(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000004627T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 004 627

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 750581 (22) A bejelentés napja: 2004. 04. 23. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040750581 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1631312 A1 2004. 11. 04. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1631312 B1 2008. 09. 10.

(51) Int. Cl.: A61K 39/395 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04093908 PCT/US 04/012651

(30) Elsõbbségi adatok: 465155 P 2003. 04. 23.

(73) Jogosult: MEDAREX, INC., Princeton, NJ 08540-1437 (US)

US

(72) Feltalálók: PICKFORD, Lesley, B., Menlo Park, CA 94025 (US); BEBBINGTON, Christopher, R., San Mateo, CA 94402 (US); YARRANTON, Geoffrey, T., Burlingame, CA 94010 (US); KING, David, Belmont, CA 94002 (US) (54)

(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest

Készítmények és eljárások gyulladásos bélbetegség terápiájához

(57) Kivonat

HU 004 627 T2

A találmány tárgyát képezik készítmények és eljárások gyulladásos bélbetegség (IBD), ezen belül coeliákia, Crohn-betegség és fekélyes vastagbélgyulladás terápiájára. A készítmény például tartalmaz egy vagy több I. típusú interferonantagonistát, így például I. típusú in-

terferonreceptor-ellenes antitestantagonistát és annak fragmenseit, valamint olyan polipeptideket és kismolekulás anyagokat, amelyek gátolják az I. típusú interferon és receptora (IFNAR) közötti kölcsönhatást.

A leírás terjedelme 42 oldal (ezen belül 23 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 004 627 T2

Mûszaki szakterület A találmány tárgyát képezi általánosságban coeliákia, Crohn-betegség és fekélyes vastagbélgyulladás (összefoglaló néven gyulladásos bélbetegség vagy IBD) terápiája. A találmány tárgyát képezik közelebbrõl I. típusú interferonreceptorok elleni antitestek, továbbá ilyen antitesteket alkalmazó terápiás eljárások az IBD kezelésére. A technika állása A coeliákia, Crohn-betegség és fekélyes vastagbélgyulladás (összefoglaló néven gyulladásos bélbetegség vagy angol rövidítéssel IBD) a gyomor-bél traktus krónikus, gyulladásos betegségei. Bár a két betegség klinikai jellegzetességei valamelyest eltérõek lehetnek, mindkettõre jellemzõ a hasi fájdalom, a hasmenés (ami gyakran véres), a bélen kívüli manifesztációk egy változatos csoportja (így például ízületi gyulladás, érhártyagyulladás, bõrelváltozások stb.) és a gyulladásos sejtek vékony- és vastagbéli akkumulációja (ami patológiás biopsziákban és sebészeti mintákban figyelhetõ meg). Az IBD a gyermekeket és felnõtteket egyaránt érinti, és bimodális kor szerinti eloszlást mutat (az egyik csúcs 20 körül, a másik 40 körül van). Az IBD krónikus, élethosszig tartó betegség, és gyakran egy csoportba tartozónak tekintik más, úgynevezett „autoimmun” betegségekkel (például reumás ízületi gyulladás, I. típusú diabetes mellitus, sclerosis multiplex stb.). Az IBD szinte kizárólag a világ iparosodott részén fordul elõ. A Mayo Klinikáról származó legfrissebb adatok alapján az Egyesült Államokban az összesített elõfordulás meghaladja az 1/100 000 lakost, sõt egyes vizsgálatokban az 1/1000¹et is. Az IBD – és különösen a Crohn-betegség – elõfordulása egyértelmûen növekvõ trendet mutat az USA-ban és Európában is. E növekedés oka jelenleg nem világos. Az IBD, mint olyan (a reumás ízületi gyulladás után), a második leggyakoribb autoimmun betegség az Egyesült Államokban. A gyulladásos bélbetegségben szenvedõ betegek beleiben I. típusú interferonokat mutattak ki. Megjelent például, hogy a coeliákiában – egy gluténérzékenységi bélbetegségben – szenvedõ betegek bélnyálkahártyájában és a Crohn-betegek lamina propriájában túlexpresszálódik az interferon-alfa. Monteleone és munkatársai: Gut 48, 425–429 (2001); Fais és munkatársai: J. Interferon Res. 14, 235–238 (1994). A fenti betegek szöveteiben talált I. típusú interferonok biológiai jelentõségét még nem írták le. Nem írtak le továbbá olyat sem, hogy I. típusú interferonok lennének gyulladásos bélbetegségben szenvedõk keringésében, és nem világos, hogy ha van, akkor mi az interferon-alfa szerepe e betegségek patológiájában. Az I. típusú interferonok (például interferon-alfa és ¹béta) többfunkciós citokinek, amelyek kritikus szerepet játszanak különféle immunválaszrendszerekben. Az I. típusú interferonok rendellenes termelõdése számos patológiás állapothoz társulhat, például transzplantátumkilökõdéshez és olyan autoimmun betegségekhez, mint a reumás ízületi gyulladás, a szisztémás

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2

lupus erythematosus és az inzulindependens cukorbetegség. Az I. típusú interferonok biológiai hatásait egyetlen sejtfelszíni receptor (IFNAR) közvetíti, amelyik minden I. típusú interferont megköt, de a 2. típusú interferont, az interferon-g¹t nem. Az I. típusú interferonreceptor a szervezet minden sejtmaggal rendelkezõ sejtjén, bár változó mértékben, de expresszálódik. Két, IFNAR1 és IFNAR2 elnevezésû polipeptidláncból áll, amelyek együttesen adják azt a nagy affinitású receptort, ami az interferon megkötõdését követõen képes sejten belüli szignált transzdukálni. Kimutatták, hogy a humán I. típusú interferonreceptor elleni, 64G12 elnevezésû, egéreredetû monoklonális antitest blokkolja az I. típusú interferonok aktivitását, mivel gátolja a citokinek kötõdését receptorukhoz. (Lásd az 5 889 151, 5 886 153, 5 731 169, 5 861 258, 5 919 453, és 6 475 983 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmakat, valamint a 20020055492 számú amerikai egyesült államokbeli közzétételi iratot.) Fõemlõs transzplantációs modellekben a 64G12 ciklosporine-nal együttesen adva jelentõs, hosszú távú hatásosságot mutatott a bõr-allograftkilökõdések és a graft-versus-host betegség megelõzésében. Benizri és munkatársai: J. Interferon Cytokine Res. 18, 273 (1998). Az IBD¹t változatos módokon kezelik. Az elsõ vonalbeli terápia tipikusan szájon vagy végbélen át adott szalicilátszármazékokkal (például 5¹ASA) történik. Szövõdménymentes Crohn-betegségnél a válaszarányok 40% körül vannak (összehasonlításképpen, placebóval 20%). A kellemetlen mellékhatások ellenére makacsabb betegség esetén továbbra is a kortikoszteroidok jelentik a betegek kezelésének fõ irányvonalát. Az újabb kezelési lehetõségek közé tartoznak az antimetabolitok (például a methotrexate, a 6¹merkaptopurin) és az immunmodulátorok (például a remicade, ami egy, a TNFa-receptorra specifikus, kiméra humán antitest). Annak ellenére, hogy intenzíven kutatják a fenti betegségek terápiáját, a coeliákia, a Crohn-betegség és a fekélyes vastagbélgyulladás továbbra is nehezen kezelhetõ hatásosan. Ennek megfelelõen kielégítetlen igény van a technikában az ilyen gyulladásos bélbetegségek kezelésére szolgáló javított eljárásokra. A találmány kielégíti ezeket és az egyéb kapcsolódó igényeket.

A találmány összefoglalása A találmány tárgyát képezi I. típusú interferonreceptor elleni antitest alkalmazása gyulladásos bélbeteg50 ség, ezen belül például coeliákia, Crohn-betegség és fekélyes vastagbélbetegség kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. A találmány szerinti gyógyszerek egy vagy több I. típusú interferonreceptor elleni antitestet tartalmaznak, például anti-IFNAR antitesteket 55 és a fentiekben említett antitestek bármelyikének fragmenseit. Egyes megvalósítási módokban a találmány szerinti antitestek lehetnek kiméra, primatizált, humanizált, deimmunizált és/vagy humán antitestek vagy azok valamely receptorkötõ fragmense. A találmány más 60 megvalósítási módjaiban a találmány tárgyát képezi 2

1

HU 004 627 T2

elsõ és második gyógyszer alkalmazása, ahol az elsõ gyógyszert toleranciakiváltó mennyiségben adjuk az érintett betegnek, a második gyógyszert pedig terápiásan hatásos mennyiségben adjuk a betegnek. Így tehát a találmány bizonyos megvalósítási módjaiban a találmány tárgyát olyan antitestek képezik, amelyek kölcsönhatásba lépnek az I. típusú interferon ligandkötésével, így például a szolúbilis receptorláncokkal (például a szolúbilis IFNAR2-vel). Más, kapcsolódó megvalósítási módokban a találmány tárgyát képezik antitestek vagy azok antigénkötõ fragmensei, amelyek szeletíven kötõdnek egy vagy több I. típusú interferonreceptorhoz, vagy oly módon kötõdnek az IFNAR-receptorhoz, hogy az zavarja a ligandkötést, így például kompetitív vagy nonkompetitív vagy unkompetitív gátlás révén. Alternatív megvalósítási módokban a találmány tárgyát olyan antitestek képezik, amelyek az IFNAR-receptor általi szignáltranszdukciót zavarják meg. A találmány szerinti terápiás eljárásokban történõ alkalmazásra megfelelõ antitestantagonisták közé tartoznak monoklonális antitestek, így például nem humán, kiméra, primatizált, deimmunizált és/vagy teljesen humán antitestek vagy azok antigénkötõ fragmensei. Az antitestantagonisták emellett egy vagy több kémiai módosítást is tartalmazhatnak, hogy növeljék az antitest vagy antigénkötõ fragmense féléletidejét a keringésben, így például polietilénglikolhoz való kapcsolással (PEGilezés). Egyes elõnyös megvalósítási módokban az antagonista egy olyan antitest, ami a 64G12 elnevezésû, egéreredetû monoklonális antitest által és/vagy a CPI1697-nek nevezett, mesterséges (tervezetten átalakított, „engineered”) humán változat által felismert IFNAR1 antigénepitóphoz vagy annak közelében kötõdik. A 64G12 monoklonális antitest 1992. február 26¹án került letétbe helyezésre az ECACC-nál (Állati Sejtkultúrák Európai Gyûjteménye, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 056, Egyesült Királyság). A találmány további megvalósítási módjaiban a találmány tárgyát képezi egy vagy több további terápiás szer, így például valamely immunszuppresszív szer, gyulladásellenes szer, szteroid, immunmoduláló szer, citokin és TNF-antagonista. A példaként említhetõ immunmodulátorok közé tartozik az azathioprine, a methotrexate, a ciklosporine, az FK506, a rapamycin és a mycophenolate mofetil. A példaként említhetõ gyulladásellenes szerek közé tartozik az 5¹aminoszalicilsav, a sulfasalazine és az olsalazine. A példaként említhetõ szteroidok közé tartoznak a kortikoszteroidok, a glükokortikoszteroidok, a prednisone, a prednisolone, a hydrocortisone, a metilprednisolone, a dexamethasone és az ACTH. A példaként említhetõ immunmoduláló szerek közé tartozik a PVAC, az anti-CD40 ligand, az antiCD40, a natalizumab (Antegren™), az anti-VCAM1 és az anti-ICAM1. A példaként említhetõ citokinek közé tartozik az IL–10. A példaként említhetõ TNF-antagonisták közé tartozik az infliximab (Remicade®), az entercept (Enbrel®), az adalimumab (Humira™) és a CDP870.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

A gyógyszerek célszerûen bármely megfelelõ bejuttatási útvonalon át beadhatók, amely megfelelõ biológiai hozzáférhetõséget biztosít. Egyes megvalósítási módokban tehát a megfelelõ beadási útvonalak közé tartozik az intravénás bolusz, az intravénás lassú bolusz vagy az infúzió. Más megvalósítási módokban az I. típusú interferonantagonista beadása történhet szubkután, intramuszkuláris, transzdermális vagy intradermális injekcióval. Alternatív megvalósítási módokban a találmány tárgyát képezi, hogy a beadás történhet nyálkahártyán át történõ bejuttatással is, így például inhalálással, vagy orr-garati vagy szájon át történõ beadással. Valamely antitestet és/vagy annak valamely antigénkötõ fragmensét alkalmazó egyes megvalósítási módokban a beadási útvonal lehet szubkután, intramuszkuláris és/vagy intravénás. Az intravénás beadás történhet bolusz injekcióval, lassú bolusz injekcióval vagy infúzióban. Az alternatív megvalósítási módokban a találmány tárgyát képezi, hogy az antitestek transzdermálisan, intradermálisan vagy nyálkahártyán keresztül. A példaként említhetõ adagolás 0,1 mg/testsúlykilogrammtól 50 mg/testsúlykilogrammig, elõnyösebben 0,5 mg/testsúlykilogrammtól 10 mg/testsúlykilogrammig, és még elõnyösebben 2 mg/testsúlykilogrammtól 5 mg/testsúlykilogrammig terjedhet. Egyes megvalósítási módokban több ismételt dózis is beadható. A találmány egyes, antitestet alkalmazó megvalósítási módjaiban az adagolási frekvencia a napi egyszeritõl a havi egyszeriig, elõnyösebben a hetente kétszeritõl a kéthetente egyszeriig terjedhet, és még elõnyösebben körülbelül hetente egyszeri. Alternatív módon az antagonista körülbelül az in vivo féléletidejének megfelelõen adagolható, feltéve hogy biztosítva van a kellõ expozíció. A találmány egyes más megvalósítási módjaiban a találmány tárgyát képezi, hogy az antitesteket más terápiás szerekkel, így például valamely immunszuppresszív szerrel, gyulladásellenes szerrel, szteroiddal, immunmoduláló szerrel, citokinnel és TNF-antagonistával – például a fentiekben megadottakkal – kombináltan adjuk be. A találmány még további megvalósítási módjaiban a találmány tárgyát képezi egy elsõ és egy második gyógyszer alkalmazása gyulladásos bélbetegségben szenvedõ betegek kezelésére, amely alkalmazások az alábbi lépésekbõl állnak: (a) elsõ gyógyszerként toleranciakiváltó mennyiségben beadunk egy I. típusú interferonreceptor elleni antitestet, és (b) második gyógyszerként terápiás dózisban beadunk egy I. típusú interferonantagonistát. Egyes elõnyös megvalósítási módokban az interferonantagonista és vagy ¹antitest irányulhat az I. típusú interferonreceptor (IFNAR) ellen. A példaként említhetõ I. típusú interferon elleni antitestek lehetnek kiméra, primatizált, humanizált, deimmunizált és humán antitestek. Egyes elõnyös anti-IFNAR antitestek közé tartoznak olyanok is, amelyek az IFNAR1-hez kötõdnek; ilyenek például a 64G12 elnevezésû, egéreredetû monoklonális antitest és/vagy a CPI-1697 elnevezésû mesterséges humán változat.

1

HU 004 627 T2

Az I. típusú interferonreceptor elleni antitest toleranciakiváltó dózisa elõnyösen a 10 mg/testsúlykilogrammtól az 50 mg/testsúlykilogrammig terjedõ tartományban mozog. A toleranciakiváltó dózis még elõnyösebben a 20 mg/testsúlykilogrammtól a 40 mg/testsúlykilogrammig terjedõ tartományban mozog. A toleranciakiváltó dózis még ennél is elõnyösebben a 20¹tól a 25 mg/testsúlykilogrammig terjedõ tartományban mozog. A fenti terápiás rendeken belül az I. típusú interferonreceptor elleni antitest terápiásan hatásos dózisát elõnyösen a 0,1 mg/testsúlykilogrammtól a 10 mg/testsúlykilogrammig terjedõ tartományban kell beadni. A még elõnyösebb terápiásan hatásos dózisok a 0,2tõl az 5 mg/testsúlykilogrammig terjedõ tartományban mozognak. A még ennél is elõnyösebb terápiásan hatásos dózisok a 0,5-tõl a 2 mg/testsúlykilogrammig terjedõ tartományban mozognak. Alternatív megvalósítási módokban a késõbbi terápiás dózis vagy dózisok lehetnek ugyanúgy vagy eltérõen formulázottak, mint a toleranciakiváltó dózis és/vagy azonos vagy eltérõ útvonalon is beadhatók, mint a toleranciakiváltó dózis. A terápiás dózisokat elõnyösen intravénásan, intramuszkulárisan vagy szubkután kell beadni. Az ábrák rövid ismertetése Az 1A–1D. és a 2A–2D. ábrákon látható grafikonok a CPI-1697 hatásait mutatják IBD-ben szenvedõ CTT¹k testsúlyára. Az 1A–1D. ábrák az I. fázisú vizsgálatok eredményeit mutatják. A 2A–2D. ábrák a II. fázisú vizsgálatok eredményeit mutatják. Az egyes állatok testsúlyának százalékos változását úgy számoltuk ki, hogy kiindulásnak a 0. napi, azaz az adagolás megkezdésének napján mért testsúlyt vettük. A grafikonokon az egyedi testsúlyokat és a csoportátlagok százalékos változásait, valamint a túlélõ állatok testsúlyának csoportátlagát ábrázoltuk. Minden idõpontra statisztikai (egyutas ANOVA) elemzéseket végeztünk a kezelt és a kontrollcsoportoknál is. **: Az I. fázisú vizsgálat 55. hetében a kezelt állatok testsúlya a kontrollokkal összehasonlítva statisztikailag szignifikáns változást mutatott (p<0,01). A nyilak az adagolási rendet mutatják. A 3A–3D. és a 4A–4D. ábrákon látható grafikonok a CPI-1697 hatásait mutatják IBD-ben szenvedõ CTT¹k hasmenési pontszámaira. A 3A–3D. ábrák az I. fázisú vizsgálatok eredményeit mutatják. A 4A–4D. ábrák a II. fázisú vizsgálatok eredményeit mutatják. A kontroll- és a kezelt állatok esetében is a túlélõ állatok heti átlagos hasmenési pontszámát (öt egymást követõ nap átlaga) ábrázoltuk. Emellett a heti átlagos hasmenési pontszámok csoportátlagát, és mintegy alapvonalként, a heti hasmenési pontszám közvetlenül az adagolás megkezdése elõtti –1. heti százalékos változásának csoportátlagát is

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 4

2

ábrázoltuk. A nyilak az adagolási rendet mutatják. Az 5A–5D. és a 6A–6D. ábrákon látható grafikonok a CPI-1697 hatásait mutatják IBD-ben szenvedõ CTT¹k aktivitási pontszámaira. Az 5A–5D. ábrák az I. fázisú vizsgálatok eredményeit mutatják. A 6A–6D. ábrák a II. fázisú vizsgálatok eredményeit mutatják. A kontroll- és a kezelt állatok esetében is a túlélõ állatok aktivitási pontszámát (három biopsziaminta átlaga) ábrázoltuk, ami a neutrofil infiltrációt jeleníti meg. Emellett az aktivitási pontszámok csoportátlagát, és mintegy alapvonalként, a heti aktivitási pontszám adagolás megkezdése elõtti –1. heti (az I. fázishoz), illetve –2. heti (a II. fázishoz) százalékos változásának csoportátlagát is ábrázoltuk. A nyilak az adagolási rendet mutatják. A 7A–7D. és a 8A–8D. ábrákon látható grafikonok a CPI-1697 hatásait mutatják IBD-ben szenvedõ CTT¹k krónikussági pontszámaira. A 7A–7D. ábrák az I. fázisú vizsgálatok eredményeit mutatják. A 8A–8D. ábrák a II. fázisú vizsgálatok eredményeit mutatják. A kontroll- és a kezelt állatok esetében is a túlélõ állatok krónikussági pontszámát (három biopsziaminta átlaga) ábrázoltuk, ami a vastagbél morfológiájában bekövetkezõ tartós változások – ezen belül a tüszõüregek eltûnésének és a mirigystruktúrák elváltozásának – mértékét jeleníti meg. Emellett az aktivitási pontszámok csoportátlagát, és mintegy alapvonalként, a heti krónikussági pontszám az adagolás megkezdése elõtti –1. heti (az I. fázishoz), illetve –2. heti (a II. fázishoz) százalékos változásának csoportátlagát is ábrázoltuk. A nyilak az adagolási rendet mutatják. A 9A–9D. és a 10A–10D. ábrákon látható grafikonok a CPI-1697 hatásait mutatják IBD-ben szenvedõ CTT¹k hiperplázia pontszámaira. A 9A–9D. ábrák az I. fázisú vizsgálatok eredményeit mutatják. A 10A–10D. ábrák a II. fázisú vizsgálatok eredményeit mutatják. A kontroll- és a kezelt állatok esetében is a túlélõ állatok hiperplázia pontszámát (három biopsziaminta átlaga) ábrázoltuk, ami a nyálkahártyaszövet – ezen belül a sejtes szövet és kötõszövet – rendellenes megvastagodását jeleníti meg. Emellett az aktivitási pontszámok csoportátlagát, és mintegy alapvonalként, a heti krónikussági pontszám adagolás megkezdése elõtt –1. heti (az I. fázishoz), illetve –2. heti (a II. fázishoz) százalékos változásának csoportátlagát is ábrázoltuk. A nyilak az adagolási rendet mutatják. A 11A–11B. ábrákon látható grafikonok a CPI1697 készítmény egyes állatokban mért

1

HU 004 627 T2

szérumkoncentrációját mutatják az I. fázisú (11A. ábra) és a II. fázisú (11B. ábra) vizsgálatokban. A 12A–12B. ábrákon látható oszlopdiagramok a CPI-1697-tel kezelt állatok relatív PAHA-válaszait mutatják az I. fázisú (12A. ábra) és a II. fázisú (12B. ábra) vizsgálatokban. A 13. ábrán látható grafikon az egyes állatok B¹sejtjein a II. fázisú vizsgálatban mért, normalizált IFNAR1 expressziós szintet mutatja. Az egyes állatok B¹sejtjein különféle idõpontokban mért IFNAR1 expressziós szinteket a kontrollállatok egyes idõpontokhoz tartozó átlagos IFNAR1-szintjeihez normalizáltuk azzal a feltételezéssel, hogy a kontrollállatokban relatíve stabilak maradtak az IFNAR1-szintek. A 14A–14B. ábrák (1. és 2. azonosító számú szekvencia) a CPI-1697 elnevezésû, IFNAR1 elleni humanizált antitest nehéz láncának (H3) (14A. ábra) (1. azonosító számú szekvencia) és könnyû láncának (K1) (14B. ábra) (2. azonosító számú szekvencia) aminosavszekvenciáit mutatják. A CDR-eket aláhúzással jelöltük. A találmány részletes ismertetése A találmány tárgyát képezik általánosságban készítmények és gyulladásos bélbetegség (IBD), különösen coeliákia, Crohn-betegség és fekélyes vastagbélbetegség kezelésére szolgáló terápiás eljárásokban történõ alkalmazásaik. Ahogy azt a késõbbiekben részletesebben is ismertetjük, az illusztrációként használható, találmány szerinti készítmények a következõket tartalmazzák: IFNAR elleni antitesteket, I. típusú interferonreceptor elleni antitesteket és/vagy azok antigénkötõ fragmenseit. Anélkül, hogy bármely adott mûködési elvre kívánnánk szorítkozni, a példaként említhetõ találmány szerinti antitestek zavarhatják a ligandkötést, és/vagy kompetálhatnak vele és/vagy az interferonközvetített szignáltranszdukcióval. A találmány szerinti I. típusú interferonreceptor elleni antitestek hosszú in vivo keringési féléletidõvel rendelkeznek, és ennek következtében hatásosan meg tudják hosszabbítani a terápiás választ. Az antitestek in vivo féléletidejének meghosszabbítására szolgáló eljárások közé tartozik például a fúziós fehérjék, így például az immunglobulin Fc-fúziók elõállítása vagy a polietilénglikolhoz való konjugálás (PEGilezés). A találmány tárgyát képezik továbbá alkalmazások, ahol az egy vagy több I. típusú interferonreceptor-antitestet toleranciakiváltó mennyiségben alkalmazzuk, amely megelõzi és/vagy minimalizálja a terápiás antitest elleni immunválaszt, és amely toleranciakiváltó adagolási rendet egy terápiás rend követ. A találmány szerinti gyakorlat – konkrét egyéb irányú megjelölés hiányában – szakember számára ismert, konvencionális virológiai, immunológiai, mikrobiológiai, molekuláris biológiai és rekombináns DNS módszereket alkalmaz, amelyek közül illusztrálás céljá-

2

ból a késõbbiekben több is ismertetésre kerül. E módszerekrõl teljes körû magyarázat a szakirodalomban található. Lásd például Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2nd Edition, 5 1989); Maniatis és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (1982); „DNA Cloning: A Practical Approach”, I. és II. kötet (szerk.: D. Glover); „Oligonucleotide Synthesis” (szerk.: N. Gait, 1984); „Nucleic Acid Hybridization” (szerk.: B. Hames és S. Higgins, 10 1985); „Transcription and Translation” (szerk.: B. Hames és S. Higgins, 1984); „Animal Cell Culture” (szerk.: R. Freshney, 1986); Perbal, „A Practical Guide to Molecular Cloning” (1984). A leírásban és a hozzá tartozó szabadalmi igény15 pontokban az „egy”, „a” vagy „az” többes számra is utal, kivéve ha a szövegkörnyezet egyértelmûen másképp kívánja.

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

I. típusú interferonantagonisták, amelyek antitestek Ahogy azt a fentiekben említettük, a találmány tárgyát képezik általánosságban I. típusú interferonok antagonistáit tartalmazó készítmények, valamint terápiás alkalmazási eljárások, amelyek gyulladásos bélbetegség (IBD), különösen coeliákia, Crohn-betegség és fekélyes vastagbélbetegség kezelésére szolgáló terápiás készítményeket alkalmaznak. A találmány egyes megvalósítási módjaiban az I. típusú interferonantagonisták lehetnek anti-IFNAR antitestek és/vagy azok olyan fragmensei, amelyek valamely I. típusú interferonreceptorhoz kötõdnek, és ezáltal blokkolják ligandjának (azaz az interferon-alfa, az interferon-béta vagy az interferon-omega) kötõdését. Alternatív módon vagy emellett az I. típusú interferonantagonisták lehetnek I. típusú interferon elleni antitestek és/vagy azok olyan fragmensei, amelyek valamely I. típusú interferonhoz (azaz interferon-alfához, interferon-bétához vagy interferon-omegához) kötõdnek, és ezáltal blokkolják receptorukhoz (azaz az IFNAR-hoz) való kötõdésüket. A ligandkötés antitestközvetített gátlása történhet kompetitív, nonkompetitív vagy unkompetitív gátlás révén. Alternatív módon az antitestalapú antagonisták úgy is hathatnak, hogy az I. típusú interferonreceptoron keresztüli intracelluláris jelátvitelt akadályozzák. Ily módon a találmány oltalmi körébe tartoznak kiméra, primatizált, burkolt (védõbevonattal ellátott), „veneered”, humanizált, deimmunizált és humán anti-IFNAR antitestek és I. típusú interferon elleni antitestek és/vagy azok antigénkötõ fragmensei. Ahogy tehát az a leírásban a késõbbiekben szerepel, a találmány szerinti antitestek magukban foglalják az elõzõ antitestek bármelyikének részleteit, változatait és/vagy származékait. Egy antitestrõl vagy annak antigénkötõ fragmensérõl akkor mondjuk, hogy „specifikusan kötõdik” vagy „immunológiailag kötõdik” egy I. típusú interferonreceptorhoz és/vagy „immunológiailag reaktív” azzal szemben, ha (például ELISA vizsgálati eljárással) kimutatható szinten reagál az IFNAR-ral vagy egy I. típusú interferonnal, de nem reagál 2. típusú interferonreceptorral, interferon-g-val vagy más fehérjével.

1

HU 004 627 T2

A leírás szerinti értelemben az „immunológiai kötõdés” általánosságban azokat a típusú nem kovalens kölcsönhatásokat jelenti, amelyek valamely antitest vagy annak egy fragmense és a között az I. típusú interferon vagy receptora között létrejön, amire az antitest specifikus. Az immunológiai kötõdési kölcsönhatások erõssége vagy affinitása kifejezhetõ a kölcsönhatás disszociációs állandójával (Kd), ahol minél kisebb a Kd, annál nagyobb az affinitás. A kiválasztott antitestek immunológiai kötõdési tulajdonságai a technikában jól ismert eljárásokkal számszerûsíthetõk. Az egyik ilyen eljárásban az antigénkötõ hely/antigén komplex kialakulásának és disszociációjának sebességét mérik, ahol e sebességek a komplexet alkotó partnerek koncentrációjától, a kölcsönhatás affinitásától és olyan geometriai paraméterektõl függenek, amelyek mindkét irányban befolyásolják a sebességet. Így tehát mind a „be sebességi állandó” (Kon), mind a „ki sebességi állandó” (Koff) meghatározható a koncentrációk és a tényleges asszociációs és disszociációs sebességek kiszámításával. A Koff/Kon arány lehetõvé teszi az affinitáshoz nem kapcsolódó paraméterek kihúzását, és ily módon egyenlõ a Kd disszociációs állandóval. Általánosságban lásd Davies és munkatársai: Annual Rev. Biochem. 59, 439–473 (1990). Valamely antitest egy „antigénkötõ helye” vagy „kötõrészlete” az immunglobulin-molekula azon részére utal, amely az antigénkötésben részt vesz. Az antigénkötõ helyet a nehéz lánc („H”) és a könnyû lánc („L”) N¹terminális variábilis („V”) régióinak aminosavai alakítják ki. A nehéz és könnyû láncok V¹régióiban van három nagyon változatos szakasz, amit „hipervariábilis régió”-nak neveznek, és amelyek jobban konzerválódott, „vázrégiónak” vagy (angol rövidítéssel) „FR”-nek nevezett szegélyezõ szakaszok közé ékelõdnek be. Az „FR” kifejezés tehát olyan aminosavszekvenciákat jelöl, amelyek természetes körülmények között megtalálhatók az immunglobulinokban, a hipervariábilis régiók között vagy azok szomszédságában. Az antitestmolekulákban a könnyû lánc három hipervariábilis régiója és a nehéz lánc három hipervariábilis régiója úgy helyezkednek el a háromdimenziós térben egymáshoz képest, hogy egy antigénkötõ felszínt alakítanak ki. Az antigénkötõ felszín komplementer a megkötött antigén háromdimenziós felszínével, és az egyes nehéz láncok és könnyû láncok három-három hipervariábilis régióját „komplementaritásmeghatározó régiók”-nak vagy (angol rövidítéssel) „CDR”-eknek nevezik. Az antitestek a technikában jártas szakember számára ismert sokféle módszerrel elõállíthatók. Lásd például Harlow és Lane, „Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). Az antitestek általánosságban elõállíthatók sejttenyésztési módszerekkel, ezen belül monoklonális antitestek termeltetése révén, vagy antitestgének megfelelõ baktérium- vagy emlõssejtes gazdákba történõ transzfekciójával, ami lehetõvé teszi rekombináns antitestek elõállítását. Egy módszernél egy I. típusú interferonreceptort vagy annak egy részletét tartalmazó immunogént elõször beadnak sok különféle állat (például egér, pat-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 6

2

kány, nyúl, juh, hörcsög, kecske vagy transzgenikus egér humán antitestrepertoárral) közül valamelyiknek. Alternatív módon az immunogén tartalmazhat sejteket vagy a receptort vagy a receptor extracelluláris doménjét (természetes vagy rekombináns) tartalmazó sejtkivonatokat. Jobb immunválasz váltható ki, ha az I. típusú interferonreceptort egy hordozófehérjéhez, így például szarvasmarha-eredetû szérumalbuminhoz vagy kürtõscsiga hemocianinhoz (KLH) kapcsoljuk. Az immunogént beinjekciózzák az állati gazdába, elõnyösen elõre meghatározott idõrend szerint, amely egy vagy több emlékeztetõ immunizálást is magában foglal, és az állatokat idõrõl idõre véreztetik. Az immunizálás végezhetõ egy vagy több adjuvánssal, így például komplett vagy inkomplett Freund-féle adjuvánssal. Az I. típusú interferonreceptorra specifikus poliklonális antitesteket ezután például affinitáskromatográfiával tisztíthatjuk meg az ilyen antiszérumokból úgy, hogy az I. típusú interferonreceptor immunogén részleteit megfelelõ szilárd hordozóhoz kapcsoljuk. Valamely I. típusú interferonreceptorra specifikus monoklonális antitesteket például a Kohler és Milstein [Nature 256 (5517), 495–7 (1975)] által leírt módszer segítségével állíthatunk elõ. Az ilyen eljárások során olyan immortalizált sejtvonalakat állítunk elõ, amelyek képesek a kívánt specificitással (azaz a kérdéses ganglioziddal szembeni reaktivitással) rendelkezõ antitest termelésére. Az ilyen sejtvonalak például a fentiek szerint immunizált állatok lépsejtjeibõl állíthatók elõ. A lépsejteket azután például úgy immortalizáljuk, hogy mielómasejtes fúziós partnerekkel fuzionáltatjuk õket, mégpedig elõnyösen olyannal, ami szingén az immunizált állattal. Sok különféle fuzionáltatási módszer alkalmazható. A lépsejteket és a mielómasejteket például pár percig valamely nemionos detergenssel reagáltathatjuk, majd kis sûrûségben egy szelektív táptalajra helyezhetjük, ami a hibrid sejtek növekedését támogatja, de a mielómasejtekét nem. Egy elõnyös megoldási módszer a HAT (hipoxantin, aminopterin, timidin) szelekció. Elegendõ idõ – általában 1¹2 hét – elteltével megfigyelhetõk a hibridek kolóniái. Önálló kolóniákat szelektálunk, és tenyészetük felülúszóiban mérjük egy I. típusú interferonreceptor elleni kötési aktivitást. Az elõnyös hibridómák magas reaktivitásúak és specificitásúak. A monoklonális antitestek a növekvõ hibridómakolóniák felülúszóiból izolálhatók. Emellett sok különféle módszer alkalmazható a hozam növelésére, így például megfelelõ gerinces gazda – például egér – hashártyaüregébe injekciózhatjuk a hibridóma sejtvonalat. A monoklonális antitestet azután az aszciteszfolyadékból vagy a vérbõl lehet begyûjteni. A szennyezõket konvencionális módszerekkel, így például kromatográfiával, gélfiltrálással, precipitációval és extrakcióval választhatjuk el az antitestektõl. A tisztítási folyamatban, például az affinitáskromatográfiás lépésben I. típusú interferonreceptor elleni antitest is alkalmazható. A technikában számos olyan terápiásan alkalmazható molekula ismeretes, amelyek egy antitestmolekula immunológiai kötési tulajdonságait mutatni képes antigénkötõ helyeket tartalmaznak. A papain nevû pro-

1

HU 004 627 T2

teolitikus enzim preferenciálisan hasítja az IgG-molekulákat, amelynek eredményeként számos fragmens keletkezik, és ezek közül kettõ (az „Fab”-fragmensek) egy-egy olyan kovalens heterodimert tartalmaz, amelyben ép antigénkötõ hely van jelen. A pepszin nevû enzim is számos fragmensre tudja hasítani az IgG-molekulákat, amelyek egyike az „Fab’2”-fragmens, ami mindkét antigénkötõ helyet tartalmazza. „Fv”-fragmensek IgM – és ritkább esetekben IgG vagy IgA – immunglobulin-molekulák preferenciális proteolitikus hasításával állíthatók elõ. Az Fv¹, Fab¹ és Fab’2-fragmenseket azonban gyakrabban állítják elõ a technikában ismert rekombináns módszerekkel. Az Fv-fragmens egy nem kovalens VH:VL heterodimert tartalmaz, amely az antigénkötõ helyet tartalmazza, és amely a natív antitestmolekula antigénfelismerõ és ¹kötõ képességének nagy részét megõrzi. Inbar és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69, 2659–2662 (1972); Hochman és munkatársai: Biochem 15, 2706–2710 (1976); és Ehrlich és munkatársai: Biochem 19, 4091–4096 (1980). Az egyláncú Fv („sFv”) antitestek kovalensen kapcsolt VH:VL heterodimerek, amelyek egy olyan fúziós génrõl expresszálódnak, ami a VH¹ és a VL-kódoló géneket tartalmazza egy peptidkódoló kapcsolóval összekapcsolt formában. Huston és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85 (16), 5879–5883 (1988). A szakirodalom számos eljárást ismertet a kémiai szerkezetek megkülönböztetésére ahhoz, hogy az I. típusú interferonreceptor elleni antitest természetesen aggregálódott – de kémiailag szeparált – könnyû és nehéz láncát egy antitest V¹régiójából egy sFv-molekulává alakítsuk, ami olyan háromdimenziós szerkezetbe tekeredik fel, amely lényegében hasonló egy antigénkötõ hely szerkezetéhez. Lásd az 5,091,513 és 5,132,405 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmakat (Houston és munkatársai:); és a 4,964,778 számú egyesült államokbeli szabadalmat (Ladner és munkatársai:). A fent leírt molekulák mindegyike tartalmaz egy nehézlánc- és egy könnyûlánc-CDR-készletet, amelyek olyan nehézlánc¹, illetve könnyûlánc-FR-készletek közé vannak elhelyezve, amelyek támasztékot adnak a CDR-eknek, és meghatározzák a CDR¹ek egymás közti kapcsolatát. A leírás szerinti értelemben a „CDR-készlet” a nehéz vagy könnyû lánc V¹régiók hipervariábilis régióit jelenti. A nehéz vagy könnyû láncok N¹terminusától kezdve e három régiót „CDR1”-nek, „CDR2”-nek és „CDR3”-nak nevezzük. Az antigénkötõ helyek tehát hat CDR¹t tartalmaznak, amelyek a nehéz és könnyû lánc V¹régiókban lévõ CDR-készletekbõl állnak. Az egyetlen CDR¹t (például CDR1¹et, CDR2¹t vagy CDR3¹at) tartalmazó I. típusú interferonantagonistákat a leírásban „molekuláris felismerõegység”-eknek nevezzük. Nagyszámú antigénantitest komplex krisztallográfiás elemzése alapján a CDR¹ek aminosavai kiterjedt kontaktust alakítanak ki a megkötött antigénnel, ahol az antigénkontaktus a nehézlánc-CDR3-mal a legkiterjedtebb. Elsõsorban tehát a molekuláris felismerõegységek felelõsek az antigénkötõ hely specificitásáért. A leírás szerinti értelemben az „FR-készlet” a nehéz vagy könnyû lánc V¹régiók CDR-készleteinek CDR-jeit

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 7

2

keretbe foglaló, négy szegélyezõ aminosavszekvenciát jelenti. Egyes FR¹aminosavak kontaktusba léphetnek a megkötött antigénnel, elsõsorban azonban az FR¹ek felelõsek a V¹régió antigénkötõ hellyé történõ feltekeredéséért, és különösen azok az FR¹aminosavak, amelyek közvetlenül szomszédosak a CDR-ekkel. Az FR¹eken belül egyes aminosavak és egyes szerkezeti jellegzetességek nagyon erõsen konzerválódtak. E szempontból minden V¹régió-szekvencia tartalmaz egy körülbelül 90 aminosav hosszúságú belsõ diszulfidhurkot. Amikor a V¹régiók kötõhellyé feltekerednek, a CDR¹ek kiálló hurokmotívumokként jelennek meg, amelyek egy antigénkötö felszínt alkotnak. Általánosan elfogadott, hogy az FR¹eknek vannak olyan konzerválódott szerkezeti régiói, amelyek – a CDR pontos aminosavszekvenciájától függetlenül – bizonyos „kanonikus” szerkezetekbe kényszerítik a CDR-hurkok feltekeredett alakját. Ismeretes továbbá, hogy egyes FR¹aminosavak olyan domének közötti nem kovalens kontaktusokban is részt vesznek, amelyek stabilizálják az antitest nehéz és könnyû lánca közötti kölcsönhatásokat. Számos olyan „humanizált” antitestmolekulát írtak le, amelyek egy nem humán immunglobulinból származó antigénkötõ helyet tartalmaznak, ezen belül olyan antitesteket is, amelyek kísérõ nem humán V¹régióit humán konstans doménekhez fuzionáltatták [Winter és Milstein, Nature 349, 293–299 (1991); Lobuglio és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 4220–4224 (1989); Shaw és munkatársai: J. Immunol. 138, 4534–4538 (1987); és Brown és munkatársai: Cancer Res. 47, 3577–3583 (1987)], a megfelelõ humán antitest konstans doménjével való fúzió elõtt humán támasztó FR¹be átültetett nem humán CDR-eket [Riechmann és munkatársai: Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen és munkatársai: Science 239, 1534–1536 (1988); és Jones és munkatársai: Nature 321, 522–525 (1986)], és rekombinánsan burkolt rágcsáló FR¹ekkel támasztott rágcsáló CDR-eket (519,596 számú európai közzétételi irat, közzététel: 1992. dec. 23.). Ezeket a „humanizált” molekulákat úgy tervezik, hogy minimalizálják a nem humán antihumán antitestekkel szembeni nemkívánatos immunológiai válaszokat, amely korlátozza az ilyen molekulák emberi fogadókban történõ terápiás alkalmazásainak idõtartamát és hatásosságát. A leírás szerinti értelemben a „burkolt FR¹ek” és a „rekombinánsan burkolt FR¹ek” az FR¹aminosavak szelektív helyettesítését jelentik például egy rágcsálóból származó nehéz vagy könnyû lánc V¹régióból, hogy ezáltal egy olyan xenogén molekulát kapjunk, ami egy olyan antigénkötõ helyet tartalmaz, ami a natív FR feltekeredett szerkezetét lényegében teljes mértékben megõrzi. A burkolási módszerek azon a tudáson alapulnak, hogy egy antigénkötõ hely ligandkötési jellemzõit elsõsorban a nehéz- és könnyûlánc-CDR-készletek antigénkötõ felszínen való relatív elhelyezkedése határozza meg. Davies és munkatársai: Annual Rev. Biochem. 59, 439–473 (1990). Az antigénkötõ specificitás tehát csak akkor õrizhetõ meg a humanizált antitestekben, ha gondosan fenntartjuk a CDR-szerkezeteket, egymás közötti kölcsönhatásaikat és a többi V¹régió doménnel

1

HU 004 627 T2

adott kölcsönhatásaikat. A burkolási módszerek alkalmazásával külsõ (például az oldószer számára hozzáférhetõ) FR¹aminosavakat, amelyekkel az immunrendszer könnyedén találkozik, szelektíven humán aminosavakkal helyettesítjük, amivel egy hibrid molekulát kapunk, ami vagy egy gyengén immunogén, vagy lényegében nem immunogén burkolt felszínbõl áll. A burkolási eljárás a humán antitest variábilis domének Kabat és munkatársai által összegyûjtött, hozzáférhetõ szekvenciaadatait hasznosítja [„Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 4. kiadás (az Egyesült Államok Egészségügyi és Humánszolgáltatási Minisztériuma, az Egyesült Államok kormányának nyomdája, 1987)], illetve a Kabat-féle adatbázis frissítéseit és más egyesült államokbeli vagy külföldi adatbázisokat (nukleinsav- és fehérje-adatbázisokat is). A V¹régió aminosavainak oldószer általi hozzáférhetõsége a humán és egéreredetû antitestfragmensek ismert háromdimenziós szerkezetébõl vezethetõ le. Az egéreredetû antigénkötõ hely burkolásának két általános lépése van. Elõször vesszük a kérdéses antitestmolekula variábilis doménjének FR¹jeit, és összehasonlítjuk a humán variábilis domének megfelelõ FR¹szekvenciáival, amelyeket a fenti forrásokból nyerünk. A leghomológabb humán V¹régiókat azután aminosavanként összehasonlítjuk a megfelelõ egéreredetû aminosavakkal. Az egéreredetû FR azon aminosavait, amelyek eltérnek a humán megfelelõétõl, a technikában ismert rekombináns módszerekkel a humán molekulában lévõ aminosavakkal helyettesítjük. Az aminosavcseréket csak azokon a molekulákon hajtjuk végre, amelyek legalább részben exponáltak (az oldószer számára hozzáférhetõk), és nagy gondossággal járunk el azoknak az aminosavaknak a helyettesítése során, amelyek jelentõs hatással lehetnek a V¹régió domének harmadlagos szerkezetére, így például a prolinok, glicinek és a töltéssel rendelkezõ aminosavak esetében. Ily módon a kapott „burkolt” egéreredetû antigénkötõ helyeket tehát úgy tervezzük, hogy megõrizzék az egéreredetû CDR-aminosavakat, a CDR-ekkel lényegében szomszédos aminosavakat, az eltemetettként vagy legtöbbször eltemetettként (az oldószer számára hozzáférhetetlenként) azonosított aminosavakat, azokat az aminosavakat, amelyekrõl feltételezhetõ, hogy a nehéz és könnyû lánc domének közötti nem kovalens (például elektrosztatikus vagy hidrofób) kontaktusokban vesznek részt, valamint az FR¹ek azon konzerválódott szerkezeti régióit, amelyek feltehetõleg befolyással vannak a CDR-hurkok „kanonikus” harmadlagos szerkezetére. Ezeket a tervezési feltételeket azután olyan rekombináns nukleotidszekvenciák elõállítására alkalmazzuk, amelyek egy egéreredetû antigénkötõ hely nehéz és könnyû láncának CDR-jeit kombinálják humánnak tûnõ FR¹ekbe, amelyek emlõssejtek transzfektálására alkalmazhatók olyan rekombináns humán antitestek expresszáltatása céljából, amelyek az egéreredetû antitestmolekula antigénspecificitását mutatják. A találmány tárgyát képezi továbbá az is, hogy kívánatos lehet a fentiekben vázoltak szerint vagy a technikában hozzáférhetõ egyéb eljárásokkal elõállított

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 8

2

antitestek in vivo immunogenicitásának csökkentése. A csökkentett immunogenicitású antitestek elõállítására példaként említhetõ megközelítés a Biovation (Aberdeen, Egyesült Királyság) által kínált Delmmunisation™ metodológia. Ezzel a metodológiával azonosítjuk az MHC II. osztályba tartozó kötõszekvenciákat tartalmazó humán helper (segítõ) T¹sejt epitópokat, és eltávolítjuk õket a terápiás antitestekbõl annak érdekében, hogy minimalizáljuk a T¹sejtek aktiválódását és differenciálódását az antitest in vivo beadása során. A találmány szerinti egyik elõnyös antitest egy humanizált antitest, amelyet a leírásban CPI-1697-nek nevezünk. Ez az antitest egy H3¹nak nevezett nehéz láncból és egy K1¹nek nevezett könnyû láncból áll. A H3 nehéz lánc és a K1 könnyû lánc variábilis régiójának aminosavszekvenciája a 14A. (1. azonosító számú szekvencia) és a 14B. ábrán (2. azonosító számú szekvencia) látható. A H3 nehéz lánc a 64G12 elnevezésû, egéreredetû anti-IFNAR1 antitest nehéz láncának CDR1¹, CDR2- és CDR3-szekvenciáit tartalmazza egy konszenzus humán immunglobulin nehéz láncának vázszekvenciájába beültetve, míg a K1 könnyû lánc a 64G12 elnevezésû, egéreredetû anti-IFNAR1 antitest könnyû láncának CDR1¹, CDR2- és CDR3-szekvenciáit tartalmazza egy konszenzus humán immunglobulin kappa-könnyûláncának vázszekvenciájába beültetve. A CPI-1697 antitest emellett egy IgG4 konstans régiót is tartalmaz. A „Humanized Antibodies to Interferon Alpha Receptor¹1 (IFNAR1)” címû, 60/465,268 számú, 2003. április 23¹án benyújtott, közös amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés részletesen ismertet a találmány céljára alkalmazható egyéb antitestalapú IFNAR1-antagonistákat, amelyek egy vagy több kismolekulás anyagból állnak, így például olyan kismolekulás anyagokból, amelyek megzavarják valamely I. típusú interferon receptorához (azaz az IFNAR) való kötõdését. Egyes megvalósítási módokban potenciális kismolekulás antagonisták kombinatorikus könyvtárait szûrhetjük az I. típusú interferonhoz vagy az I. típusú interferonreceptorhoz való kötõdési képesség alapján. A hasznos tulajdonságokkal rendelkezõ, új kémiai entitásokat konvencionálisan úgy hozzuk létre, hogy azonosítunk egy valamely kívánatos tulajdonsággal vagy aktivitással, például gátló aktivitással rendelkezõ kémiai vegyületet (amelyet „vezérvegyület”-nek nevezünk), létrehozzuk a vezérvegyület változatait, és értékeljük a vegyületváltozatok tulajdonságait vagy aktivitását. Az ilyen elemzésekhez gyakran nagy átbocsátóképességû szûrési (angol rövidítéssel HTS) eljárásokat alkalmazunk. Egy elõnyös megvalósítási módban a nagy átbocsátóképességû szûrési eljárások során egy olyan könyvtárat hozunk létre, ami nagyszámú potenciális terápiás vegyületet (vegyületjelöltet) tartalmaz. Az ilyen „kombinatorikus vegyületkönyvtárak”¹at azután egy vagy több vizsgálati eljárással szûrjük, hogy azonosítsuk azokat a könyvtártagokat (adott kémiai vegyületeket vagy alosztályokat), amelyek a kívánt kémiai aktivi-

1

HU 004 627 T2

tást mutatják. Az így azonosított vegyületek konvencionális „vezérvegyületek”-ként szolgálhatnak, vagy önmagukban is alkalmazhatók potenciális vagy tényleges IBD terápiás szerként. A kombinatorikus vegyületkönyvtárak különféle olyan kémiai vegyületek gyûjteményei, amelyeket vagy kémiai szintézissel vagy biológiai szintézissel állítottak elõ úgy, hogy reagensként több kémiai „építõblokkot” kombináltak. Egy lineáris kombinatorikus vegyületkönyvtár, így például egy polipeptid- (például mutein¹) könyvtár úgy alakítható ki, hogy adott vegyülethosszúságra (azaz a polipeptidvegyületben lévõ aminosavak számára) minden lehetséges módon kombináljuk aminosavaknak nevezett kémiai építõblokkok egy készletét. A kémiai építõblokkok ilyen kombinatorikus keverésével kémiai vegyületek milliói szintetizálhatók. Gallop és munkatársai: J. Med. Chem. 37 (9), 1233–1251 (1994). A kombinatorikus vegyületkönyvtárak elõállítása és szûrése technikában jártas szakember számára jól ismert. Az ilyen kombinatorikus vegyületkönyvtárak lehetnek többek között peptidkönyvtárak [lásd például: 5,010,175 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; Furka, Pept. Prot. Res. 37, 487–493 (1991); Houghton és munkatársai: Nature 354, 84–88 (1991)], peptoidok (WO 91/19735 számú nemzetközi közzétételi irat), kódolt peptidek (WO 93/20242 számú nemzetközi közzétételi irat), random biooligomerek (WO 92/00091 nemzetközi közzétételi irat), benzodiazepinek (5,288,514 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom), diverzomerek, így például hidantoinok, benzodiazepinek és dipeptidek [Hobbs és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90, 6909–6913 (1993)], vinilóg polipeptidek [Hagihara és munkatársai: J. Amer. Chem. Soc. 114, 6568 (1992)], nem peptid típusú peptidomimetikumok béta-D-glükóz állványzattal [Hirschmann és munkatársai: J. Amer. Chem. Soc. 114, 9217–9218 (1992)], kis vegyületkönyvtárak analóg szerves szintézisei [Chen és munkatársai: J. Amer. Chem. Soc. 116, 2661 (1994)], oligokarbamátok [Cho és munkatársai: Science 261, 1303 (1993)], és/vagy peptidil-foszfonátok [Campbell és munkatársai: J. Org. Chem. 59, 658 (1994)]. Általánosságban lásd Gordon és munkatársai: J. Med. Chem. 37, 1385 (1994), nukleinsavkönyvtárak (lásd például: Strategene Corp.), peptid-nukleinsav-könyvtárak (lásd például: 5,539,083 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom), antitestkönyvtárak [lásd például: Vaughn és munkatársai: Nature Biotechnology 14 (3), 309–314 (1996), és PCT/US96/10287 számú nemzetközi közzétételi irat], szénhidrátkönyvtárak [lásd például: Liang és munkatársai: Science 274, 1520–1522 (1996), és 5,593,853 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom], és kis szerves molekula könyvtárak [lásd például: benzodiazepinek, Baum, C&EN, jan. 18., 33. oldal (1993); izoprenoidok, 5 569 588 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; tiazolidinonok és metatiazanonok, 5 549 974 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; pirrolidinok, 5 525 735 és 5 519 134 számú amerikai egyesült államokbeli szaba-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 9

2

dalom; morfolinovegyületek, 5 506 337 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; benzodiazepinek, 5 288 514 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; és hasonlók]. A kombinatorikus könyvtárak elõállítására szolgáló eszközök kereskedelmi forgalomban beszerezhetõk (lásd például 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosistems, Forster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA). Jól ismert robotrendszerek sorát is kifejlesztették oldatfázisú kémiai vizsgálatokhoz. Ilyen rendszerek az automatizált munkaállomások, mint például a Takeda Chemical Industries LTD. (Osaka, Japán) által kifejlesztett automatizált, szintetizálóberendezés és sok olyan robotrendszer, amely robotkarokat alkalmaz (Zymate II, Zymate Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Kalif. USA), amelyek a vegyészek által elvégzett manuális szintézismûveleteket utánozzák. A fenti eszközök a kellõ módosítással megfelelnek a találmány szerinti alkalmazás céljára. Emellett számos kombinatorikus könyvtár maga is kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ (lásd például ComGenex, Princeton, N. J., Asinex, Moszkva, Oroszország, Tripos Inc., St. Louis, MO, ChemStar Ltd., Moszkva, Oroszország, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD stb.). Az interferon-receptor kölcsönhatások kimutatására IFN-közvetített szignáltranszdukciót detektáló vizsgálati eljárások alkalmazhatók, így például a sejtproliferáció IFN-közvetített gátlása tenyésztett humán tumorsejtekben. Emellett riportergén vizsgálati eljárások is alkalmazhatók, például úgy, hogy valamely IFN-érzékeny génpromoterrõl expresszált riportergéneket alkalmazunk. Lallemand és munkatársai: J. Leukocyte Biol. 60, 137–146 (1996). A megfelelõ riportergének olyan géneket is magukban foglalnak, amelyek luciferázt és zöld fluoreszcens fehérjét termelnek. Az ilyen vizsgálati eljárásokban a riportergén expressziója az IFN-aktivitástól függ, és az IFN-antagonista szelektíven gátolja az IFN-nel stimulált génexpressziót. Az egyes polipeptidek jelenlétének, hiányának, számszerûsítésének vagy egyéb képességeinek értékelésére szolgáló nagy átbocsátóképességû vizsgálati eljárások technikában jártas szakember számára jól ismertek. Hasonló módon jól ismertek a kötési vizsgálati eljárások és a riportergénes vizsgálati eljárások. Az 5 559 410 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom tehát nagy átbocsátóképességû, nukleinsavkötési (azaz mátrixos) szûrési eljárásokat ismertet, az 5 576 220 és az 5 541 061 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak pedig nagy átbocsátóképességû, ligand/antitest kötési szûrési eljárásokat ismertetnek. Emellett a nagy átbocsátóképességû szûrési rendszerek is beszerezhetõk kereskedelmi forgalomban (lásd például Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckmann Instruments Inc., Fullerton, CA; Precision Systems Inc., Natick, MA stb.). Az ilyen rendszerek tipikusan automatizált eljárá-

1

HU 004 627 T2

sok, amelyek az alábbiakat foglalják magukban: mintaés reagenspipettázás, folyadékkiadagolás, mért idejû inkubálások és a mikrolemezek vizsgálati eljárásnak megfelelõ detektorokban történõ végsõ leolvasása(i). Ezek a konfigurálható rendszerek nagy átbocsátóképességet és gyors bemelegedést biztosítanak, továbbá nagyfokú flexibilitást és testreszabhatóságot. Az ilyen rendszerek gyártói részletes protokollokat adnak meg a különféle nagy átbocsátóképességû rendszerekhez. Tehát a Zymark Corp. például mûszaki hírleveleket ad ki, amelyek a géntranszkripció, ligandkötés és hasonlók detektálására szolgáló szûrõrendszereket ismertetik. Egy megvalósítási módban a modulátorok fehérjék, gyakran természetes elõfordulású fehérjék vagy természetes elõfordulású fehérjék fragmensei. Tehát például sejtkivonatok, amelyek fehérjéket tartalmaznak vagy fehérjetartalmú sejtkivonatok random vagy irányított emésztményei.

5

10

15

20 I. típusú interferonreceptor elleni antitesteket tartalmazó készítmények További megvalósítási módokban a találmány tárgyát képezi egy vagy több, leírás szerinti I. típusú interferonreceptor elleni antitest gyógyszerészetileg elfogadható hordozókkal történõ formulázása egy sejtnek vagy állatnak való beadás céljából, amely történhet önmagában vagy egy vagy több terápiás módozattal kombináltan. A találmány szerint alkalmazható terápiás rendtõl függõen például a találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak emellett egy vagy több további terápiás szert, így például valamely immunszuppresszív szert, gyulladásellenes szert, szteroidot, immunmoduláló szert, citokint és TNF-antagonistát. A példaként említhetõ immunmodulátorok közé tartozik az azathioprine, a methotrexate, a ciklosporine, az FK506, a rapamycin és a mycophenolate mofetil. A példaként említhetõ gyulladásellenes szerek közé tartozik az 5¹aminoszalicilsav, a sulfasalazine és az olsalazine. A példaként említhetõ szteroidok közé tartoznak a kortikoszteroidok, a glükokortikoszteroidok, a prednisone, a prednisolone, a hydrocortisone, a metilprednisolone, a dexamethasone és az ACTH. A példaként említhetõ immunmoduláló szerek közé tartozik a PVAC, az anti-CD40 ligand, az anti-CD40, a natalizumab (Antegren™), az anti-VCAM1 és az anti-ICAM1. A példaként említhetõ citokinek közé tartozik az IL–10. A példaként említhetõ TNF-antagonisták közé tartozik az infliximab (Remicade®), az entercept (Enbrel®), az adalimumab (Humira®) és a CDP870. Szakember számára nyilvánvaló, hogy ha kívánatos, a találmány szerinti készítmény beadható más szerekkel, így például más fehérjékkel vagy polipeptidekkel vagy különféle gyógyszerészetileg aktív szerekkel kombináltan is. Valójában látszólag nincs korlát arra nézve, hogy milyen más komponenseket adhatunk még hozzá, mivel a további szerek nem okoznak jelentõs káros hatásokat a célsejtekkel vagy gazdaszövetekkel való érintkeztetést követõen. A készítmények tehát sok különféle más szerrel együtt is bejuttathatók,

25

30

35

40

45

50

55

60 10

2

ahogy azt az adott helyzet megköveteli. Az ilyen készítmények tisztítása történhet gazdasejtekbõl vagy más biológiai forrásból, vagy alternatív módon lehet kémiailag szintetizált is, ahogy az a leírásban szerepel. A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát képezik gyógyászati készítmények, amelyek egy vagy több leírás szerinti antitestet tartalmaznak valamely fiziológiásan elfogadható hordozóval kombináltan. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a leírásban szereplõ gyógyászati készítmények a találmány szerinti polipeptidek gyógyszerészetileg elfogadható sóit is tartalmazhatják. Ilyen sók elõállíthatók például gyógyszerészetileg elfogadható nem toxikus bázisokból, ezen belül szerves bázisokból (például primer, szekunder és tercier aminok és bázikus aminosavak) és szervetlen bázisokból (például nátrium¹, kálium¹, lítium¹, ammónium¹, kalcium- és magnéziumsók). A technikában jártas szakember számára ismert, bármely megfelelõ hordozó alkalmazható a találmány szerinti készítményekben, és a hordozó típusa tipikusan a beadás módjától függõen változik. A találmány szerinti készítmények bármely megfelelõ beadási módhoz formulázhatók, ezen belül például szájon át, orron át, nyálkahártyán át, intravénásan, intraperitoneálisan és intramuszkulárisan történõ beadáshoz. Az ilyen gyógyászati készítményekben alkalmazható hordozók biológiailag kompatibilisek, és lehetnek biológiailag lebonthatók is. Egyes megvalósítási módokban a formulázás elõnyösen egy viszonylag állandó szinten biztosítja az aktív komponens felszabadulását. Más megvalósítási módokban azonban kívánatos lehet a beadást követõ azonnali és gyors felszabadulás. Az ilyen készítmények ismert módszerekkel történõ formulázása teljes mértékben szakember köteles tudásához tartozik. E szempontból illusztrációként használható hordozók a poli(laktid-koglikolid), a poliakrilát, a latex, a keményítõ, a cellulóz, a dextrán és a hasonlók. Más, illusztrációként használható, késleltetett felszabadulású hordozók a szupramolekuláris biovektorok, amelyek egy nem folyadék típusú hidrofil magot (például egy keresztkötött poliszacharidot vagy oligoszacharidot) tartalmaznak, és adott esetben egy külsõ réteget is, amely egy amfifil vegyületbõl, így például valamely foszfolipidbõl áll (lásd például az 5 151 254 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmat és a WO 94/20078, WO/94/23701 és a WO 96/06638 számú nemzetközi közzétételi iratokat). Az ilyen nyújtott felszabadulású formulákban a hatóanyag mennyisége a beültetés helyétõl, a felszabadulás várható sebességétõl és idõtartamától, valamint a kezelendõ vagy megelõzendõ betegség jellegétõl függ. Egy másik, illusztrációként használható megvalósítási módban biológiailag lebontható mikrogömböket (például polilaktát-poliglikolát) alkalmazunk hordozóként a találmány szerinti készítményekben. Megfelelõ biológiailag lebontható mikrogömböket ismertet például a 4 897 268, az 5 075 109, az 5 928 647, az 5 811 128, az 5 820 883, az 5 853 763, az 5 814 344, az 5 407 609 és az 5 942 252 számú amerikai egye-

1

HU 004 627 T2

sült államokbeli szabadalom. A módosított hepatitis B magfehérje hordozórendszerek, mint például a WO/99 40934 számú nemzetközi közzétételi iratban és a leírásban szereplõ egyéb hivatkozásokban ismertetett rendszerek sokféle alkalmazásban felhasználhatók. Egy másik illusztrációként használható hordozó/bejuttató rendszer egy olyan hordozót alkalmaz, amely részecske-fehérje komplexeket tartalmaz, így például olyanokat, amelyeket az 5 928 647 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom ismertet, és amelyek képesek I. osztályra korlátozott citotoxikus T¹limfocita választ kiváltani a gazdában. A találmány szerinti gyógyászati készítmények gyakran tartalmaznak egy vagy több puffert is (például semleges sópuffert vagy sós foszfátpuffert), valamint szénhidrátokat (például glükózt, mannózt, szacharózt vagy dextránokat), mannitolt, fehérjéket, polipeptideket vagy aminosavakat, így például glicint, antioxidánsokat, bakteriosztatikumokat, kelátorokat, így például EDTA¹t vagy glutationt, adjuvánsokat (például alumínium-hidroxidot), olyan oldott anyagokat, amelyek az alany vérével izotóniássá, hipotóniássá vagy gyengén hipertóniássá teszik a formulát, szuszpendálószereket, sûrítõanyagokat és/vagy tartósítószereket. Alternatív módon a találmány szerinti készítmények formulázhatók liofilizátumként is. A leírásban ismertetett gyógyszerészeti készítmények kiszerelése történhet egységdózisos vagy sokdózisos edényben, így például lezárt ampullákban vagy fiolákban. Az ilyen edények tipikusan úgy vannak lezárva, hogy a felhasználásig megõrizzék a formula sterilitását és stabilitását. A készítmények általánosságban tárolhatók szuszpenzió, oldat vagy emulzió formájában, olajos vagy vizes hordozókban. Alternatív módon a gyógyszerészeti készítmény tárolható fagyasztva szárított állapotban is, amihez közvetlenül a felhasználás elõtt csak steril folyékony hordozót kell hozzáadni. A leírásban ismertetett adott készítmények különféle kezelési rendekben történõ alkalmazásához, ezen belül például szájon át, intravénásan, intranazálisan és intramuszkulárisan történõ beadásához és formulázásához a megfelelõ adagolási és kezelési rendek kialakítása a technikában jól ismert, és néhányat közülük általános illusztrálási céllal az alábbiakban röviden ismertetünk. Egyes alkalmazásokban a leírásban ismertetett gyógyászati készítmények szájon át is beadhatók valamely állatnak. E készítmények, mint olyanok, formulázhatók inert hígítószerben vagy egy asszimilálható ehetõ hordozóban, vagy bezárhatók kemény- vagy lágyzselatin-kapszulákba, vagy tablettába préselhetõk, vagy közvetlenül is beépíthetõk az étrendet alkotó élelmiszerekbe. A hatóanyagok beépíthetõk excipiensekbe is, és felhasználhatók lenyelhetõ tabletták, orális tabletták, pasztillák, kapszulák, elixírek, szuszpenziók, szirupok, ostyák és hasonlók formájában [lásd például Mathiowitz és munkatársai: Nature 386 (6623), 410–4 (1997. márc. 27.); Hwang és munkatársai: Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 15 (3), 243–84 (1998); 5 641 515 számú

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 11

2

amerikai egyesült államokbeli szabadalom; 5 580 579 és 5 792 451 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom]. A tabletták, pasztillák, pirulák és hasonlók emellett tartalmazhatnak különféle további komponenseket is, például valamely kötõanyagot, így például tragakantmézgát, gumiarábikumot, kukoricakeményítõt, vagy zselatint; excipienseket, így például dikalcium-foszfátot; dezintegrálószert, így például kukoricakeményítõt, burgonyakeményítõt, alginsavat és hasonlókat; kenõanyagot, így például magnézium-sztearátot; és édesítõszert, így például szacharózt, laktózt vagy szacharint adhatunk hozzá, vagy ízesítõanyagot, így például borsmentát, gaulteriaolajat vagy cseresznyearomát. Ha a dózisegységforma kapszula, akkor a fenti típusú anyagok mellett tartalmazhat folyékony hordozót is. Különféle más anyagok is jelen lehetnek bevonatként, vagy hogy egyéb módon módosítsák a dózisegység fizikai formáját. A tabletták, pirulák vagy kapszulák lehetnek sellakkal, cukorral vagy mindkettõvel bevontak. A dózisegység elõállításához felhasznált bármely anyagnak természetesen gyógyszerészetileg tisztának és az alkalmazott mennyiségben lényegében nem toxikusnak kell lennie. A hatóanyagokat emellett beépíthetjük nyújtott felszabadulású készítménybe és formulákba. Az ilyen formulák tipikusan legalább 0,1%-ban vagy nagyobb mennyiségben tartalmazzák a hatóanyagot, bár a hatóanyag(ok) százalékos aránya természetesen változhat, és célszerûen az egész formula körülbelül 1 és 2 és 60 és 70 tömeg- vagy térfogat%¹a között mozoghat. A hatóanyag(ok) mennyisége az egyes terápiásan hasznos készítményekben természetesen elõállítható oly módon, hogy a vegyület bármely adott egységdózisában megfelelõ adagolást kapunk. Az ilyen gyógyászati készítmények elõállítása során a technikában jártas szakember olyan tényezõket is figyelembe vesz, mint az oldhatóság, biológiai hozzáférhetõség, biológiai féléletidõ, beadási útvonal, eltarthatósági idõ, valamint egyéb farmakológiai megfontolások, és mint ilyenek, különféle adagolások és kezelési rendek lehetnek kívánatosak. Szájon át történõ beadáshoz a találmány szerinti készítmények alternatív módon beépíthetõk egy vagy több excipiensbe is szájöblítõ, fogkrém, orális tabletta, orális permet („spray”) vagy szublingvális, szájon át beadott formulák formájában. Alternatív módon a hatóanyag beépíthetõ egy orális oldatba is, például olyanba, amely nátrium-borátot, glicerint és kálium-bikarbonátot tartalmaz, vagy diszpergálható egy fogkrémben, vagy terápiás mennyiségben hozzáadható egy készítményhez, amely tartalmazhat vizet, kötõanyagokat, koptatóanyagokat, ízesítõszereket, habosítószereket és nedvesítõszereket. Alternatív módon a készítmények olyan tabletta vagy oldat formájában is kiszerelhetõk, amelyet a nyelv alá kell helyezni, vagy más módon fel kell oldani a szájban. Bizonyos körülmények között kívánatos lehet, hogy a leírásban ismertetett gyógyászati készítményeket intravénásan vagy intramuszkulárisan adjuk be. Technikában jártas szakember számára jól ismertek az ilyen

1

HU 004 627 T2

megközelítések, amelyek némelyikét részletesebben az 5 543 158, az 5 641 515 és az 5 339 363 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak ismertetik. Bizonyos megvalósítási módokban a hatóanyagok oldatai szabad bázisként vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóként is elõállíthatók vízben, amelyhez megfelelõ módon egy felületaktív anyagot, például hidroxipropil-cellulózt kevertünk. A diszperziók elkészíthetõk emellett glicerinben, folyékony polietilénglikolban, valamint ezek keverékeiben és olajokban. A szokásos tárolási és felhasználási körülmények között e készítmények általában tartósítószert is tartalmaznak, amely megakadályozza a mikroorganizmusok növekedését. Az injekciós alkalmazáshoz illusztrációként használható gyógyszerészeti formák közé tartoznak a vényre készített steril injekciós oldatokhoz vagy diszperziókhoz való vizes oldatok vagy diszperziók és steril porok (lásd például az 5,466,468 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmat). A formának minden esetben sterilnek kell lennie, illetve olyan mértékben folyékonynak, ami lehetõvé teszi a fecskendõ egyszerû használatát. A gyártási és tárolási körülmények között stabilnak kell lennie, illetve tartósítva kell hogy legyen a mikroorganizmusok, így például baktériumok és gombák szennyezõ hatása ellen. A hordozó lehet valamely oldat vagy diszperziós közeg, amely például vizet, etanolt, poliolt (például glicerint, propilénglikolt és folyékony polietilénglikolt és hasonlókat), ezek megfelelõ keverékeit és/vagy növényi olajokat tartalmaz. A megfelelõ folyékonyság fenntartható például bevonatok, így például lecitin alkalmazásával, diszperzió esetén a szükséges részecskeméret fenntartásával és/vagy felületaktív anyagok felhasználásával. A mikroorganizmusok hatásának megelõzése különféle baktérium- és gombaellenes szerek, például parabének, klór-butanol, fenol, szorbinsav, thimerosal és hasonlók segítségével könnyíthetõ meg. Sok esetben elõnyös, ha izotóniás szereket, például cukrokat vagy nátriumkloridot is teszünk bele. Az injekciós készítmények felszívódásának meghosszabbítása érdekében felszívódáskésleltetõ szereket, például alumínium-monosztearátot és zselatint alkalmazhatunk a készítményben. Egy megvalósítási módban az oldatot szükség esetén megfelelõen pufferelni kell, és a folyékony hígítószert elõször sóoldat vagy glükóz hozzáadásával izotóniássá kell tenni. Ezek a konkrét vizes oldatok különösen alkalmasak intravénás vagy intramuszkuláris beadásra. Ebben az összefüggésben, a leírás fényében a technikában jártas szakember számára az alkalmazható steril vizes közegek ismertek lesznek. Egy dózis feloldható például 1 ml izotóniás NaCl-oldatban, és vagy hozzáadható 1000 ml hypodermoclysis-folyadékhoz, vagy a kívánt infúziós helyen át beinjekciózható (lásd például „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 15. kiadás, 1035–1038. és 1570–1580. oldal). A kezelés alatt álló beteg állapotától függõen az adagolás szükségképpen némileg megváltozhat. Humán beadás esetén emellett a készítményeknek természetesen elõnyösen meg kell felelniük a sterilitási, pirogenitási és általános biztonsági és tisztasági elõírásoknak, ahogy

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 12

2

arról az FDA (azaz az Amerikai Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerellenõrzõ Hatósága) Biológia Készítmények Hivatalának (Office of Biologics) szabványa rendelkezik. A találmány egy más megvalósítási módjában a leírásban ismertetett készítmények semleges vagy só formában is formulázhatók. Az illusztrációként használható gyógyszerészetileg elfogadható sók közé tartoznak a (fehérje szabad aminosavaival képzett) savaddíciós sók, valamint azok, amelyeket szervetlen savakkal, így például sósavval vagy foszforsavval, vagy szerves savakkal, így például ecetsavval, oxálsavval, borkõsavval, mandulasavval és hasonlókkal alkotnak. A szabad karboxilcsoportokkal alkotott sók is elõállíthatók szervetlen bázisokból, így például nátrium¹, kálium¹, ammónium¹, kalcium- vagy vas-hidroxidból, és szerves bázisokból, így például izopropil-aminból, trimetil-aminból, hisztidinbõl, prokainból és hasonlókból. A formulázást követõen az oldatokat olyan módon kell beadni, ami kompatibilis a dózisformulával, és olyan mennyiségben, ami terápiásan hatásos. A hordozók emellett tartalmazhatnak még mindenféle oldószert, diszpergálóközeget, vehikulumot, bevonatot, hígítószert, baktérium- és gombaellenes szereket, izotóniás és felszívódáskésleltetõ szereket, puffereket, hordozóoldatokat, szuszpenziókat, kolloidokat és hasonlókat. Az ilyen közegek és szerek gyógyszerészetileg aktív anyagoknál történõ alkalmazása a technikában jól ismert. Ha egy hagyományos közeg vagy szer nem inkompatibilis a hatóanyaggal, akkor a terápiás készítményekben történõ alkalmazását is úgy tekintjük, hogy a találmány tárgyát képezi. A készítményekbe kiegészítõ hatóanyagok is beépíthetõk. A „gyógyszerészetileg elfogadható” kifejezés olyan molekuláris entitásokat és készítményeket jelent, amelyek nem váltanak ki allergiás vagy hasonló nemkívánatos reakciókat embernek történõ beadáskor. Egyes megvalósítási módokban a gyógyászati készítmények intranazális permetek segítségével, inhalálással és/vagy egyéb aeroszolos bejuttatóvehikulumok segítségével is bejuttathatók. Gének, nukleinsavak és peptidkészítmények aeroszolos orrpermetekkel történõ, közvetlen tüdõbe juttatására szolgáló eljárásokat ismertet például az 5 756 353 és az 5 804 212 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom. Hasonló módon jól ismert a gyógyszerészeti technikában a készítmények intranazális mikrorészecskegyantákat [Tagenaka és munkatársai: J. Controlled Release 52 (1–2), 81–7 (1998. március 2.)] és a lizofoszfatidil-inozitol-vegyületeket (5 725 871 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom) alkalmazó bejuttatása. Ehhez hasonlóan, politetrafluoroetilén hordozómátrix formájában illusztrációként használható nyálkahártyán keresztüli bejuttatást ismertet az 5 780 045 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom. Egyes megvalósítási módokban liposzómákat, nanokapszulákat, mikrorészecskéket, lipidrészecskéket, vezikulumokat és hasonlókat alkalmazunk arra, hogy a találmány szerinti készítményeket valamely megfelelõ gazdasejtbe/organizmusba juttassuk. A találmány sze-

1

HU 004 627 T2

rinti készítmények közelebbrõl bejuttatásra formulázhatók valamely lipidrészecskébe, liposzómába, vezikulumba, nanogömbbe vagy nanorészecskébe vagy hasonlóba kapszulázottan is. Alternatív módon a találmány szerinti készítmények kovalensen vagy nem kovalensen hozzákapcsolhatók ilyen hordozórészecskék felületéhez. A liposzómák és liposzómaszerû készítmények elkészítése és potenciális hatóanyag-hordozókként történõ alkalmazása technikában jártas szakember számára jól ismert [lásd például Lasic, Trends Biotechnol 16 (7), 307–21 (1998. július); Takakura, Nippon Rinsho 56 (3), 691–5 (1998. március); Chandran és munkatársai: Indian J. Exp. Biol. 35 (8), 801–9 (1997. augusztus); Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 12 (2–3), 233–61 (1995); 5 567 434 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; 5 552 157 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; 5 565 213 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; 5 738 868 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom és 5 795 587 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom]. Egyes megvalósítási módokban a liposzómákat foszfolipidekbõl készítjük, amelyek egy vizes közegben vannak diszpergálva, és spontán módon soklemezes, koncentrikus kettõsréteg-vezikulumokat [más néven soklemezes vezikulumokat (angol rövidítéssel MLVket)] alkotnak. Alternatív módon, más megvalósítási módokban a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti készítmények gyógyszerészetileg elfogadható nanokapszulás formulái. A nanokapszulák általánosságban stabilis és reprodukálható módon zárják magukba a vegyületeket [lásd például Quintanar-Guerrero és munkatársai: Drug Dev Ind Pharm. 24 (12), 1113–28 (1998. december)]. A sejten belüli polimer túlterhelés miatti mellékhatások elkerülése végett ultrafinom (körülbelül 0,1 mm¹es) részecskék is tervezhetõk olyan polimerek alkalmazásával, amelyek in vivo lebonthatók. Ilyen részecskék elõállíthatók például az alábbiak szerint: Couvreur és munkatársai: Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 5 (1), 1–20 (1988); Muhlen és munkatársai: Eur. J. Pharm Biopharm. 45 (2), 149–55 (1998. március); Zambaux és munkatársai: J. Controlled Release. 50 (1–3), 31–40 (1998. január 2.); és 5 145 684 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom. I. típusú interferonreceptor elleni antitestek alkalmazásai gyulladásos bélbetegség kezelésére Ahogy az a leírásban szerepel, a találmány tárgyát képezik emellett I. típusú interferonreceptor elleni antitestek terápiás alkalmazásai gyulladásos bélbetegség, ezen belül például coeliákia, Crohn-betegség és fekélyes vastagbélbetegség kezelésére. Egyes megvalósítási módokban a találmány tárgyát képezik továbbá alkalmazások, amelyek a következõ lépésekbõl állnak: (a) egy IBD-ben szenvedõ betegnek toleranciakiváltó mennyiségben beadunk valamely I. típusú interferonreceptor elleni antitestet, és (b) terápiásan hatásos mennyiségben beadunk a betegnek valamely I. típusú

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 13

2

interferonantagonistát. Emellett kívánatos lehet, hogy egy vagy több I. típusú interferonantagonistát más terápiás szerekkel, így például valamely immunszuppresszív szerrel, gyulladásellenes szerrel, szteroiddal, immunmoduláló szerrel, citokinnel és TNF-antagonistával – például a fentiekben megadottakkal – kombináltan adjuk be. A leírásban ismertetett terápiás készítmények beadási útvonala és gyakorisága, valamint adagolása egyénenként változó és standard módszerekkel könnyen meghatározható. A találmány szerinti eljárásokkal az antagonista bármely megfelelõ bejuttatási útvonalon át beadható, amely megfelelõ biológiai hozzáférhetõséget biztosít. Egyes megvalósítási módokban tehát a megfelelõ beadási útvonalak közé tartozik az intravénás bolusz, az intravénás lassú bolusz vagy az infúzió. Más megvalósítási módokban az I. típusú interferonantagonista beadása történhet szubkután, intramuszkuláris, transzdermális vagy intradermális injekcióval. Alternatív megvalósítási módokban a találmány tárgyát képezi, hogy a beadás történhet nyálkahártyán át történõ bejuttatással is, így például inhalálással (például felszívással), vagy orr-garati vagy szájon át történõ beadással. Az antitesttel és/vagy annak valamely antigénkötõ fragmensével kapcsolatos egyes megvalósítási módokban a beadási útvonal lehet szubkután, intramuszkuláris és/vagy intravénás. Az intravénás beadás történhet bolusz injekcióval, lassú bolusz injekcióval vagy infúzióban. Az alternatív megvalósítási módokban a találmány tárgyát képezi, hogy az antitestek transzdermálisan, intradermálisan vagy nyálkahártyán keresztül is bejuttathatók. Általánosságban véve valamely megfelelõ adagolási és kezelési rend a terápiás elõny biztosításához szükséges mennyiségben biztosítja a hatóanyago(ka)t. Az ilyen válasz úgy követhetõ nyomon, ha javult klinikai kimenetel kerül megállapításra (például az alábbiak csökkenése: hasi fájdalom, véres hasmenés, bélen kívüli manifesztációk, így például ízületi gyulladás, érhártyagyulladás és bõrelváltozások stb., valamint a gyulladásos sejtek vékony- és vastagbéli akkumulációja). A kezelési rend pontos jellegétõl függõen a leírásban ismertetett I. típusú interferonreceptor elleni antitestek megfelelõ adagolása 0,1 mg/testsúlykilogrammtól 50 mg/testsúlykilogrammig, elõnyösebben 0,5 mg/testsúlykilogrammtól 10 mg/testsúlykilogrammig, és még elõnyösebben 2 mg/testsúlykilogrammtól 5 mg/testsúlykilogrammig terjedhet. Egyes megvalósítási módokban több ismételt dózis is beadható. A találmány egyes megvalósítási módjaiban az adagolási frekvencia a napi egyszeritõl a havi egyszeriig, elõnyösebben a hetente kétszeritõl a kéthetente egyszeriig terjedhet, és még elõnyösebben körülbelül hetente egyszeri. A találmány még további megvalósítási módjaiban a találmány tárgyát képezik alkalmazások, amely alkalmazások az alábbi lépésekbõl állnak: (a) elsõ gyógyszerként toleranciakiváltó mennyiségben beadunk egy I. típusú interferonreceptor antitestet, és (b) második

1

HU 004 627 T2

gyógyszerként terápiás dózisban beadunk egy I. típusú interferonantagonistát. Ezen eljárások elõnyös megvalósítási módjaiban az interferonantagonista és vagy ¹antitest irányulhat az I. típusú interferonreceptor (IFNAR) ellen. A példaként említhetõ I. típusú interferon elleni antitestek lehetnek kiméra, primatizált, humanizált, deimmunizált és humán antitestek. Egyes elõnyös anti-IFNAR antitestek közé tartoznak olyanok is, amelyek az IFNAR1-hez kötõdnek; ilyenek például a 64G12 elnevezésû, egéreredetû monoklonális antitest és/vagy a CPI-1697 elnevezésû mesterséges humán változat. A kezdeti toleranciakiváltó dózis elérése érdekében az I. típusú interferon elleni antitestek emberekben és más fõemlõsökben immunogének lehetnek. Az immunválasz lehet biológiailag jelentõs, és ronthatja az antitest terápiás hatásosságát még akkor is, ha az antitest részben vagy fõleg humán immunglobulin-szekvenciákból áll, így például a kiméra, primatizált vagy humanizált antitestek esetében. Egyes elõnyös megvalósítási módokban elõször magas dózisban adjuk be az antitestet oly módon, hogy kialakítjuk a terápiás antitest elleni immunológiai tolerancia egy bizonyos mértékét. A toleranciakiváltó dózis elegendõ ahhoz, hogy az antiIFNAR antitest ismételt beadásakor megelõzze vagy csökkentse az IgG-antitestes válasz kiváltódását. Az elsõ I. típusú interferonreceptor elleni antitest toleranciakiváltó dózisa elõnyösen 10 mg/testsúlykilogrammtól 50 mg/testsúlykilogrammig terjedõ tartományban mozog. A toleranciakiváltó dózis még elõnyösebben a 20¹tól a 40 mg/kg¹ig terjedõ tartományban mozog. A toleranciakiváltó dózis még ennél is elõnyösebben a 20¹tól a 25 mg/kg¹ig terjedõ tartományban mozog. A fenti terápiás rendeken belül az I. típusú interferonreceptor elleni antitest terápiásan hatásos dózisát elõnyösen a 0,1 mg/testsúlykilogrammtól a 10 mg/testsúlykilogrammig terjedõ tartományban kell beadni. A még elõnyösebb második terápiásan hatásos dózisok a 0,2-tõl az 5 mg/testsúlykilogrammig terjedõ tartományban mozognak. A még ennél is elõnyösebb terápiásan hatásos dózisok a 0,5-tõl a 2 mg/kg¹ig terjedõ tartományban mozognak. Alternatív megvalósítási módokban a késõbbi terápiás dózis vagy dózisok lehetnek ugyanúgy vagy eltérõen formulázottak, mint a toleranciakiváltó dózis, és/vagy azonos vagy eltérõ útvonalon is beadhatók, mint a toleranciakiváltó dózis. A terápiás dózisokat elõnyösen intravénásan, intramuszkulárisan vagy szubkután kell beadni. Az alábbi példát szemléltetés céljából nyilvánítjuk ki, nem pedig az oltalmi kör korlátozásaként. Példa: IFNAR¹1 antagonisták alkalmazása gyulladásos bélbetegség kezelésében Az embernél jelentkezõ gyulladásos bélbetegség (IBD) technikában elismert modellje egy újvilági fõemlõs fajban, a lisztmajmocskában (angol rövidítéssel CTT, Sanguinus oedipus) elõforduló idiopátiás vastagbélgyulladás. Az érintett állatok a fekélyes vastagbélgyulladáshoz hasonló patofiziológiát mutatnak hasonló

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 14

2

vastagbéli szövettani elváltozásokkal, és az emberekben és CTT-kben közös utóbaj a vastagbélrák. A vastagbélgyulladás CTT-kben morbiditással és mortalitással társul – mindkettõ a vastagbélgyulladási fázisban és vastagbélrák miatt következik be. A vastagbélgyulladást a tünetek ismétlõdõ kitörése és enyhülése jellemzi. A betegségi idõszakok általában körülbelül 4 hétig tartanak, bár jelentõs az egyéni variabilitás. A klinikai tünetek közé tartozik a véres hasmenés, rossz emésztési/rossz felszívódási szindrómával. A betegséget szövettanilag az jellemzi, hogy neutrofil sejtek infiltrálódnak a vastagbél nyálkahártya epitéliumába, és progresszív degeneratív elváltozások jelennek meg a bélben lévõ tüszõüregek morfológiájában, ami lehetõ teszi a betegség progressziós fázisának diagnosztizálását. Bár az ok ismeretlen, az étrendi és fertõzõ ágenseknek valószínûleg megvan a szerepe, és majdnem biztosan az állapot súlyosbodásához vezetnek. Kifejlesztettük az egéreredetû 64G12 antitest egy mesterséges humanizált formáját, a CPI-1697¹et (IgG4k), amely kötõdik az IFNAR1-hez, és kompetál a 64G12-vel egy hasonló epitóp megkötéséért. A CPI1697¹et az alábbiak szerint alkalmaztuk CTT-kben az idiopátiás vastagbélgyulladás kezelésére. Egy kolóniából az alábbiak alapján kísérletileg naiv állatokat választottunk ki: vastagbélgyulladás a kórtörténetben és klinikai tünetek, ezen belül hasmenés és súlycsökkenés a vizsgálatba történõ felvételkor. A kísérlet megkezdése elõtt két héttel az állatok vastagbél-biopszián estek át, ami igazolta a vastagbél gyulladtságát. Egy megállapított számszerûsítõ séma szerint minden vizsgálati állat pozitív, 2¹es szövettani vastagbélgyulladás pontszámot kapott a 0 és 4 közötti tartományban (0=normálszövet) az aktivitásra, a hiperpláziára és a krónikusságra. Madara és munkatársai: Gastroenterology 88, 13–19 (1985). A vizsgálatba való felvétel elõtt az állatokat átfolyásos citometriával IFNAR1¹re elõszûrtük, amelyhez fikoeritrinnel konjugált CPI-1697¹et alkalmaztunk izolált perifériás vérleukocitákon. A CPI1697¹et sterilszûrtük, majd 20 mg/ml¹es koncentrációjú vehikulumoldatot készítettünk belõle [Dulbecco-féle Na PBS (steril, USP)]. A kísérletet két egymást követõ fázisban végeztük. Az elsõ kísérletben (I. fázis) 5 vastagbélgyulladásban szenvedõ állatot kezeltünk a CPI-1697-tel elõször 20 mg/kg¹os dózisban, amit lassú iv. infúzióban adtunk be, majd hét alkalommal 10 mg/kg¹os dózisban, amit im. adtuk be hetente kétszer, 4 héten át. Az öt kontrollállatnak egyenlõ térfogatú vehikulumoldatot (Dulbeccoféle Na PBS) adtunk azonos adagolási menetrend szerint. A második kísérletben (II. fázis) 6 állatot kezeltünk a CPI-1697-tel ugyanolyan kiindulási iv. dózisban (20 mg/kg), majd 8 héten át hetente kétszer im. dózisban (10 mg/kg). Az 5 kontrollállatnak azonos menetrend szerint vehikulumoldatot adtunk. Mindkét fázisban nyomon követtük az állatok testsúlyát (hetente kétszer), hasmenését, valamint idõszakosan vastagbélbiopszia szövettani pontszámukat is. Az I. fázisban az állatokat a kezelés idõtartama alatt is, majd a kezelési idõszak végét követõen 6 hé-

1

HU 004 627 T2

tig, a II. fázis végét követõen pedig 4 hétig értékeltük. Minden állatnál utánkövetést végeztünk az I. fázis végét követõ 51. héten és a II. fázis végét követõ 27. héten is. A hasmenést legalább hetente 5¹ször vizuálisan értékeltük és pontszámoztuk egy standardizált 0–5¹ös skála segítségével, ahol a 0 jelentette a normálszékletet és az 5¹ös jelentette a nagyon vizes hasmenést. Rendszeres idõközönként vénás vérmintákat vettünk, amelyekben elemeztük a fõemlõs antihumán antitestes (angol rövidítéssel PAHA) immunválaszokat. A kezelés és utánkövetés során idõközönként három helyrõl (a vastagbél disztális végétõl 1, 3 és 6 cm¹re) vastagbélbiopsziát vettünk, és a szövetet formalinban rögzítettük, metszeteket készítettünk belõle, és szövettani értékelés céljára hematoxilinnel és eozinnel festettük. A metszeteket egy olyan állatorvosi hisztopatológus pontszámozta, aki nem ismerte a kezelési csoportokat. A 0¹tól (normál) 4¹ig (súlyos) terjedõ pontszámozási rendszer 3 független kritériumot alkalmazott az alábbiak szerint (Madara és munkatársai: 1985). Az elsõ paraméter az „aktivitás” volt – az infiltrálódó neutrofil sejtek száma –, a második a „krónikusság” – a vastagbél morfológiájában bekövetkezõ tartós változások, ezen belül a tüszõüregek eltûnése és a mirigyszerkezet elváltozásai, amelyek a vastagbélgyulladás idõtartama alatt lassan fokozódtak –, a harmadik pedig a „hiperplázia” – a nyálkahártyaszövet, ezen belül a sejtes szövet és kötõszövet rendellenes megvastagodása. Az átlagos szövettani pontszámot a három biopsziaszintbõl határoztuk meg a 3 értékelt paraméter mindegyikére és minden egyes idõpontra. Az I. és II. fázisban mért testsúlyokat az 1A–1D., illetve a 2A–2D. ábrák mutatják. Az I. és II. fázisban mért hasmenési pontszámokat a 3A–3D., illetve a 4A–4D. ábrák mutatják. Az I. és II. fázisban mért „aktivitási” pontszámokat az 5A–5D., illetve a 6A–4D. ábrák mutatják. Az I. és II. fázisban mért „krónikussági” pontszámokat a 7A–7D., illetve a 8A–8D. ábrák mutatják. Az I. és II. fázisban mért „hiperplázia” pontszámokat a 9A–9D., illetve a 10A–10D. ábrák mutatják. Az I. fázisban, a kontrollcsoportban egy állat (a 25285. számú) eutanáziára került a kezelési idõszak alatt, mivel fokozódott lágyéksérve volt, ami nem kapcsolódott a fekélyes vastagbélgyulladáshoz vagy a kezelési rendhez. Az I. fázisban egy állat sem pusztult el a kezelt csoportban. A II. fázisban a kontrollcsoportban és a kezelt csoportban is egy-egy állat pusztult el a kezelési idõszakban. A túlélõ állatok között a kezelt csoportban nagyobb volt a százalékos testsúlynövekedés, mint a kontrollcsoportban, mind az I., mind a II. fázisú vizsgálatban, az egész vizsgálati idõszak alatt (1A–1D. és 2A–2D. ábrák). A testsúlynövekedés a 4–6. héten, az adagolási idõszak végét követõen volt a legszembetûnõbb. Igen érdekes, hogy az állatok hosszú távú utánkövetése – amely az I. fázisú vizsgálat esetében az adagolási idõszak utáni 51. héten, a II. fázisú vizsgálat esetében a 27. vagy a 43. héten történt – azt mutatta, hogy a kezelt állatok testsúlya még nagyobb mértékben növekedett, mint a kontrollállatoké. Közelebbrõl az I. fázisban kezelt állatok testsúlya a kontrollokhoz képest

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 15

2

statisztikailag szignifikáns százalékos növekedést mutatott (p<0,01). A jó testsúlynövekedést mutató kezelt csoportban három állatról (a 4199., a 12300. és az 52099. számúról) derült ki, hogy a vizsgálat kezdetekor 20 hónap alatt voltak, és a testsúlynövekedést a fiatal állatok normálnövekedésének lehetett tulajdonítani. A CPI-1697-kezelés CTT¹k hasmenési pontszámaira gyakorolt hatását a 3A–3D. és a 4A–4D. ábrák foglalják össze. A vizsgálat során, a II. fázisú vizsgálatban, a heti átlagos hasmenési pontszám csoportátlaga javulást mutatott (csökkent a pontszám) a kezelt csoportban, míg a kontrollcsoport nem mutatott javulást (4A–4D. ábrák). A hasmenési pontszámok javulása a kezelés megkezdése után azonnal elkezdõdött, és a II. fázisú vizsgálat befejezése után is fennmaradni látszott. Az I. fázisú vizsgálatban nem volt egyértelmû a hasmenési pontszámok javulása a kezelésnél (3A–3D. ábrák). A CPI-1697-kezelés CTT¹k – vastagbéli neutrofil infiltrációt megjelenítõ – „aktivitási” pontszámaira gyakorolt hatását az 5A–5D. és a 6A–6D. ábrák foglalják össze. Az I. fázisú vizsgálatban (5A–5D. ábrák), mind a kontroll¹, mind a kezelt csoportnál a vizsgálat megkezdése után azonnal csökkent a neutrofil infiltráció. A kezelt csoportban a 0–8. hét között növekedett a neutrofil infiltráció, majd a 8–10. hét között lényeges mértékben csökkent a neutrofil infiltráció. A kontrollcsoportban ezzel szemben a 0–10. hét között enyhén csökkent a neutrofil infiltráció. Az 55. héten azonban a kezelt csoportnál némileg alacsonyabb volt a neutrofil infiltráció, mint a kontrollcsoportban. A II. fázisú vizsgálatban (6A–6D. csoportok) a kezelt csoportnál a 12 hetes vizsgálati idõszak során csökkent a neutrofil infiltráció (csoportátlag), majd a 35. héten újabb csökkenés következett, míg a kontrollcsoport nem mutatott csökkenést. A CPI-1697-kezelés CTT¹k – a vastagbél morfológiájában bekövetkezõ tartós változásokat, ezen belül a tüszõüregek eltûnését és a mirigystruktúrák elváltozását megjelenítõ – „krónikussági” pontszámaira gyakorolt hatását a 7A–7D. és a 8A–8D. ábrák foglalják össze. Az I. fázisú vizsgálatban (7A–7D. ábrák), mind a kontroll¹, mind a kezelt csoportnál a kezelés megkezdése után azonnal javult a vastagbél morfológiája, ez a javulás azonban nem volt tartós. A kontrollcsoporttal összehasonlítva a kezelt csoport nem mutatott további jótékony hatásokat a vastagbél morfológiájára nézve. A II. fázisú vizsgálatban (8A–8D. ábrák), a kezelt csoportnál az adagolás megkezdése után két héttel javult a vastagbél morfológiája, pont ellentétben a kontrollcsoporttal. A kezelt csoport emellett hosszú távon is nagyobb fokú javulást mutatott a vastagbél morfológiájában, mint a kontrollcsoport, a 35. és a 12. hetet összehasonlítva. A CPI-1697-kezelés CTT¹k – a nyálkahártyaszövet, ezen belül a sejtes szövet és kötõszövet rendellenes megvastagodását megjelenítõ – „hiperplázia” pontszámaira gyakorolt hatását a 9A–9D. és a 10A–10D. ábrák foglalják össze. Az I. fázisú vizsgálatban (9A–9D. ábrák), a vastagbél morfológiájához hasonlóan, mind a kontroll¹, mind a kezelt csoportnál a kezelés megkezdése után azonnal csökkent a nyálkahártyaszövet vastagsága, ez a javulás azonban nem volt tartós. A kont-

1

HU 004 627 T2

rollcsoporttal összehasonlítva a kezelt csoport nem mutatott további jótékony hatásokat a nyálkahártyaszövet vastagságára nézve. A II. fázisú vizsgálatban (10A–10D. ábrák) a kezelt csoport hasonló változásokat mutatott, mint a kontrollcsoport a nyálkahártyaszövet vastagsága tekintetében a 12 hetes vizsgálati idõszak alatt. A hosszú távú utánkövetés azonban azt mutatta, hogy hosszú távon, a 35. héten, a kezelt csoportnál csökkent a nyálkahártyaszövet vastagsága a kontrollcsoporttal összehasonlítva. Az egyes állatokból vett szérummintákban ELISAval mértük a hatóanyag (CPI-1697 anti-IFNAR1 antitest) koncentrációját úgy, hogy a humán IgG4¹et és a fõemlõs antihumán antitest (PAHA) válaszokat detektáltuk. Ahogy az a 11A–11D. ábrákon látható, a kezelési fázisban végig 50 ng/ml és 270 ng/ml közötti volt a hatóanyag plazmakoncentrációja, a PAHA-szintek pedig az állatok többségében alacsonyak vagy detektálhatatlanok voltak (12A–12B. ábrák). Bár testsúly alapján minden állat ugyanazt a dózist kapta, egyes állatoknál – akár háromszor – magasabb koncentrációban figyeltük meg a CPI-1697¹et a keringésben. Korábban igazoltuk, hogy in vitro fõemlõs vizsgálatokban a CPI1697 a fenti koncentrációtartományban hatásosan blokkolja az IFNAR1¹et. Az I. fázisban két állatnál (a 8494. és az 52099. számúnál) kimutatható PAHA-válaszok jelentkeztek, de a II. fázisban semelyik másik állatban nem figyeltünk meg kimutatható PAHA-választ (12A–12B. ábrák). A fenti eredmények arra engednek következtetni, hogy az alkalmazott adagolási rendek – ezen belül a CPI-1697 nagy kezdõ dózisa – nem vezettek szignifikáns immunológiai válaszhoz a fehérjével (humán antitest) szemben. Annak a két állatnak is alacsony volt a hatóanyagszintje (11A–11B. ábrák).

5

10

15

20

25

30

A fehérvérsejteken lévõ IFNAR1 mennyiségét átfolyásos citometriával mértük, és a II. fázis normalizált receptorszintjeit a 13. ábrán foglaltuk össze. Az I. fázis receptorszintjeit nem mértük meg, mivel akkor még nem optimalizáltuk a FAS vizsgálati eljárásokat. A kezelt állatokban az interferonreceptor-blokkolást különféle szintekre vittük, habár a teljességig nem. A magasabb CPI-1697 szérumkoncentrációt mutató állatok általában jobb receptorblokkolást mutattak. Összefoglalásképpen elmondható, hogy vastagbélgyulladásban szenvedõ lisztmajmocskákban a CPI1697-kezelés a testsúlynövekedés tekintetében az I. és II. fázisban is jótékony hatást gyakorolt a kontrollhoz képest. A hosszabb kezelési idõt jelentõ II. fázisú vizsgálatban még ennél is jobb volt a hatás a hasmenési pontszámok és a hisztopatológiás pontszámok – ezen belül az „aktivitási”, „krónikussági” és „hiperplázia” pontszám – javulása tekintetében. A II. fázisú vizsgálatban korrelációt figyeltünk meg a pozitív klinikai válaszok és a CPI-1697 keringésben mért magasabb koncentrációja között. Pozitív korreláció volt továbbá a PAHA-válaszok hiánya és a javult klinikai pontszámok között is. Az I. fázisban nem találtunk ilyen korrelációkat. E korrelációkat statisztikai módszerekkel a vizsgálatban alkalmazott kis mintaméret miatt nem tudtuk kimutatni. Az eredmények összességében azt jelzik, hogy az IFNAR1 elleni humanizált antitestekkel történõ kezelések klinikai javulást hoznak. A hatás inkább krónikus volt, mint akut, és – ahogy azt a hosszú távú utánkövetési vizsgálatok mutatták – általában kezelési fázisok után is megmaradt. A II. fázisban alkalmazott hosszabb távú kezelés erõsebb hatásokat váltott ki, mint a rövidebb idejû kezelések. Az idõbeli és plazmakoncentráció tekintetében is fokozott CPI-1697-expozícióhoz nagyobb válasz társult.

SZEKVENCIALISTA <110> Medarex, Inc. Leslie B. Pickford Christopher R. Bebbington Geoffrey T. Yarranton David King <120> Compositions and Methods for the Therapy of inflammatory Bowel Disease <130>2201663-w00 <140> PCT/US2004/012651 <141> 2004-04¹23 <150> US 60/465,155 <151> 2003-04¹23 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial 16

2

HU 004 627 T2

<220> <223> Kompozit humán-egér szekvencia <400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 41 Trp Val Ala His Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Tyr Tyr Pro Tyr Asp Ala Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 2 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Kompozit humán-egér szekvencia <400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Ser Asn 20 25 30 His Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 41 Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Asn Ile Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105

17

1

HU 004 627 T2

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. I. típusú interferonreceptor elleni antitest alkalmazása gyulladásos bélbetegségben szenvedõ beteg kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyulladásos bélbetegség coeliákia. 3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyulladásos bélbetegség Crohn-betegség. 4. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyulladásos bélbetegség fekélyes vastagbélgyulladás. 5. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer az alábbi csoportból választott útvonalon adható be: intravénás bolusz, intravénás lassú bolusz és infúzió. 6. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer az alábbi csoportból választott útvonalon adható be: szubkután, intramuszkuláris, transzdermális, intradermális és intravénás. 7. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer valamely nyálkahártyás bejuttatási útvonalon adható be. 8. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a bejuttatás inhalációval történik. 9. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a bejuttatás orr-garati útvonalon történik. 10. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a bejuttatás szájon át történik. 11. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer 0,1 mg/testsúlykilogrammtól 50 mg/testsúlykilogrammig terjedõ dózisban adható be. 12. Az 11. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer 0,5 mg/testsúlykilogrammtól 10 mg/testsúlykilogrammig terjedõ dózisban adható be. 13. A 12. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer 2 mg/testsúlykilogrammtól 5 mg/testsúlykilogrammig terjedõ dózisban adható be. 14. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer napi egyszeritõl a havi egyszeriig terjedõ gyakorisággal adható be. 15. A 14. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer heti két alkalomtól kéthetente egy alkalomig terjedõ gyakorisággal adható be. 16. A 14. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer körülbelül heti egy alkalom gyakorissággal adható be. 17. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol egy, az alábbi csoportból választott második terápiás szer is

5

10

15

20

25

30

35

40

45

18

2

beadható: immunszuppresszív szer, gyulladásellenes szer, szteroid, immunmoduláló szer, citokin és TNF-antagonista. 18. I. típusú interferonreceptor elleni antitest és egy I. típusú interferonantagonista alkalmazása gyulladásos bélbetegségben szenvedõ betegek kezelésére szolgáló elsõ és második gyógyszer elõállítására, ahol az I. típusú receptor elleni antitestet tartalmazó elsõ gyógyszer betegnek egy elsõ idõpontban, toleranciakiváltó dózisban történõ beadására szolgál, az I. típusú interferonantagonistát tartalmazó gyógyszer pedig betegnek egy második idõpontban, terápiásan hatásos dózisban történõ beadására szolgál. 19. A 18. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az I. típusú interferonreceptor elleni antitest egy anti-IFNAR antitest. 20. A 18. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az I. típusú interferonantagonista egy I. típusú interferon elleni antitest. 21. A 18. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az elsõ gyógyszer az I. típusú interferonreceptor elleni antitest egy olyan dózisát tartalmazza, amely elegendõ az I. típusú interferonreceptor elleni antitest ismételt beadása által keltett IgG-antitestes válasz kiváltásának megelõzéséhez vagy csökkentéséhez. 22. A 18. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az I. típusú interferonreceptor elleni antitest dózisa 10 mg/testsúlykilogrammtól 50 mg/testsúlykilogrammig terjed. 23. A 22. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az I. típusú interferonreceptor elleni antitest dózisa 20 mg/testsúlykilogrammtól 40 mg/testsúlykilogrammig terjed. 24. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az I. típusú interferonreceptor elleni antitest dózisa 20 mg/testsúlykilogrammtól 25 mg/testsúlykilogrammig terjed. 25. A 18. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az I. típusú interferonantagonista 0,1 mg/testsúlykilogrammtól 10 mg/testsúlykilogrammig terjedõ dózisban adható be. 26. A 25. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az I. típusú interferonantagonista 0,2 mg/testsúlykilogrammtól 5 mg/testsúlykilogrammig terjedõ dózisban adható be. 27. A 26. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az I. típusú interferonantagonista 0,5 mg/testsúlykilogrammtól 2 mg/testsúlykilogrammig terjedõ dózisban adható be.

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

19

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

20

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

21

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

22

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

23

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

24

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

25

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

26

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

27

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

28

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

29

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

30

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

31

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

32

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

33

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

34

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

35

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

36

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

37

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

38

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

39

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

40

HU 004 627 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

41

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest