!HU000003779T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 003 779
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 38/17
(21) Magyar ügyszám: E 05 742910 (22) A bejelentés napja: 2005. 04. 28. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050742910 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1750744 A1 2005. 11. 17. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1750744 B1 2008. 06. 11.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 2004RM00223 2004. 05. 07.
(73) Jogosult: SIGMA-TAU INDUSTRIE FARMACEUTICHE RIUNITE S.P.A., Roma (IT)
IT
(72) Feltalálók: Salvatori, Giovanni, Pomezia_RM (IT); Carminati, Paolo, Pomezia (IT); Romani, Luigina, Perugia PG (IT) (54)
(2006.01) A61K 31/7048 (2006.01) A61P 31/10 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05107791 PCT/IT 05/000247
(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Gyógyszer gombás fertõzések, különösen aspergillózis kezelésére
(57) Kivonat
HU 003 779 T2
A találmány PTX3 pentraxin gombaellenes szerekkel való kombinációját ismerteti gombás fertõzések és kü-
lönösen Aspergillus fumigatus által okozott fertõzések kezelésére.
A leírás terjedelme 16 oldal (ezen belül 7 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 003 779 T2
A találmány tárgya PTX3 pentraxin és amfotericin¹B kombinációjából álló gyógyszer aszpergillózis kezelésére. A találmány háttere Az invazív aszpergillózis (IA) a kóros tüdõgyulladás és halál fõ oka az allogén csontvelõ (BM)-transzplantáltakban, a fertõzés becsült aránya 8%¹tól 15%¹ig terjed, és a kapcsolódó halálozási arány megközelítõleg 90% (3, 16, 30, 36,47). A korai diagnózis és az új gombaellenes szerekkel (6, 31) való terápia fejlõdése ellenére az AI esetek többsége diagnosztizálatlan és kezeletlen marad (16). Az AI legfontosabb kockázati tényezõje történetileg a neutropénia volt. Azonban a kemoterápián és transzplantáción átesõ páciensek elõkészítésében történt fejlõdés azonban a neutropéniás idõszak szignifikáns csökkenéséhez vezetett. Számos vizsgálat dokumentálta, hogy az aszpergillózis csontvelõtranszplantáció után jelenik meg, együtt a ’graft-versus-host’ (GvH) betegség (30) megjelenésével. Az IA elõfordulása nem neutropéniás páciensekben is (17) igazolja specifikus defektusok jelenlétét a veleszületett és adaptív effektor mechanizmusokban a betegség patogenezisében (13, 20, 22, 32, 39, 43, 44). Közelebbrõl, vizsgálták a Th¹limfociták szerepét esszenciális másodlagos védelem biztosításában a gomba ellen (8–10, 12, 14, 23, 26). Mivel az IA rendkívül ritka immunkompetens egyénekben, a gazda immunválaszának fokozására irányuló terápia új és ígéretes megközelítési módot biztosít a fertõzés kezelésére. A veleszületett immunrendszer bonyolult, több szintû módon evolvált a tüdõszövet fertõzések elleni védelmére. A tüdõszövet védelmérõl azt gondolják, hogy nemcsak a mikrobiális szaporodás megelõzõ szabályozását tartalmazza, hanem egy kiegyensúlyozott gyulladásos válasz végrehajtását is, amely elegendõ a fertõzés visszafojtására az alveoláris izzadmányképzõdés és beszûrõdés veszélyes mértékének indukálása nélkül. Az alveoláris felület molekuláris komponensei mostanában jelentõs figyelem tárgyát képezik mint elsõdleges immunmodulátorok fertõzések esetében (28, 29). A pentraxinok (PTX) a fehérjék evolúció során konzervált szupercsaládja a Limulus polyphemustól az emberig, amelyeket általában pentamer szerkezet jellemez (21). A PTX3 a hosszú pentraxin prototípusa, amely a pentraxin C¹terminális doménjéhez kapcsolódó N¹terminálishoz részt tartalmaz, ahol az elõbbi homológ a rövid PTX-ekkel (7). A PTX3¹at különbözõ típusú sejtek szekretálják, különösen mononukleáris fagociták, endoteliális sejtek és dendritikus sejtek (DC), válaszként az elsõdleges gyulladási citokinekre in vitro és in vivo (11, 38, 18). Detektálták a fehérje keringési szintjének növekedését különféle fertõzõ és gyulladásos állapotokban (37, 19, 34, 41). A PTX3 számos mikrobiális ágenshez (például A. fumigatus konídiumok és P. aeruginosa) kötõdik, és az immunrendszer különféle effektor útvonalait aktiválja a patogén fertõzõképességével való küzdelemre (20). PTX3-deficiens egerek elemzése demonstrálta, hogy a PTX3 egy mintázatfelismerõ receptor (PRR), amely nem redundáns szere-
5
10
15
20
25
30
2
pet játszik kiválasztott patogének ellen rezisztenciában (20). A PTX3-deficiens egerek érzékenységét A. fumigatusra kapcsolatba hozták az I¹es típusú adaptív immunválasz sikertelen megszervezésével, de azt visszaállítja rekombináns PTX3 külsõ adagolása (20). Szükség van terápiás elõrelépésre az aszpergillózissal való küzdelemben, a gombaellenes fegyvertár jelenlegi bõvülése (45) ellenére is. A kutatók kezdenek új stratégiákat felfedezni gombaellenes szerek és citokinek egyedülálló kombinációival (46). Az amfotericin-B-vel – egy elsõdlegesen választott gyógyszer – végzett kezelés korlátozott a dózisfüggõ nefrotoxicitás miatt, ami megakadályozza a BM transzplantációnak alávetett páciensekben a teljes dózissal végzett terápiát (24). Különféle amfotericin¹B lipidalapú kiszereléseket kifejlesztettek a hagyományos D¹AmB (25), valamint az L¹AmB (2) kezelésekkel kapcsolatos toxicitás csökkentésére. Az L¹AmB toxicitás farmakokinetikai profilja kedvezõbb, mint a D¹AmB¹é, ily módon lehetõvé teszi a teljes dózisú terápiát. Mindazonáltal a sikertelenség aránya még mindig figyelemre méltó (I). Az IA publikált egérmodelljei, amelyekben a gombaellenes ágensek hatékonyságát vizsgálták, kemoterápiával indukált neutropénián alapultak, kortikoszteroidokkal vagy azok nélkül, hogy az egereket kevéssé érzékennyé tegyék a fertõzésre. Újabban növekedett az új gombaellenes szerek fejlesztése IA kezelésére, új terápiás célpontokkal jellemzett gyógyszerosztályokkal (45), amelyek új elvárásokat hoznak az IA kezelésében, és amelyek növelik a lehetséges új kombinált terápiák számát (45). Más fertõzõ betegségek kezelése alapján (4) a kombinációs terápia fontos terápiás lehetõségnek bizonyulhat.
A találmány összefoglalása Azt találtuk, hogy a PTX3 pentraxin meglepõ szinergikus hatást fejt ki, amikor gombaellenes szerekkel kombináljuk, ily módon lehetõvé teszi gombaellenes szer szuboptimális dózisával jellemzett gyógyszer elõ40 állítását. Ez a jellemzõ elõnyösnek bizonyul a gyógyszer jobb kezelhetõségével kapcsolatban, amennyiben lehetséges lényegesen korlátozni az egyedi hatóanyagokra jellemzõ mellékhatásokat. Tehát a találmány egyik célja PTX3 pentraxin és 45 amfotericin¹B kombinációja, valamint az azt tartalmazó gyógyászati készítmény, és a kombináció alkalmazása gombás fertõzések, különösen aszpergillózis profilaktikus és terápiás kezelésére alkalmas gyógyszer elõállítására. 50 A találmány részletes leírása A PTX3 pentraxint és különféle terápiás alkalmazásait a jelen bejelentõ különbözõ szabadalmi bejelentéseiben ismertetjük. A WO 99/32516 számú nemzetközi közzétételi irat 55 ismerteti a fehérje szekvenciáját és alkalmazását fertõzõ, gyulladásos és daganatos betegségekben. A PTX3 pentraxin más alkalmazásait a WO 02/38169, WO 02/36151, WO 03/011326 és WO 03/084561 szá60 mú nemzetközi közzétételi iratokban ismertetjük. 35
2
1
HU 003 779 T2
A találmány szerint a gombaellenes szer amfotericin¹B, elõnyösebben a deoxikolát formájában, amely a Fungizone kereskedelmi név alatt ismert a piacon (Bristol-Myers Squibb), vagy liposzomális kiszerelésben, amely az AmBisome védjegy alatt ismert a piacon (GILEAD). A találmány ipari alkalmazhatósága tekintetében a hosszú PTX3 pentraxin és a gombaellenes szer olyan gyógyászati készítmény formájában lehet, amelyben a hatóanyagok szolubilizálva vannak és/vagy gyógyászatilag elfogadható excipiensekkel és/vagy oldószerekkel mint hordozóval együtt vannak. A hosszú PTX3 pentraxin esetében alkalmazható gyógyászati készítmény példái azok is, amelyek a WO 99/32516 számú nemzetközi közzétételi iratban vannak ismertetve. A találmány szerinti kombinációt enterális vagy parenterális úton adhatjuk be. A napi dózis függhet az orvos ítéletétõl, a páciens tömegétõl, korától ás általános állapotától. Megjegyezzük, hogy a gyógyászati készítmények, beleértve a lassú felszabadulásúak elõállítását megvalósíthatjuk gyógyszerészek és a gyógyászati technológia területén járatos szakember számára ismert szokásos módszerekkel és a berendezésekkel. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a gombás fertõzés invazív aszpergillózis (IA). A találmány szerinti kombinációt egér csontvelõtranszplantációs modellben vizsgáltuk, amely replikálja az ugyanilyen állapotban emberben megfigyelt immundeficienciát. Az egereket különbözõ kezelési rendeknek vetettük alá, és vizsgáltuk az IA elleni rezisztenciát, és a veleszületett és adaptív immunitás paramétereit. Az eredmények azt mutatták, hogy a PTX3 teljes rezisztenciát indukált a fertõzés és újrafertõzés ellen, és aktiválta az I¹es típusú védõválaszokat, és jelentõsen megnövelte az gombaellenes szerek terápiás hatását amikor kombinációban volt beadva. A találmányt most részletesen bemutatjuk, példák és ábrák segítségével, amelyeken: az 1. ábrán PTX3, AmBisome (L¹AmB) vagy Fungizone (D¹AmB) beadásának hatását mutatjuk be invazív aszpergillózisban szenvedõ egerekben. Letálisan besugárzott C3H/HeJ egereknek beadtuk BALB/c egerek T¹sejt-depletált BM¹sejt infúzióját (2×106) egy héttel 2×107 Aspergillus konídiumokkal való intranazális fertõzést megelõzõen. Az egereket PTX3-mal vagy a poliénekkel kezeltük a jelzett dózisokkal és útvonalakon, 5 nappal a fertõzés elõtt (Pre¹) vagy után (Post¹) vagy egyidejûleg (Con.), minden esetben megismételve a beadást a következõ 5 napon. A fertõzés elleni rezisztenciát a túlélés százalékával mértük. A fertõzött egerek tüdejének, agyának és veséjének gombás terhelésének mértékét sorozatos szélesztéssel határoztuk meg Sabouraud-dextróz tápközegen a különbözõ szervek mosófolyadékaival, és az eredményeket kolóniaformáló egységekben (CFU)(átlag ±SE) adtuk meg a jelzett szervekbõl vett mintákban és a halál beálltakor azoknál az egereknél, amelyek a fertõzés elõtt elpusz-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
tultak, vagy egyébként 6 nappal a fertõzés után. A csoportok 6 állatból álltak. * jelentése P<0,05 (kezelt vs. kezeletlen egerek). A 2. ábrán PTX3 beadásának hatását mutatjuk be Aspergillus újrafertõzés elleni rezisztenciára. BM¹transzplantált egereket, amelyeket az 1. ábránál részletesen ismertetett módon állítottunk elõ, intranazálisan megfertõztünk 2×107 Aspergillus konídiummal egy héttel a BM¹transzplantáció után, és egyidejûleg kezeltünk PTX3-mal a jelzett dózisokkal és útvonalakon, a fertõzés napjával kezdõdõen és az azt követõ 5 napon. Két héttel a fertõzés után a túlélõ egereket újra megfertõztük intravénásan 5×105 Aspergillus konídiummal. Értékeltük a gombás növekedést (CFU) a vesékben 3 nappal az újrafertõzés után. * jelentése P<0,05 (kezelt vs. kezeletlen egerek). A 3. ábrán azt mutatjuk be, hogy a PTX3 csökkenti a tüdõ betegségét invazív aszpergillózisban szenvedõ egerekben. Perjodátos Schiff-bázis metszeteket készítettünk a BM¹transzplantált egerek tüdejébõl, amelyek meg voltak fertõzve Aspergillus konídiummal és vagy nem voltak kezelve (A), vagy kezelve voltak (B) 1 mg/kg PTX3-mal intraperitoneálisan a fertõzés napjától kezdõdõen és az azt követõ 5 napon. Számos Aspergillus hifa (nyilak) beszûrõdött a tüdõparenchimába, kiterjedt parenchimális roncsolással és a bronchiális fal károsodásának erõs jeleivel, és nekrózist és gyenge sejttoborzást figyelünk meg a kezeletlen egerek tüdejében (3 nappal a fertõzés után). A PTX3-kezelt egerek tüdõszövetét gyulladásos sejtek gyógyító beszûrõdése jellemzi, a parenchimális roncsolás és gombás növekedés jelei nélkül (6 nappal fertõzés után). Nagyítás: ×100 az A és B panelen; ×400 a betétekben. A 4. ábrán azt mutatjuk be, hogy a PTX3 gyorsítja a sejtek regenerálódását invazív aszpergillózisban szenvedõ egerekben. BM¹transzplantált egereket, amelyeket az 1. ábránál részletesen ismertetett módon állítottunk elõ, fertõztünk meg intranazálisan 2×107 Aspergillus konídiummal és kezeltünk (+) vagy nem kezeltünk (–) 1 mg/kg PTX3-mal intraperitoneálisan a fertõzés napjától kezdõdõen és az azt követõ 5 napon. A számok a pozitív sejtek százalékát jelentik FACS-elemzéssel a tüdõben (A) és a lépben (B), 3 vagy 6 nappal a fertõzés után. Az 5. ábrán azt mutatjuk be, hogy a PTX3 a Th1 sejtek funkcionális regenerálódását indukálja. BM¹transzplantált egereket, amelyeket az 1. ábránál részletesen ismertetett módon állítottunk elõ, fertõztünk meg intranazálisan 2×107 Aspergillus konídiummal és kezeltünk 1 mg/kg PTX3-mal intraperitoneálisan a fertõzés elõtt (ferdén vonalazott oszlopok) és a fertõzés napjától kezdõdõen és az azt követõ 3 napon (pontozott oszlopok). A fertõzés utáni 3. napon meghatároztuk az IL–12 p70 és IL–10 szinteket specifikus ELISA-elemzésekkel a bronchoalveoláris mosófolyadékban (A), a citokint termelõ CD4+ T lépsejteket megszámoltuk ELISPOT-elemzéssel (B), és a citokin génexpressziót CD4+ lépsejteken valós idejû PCR-rel határoztuk meg. Az oszlopok a standard hibát jelzik. *P<0,05, fertõzött vs. nem fertõzött egerek; **P<0,05
1
HU 003 779 T2
(PTX3-kezelt vs. kezeletlen egerek. Nem fertõzött egerek (fehér oszlopok); fertõzött egerek (fekete oszlopok). A 6. ábrán azt mutatjuk be, hogy a PTX3 növeli az AmBisome (L¹AmB) és Fungizone (D¹AmB) terápiás hatékonyságát. BM¹transzplantált egereket, amelyeket az 1. ábránál részletesen ismertetett módon állítottunk elõ, fertõztünk meg intranazálisan 2×107 Aspergillus konídiummal, és kezeltünk intraperitoneálisan az egyes szerekkel egyedül vagy kombinációban, fertõzés elõtt (Pre¹) vagy után (Post¹). A dózisok az alábbiak voltak: 0,04 és 0,2 mg/kg PTX3 fertõzés elõtt vagy után; 1 mg/kg AmBisome és 2 mg/kg Fungizone. A fertõzés elleni rezisztenciát a túlélés százalékaként értékeltük és a tüdõbõl mért CFU-ként, a halál idején végeztük azoknál az egereknél, amelyek korábban elpusztultak, vagy egyébként 6 nappal a fertõzés után. *P<0,05, kezelt vs. kezeletlen egerek; **P<0,001, kombinációs kezelés PTX3+L-AmB vs. az egyes egyedi kezelések önmagukban; ***P<0,05, kombinációs kezelés PTX3+D-AmB vs. D¹AmB önmagában. A 7. ábrán azt mutatjuk be, hogy a PTX3 csökkenti a TNF¹a termelését, és növeli a Th1:Th2 citokin arányt a poliénekkel kezelt egerekben. BM¹transzplantált egereket, amelyeket az 1. ábránál részletesen ismertetett módon állítottunk elõ, fertõztünk meg intranazálisan 2×107 Aspergillus konídiummal, és kezeltünk intraperitoneálisan az egyes szerekkel egyedül vagy kombinációban a fertõzés után. A dózisok a 6. ábránál részletesen ismertettek voltak. A TNF¹g szintet (pg/ml) a bronchoalveoláris mosófolyadékban határoztuk meg 3 nappal a fertõzés után (A) és az IFN¹g és IL–4 szinteket (pg/ml) antigénaktivált lépsejtek tenyésztõ felülúszójában (B) a halál idõpontjában azoknál az egereknél, amelyek korábban elpusztultak, vagy 6 nappal a fertõzés után. Az oszlopok a standard hibát jelzik: (–, kezeletlen egerek). *P<0,05, kezelt vs. kezeletlen egerek; **P<0,05, kombinációs kezelés PTX3+Fungizone (D¹AmB) vs. DAmB önmagában; **P<0,05, kombinációs kezelés PTX3+AmBisome (L¹AmB) vs. az egyes egyedi kezelések önmagukban. Anyagok és eljárások Állatok. 8–10 hetes nõstény BALB/c és C3H/HeJ egereket szereztünk be a Charles River Breeding Laboratories (Calco, Italy) cégtõl. Az egereket specifikus axéniás körülmények között tenyésztették. BM¹transzplantált egereket kis steril ketrecekben tartottunk (5 állat ketrecenként) és steril táppal és vízzel etettünk. Az állatok és ketreceik minden kezelését nemzeti és nemzetközi törvényeknek és szabványoknak megfelelõen hajtottuk végre. Az összes in vivo vizsgálatot nemzeti és a „Committee for the Care and Use of Animals of the University of Perugia” iránymutatásaival összhangban végeztük. BM-transzplantációs modell. Csontvelõ (BM)-sejteket állítottunk elõ BALB/c donor egerekbõl differenciális agglutinációval szója agglutininnel. T¹limfocita-depletált sejteket (kevesebb mint 1% szennyezõ T¹sejt, FACS-elemzéssel mérve) injektáltunk intravénásan
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
(iv.) ³4×106/mL koncentrációban recipiens C3H/HeJ egerekbe, amelyeket 9 Gy letális dózisnak tettünk ki (33). A BM¹transzplantáció nélkül az egerek 14 napon belül elpusztultak. Korábbi vizsgálatok szerint (33) az egerek több mint 95%¹a túlélt, ami a stabil donor hematopoietikus kimérizmusát mutatja, amit a donor típusú I. osztályba tartozó MHC expressziójának detektálásával detektálhatunk a lépben. Mikroorganizmus, tenyésztési körülmények és fertõzés. Az A. fumigatus törzset tüdõaszpergillózis halálos esetébõl nyertük az „Infectious Diseases of the University of Perugia” intézetben (13). A fertõzéshez az egereket enyhén érzéstelenítettük etil-éter inhalálásával a 2×107 konídium/20 mL sóoldat-szuszpenzió becsepegtetését megelõzõen, amelyet lassan juttattunk be az orrlyukakon keresztül eldobható steril heggyel ellátott mikropipetta alkalmazásával. Az eljárást három egymást követõ napon megismételtük. Az újrafertõzéshez az elsõ intranazális (in.) fertõzést túlélõ egereket iv. beoltottuk 5×105 Aspergillus konídiummal. A fertõzött egerek tüdejének, agyának és veséjének gombás terhelését sorozatos szélesztéssel határoztuk meg Sabouraud-dextróz tápközegen, és az eredményeket (átlag ±SE) kolóniaformáló egységekként (CFU) adtuk meg a jelzett szervekbõl vett mintákban. Kiválasztott kísérletekben a gombás növekedést értékeltük kitinelemzéssel is (10). A szövettani elemzéshez a tüdõt eltávolítottuk és azonnal rögzítettük formalinban. Paraffinba ágyazott szövetek metszeteit (3–4 mm) megfestettük perjódsav Schiff-bázis eljárással (13, 20). Kezelések. A PTX3¹at (SIGMA-Tau, Pomezia, Rome, Italy) immunaffinitási kromatográfiával tisztítottuk meg PTX3-mal transzfektált CHO-sejtek tenyészet felülúszójából, és ellenõriztük endotoxinok hiányára (20). A PTX3¹at, amfotericin-B-deoxikolátot (D¹AmB, Fungizone, Bristol-Myers Squibb, Sermoneta, Italy) és liposzomális amfotericin-B¹t (L¹AmB, AmBisome, GILEAD, Milan, Italy) steril sóoldatban (PTX3) vagy 5% glükóz-víz oldatban hígítottuk meg a kívánt koncentrációra. A kezeléseket a következõ rend szerint hajtottuk végre: a PTX3, amfotericin¹B vagy AmBisome különbözõ dózisait – egyedül vagy kombinációban – intraperitoneálisan (ip.) vagy intranazálisan (in.) (csak a PTX3) adtuk be 5 napon keresztül az Aspergillusszal történõ kezelés elõtt (profilaktikus kezelés), a fertõzéssel egyidejûleg és 5 napig a fertõzés után, vagy 5 nappal a konídiumok utolsó beadása után (terápiás kezelés). Az in. beadás esetén a PTX3¹t és a konídiumot külön-külön adtuk be. A kontrollállatok csak oldószert vagy steril sóoldatot kaptak. Áramlási citometria. A különféle sejttípusok fenotípusát a jelzett antigének elleni egér ellenanyagok alkalmazásával állapítottuk meg, FITC-cel konjugált patkány anti-egér ellenanyagokkal (PharMingen, San Diego, Ca). Az immunkémia azonosítást megelõzõen az FcR¹t telítettük a sejtek 5% normálszérummal történõ inkubálásával. Szövettípus-ellenanyagokat alkalmaztuk kontrollként. Az elemzést FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, Ca) berendezéssel végeztük. A kapott adatokat a pozitív sejtek százalékaként érté-
1
HU 003 779 T2
keltük ki. A hisztogramok négy független kísérlet egyikét reprezentálják. Citokin transzkriptumok mennyiségi meghatározása valós idejû RT¹PCR-rel. Teljes RNS¹t – 5 mg, CD4+ T lépsejtekbõl extrahálva az RNeasy Mini Kit (QIAGEN S. p. A., Milan, Italy) alkalmazásával – reverz transzkripcióval átírtunk Sensiscript reverz-transzkriptázzal (QIAGEN) a gyártó útmutatása alapján. A PCR láncindítókat az Applied Biosystems (Foster City, Ca) cégtõl szereztük be. A mintákat 40 amplifikációs ciklusnak vetettük alá 95 °C¹on 15 másodpercig, és azután 60 °C¹on 1 percig az ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) alkalmazásával. Az eukarióta 18S rRNS háztartási gén PCR-amplifikációját azért csináltuk meg, hogy lehetõvé tegye a minták normalizálását a gyártó utasításainak megfelelõen (Applied Biosystems). Vizes kontrollokat alkalmaztunk a specifitás biztosítása érdekében. Az összes adat integritását megvizsgáltuk az amplifikációs görbék elemzésével. Az 18S RNS-sel normalizált adatokat a vizsgált citokinek relatív mRNS-eként fejeztük ki (DDCt), és összehasonlítottuk a naiv egerekével (10). Citokinek elemzése és „spot enzyme-linked immuno-sorbent” (ELISPOT) elemzés. A citokinek szintjét a bronchoalveoláris mosófolyadékban és a termálisan aktivált Aspergillusszal (9, 10) stimulált lépsejtek tenyészet-felülúszójában ELISA reagenskészlet (R&D Systems, Inc. Space Import-Export srl, Milan Italy) alkalmazásával határoztuk meg. Az elemzések detektálási határa (pg/ml) <16 volt IL–12 p70¹re, <32 volt TNFa¹ra, <10 volt IFN-g¹ra és <3 volt IL–4¹re és IL–10¹re. A citokint termelõ CD4+ T¹sejtek leszámolásához ELISPOT elemzést alkalmaztunk tisztított CD4+ T lépsejteken (9, 10). Az eredményeket citokint termelõ sejtek számának átlagaként (±SE) fejeztük ki 105 sejtenként, sorozatos sejthígítás paraleljeinek alkalmazásával számítva. Statisztikai elemzés. Log-rank tesztet alkalmaztunk a Kaplan–Meier túlélési görbék párosított adatainak elemzésére. Student-féle t¹tesztet vagy varianciaanalízist (ANOVA) és a Bonferroni-tesztet alkalmaztuk a szervekbõl való kiürülés és az in vitro elemzések statisztikai szignifikanciájának meghatározására, amint az ábrafeliratokon jelezzük. A szignifikanciát P<0,05 értékként definiáltuk. Az in vivo csoportok 4–6 állatból álltak. A közölt eredmények 3–5 kísérletbõl lettek összevonva, hacsak másképpen nem mondjuk. Eredmények Amint korábban demonstrálták, a PTX3 exogén beadása visszaállította az IA¹ban szenvedõ PTX3-deficiens egerek gombaellenes rezisztenciáját (20). Annak megállapítására, hogy a PTX3 jó hatással lehet¹e egyébként érzékeny egerekre, olyan BM¹transzplantált egereket alkalmaztunk, amelyek jelentõs érzékenysége IA¹ra jól dokumentált (15). Az egereket intranazálisan vagy intraperitoneálisan beadott PTX3 különbözõ dózisaival történõ kezelésnek vetettük alá, fertõzés elõtt, azzal egyidejûleg vagy utána. A dózisokat olyan elõkísérletek alapján választottuk ki, amelyek azt mu-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
tatták, hogy a PTX3 szintje (0,5 mg/kg/in. dózis esetében) magas volt a bronchoalveoláris mosófolyadékban legalább 24 órán keresztül (70-tõl 25 ng/ml¹ig 2¹tõl 24 óráig), és hogy magasabb volt, mint az IA¹ban szenvedõ egérben megfigyelt, egy nappal a fertõzés után (2¹tõl 15 ng/ml¹ig) (20, és nem közölt eredmények). Azután rögzítettük a túlélési paramétereket és a tüdõ és agy gombás terhelését, és elemeztük összehasonlítva AmBisome vagy Fungizone különbözõ dózisaival kezelt egerek esetében kapottakkal. Az eredmények azt mutatták, hogy a profilaktikusan beadott PTX3 (1A. ábra) teljes rezisztenciát indukált IA¹ra a vizsgált dózisok bármelyikében, amint azt a kezelt egerek többségének (85–95%) túlélésének növekedése mutatta (³60 nap), és a szignifikánsan csökkent gombás terhelés a tüdõben és az agyban, különösen a legmagasabb dózist (1 mg/kg) kapott egerekben. Hasonló eredményeket kaptunk olyan egerekben, amelyek a fertõzéssel egyidejûleg kapták a PTX3¹at (1B. ábra). Dózisfüggõ hatást detektáltunk ebben a beadási periódusban, amennyiben a PTX3 védõ hatékonysága elveszett a 0,04 mg/kg dózisnál. A fertõzés után beadott PTX3 csak a legmagasabb dózisnál növelte az egerek túlélését, habár mindkét dózis szignifikánsan csökkentette a gombás terhelést a tüdõben és a magasabb dózisnál szignifikánsan csökkentette gombás terhelést az agyban (1C. ábra). Nem figyeltünk meg különbséget a két beadási útvonal között. Hasonló eredményeket figyeltünk meg az 5 mg/kg AmBisome-mal kezelt egerekben, amennyiben az összes egér túlélte a fertõzést, amikor a fertõzés elõtt vagy után kezeltük (1D. ábra). A Fungizone nem biztosított ugyanakkora mértékû védettséget, és csak a fertõzés után beadott legmagasabb tolerált dózisnál (4 mg/kg) figyeltük meg a túlélés növekedését és a gombás terhelés csökkenését (1E. ábra). Ezenfelül értékeltük a PTX3 kezelés után meggyógyult egerek érzékenységét Aspergillus újrafertõzésre, és azt találtuk, hogy a PTX3 kezelés szignifikánsan megnövelte az újrafertõzés elleni rezisztenciát is, amint azt a csökkent gombás növekedés mutatta az újrafertõzött egerek veséjében (2. ábra). A PTX3 javított a tüdõ patológiáját is. A fertõzött egerek tüdejének metszetei számos Aspergillus hifa jelenlétét mutatták, amely beszûrõdött a tüdõparenchimába, a bronchiális fal súlyos károsodása, nekrózis és a gyulladásos sejtek toborzása gyengeségének jeleivel (3A. ábra). Ezeket a jellegzetességeket nem figyeltük meg a PTX3-mal kezelt egerekben, amelyek tüdejét poli- és mononukleáris gyulladásos sejtek gyógyító beszûrõdése jellemezte, gombás növekedés vagy a bronchiális fal roncsolásának jelei nélkül (3B. ábra). Ezek az adatok bizonyítják a PTX3 terápiás hatékonyságát BM¹transzplantációs körülmények között, ahol gombaellenes szerek normálisan csökkent aktivitást mutatnak (16, 31). Az IA¹ban szenvedõ egerekben a fertõzés elleni rezisztencia korrelál az IFN-g¹t termelõ Th1 sejtek aktiválásával (12, 13). Annak megállapítására, hogy PTX3 aktiválta¹e az IA¹ban szenvedõ BM¹transzplantált egerekben a Th1 sejtek reaktivitását, értékeltük a sejtek regenerálódását FACS-elemzéssel, lokális cito-
1
HU 003 779 T2
kintermeléssel és az effektor fagociták gombaellenes aktivitásával. A vérleukociták mennyiségi meghatározása azt jelezte, hogy a keringésben lévõ neutrofilek teljes száma szignifikánsan növekedett a PTX3-mal történõ kezelést követõen (adatokat nem közlünk). Mindazonáltal mivel a neutrofilek szintje a vérben nem teszi lehetõvé számunkra az aszpergillózis iránti érzékenység megjóslását (5), a citofluorimetriás elemzést tüdõ és lépsejteken hajtottuk végre. A CD4+ sejtek, CD8+ sejtek és Gr¹1+ neutrofilek száma szignifikánsan megnövekedett a PTX3-mal kezelt egerek tüdejében (4A. ábra). A neutrofilek, és részben a CD4+ T¹sejtek regenerálódását megfigyeltük a lépben is. Nem figyeltünk meg különbséget az F4–80+ sejtek számában a tüdõben vagy a lépben a PTX3-mal történõ kezeléssel vagy anélkül (4B. ábra). A regenerálódott sejtek és limfociták funkcionálisan aktívnak bizonyultak, amint azt a pro- (IL–12) és antiinflammatorikus (IL–10) citokinek pulmonáris homogenizátumokban való termelõdése és a CD4+ Th1 (IFN¹g) és Th2 (IL–4) gyakorisága jelezte. Az 5A. ábra azt mutatja, hogy a PTX3-mal történõ kezelés lényegesen növelte az IL–12 termelést (megközelítõleg 4¹szeresre) azonban az IL–10 termelõdése csak felezõdött (összehasonlítva a kezeletlen kontrollal), amely eredmény azt sugallja, hogy a PTX3 finoman szabályozza a gyulladásos folyamatot a fertõzés helyén. Ezenfelül a PTX3 kezelés növelte a CD4+ Th1 sejtek gyakoriságát a lépben és csökkentette az IL–4¹et termelõ sejtekét (5B. ábra), amely eredményt megerõsítettünk a citokinek mRNS-expressziós szintjének értékelésével kvantitatív PCR-rel. Az 5C. ábra azt mutatja, hogy mind a profilaktikus, mind a terápiás kezelés PTX3-mal szignifikánsan növelte az IFN¹g expresszióját és csökkentette az IL–4¹ét. Az effektor fagociták gombaellenes aktivitásának vizsgálatakor az találtuk, hogy az effektor fagociták konídiumölõ aktivitása magasabb volt a PTX3-kezelt egerekben, mint a kezeletlen egerekben (adatokat nem közlünk). Mivel az in vitro vizsgálatok kizárták a PTX3 bármilyen közvetlen ölõhatását a gombára (adatokat nem közlünk), ezek az adatok a PTX3¹at olyan új szerként azonosítják, amelynek jelentõs az immunmodulátor aktivitással a veleszületett és adaptív gombaellenes immunitásra. Az összes fent említett eredmény arra késztetett bennünket, hogy megvizsgáljuk, hogy a PTX3 immunmodulátor aktivitása kihasználható¹e az AmBisome vagy Fungizone terápiás hatékonyságának növelésére, mert ezek a szerek ismert módon szinergikusan hatnak gombaellenes effektor fagocitákkal (40). Ebbõl a célból BM¹transzplantált egerek PTX3¹at kaptak egyedül vagy a poliénekkel együtt, olyan szuboptimális dózisokban, amelyeknél egyik szer sem érte el a maximális terápiás hatását. A kombinált vagy egyedi kezeléseket fertõzés elõtt vagy után adtuk be. Az egereket monitoroztuk túlélésre, gombás növekedésre és citokinek termelésére. Azt találtuk, hogy míg minden egyes önmagában beadott szer szignifikánsan csökkentette a gombás növekedést a tüdõben, nem módosították szignifikánsan az egerek túlélését, kivéve a fertõzés elõtt beadott PTX3¹at. Azonban a PTX3 és AmBisome kombinált te-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
rápia, akár a fertõzés elõtt, akár utána, meggyógyította a fertõzést, amint a megnövekedett túléléssel (>60 nap) és a csökkent gombás növekedéssel igazoltuk. A PTX3 és Fungizone kombinált beadása szignifikánsan megnövelte gombás fertõzés elleni rezisztenciát összehasonlítva a Fungizone önmagában történõ beadásával, amikor fertõzés után volt beadva (6. ábra). A citokinek elemzése a pulmonáris homogenizátumokban és tenyésztett antigénstimulált lépsejtek felülúszóiban azt demonstrálta, hogy a PTX3 nagyban csökkentette a TNF¹a termelését a Fungizone¹t kapott egerek tüdejében, összehasonlítva a droggal önmagában kezelt egerekben megfigyelt szinttel; a TNF¹a termelõdésének AmBisome¹ra válaszként adott szintje alacsonyabb volt, mint a Fungizone-nal történõ kezeléssel indukált, és nem módosult PTX3-mal kombinációban kezelve (7A. ábra). Az IFN¹g lépsejtek általi termelése szignifikánsan megnövekedett összehasonlítva kezeletlen egerekkel minden négyes kezelés után, és tovább növekedett a PTX3-mal és AmBisome-mal kezelt egerekben; ezzel ellentétben az IL–4 termelõdése nagyban csökkent mind a PTX3-mal és/vagy AmBisome-mal történõ kezelés, mind a PTX3-mal és Fungizone-nal történõ kombinált kezelés által, jóllehet kisebb mértékben (7B. ábra). Tehát a PTX3 látszólag az AmBisome-mal – inkább, mint a Fungizone-nal – szinergikusan mûködik a pulmonáris gyulladásos válasz csökkentésében és a Th1 gombaellenes reaktivitás elõsegítésében. A találmány szerinti PTX3 gyógyító választ indukált IA¹ban szenvedõ egerekben minimális betegség mellett. Figyelemben tartva, hogy a PTX3 hatékony volt profilaktikusan beadva, és hogy nem mutat közvetlen aktivitást gombás sejtekre, úgy tûnhet, hogy a jótékony hatása a Th1-függõ védõválasz aktiválásának képességétõl függ. A PTX3 legalább kettõ, patogén fertõzés elleni effektor útvonalat aktivál, nevezetesen a klasszikus komplement aktivációs útvonalat a C1q kötéssel (35), és a fagocitózis elõsegítését egy vagy több még nem azonosított sejtreceptorral történõ kölcsönhatáson keresztül (20). Valószínû, hogy a konídiumok internalizálódása a rezidens mononukleáris sejtek által a gombás fertõzõképesség korlátozását szolgálhatja és lehetõvé teheti a mieloid és limfoid sejtek regenerálódását a tüdõben. A PTX3 azonban aktiválja a DC¹ket is az IL–12 termelésén és a kostimuláns molekulák expresszióján keresztül az Aspergillus konídiumra adott válaszul (20). Ily módon a PTX3 DC¹kben való termelõdésének gyors kialakulása a Toll-szerû receptor (TLR) család tagjain keresztül (18) a PTX3 közvetlen szerepét jelenti a veleszületett rezisztencia amplifikálásában és az adaptív immunitás irányításában. Az IL–12 termelõdése megnövekedett és az IL–10¹é csökkent a PTX3-mal kezelt fertõzött egerek tüdejében, amely eredmény gyulladásos választ jelez. Mindazonáltal a TNF¹a termelõdése nem növekedett a PTX3-mal történõ kezelés hatására, ami azt sugallja, hogy a PTX3, mint számos kollektin, a pro- és antiinflammatorikus stimulusok közötti egyensúly finom szabályozójaként mûködhet (42, 48).
1
HU 003 779 T2
A találmány szerint az AmBisome és Fungizone terápiás hatékonyságát értékeltük a BM¹transzplantátum fertõzéses modellben, ami párhuzamos a BM¹transzplantátum recipiensekben megfigyelt immunpatológiával, ahol az invazív gombás fertõzésekre való érzékenység okozatilag összefügg a védõ Th¹válaszok kialakulásával (15, 33). Azt találtuk, hogy az AmBisome jobb aktivitást mutat IA¹ban szenvedõ egerekben BM¹transzplantáció után, mint a Fungizone. AmBisome 5 mg/kg napi profilaktikus és terápiás kezelése meggyógyította az egereket e fertõzésbõl, és csökkentette a gombás terhelést a tüdõben. A D¹AmB-vel csak kissé megnövekedett fertõzés elleni rezisztenciát figyeltünk meg a legmagasabb tolerált dózisban (például 4 mg/kg) a fertõzés után beadva. Feltételezték, hogy a D¹AmB toxicitása, beleértve a lázat és reszketést, a veleszületett immunrendszer immunsejtjei általi proinflammatorikus citokintermelés eredménye, TLR-függõ mechanizmus útján (43). A TLR2, CD 14 és a MyD88 adaptor fehérjét expresszáló egérmakrofágok és humán sejtvonalak proinflammatorikus citokinek, beleértve TNF-alfa felszabadításával reagáltak a D¹AmB¹re. Felismertük, hogy a TNF¹a termelése magasabb volt a DAmB-vel kezelt egerekben, mint az L¹AmB-vel kezeltekben. Azonban a kombinált kezelés PTX3-mal nagyban csökkentette a Fungizone-nal indukált TNF¹a termelést, míg egyidejûleg növelte a gyógyszer terápiás hatását, amint azt a megnövekedett túlélés és csökkent gombás terhelés mutatta a PTX3 és D¹AmB kombinációjával kezelt egerekben a fertõzést követõen. A kombinált terápia PTX3-mal növelte az AmBisome szuboptimális dózisának a hatékonyságát is a TNF-a-termelés szintjének befolyásolása nélkül, összehasonlítva az egyes egyedi kezelésekkel megfigyelttel. Tehát a PTX3 aktivitása gombaellenes szerekkel történõ együttes beadása olyan hatástól függhet, amely túlmutat a TNF-a-termelésen. Ebben a vonatkozásban ismert, hogy a gombaellenes kemoterápia hatékonysága a gazda immunreaktivitásától függ, és hogy az amfotericin¹B különbözõ kiszerelései további gombaellenes aktivitást fejtenek ki az effektor fagocitákkal együtt az A. fumigatus ellen (40). Arról is beszámoltak, hogy a PTX3 növeli a fagocitózist és az effektor fagociták ölõaktivitását Aspergillus konídium ellen (20). Hivatkozások 1. Adler-Moore, J. és R. T. Profitt. 1993. Development, characterization, efficacy, and mode of action of AmBisome, a unilamellar formulation of amphotericin B. J. Liposome Res. 3:429–450. 2. Adle-Moore, J. és R. T. Proffitt. 2002. AmBisome: liposomal formulation, structure, mechanism of action and preclinical experience. J Antimicrob. Chemother. 49:21–30. 3. Babbin, B. A., J. N. Greene, R. Vega, S. Iravani, N. N. Ku és R. L. Sandin. 2000. Pathologic manifestations of invasive pulmonary aspergillosis in cancer patients: the many faces of aspergillus. Cancer Control 7:566–571.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
4. Bennett, J. E., W. E. Dismukes, R. J. Duma, G. Medoff, M. A. Sande, H. Gallis, J. Leonard, B. T. Fields, M. Bradshaw, H. Haywood, Z. A. McGee, T. R. Cate, C. G. Cobbs, J. F. Warner és D. W. Alling. 1979. A comparison of amphotericin B alone and combined with flucytosine in the treatment of cryptoccal meningitis. N. Engl. J. Med. 301:126–131. 5. BitMansour, A., S. M. Burns, D. Traver, K. Akashi, C. H. Con- tag, I. L. Weissman és J. M. Brown. 2002. Myeloid progenitors protect against aspergillosis and Pseudomonas aeruginosa infection following hematopoietic stem cell transplantation. Blood 100:4660–4667. 6. BitMansour, A. és J. M. Y. Brown. 2002. Prophylactic administration of liposomal amphotericin B is superior to treatment in a mur- ine model of invasive aspergillosis after hematopoietic cell transplantation. J. Infect. Dis. 186:134–134. 7. Bottazzi, B., V. Vouret-Craviari, A. Bastone, L. De Gioia, C. Matteucci, G. Peri, F. Spreafico, M. Pausa, C. D’Ettorre, E. Gianazza, A. Tagliabue, M. Salmona, F. Tedesco, M. Introna és A. Mantovani. 1997. Multimer formation and ligand recognition by the long pentraxin PTX3. Similarities and differences with the short pentraxins C¹reactive protein and serum amyloid P component. J. Biol. Chem. 272:32 817–32 823. 8. Bozza, S., R. Gaziano, G. B. Lipford, C. Montagnoli, A. Bacci, P. Di Francesco, V. P. Kurup, H. Wagner és L. Romani. 2002. Vaccination of mice against invasive aspergillosis with recombinant Aspergillus proteins and CpG oligodeoxynucleotides as adjuvants. Microbes Infect. 4:1281–1290. 9. Bozza, S., R. Gaziano, A. Spreca, A. Bacci, C. Montagnoli, P. Di Francesco és L. Romani. 2002. Dendritic cells transport conidia and hyphae of Aspergillus fumigatus from the airways to the draining lymph nodes and initiate disparate Th responses to the fungus. J. Immunol. 168:1362–1371. 10. Bozza, S., K. Perruccio, C. Montagnoli, R. Gaziano, S. Bellocchio, E. Burchielli, G. Nkwanyuo, L. Pitzurra, A. Velardi és L. Romani. 2003. A dendritic cell vaccine against invasive aspergillosis in allogeneic hematopoietic transplantation. Blood 102:3807–3814. 11. Breviario, F., E. M. d’Aniello, J. Golay, G. Peri, B. Bottazzi, A. Bairoch, S. Saccone, R. Marzella, V. Predazzi, M. Rocchi, G. Della Valle, E. Dejana, A. Mantovani és M. Introna. 1992. Interleukin-1-inducible genes in endothelial cells. Cloning of a new gene related to C¹reactive protein and serum amyloid P component. J. Biol. Chem. 267:22 190–22 197. 12. Cenci, E., S. Perito, K. H. Enssle, P. Mosci, J. P. Latge, L. Romani és F. Bistoni. 1997. Th1 and Th2 cytokines in mice with invasive aspergillosis. Infect. Immun. 65:564–570. 13. Cenci, E., A. Mencacci, C. F d’Ostiani, G. Del Sero, P. Mosci, C. Montagnoli, A. Bacci és L. Romani. 1998. Cytokine- and T helper-dependent lung mucosal immunity in mice with invasive pulmonary aspergillosis. J. Infect. Dis. 178:1750–60.
1
HU 003 779 T2
14. Cenci, E., A. Mencacci, A. Bacci, F. Bistoni, V. P. Kurup és L. Romani. 2000. T cell vaccination in mice with invasive pulmonary aspergillosis. J. Immunol. 165:381–388. 15. Cenci, E., A. Mencacci, A. Spreca, C. Montagnoli, A. Bacci, K. Perruccio, A. Velardi, W. Magliani, S. Conti, L. Polonelli és L. Romani. 2002. Protection of killer antiidiotypic antibodies against early invasive aspergillosis in a murine model of allogeneic T¹ cell depleted bone marrow transplantation. Infect. Immun. 70:2375–2382. 16. Denning, D. W. 1998. Invasive aspergillosis. Clin. Infect. Dis. 26:781–803. 17. Denning, D. W., S. E. Follansbee, M. Scolaro, S. Norris, H. Edelstein és D. A. Stevens. 1991. Pulmonary aspergillosis in the acquired immunodeficiency syndrome. N. Engl. J. Med. 324:654–662. 18. Doni, A., G. Peri, M. Chieppa, P. Allavena, F. Pasqualini, L. Vago, L. Romani, C. Garlanda és A. Mantovani. 2003. Production of the soluble pattern recognition receptor PTX3 by myeloid, but not plasmacytoid, dendritic cells. Eur. J. Immunol. 33:2886–2893. 19. Fazzini, F., G. Peri, A. Doni, G. Dell’Antonio, E. Dal Cin, E. Bozzolo, F. D’Auria, L. Praderio, G. Ciboddo, M. G. Sabbadini, A. A. Manfredi, A. Mantovani és P. R. Querini. 2001. PTX3 in small-vessel vasculitides: an independent indicator of disease activity produced at sites of inflammation. Arthritis Rheum. 44:2841–2850. 20. Garlanda, C., E. Hirsch, S. Bozza, A. Palustri, M. De Acetis, R. Nota, A. Maccagno, F. Riva, B. Bottazzi, G. Peri, A. Doni, L. Vago, M. Botto, R. De Santis, P. Carminati, G. Siracusa, F. Altruda, A. Vecchi, L. Romani és A. Mantovani. 2002. Non-redundant role of the long pentraxin PTX3 in anti-fungal innate immune response. Nature 420:182–186. 21. Gewurz, H., X. H. Zhang és T. F. Lint. 1995. Structure and function of the pentraxins. Curr. Opin. Immunol. 7:54–64. 22. Grazziutti, M., D. Przepiorka, J. H. Rex, I. Braunschweig, S. Vadhan-Raj és C. A. Savary. 2001. Dendritic cell-mediated stimulation of the in vitro lymphocyte response to Aspergillus. Bone Marrow Transplant. 27:647–652. 23. Hebart, H., C. Bollinger, P. Fisch, J. Sarfati, C. Meisner, M. Bauer, J. Loeffler, M. Monod, J. Latge és H. Einsele. 2002. Analysis of T¹cell responses to Aspergillus fumigatus antigens in healthy individuals and patients with hematological malignancies. Blood 100:4521–4527. 24. Herbrecht, R., D. W. Denning, T. F. Patterson, J. E. Bennett, R. E. Greene, J. W. Oestmann, W. V. Kern, K. A. Marr, P. Ribaud, O. Lortholary, R. Sylvester, R. H. Rubin, J. R. Wingard, P. Stark, C. Durand, D. Caillot, E. Thiel, P. H. Chandrasekar, M. R. Hodges, H. T. Schlamm, P. F. Troke, B. de Pauw és Invasive Fungal Infections Group of the European Organisation for Research and Treatment of Cancer and the Global Aspergillus Study Group. 2002. Voriconazole versus amphotericin B for primary therapy of invasive aspergillosis. N. Engl. J. Med. 347:408–415.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
25. Hiemenz, J. W. és T. J. Walsh. 1996. Lipid formulation of amphotericin B: recent progress and future directions. Clin. Infect. Dis. 22:5133–5144. 26. Ito, J. és J. Lyons. 2002. Vaccination of corticosteroid immunosuppressed mice against invasive pulmonary aspergillosis. J. Infect. Dis. 186:869–871. 27. Latge, J. P. 1999. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clin. Microbiol. Rev. 12:310–350. 28. McCormack, F. X. és J. A. Whitsett. 2002. The pulmonary collectins, SP¹A and SP¹D, orchestrate innate immunity in the lung. J. Clin. Invest. 109:707–712. 29. Madan, T., U. Kishore, M. Singh, P. Strong, E. M. Hussain, K. B. M. Reid és P. U. Sarma. 2001. Protective role of lung surfactant protein D in a murine model of invasive pulmonary aspergillosis. Infect. Immun. 69:2728–2731. 30. Marr, K. A., R. A. Carter, M. Boeckh, P. Martin és L. Corey. 2002. Invasive aspergillosis in allogeneic stem cell transplant recipients: changes in epidemiology and risk factors. Blood 100:4358–4366. 31. Marr, K. A. 2003. New approaches to invasive fungal infections. Curr. Opin. Hematol. 10:445–450. 32. Mencacci, A., E. Cenci, A. Bacci, F. Bistoni és L. Romani. 2000. Host immune reactivity determines the efficacy of combination immunotherapy and antifungal chemotherapy in candidiasis. J. Infect. Dis. 181:686–694. 33. Mencacci, A., K. Perruccio, A. Bacci, E. Cenci, R. Benedetti, M. F. Martelli, F. Bistoni, R. Coffman, A. Velardi és L. Romani. 2001. Defective antifungal T¹helper 1(Th1) immunity in a murine model of allogeneic T¹cell-depleted bone marrow transplantation and its restoration by treatment with TH2 cytokine antagonists. Blood 97:1483–1490. 34. Muller, B., G. Peri, A. Doni, V. Torri, R. Landmann, B. Bottazzi és A. Mantovani. 2001. Circulating levels of the long pentraxin PTX3 correlate with severity of infection in critically ill patients. Crit. Care Med. 29:1404–1407. 35. Nauta, A. J., B. Bottazzi, A. Mantovani, G. Salvatori, U. Kishore, W. J. Schwaeble, A. R. Gingras, S. Tzima, F. Vivanco, J. Egido, O. Tijsma, E. C. Hack, M. R. Daha és A. Roos. 2003. Biochemical and functional characterization of the interaction between pentraxin 3 and Clq. Eur. J. Immunol. 33:465–473. 36. Patterson, T. F., W. R. Kirkpatrick, M. White, J. W. Hiemenz, J. R. Wingard, B. Dupont, M. G. Rinaldi, D. A. Stevens és J. R. Graybill. 2000. Invasive aspergillosis. Disease spectrum, treatment practices, and outcomes. Medicine 79:250–260. 37. Peri, G., M. Introna, D. Corradi, G. Iacuitti, S. Signorini, F. Avanzini, F. Pizzetti, A. P. Maggioni, T. Moccetti, M. Metra, L. D. Cas, P. Ghezzi, J. D. Sipe, G. Re, G. Olivetti, A. Mantovani és R. Latini. 2000. PTX3, A prototypical long pentraxin, is an early indicator of acute myocardial infarction in humans. Circulation 102:636–641. 38. Polentarutti, N., G. Picardi, A. Basile, S. Cenzuales, A. Rivolta, C. Matteucci, G. Peri, A. Mantovani és M. Introna. 1998. Interferon-gamma inhibits expres-
1
HU 003 779 T2
sion of the long pentraxin PTX3 in human monocytes. Eur. J. Immunol. 28:496–501. 39. Roilides, E., H. Katsifa és T. J. Walsh. 1998. Pulmonary host defences against Aspergillus fumigatus. Res. Immunol. 149:454–465. 40. Roilides, E., C. A. Lyman, J. Filioti, O. Akpogheneta, T. Sein, C. G. Lamaignere, R. Petraitiene és T. J. Walsh. 2002. Amphotericin B formulations exert additive antifungal activity in combination with pulmonary alveolar macrophages and polymorphonuclear leukocytes against Aspergillus fumigatus. Antimicrob. Agents Chemother. 46:1974–1976. 41. Rolph, M. S., S. Zimmer, B. Bottazzi, C. Garlanda, A. Mantovani és G. K. Hansson. 2002. Production of the long pentraxin PTX3 in advanced atherosclerotic plaques. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 22:e10–14. 42. Sato, M., H. Sano, D. Iwaki, K. Kudo, M. Konishi, H. Takahashi, T. Takahashi, H. Imaizumi, Y. Asai és Y. Kuroki. 2003. Direct binding of Toll-like receptor 2 to zymosan, and zymosan-induced NF¹kappa B activation and TNF-alpha secretion are down-regulated by lung collectin surfactant protein A. J. Immunol. 171:417–425. 43. Sau, K., S. S. Mambula, E. Latz, P. Henneke, D. T. Golenbock és S. M. Levitz. 2003. The antifungal drug amphotericin B promotes inflammatory cytokine release by a Toll-like receptor- and CD14-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278:37 561–37 568. 44. Schneemann, M. és A. Schaffner. 1999 Host defence mechanism in Aspergillus fumigatus infections. Contrib. Microbiol. 2:57–68. 45. Steinbach, W. J. és D. A. Stevens. 2003. Review of newer antifungal and immunomodulatory strategies for invasive aspergillosis. Clin. Infect. Dis. 37 (Suppl 3):S157–S187. 46. Steinbach, W. J., D. A. Stevens és D. W. Denning. 2003. Combination and sequential antifungal the-
2
rapy for invasive aspergillosis: review of published in vitro and in vivo interactions and 6281 clinical cases from 1966 to 2001. Clin. Infect. Dis. 37 (Suppl 3):S188–S224. 47. Wingard, J. R. 1999. Fungal infections after 5 bone marrow transplant. Biol. Blood Marrow Transplant. 5:55–68. 48. Yang, S., C. Milla, A. Panoskaltsis-Mortari, S. Hawgood, B. R. Blazar és 1. Y. Haddad. 2002. Surfac10 tant protein A decreases lung injury and mortality after murine marrow transplantation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 27:297–305.
15
20
25
30
35
9
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. PTX3 pentraxin és gombaellenes szer kombinációja. 2. Az 1. igénypont szerinti kombináció, amelyben a gombaellenes szer amfotericin¹B. 3. A 2. igénypont szerinti kombináció, amelyben az amfotericin¹B deoxikolát formában vagy liposzomális kiszerelésben van. 4. Gyógyászati készítmény, amely 1–3. igénypontok bármelyike szerinti kombinációból áll. 5. A 4. igénypont szerinti készítmény, amely gombaellenes szer szuboptimális dózisát tartalmazza. 6. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti kombináció alkalmazása gombás fertõzések profilaktikus vagy terápiás kezelésére alkalmas gyógyszer elõállítására. 7. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a gyógyszer gombaellenes szer szuboptimális dózisát tartalmazza. 8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a gombás fertõzés tüdõaszpergillózis.
HU 003 779 T2 Int. Cl.: A61K 38/17
10
HU 003 779 T2 Int. Cl.: A61K 38/17
11
HU 003 779 T2 Int. Cl.: A61K 38/17
12
HU 003 779 T2 Int. Cl.: A61K 38/17
13
HU 003 779 T2 Int. Cl.: A61K 38/17
14
HU 003 779 T2 Int. Cl.: A61K 38/17
15
HU 003 779 T2 Int. Cl.: A61K 38/17
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
