!HU000006472T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 006 472
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 39/12
(21) Magyar ügyszám: E 04 788982 (22) A bejelentés napja: 2004. 09. 24. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040788982 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1673106 A1 2005. 04. 14. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1673106 B1 2009. 07. 01.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 506812 P 2003. 09. 29.
(73) Jogosult: Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey 070650907 (US)
US
(72) Feltalálók: BRYAN, Janine, T., Rahway, New Jersey 07065-0907 (US); BROWNLOW, Michelle, K., Rahway, New Jersey 07065-0907 (US); SCHULTZ, Loren, D., Rahway, New Jersey 07065-0907 (US); JANSEN, Kathrin, U., Rahway, New Jersey 07065-0907 (US) (54)
(2006.01) C12N 15/37 (2006.01) C12N 15/81 (2006.01) C07K 14/025 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05032586 PCT/US 04/031326
(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
HPV 45 L1 optimalizált expresszáltatása élesztõben
(57) Kivonat
HU 006 472 T2
A találmány tárgyát HPV45 L1 fehérjét kódoló szintetikus DNS-molekulák képezik. Közelebbrõl a találmány tárgyát HPV45 L1 fehérjét kódoló polinukleotidok képezik, ahol a polinukleotidok kodon-optimalizálva lettek élesztõben történõ magas szintû expresszióra. A szintetikus molekulák HPV45 vírusszerû részecskék
(VLP¹k) elõállítására, és a HPV45 VLP-ket tartalmazó vakcinák és gyógyászati készítmények elõállítására alkalmazhatók. A találmány szerinti vakcinák hatékony immunprofilaxist biztosítanak papillomavírus-fertõzés ellen, semlegesítõ ellenanyagok és sejtközvetített immunitás révén.
A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül 9 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 006 472 T2
A találmány területe A találmány tárgya általánosságban a humán papillomavírus (HPV) terápiája. Közelebbrõl a találmány tárgyát a HPV45 L1 fehérjét kódoló szintetikus polinukleotidok képezik, és a polinukleotidokat tartalmazó rekombináns vektorok és gazdák. A találmány tárgyát képezik HPV45 vírusszerû részecskék (VLP) is, ahol a VLP¹k rekombináns HPV 45 L1 vagy L1+L2 élesztõsejtekben történõ expresszáltatásával vannak elõállítva, és azok alkalmazása vakcinákban és gyógyászati készítményekben HPV megelõzésére és kezelésére. A találmány háttere A humán papillomavírusnak (HPV) több mint 80 típusa van, amelyek közül sokat kapcsolatba hoztak biológiai fenotípusok széles körével, a jóindulatú proliferatív szemölcsöktõl a rosszindulatú karcinómákig [összefoglalásért lásd McMurray és mtsai., Int. J. Exp. Pathol. 82(1): 15–33. old. (2001)]. A HPV6 és HPV11 leggyakrabban a jóindulatú szemölcsökkel és/vagy a genitális vagy respiratorikus nyálkahártya nem rosszindulatú condyloma acuminata-ival kapcsolatos két típus. A HPV16 és HPV18 a legkockázatosabb típusok, amelyek gyakran kapcsolatba hozhatók a méhnyak, hüvely, szeméremajkak és a végbélcsatorna in situ és invazív karcinómáival. A méhnyakkarcinómák több mint 90%¹a kapcsolatos a HPV16, HPV18 vagy a kevésbé gyakori HPV31, –33, –45, –52 és –58 onkogén típusokkal [Schiffman és mtsai., J. Natl. Cancer Inst. 85(12): 958–964. old. (1993)]. Az a megfigyelés, hogy HPV DNS detektálható a méhnyakrákok több mint 90%ában erõs járványtani bizonyíték arra, hogy a HPV¹k méhnyakrákot okoznak [lásd Bosch és mtsai., J. Natl. Cancer Inst. 87(11): 796–802. old. (1995)]. A papillomavírusok kicsi (50–60 nm), nemburkos, ikozahedrális DNS-vírusok, amelyek maximum nyolc korai és két késõi gént kódolnak. A virális genom nyílt leolvasási fázisait (ORF) E1–E7-nek és L1¹nek és L2¹nek nevezzük, ahol „E” jelentése korai és „L” jelentése késõi. Az L1 és L2 kapszidfehérjéket kódolnak, míg az E¹gének olyan funkciókkal kapcsolatosak, mint például a virális replikáció és celluláris transzformáció. Az L1 fehérje a fõ kapszidfehérje, és a molekulatömege 55–60 kDa. Az L2 fehérje a kis kapszidfehérje. Az immunológiai adatok arra utalnak, hogy az L2 fehérje többsége belül van a virális kapszidban az L1 fehérjéhez képest. Az L1 és L2 fehérjék egyaránt erõsen konzerváltak a különbözõ papillomavírusok között. Az L1 fehérje vagy az L1 és L2 fehérjék kombinációjának az expressziója élesztõben, rovarsejtekben, emlõssejtekben vagy baktériumokban vírusszerû részecskék (VLP) önmaguktól való összeállítódásához vezet [összefoglalásért lásd Schiller és Roden, „Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses”; szerk.: Lacey, kiad.: Leeds, UK: Leeds Medical Information, 101–112. old. (1996)]. A VLP¹k morfológiailag hasonlóak a valódi virionokhoz, és képesek semlegesítõ ellenanyagok magas titerének indukálására állatnak történõ beadás után. Mivel a VLP¹k nem tartalmazzák a potenciálisan onkogén virális genomot,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
azok biztonságos alternatívát jelentenek az élõ vírus alkalmazásához képest HPV-vakcinák kifejlesztésében [összefoglalásért lásd Schiller és Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67–74. old. (2000)]. Ezen okból az L1 és L2 géneket immunológiai célpontként azonosították HPV-fertõzés és betegség elleni profilaktikus és terápiás vakcinák kifejlesztése érdekében. A HPV-vakcina-fejlesztést és forgalomba hozatalt akadályozták az exogén gének magas expressziós arányának elérésével kapcsolatos nehézségek a sikeresen transzformált gazdaszervezetekben, ami korlátozza a tisztított fehérje termelését. Tehát a HPV L1 fehérjéket, mint például a HPV45 L1 fehérjét kódoló vad típusú nukleotidszekvenciák azonosítása ellenére nagy igény lenne a nyers HPV L1 fehérje könnyen újratermelõdõ forrására, amely olyan HPV45 L1¹et kódoló nukleotidszekvenciákat alkalmaz, amelyek optimalizálva vannak a tervezett gazdasejtben történõ expresszáltatásra. Ezenfelül hasznos lenne olyan HPV45 L1 VLP¹k nagy mennyiségének termeltetése vakcinafejlesztésben történõ alkalmazásra, amelynek megvannak a natív fehérjék immunitást kiváltó tulajdonságai. Tobery és mtsai. [Vaccine, 21 (2003) 1539–1547. old.] leírják vakcinabejuttatási rendszer hatásait HPV16 L1¹re specifikus immunválaszokra immunizált makákó majmokban. A WO 01/14416 számú nemzetközi közzétételi irat olyan szintetikus HPV géneket tár fel, amelyek kodon-optimalizálva vannak humán gazdasejtekben történõ expresszáltatásra. Zhou és mtsai. [J. Virology, 73 (1999) 4972–4982. old.] a papillomavírus L1 gének expresszióját replikálódó és nem replikálódó sejtekben szabályozó faktorokat tárgyalnak. A találmány összefoglalása A találmány tárgyát a méhnyakrákkal kapcsolatba hozott HPV45 L1 gének által expresszált fehérjetermékek elleni immunitás kiváltására vagy fokozására szolgáló eljárásokban alkalmazható készítmények képezik. A találmány tárgyát a HPV45 L1 fehérjét kódoló szintetikus DNS-molekulák képezik. A szintetikus molekulák kodonjai úgy vannak megtervezve, hogy élesztõsejtben preferált kodonok vannak alkalmazva. A szintetikus molekulák HPV45 L1 fehérje forrásaiként alkalmazhatók, amelyek maguktól összeállítódhatnak VLP¹ké. A VLP¹k VLP-alapú vakcinában alkalmazhatók. Közelebbrõl a találmány tárgyát olyan szintetikus nukleinsavmolekula képezi, amely a 2. azonosító számú szekvencia szerinti HPV45 L1 fehérjét kódolja, amely nukleinsavmolekula 1. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz. A találmány tárgyát képezik továbbá rekombináns vektorok és rekombináns gazdasejtek, prokarióták és eukarióták egyaránt, amelyek tartalmazzák a leírásban feltárt nukleinsavmolekulákat. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás HPV45 L1 fehérje expresszáltatására rekombináns gazdasejtben, amely tartalmazza a következõket: (a) HPV45 L1 fehérjét kódoló nukleinsavat tartalmazó vektor bejuttatása élesztõgazdasejtbe; ahol a nukleinsav-
1
HU 006 472 T2
molekula kodon-optimalizált élesztõgazdasejtben történõ optimális expresszáltatásra; és (b) az élesztõgazdasejt tenyésztése olyan körülmények között, amelyek lehetõvé teszik a HPV45 L1 fehérje expresszálódását; a nukleinsav 1. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz (45 L1 R szekvencia). A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint az élesztõ az alábbiakból álló csoportból van választva: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis és Schizosaccharomyces pombe. A találmány tárgyát képezik eljárások is HPV45 L1 vírusszerû részecskéket (VLP) tartalmazó vakcina elõállítására. A találmány ezen aspektusának egy alternatív megvalósítási módja szerint a vakcina tartalmazza legalább egy további HPV típus VLP¹it is. A legalább egy további HPV-típus bármely jelentõséggel bíró HPV-típus lehet, beleértve a szakirodalomban leírt bármely HPV-típust vagy az ezt követõen azonosítottakat. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a HPV-típus olyan típus, amely klinikai fenotípussal, mint például szemölcsökkel vagy méhnyakrákkal kapcsolatos. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint a legalább egy további HPV-típus az alábbiakból álló csoportból választott: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 és HPV68. A leírásban és a csatolt igénypontokban a határozatlan és határozott névelõ egyes számú formái magától értetõdõen magukban foglalják a többes számú referenciákat, hacsak nem a tartalom nyilvánvalóan másként követeli meg. Amint a leírásban és a csatolt igénypontokban alkalmazzuk, a következõ definíciók és rövidítések alkalmazandók: A „promoter” kifejezés alatt olyan felismerési helyet értünk a DNS-szálon, amelyhez az RNS-polimeráz kötõdik. A promoter iniciációs komplexet alkot az RNSpolimerázzal a transzkripciós aktivitás iniciálására és irányítására. A komplex módosítható „enhanszereknek” vagy „leolvasási iránnyal szemben elhelyezkedõ aktiválószekvenciáknak” nevezett aktiválószekvenciákkal vagy „szilenszereknek” nevezett gátlószekvenciákkal. A „vektor” kifejezés alatt olyan eszközöket értünk, amelyekkel DNS-fragmenseket juttathatunk be gazdaszervezetbe vagy gazdaszövetbe. Különbözõ típusú vektorok vannak, beleértve plazmidok, vírusok (beleértve adenovírust), bakteriofágok és kozmidok. A „45 L1 vad típusú szekvencia” elnevezés alatt a 3. azonosító számú szekvencián feltárt HPV45 L1 DNSszekvenciát értjük (45 L1 wt). Habár a HPV45 L1 vad típusú DNS-szekvenciát korábban már feltárták, nem szokatlan kisebb szekvenciavariációk megtalálása a klinikai izolátumokból nyert DNS¹ek között. Tehát egy jellegzetes 45 L1 vad típusú DNS-szekvenciát izoláltunk olyan klinikai mintákból, amelyekrõl korábban kimutatták, hogy HPV45 DNS¹t tartalmaznak (lásd az 1. példát). A 45 L1 vad típusú szekvenciát alkalmaztuk referenciaszekvenciaként a találmány szerinti kodon-opti-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
malizált 45 L1 szekvenciák összehasonlításához (lásd a 1. ábrát). A „HPV 45 L1 R” vagy „45 L1 R” elnevezések alatt olyan szemléltetõ találmány szerinti szintetikus HPV45 L1 nukleotidszekvenciát (1. azonosító számú szekvencia) értünk, amely szekvenciája újra fel lett építve oly módon, hogy olyan kodonokat tartalmazzon, amelyek preferáltak magas szintû expresszióhoz élesztõsejtben. A „hatásos mennyiség” kifejezés alatt a polipeptid megfelelõ szintjének eléréséhez elegendõ mennyiségû vakcinakészítmény beadását értjük, aminek az eredménye immunválasz. A szakember számára nyilvánvaló, hogy ez a szint változó lehet. A „konzervatív aminosavszubsztitúció” kifejezés alatt egy aminosav-oldalláncnak egy másik, kémiailag hasonló aminosav-oldallánccal történõ helyettesítését értjük. Az ilyen konzervatív szubsztitúciók példái közé tartozik: egy hidrofób oldallánc (izoleucin, leucin, valin vagy metionin) szubsztitúciója egy másikkal, egy poláros oldallánc szubsztitúciója egy másik azonos töltésû poláros oldallánccal (például arginin lizin helyett; glutaminsav aszparaginsav helyett). Az „emlõs” kifejezés alatt bármilyen emlõst, beleértve emberi lényt értünk. A „VLP” vagy „VLP¹k” kifejezés alatt vírusszerû részecskét vagy vírusszerû részecskéket értünk. A „szintetikus” kifejezés alatt azt értjük, hogy a HPV45 L1 gént oly módon hoztuk létre, hogy olyan nukleotidok szekvenciáját tartalmazza, amelyek nem ugyanazok, mint a természetben elõforduló, megnevezett vad típusú HPV45 L1 génben (45 L1 wt, 3. azonosító számú szekvencia) jelen lévõk. Amint fent mondtuk, a találmány tárgyát olyan szintetikus molekulák képezik, amelyek olyan kodonokat tartalmazó nukleotidszekvenciát tartalmaznak, amelyek expressziója preferált élesztõsejtekben. A találmány szerinti szintetikus molekulák ugyanazt az aminosavszekvenciát kódolják, mint a vad típusú HPV45 L1 gén (2. azonosító számú szekvencia). Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra DNS-szekvencia egymás alá rendezést mutat, amely azokat a nukleotidokat mutatja, amelyek meg lettek változtatva a találmány szerinti szintetikus HPV45 L1 génben (1. azonosító számú szekvencia, jelölése „45 L1 R”) (lásd a 2. példát). A referenciaszekvencia a 45 L1 vad típusú szekvencia (3. azonosító számú szekvencia, jelölése „45 L1 wt”; lásd az 1. példát). A megváltoztatott nukleotidokat a megfelelõ helyeiken mutatjuk. A nukleotidszám zárójelben látható. A 45 L1 újjáépített szekvencia azonos nukleotidjait pontokkal jelöljük. A 2. ábra a szintetikus HPV45 L1 nukleotidot és az egybetûsen kódolt aminosavszekvenciát mutatja be. A nukleotidszámokat a bal oldalon jelezzük.
1
HU 006 472 T2
A 3. ábra a HPV 45 L1 RNS¹re erõsen sztringens körülmények között specifikusan próbázott Northern-blotot mutat be (lásd a 4. példát). Az (1) sáv 5 mg HPV 45 L1 R RNS¹t tartalmaz, és a (2) sáv 10 mg HPV 45 L1 R RNS¹t tartalmaz. Egyetlen teljes hosszúságú RNS-transzkriptum látható a bloton. A bal oldali nyíl jelöli a teljes hosszúságú HPV45 L1 transzkriptum megjósolt pozícióját. A 4. ábra HPV 45 L1 wt és három HPV 45 L1 R izolátum Western-blotját mutatja be. A sávok tartalma: 45 L1 wt (1. sáv), 45 L1 R #4 (2. sáv), 45 L1 R #7 (3. sáv), 45 L1 R #11 (4. sáv), HPV 16 L1 kontroll (5. sáv). 15 mg teljes élesztõfehérje-extraktumot vittünk fel 10%¹os SDS-PAGE gél mindegyik sávjában. A TrpE-HPV 45 L1 fúziós fehérje elleni kecske poliklonális ellenanyagot alkalmaztunk a HPV 45 L1 fehérje specifikus azonosítására. A bal oldali nyíl az 55 kDa pozíciót jelöli. Az 5. ábra két ELISA kísérletbõl származó adatok egy részét mutatja be ng VLP/mg összfehérje-egységekben (lásd a 7. példát). A 45 L1 wt és a 45 L1 R két különálló klónjának összehasonlítását mutatjuk be. Az újraépített HPV 45 L1 VLP expressziója megközelítõleg 2¹szerese volt, mint a 45 L1 wt¹é. A 6. ábra HPV45 VLP¹k jellegzetes mintáját mutatja be transzmissziós elektronmikroszkópiával, amelyek találmány szerinti HPV45 L1 R fehérjékbõl állnak (lásd a 8. példát). A mérõvonal megközelítõleg 100 nm. A találmány részletes leírása A méhnyakkarcinómák többsége humán papillomavírusok (HPV) specifikus onkogén típusaival való fertõzéssel hozhatók kapcsolatba. A találmány tárgyát készítmények és eljárások képezik onkogén HPV-típusok által expresszált fehérjetermékek elleni immunitás kiváltására vagy fokozására. Közelebbrõl a találmány tárgyát HPV45 L1 fehérjét kódoló polinukleotidok képezik, amelyek önmaguktól HPV45 vírusszerû részecskékké (VLP) állítódnak össze, és feltárja a polinukleotidok és VLP¹k gyógyászati készítményekben és vakcinákban történõ alkalmazását HPV-vel kapcsolatos rák megelõzésére és/vagy kezelésére. A vad típusú HPV45 L1 nukleotidszekvenciát már leközölték [Genbank hozzáférési száma # NC_001590; lásd még Delius és Hofmann, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 186: 13–31. old. (1994)]. A találmány tárgyát a HPV45 L1 fehérjét kódoló szintetikus DNS-molekulák képezik. A találmány szerinti szintetikus molekulák olyan kodonok szekvenciáját tartalmazzák, amelyekben a kodonok úgy vannak megváltoztatva, hogy az élesztõ által preferált kodonokat vannak alkalmazva a magas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
szintû expresszió érdekében. A szintetikus molekulák kódolószekvenciaként alkalmazhatók HPV45 L1 fehérje expressziójához, amelyek összeállítódhatnak VLP¹ké. A VLP¹k alkalmazhatók VLP-alapú vakcinában hatékony immunprofilaxis biztosítására papillomavírus-fertõzés ellen, semlegesítõ ellenanyag és sejtközvetített immunitás révén. A HPV VLP¹k élesztõsejtekben történõ expressziója azzal az elõnnyel jár, hogy költséghatékony és könnyen adaptálható nagyléptékû tenyésztéshez fermentorokban. Azonban sok HPV L1 fehérje, beleértve a HPV45 L1¹et is, olyan szinten expresszálódik élesztõsejtekben, ami alacsonyabb, mint ami kívánatos a kereskedelmi célú léptéknöveléshez. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát olyan HPV45 L1 génszekvenciák képezik, amelyek „optimalizálva” vannak élesztõsejtes környezetben történõ magas szintû expresszióra. A négy lehetséges nukleotidbázis „triplett” kodonja több mint 60¹féle variáns alakban létezhet. Mivel ezek a kodonok csak 20 különbözõ aminosav számára biztosítják az üzenetet (valamint a transzkripciós iniciációhoz és terminációhoz), bizonyos aminosavakat több mint egy kodon kódolhat, amely jelenséget kodonredundanciaként ismerünk. Nem teljesen értett okokból az alternatív kodonok nem egységesen vannak jelen az különbözõ típusú sejtek endogén DNS-ében. Sõt, úgy tûnik, hogy variábilis természetes hierarchia vagy „preferencia” van bizonyos kodonok esetében bizonyos sejttípusokban. Például a leucin aminosavat hat DNSkodon határozza meg, a CTA, CTC, CTG, CTT, TTA és TTG. A mikroorganzimusok genom-kodon használatának kiterjedt elemzése feltárta, hogy az E. coli endogén DNS¹e leggyakrabban a CTG leucint meghatározó kodont tartalmazza, míg az élesztõ- és a nyálkagombák DNS¹e leggyakrabban a TTA leucint meghatározó kodont tartalmazza. Ezen hierarchia láttán általában úgy vélik, hogy egy leucinban gazdag polipeptid E. colibeli magas szintû expressziójának nagy valószínûségû elérése valamelyest függeni fog a kodonhasználat gyakoriságától. Például valószínû, hogy egy TTA kodonokban gazdag gén gyengén fog expresszálódni E. coliban, míg egy CTG-ben gazdag gén magas szinten fog expresszálódni E. coliban. Hasonlóképpen, egy leucinban gazdag polipeptid élesztõgazdasejtben történõ expresszálódáshoz elõnyös kodon a TTA lenne. A kodonpreferencia jelenség jelentõsége a rekombináns DNS-módszerekre kifejezett, és a jelenség megmagyarázhatja exogén gének magas szintû expressziója elérésének számos korábbi sikertelenségét sikeresen transzformált gazdaszervezetekben – egy kevésbé „preferált” kodon lehet ismételten jelen a beinszertált génben, és a gazdasejt expressziós gépezete nem mûködhet megfelelõ hatékonysággal. Ez a jelenség arra utal, hogy az elképzelt gazdasejtek preferált kodonjaival megtervezett szintetikus gének az idegen genetikai anyag optimális formáját biztosíthatják a rekombináns fehérjeexpresszió megvalósításához. Ily módon a találmány egyik aspektusa olyan HPV45 L1 gén, amely kodonoptimalizálva van élesztõsejtekben
1
HU 006 472 T2
történõ magas szintû expresszióhoz. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint azt találtuk, hogy az ugyanazon fehérjeszekvenciát kódoló alternatív kodonok alkalmazása megszüntetetheti a HPV45 L1 fehérjék élesztõsejtek általi expressziójának akadályait. A találmány szerinti HPV45 L1 génszegmenseket alakítottunk át azonos transzlált szekvenciájú szekvenciákká, de alternatív kodonhasználattal, amint Sharp és Cowe ismertetik [„Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae.”, Yeast 7: 657–678. old. (1991)]. A módszer általánosságban olyan kodonok azonosítását foglalja magában a vad típusú szekvenciában, amelyek rendszerint nem kapcsolatosak magas szinten expresszálódó élesztõgénekkel, és azok helyettesítését az élesztõben való magas szintû expresszióhoz optimális kodonokkal. Az új génszekvenciákat azután megvizsgáljuk az ezen kodonhelyettesítésekkel keletkezett nemkívánatos szekvenciák jelenlétére (például „ATTTA” szekvenciák, intron „splice” felismerési helyek véletlen kialakulása, nemkívánatos restrikciós enzim helyek, magas GC¹tartalom, élesztõ által felismert transzkripciós teminációs jelek jelenléte stb.). A nemkívánatos szekvenciákat elimináljuk a meglévõ kodonoknak ugyanazon aminosavat kódoló eltérõ kodonokkal történõ helyettesítésével. A szintetikus génszegmenst azután teszteljük a javított expresszióra. A fent ismertetett eljárásokat alkalmaztuk HPV45 L1 szintetikus génszegmensek létrehozására, ami az élesztõsejtes környezetben való magas szintû expresszióra optimalizált kodonokat tartalmazó gént eredményezett. Bár a fenti eljárás a módszerünk összefoglalását adja HPV-vakcinákban alkalmazható kodon-optimalizált gének tervezésére, a szakember számára nyilvánvaló, hogy hasonló vakcinahatékonyságot vagy gének megnövekedett expresszióját elérhetjük az eljárás kisebb variációival vagy a szekvencia kisebb variációival. Ennek megfelelõen a találmány adaptálható olyan szintetikus nukleotidszekvenciákat tartalmazó polinukleotid biztosítására, amelyek HPV45 L1 fehérje biológiailag aktív fragmensét vagy mutáns formáját kódolják, és a polinukleotidszekvencia élesztõgazdasejtben való expresszióra optimalizált kodonokat tartalmaz. A HPV45 L1 fehérje mutáns formái nem korlátozó példái közé tartoznak: konzervatív aminosavszubsztitúciók, aminosavterminális csonkolások, karboxiterminális csonkolások, deléciók vagy addíciók. Bármely ilyen biológiailag aktív fragmens és/vagy mutáns olyan fehérjét vagy fehérjefragmenst kódol, amely legalább lényegében imitálja a 2. azonosító számú szekvencia szerinti HPV45 L1 fehérje immunológiai tulajdonságait. A találmány szerinti szintetikus polinukleotidok olyan mRNS-molekulákat kódolnak, amelyek funkcionális HPV45 L1 fehérjét expresszálnak, oly módon, hogy az hasznos terápiás vagy profilaktikus HPV-vakcina fejlesztésében. A találmány egyik aspektusa kodon-optimalizált nukleinsavmolekula, amely a 2. azonosító számú szekvencia szerinti HPV45 L1 fehérjét kódolja, amely nuk-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
leinsavmolekula 1. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz. A találmány tárgyát képezik rekombináns vektorok és rekombináns gazdasejtek is, prokarióták és eukarióták egyaránt, amelyek a leírásban feltárt nukleinsavmolekulákat tartalmazzák. A leírásban ismertetett eljárásokkal létrehozott szintetikus HPV45 DNS¹t vagy fragmenseit rekombináns úton expresszáltatjuk molekuláris klónozással olyan expressziós vektorba, amely alkalmas promotert és más megfelelõ transzkripciós szabályozóelemeket tartalmaz, és átvihetjük prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekbe a rekombináns HPV45 L1 termeltetésére. Ilyen manipulációkra szolgáló módszereket részletesen ismertetnek Sambrook és mtsai. [„Molecular Cloning: A Laboratory Manual”; kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989); „Current Protocols in Molecular Biology”, szerk.: Ausubel és mtsai., kiad.: Green Pub. Associates and WileyInterscience, New York (1988); „Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual”, szerk.: Rose és mtsai., kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1990)]. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás HPV45 L1 fehérje expresszáltatására rekombináns gazdasejtben, amely tartalmazza a következõket: (a) 1. azonosító számú szekvencia szerinti nukleinsavat tartalmazó vektor bejuttatása élesztõgazdasejtbe; és (b) az élesztõgazdasejt tenyésztése olyan körülmények között, amely lehetõvé teszi a HPV45 L1 fehérje expresszióját. A találmány szerinti szintetikus géneket olyan expressziós kazettává állíthatjuk össze, amely a HPV45 L1 fehérje gazdasejtben való hatékony expressziójának biztosítására megtervezett szekvenciákat tartalmaz. A kazetta elõnyösen tartalmazza a szintetikus gént, a kapcsolódó transzkripciós és transzlációs szabályozószekvenciákkal, mint például promoterrel és terminációs szekvenciákkal mûködõképesen kapcsoltan. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a promoter a S. cerevisiae GAL1 promoter, bár a szakember számára nyilvánvaló, hogy számos más ismert élesztõpromoter bármelyikét, mint például a GAL10, GAL7, ADH1, TDH3 vagy PCK promotereket, vagy más eukarióta promotereket alkalmazhatunk. Elõnyös transzkripciós terminátor az S. cerevisiae ADH1 terminátor, bár más ismert transzkripciós terminátorok is alkalmazhatók. A GAL1 promoter–ADH1 terminátor kombináció különösen elõnyös. A találmány egy másik aspektusát eljárások képezik HPV45 VLP¹k elõállítására, és eljárások HPV45 VLP¹k alkalmazására. A VLP¹k maguktól összeállítódhatnak amikor az L1 – a humán vagy állati papillomavírusok fõ kapszid-fehérjéje – expresszálódik élesztõsejtekben, emlõssejtekben vagy baktériumokban [összefoglalásért lásd Schiller és Roden, „Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses”; szerk.: Lacey, kiad.: Leeds, UK: Leeds Medical Information, 101–112. old. (1996)]. Morfológiailag megkülönböztethetetlen HPV VLP-ket állíthatunk elõ az
1
HU 006 472 T2
L1 és L2 kapszidfehérjék kombinációjának expresszáltatásával is. A VLP¹k L1 72 pentamerjébõl állnak T=7 ikozahedrális szerkezetben [Baker és mtsai., Biophys. J. 60(6): 1445–1456. old. (1991)]. A VLP¹k morfológiailag hasonlítanak a valódi virionokhoz, és képesek semlegesítõ ellenanyagok magas titerének kiváltására, amikor állatnak vannak beadva. Nyulak [Breitburd és mtsai., J. Virol. 69(6): 3959–3963. old. (1995)] és kutyák [Suzich és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(25): 11 553–11 557. old. (1995)] immunizálása VLP-kkel megmutatta, hogy mindkettõ esetben semlegesítõ ellenanyagok indukálódnak, és védenek a kísérletes papillomavírus-fertõzéssel szemben. Azonban mivel a VLP¹k nem tartalmazzák a potenciálisan onkogén virális genomot és képesek maguktól összeállítódni, amikor egyetlen génrõl expresszálódnak, biztonságos alternatívát biztosítanak az élõ vírus alkalmazásával szemben a HPV-vakcina-fejlesztésben [összefoglalásért lásd Schiller és Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67–74. old. (2000)]. Marais és kollégái [J. Med. Virol. 60: 331–336. old. (2000)] ismertetnek HPV45 VLP-ket, amelyeket rovarsejtekben termeltettek bakulovírusról expresszált HPV45 L1 génrõl. A VLP¹k rovarsejtekben való expresszáltatása nem elõnyös vakcinafejlesztés számára a kapcsolódó magas költségek miatt. Ezenfelül gyakran nehéz rovarsejtekben a HPV L1 gének expressziójának léptéknövelése a kereskedelmi termékfejlesztéshez szükséges nagy térfogatok miatt. Nem tártak fel élesztõsejtekben termeltetett HPV45 VLP-ket. A HPV VLP¹k expressziója élesztõsejtekben azzal az elõnnyel jár, hogy költséghatékony és könnyen adaptálható fermentorokban történõ nagyléptékû tenyésztéshez. Ezenfelül az élesztõgenom könnyen megváltoztatható a megnövekedett tenyésztési és expressziós potenciálú rekombináns, transzformált élesztõ szelekciójának biztosítására. A találmány még másik aspektusa eljárás HPV45 VLP¹k elõállításra, amely tartalmazza a következõket: (a) élesztõ transzformálása HPV45 L1 fehérjét vagy HPV45 L1+L2 fehérjéket kódoló rekombináns DNS-molekulával; (b) a transzformált élesztõ tenyésztése olyan körülmények között, amely lehetõvé teszi a rekombináns DNS-molekula expresszióját a rekombináns HPV45 fehérje termeléséhez; és (c) a rekombináns HPV45 fehérje izolálása a HPV45 VLP¹k elõállításához, ahol az élesztõ olyan kodon-optimalizált HPV45 L1 génnel van transzformálva, amely 1. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás immunválasz indukálására állatban, amely szerint a HPV45 vírusszerû részecskéket beadjuk az állatnak. A találmány még másik alkalmazása eljárás HPVvel kapcsolatos méhnyakrák megelõzésére vagy kezelésére, amely szerint emlõsnek a HPV45 VLP-ket tartalmazó vakcinát adunk be. A találmány tárgya eljárás HPV45 vírusszerû részecskéket (VLP) tartalmazó vakcina elõállítására is, amelyek a fent ismertetett eljárással lettek elõállítva.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
A találmány ezen aspektusának egy alternatív megvalósítási módja szerint a vakcina továbbá tartalmazza legalább egy további HPV-típus VLP¹it is. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a legalább egy további HPV-típus az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 és HPV68. A találmány ezen aspektusának egy elõnyös megvalósítási módja szerint a vakcina továbbá HPV16 VLPket is tartalmaz. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a vakcina továbbá HPV16 VLP-ket és HPV18 VLPket is tartalmaz. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módja szerint a vakcina továbbá HPV6 VLP-ket és HPV11 VLP-ket és/vagy HPV31 VLP-ket is tartalmaz. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módja szerint a vakcina továbbá HPV6 VLP-ket és HPV11 VLP-ket, HPV16 VLP-ket és HPV18 VLP-ket is tartalmaz. A vakcinák önmagukban alkalmazhatók megfelelõ dózisokban, amelyeket rutinteszteléssel meg lehet határozni, annak érdekében, hogy elérjük a HPV45-fertõzés optimális gátlását, miközben minimalizálunk bármiféle potenciális toxicitást. Ezenfelül más szerek együttes vagy egymást követõ beadása is kívánatos lehet. A vírusszerû részecskék vakcinát kapó alanyba bejuttatandó mennyisége az expresszáltatott géntermék immunogenitásától függ. Általában körülbelül 10–100 mg, és elõnyösen körülbelül 20–60 mg immunológiailag vagy profilaktikusan hatásos dózisnyi VLP¹t adunk be közvetlenül az izomszövetbe. A találmány tárgykörébe tartozik szubkután injekció, intradermális bejuttatás, bõrön keresztül történõ hatás, és a beadás más módjai, mint például intraperitoneális, intravénás, vagy inhalációs bejuttatás. A találmány tárgykörébe tartozik, hogy megerõsítõ vakcinázást is alkalmazhatunk. A parenterális beadás, mint például intravénás, intramuszkuláris, szubkután vagy más beadási módok adjuvánssal, mint például alumínium vagy Merck alumínium adjuváns, együtt vagy egymás után a találmány szerinti vakcina parenterális beadásával szintén elõnyös. A következõ példák illusztrálják, de nem korlátozzák a találmányt.
1. példa Reprezentatív HPV45 L1 szekvencia meghatározása 50 A HPV45 L1 szekvenciát korábban már leírták [Genbank hozzáférési száma # NC_001590; lásd Delius és Hofmann, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 186: 13–31. old. (1994)]. Nem szokatlan azonban, hogy ki55 sebb szekvenciavariációkat találnak a klinikai izolátumokból nyert DNS¹ek között. A reprezentatív HPV45 L1 vad típusú szekvencia meghatározásához DNS¹t izoláltunk négy különbözõ klinikai mintából, amelyekrõl korábban kimutatták, hogy tartalmaznak 60 HPV45 DNS¹t. A HPV45 L1 szekvenciákat amplifikál6
1
HU 006 472 T2
tuk polimeráz-láncreakcióval (PCR) Taq DNS-polimeráz és a következõ láncindítók alkalmazásával: HPV45 L1 F 5’¹CCACCACCACCTATATAGGTATTC¹3’ (4. azonosító számú szekvencia) és HPV45 L1 B 5’¹CAAACATACATATATGTGCTAACA¹3’ (5. azonosító számú szekvencia). Az amplifikált termékeket agarózgélen elektroforetizáltuk és láthatóvá tettük etídiumbromid-festéssel. A ~1500 bp méretû L1 csíkokat kivágtuk és a DNS¹t megtisztítottuk a „QIA quick PCR purification kit” (Qiagen, Hilden, Germany) alkalmazásával. Azután a DNS¹t beligáltuk TA klónozóvektorba (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), E. Colit transzformáltunk a ligációs eleggyel, és szélesztettük ampicillinnel és IPTG és X¹gal-lal kiegészített LB¹agarra a kolóniák kék/fehér szelektáláshoz. A csészéket megfordítottuk és 16 órán keresztül inkubáltuk 37 °C¹on. Kolónia-PCR¹t hajtottunk végre nyolc fehér kolónián, amelyek a négy PCR-rel amplifikált klinikai izolátumból származtak. A HPV 45 L1 DNS¹t PCR-rel amplifikáltuk a HPV 45 L1 F és HPV 45 L1 B láncindítók alkalmazásával. A specifikus PCR-protokoll 25 alábbi ciklusból állott: 15 másodpercen keresztül 98 °C¹on (denaturáció), 30 másodpercen keresztül 50 °C¹on (anneálás) és 2 percen keresztül 68 °C¹on (lánchosszabbítás). A PCR-termékeket etídium-bromid-festéssel tettük láthatóvá agaróz-gélelektroforézist követõen. Az izolátumokból származó számos kolónia tartalmazott L1 csíkokat. Az egyes izolátumokból származó második kolóniát kitenyésztettük ampicillint tartalmazó LB¹tápközegen, rázatás mellett 37 °C¹on 16 órán keresztül. Miniprepeket készítettünk a plazmid-DNS kolóniákból történõ extraháláshoz. A négy klinikai izolátumból származó amplifikált és klónozott HPV45 L1 DNS¹t tartalmazó plazmidokon DNS-szekvenálást végeztünk. A DNS¹t és transzlált aminosavszekvenciákat összehasonlítottuk egymással és a Genbank HPV45 L1 szekvenciákkal. A négy klinikai izolátum szekvenciaelemzése megmutatta, hogy egyik sem volt azonos a Genbank szekvenciával. A #33 izolátumból származó HPV 45 L1 plazmidot választottuk ki reprezentatív vad típusú (wt) 45 L1 szekvenciának, amelyet a leírásban „45 L1 vad típusú szekvenciának” nevezünk (3. azonosító számú szekvencia, lásd az 1. ábrát). Ez a szekvencia tartalmazott egy 9¹nukleotid, 3¹aminosav méretû deléciót, amely megtartotta az azt követõ szekvencia olvasási fázisát, 5 pontmutációt, amelyek 5 aminosavváltozást eredményeztek, és nyolc további csendes pontmutációt. A Genbank szekvencia 495–497 aminosavai deletálva vannak a 45 L1 vad típusban. A 23 (S®N), 55 (N®S), 303 (I®T), 357 (S®N) és 356 (Q®H) Genbank aminosavszámok öt aminosavváltozást reprezentálnak (Genbank aminosav ® 45 L1 wt aminosav). A 8 csendes mutáció eloszlott az egész szekvenciában. Lásd az 1. ábrát. A 45 L1 vad típusú szekvenciát amplifikáltuk a LS–112 5’¹CTCAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTGAC¹3’ (6. azonosító számú szekvencia) és HPV 45 L1 EAS 5’¹GACAGATCTTATTTTTTACTACGTATACGTACACG¹3’ 7. azonosító számú szekvencia) láncindítókkal, hogy BglII hosszab-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
bításokat adjunk hozzá. A PCR¹t Vent-polimeráz alkalmazásával hajtottuk végre. A PCR-terméket etídiumbromid-festéssel tettük láthatóvá agarózgélen. A ~1500 bp méretû csíkot kivágtuk és a DNS¹t megtisztítottuk a „QIAEX II gel extraction kit” (Qiagen) alkalmazásával. A PCR-terméket azután megemésztettük Bg/II enzimmel 37 °C¹on 2 órán keresztül, és megtisztítottuk a „QIA quick PCR purification kit” alkalmazásával. A BglII-emésztett HPV 45 L1 PCR-terméket beligáltuk BamHI-emésztett pGAL110 vektorba [leírva: Hofmann és mtsai., Virology 209: 506–518. old. (1995)], és E. coli DH5-sejteket transzformáltuk a ligációs eleggyel. A kolóniákat PCR-rel szkríneltük a HPV45 L1 inszert helyes irányítottságára. A szekvenciát és az irányítottságot DNS-szekvenálással igazoltuk. A kiválasztott klónt pGAL110-HPV 45 L1 #6¹nak neveztük el. Ezt a klónt megemésztettük PstI, EcoRI és HindIII enzimekkel, hogy meghatározzuk a HPV45 L1 gén restrikciós profilját a pGAL110 vektorban. A DNS-fragmenseket agarózgéleken elektroforetizáltuk. A kapott restrikciós fragmens profilt etídium-bromid-festéssel tettük láthatóvá és UV fényben néztük meg. Maxiprep DNS¹t preparáltunk. Saccharomyces cerevisiae-sejteket tettünk kompetenssé „Glusulase”¹al végzett szferoplasztizálással, és transzformáltunk a pGAL110-HPV 45 L1 #6¹al. Az élesztõ transzformációs elegyet Leu(–) szorbitol top-agarban szélesztettük Leu(–) szorbitolcsészékre, és felfordítva inkubáltuk 5–7 napon keresztül 30 °C¹on. Kolóniákat szedtünk fel és kentünk szét klonális izoláláshoz Leu(–) szorbitolcsészékre. Az izolált kolóniákat azt követõen felnövesztettük 5 ml 5X Leu(–) Ade(–) szorbitol, 1,6% glükóz és 4% galaktóztartalmú tápközegben forgatott csöves tenyészetekben 30 °C¹on, hogy indukáljuk az L1 transzkripcióját és a fehérjeexpressziót. 2. példa Élesztõkodon-optimalizáció Az élesztõben preferált kodonokat már leírták (Sharp, Paul M és Cowe, Elizabeth, 1991, „Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae”, YEAST 7: 657–678. old.). A HPV45 L1 wt fehérje expressziója detektálható volt, azonban a kereskedelmi célú fejlesztéshez szükséges megemelkedett expresszió érdekében a HPV45 L1 gént újra felépítettük élesztõben preferált kodonok alkalmazásával. Az újrafelépített szekvencia biztosíthatja a megnövekedett HPV45 L1 expressziót, amely szignifikáns elõrelépés lenne a vad típushoz képest a vakcinafejlesztésben történõ alkalmazásnál. Amikor a szekvenciát újrafelépítettük az élesztõ-optimalizált kodonszekvenciákkal, a 45 L1 nukleotid szekvenciáját 392 helyen változtattuk meg a 45 L1 R (R=”rebuilt”) létrehozásával. Az aminosavszekvenciát azonban nem változtattuk meg. A HPV45 L1 nukleotid- (1. azonosító számú szekvencia) és aminosav- (2. azonosító számú szekvencia) szekvenciáját a 2. ábrán mutatjuk be. A gén újrafelépítéséhez alkalmazott stratégia az volt, hogy hosszú átfedõ szensz és antiszensz oligomereket terveztünk, amelyek lefedik a gént, szubszti-
1
HU 006 472 T2
tuálva a nukleotidokat az élesztõben preferált kodonszekvenciákkal, miközben megtartottuk az eredeti aminosavszekvenciát. Ezeket az oligomereket alkalmaztuk templát-DNS helyett PCR-reakcióban. További amplifikációs láncindítókat terveztünk és alkalmaztunk az újrafelépített szekvenciák templátoligomerekrõl történõ amplifikálására. Pfu DNs-polimerázt alkalmaztunk a PCR-ben 25 cikluson keresztül. Az amplifikáció optimális körülményei szekcióspecifikusak voltak, azonban a legtöbb alkalmazott program hasonlított: 94 °C 5 percen keresztül (denaturáció), majd 25 ciklus: 95 °C 30 másodpercen keresztül (denaturáció), 55–50 °C 30 másodpercen keresztül (anneálás), és 72 °C 1,5 percen keresztül (lánchosszabbítás), majd 7 perc végsõ lánchosszabbítás 72 °C¹on, és tartva 4 °C¹on. A PCR-trermékeket agaróz-gélelektroforézissel vizsgáltuk meg. A megfelelõ méretû csíkokat kivágtuk és a DNS¹t a gélbõl megtisztítottuk. Az amplifikált fragmenseket azután templátként alkalmaztuk az 1533 nukleotid hosszúságú újrafelépített HPV45 L1 gén összeállításához. Az újratelepítést követõen az 1533 nukleotid méretû csíkot megtisztítottuk a gélbõl, beligáltuk pCR4 Blunt vektorba (Invitrogen), és a ligációs eleggyel E. coli TOP10-sejteket transzformáltunk. Kolóniákat tenyésztettünk 4 ml ampicillint tartalmazó LB¹tápközegben, és plazmid-DNS¹t extraháltunk szokásos miniprep módszerekkel. A plazmid-DNS¹t megszekvenáltuk, hogy igazoljuk az újrafelépített 45 L1 kívánt változásainak jelenlétét. A 45 L1 R¹t („rebuild”) újraamplifikátuk a pCR4Blunt¹45 L1 R vektorból, hogy mindkét végéhez BamHI hosszabbításokat és egy élesztõ 5’ nem transzlálódó vezetõszekvenciát adjunk hozzá az ATG iniciációs kodon elé a leolvasással ellenkezõ irányban. Az amplifikált fragmenst megklónoztuk, mint fent, és a plazmid-DNS¹t megszekvenáltuk. A plazmidot – pCR4 Blunt¹45 L1 R (Bam) – megemésztettük BamHI enzimmel és a DNS-fragmenseket elektroforetizáltuk agarózgélen. A ~1550 bp méretû 45 L1 R (Bam) fragmenst gélen megtisztítottuk, beligáltuk BamHI-emésztett pGAL110 vektorba és transzformáltuk TOP10F’ E. coliba (Invitrogen). A kolóniákat PCR-rel szkríneltük a HPV45 L1 inszert helyes irányítottságára a pGAL110-ban. A szekvenciát és az irányítottságot DNS-szekvenálással igazoltuk. Maxiprep plazmid-DNS¹t preparáltunk és azt alkalmaztuk S. cerevisiae-sejtek transzformálására, amelyeket kompetenssé tettünk szferoplasztizálással. A transzformált élesztõket Leu(–) szorbitol top-agarban szélesztettük Leu(–) szorbitolcsészékre, amelyeket felfordítva inkubáltunk 7 napon keresztül. A kolóniákat szétkentük klonális izoláláshoz Leu(–) szorbitolcsészékre. Az izolált kolóniákat azt követõen felnövesztettük 5 ml 5X Leu(–) Ade(–) szorbitol, 1,6% glükóz és 4% galaktóz tartalmú tápközegben forgatott csöves tenyészetekben 30 C¹on, hogy indukáljuk az L1 transzkripcióját és a fehérjeexpressziót. 48 óra elteltével OD600=10 értéknek megfelelõ térfogatú tenyészetet lecentrifugáltunk, a felülúszót eltávolítottuk és a csapadékot lefagyasztottuk –70 °C¹on.
2
3. példa RNS-preparálás A HPV 45 L1 expresszálására galaktózindukálással indukált transzformált élesztõsejt csapadékát felolvasz5 tottuk jégen, felszuszpendáltuk 0,8 ml Trizol-reagensben (Life Technologies, Gibco BRL), és szobahõmérsékleten inkubáltuk 5 percen keresztül. Egyötöd térfogatnyi kloroformot adtunk a csõbe. Azután erõteljesen felráztuk 15 másodpercen keresztül, hogy összekever10 jük, és szobahõmérsékleten inkubáltuk 3 percen keresztül. 5 perc 13 k rpm centrifugálás után a felsõ fázist összegyûjtöttük, és átvittük egy új csõbe. 0,4 ml izopropanolt adtunk hozzá és szobahõmérsékleten inkubáltuk 10 percen keresztül. Lecentrifugáltuk az RNS ki15 csapására 13 k rpm¹en 10 percen keresztül. A felülúszót dekantáltuk, az RNS-cspadékot megmostuk 75% EtOH-lal, és a centrifugálást megismételtük. A felülúszót dekantáltuk és az RNS-csapadékot hagytuk levegõn megszáradni 15 percen keresztül, majd fel20 szuszpendáltuk RNáz-mentes vízben. Spektrofotometriásan meghatároztuk az RNS koncentrációját a mintában azt feltételezve, hogy az 1¹es A260-érték=40 mg/ml RNS, amikor az A260/280 arány 1,7–2,0. 25
30
35
40
45
50
55
60 8
4. példa Northern-blot-elemzés 1,1%¹os formaldehides agarózgélt öntöttünk. 5 és 10 mg RNS¹t kombináltunk denaturálópufferrel (végkoncentrációk: 6% formaldehid, 50% formamid és 0,1×MOPS) és felhevítettük 65 °C¹ra 10 percen keresztül. Egytizednyi gélfelviteli puffert adtunk hozzá, és a mintát felvittük a gélre. Az elektroforézist 75 V¹on hajtottuk végre 1×MOPS-pufferben ~3 órán keresztül. A gélt megmostuk 60 percen keresztül 10×SSC-pufferben. Az RNS¹t kapilláris hatás révén átvittük Hybond¹N+ nejlonmembránra (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 16 órán keresztül 10×SSC-ben. Azután az RNS¹t rögzítettük a nejlonmembránra Stratagene UV Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA) készülék autokeresztkötési funkciójának alkalmazásával történõ keresztkötéssel. A rögzítés után a nejlonmembránt hagytuk levegõn megszáradni. A „Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection KIT I” (F. Hoffmann¹La Roche Ltd., Basel, Switzerland) reagenskészletet alkalmaztuk 45 L1 R DNSszekvencia DIG-gel történõ jelölésére, amely próbaként alkalmazható 45 L1 R RNS detektálására a Northern-bloton. A prehibridizációt, hibridizációt és az antiDIG alkalikus foszfatázzal konjugált ellenanyaggal végzett immunfestést a gyártó javaslatait követve hajtottuk végre. Röviden, a blotot prehibridizáltuk 37 °C¹on 30 percen keresztül gyengéd rázatás mellett. A próbát denaturáltuk 5 percen 95 °C¹ra keresztül történõ hevítéssel, és jégen csillapítottuk. A próbát hozzáadtuk a hibridizációs oldathoz és felvittük a membránra 4 órán keresztül 44,6 °C¹on gyengéd rázatás mellett. Azután eltávolítottuk a hibridizációs oldatot, és a blotot kétszer megmostuk 5 percen keresztül 0,1% SDS¹t tartalmazó 2×SSC-ben szobahõmérsékleten, majd tovább mostuk
1
HU 006 472 T2
65 °C¹on 0,5×SSC-vel és 0,1% SDS-sel. Azután a blotot blokkoltuk 30 percen keresztül, és anti-DIG alkalikus foszfatázzal konjugált ellenanyagot vittünk fel rá 1:5000 hígításban 30 percen keresztül. Azután a blotot megmostuk és meghatároztuk a próbához kötõdött RNS jelenlétét az alkalikus foszfatázzal konjugált antiDIG kötött ellenanyag NBT/BCIP szubsztrátos detektálásával. A 45 L1 vad típust expresszáló élesztõ kezdeti elemzése arra utalt, hogy volt jele mûködõképes HPV 45 L1 transzkripciójának és transzlációjának, azonban a szekvenciát újra felépítettük élesztõreferált kodonszekvenciákkal, hogy megnövekedett expressziós szintet érjünk el, amely hasznos vakcinafejlesztésre. Az újrafelépített 45 L1 szekvenciát úgy hoztuk létre, hogy elkerüljük a lehetséges korai transzkripciós terminációs helyeket a robusztus transzkripció biztosítására. A 45 L1 R transzkriptum Northern-blot-elemzése azt tárta fel, hogy teljes hosszúságú transzkriptumok jöttek létre (3. ábra). 5. példa HPV 45 L1 fehérjeexpresszió A galaktózzal indukált OD600=10 ekvivalens tenyészetek fagyasztott élesztõsejt-csapadékát felolvasztottuk jégen, és felszuszpendáltuk 300 ml PC¹pufferben (100 mM Na2HPO4 és 0,5 M NaCl, pH=7,0) 2 mM PMSF-fel. Savval megmosott üveggyöngyöket adtunk hozzá, ~0,5 g/csõ. A csöveket 3 5 perces ciklusban felvortexeltük 4 °C¹on 1 perces szünetekkel. 7,5 ml 20% Triton X–100¹at adtunk hozzá és a vortexelést megismételtük 5 percig 4 °C¹on. A csöveket jégre helyeztük 15 percre, és azután lecentrifugáltuk 10 percen keresztül 4 °C¹on. A felülúszót átvittük steril mikrocentrifugacsövekbe, felcímkéztük teljes élesztõfehérje-extraktumként, dátumoztuk és –70 °C¹on tároltuk. 6. példa Western-blot-elemzés Az egyes 45 L1 konstrukciókból származó 20 élesztõizolátumból való teljes fehérjeextraktumot Western-blottal elemeztük a 45 L1 fehérje galaktózindukálás utáni expressziójának igazolására. 10 mg teljes élesztõextraktumot kombináltunk SDSPAGE felvivõpufferrel, és felmelegítettük 95 °C¹ra 10 percen keresztül. A fehérjéket felvittük 10% SDSPAGE gélre, és elektroforetizáltuk Tris-Glicin-pufferben. A fehérjék elválasztása után a fehérjéket Western-módon átvittük a gélbõl nitro-cellulózra, és a blotot blokkoltuk 1x hígítópufferben (Kirkegaard and Perry Laboratories) 1 órán keresztül szobahõmérsékleten rázatás mellett. A blotot háromszor megmostuk és azután inkubáltuk kecske anti-trpE-HPV 45 L1 szérum 1:2500 hígításával szobahõmérsékleten 16 órán keresztül. Azután a blotot háromszor megmostuk, és inkubáltuk antikecskeHRP konjugált ellenanyag 1:2500 hígításával 1 órán keresztül. A blotot ismét háromszor megmostuk, és a NBT/BCIP detekciós szubsztrátot vittünk fel rá (Kirkegaard and Perry Laboratories). Az immunreaktív fehérjéket lila csíkokként detektáltuk a blot¹on.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
Az eredmények azt demonstrálták, hogy mindhárom esetben a 45 L1 fehérje különálló immunreaktív csíkként volt detektálható a nitro-cellulózon megközelítõleg 57 kDa méretben (4. ábra). A 16 L1 fehérjét – amely megközelítõleg 55 kDa méretû – alkalmaztuk pozitív kontrollként, a HPV L1¹mentes teljes élesztõextraktummal együtt, amely a negatív kontroll volt (adatokat nem közlünk). 7. példa ELISA vizsgálati eljárás A HPV 45 L1¹et expresszáló élesztõsejteket különféle eljárásokkal tenyésztettük, beleértve a rotációs csöves tenyészeteket, rázóedényeket és fermentorokat. Az élesztõt lizáltuk és fehérjeextraktumokat állítottunk elõ a termelt teljes fehérje mikrogrammjaiban lévõ HPV45 L1 vírusszerû részecskék (VLP¹k) mennyiségének meghatározására. Szendvics ELISA vizsgálati eljárást terveztünk a HPV45 L1 VLP expresszió demonstrálására. A H18R.5 monoklonális ellenanyagot – amely egyaránt felismeri a HPV 18¹as típust és a 45 L1 VLP-ket – alkalmaztuk az élesztõfehérje-extraktumokban található 45 L1 VLP¹k megkötésére. A meg nem kötõdött fehérjéket elmostuk, és H45.10B11.A5¹t – amely egy HPV 45 L1 VLP típusra és konformációra specifikus mAb – alkalmaztunk detekciós ellenanyagként. A valódi, konformációsan helyes 45 L1 VLP¹k megkötõdtek, és a detektálást antiegér IgG1 HRP-vel konjugált ellenanyag és TMB szubsztrát alkalmazásával hajtottuk végre. Közelebbrõl, a H18R.5¹öt alkalmaztuk Immulon 4 HBX 96 mérõhelyes lemezek fenekének bevonására éjszakán keresztül 4 °C¹on. A lemezeket háromszor megmostuk PBS és 0,05% Tween 20¹pufferrel, majd blokkoltuk blokkolóoldattal (PBS+0,05% Tween 20+1% BSA). A lemezeket háromszor megmostuk és antigént (teljes élesztõsejt-lizátumokat blokkoló oldatban 100 mg/ml¹re meghígítva) adtunk az A¹sorhoz két párhuzamosban. Tisztított HPV 45 L1 VLP referenciastandardokat vittünk fel az A sor 1. és 2. oszlopába, 3300 ng/ml 100 mg/ml teljes élesztõfehérjében feloldva. A referencia- és tesztmintákat azután kétszeresen sorozathígítottuk lefelé az egyes oszlopokban. Három óra elteltével szobahõmérsékleten a felesleges antigént eltávolítottuk leszívással, és a lemezeket háromszor megmostuk. A HPV 45 L1 VLP konformációspecifikus H45.10B11.A5 mAb¹ot tartalmazó sejtfelülúszókat hígítottunk meg 1:80 arányban blokkolóoldatban, és hozzáadtuk az egyes mérõhelyekhez 1 órára szobahõmérsékleten. A lemezeket háromszor megmostuk, és blokkolóoldatban 1:8000 arányban meghígított antiegér IgGl HRP-konjugált ellenanyagot adtunk hozzájuk 1 órára szobahõmérsékleten. A lemezeket megmostuk és TMB¹t (Pierce) adtunk 5 percen keresztül a HRPkonjugált ellenanyagkomplexek detektálásra. A detektálási reakciót 2M H2SO4 hozzáadásával állítottuk le. A lemezeket leolvastuk 450 nm hullámhosszon, és a HPV 45 L1 VLP koncentrációját meghatároztuk a referenciastandarddal való összehasonlítással ng VLP/mg teljes fehérjeként.
1
HU 006 472 T2
A 45 L1 wt és a 45 L1 R két különálló klónjának az összehasonlítását – mindegyiket két párhuzamosban mérve – az 5. ábrán mutatjuk be. Az újrafelépített HPV 45 L1 VLP expressziója megközelítõleg 2¹szer magasabb volt, mint a 45 L1 wt esetében megfigyelt eredmények (6. ábra). 8. példa Transzmissziós elektronmikroszkópia Annak demonstrálására, hogy a 45 L1 fehérje valójában magától összeállítódott pentamer¹L1 kapszomereket alakítva ki, amelyek pedig maguktól összeállítódnak vírusszerû részecskékké, részlegesen megtisztított 45 L1 R fehérjeextraktumot elemeztünk transzmissziós EM¹mel.
2
Élesztõsejteket tenyésztettünk kisléptékû fermentációs körülmények között, kicsaptuk azokat és a csapadékokat tisztítási kezelésnek vetettük alá. A csapadékot és a feltisztított élesztõextrakrtumokat immunblottal 5 elemeztük, hogy demonstráljuk az L1 fehérje expresszióját és a megmaradását a tisztítási eljárás folyamán. A feltisztított élesztõextraktumokat azután lecentrifugáltuk 45% szukrózpárnán, és a kapott csapadékot pufferben felszuszpendáltuk transzmissziós elektron10 mikroszkópiával (EM) végzett vizsgálathoz. A termelt 45 L1 R VLP¹k egy reprezentatív mintáját a 6. ábrán mutatjuk be. A gömb alakú részecskék átmérõje ebben a nyers mintában 40 és 60 nm között változott, és némely részecske kapszomerek rendezett 15 hálózatát mutatta.
A szekvencialistában található kötetlen szövegek (<223> kód) magyar fordítása 1. azonosító számú szekvenciához: <223> HPV45 L1R 4–7. azonosító számú szekvenciákhoz: <223> PCR-láncindító 8. azonosító számú szekvenciához: <223> HPV45 L1R – antiszensz SZEKVENCIALISTA <110> Merck & Co., Inc. Bryan, Janine T. Brownlow, Michelle K. Schultz, Loren D. Jansen, Kathrin U. <120> OPTIMIZED EXPRESSION OF HPV 45 L1 IN YEAST <130> 21500-PCT <150> 60/506,812 <151> 2003–09–29 <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1533 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV45 L1R <400> 1
atggctttgt gtcgtcaaca agattgttga caagctgttc ccaaacaagt
ggagaccatc ctgacgacta ctgtcggtaa caaaggtctc tcggtttgcc
tgactctact cgtctccaga cccatacttc tgcttaccaa agactctact
gtctacttgc acctccatct agagtcgtcc tacagagtct atctacaacc 10
caccaccatc tctaccacgc catccggtgc tcagagtcgc cagaaactca
tgtcgctaga tggttcttcc tggtaacaag tttgccagac aagattggtc
60 120 180 240 300
HU 006 472 T2
tgggcatgcg cacccattct actcaagacg ggttgtgtcc ttgcaaccag atggttgaca gttccattgg gacccatacg ttctggaaca acctctgcta tctatcacta ggtcacaaca agatctacta ccaaccaagt caattgtgta tctatcttgg acttacagat aagcaagacc tccgacttgg agaccaacta gctaagcgtg
tcggtatgga acaacaagtt tcagagacaa cagctatcgg gtgactgtcc ctggttacgg acatctgtca gtgactctat gagctggtgt acatgagaga cttccgactc acggtatctg acttgacctt tcaagcacta ctatcacctt aaaactggaa tcgtccaatc catacgacaa accaataccc tcggtccacg tcagaatcag
aatcggtaga ggacgacacc cgtctctgtc tgaacactgg accattggaa tgctatggac atctatctgt gttcttctgt catgggtgac aactccaggt tcaattgttc ttggcacaac gtgtgcttct ctccagacac gaccgctgaa cttcggtgtt tgtcgctgtc gttgaagttc attgggtaga taagagacca atccaagaag
ggtcaaccat gaatccgctc gactacaagc gctaagggta ttgaagaaca ttctccaccc aagtacccag ttgagaagag actgttccaa tcctgtgtct aacaagccat caattgttcg actcaaaacc gtcgaggaat gtcatgtcct ccaccaccac acttgtcaaa tggactgttg aagttcttgg gctgcttcca taa
tgggtatcgg acgctgctac aaacccaatt ccttgtgtaa ctatcatcga tgcaggacac actacttgca aacaattgtt ccgacttgta actctccatc actggttgca tcaccgtcgt cagttccaaa acgacttgca acattcactc caaccacctc aggacaccac acttgaagga ttcaagctgg cttccactgc
tttgtctggt tgctgtcatc gtgtatcttg gccagctcaa agacggtgac taagtgtgaa aatgtccgct cgctagacac catcaagggt tccatctggt caaggctcaa tgacactacc cacttacgac attcatcttc tatgaactcc cttggttgac tccaccagaa aaagttctct tttgagacgt ttctagacca
<210> 2 <211> 510 <212> PRT <213> Human Papillomavirus Type 45 <400> 2
Met Ala Leu Trp Arg Pro Ser Asp Ser Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro 1 5 10 15 Ser Val Ala Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Ser Arg Thr Ser 20 25 30 Ile Phe Tyr His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro 35 40 45 Tyr Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Ala Gly Asn Lys Gln Ala Val Pro 50 55 60 Lys Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Ala Leu Pro Asp 65 70 75 80 Pro Asn Lys Phe Gly Leu Pro Asp Ser Thr Ile Tyr Asn Pro Glu Thr 85 90 95 Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Mat Glu Ile Gly Arg Gly Gln 100 105 110 Pro Leu Gly Ile Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp 115 120 125 Asp Thr Glu Ser Ala His Ala Ala Thr Ala Val Ile Thr Gln Asp Val 130 135 140 Arg Asp Asn Val Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu 145 150 155 160
11
360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1533
HU 006 472 T2
Gly Cys Val Pro Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Leu Cys 165 170 175 Lys Pro Ala Gln Leu Gln Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys 180 185 190 Asn Thr Ile Ile Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala 195 200 205 Met Asp Phe Ser Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp 210 215 220 Ile Cys Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala 225 230 235 240 Asp Pro Tyr Gly Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu 245 250 255 Phe Ala Arg His Phe Trp Asn Arg Ala Gly Val Met Gly Asp Thr Val 260 265 270 Pro Thr Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Thr Ser Ala Asn Met Arg Glu Thr 275 280 285 Pro Gly Ser Cys Val Tyr Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Thr Thr 290 295 300 Ser Asp Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln 305 310 315 320 Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val 325 330 335 Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Leu Cys Ala Ser Thr Gln 340 345 350 Asn Pro Val Pro Asn Thr Tyr Asp Pro Thr Lys Phe Lys His Tyr Ser 355 360 365 Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr 370 375 380 Ile Thr Leu Thr Ala Glu Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser 385 390 395 400 Ser Ile Leu Glu Asn Trp Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr 405 410 415 Ser Leu Val Asp Thr Tyr Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Val Thr Cys 420 425 430 Gln Lys Asp Thr Thr Pro Pro Glu Lys Gln Asp Pro Tyr Asp Lys Leu 435 440 445 Lys Phe Trp Thr Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser Asp Leu Asp 450 455 460 Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg 465 470 475 480
12
HU 006 472 T2
Arg Pro Thr Ile Gly Pro Arg Lys Arg Pro Ala Ala Ser Thr Ser Thr 485 490 495 Ala Ser Arg Pro Ala Lys Arg Val Arg Ile Arg Ser Lys Lys 500 505 510 <210> 3 <211> 1533 <212> DNA <213> Human Papillomavirus Type 45
atggctttgt gttgtcaaca cgattattaa caggctgttc cctaataaat tgggcatgtg catccatttt acgcaggatg ggttgtgtac ttgcaacctg atggtggata gttccattag gatccctatg ttttggaata actagcgcta tctattacta ggccataaca cgcagtacta cctactaagt cagttgtgca agtatattgg acatatcgtt aagcaggatc tccgatttgg aggcctacca gccaaacgtg
ggcggcctag ctgatgatta ctgtaggcaa ctaaggtatc ttggattacc taggtatgga ataataaatt ttagggataa ctgctattgg gtgactgtcc caggttatgg acatttgtca gggattctat gggcaggtgt atatgcgtga cttctgattc atggtatttg atttaacatt ttaagcacta ctattacttt aaaattggaa ttgtgcaatc catatgataa atcaatatcc taggacctcg tacgtatacg
tgacagtacg tgtgtctcgc tccatatttt cgcatatcag tgattctact aattggtcgt ggatgataca tgtgtcagtt tgagcactgg tcctttggaa ggcaatggat atccatctgt gtttttttgc tatgggtgac aacccctggc tcaattattt ttggcataat atgtgcctct tagtagacat aactgcagag ttttggtgta agttgctgtt attaaagttt ccttggtcga taagcgtcct tagtaaaaaa
gtatatcttc acaagcatat agggttgtac tatagggtgt atatataatc gggcagcctt gaaagtgctc gattataagc gccaagggca cttaaaaaca tttagtacat aaatatccag ctacgccgtg acagtaccta agttgtgtgt aataagccat cagttgtttg acacaaaatc gtggaggaat gttatgtcat cctccaccac acctgtcaaa tggactgttg aagtttttag gctgcttcca taa
caccaccttc tttaccatgc ctagtggtgc ttagagtagc ctgaaacaca taggtattgg atgcagctac aaacacagct cactttgtaa ccattattga tgcaggatac attatttgca aacaactgtt cagacctata attccccttc attggttaca ttactgtagt ctgtgccaaa atgatttaca atatccatag ctactacaag aggatactac acctaaagga ttcaggctgg cgtctactgc
tgtggccaga aggcagttcc aggtaataaa tttgcccgat acgtttggtt cctaagtggc agctgtcatt gtgtatttta acctgcacaa ggatggtgat aaagtgcgag aatgtctgct tgcaagacat tattaaaggc tcccagtggc taaggcccag ggacactacc tacatatgat gtttattttt tatgaatagt tttagtggat acctccagaa aaaattttcc gttacgtcgt atctaggcct
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1533
<400> 3 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 4
ccaccaccac ctatataggt attc
24
<210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer
13
HU 006 472 T2
<400> 5
caaacataca tatatgtgct aaca
24
<210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 6
ctcagatctc acaaaacaaa atggctttgt ggcggcctag tgac
44
<210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 7
gacagatctt attttttact acgtatacgt acacg
35
<210> 8 <211> 1533 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV45 L1R – Antisense <400> 8
taccgaaaca cagcagttgt tctaacaact gttcgacaag ggtttgttca acccgtacgc gtgggtaaga tgagttctgc ccaacacagg aacgttggtc taccaactgt caaggtaacc ctgggtatgc aagaccttgt tggagacgat agatagtgat ccagtgttgt tctagatgat ggttggttca gttaacacat agatagaacc tgaatgtcta
cctctggtag gactgctgat gacagccatt gtttccagag agccaaacgg agccatacct tgttgttcaa agtctctgtt gtcgatagcc cactgacagg gaccaatgcc tgtagacagt cactgagata ctcgaccaca tgtactctct gaaggctgag tgccatagac tgaactggaa agttcgtgat gatagtggaa ttttgacctt agcaggttag
actgagatga gcagaggtct gggtatgaag acgaatggtt tctgagatga ttagccatct cctgctgtgg gcagagacag acttgtgacc tggtaacctt acgatacctg tagatagaca caagaagaca gtacccactg ttgaggtcca agttaacaag aaccgtgttg cacacgaaga gaggtctgtg ctggcgactt gaagccacaa acagcgacag
cagatgaacg tggaggtaga tctcagcagg atgtctcaga tagatgttgg ccagttggta cttaggcgag ctgatgttcg cgattcccat aacttcttgt aagaggtggg ttcatgggtc aactcttctc tgacaaggtt aggacacaga ttgttcggta gttaacaagc tgagttttgg cagctcctta cagtacagga ggtggtggtg tgaacagttt 14
gtggtggtag agatggtgcg gtaggccacg agtctcagcg gtctttgagt acccatagcc tgcgacgatg tttgggttaa ggaacacatt gatagtagct acgtcctgtg tgatgaacgt ttgttaacaa gactgaacat tgagaggtag tgaccaacgt agtggcagca gtcaaggttt tgctgaacgt tgtaagtgag gttggtggag tcctgtggtg
acagcgatct accaagaagg accattgttc aaacggtctg ttctaaccag aaacagacca acgacagtag cacatagaac cggtcgagtt tctgccactg attcacactt ttacaggcga gcgatctgtg gtagttccca aggtagacca gttccgagtt actgtgatgg gtgaatgctg taagtagaag atacttgagg gaaccaactg aggtggtctt
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320
1
ttcgttctgg aggctgaacc tctggttgat cgattcgcac
gtatgctgtt tggttatggg agccaggtgc agtcttagtc
HU 006 472 T2
caacttcaag taacccatct attctctggt taggttcttc
2
acctgacaac tgaacttcct tttcaagaga ttcaagaacc aagttcgacc aaactctgca cgacgaaggt gaaggtgacg aagatctggt att
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Nukleinsavmolekula, amely 2. azonosító számú szekvencia szerinti HPV45 L1 fehérjét kódoló olyan nukleotidok szekvenciáját tartalmazza, amely nukleotidszekvencia az 1. azonosító számú szekvencia szerinti. 2. Vektor, amely 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekulát tartalmaz. 3. Gazdasejt, amely 2. igénypont szerinti vektort tartalmaz. 4. A 3. igénypont szerinti gazdasejt, ahol a gazdasejt a következõk alkotta csoportból van kiválasztva: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis és Schizosaccharomyces pombe. 5. Eljárás HPV45 L1 vírusszerû részecskék (VLP¹k) elõállításra, amely tartalmazza a következõket: (a) élesztõ transzformálása 1. igénypont szerinti DNSmolekulával; (b) a transzformált élesztõ tenyésztése olyan körülmények között, amely lehetõvé teszi a DNS-molekula expresszióját a rekombináns papillomavírus fehérje termeléséhez; és (c) a rekombináns papillomavírus fehérje izolálása a HPV45 L1 VLP¹k létrehozásához.
10
15
20
25
30
15
1380 1440 1500 1533
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, ahol az élesztõ a Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis és Schizosaccharomyces pombe alkotta csoportból van kiválasztva. 7. Eljárás HPV-fertõzések kezelésére vagy megelõzésére szolgáló vakcina elõállításra, amely magában foglalja HPV45 L1 VLP¹k 5. igénypont szerinti elõállítását. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina legalább egy további HPV-típus VLP¹it is tartalmazza. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, ahol a legalább egy további HPV-típus a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 és HPV68. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, ahol a legalább egy HPV-típus HPV16¹ot tartalmaz. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina tartalmaz HPV18 VLP-ket is. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina tartalmaz HPV6 VLP-ket és HPV11 VLP-ket is. 13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina tartalmaz HPV31 VLP-ket is.
HU 006 472 T2 Int. Cl.: A61K 39/12
16
HU 006 472 T2 Int. Cl.: A61K 39/12
17
HU 006 472 T2 Int. Cl.: A61K 39/12
18
HU 006 472 T2 Int. Cl.: A61K 39/12
19
HU 006 472 T2 Int. Cl.: A61K 39/12
20
HU 006 472 T2 Int. Cl.: A61K 39/12
21
HU 006 472 T2 Int. Cl.: A61K 39/12
22
HU 006 472 T2 Int. Cl.: A61K 39/12
23
HU 006 472 T2 Int. Cl.: A61K 39/12
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
