!HU000007017T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 017
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 07 723032 (22) A bejelentés napja: 2007. 03. 03. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20070723032 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1991875 A1 2007. 09. 13. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1991875 B1 2009. 09. 23.
(51) Int. Cl.: G01N 33/68 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 07101631 PCT/EP 07/001844
(30) Elsõbbségi adatok: 102006010647 2006. 03. 06. DE (72) (73) Feltaláló és szabadalmas: Latza, Reinhard, Dr., 66386 St. Ingbert (DE)
(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
HU 007 017 T2
(54)
Vizsgálat patológiás prionok kimutatására
A leírás terjedelme 18 oldal (ezen belül 5 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 017 T2
A találmány tárgyát képezi eljárás patológiás prionfehérjék in vitro kimutatására egy próbában, valamint diagnosztikai reagenskészlet ezen eljárás kivitelezéséhez. Fertõzõ spongiform encephalopathiák („transmissiblen spongiformen Enzephalopathien”, TSE) vagy prionbetegségek az agy degeneratív betegségei, amelyek az agy jellegzetes, szivacsos szöveti elváltozását okozzák, és mindig halálos kimenetelûek. Prusiner elmélete szerint [Science, 216, 136–144 (1982)] ezen betegségek kórokozója egy kimutatható nukleinsav nélküli fertõzõ fehérje, a prion („proteinaceous infectious agent”, fehérjetermészetû fertõzõ ágens). Itt egy természetesen elõforduló fehérje, a sejtes prionfehérje (PrP C ) helytelenül hajtogatott formájáról van szó (PrPSc, Sc: „scrapie” surlókór). A kórokozó szaporodása a prionfehérje normál szerkezetének a helytelenül hajtogatott formává történõ átalakulása révén következik be, melynek fellépése fertõzéssel, illetve megbetegedéssel jár. Ezzel az elmélettel összhangban azok az egértörzsek, amelyekben a prionfehérje hiányzik, kísérletesen nem fertõzhetõk meg. Ennek következtében a TSE-kórokozókat gyakran prionoknak nevezik, és ezen betegségképek valamennyi formáját prionmegbetegedésekként foglalják össze. A spongiform encephalopathiák sok emlõsnél – az embert is beleértve – fordulnak elõ. Ember esetében a Creutzfeldt–Jakob-betegségrõl (CJK), a Gerstmann–Straussier–Scheinker-szindrómáról (GSS), a halálos családi inszomniáról (FFI), a kururól és a variáns Creutzfeldt–Jakob-betegségrõl van szó (vCJK). Legrégebben a juhok surlókórja („scrapie”) ismert. 1984-ben a kergemarhakórt (BSE, „bovine spongiforme Enzephalopathie”), 1996-ban pedig a variáns Creutzfeldt–Jakob-betegséget írták le. Azóta Nagy-Britanniában és más EU¹országokban több mint 180 000 marha betegedett meg kergemarhakórban (BSE), és ezeket az állatokat leölték. Németországban több mint 290 marhában mutatták ki a BSE¹t. 1993-ban elõször 2 fiatal, brit földmûves betegedett meg Creutzfeldt–Jakob-betegség (CJK) egy szokatlan formájában, amelyet 1996-ban új, variáns CJK-nak (vCJK) írtak le. A mai napig ennek a betegségnek több mint 100 ember esett áldozatul Nagy-Britanniában. Ma már biztosnak veszik, hogy BSE emberi kórformájáról van szó. A halálos kimenetelt tekintetbe véve, valamint az emberre történõ átvihetõségét, a hosszú inkubációs idõt és a terápia hiányát, a fertõzõ spongiform encephalopathiák diagnózisa igen nagy jelentõséggel bír. Ez idáig három BSE-gyorsteszt kapott EU¹jóváhagyást [EUROPEAN COMMISSION (1999) DIRECTORATE-GENERAL XXIV CONSUMER POLICY AND CONSUMER HEALTH PROTECTION Directorate B – Scientific Health Opinions The Evaluation of Tests for the Diagnosis of transmissible spongioform encephalopathy in bovines www.eu-komission.de]: – Prionics Check, amelyet eredetileg Prionics AG (Zürich, Svájc) fejlesztett ki, de 2001. február 1¹je óta a Roche Diagnostics terjeszti világszerte.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
A vizsgálat Western-bloton alapul, a vizsgálat idõtartama hét–nyolc óra. – Platelia” BSE-Test, amelyet a Bio-Rad Laboratories (USA) hoz forgalomba, és a Commission de L’Energie Atomique (Atomenergia Bizottság) (Franciaország) bizottsággal közösen fejlesztették ki. ELISA¹n alapul, a vizsgálat idõtartama négy–hét óra. – Enfer TSE az Enfer Technology cégtõl (Írország) ELISA-elven alapul, a vizsgálat idõtartama négy óra. Mind a három vizsgálatban PrP27–30 szakasz elleni, prionspecifikus ellenanyagokat alkalmaznak. Amennyiben PrPC¹t és PrPSc¹t proteolitikus Proteinase K enzimmel kezeljük, a PrPC teljes mértékben megemésztõdik, míg a PrPSc a szerkezeti eltérésbõl adódóan csak részlegesen emésztõdik. A Proteinase K¹rezisztens PrP27–30 fragmens megmarad, amely végül kimutatható. A Proteinase K¹val történõ emésztés további munkafázist kíván ezekben a vizsgálatokban, továbbá az enzim koncentrációjának és behatási idejének pontos ellenõrzését, azért, hogy hosszabb kezelés után a patológiás prionok is csaknem teljesen megemészthetõk legyenek. Mivel az emésztés elõször a mintában történik, és csak ezután történik a prionok specifikus kimutatása, ezek az eljárások veszítenek az érzékenységükbõl. Egy további közös tulajdonságuk: a vizsgálatok csak post mortem végezhetõk el, és az agytörzsbõl, amelyben különlegesen sok PrPSc-molekula halmozódik fel, egy grammnál kevesebb szövetre van szükség. Mindhárom tesztnek az egyik hátránya, hogy nem megfelelõ az érzékenysége. A betegségnek elõrehaladott állapotban kell lennie, ennek megfelelõen a BSE-prionok erõsebb felhalmozódásával azért, hogy egyértelmû vizsgálati eredményeket lehessen kapni. Ezért fordulnak a hivatalos hatóságok és intézmények gyanús esetekben vagy egy diagnózis megerõsítéseképpen más módszerekhez, mint például hisztopatológia és immunhisztokémia. Újabb technológiákat, mint például immun-PCR, specifikus ligandadszorpció és fluoreszcens korrelációs spektroszkópia (FCS) kutatnak, hogy a vizsgálati eredmények érzékenységét javítani tudják. Egy további eljárás a konformációfüggõ vizsgálat [„conformation dependent immunoassay”, CDI; Safar, J. és mtsai., Nature Medicine 4(10), 1157–1165 (1998], amely a PrPSc-molekula specifikus konformációján alapul, éspedig a monoklonális 3F4-ellenanyag részlegesen fedett kötõhelyén. A patológiás forma kimutatásához a natív és a denaturált (kihajtogatott PrP-molekula) minták közötti jelviszonyokat használja fel. Ezek a módszerek a minta további elõkezelését igényelik, és viszonylag idõigényesek. A kimutatási módszerek egy másik sorozatában valamilyen technikát alkalmaznak a mintában a patológiás prionok feldúsítására. Ezek közül egy eljárás a Soto által közölt PMCA („protein misfolding cyclic amplification”) eljárás (Serono cég; Castilla J és mtsai., Na-
1
HU 007 017 T2
ture Medicine Online Publication 28. 08. 2005). Ehhez PrPSc¹t PrPC feleslegével inkubálják, hogy a PrPScaggregátumokat felszaporítsák, amelyek az ezt követõ ultrahangkezelés során szétesnek, így új, kisebb aggregátumok képzõdnek. Ez utóbbiak szolgálnak „mátrixként” az új PrPSc-aggregátumok képzõdéséhez. Ezeket a ciklusokat többször megismétlik (akár 150-szer). A PMCA-eljárásnál legalább 75 óra szükséges a leírt érzékenység eléréséhez. Továbbá mátrixként hörcsögbõl származó agyszövetet adnak hozzá, és nem tudható, a fertõzés melyik fázisában vannak a vizsgált állatok. A plazmin szerinproteáz (elõnyös hasítási hely a Lys-Xaa>Arg-Xaa) egy plazminogén, egy mindenütt elõforduló zymogénprekurzor; szintetikus enzim, amely fontos szerepet játszik a fibrin oldható termékké történõ alakításában (fibrinolízis), és az extracelluláris mátrix (plazmin által indukált proteolízis) proteolitikus lebontásában. A közelmúltban leírták, hogy a plazmin képes PrPC¹t in vitro hasítani, és hogy PrPC és a PrP-molekula NH2-szakasza a t¹PA („tissue-type plasminogen activator”) közvetítette plazminképzõdést serkenteni tudja. Azt tapasztalták továbbá, hogy a plazmin elsõdleges hasítási helye a PrP-molekulán a 108–112 aminosavak közé esik. A plazminnak a prionfehérje patológiás formájával (PrPSc) szembeni aktivitásáról mindazonáltal további ismereteink nincsenek. Tehát ez idáig nem áll rendelkezésre rutinszerûen alkalmazható vizsgálati eljárás, amely révén egyértelmû, korai diagnózis alkotható élõ állatról vagy emberrõl az inkubációs idõ alatt, azaz a klinikailag észlelhetõ tünetek megjelenése elõtt. Szükség van tehát patológiás prionok kimutatásához egy gyorstesztre, amely a technika állása szerinti, az elõzõekben említett hátrányokat kiküszöböli. A találmány azon feladat megoldásán alapul, hogy a patológiás prionok kimutatásához kifejlesszünk egy vizsgálatot, amely magas fokú érzékenységgel bír, rövid idõ alatt és viszonylag kis költséggel, adott esetben automatizálva végrehajtható, és patológiás prionokat korai betegségstádiumban kimutatni képes, és amelynél Proteinase K kezelés nem szükséges. Ezekre és más, a szakember számára nyilvánvaló feladatokra a következõkben ismertetett találmány megoldást nyújt. Meglepõ módon azt tapasztaltuk, hogy prionfehérje patológiás formáját igen magas szelektivitással és viszonylag kis ráfordítással in vitro ki lehet mutatni egy próbában, amikor: a) a befogó („capture”) ellenanyagot, amely akár a prionfehérje patológiás formáját (PrPSc), akár a nem patológiás formáját ismeri fel, egy szilárd fázisra rögzítjük; b) a mintát az a) lépésbõl származó, rögzített ellenanyaggal inkubáljuk, ahol a prionfehérje patológiás és nem patológiás formája a rögzített ellenanyagon komplexképzés révén kötõdik; c) a mintát a képzõdött komplexektõl elválasztjuk; d) a komplexet plazminnal inkubáljuk, miközben a prionfehérje nem patológiás formája hasítódik;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
e) a plazminnal történõ inkubációval kapott hasítási fragmenseket a komplexektõl elválasztjuk; és f) a komplexekben lévõ, nem hasított prionfehérjét kimutatási ellenanyaggal kimutatjuk. A plazminnal történõ kezelés során, meglepõ módon, a prionfehérje nem patológiás formája hasad, míg a prionfehérje patológiás formája emésztetlenül marad. A patológiás formának ugyanaz az aminosavszekvenciája, mint a prionfehérje fiziológiás formájának, de attól eltérõ a térszerkezete. Azt tapasztalták, hogy a plazmin elsõdleges hasítási helye valamennyi vizsgált fajban a prionfehérje 106 és 126 aminosavai közötti területen található. A patológiás forma elsõdleges hasítási helye részben fedve, álcázva van („buried core”, fedett mag), és ezért a plazmin enzimaktivitása számára nehezen hozzáférhetõ. A fiziológiás forma jó hasíthatósága a patológiás forma nehezen hasítható voltához képest képezi az alapelvét az itt kifejlesztett eljárásnak, amely a két prionforma között különbséget tesz. A találmány szerint ezzel az eljárással patológiás prionfehérjéket mutatunk ki. A jelen alkalmazásban a következõk jelentése: PrP: prionfehérje általában, például amikor prionfehérje szerkezeti jellemzõire történik hivatkozás; PrPC: prionfehérje sejtes formája, tehát amely egészséges sejtekben található, a nem patológiás forma; és PrPSc: prionfehérje patológiás formája. Az eljárás számára vett minta lényegében bármilyen emberi vagy állati alanyból származhat, amelyrõl feltételezhetõ, hogy prionfehérje patológiás formája kimutatható benne. A minta származhat például emberbõl, marhából vagy hörcsögbõl. A minta élõ vagy halott alanyból vehetõ. Alapvetõen a minta számára kiindulási anyagként bármilyen folyékony vagy szilárd, az alany testébõl származó anyag szolgálhat, amely a prionfehérje patológiás formáját tartalmazhatja. Például a minta számára kiindulási anyag lehet vérminta, szövetminta vagy testfolyadék, mint vizelet, tej, nyirok vagy nyál. Szilárd mintáknál mindenekelõtt azonban szükséges lehet a kiindulási anyagot elõször is feltárni, hogy a prionfehérje patológiás formája a találmány szerinti eljárás számára alkalmas formában kerüljön. Ezek a feltárási eljárások a szakember számára már régóta jól ismertek. A találmány szerinti eljárásnál elõször is a befogó ellenanyagot egy szilárd fázishoz rögzítjük. A befogó ellenanyag képes mind a prionfehérje patológiás formáját (PrPSc), mind a nem patológiás formáját (PrPC) felismerni és megkötni. A befogó ellenanyag lehet például monoklonális vagy poliklonális. Alkalmas befogó ellenanyagok a hagyományos eljárásokkal saját részre elõállíthatók, vagy kereskedelmi forgalomban beszerezhetõk. Például befogó ellenanyagok lehetnek a SAF32 és SAF61 anti-PrP-ellenanyagok (Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Franciaország). Szilárd fázisként lényegében bármilyen szilárd anyag szolgálhat, amely a befogó ellenanyag rögzítését lehetõvé teszi, és amely a prionfehérje patológiás
1
HU 007 017 T2
formájának kimutatását nem akadályozza. Szilárd fázisként elõnyösen mikrotiterlemezek vagy mágneses, vagy nem mágneses gyöngyök alkalmazhatók. Mikrotiterlemez alkalmazása szilárd fázisként különösen elõnyös. A befogó ellenanyag rögzítése a szilárd fázison bármilyen, a szakember számára ismert módon történhet. A befogó ellenanyag közvetlenül a szilárd fázisra rögzíthetõ. Például a befogó ellenanyag kovalensen a szilárd fázishoz kapcsolható. Másrészrõl a befogó ellenanyag a szilárd fázis felületére adszorbeáltatható. Ehhez például a mikrotiterlemez egy üregének aljára pipettázzuk, és megfelelõ ideig (például legalább 16 órán keresztül), megfelelõ hõmérsékleten (például 4 °C¹on) inkubáljuk. Lehetséges továbbá a befogó ellenanyagot a szilárd fázishoz a szakember számára ismert biotin/avidin vagy sztreptavidinrendszerrel kapcsolni. Egy másik lehetõségként a befogó ellenanyag rögzítése egy áthidaló ellenanyagon keresztül is történhet, amely a befogó ellenanyagnak a szilárd fázishoz történõ kapcsolását közvetíti. Elõnyös azonban, ha a befogó ellenanyag közvetlenül a szilárd fázishoz van rögzítve. A rögzítést követõen a szilárd fázis szabad kötõhelyeit egy alkalmas blokkolópufferrel telítjük, amelynek egyedi alkotóelemei a szakember számára ismertek. Egy alkalmas blokkolópuffer például egy alkalmas pufferrendszerbõl és egy blokkolóreagensbõl, mint például BSA (marha-szérumalbumin) áll. A befogó ellenanyagnak a szilárd fázishoz történõ rögzítését követõen a mintával inkubáljuk. Ekkor kötõdnek meg a prionfehérje patológiás (PrPSc) és nem patológiás formái (PrPC) a rögzített befogó ellenanyagon. Az inkubáció annyi ideig tart, amely elegendõ, hogy a prionfehérje mindkét formája lehetõség szerint teljes mértékben megkötõdjön a befogó ellenanyagokon. Elõnyösen az inkubációs idõ 2 óránál nem több. Az inkubációt követõen a maradék mintát a szilárd fázisból, a befogó ellenanyagból és a prionfehérjébõl álló, képzõdött komplexektõl elválasztjuk. Amennyiben a szilárd fázis mikrotiterlemez, a minta eltávolítása például mosással történhet. Amennyiben gyöngyöket alkalmazunk szilárd fázisként, akkor a komplexeket tartalmazó gyöngyöket centrifugálással vagy mágneses gyöngyök esetében mágneses erõ hatására ülepítjük ki, és választjuk el a felülúszóban található mintától. Ezután a szilárd fázisból, a befogó ellenanyagból és a prionfehérje mindkét formájából álló komplexeket plazminnal keverjük. Ennek a lépésnek az a lényeges és meglepõ elv szolgál alapul, hogy a plazmin a prionfehérje komplexben lévõ nem patológiás formáját (PrPCm) specifikusan hasítja, míg a prionfehérje komplexben lévõ patológiás formáját (PrPSc) ezzel szemben nem hasítja. A prionfehérje nem patológiás formájának hasítását követõen a komplexek a szilárd fázist, a befogó ellenanyagot és a prionfehérje ép, nem emésztett patológiás formáját (PrPSc), illetõleg a prionfehérje nem patológiás formájának a befogó ellenanyag által kötött hasítási fragmensét tartalmazzák. A prionfehérje nem patológiás formájának azon hasítási fragmenseit,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
amelyek nincsenek a befogó ellenanyaghoz kötve, ebben a lépésben a komplextõl elválasztjuk. A PrPC hasítására alkalmazott plazminra nézve nincs további korlátozás azzal a kivétellel, hogy a prionfehérje nem patológiás formáját specifikusan hasítani legyen képes, míg a prionfehérje patológiás formáját nem. Lehet például rekombináns vagy natív plazmin. Továbbá a szakember számára ismert módon például plazminogénnek egy aktivátorral (például urokináz vagy sztreptokináz) történõ aktiválása útján állítható elõ, amely aktivátor például mátrixhoz kötött. Lehet humán eredetû plazmin vagy más fajokból származó plazmin. A szakember számára ismert, hogy a plazmin aminosavszekvenciájába mutációk vagy deléciók is bevihetõk, anélkül, hogy ez a plazmin találmány szerinti aktivitását befolyásolná. Az ily módon módosított plazmin is a találmány tárgykörébe tartozik. A prionfehérje nem patológiás formájának hasításához a plazmin elõnyösen oldatban található, amely egy fiziológiás puffert, például PBS¹t tartalmaz. A plazmin koncentrációját úgy választjuk, hogy elegendõ legyen a komplexekben lévõ prionfehérjék nem patológiás formájának hasítására a hasításhoz tervbe vett idõtartam alatt. A plazmin koncentrációja elõnyösen 10 nM és 2 mM között van, elõnyösebben 25 nM és 1 mM között, elõnyösebben 40 nM és 60 nM között. A komplexeknek plazminnal történõ inkubációs idejére nincs korlátozás. Elõnyösen az inkubációs idõ egyébként 30 percnél nem több. Egy elõnyös kiviteli mód szerint a prionfehérje nem patológiás formájának hasítását egy alkalmas reagens hozzáadásával, amely a plazmin aktivitását gátolja, leállítjuk. Elõnyösen aprotinint alkalmazunk. A plazmin aktivitását gátló reagenst szilárd vagy elõnyösen folyékony formában és a plazminaktivitás gátlásához elegendõ koncentrációban adjuk hozzá. Aprotinin esetében az elõnyös koncentráció 4 és 6 mM között van. Végül a prionfehérje nem patológiás formájának a plazminnal történõ inkubálással nyert hasítási fragmenseit, amelyek nincsenek a befogó ellenanyaghoz kötve a szilárd fázisból, a befogó ellenanyagból és a prionfehérje patológiás formájából (PrPSc) álló komplexektõl, illetõleg a prionfehérje nem patológiás formájának (PrPC) a plazminnal történõ hasítással keletkezett és a befogó ellenanyag által kötött hasítási fragmenseitõl elválasztjuk. Az elválasztás módját az alkalmazott kimutatási rendszerhez, mindenekelõtt az alkalmazott szilárd fázishoz igazítjuk. Sok esetben elõnyös a nem kötött PrPC hasítási fragmenseket egyszerûen mosással eltávolítani. A komplexekben nem kötött PrPC hasítási fragmensek eltávolítása után a komplexekben lévõ, nem hasított prionfehérjét mutatjuk ki kimutatási ellenanyaggal. A nem hasított prionfehérje esetében lényegében kizárólag prionfehérje patológiás formájáról van szó (PrPSc). Ennek kimutatására alkalmazandó kimutatási ellenanyagnak specifikusan PrPSc-hez kell kötõdnie. Mivel a prionfehérje nem patológiás formáját a komplexektõl lényegében teljes mértékben eltávolítottuk, ki-
1
HU 007 017 T2
mutatási ellenanyagként olyan ellenanyag is szóba jöhet, amely mind PrPSc¹t, mind PrPC¹t felismeri. A kimutatási ellenanyagok kimutatása valamilyen, a szakember számára ismert úton történik. A technika állása szerint számos alkalmas kimutatási eljárás ismert. Ezen technológiák egy, de nem kimerítõ készleteként például ELISA („enzyme-linked immunosorbent assay”), EtA („enzyme-linked immunoassay”), nanogyöngy-technológia (például európiummal jelölt nanogyönggyel), fluoreszcens („time-resolved” fluoreszcencia) és lumineszcens eljárások említhetõk. Elõnyösen a kimutatás a szakember számára ismert ELISA („enzyme-linked immunosorbent assay”) módszerrel történik. Például a kimutatási antigén biotinnal lehet konjugálva, és a kimutatása sztreptavidinpoliperoxidáz-konjugátummal történhet, amelyhez közvetlenül mérés elõtt egy aktivátort, például luminolt vagy TMB¹t (3,3’,5,5’-tetrametil-benzidin) adunk. Elõnyösen a biotin/sztreptavidin vagy avidinrendszerrel történõ kimutatás akkor történik, amikor a befogó ellenanyag már nincs ezzel a rendszerrel a szilárd fázishoz rögzítve. Például a találmány szerinti kimutatási ellenanyagok a biotinilált anti-PrP-ellenanyag SAF32 és SAF61 (Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Franciaország). A szakember számára ismert, hogy a kimutatási ellenanyagok egy kimutatási molekulával, egy kimutatásra alkalmas csoporttal vagy akár szilárd struktúrával (például mikrogyöngyökkel vagy nanogyöngyökkel, mint például európium-nanogyöngyök) konjugálhatók, hogy a kimutatást az elõbbiek egyikével vagy más, a technika állása szerint ismert kimutatási eljárásokkal lehetõvé tegye. Elõnyös lehet például olyan kimutatási ellenanyagokat alkalmazni, amelyek biotinnal vagy fluoreszcens jelöléssel konjugáltak (például fluoreszcein-izotiocianát vagy rodamin). A kimutatási ellenanyagok lehetnek például poliklonálisak vagy elõnyösen monoklonálisak. Alkalmas kimutatási ellenanyagok hagyományos eljárásokkal elõállíthatók, vagy kereskedelmi forgalomban beszerezhetõk. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a befogó ellenanyagot és a kimutatási ellenanyagot úgy választjuk, hogy a befogó ellenanyag a prionfehérje egy olyan epitópjára irányul, amely a plazmin elsõdleges hasítási helyétõl aminoterminálisan helyezkedik el, amikor a kimutatási ellenanyag a prionfehérje olyan epitópját ismeri fel, amely a plazmin elsõdleges hasítási helyétõl karboxiterminálisan helyezkedik el. Ennek megfelelõen az is elõnyös, hogy a befogó ellenanyag a prionfehérje olyan epitópjára irányul, amely a plazmin elsõdleges hasítási helyétõl karboxiterminálisan helyezkedik el, amikor a kimutatási ellenanyag a prionfehérje olyan epitópját ismeri fel, amely a plazmin elsõdleges hasítási helyétõl aminoterminálisan helyezkedik el. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a kimutatási ellenanyagot és a befogó ellenanyagot úgy választjuk, hogy a befogó ellenanyag a prionfehérje olyan epitópjára irányul, amely az 1–110 aminosavak területére esik, és a kimutatási ellenanyag olyan epitópra irányul, amely ezen a területen kívül esik, vagy a kimutatási el-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
lenanyag olyan epitópra irányul, amely az 1–110 aminosavak területére esik, amikor a befogó ellenanyag olyan epitópra irányul, amely ezen a területen kívül esik. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint a komplexekben lévõ, nem hasított prionfehérje kimutatása kvantitatív módon történik. Ez például úgy lehetséges, hogy amikor a prionfehérje kimutatására egy ELISA-vizsgálatot végzünk, amelynél a mért jelintenzitás arányos a mintában lévõ, kimutatott prionfehérje mennyiségével. Amennyiben a találmány szerinti eljárást például a mintákon duplikátban végezzük el, és az egyik mintát a prionfehérje nem patológiás formájának teljes hasításához elegendõ mennyiségû plazminnal inkubáljuk elegendõ ideig, például 30 percen keresztül 50 nM plazminnal, és a másik mintát nem kezeljük, akkor a kezelt minta jelintenzitásának a nem kezelt minta jelintenzitásához viszonyított aránya alapján megállapítható, hogy a prionfehérje teljes mennyiségének hasítása milyen mértékben történt meg. A találmány szerinti eljárás egy további elõnye lehet, hogy az eljárás egyes lépései közötti egy vagy több mosási lépés a szakember számára ismert, alkalmas mosópufferrel végezhetõ el. Ehhez elõnyösen fiziológiás pufferoldatokat, mint például PBS¹t vagy TBS¹t alkalmazunk, amelyek detergensekkel, például Tween-20-szal kiegészíthetõk. A találmány szerint a patológiás prionfehérjék kimutatására szolgáló, találmány szerinti eljárás kivitelezéséhez egy reagenskészlet is alkalmazható. A találmány szerinti reagenskészlet befogó ellenanyagot tartalmaz, amely mind a prionfehérje patológiás formája (PrPSc) ellen, mind a nem patológiás forma (PrPC) ellen irányul, továbbá plazmint és kimutatási ellenanyagot tartalmaz. A reagenskészlet ezen, a találmány szempontjából lényeges ismertetõit részletesen leírjuk. Például elõnyös lehet, amikor a befogó ellenanyag már egy szilárd fázison rögzítve van. Szilárd fázisként elõnyösen mikrotiterlemezek vagy mágneses, vagy nem mágneses gyöngyök szolgálhatnak. Egy megvalósítási mód szerint a reagenskészletben lévõ kimutatási ellenanyagok mind a prionfehérje patológiás formáját, mind a nem patológiás formáját felismerik. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a reagenskészletben lévõ befogó ellenanyag a prionfehérje olyan epitópjára irányul, amely a plazmin elsõdleges hasítási helyétõl aminoterminálisan helyezkedik el, amikor a kimutatási ellenanyag a prionfehérje egy olyan epitópját ismeri fel, amely a plazmin elsõdleges hasítási helyétõl karboxiterminálisan helyezkedik el. Egy másik lehetõségként elõnyös lehet, ha a befogó ellenanyag a prionfehérje olyan epitópjára irányul, amely a plazmin elsõdleges hasítási helyétõl karboxiterminálisan helyezkedik el, amikor a kimutatási ellenanyag a prionfehérje egy olyan epitópját ismeri fel, amely a plazmin elsõdleges hasítási helyétõl aminoterminálisan helyezkedik el. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint a reagenskészletben lévõ befogó ellenanyag a prionfe-
1
HU 007 017 T2
hérje olyan epitópjára irányul, amely az 1–110 aminosavak területére esik, amikor a kimutatási ellenanyag olyan epitópra irányul, amely ezen területen kívül esik. Más részrõl, a reagenskészletben lévõ kimutatási ellenanyag olyan epitópra is irányulhat, amely az 1–110 aminosavak területén belül van, amikor a befogó ellenanyag olyan epitópra irányul, amely ezen a területen kívül esik. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint a reagenskészlet tartalmaz továbbá egy blokkolópuffert is a szilárd fázison lévõ szabad kötõhelyek telítésére, egy mosópuffert és/vagy aprotinint. Egy további megvalósítási mód szerint a reagenskészletben lévõ plazmin vagy pufferoldatban oldott állapotban van, vagy liofilizált állapotban, szilárd formában van. Amennyiben a reagenskészlet aprotinint tartalmaz, ez ugyanúgy pufferoldatban oldva vagy liofilizált formában, szilárd állapotban lehet. A reagenskészletben lévõ oldatokhoz esetleges adalék anyagokat (például detergensek, blokkolóreagensek) szintén tartalmazhat a reagenskészlet. A találmány szerinti eljárással patológiás prionfehérjék korai betegségstádiumban mutathatók ki alacsony költséggel, és kis idõráfordítással, ugyanakkor magas specifitással és érzékenységgel, adott esetben egy automatizált vizsgálat keretében. Különbözõ fajokban kimutatható a PrPSc, mint emberben, hörcsögben vagy szarvasmarhában különlegesen magas érzékenységgel. Az ID50-dózis meghatározása [az a fertõzõ dózis, amely a kapcsolatba hozott állatok legalább 50%-ában megbetegedést okoz; Prusiner, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10(95), 13 363–13 383 (1998)] révén állapítható meg a patológiás prionok kimutatására szolgáló vizsgálat érzékenysége (minél alacsonyabb az ID50/mlérték, annál jobb a vizsgálat érzékenysége). A találmány szerinti eljárással 1000 lD50/ml-nél kisebb értékek is elérhetõk. Összehasonlításképpen a kereskedelmi forgalomban kapható vizsgálatok ID50/ml-értékei Prionics Check (ID50/ml: 1 000 000–100 000; mintaként BSE-homogenizátum; kimutatási határ 100–10–1 hígítás), Platelia® BSE- Test (ID50/ml: 3000; mintaként BSE-homogenizátum; kimutatási határ 10–2,5 hígítás) és Enfer TSA (ID50/ml: 30 000; mintaként BSE-homogenizátum; kimutatási határ 10–1,5 hígítás). A találmány szerinti eljárás a fiziológiás PrP-forma plazminnal való jól hasíthatóságán alapul a patológiás forma rossz hasíthatóságához viszonyítva. A PrPScmolekula specifikus hajtogatottsága, amely a plazmin elsõdleges hasítási helyét elfedi, és a plazmin szelektívebb enzimaktivitása teszi lehetõvé a két forma közötti különbségtételt a prion immobilizálását követõen. A plazmin alkalmazásának a Proteinase K¹val szemben az az elõnye, hogy csak a PrPC hasítódik, és nem teljesen emésztõdik meg, így az alkalmazott ellenanyagok épen maradnak. Az eljárás összesen mintegy 3,5 óráig tart, és nem kívánja a minta különleges elõkészítését, mint például a Platelia” BSE-Test-nél. Az Enfer-Testtõl eltérõen,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
ahol a prionok adszorpciója a mikrotiterlemezek felületére nem specifikusan történik, a prionok megkötése a kezdettõl fogva specifikus. A találmány szerinti eljáráshoz szükséges idõ egyértelmûen kevesebb mint a Prionics-Check esetében, ahol a kimutatás Western-blottal történik. A találmány szerinti eljárás kevésbé függ egy specifikus ellenanyagtípustól, és így rendkívül flexibilis: Mivel a plazmin a PrPC¹t lényegében két fragmensre hasítja, különbözõ ellenanyagok alkalmazhatók oly módon, hogy akár a PrP-molekula aminoterminális része, akár a karboxiterminális szakasza kimutatható. Továbbá a találmány szerinti eljárás minden más eddig ismert eljárással szemben a PrPC-hasítás kezdeti sebességének mérését is lehetõvé teszi. A találmány szerinti eljárás könnyen automatizálható, amely a mindennapi gyakorlatban való alkalmazása szempontjából kedvezõ. Az eljárás más, prion kimutatására szolgáló immunológiai eljárások érzékenységének fokozására is alkalmazható („enyhe” emésztés, amely által jobb a jel-zaj arány). A találmányt a következõkben példákkal szemléltetjük, amelyek azonban a találmányt nem korlátozzák. Az 1. ábrán a például szolgáló kísérletekben alkalmazott anti-PrP-ellenanyag epitópjait mutatjuk be. A 2. ábrán nem immobilizált prionfehérje humán eredetû plazminnal történõ in vitro hasítását mutatjuk be különbözõ plazminkoncentrációk függvényében. A jelmagyarázatban rhuPrP rekombináns humán eredetû PrP¹t jelent, huPrPC humán eredetû PrPC (szérum), ham-PrPC hörcsögbõl származó PrPC (agyhomogenizátum). Három független kísérlet középértékeit és standard eltéréseit ábrázoltuk. A mintának a plazminnal történõ, megadott inkubációs idõ utáni intenzitásának és a plazminnal való inkubáció nélküli intenzitásának százalékos arányát tüntettük fel. Valamennyi megadott értéket a háttérrel korrigáltunk. A 3. ábrán natív humán PrPC hasítását mutatjuk be humán eredetû plazminnal, mikrotiterlemezen történõ immobilizálást követõen. Befogó ellenanyagként SAF32¹t (a PrP-molekula 58 és 89 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) és kimutatási ellenanyagként biotinilált 3F4¹et (a PrP-molekula 108 és 111 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) alkalmaztunk. Különbözõ hígítású mintákat közvetlenül a lemezen kezeltünk plazminnal különbözõ inkubációs idõkkel, 37 °C¹on. A mintának a plazminnal történõ, megadott inkubációs idõ utáni intenzitásának és a plazminnal való inkubáció nélküli intenzitásának százalékos arányát tüntettük fel. Valamennyi megadott értéket a háttérrel korrigáltunk. A 4. ábrán natív, hörcsögbõl származó PrPC hasítását mutatjuk be humán eredetû plazmin-
1
HU 007 017 T2
nal, mikrotiterlemezen történõ immobilizálást követõen. Befogó ellenanyagként SAF32¹t (a PrP-molekula 58 és 89 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) és kimutatási ellenanyagként biotinilált 3F4¹et (a PrPmolekula 108 és 111 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) alkalmaztunk. Különbözõ hígítású mintákat közvetlenül a lemezen kezeltünk plazminnal, különbözõ inkubációs idõkkel, 37 °C¹on. A mintának a plazminnal történõ, megadott inkubációs idõ utáni intenzitásának és a plazminnal való inkubáció nélküli intenzitásának százalékos értékeit tüntettük fel. Az 5. ábrán natív PrPC (hörcsögbõl származó agyhomogenizátumból) hasítását mutatjuk be humán eredetû plazminnal, mikrotiterlemezen történõ immobilizálást követõen. Befogó ellenanyagként PRI308¹at (a PrP-molekula 106–126 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) és kimutatási ellenanyagként biotinilált SAF32¹t (a PrP-molekula 58–89 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) alkalmaztunk. A PRI308-epitóp tartalmazza a plazmin hasítási helyét, így a PrPC hasítása gátolt. A 6. ábrán olyan rekombináns humán PrP hasítását mutatjuk be humán eredetû plazminnal, mikrotiterlemezen történõ immobilizálást követõen, amely kicserélt lizineket tartalmaz a lizinklaszter 2¹ben (dLC2). A lizinklaszter 2 tartalmazza a PrP 101-tõl 110¹ig terjedõ aminosavait. Az itt lévõ lizineket a 101., 104., 106. és 110. helyzetekben alaninra cseréltük. Különbözõ mintakoncentrációkat vizsgáltunk. Befogó ellenanyagként SAF61¹et (a PrP-molekula 142–160 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) és kimutatási ellenanyagként biotinilált SAF32¹t (a PrP-molekula 58–89 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) alkalmaztunk. A mintának a plazminnal történõ, megadott inkubációs idõ utáni intenzitásának és a plazminnal való inkubáció nélküli intenzitásának százalékos értékeit tüntettük fel. Valamennyi megadott értéket a háttérrel korrigáltunk. A 7. ábrán olyan rekombináns humán PrP hasítását mutatjuk be humán eredetû plazminnal, mikrotiterlemezen történõ immobilizálást követõen, amely kicserélt lizineket tartalmaz a lizinklaszter 2¹ben (dLC2), és bPrP feleslegében [marhaeredetû („bovine”) PrP marhaagy-homogenizátumából]. Befogó ellenanyagként SAF61¹et (a PrP-molekula 142–160 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) és kimutatási ellenanyagként biotinilált SAF32¹t (a PrP-molekula 58–89 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) alkalmaztunk. A mintának a plazminnal történõ, megadott
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
inkubációs idõ utáni intenzitásának és a plazminnal való inkubáció nélküli intenzitásának százalékos értékeit tüntettük fel. Valamennyi megadott értéket a háttérrel korrigáltunk. A 8. ábrán hörcsög agyhomogenizátumából származó PrPSc hasítását mutatjuk be humán eredetû plazminnal, mikrotiterlemezen történõ immobilizálást követõen. Befogó ellenanyagként SAF61¹et (a PrP-molekula 142–160 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) és kimutatási ellenanyagként SAF32biotint (a PrP-molekula 58–89 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) alkalmaztunk. Surlókórral fertõzött állatok agyhomogenizátumából különbözõ hígításokat készítettünk. A mintának a plazminnal történõ, megadott inkubációs idõ utáni intenzitásának és a plazminnal való inkubáció nélküli intenzitásának százalékos értékeit tüntettük fel. Valamennyi megadott értéket a háttérrel korrigáltunk. Három független kísérlet középértékeit és standard eltérését ábrázoljuk. 9. ábra: PrPSc (hörcsög agyhomogenizátumából) humán eredetû plazminnal történõ hasítása natív PrPC feleslegében, mikrotiterlemezen történõ immobilizálást követõen. Befogó ellenanyagként SAF61¹et (a PrP-molekula 142–160 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) és kimutatási ellenanyagként biotinilált SAF32¹t (a PrP-molekula 58–89 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) alkalmaztunk. PrPC a PrP normál, sejtes formáját jelenti és PrPSc a PrP patológiás formáját. A surlókórral fertõzött hörcsög agyhomogenizátumát egészséges hörcsögök agyhomogenizátumával hígítottuk. Három független kísérlet középértékeit és standard eltérését ábrázoljuk. A mintának a plazminnal történõ, megadott inkubációs idõ utáni intenzitásának és a plazminnal való inkubáció nélküli intenzitásának százalékos értékeit tüntetjük fel. Valamennyi megadott értéket a háttérrel korrigáltunk.
1. példa: Nem immobilizált PrP hasítása plazminnal A kísérletek egyik sorozatában mind rekombináns, 50 humán eredetû PrP¹t (rhuPrP), mind natív PrPC¹t (humánszérum, hörcsög-agyhomogenizátum) hasítottunk in vitro plazminnal, ahol a plazminnal történõ emésztés kémcsõben történt, és a prionfehérjék az emésztés idõpontjában nem voltak immobilizálva. Rekombináns humán PrP¹t (rhuPrP), humán PrPC¹t 55 (szérum; huPrPC) és hörcsög-PrPC¹t (agyhomogenizátum; hamPrPC) 553–575 pg/ml végkoncentrációban (kalibrálás rekombináns humán PrP-vel; Roboscreen) inkubáltunk 30 percen keresztül, 37 °C¹on, különbözõ 60 koncentrációjú humán eredetû plazminnal, kémcsõ7
1
HU 007 017 T2
ben. Végül a reakciót aprotinin hozzáadásával állítottuk le, és a PrP¹t ELISA-val mutattuk ki. Befogó ellenanyagként SAF32¹t (a PrP-molekula 58 és 89 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) és kimutatási ellenanyagként biotinilált 3F4¹et (a PrP-molekula 108 és 111 aminosavai közötti epitópot ismeri fel) alkalmaztunk. Az ELISA-vizsgálathoz a mintát 1:5000 arányban reakciópufferrel hígított sztreptavidin-poliperoxidáz-konjugátummal (SApolyHRP, Pierce, Rockford, USA) összekevertük, és 20 percen keresztül szobahõmérsékleten inkubáltuk. Végül TMB¹t (3,3’,5,5’-tetrametil-benzidin) adtunk szubsztrátként a mintához, és 30 percen keresztül inkubáltuk. A leállítóoldat hozzáadását követõen (0,25% H2SO4 desztillált vízben) a minta elnyelését 405 nm¹nél ELISA-olvasóval értékeltük (Tecan Genios; Tecan, Svájc). A kimutatási ellenanyag epitópja éppen a prionfehérje elsõdleges hasítási helyében található, így csak a mintában lévõ, nem hasított prionfehérjék mutathatók ki ELISA-val (1. ábra). Kimutatható volt, hogy natív PrPC in vitro hasítása a mintában lévõ plazmininhibitorok jelenlétében csak nehezen ellenõrizhetõ, amikor az emésztés egy kémcsõben a prionfehérjék elõzetes immobilizálása nélkül történt. Rekombináns humán PrP kémcsõben történõ szignifikáns hasításához körülbelül 200 nM plazminkoncentráció szükséges, míg humán PrPC és hörcsögPrPC ugyanilyen mértékû hasítása csak 1 mM-nál magasabb plazmakoncentrációval volt elérhetõ (2. ábra). Ennek alapján olyan vizsgálatot fejlesztettünk ki, ahol a mintában lévõ prionokat elõször monoklonális ellenanyag segítségével immobilizáljuk, majd humán eredetû plazminnal kezeljük, és a maradék, nem hasított prionokat végül egy másik, jelölt ellenanyaggal kimutatjuk. Mivel a mintát a plazminnal történõ emésztés elõtt a rögzített ellenanyagból és a prionfehérjékbõl álló komplexektõl elválasztjuk, a mintában lévõ plazmininhibitorok vagy plazminszubsztrátok a plazmin aktivitását az emésztés során nem gátolják vagy befolyásolják. 2. példa: Immobilizált PrP hasítása plazminnal További vizsgálatokban a PrP plazminnal történõ hasítását mikrotiterlemezeken rögzített ellenanyagokkal történõ immobilizálást követõen végeztük (3. ábra és 4. ábra). Ehhez mind olyan ellenanyagot alkalmaztunk, amely PrP-molekula különbözõ epitópjára irányul (1. ábra; 5. ábra), mind pedig olyan rhuPrP¹t, amelynél a plazmin hasítási szakaszában lévõ lizinek alaninra voltak cserélve (6. ábra és 7. ábra). 2.1 példa: Humán eredetû plazmából vagy hörcsög agyhomogenizátumából származó, immobilizált PrPC hasítása Humán eredetû plazmából származó, immobilizált PrPC hasításához három, átlátszó mikrotiterlemezt (Lumi-Nunc Maxi-Sorp F96; Nunc, Wiesbaden) cellánként 100 ml monoklonális ellenanyaggal rétegeztünk (antiPrP; SAF32, Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Franciaország; koncentráció: 1 mg/ml karbonát/bikarbonát puf-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
ferben, pH 9,0, Perbio, Bonn) 16–18 órán keresztül, 4 °C¹on. A maradék folyadékot leszívtuk, és a szabad kötõhelyeket minden cellához 100 ml blokkolópuffer (Superblock, Perbio, Bonn) hozzáadásával, 1 órán keresztül telítettük. A blokkolópuffert a lemezekrõl leszívtuk, és a mintákat a lemezekre pipettáztuk (összegyûjtött, humán eredetû, citrátos plazma, a reakciópufferrel: 1 rész blokkolópuffer+4 rész PBS megfelelõen hígítva). Szobahõmérsékleten, kétórás inkubációt követõen a lemezeket háromszor mostuk mosópufferrel [0,5% Tween20-szal (Surfact-Amps, Pierce, Rockford, USA) kiegészített TBS (Burph TBS, Pierce, Rockford, USA)]. Végül a cellákba PBS-ben lévõ (Perbio, Bonn) 100 ml, 50 nM humán eredetû plazmint pipettáztunk (Chromogenix, Stockholm, Svédország). A lemezeket 0, 10, 20 és 30 percen keresztül 37 °C¹on, termosztált rázóasztalon (THERMOSTAR, BMG, Offenburg), percenként 500 fordulattal inkubáltuk. Ezután minden cellába PBS-ben lévõ 25 ml, 5 mM aprotinint pipettáztunk (Merck Biosciences, Schwalbach). Szobahõmérsékleten 5 percen keresztül történõ inkubációt követõen a lemezeket háromszor mostuk mosópufferrel. A nem emésztõdött PrP kimutatásához minden cellába reakciópufferben lévõ, 100 ml biotinilált kimutatási ellenanyagot pipettáztunk (3F4, Signet, Dedham, USA; 125 ng/ml). ELISA-vizsgálat Az ELISA-vizsgálathoz a kimutatási ellenanyaggal 1 órán keresztül, szobahõmérsékleten, enyhe rázatás mellett, sötétben inkubáltuk. Esetenként 300 ml mosópufferrel [0,5% Tween-20-szal (Surfact-Amps, Pierce, Rockford, USA) kiegészített TBS (Burph TBS, Pierce, Rockford, USA)] történõ hatszoros mosást követõen sztreptavidin-poliperoxidáz-konjugátumot (SApolyHRP, Pierce, Rockford, USA) reakciópufferben (1 rész blokkolópuffer+4 rész PBS) 1:5000 arányban hígítottunk, és cellánként 100 ml¹t a mikrotiterlemezekre pipettáztunk. Szobahõmérsékleten, 20 percen keresztül, sötétben, enyhe rázatás közben történõ inkubációt követõen ismét hatszor mostuk 300-300 ml mosópufferrel. Végül szobahõmérsékletre melegített TMB-bõl (3,3’,5,5’-tetrametil-benzidin) 100 ml¹t pipettáztunk szubsztrátként minden cellába, és 30 percen keresztül szobahõmérsékleten, mérsékelt rázatás közben, sötétben inkubáltuk. A cellákhoz 50 ml leállítóoldat (0,25% H2SO4 desztillált vízben) hozzáadása után a minta extinkcióját 405 nm¹nél ELISA-olvasóval mértük (Tecan Genios; Tecan, Svájc). A humán eredetû plazmából származó, immobilizált PrPC hasításának eredményét a 3. ábrán ábrázoljuk. Hasonló módon hajtottuk végre a hörcsög-agyhomogenizátumból származó immobilizált PrPC hasítását is azzal a kivétellel, hogy a minta nem összegyûjtött, humán eredetû citrátos plazma volt, hanem egészséges állatokból vett hörcsög-agyhomogenizátum. A hörcsögagyhomogenizátumból származó immobilizált PrPC hasításának eredményét a 4. ábrán mutatjuk be. A 3. és 4. ábrán megfigyelhetõ, exponenciálisan növekvõ, százalékos intenzitás nyilvánvalóvá teszi, hogy a kimutatási ellenanyagként alkalmazott biotinilált
1
HU 007 017 T2
3F4, amely a PrP-molekula 108 és 111 aminosavai közötti epitópot ismeri fel, az inkubációs idõ növelésével egyre kevesebb epitópot mutat ki. Ez arra utal, hogy ezen PrP-ellenanyag epitópja azon a PrPC-fragmensen van, amely a plazminnal történõ hasítás révén lebontódik, és a kimutatás elõtt a kimutatási ellenanyaggal kimosódik. Továbbá az is látható, hogy már húszperces, plazminnal történõ inkubációt követõen a humánplazma 1:200-szoros hígításából származó immobilizált PrPC összes mennyiségét a plazmin elhasítja. Az 1:50-szeres és 1:100-szoros hígításoknál 30 perces, plazminnal történõ inkubációt követõen hasítatlan humán PrPC gyakorlatilag nem található (3. ábra). A hörcsögbõl származó homogenizátum esetében (1:400¹as hígítás) 20 perces, plazminnal történõ emésztést követõen az immobilizált PrP C összes mennyiségét a plazmin elhasította. Az 1:100-szoros és 1:200-szoros hígításoknál 30 perces, plazminnal történõ inkubációt követõen emésztetlen hörcsög-PrPC gyakorlatilag nem mutatható ki (4. ábra). 2.2. példa: A PrP hasításának gátlása A PrP plazminnal történõ hasítása gátlásának vizsgálatához két átlátszó mikrotiterlemezt (Lumi-Nunc Maxi-Sorp F96; Nunc, Wiesbaden) cellánként 100 ml monoklonális ellenanyaggal rétegeztünk (anti-PrP; PRI308, Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Franciaország; koncentráció: 1 mg/ml karbonát/bikarbonát pufferben pH 9,0 (Perbio, Bonn) 16–18 órán keresztül, 4 °C¹on. A maradék folyadékot leszívtuk, és a szabad kötõhelyeket mindegyik cellához 100 ml blokkolópuffer (Superblock, Perbio, Bonn) hozzáadásával 1 órán keresztül telítettük. A blokkolópuffert a lemezekrõl leszívtuk, és a mintákat a lemezekre pipettáztuk (egészséges állatokból származó hörcsögagyhomogenizátum a reakciópufferrel: 1 rész blokkolópuffer+4 rész PBS megfelelõen hígítva). Két órán keresztül szobahõmérsékleten történõ inkubációt követõen a lemezeket háromszor mostuk mosópufferrel [0,5% Tween-20-szal (Surfact-Amps, Pierce, Rockford, USA) kiegészített TBS (Burph TBS, Pierce, Rockford, USA)]. Az egyik mikrotiterlemezre végezetül PBS-ben lévõ (Perbio, Bonn) 100 ml, 50 nM humán plazmint (Chromogenix, Stockholm, Svédország) pipettáztunk, míg a másik mikrotiterlemezre 100 ml PBS¹t pipettáztunk. A lemezeket 30 percen keresztül, 37 °C¹on, rázótermosztátban (THERMOSTAR, BMG, Offenburg) 500 percenkénti fordulatszámmal inkubáltuk. Azután mindkét lemezre cellánként 25 ml, PBS-ben lévõ 5 mM aprotinint pipettáztunk (Merck Biosciences, Schwalbach). Szobahõmérsékleten történõ 5 perces inkubációt követõen a lemezeket háromszor mostuk mosópufferrel. Az emésztetlen PrP kimutatásához reakciópufferben lévõ 100 ml biotinilált kimutatási ellenanyagot (SAF32, Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Franciaország; 125 ng/ml) pipettáztunk minden cellába. Végezetül az ELISA-vizsgálatot az elõzõ leírás szerint hajtottuk végre. Mint az 5. ábrán látható, natív PrPC-nek egy befogó ellenanyaggal (PRI3O8) történõ immobilizálását köve-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2
tõen, amely ellenanyag a PrP-molekula 106–126 aminosavait ismeri fel epitópként, plazminnal történõ hasítás nem lehetséges. Ez azt mutatja, hogy a PrPC-nek a befogó ellenanyag révén történõ kötõdése a plazminnak a PrPC¹n lévõ elsõdleges hasítási helyét elfedi, és ennek a PrP-molekula 106–126 aminosavai között kell lennie. 2.3 példa: Rekombináns PrPC hasítása A rekombináns PrPC hasításához négy átlátszó mikrotiterlemezt (Lumi-Nunc Maxi-Sorp F96; Nunc, Wiesbaden) cellánként 100 ml monoklonális ellenanyaggal rétegeztünk (anti-PrP; SAF61, Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Franciaország; koncentráció: 1 mg/ml karbonát/bikarbonát pufferben pH 9,0, Perbio, Bonn) 16–18 órán keresztül, 4 °C¹on. A maradék folyadékot leszívtuk, és a szabad kötõhelyeket mindegyik cellához 100 ml blokkolópuffer (Superblock, Perbio, Bonn) hozzáadásával 1 órán keresztül telítettük. A blokkolópuffert a lemezekrõl leszívtuk, és a mintákat (rekombináns humán PrP alaninra cserélt lizinnel a lizinklaszter 2¹ben (dLC2) az Institut für Labormedizin, Charité, Campus Virchow Klinikumból a reakciópufferrel: 1 rész blokkolópuffer+4 rész PBS, megfelelõen hígítva) a lemezekre pipettáztuk. Két órán keresztül szobahõmérsékleten történõ inkubációt követõen a lemezeket háromszor mostuk mosópufferrel [0,5% Tween-20-szal (Surfact-Amps, Pierce, Rockford, USA) kiegészített TBS (Burph TBS, Pierce, Rockford, USA)]. A mikrotiterlemezekre végezetül 100 ml, PBS-ben lévõ (Perbio, Bonn) 50 nM humán plazmint (Chromogenix, Stockholm, Svédország) pipettáztunk. A lemezeket 0, 5, 15 és 30 percen keresztül 37 °C¹on, rázótermosztátban (THERMOSTAR, BMG, Offenburg) 500 percenkénti fordulatszámmal inkubáltuk. Azután valamennyi lemezre cellánként 25 ml, PBSben lévõ 5 mM aprotinint pipettáztunk (Merck Biosciences, Schwalbach). Szobahõmérsékleten történõ 5 perces inkubációt követõen a lemezeket háromszor mostuk mosópufferrel. Az emésztetlen PrPC kimutatásához, reakciópufferben lévõ 100 ml biotinilált kimutatási ellenanyagot (SAF32, Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Franciaország; 125 ng/ml) pipettáztunk minden cellába. Végezetül az ELISA-vizsgálatot az elõzõ leírás szerint hajtottuk végre. Az eredmények mutatják (6. ábra), hogy a humán PrP-ben a lizinklaszter 2¹ben (dLC2) lévõ lizinek kicserélése alaninra a PrP plazmin általi hasításának szignifikáns csökkenését eredményezi. Így abban a mintában, amely a mutált PrPC¹t 25,7 ng/ml koncentrációban tartalmazta, 30 perc múlva még több mint 70%¹a a mutált PrPC-nek emésztetlen maradt. A mutált PrPC alacsonyabb koncentrációjánál is a plazminnal történõ hasítás jelentõsen gátolt.
2.4 példa: Immobilizált rekombináns és natív PrPC hasítása egyetlen keverékben Immobilizált rekombináns és natív PrPC egy keverékben történõ hasításához hét átlátszó mikrotiterlemezt (Lumi-Nunc Maxi-Sorp F96; Nunc, Wiesbaden) 60 cellánként 100 ml monoklonális ellenanyaggal rétegez55
9
1
HU 007 017 T2
tünk (anti-PrP; SAF61, Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Franciaország; koncentráció: 1 mg/ml karbonát/bikarbonát pufferben pH 9,0, Perbio, Bonn) 16–18 órán keresztül, 4 °C¹on. A maradék folyadékot leszívtuk, és a szabad kötõhelyeket mindegyik cellához 100 ml blokkolópuffer (Superblock, Perbio, Bonn) hozzáadásával 1 órán keresztül telítettük. A blokkolópuffert a lemezekrõl leszívtuk, és a mintákat (rekombináns humán PrP alaninra cserélt lizinnel a lizinklaszter 2¹ben (dLC2) az Institut für Labormedizin, Charité, Campus Virchow Klinikumtól 25,7 ng/ml, 14,1 ng/ml és 7,1 ng/ml koncentrációra hígítva marha-agyhomogenizátummal, 1:100 arányban hígítva a reakciópufferrel: 1 rész blokkolópuffer+4 rész PBS) a lemezekre pipettáztuk. Két órán keresztül szobahõmérsékleten történõ inkubációt követõen a lemezeket háromszor mostuk mosópufferrel [0,5% Tween-20-szal (Surfact-Amps, Pierce, Rockford, USA) kiegészített TBS (Burph TBS, Pierce, Rockford, USA)]. A mikrotiterlemezekre végezetül 100 ml, PBS-ben lévõ (Perbio, Bonn) 50 nM humán plazmint (Chromogenix, Stockholm, Svédország) pipettáztunk. A lemezeket 0, 5, 10, 15, 20, 25 és 30 percen keresztül 37 °C¹on, rázótermosztátban (THERMOSTAR, BMG, Offenburg) 500 percenkénti fordulatszámmal inkubáltuk. Azután valamennyi lemezre cellánként 25 ml, PBSben lévõ 5 mM aprotinint pipettáztunk (Merck Biosciences, Schwalbach). Szobahõmérsékleten történõ 5 perces inkubációt követõen a lemezeket háromszor mostuk mosópufferrel. Az emésztetlen PrPC kimutatásához, reakciópufferben lévõ 100 ml biotinilált kimutatási ellenanyagot (SAF32, Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Franciaország; 125 ng/ml) pipettáztunk minden cellába. Végezetül az ELISA-vizsgálatot az elõzõ leírás szerint hajtottuk végre. A 7. ábrán látható, hogy natív marha-PrPC még egy olyan keverékben is hasítható, amely különbözõ koncentrációban mutált, rekombináns humán PrP¹t tartalmaz, amelynek plazminnal történõ hasítása a mutáció miatt erõsen gátolt (lásd elõzõ példát).
5
10
15
20
25
30
35
40 3. példa: PrPSc kimutatására szolgáló vizsgálat PrPC-vel egy mintában További kísérletekben surlókórral fertõzött mintákat (hörcsög 263K-törzs) vizsgáltunk plazminnal. Végsõ stádiumban lévõ, fertõzött állatok agyhomogenizátumát különbözõ koncentrációban PrPSc jelenlétére vizsgáltuk (8. ábra). Továbbá fertõzött állatok agyhomogenizátumából különbözõ mennyiségeket adtunk egészséges állatok agyhomogenizátumához, hogy a patológiás forma kimutatását a normál forma nagyobb koncentrációja esetén is ellenõrizzük (9. ábra). 3.1 példa: Fertõzött hörcsög agyhomogenizátumából származó PrPC hasítása plazminnal mikrotiterlemezen történõ immobilizálást követõen A minták elõkészítéséhez surlókórral fertõzött hörcsögök agyhomogenizátumának 40 ml¹ét 40 ml 2%¹os Sarkosyllal (Sigma, Seelze) kevertük, 60 másodpercig 3¹as fokozaton ultrahanggal kezeltük (ultrahangkészü-
45
50
55
60 10
2
lék UP100H. Dr. Hielscher, Teltow), és 2 órán keresztül, szobahõmérsékleten, rotoron inkubáltuk (neoLabRotor, Roth, Karlsruhe). Ezután hígítási sort készítettünk reakciópufferben. Négy átlátszó mikrotiterlemezt (Lumi-Nunc MaxiSorp F96; Nunc, Wiesbaden) cellánként 100 ml monoklonális ellenanyaggal rétegeztünk (anti-PrP; SAF61, Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Franciaország; koncentráció: 1 mg/ml karbonát/bikarbonát pufferben pH 9,0, Perbio, Bonn) 16–18 órán keresztül, 4 °C¹on. A maradék folyadékot leszívtuk, és a szabad kötõhelyeket mindegyik cellához 100 ml blokkolópuffer (Superblock, Perbio, Bonn) hozzáadásával 1 órán keresztül telítettük. A blokkolópuffert a lemezekrõl leszívtuk, és az elõkészített mintákat a lemezekre pipettáztuk. Két órán keresztül szobahõmérsékleten történõ inkubációt követõen a lemezeket háromszor mostuk 0,5% Tween-20-szal (Surfact-Amps, Pierce, Rockford, USA) kiegészített mosópufferrel TBS (Burph TBS, Pierce, Rockford, USA). A mikrotiterlemezekre végezetül 100 ml, PBS-ben lévõ (Perbio, Bonn) 50 nM humán plazmint (Chromogenix, Stockholm, Svédország) pipettáztunk. A lemezeket 5, 15 és 30 percen keresztül 37 °C¹on, rázótermosztátban (THERMOSTAR, BMG, Offenburg) 500 percenkénti fordulatszámmal inkubáltuk. Azután valamennyi lemezre cellánként 25 ml, PBSben lévõ 5 mM aprotinint pipettáztunk (Merck Biosciences, Schwalbach). Szobahõmérsékleten történõ 5 perces inkubációt követõen a lemezeket háromszor mostuk mosópufferrel. Az emésztetlen PrP-molekula kimutatásához reakciópufferben lévõ 100 ml biotinilált kimutatási ellenanyagot (SAF32, Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Franciaország; 125 ng/ml) pipettáztunk minden cellába. Végezetül az ELISA-vizsgálatot az elõzõ leírás szerint hajtottuk végre. Kimutatható volt, hogy PrPSc surlókórral fertõzött hörcsög agyhomogenizátumának még 1:6400-szoros, pufferrel történõ hígításában is egyértelmûen kimutatható volt. A mért intenzitás arányos a hörcsögagyhomogenizátum koncentrációjával (és így PrPScvel). 3.2 példa: Hörcsög-agyhomogenizátumból származó PrPC hasítása plazminnal PrPC feleslegében, mikrotiterlemezen történõ immobilizálást követõen A minták elõkészítéséhez surlókórral fertõzött, illetõleg egészséges hörcsögök agyhomogenizátumának 40 ml¹ét 40 ml 2%¹os Sarkosyllal (Sigma, Seelze) kevertük, 60 másodpercig 3¹as fokozaton ultrahanggal kezeltük (ultrahangkészülék UP100H, Dr. Hielscher, Teltow), és 2 órán keresztül, szobahõmérsékleten, rotoron inkubáltuk (neoLab-Rotor, Roth, Karlsruhe). Ezután hígítási sort készítettünk a surlókórral fertõzött homogenizátumokból normál homogenizátummal. Közvetlenül a lemezekre történõ pipettázás elõtt a mintákat 1:100 arányban reakciópufferrel hígítottuk. Hét átlátszó mikrotiterlemezt (Lumi-Nunc MaxiSorp F96; Nunc, Wiesbaden) cellánként 100 ml monoklonális ellenanyaggal rétegeztünk (anti-PrP; SAF61,
1
HU 007 017 T2
Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Franciaország; koncentráció: 1 mg/ml karbonát/bikarbonát pufferben pH 9,0, Perbio, Bonn) 16–18 órán keresztül, 4 °C¹on. A maradék folyadékot leszívtuk, és a szabad kötõhelyeket mindegyik cellához 100 ml blokkolópuffer (Superblock, Perbio, Bonn) hozzáadásával 1 órán keresztül telítettük. A blokkolópuffert a lemezekrõl leszívtuk, és az elõkészített mintákat a lemezekre pipettáztuk. Két órán keresztül szobahõmérsékleten történõ inkubációt követõen a lemezeket háromszor mostuk 0,5% Tween-20-szal (Surfact-Amps, Pierce, Rockford, USA) kiegészített mosópufferrel (TBS (Burph TBS, Pierce, Rockford, USA). A mikrotiterlemezekre végezetül 100 ml, PBS-ben lévõ (Perbio, Bonn) 50 nM humán plazmint (Chromogenix, Stockholm, Svédország) pipettáztunk. A lemezeket 5, 15 és 30 percen keresztül 37 °C¹on, rázótermosztátban (THERMOSTAR, BMG, Offenburg) 500 percenkénti fordulatszámmal inkubáltuk. Azután valamennyi lemezre cellánként 25 ml, PBSben lévõ 5 mM aprotinint pipettáztunk (Merck Biosciences, Schwalbach). Szobahõmérsékleten történõ 5 perces inkubációt követõen a lemezeket háromszor mostuk mosópufferrel. Az emésztetlen PrP-molekula kimutatásához, reakciópufferben lévõ 100 ml biotinilált kimutatási ellenanyagot (SAF32, Spi-Bio, Montigny le Bretonneux, Franciaország; 125 ng/ml) pipettáztunk minden cellába. Végezetül az ELlSA-vizsgálatot az elõzõ leírás szerint hajtottuk végre. A 9. ábrán látható, hogy prionfehérje patológiás formája (PrPSc) még a prionfehérje nem patológiás formájának (PrPC) 6400-szoros feleslegében is egyértelmûen kimutatható. Ez azt mutatja, hogy PrPSc találmány szerinti eljárással történõ kimutatása nemcsak olyan egyedeknél sikeres, amelyek már a betegség végsõ stádiumában vannak, amely révén PrPSc koncentrációja PrPC koncentrációját meghaladja, hanem már nyilvánvalóan korábban, egy korai, klinikai fázis elõtti szakaszban is lehetséges a kimutatása.
5
10
15
20
25
30
35
40 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás bizonyíték szolgáltatására patológiás prionfehérjék jelenlétére mintában in vitro, ahol a) mind a prionfehérje patológiás formáját (PrpSc), mind a nem patológiás formáját (PrpC) felismerõ befogó („capture”) ellenanyagokat biztosítunk, amelyek szilárd fázison vannak rögzítve; b) az a) lépésben nyert, rögzített ellenanyagokkal ellátott mintát inkubáljuk, miáltal a prionfehérje patológiás és nem patológiás formája komplexképzõdéssel kötõdik a rögzített ellenanyagokhoz; c) a mintát elválasztjuk a képzõdött komplexektõl; d) a komplexeket plazminnal inkubáljuk, miáltal a prionfehérje nem patológiás formája elhasad; e) a plazminnal történõ inkubáció során kapott hasítási fragmenseket elválasztjuk a komplexektõl; és f) a komplexekben kapott, nem hasítódott prionfehérjét olyan kimutatási ellenanyaggal mutatjuk ki, amely specifikusan PrPSc-hez kötõdik.
45
50
55
60 11
2
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az f) lépés szerinti kimutatás kvantitatív módon történik. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a kimutatási ellenanyagok mind a prionfehérje patológiás formáját, mind a nem patológiás formáját felismerik. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a befogó ellenanyag a prionfehérje olyan epitópjára irányul, amely az 1–110 aminosavak tartományában található, feltéve, hogy a kimutatási anyag egy olyan epitópra irányul, amely ezen a tartományon kívül esik; vagy a kimutatási ellenanyag olyan epitópra irányul, amely az 1–110 aminosavak tartományában található, feltéve, hogy a befogó ellenanyag egy olyan epitópra irányul, amely ezen a tartományon kívül helyezkedik el. 5. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az a) lépést követõen a szilárd fázis szabad kötõhelyeit blokkolópufferrel telítjük. 6. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a szilárd fázis mikrotiterlemez vagy paramágneses vagy nem mágneses gyöngyök. 7. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a b) lépés szerinti inkubációs idõ nem több két óránál. 8. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a d) lépés szerinti inkubációs idõ nem több 30 percnél. 9. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a d) lépésben történõ, plazminnal való inkubáció után aprotinin hozzáadása következik. 10. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol mosási lépéseket hajtunk végre az egyes lépések között. 11. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a kimutatási ellenanyagok biotint, fluoreszcens markereket és/vagy nanogyöngyöket, elõnyösen európiummal jelölt nanogyöngyöket tartalmaznak. 12. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az f) lépés szerinti kimutatás ELISA-vizsgálattal történik. 13. Diagnosztikai reagenskészlet bizonyíték szolgáltatására patológiás prionoknak mintában történõ jelenlétére in vitro, amely készlet tartalmaz a) befogó ellenanyagokat, amelyek mind a prionfehérje patológiás formájára (PrpSc), mind a nem patológiás formájára (PrpC) irányulnak, b) plazmint; és c) kimutatási ellenanyagokat, amelyek specifikusan PrpSc-hez kötõdnek. 14. A 13. igénypont szerinti diagnosztikai reagenskészlet, ahol a befogó ellenanyagok már rögzítve vannak a szilárd fázison. 15. A 14. igénypont szerinti diagnosztikai reagenskészlet, ahol a szilárd fázis mikrotiterlemez vagy gyöngy. 16. A 13. igénypont szerinti diagnosztikai reagenskészlet, ahol a kimutatási ellenanyagok mind a prionfehérje patológiás formáját, mind a nem patológiás formáját felismerik. 17. A 13. igénypont szerinti diagnosztikai reagenskészlet, amely tartalmaz továbbá blokkolópuffert a szi-
1
HU 007 017 T2
lárd fázis szabad kötõhelyeinek telítésére, mosópuffert és/vagy aprotinint. 18. A 13. igénypont szerinti diagnosztikai reagenskészlet, ahol a plazmin egy pufferoldatban van oldva vagy liofilizálva van szilárd állapotban. 19. A 13. igénypont szerinti diagnosztikai reagenskészlet, ahol a befogó ellenanyag a prionfehérje epitóp-
5
12
2
jára irányul, amely az 1–110 aminosavak tartományában található, feltéve, hogy a kimutatási ellenanyag olyan epitópra irányul, amely ezen a tartományon kívül esik; vagy a kimutatási ellenanyag olyan epitópra irányul, amely az 1–110 aminosavak tartományában található, feltéve, hogy a befogó ellenanyag irányul olyan epitópra, amely ezen a tartományon kívül helyezkedik el.
HU 007 017 T2 Int. Cl.: G01N 33/68
13
HU 007 017 T2 Int. Cl.: G01N 33/68
14
HU 007 017 T2 Int. Cl.: G01N 33/68
15
HU 007 017 T2 Int. Cl.: G01N 33/68
16
HU 007 017 T2 Int. Cl.: G01N 33/68
17
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
