on tároltuk.

5

10

2

mic1–3KO vakcinatörzs A mic1–3KO törzset a fenti 1. példa szerinti eljárással állítottuk elõ. A törzs fenntartása egymást követõ passzálásokkal történt, humán fityma eredetû fibroblaszt sejtvonalon (HFF), amelyet 10% FCS-sel, 50 mmol/l glutamáttal, 50 mmol/l penicillinnel és 50 mmol/l streptomicinnel kiegészített IMDM közegben tenyésztünk. PRU próbatörzs A birkák vemhességük félidejében történõ fertõzését II¹es típusú PRU törzs (Prugniaud törzs) 400 oociszta formájával végeztük, amelyeket fertõzött macskák székletébõl tisztítva állítottunk elõ.

Vizsgálati protokoll Vakcinázás A 36 szeronegatív birkát három, tucatnyi egyedbõl álló csoportra osztottuk: – kontrollcsoportra; – 105 mic1–3KO trachyzoitát kapott csoportra, 20 amelyet „kis dózisú csoportként (KO FA)” jelöltünk; – 2×106 mic1–3KO trachyzoitát kapott csoportra, amelyet „nagy dózisú csoportként (KO FO)” jelöltünk. A birkákat szubkután úton vakcináztuk. 25 15

Testhõmérséklet felvétele Az immunizálást követõen, naponta egyszer, reggelente feljegyeztük az állatok rektális testhõmérsékle30 tét mindaddig, amíg fiziológiás értéknél újra nem stabilizálódott. Birkáknál a fiziológiás testhõmérséklet 38,5 °C. Figyelembe véve a fizikai megerõltetést és a beavatkozások okozta stresszt, 40 °C fölötti testhõmérsékletet tekintettünk hipertermiának. 35 A humorális válasz vizsgálata A humorális immunválaszt úgy vizsgáltuk, hogy ELISA-eljárással értékeltük a Toxoplasma gondii elleni specifikus IgG megjelenésének a kinetikáját a szérum40 ban. Szérumok levétele A szérumokat az immunizálás elõtt (0. nap), majd a vakcinázást követõen a 24., 39., 98. és 134. napon vet45 tük le. A vért a vena jugularisból vettük le és a mintát (antikoaguláns nélkül) éjszakán át +4 °C¹on tartottuk, ami lehetõvé tette alvadék képzõdését. A szérumot a minták percenként 1500 fordulatszámon, +20 °C¹on, 50 10 percen át tartó centrifugálásával gyûjtöttük össze. A felülúszót 3 ml¹es mintákra osztottuk, és –20 °C¹on tároltuk. ELISA-vizsgálat A Toxoplasma gondii RH törzs teljes kivonatát, amelyet a fent ismertetett eljárással állítottunk elõ, alkalmaztuk lapos fenekû mikrotitrálólemezek (Nunc) vályulatainak az érzékenyítésére. Minden vályulatba 100 ml kivonatot mértünk be (10 ml/ml koncentrációban, 60 50 mmol/l karbonátpufferben hígítva, pH=9,6). Éjsza55

9

1

HU 003 689 T2

kán át, +4 °C¹on történõ inkubálást követõen, három mosást végeztünk 0,05% Tween¹20 reagenst tartalmazó PBS-pufferrel (PBS¹T), automata mosóberendezést alkalmazva (MultiWash Advantage). A nem specifikus kötõhelyeket 4% BSA¹t tartalmazó PBS-sel telítettük, 1 óra 30 percen át, 37 °C¹on (nedves környezetben). PBS¹T pufferben hígított szérumminták 100 ml¹ét (1/50 és 1/100 hígításokat) mértük a vályulatokba és 1 órán át, 37 °C¹on inkubáltuk. Két sorozatban végzett három mosást követõen, PBS¹T pufferben oldott, alkalikus foszfatázzal jelölt, birkaeredetû IgG elleni reagens (PAL; Sigma) 1/5000 hígításának 100 ml¹ét mértük be, és 1 óra 30 percen át 37 °C¹on inkubáltuk. Három újabb mosásból álló sorozatot követõen, az elõhívást DEA-HCl-ben oldott, 1 mg/ml paranitro-fenil-foszfát (PNPP) 100 ml-ével végeztük. A leolvasást 10–20 percnyi inkubálást követõen végeztük, lemezleolvasó készülék (Wallac 1420 Multilabel counter) alkalmazásával, l=405 nm hullámhosszon. A pozitivitás küszöböt a kontrollbirkák által mutatott abszorbanciaértékek (optikai denzitás, OD) függvényében határoztuk meg: 1/100 szérumhígításnál ezt 0,35 OD¹értéknél rögzítettük. Fertõzés A vakcinázást követõen, két hónap elteltével, az állatokat tenyésztésbe vontuk. A vemhesség félidejében a vemhes állatokat a PRU törzs 400 oociszta formájával fertõztük meg. A fertõzést követõ napokban, naponta felvettük a rektális testhõmérsékleteket, mindaddig, amíg a fiziológiás értékek vissza nem tértek, és az alábbiak szerint értékeltük a humorális és celluláris immunválaszt. Végül az ellések során feljegyeztük a lázzal járó és a fertõzéses vetéléseket. Eredmények Testhõmérsékletek felvétele az immunizálást követõen A különbözõ csoportokba tartozó birkák immunizálást követõ testhõmérsékleteinek az átlagát a 6. ábra szemlélteti. A kontrollcsoport testhõmérséklete fiziológiás maradt. Ezzel szemben, a két vakcinázott csoport esetében testhõmérsékleti csúcsot figyeltünk meg a 3. napon (40,5 °C); a FO csoport hõemelkedése elõbb jelentkezett (a 2. napon 40,1 °C), mint a FA csoporté (a 2. napon 39,5 °C). Az immunizálást követõ 4. nap után a hõmérsékletek visszatértek a fiziológiás értékekre. Az immunizálást követõ humorális válasz vizsgálata A különbözõ birkacsoportok szérumának 1/100 hígításával a 0., 24., 39., 98. és 134. napokon elvégzett ELISA-vizsgálatok eredményeinek az átlagát a 7. ábra szemlélteti. A kontrollcsoportba tartozó birkákban nem fejlõdött ki humorális válasz.

2

A 24. napra a FO és FA csoportba tartozó birkákban toxoplazma elleni IgG-válasz alakult ki. Megfigyeltük, hogy ez a válasz fennmaradt a vizsgálat végéig (134. nap). 5 A termékenyülés eredményessége A párzást követõen, az eredeti 36 birkából csak harminc lett vemhes. Minden csoportban két, nem vemhes állat fordult elõ. 10

15

20

25

30

A fertõzést követõ testhõmérsékletek vizsgálata A különbözõ csoportokba tartozó birkák fertõzést követõ testhõmérsékletének az átlagát mutatja a 8. ábra. A fertõzést követõen, minden birkánál hõemelkedést észleltünk. A kontrollcsoport esetében a lázgörbe csúcsa 5 napon át tartott, az 5–9. napokon, maximuma 41,5 °C volt, a 6. napon. A két vakcinázott csoport esetében a lázgörbe csúcsa 3 napon át tartott, a 4–6. napokon, maximuma 41,2 °C volt, az 5. napon. Abban az idõpontban, amikor a kontrollcsoportban a lázgörbe csúcsa volt megfigyelhetõ (6. nap), a KO FA és KO FO csoportokba tartozó birkák testhõmérséklete már leesett (40,0–40,5 °C¹ra), a kontrollbirkáknál megfigyelt csúcs a 7. napig tartott, majd fokozatosan csökkent a 9. napig, amely idõtartam alatt a megfigyelt átlagos hõmérséklet 40,5 °C volt (a Ko FA és KO FO csoportok esetében a 7–9. napok között 39,0 °C volt). A vakcinázott birkák lázgörbéjének a csúcsa elõbb jelenik meg, kevésbé húzódik el és maximuma alacsonyabb, mint a kontrollcsoporté.

Ellések és vetélések követése Elléskor az élõ vagy élettelen bárányokat azonosí35 tottuk és lemértük. Két típusú vetélést különböztettünk meg: – lázzal járó vetélés, oocisztákkal történt fertõzést követõ hõemelkedés miatt; – fertõzõ toxoplazmás vetélések, a magzatban fejlõdõ paraziták miatt. 40 Lázzal járó vetélések Ezek a vetélések közvetlenül a fertõzést követõ lázgörbe alatt történnek. Az eredményeket az alábbi 1. táblázat szemlélteti. 45 1. táblázat

50

Csoport

Kontroll

KO FA

KO FO

Lázzal járó vetélés

6/10

0/10

0/10

A kontrollcsoportban hat birka vetélt el a fertõzést követõ 15 nap alatt. Ezzel szemben, a vakcinázott birkák között nem észleltünk vetélést. 55 Toxoplazmafertõzés miatt bekövetkezõ vetélések Ezek a vetélések a vemhesség alatt következnek be, és okuk a parazita átjutása a placentán és a magzatban történõ fejlõdése. Általában a vemhesség vé60 gén figyelhetõ meg. 10

1

HU 003 689 T2

Az eredményeket az alábbi 2. táblázat szemlélteti. 2. táblázat Csoport

Kontroll

KO FA

KO FO

Fertõzéses vetélés

4/10

1/10

3/9

2

(T82C10) vagy MIC1 elleni (T101F7) monoklonális ellenanyagokkal, Toxoplasma gondii 76K törzzsel szájon át fertõzött egerek szérumával, vagy intakt egerek szérumával hívtuk elõ. Az eredményeket a 9. ábra szemlélteti. A 9. ábra magyarázata: (A) S48 tachyzoiták lizátu5 ma; (B) mic1–3KO tachyzoiták lizátuma. 1. csík: K76 elleni szérum; 2. csík: intakt egerek széruma; 3. csík: MIC1 elleni ellenanyag; 4. csík: MIC3 elleni ellenanyag. Az eredmények azt mutatják, hogy a mic1–3KO és 10 S48 törzsek nagyon eltérõ elektroforetikus profilokat mutatnak, és közelebbrõl azt, hogy a mic1–3 törzzsel szemben, az S48 törzs expresszálja a MIC1 és MIC3 proteineket.

Az eredmények interpretálása érdekében a KO FO csoportba tartozó egyik birkát kizártuk a vizsgálatból: valójában nehéz ellésen esett át, az egyik bárány életképes volt. Az anyja azonban nem törõdött vele, nem élt túl, ezért nem vettük figyelembe az eredmények értékelésénél. A kontrollcsoportban, a lázzal járó vetélést elkerülõ A mic1–3KO és S48 törzsek által kiváltott négy birka egyike sem hordta ki vemhességét és adott 15 vakcinázási védelem összehasonlítása életet életképes báránynak. A törzsek által kiváltott vakcinázási védelem értékeA kis dózisú csoportban (KO FA) a tízbõl egyetlen lésére a fenti 5. példa szerinti protokollt alkalmaztuk. birka vetélt el. Ebbõl a célból szeronegatív birkákat három csoA nagy dózisú csoportban (KO FO) kilenc birkában 20 portra osztottunk: 3 vetélést jegyeztünk fel. – 12 egyedbõl álló kontrollcsoportra; A vakcina általános védelmének a százalékos értékét – 13 egyedbõl álló csoportra (Toxo KO 1–3), amea (lázzal járó és fertõzéses) vetélések összes számának lyet 105 mic1–3KO tachyzoitával immunizáltunk; a függvényében értékeltük. Mivel az egyik birka két bá– 12 egyedbõl álló csoportra (Toxo S48), amelyet rányt ellett, amelybõl egy élt, ezt nem tartottuk számon a 105 S48 tachyzoitával immunizáltunk. vetélések között, mivel a vetélésre a fertõzésen kívül 25 A vakcinák injektálását követõen, az egyes csoporszámos hipotézis adhat magyarázatot: méhen belüli hely tokat az alábbiaknak tettük ki: hiánya a vemhesség alatt, az ellés után a bárány iránti – testhõmérsékletek felvétele az immunizálást köanyai érdeklõdés és gondoskodás hiánya; ezt a birkát tevetõen hát úgy tekintettük, hogy a vakcinázás megvédte. – humorális válasz követése ELISA-eljárással 30 3. táblázat – a vemhes állatok fertõzése 400 PRU oocisztával Csoport Kontroll KO FA KO FO – testhõmérséklet felvétele a fertõzést követõen – vetélések és ellések követése Vetélés 10 1 3 35 Birkák száma 10 10 9 Immunizálást követõ testhõmérsékletek Védelem százalé0% 90% 67% A különbözõ csoportokba tartozó birkák immunizákos aránya lást követõ testhõmérsékleteinek az átlagát a 10. ábra A KO FA csoport százalékos védettsége 90%, míg szemlélteti. a KO FO csoporté 67%. A kontrollcsoportnál nem volt 40 védettség. Immunizálást követõ humorális válasz A különbözõ birkacsoportok szérumának 1/100 híÉletképes bárányok gításával a 0., 24. és 39. napokon elvégzett ELISAKilenc vemhes birka hét életképes bárányt ellett a vizsgálatok eredményeinek az átlagát a 11. ábra szemnagy dózisú csoportban, szemben a tíz birka által ellett 45 lélteti. kilenc báránnyal a kis dózisú csoportban. A bárányok jó egészségben voltak, fejlõdési rendellenességet nem A termékenyülés eredményessége mutattak. Testtömegük 2200 és 5200 g közötti volt, A párzást követõen 11 kontrollbirka (az eredeti amely megfelel az idõre született bárány normáltöme12¹bõl), 12 ToxoKO birka (az eredeti 13¹ból) és gének (a vemhességi idõ 5 hónap). 50 12 Toxo S48 birka (az eredeti 12¹bõl) vemhesült. 6. példa: mic1–3KO törzs és S48 (TOXOVAX®) A fertõzést követõ testhõmérsékletek törzs összehasonlítása A különbözõ csoportokba tartozó birkák fertõzést mic1–3KO és S48 tachyzoiták követõ testhõmérsékletének az átlagát a 12. ábra muimmunelektroforetikus profiljának az 55 tatja. összehasonlítása A mic1–3KO és S48 tachyzoiták teljes proteinjét vizsA vetélések és ellések követése gáltuk nem redukáló körülmények mellett végzett SDSLázzal járó vetélések (a próbafertõzés PAGE és Western-blot vizsgálatokkal, amint azt a fenti 1. lázgörbéjének csúcsát követõ 1 héten belül) példában ismertettük. A Western-blot profilt MIC3 elleni 60 Az eredményeket az alábbi 4. táblázat szemlélteti. 11

1

HU 003 689 T2

2

4. táblázat

6. táblázat

Csoport

Kontroll

ToxoKO

S48

Lázzal járó vetélések

10/11

0/12

0/12

Csoport

5

Fertõzéses vetélések (a vemhesség utolsó 2 hete alatt) 5. táblázat 10 Csoport

Kontroll

ToxoKO

S48

Fertõzéses vetélés

1/11

4/12

4/12

Általános védelem Az eredményeket az alábbi 6. táblázat szemlélteti.

Kontroll

ToxoKO

S48

Vetélések száma

11

4

4

Vemhes állatok összesen

10

12

12

66,6%

66,6%

Védelem százalékos aránya

0%

A védelem százalékos aránya ToxoKO és S48 esetében egyaránt 66,6%¹os. A kontrollok esetében nem volt védelem. A mic1–3KO és S48 törzsek tehát hasonló szintû 15 védelmet biztosítanak.

Szekvencialista <110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE FRANCOIS RABELAIS DUBREMETZ, Jean-François BOUT, Daniel LEBRUN, Maryse SOÊTE, Martine CEREDE, Odile <120> SOUCHES VACCINALES D’APICOMPLEXES DE LA FAMILLE DES SARCOCYSTIDAE <130> MJPbv539/120 <150> FR04 00260 <151> 2004–01–13 <160> 6 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR láncindító: ML9 <400> 1

gtgtaagctt cagcgagtct ctgagag

27

<210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR láncindító: ML10 <400> 2

ggggtaccga gctcatgagc agaagctgcc ag

32 12

1

HU 003 689 T2

2

<210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR láncindító: ML23 <400> 3

ctgaattcag atcttaccag tgttggacaa gg

32

<210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR láncindító: ML24 <400> 4

ggggtacccc ttgctaggta accactcgtg c

31

<210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR láncindító: ML11 <400> 5

gcacaattga gatctaaaat gcgaggcggg acgtcc

36

<210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR láncindító: ML15 <400> 6

tgctatgcat tcctaggctg cttaattttc tcacacgtca c

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Apicomplexa Sarcocystidae családba tartozó mutáns törzse, azzal jellemezve, hogy MIC1 adhezin expresszálódásának a hiányát indukáló mutációt és MIC3 adhezin expresszálódásának a hiányát indukáló mutációt tartalmaz. 2. Az 1. igénypont szerinti mutáns törzs, azzal jellemezve, hogy a törzs toxoplazma törzs.

41

3. A 2. igénypont szerinti mutáns törzs, azzal jellemezve, hogy a törzs Toxoplasma gondii törzse. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti mutáns 55 törzs alkalmazása vakcina elõállítására. 5. A 4. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a vakcina toxoplazmózis elleni vakcina. 6. Vakcina, amely az 1–3. igénypontok bármelyike 60 szerinti mutáns törzset tartalmaz. 13

HU 003 689 T2 Int. Cl.: A61K 35/68

14

HU 003 689 T2 Int. Cl.: A61K 35/68

15

HU 003 689 T2 Int. Cl.: A61K 35/68

16

HU 003 689 T2 Int. Cl.: A61K 35/68

17

HU 003 689 T2 Int. Cl.: A61K 35/68

18

HU 003 689 T2 Int. Cl.: A61K 35/68

19

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest