!HU000007206T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 206
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A23L 1/29
(21) Magyar ügyszám: E 07 108969 (22) A bejelentés napja: 2004. 06. 22. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20070108969 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1815755 A1 2007. 08. 08. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1815755 B1 2009. 04. 22.
(51) Int. Cl.:
(72) Feltalálók: Van Tol, Eric Alexander Franciscus, 6824 MZ, Arnhem (NL); Willemsen, Linette Eustachia Maria, 3522 AJ, Utrecht (NL); Koetsier, Marleen Antoinette, 8161 XJ, Epe (NL); Beermann, Christopher, D-61267, Neu-Anspach (DE); Stahl, Bernd, D-61191, Rosbach-Rodheim (DE)
(73) Jogosult: N. V. Nutricia, 2712 HM Zoetermeer (NL)
(54)
A23L 1/30
(2006.01) (2006.01)
(74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Az intestinalis gát integritásának javítása
(57) Kivonat
HU 007 206 T2
A találmány tárgya csecsemõtápszer-készítmény, továbbá a készítmény alkalmazása allergia kezelésére
vagy megelõzésére szolgáló eljárásban alkalmazható gyógyszer elõállítására.
A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 4 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 206 T2
A találmány területe A találmány tárgya eljárás az intestinalis gát („intestinal barrier”) integritásának javítására és az ilyen eljárásban történõ alkalmazásra megfelelõ készítmény. 5 A találmány háttere A gastrointestinalis epithelium normálisan szelektív gátként mûködik, lehetõvé teszi a tápanyagok, elektrolitok és víz abszorpcióját és meggátolja az élelmezési és mikrobiális antigéneknek, ideértve a táplálék allergéneket, való kitettséget. A gastrointestinalis epithelium korlátozza az olyan antigének átjutását a szisztémás keringésbe, amelyek gyulladásos reakciókat, például allergiás reakciókat válthatnak ki. Ahogy az allergia, különösen a táplálékallergia elõfordulása növekszik, számos kutatócsoport keres (megelõzõ) gyógymódokat ezen betegségekre. A 1272058 számú európai szabadalom egy készítményt ismertet, amely emészthetetlen oligoszacharidokat tartalmaz, a szoros sejtkapcsolat javítására, hogy ezzel csökkentsék az intestinalis permeabilitást és csökkentsék az allergiás reakciókat. A készítmény tartalmazhat LC¹PUFA-kat („long chain-polyunsaturated faty acids”, hosszláncú többszörösen telítetlen zsírsavak). A 745001 számú európai szabadalom emészthetetlen oligoszacharidok kombinációját ismerteti és n¹3 és n¹6 zsírsavakat az ulcerativ colitis kezelésére. Usami és munkatársai (Clinical Nutrition 2001, 20(4): 351–359) ismertették az eikozapentaénsav (EPA) hatását a szoros sejtkapcsolatok permeabilitására az intestinalis egysejtrétegben. Az õ kezükben az EPA-ról azt találták, hogy növeli a permeabilitást, ami azt jelezte, hogy az EPA nem megfelelõ az intestinalis gát integritásának javítására. A technika állása szerinti készítmények nem optimálisan megfelelõek a gátegység javítására. A találmány összefoglalása A találmány tárgya válogatott hosszú láncú többszörösen telítetlen zsírsavak (LC-PUFA¹k) és válogatott oligoszacharidok kombinációja. A találmány szerinti LC¹PUFA és oligoszacharid kombináció hatásosan javítja a gát integritását az inestinalis permeabilitás és a nyálkatermelés szinergisztikus javítása révén, és különösen alkalmas a gát integritásának javítására csecsemõkben. Meglepetésre azt találtuk, hogy egyes LC¹PUFA¹k hatásosan csökkentették az epithelialis paracelluláris permeabilitást. Szemben azzal, amirõl Usami és munkatársai [Clinical Nutrition 20(4) 351–359 (2001)] számoltak be, azt találtuk, hogy a C18 és C20 többszörösen telítetlen zsírsavak, különösen az eikozapentaénsav (EPA), dokozahexaénsav (DHA) és arachidonsav (ARA) képes hatásosan csökkenteni az intestinalis szoros sejtkapcsolat permeabilitását. Az LC¹PUFA-kon kívül a találmány szerinti készítmény tartalmaz oligoszacharidokat. A kiválasztott oligoszacharidok javítják a gát integritását a nyálkatermelés serkentése révén, amely megnövelt nyálkaré-
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
teg¹vastagságot eredményez. Úgy gondoljuk, hogy ezt a hatást a különbözõ oligoszacharidoknak a rövid láncú zsírsav (SCFA) termelésre kifejtett hatása okozza. Ennek megfelelõen, amennyiben jelen LC¹PUFA és emészthetetlen oligoszacharidok kombinációja enterálisan kerül beadásra emlõsnek, akkor szinergisztikusan javítja a gát integritását és/vagy szinergisztikusan csökkenti az intestinalis permeabilitást, a szoros sejtkapcsolat permeabilitásra és a nyálkatermelés serkentésére kifejtett szimultán hatása révén. A találmány egy további szempontja szerint a készítmény javítja az intestinalis nyálkaréteg minõségét. A nyálkaréteg mucinokat tartalmaz. A mucinok nagy molekulatömegû glikoproteinek, amelyeket kehelysejtek szintetizálnak és választanak ki. Gélszerû réteget alakítanak ki a nyálkás felületen, ezzel javítják a gát integritását. A nyálkaréteg különbözõ típusú mucinokat tartalmaz, például savas, semleges és szulfonált mucinokat. A nyálkaréteg megnövekedett heterogenitásáról azt gondoljuk, hogy javítja a gát mûködését. A találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább kettõ különbözõ oligoszacharidot tartalmaz, amely befolyásolja a nyálka felépítését és elõnyös módon befolyásolja a mucin heterogenitást a nyálkarétegben, vagy közvetlenül vagy a bélflóra megváltoztatásával. Véleményünk szerint minden egyes különbözõ kiválasztott oligoszacharid a nyálka mennyiségére különbözõ hatást gyakorol. Továbbá két különbözõ oligoszacharid szintén képes a nyálka minõségének javítására, ahogy ez a szulfonálás mértékében tükrözõdik, az SCFA termelés szinergisztikus stimulálásával. Meglepetésünkre azt találtuk, hogy a találmány szerinti két különbözõ oligoszacharid keveréke szinergisztikusan serkenti az acetáttermelést. Azt is felismertük, hogy a nyálkatermelés függ az acetáttermeléstõl. Jelen készítményt elõnyösen tovább javítjuk mind hosszú, mind rövid láncú oligoszacharidok hozzáadásával. A különbözõ lánchosszok hozzáadása az ileum (csípõbél) és a vastagbél különbözõ részein eredményezi a nyálkahártya serkentését. A rövid láncú oligoszacharidok (jellemzõen a 2, 3, 4 vagy 5 polimerizációs fokúak [DP]) a proximális vastagbélben és/vagy a disztális ileumban serkentik a mucintermelést, míg a hosszabb láncú oligoszacharidokról (elõnyösen 5–60¹as polimerizációs fokú [DP]) azt gondoljuk, hogy a vastagbél („colon”) disztálisabb részén serkentik a mucintermelést. Még további javítások érhetõek el legalább kettõ különbözõ oligoszacharid mind rövid láncú, mind hosszú láncú oligoszacharid hozzáadásával. Ezen elõnyös megvalósítási módok mind hozzájárulnak a gát integritásának további javításához az ileum és/vagy a vastagbél teljes hosszában. Továbbá meglepetésre azt találtuk, hogy az EPA, DHA és ARA képes volt csökkenteni az interleukin–4 (IL–4) káros hatását az intestinalis permeabilitásra. Az IL–4 egy citokin, amelyet bizonyos betegekben a nyálkahártya T¹sejtjei megnövekedett mennyiségben választanak ki, és amely kiváltja az intestinalis permeabilitást. Ennek megfelelõen a találmány tárgya eljárás
1
HU 007 206 T2
olyan betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére, amelyekben az intestinalis IL–4 koncentráció megemelkedett, mint amilyen az allergia, különösen az atopiás dermatitis. 5 A találmány részletes ismertetése A találmány tárgya csecsemõtápszer készítmény, amely tartalmaz 7,5–12,5 energia% fehérjét; 40–55 energia% szénhidrátokat; és 35–50 energia% zsírt, ahol a fehérje hidrolizált tejfehérje, növényi fehérje és aminosavak alkotta csoportból választott fehérjerészt tartalmaz, és a) eikozapentaénsavat (EPA), dokozahexaénsavat (DHA) és arachidonsavat (ARA), ahol a 20 és 22 szénatomos hosszú láncú többszörösen telítetlen zsírsavak aránya nem haladja meg a teljes zsírtartalom 15 tömeg%¹át; és b) legalább két különbözõ oligoszacharidot (OL1 és OL2), ahol a két különbözõ oligoszacharid homológiája monoszacharidegységekben kifejezve 90% alatti; és c) 1–500 mg nukleozidot és/vagy nukleotidot 100 g tápszer-szárazanyagra vetítve. Ezen készítményt elõnyösen lehet alkalmazni intestinalis gát integritását javító eljárásban, amely eljárás tartalmazza a készítmény beadását emlõsnek. Többszörösen telítetlen zsírsavak Meglepetésünkre azt találtuk, hogy az eikozapentaénsav (EPA, n¹3), dokozahexaénsav (DHA, n¹3) és arachidonsav (ARA, n¹6) hatásosan csökkentik az intestinalis szoros sejtkapcsolat permeabilitását. Ennek megfelelõen a találmány szerinti készítmény, amely különösen alkalmas az intestinalis gát integritásának javítására, tartalmaz EPA¹t, DHA¹t és ARA¹t. Azt találtuk, hogy LC¹PUFA¹k alacsonyabb koncentrációja hatásos volt a szoros sejtkapcsolat permeabilitás csökkentésére (lásd a példákat az Usami és munkatársai közleményével szemben). Ennek megfelelõen a 20 és 22 szénatomos LC¹PUFA-tartalom a találmány szerinti készítményben elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom 15 tömeg%¹át, elõnyösen nem haladja meg a 10 tömeg%¹át, még elõnyösebben nem haladja meg a teljes zsírtartalom 5 tömeg%¹át. Elõnyösen a találmány szerinti készítmény a teljes zsírtartalomnak legalább 0,1 tömeg%-ában, elõnyösen legalább 0,25 tömeg%-ában, még elõnyösebben legalább 0,5 tömeg%-ában, még elõnyösebben legalább 0,75 tömeg%-ában tartalmaz 20 és 22 szénatomos LC¹PUFA¹t. Ugyanezen okból az EPA-tartalom elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom 5 tömeg%¹át, még elõnyösebben nem haladja meg a teljes zsírtartalom 1 tömeg%¹át, de elõnyösen a teljes zsírtartalomnak legalább 0,05 tömeg%¹a, még elõnyösebben legalább 0,1 tömeg%¹a. A DHA-tartalom elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom 5 tömeg%¹át, még elõnyösebben nem haladja meg az 1 tömeg%¹át, de legalább 0,1 tömeg%¹a. Mivel az ARA¹t különösen hatásosnak találtuk a szoros sejtkapcsolat permeabilitásának csökkentésére, ezért a találmány szerinti ké-
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2
szítmény viszonylag nagy mennyiségben tartalmazza, elõnyösen a teljes zsírtartalomnak legalább 0,1 tömeg%-ában, elõnyösebben legalább 0,25 tömeg%ában, legelõnyösebben legalább 0,5 tömeg%-ában. Az ARA-tartalom elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom 5 tömeg%¹át, még elõnyösebben nem haladja meg az 1 tömeg%¹át. A jelen ARA-tartalmú enterális készítményhez elõnyösen EPA¹t és DHA¹t adtunk, hogy kiegyensúlyozzuk az ARA hatását, például hogy csökkentsük az ARA-metabolitok lehetséges gyulladáskeltõ hatását. Az ARA-metabolitok túlzott mennyisége gyulladást okozhat. Ennek megfelelõen a találmány szerinti készítmény elõnyösen tartalmaz ARA¹t, EPA¹t és DHA¹t, amelyben az ARA/DHA tömegarány elõnyösen 0,25 feletti, elõnyösebben 0,5 feletti, még elõnyösebben 1 feletti. Az arány elõnyösen 25 alatt van. Az ARA/EPA tömegarány elõnyösen 1 és 100 közötti, elõnyösebben 5 és 20 közötti. A találmány szerinti készítmény elõnyösen a teljes zsírtartalomra vetítve 5 és 75 tömeg% közötti mennyiségben tartalmaz többszörösen telítetlen zsírsavakat, elõnyösen 10 és 50 tömeg% között. Amennyiben a találmány szerinti készítményt csecsemõtápszerként alkalmazzuk (például eljárás csecsemõ táplálására, amely eljárás tartalmazza a találmány szerinti készítmény beadását csecsemõnek), akkor az LC¹PUFA¹tartalom, különösen a 20 és 22 szénatomos LC¹PUFA nem haladja meg a teljes zsírtartalom 3 tömeg%¹át, mivel kívánatos az emberi tej utánzása, amennyire csak lehetséges. Ugyanezen okból, az omega¹3 LC¹PUFA-tartalom elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom 1 tömeg%¹át; az omega¹6 LC¹PUFA-tartalom elõnyösen nem haladja meg a teljes zsírtartalom 2 tömeg%¹át; az ARA (omega¹6) tartalom elõnyösen a teljes zsírtartalom 1 tömeg%¹a alatt van; és/vagy az EPA/DHA tömegarány elõnyösen 1 vagy kisebb, még elõnyösebben 0,5-nél kisebb. A 20 és 22 szénatomos LC¹PUFA lehet szabad zsírsavakként, triglicerid formában, foszfolipid formában jelen, vagy az elõzõk valamelyikének vagy többjének a keveréke formájában. A találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább az ARA vagy DHA egyikét foszfolipid formában tartalmazza. A találmány szerinti táplálékkészítmény elõnyösen tartalmaz omega¹9 (n¹9) zsírsavat (elõnyösen oleinsavat, 18:1) a megfelelõ táplálás nyújtása érdekében. Elõnyösen a találmány szerinti készítmény a teljes zsírtartalomra vetítve legalább 15 tömeg% n¹9 zsírsavat ad, elõnyösebben legalább 25 tömeg%¹ot. Az n¹9 zsírsavtartalom elõnyösen 80 tömeg% alatti.
Oligoszacharidok A találmány szerinti megfelelõ oligoszacharidok az olyan szacharidok, amelyek polimerizációs foka (DP) 55 legalább 2 monoszacharidegység, amelyek nem vagy csak részlegesen emésztõdnek meg a belekben az emberi felsõ emésztési szakaszban (vékonybél és gyomor) jelen lévõ savak vagy emésztõenzimek hatására, de amelyeket az emberi bélflóra képes fermentálni. 60 A monoszacharidegység kifejezés olyan egységeket 3
1
HU 007 206 T2
jelöl, amelyek zárt gyûrûszerkezettel bírnak, elõnyösen hexóz, például piranóz vagy furanóz formájúak. Az oligoszacharid polimerizációs foka jellemzõen 60 monoszacharidegység alatti, elõnyösen 40 alatti, még elõnyösebben 20 alatti. A találmány szerinti készítmény legalább két különbözõ oligoszacharidot tartalmaz, ahol az oligoszacharidok homológiája a monoszacharidegységekben körülbelül 90% alatti, elõnyösen 50% alatti, még elõnyösebben 25% alatti, még elõnyösebben 5% alatt. A „homológia” kifejezés, a találmány szerinti értelemben a különbözõ oligoszacharidokban az azonos monoszacharidegységek százalékának kumulatív értéke. Például az 1¹es oligoszacharid (OL1) szerkezete a következõ: fruktóz-fruktóz-glukóz-galaktóz, és így 50% fruktózt, 25% galaktózt és 25% glukózt tartalmaz. A 2¹es oligoszacharid (OL2) szerkezete a következõ: fruktóz-fruktóz-glukóz, és így 66% fruktózt és 33% glukózt tartalmaz. A különbözõ oligoszacharidok homológiája így 75% (50% fruktóz+25% glukóz). Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti készítmény tartalmaz galaktooligoszacharidokat és a következõk közül legalább egyet: fruktooligoszacharidok vagy inulin. Minden egyes találmány szerinti oligoszacharid a benne található monoszacharidegységek összes számának elõnyösen legalább 66%-ban, elõnyösebben legalább 90%-ban olyan monoszacharidegységet tartalmaz, amely a következõk bármelyike: mannóz, arabinóz, fruktóz, fukóz, ramnóz, galaktóz, b¹D-galaktopiranóz, ribóz, glukóz, xilóz, uronsav vagy ezek származékai. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány szerinti oligoszacharidok közül legalább egy a következõk bármelyike: fruktánok, fruktooligoszacharidok, emészthetetlen dextrinek galaktooligoszacharidok (ideértve a transzgalaktooligoszacharidokat), xilooligoszacharidok, arabinooligoszacharidok, glukooligoszacharidok, mannooligoszacharidok, fukooligoszacharidok, savas oligoszacharidok (lásd alább például uronsavoligoszacharidok, mint amilyen a pektinhidrolizátum) vagy ezek keverékei. Elõnyösen a találmány szerinti készítmény tartalmaz legalább egyet, elõnyösen legalább kettõt a következõ oligoszacharidok közül: fruktooligoszacharidok vagy inulin, galaktooligoszacharidok vagy pektinhidrolizátum. A jó nyálkamennyiség és ¹minõség érdekében a találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább egy oligoszacharidot tartalmaz, amely legalább 66% galaktózt vagy fruktózt tartalmaz monoszacharidegységként. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a készítmény tartalmaz legalább egy oligoszacharidot, amely legalább 66% galaktózt tartalmaz monoszacharidegységként, és legalább egy oligoszacharidot, amely legalább 66% fruktózt tartalmaz monoszacharidegységként. Egy különösen elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti készítmény tartalmaz galaktooligoszacharidot és a következõ oligoszacharidok bármelyikét: fruktooligoszacharid vagy inulin. A fruktooligoszacharidok serkentik a szulfomucin-termelést a distalis vastag-
5
10
15
20
25
30
35
2
bélben az emberiflóra-kapcsolt patkányokban [Kleessen és munkatársai, (2003) Brit J. Nutr 89: 597–606] és a galaktooligoszacharidok serkentik a savas mucintermelést [Meslin és munkatársai, (1993) Brit. J. Nutr 69: 903–912]. A nyálkaréteg vastagságának a további javításához a teljes vastagbélben, a találmány szerinti készítményben az oligoszacharidoknak legalább 10 tömeg%-ának a DP¹je 2 és 5 közötti (például 2, 3, 4, és/vagy 5) és legalább 5 tömeg%-ának a DP¹je 10 és 60 közötti. Elõnyösen az oligoszacharidoknak legalább 50 tömeg%ának, még elõnyösebben legalább 75 tömeg%-ának a DP¹je 2 és 9 közötti (például 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, és/vagy 9), mivel ezekrõl úgy gondoljuk, hogy a csípõbél (ileum) teljes hosszában és a vastagbél proximális és középsõ részein mûködnek, és mert a kívánt hatás eléréséhez a készítményhez hozzáadni szükséges oligoszacharidok tömegszázalékai csökkentettek. Elõnyösen a tömegarányok: a) (2 és 5 közötti DP¹jû oligoszacharidok): (6, 7, 8 és/vagy 9 DP¹jû oligoszacharidok) >1; b) (10 és 60 közötti DP¹jû oligoszacharidok): (6, 7, 8 és/vagy 9 DP¹jû oligoszacharidok) >1; vagy mindkettõ nagyobb, mint 1. Elõnyösen mindkét tömegarány 2 feletti, még elõnyösebben 5 feletti. A nyálkaréteg vastagságának és minõségének még további javításához a teljes vastagbél területén, elõnyösen a legalább kettõ különbözõ oligoszacharid mindegyike különbözõ lánchosszúságúként kerül hozzáadásra, elõnyösen a megfelelõ oligoszacharid teljes tömegének legalább 10 tömeg%¹a minden egyes oligoszacharid esetében 2 és 5 közötti DP¹jû (például 2, 3, 4, és/vagy 5) és legalább 5 tömeg%¹a 10 és 60 közötti DP¹jü. Elõnyösen az adott oligoszacharid össztömegének legalább 50 tömeg%-ának, elõnyösebben legalább 75 tömeg%-ának DP¹je 2 és 10 közötti, mivel ezekrõl úgy véljük, hogy az ileum teljes hosszában és a vastagbél középsõ részein mûködnek.
40
45
50
55
60 4
Savas oligoszacharidok A gát integritásának további javításához a találmány szerinti készítmény tartalmaz 2 és 60 közötti DP¹jû savas oligoszacharidokat. A savas oligoszacharid olyan oligoszacharidot jelöl, amely legalább egy savas csoportot tartalmaz a következõk közül: N¹acetilneuraminsav, N¹glikoloilneuraminsav, szabad vagy észterezett karbonsav, kénsavcsoport vagy foszforsavcsoport. A savas oligoszacharid elõnyösen tartalmaz uronsavegységeket (például uronsavpolimer), még elõnyösebben galakturonsavegységeket. A savas oligoszacharid lehet homogén vagy heterogén szénhidrát. megfelelõ példák a pektin és/vagy alginát hidrolizátumok. Az intestinalis szakaszban az uronsavpolimerek uronsavmonomerekké hidrolizálódnak, amely serkenti az intestinalis acetáttermelést, amely serkenti az intestinalis nyálkakiválasztást (Barcelo és munkatársai, Gut 2000; 46:218–224). Elõnyösen a savas oligoszacharidok az alábbi l¹es szerkezettel bírnak, amelyben a terminális hexóz (bal)
1
HU 007 206 T2
elõnyösen tartalmaz kettõs kötést. A terminális hexózegységen kívüli hexózegységek elõnyösen uronsavegységek, még elõnyösebben galakturonsavegységek. A karbonsavcsoportok ezeken az egységeken lehetnek szabadok vagy (részlegesen) észterezettek, és elõnyösen legalább 10%-ban metilezettek (lásd alább).
5
l¹es szerkezet: Savas oligoszacharidpolimer 10
15
ahol: R elõnyösen a következõk bármelyike: hidrogén, hidroxi- vagy savcsoport, elõnyösen hidroxi; és az R2, R3, R4 és R5-bõl álló csoport legalább egyike N¹acetilneuraminsavat, N¹glikoloilneuraminsavat, szabad vagy észterezett karbonsavat, kénsavcsoportot vagy foszforsavcsoport jelöl, és a többi R2, R3, R4 vagy R5 jelentése hidroxi és/vagy hidrogén. Elõnyösen az R2, R3, R4 vagy R5-bõl álló csoport bármelyike N¹acetilneuraminsavat, N¹glikoloilneuraminsavat, szabad vagy észterezett karbonsavat, kénsavcsoportot vagy foszforsavcsoport jelöl, és a többi R2, R3, R4 vagy R5 jelentése hidroxi és/vagy hidrogén. Még elõnyösebben az R2, R3, R4 és R5-bõl álló csoport egyike szabad vagy észterezett karbonsavat jelöl, és a többi R2, R3, R4 vagy R5 jelentése hidroxi és/vagy hidrogén; és n egész szám és a hexózegységek számát jelöli (lásd még a polimerizációs fokot az alábbiakban), ami bármilyen hexózegység lehet. Megfelelõen n egy 1 és 5000 közötti egész szám. Elõnyösen a hexózegység(ek) uronsavegységek. Legelõnyösebben R1, R2 és R3 jelentése hidroxi, R4 jelentése hidrogén, R5 jelentése karbonsav, n 1 és 250 közötti egész szám, elõnyösen 1 és 10 közötti, és a hexózegység galakturonsav. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott elõnyös savas oligoszacharidok detektálását, mérését és analízisét ismertetik korábbi szabadalmi beadványok, amelyek tárgya a savas oligoszacharid, például WO 0/160378 számú nemzetközi közzétételi irat. A vastagbél teljes területén a nyálkaréteg vastagságának serkentéses javításához, a találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább 10 tömeg% 2 és 5 közötti (például 2, 3, 4 és/vagy 5) DP¹jû savas oligoszacharidot tartalmaz és legalább 5 tömeg% 10 és 60 közötti DP¹jû savas oligoszacharidot tartalmaz, amely tömeg% az oligoszacharidok teljes tömegén alapszik. A találmány szerinti alkalmazott savas oligoszacharidokat elõnyösen pektinbõl, pektátból, alginátból, chondroitinbõl, hialuronsavakból, heparinból, heparánból, bakteriális szénhidrátokból, szialoglikánokból, fukodiánból, fukooligoszacharidokból vagy karragenánból állítjuk elõ, elõnyösen pektinbõl és/vagy alginátból.
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
Oligoszacharidtartalom Amennyiben etetésre kész folyadék formában van, akkor a találmány szerinti készítmény 0,1–100 gramm emészthetetlen oligoszacharidokat tartalmaz literenként, elõnyösebben 0,5–50 grammot literenként, még elõnyösebben 1–25 grammot literenként. A túl magas oligoszacharidtartalom kellemetlen érzéseket válthat ki a jelentõs fermentáció miatt, míg a nagyon alacsony tartalom elégtelen nyálkaréteget eredményezhet. A legalább kettõ különbözõ oligoszacharid tömegaránya elõnyösen 1 és 10 közötti, még elõnyösebben 1 és 5 közötti. Ezen tömegarányok optimálisan serkentik a különbözõ típusú mucinok termelését, különbözõ helyeken a belekben. A találmány szerinti készítményhez az oligoszacharidot 0,1 tömeg%-nál nagyobb mennyiségben adjuk, elõnyösen 0,2 tömeg%-nál nagyobban, még elõnyösebben 0,5 tömeg%-nál nagyobban és még elõnyösebben 1 tömeg%-nál nagyobban, a készítmény teljes száraz tömegére vetítve. A készítmény oligoszacharidtartalma elõnyösen 20 tömeg% alatti, elõnyösebben 10 tömeg% alatti, még elõnyösebben 5 tömeg% alatti. A találmány szerinti készítményhez nukleotidok és/vagy nukleozidok hozzáadása tovább javítja a bélnyálka gátfunkcióját, különösen, mivel gátolja és/vagy csökkenti a bakteriális transzlokáció elõfordulását és csökkenti a belek sérülését. Ennek megfelelõen a találmány szerinti készítmény tartalmaz továbbá 1 és 500 mg közötti mennyiségben nukleozidokat és/vagy nukleotidokat a száraz tápszer 100 grammjára vetítve, még elõnyösebben 5 és 100 mg közötti mennyiségben. Alkalmazás A találmány szerinti készítményt elõnyösen alkalmazhatjuk emlõsökben, különösen emberekben a gát integritásának javítására szolgáló eljárásban. A találmány szerinti készítményt továbbá elõnyösen alkalmazhatjuk a csökkent gátintegritással asszociált betegségek kezelésére vagy megelõzésére szolgáló eljárásban, amely eljárás tartalmazza a találmány szerinti készítmény beadását emlõsnek. A találmány szerinti készítmény elõnyösen szájon át kerül beadásra. A betegeknek és csecsemõknek a találmány szerinti készítmény elõnyösen kombinálva van teljes táplálékkal, ideértve a fehérjét, szénhidrátot és zsírt. A találmány szerinti készítmény elõnyösen 0 és 2 év közötti csecsemõknek kerül beadásra. A készítmény beadható olyan pácienseknek, akik a gát integritásának sérülésében szenvednek és egészséges pácienseknek. A találmány szerinti készítményt elõnyösen koraszülött csecsemõ (olyan csecsemõ, aki 37 hét gesztációs idõ elõtt születik) táplálékszükségleteit adó eljárásban alkalmazhatjuk. A találmány szerinti készítményt elõnyösen alkalmazhatjuk továbbá intestinalis sérülés kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló eljárásban, melynek során a találmány szerinti készítményt az intestinalis sérülést kiváltható orvosi kezelést megelõzõen vagy azt követõen adjuk be. Ilyen orvosi kezelés lehet például a sebészet vagy az enterális gyógyszeres kezelés
1
HU 007 206 T2
(például antibiotikumos, analgéziás, NSAID, kemoterápiás vegyületek stb.). A találmány szerinti készítményt elõnyösen alkalmazhatjuk továbbá olyan betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére, amelyekben az intestinalis gát sérülése határozza meg a betegség elõrehaladását, például krónikus gyulladásos megbetegedések, különösen a gyulladásos bélbetegség (IBD), irritábilis bél szindróma (IBS), coeliákia, pankreatitisz, hepatitisz, arthritis vagy cukorbetegség megelõzésére vagy kezelésére szolgáló eljárásban. Továbbá a találmány alkalmazható olyan páciensek táplálását adó eljárásokban, akik abdominális sebészeti beavatkozáson estek át vagy fognak átesni és olyan pácienseknek, akiknél a belek posztoperatív mûködési zavarait tapasztalják és/vagy rosszul táplált pácienseknek. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány szerinti készítményt olyan pácienseknek adjuk be, akik szerzett immunhiány szindrómában (AIDS) szenvednek és/vagy olyan pácienseknek, akik emberi immunhiány vírussal (HIV) fertõzöttek, például AIDS és/vagy HIV-fertõzés kezelésére alkalmas eljárásban. Az eljárás tartalmazza a találmány szerinti készítmény beadását, elõnyösen a következõ tápanyagok bármelyikével együtt: szénhidrát, zsír vagy fehérje. Továbbá a találmányt alkalmazhatjuk a gát integritásának csökkenése által okozott komplikációk megelõzésére vagy kezelésére, különösen a hasmenés, különösen a csecsemõhasmenés kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló eljárás során. A csecsemõhasmenés csökkent elõfordulási gyakorisága miatt a találmány szerinti készítmény elõnyösen alkalmazható a pelenka által okozott kiütések csökkentésére. A találmány szerinti készítmény beadása csökkenti a táplálék és mikrobiális antigének, különösen az élelmiszer-allergének átjutását az intestinalis lumenbõl a nyálkahártyába vagy a szisztémás keringésbe, és ennek megfelelõen elõnyösen alkalmazható allergia és/vagy allergiás reakció kezelésére vagy megelõzésére szolgáló eljárásban, különösen élelmiszer-allergia kezelésére vagy megelõzésére szolgáló eljárásban, például élelmiszeranyagok bevitele által kiváltott allergiás reakció. Azt is tapasztaltuk, hogy az EPA, DHA és/vagy ARA képesek az IL–4 hatását csökkenteni az intestinalis permeabilitáson. Ennek megfelelõen a találmány egy szempontja eljárás olyan betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére, amelyekben az intestinalis IL–4 koncentráció megemelkedett (például allergiás betegségek), amely eljárás tartalmazza LC¹PUFA beadását, amely elõnyösen a következõk bármelyike: EPA, DHA vagy ARA, elõnyösen kombináltan a jelen kiválasztott oligoszacharidokkal. Ennek megfelelõen a találmány szerinti készítmény elõnyösen alkalmazható atópiás dermatitisz kezelésére szolgáló eljárásban. Mivel az újszülöttek gátfunkciója még nem fejlõdött ki teljesen, ezért a találmány szerinti készítmény elõnyösen adható fiatal csecsemõknek, azaz 0 és 6 hónap közötti korú csecsemõknek. A készítményt be lehet adni a csecsemõnek csecsemõtápszer formájában
5
10
15
20
25
2
emberi tej nélkül vagy emberi tejjel elõkeverten. Ennek megfelelõen a találmány tárgya továbbá olyan csecsemõtápszer, amely emberi tejet és a találmány szerinti készítményt tartalmazza. Emberi tejet és a találmány szerinti készítményt tartalmazó készítmények különösen megfelelõek koraszülött csecsemõk táplálására. A találmány szerinti készítmény elõnyösen csomagolt por vagy etetésre kész tápszer. Annak érdekében, hogy megelõzzük a termék pazarlását, az etetésre kész tápszer csomagolási mérete nem haladja meg az egy adagot, például elõnyösen nem haladja meg az 500 ml¹t; és a por alakú találmány szerinti készítmény csomagolása elõnyösen nem haladja meg a 250 adagnyit. A por megfelelõ csomagolási mérete a 2000 g¹os vagy ennél kisebb, elõnyösen az 1000 g¹os vagy ennél kisebb. A találmány tárgyát képezik címkével ellátott csomagolt termékek, amelyek explicite vagy implicite utasítják a fogyasztót a termék alkalmazására a fenti vagy alábbi okoknak megfelelõen. Az ilyen címkék például hivatkozhatnak a találmány szerinti eljárásra, amely az élelmiszer allergének által kiváltott allergiás reakciók megelõzésére szolgál, olyan kifejezésekkel mint, „csökkentett élelmiszer-érzékenység”, az „intestinalis tolerancia javítása” „javított tápláléktolerancia” vagy hasonló kifejezések. Hasonló módon lehet hivatkozni jelen allergia kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló eljárásra a „javított rezisztencia” vagy „csökkentett érzékenység” kifejezésekkel ekvivalens terminológiával.
30
35
40
45
50
55
60 6
Tápszerek Azt találtuk, hogy a találmány szerinti készítményt elõnyösen lehet alkalmazni élelmiszerekben, mint amilyen a csecsemõ élelmiszer és a klinikai élelmiszer. Az ilyen élelmiszer elõnyösen tartalmaz lipidet, fehérjét és szénhidrátot és elõnyösen folyadék formában kerül beadásra. A „folyékony élelmiszer” kifejezés a találmány szerinti értelemben száraz élelmiszert tartalmaz (például porokat), amelyekhez utasításokat mellékelünk arra vonatkozóan, hogy a száraz élelmiszer keveréket megfelelõ folyadékkal (például vízzel) kell elkeverni. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát képezi továbbá táplálékkészítmény, amely tartalmaz 5 és 50 en% közötti lipidet, 5 és 50 en% közötti fehérjét, 15 és 90 en% közötti szénhidrátot és oligoszacharidok és LC¹PUFA¹k jelen kombinációját. Elõnyösen jelen táplálékkészítmény elõnyösen tartalmaz 10 és 30 en% közötti lipidet, 7,5 és 40 en% közötti fehérjét, 25 és 75 en% közötti szénhidrátot (az en% az energia százalék rövidített formája, és az egyes összetevõknek a készítmény teljes kalorikus értékéhez való hozzájárulását képviseli). Elõnyösen növényi lipidek kombinációját és a következõk közül legalább egyet alkalmazunk: halolaj, omega¹3 növényi, alga- vagy baktériumolaj. A táplálékkészítményben alkalmazott fehérjék elõnyösen a következõk bármelyike: nem emberi állati fehérjék (mint amilyenek a tejfehérjék, húsfehérjék vagy tojásfehérjék), növényi fehérjék (mint amilyen a szójafehérje, búzafehérje, rizsfehérje vagy borsófehérje), sza-
1
HU 007 206 T2
bad aminosavak vagy ezek keverékei. Tehéntej-eredetû nitrogénforrás, különösen tehéntejfehérjék, mint amilyen a kazein és a savófehérjék különösen elõnyösek. A táplálék tápszerhez adható emészthetõ szénhidrátforrás. Ez elõnyösen a táplálékkészítmény energiájának körülbelül 40% – körülbelül 80% közötti részét adja. Bármilyen megfelelõ szénhidrát (forrás) alkalmazható, például szacharóz, laktóz, glukóz, fruktóz, kukoricaszirup szárazanyag, vagy maltodextrinek vagy ezek keverékei. A találmány szerinti készítményt elõnyösen csecsemõtápszerként alkalmazzuk és elõnyösen 7,5–12,5 energia% fehérjét, 40–55 energia% szénhidrátot, és 35–50 energia% zsírt tartalmaz. Mivel a találmány szerinti készítmény megfelelõen alkalmazható az allergiás reakciók csökkentésére csecsemõkben, ezért a csecsemõtápszer fehérjéje elõnyösen a következõk bármelyike: hidrolizált tejfehérje (például hidrolizált kazein vagy hidrolizált savófehérje), növényi fehérje és/vagy aminosavak. Ezen fehérjék alkalmazása tovább csökkentette a csecsemõ allergiás reakcióit. A széklet rendszertelenségek (például kemény székletek, nem megfelelõ széklettérfogat, hasmenés) sok folyadék élelmiszert kapó csecsemõ és beteg alanyok esetében fontos problémák. Azt találtuk, hogy a székletproblémák csökkenthetõk jelen oligoszacharidok folyékony élelmiszerként történõ beadásával, amelyeknek az ozmolaritása 50 és 500 mOsm/kg közötti, elõnyösebben 100 és 400 mOsm/kg közötti. A fentiek fényében az is fontos, hogy a folyékony tápláléknak ne legyen túlzott kalorikus sûrûsége, azonban az alany táplálásához még elégséges kalóriát adjon. Ennek megfelelõen a folyékony élelmiszer kalorikus sûrûsége 0,1 és 2,5 kcal/ml közötti, még elõnyösebben 0,5 és 1,5 kcal/ml közötti a kalorikus sûrûsége, legelõnyösebben 0,6 és 0,8 kcal/ml közötti.
5
10
15
20
25
30
35
Példák 1. példa: Az LC¹PUFA hatása a gátintegritásra Intestinalis T84¹es epithel sejtvonalak [American Type Culture Collection (ATTC), Manassas, Amerikai Egyesült Államok] egysejtrétegeit („monolayer”, MC) tenyésztettük Transwell (filter) szûrõkön (Corning, Costar BV, Hollandia) amely lehetõvé tette mind a nyálka, mind a szerológiai mintavételt és az emberi intestinalis epithelsejtek serkentését. A konfluencia elérését követõen két héttel az egysejtrétegeket inkubáltuk az üreges rekeszekben többszörösen telítetlen zsírsavakkal, ARAval (arachidonsav; 5,8,11,14-eikozatetraénsav), DHAval (cis¹4,7,10,13,16,19-dokozahexaénsav), EPA-val (eikozapentaénsav) vagy kontrollpalmitinsavval (C 16: 0) (Palm) (Sigma, St. Louis, Amerikai Egyesült Államok). Az utóbbi eljárást azért választottuk, hogy utánozza a táplálékvegyületek in vivo beadási útvonalát. A sejteket inkubáltuk ARA-val, DHA-val, EPA-val, vagy palmitinsavval 0, 24, 48 és 72 óráig különbözõ koncentrációkban (10 mM és 100 mM). A kísérleteket az alap integritás értékelésére végeztük. Az epithelialis gát funkciót a transzepithelialis ellenállás (TER, W.cm2) megmérésével határoztuk meg, epithelialis volt-ohm mérõ ké-
40
2
szülékkel (EVOM; World Precision Instruments, Németország) és 4 kD FITC dextrán permeabilitással (paracelluláris permeabilitási jel, Sigma, Amerikai Egyesült Államok). Rezisztancia Az epithelium permeabilitást a 4 kDa FITC-dextránra a következõ módon határoztuk meg. A dextrán fluxusokat megelõzõen a tápközeget felfrissítettük egy óráig fenolvörös nélküli tenyésztõközeggel, amit 5 l (100 mg/ml törzs) 4 kDa FITC-dextrán hozzáadása követett az üreges rekeszbe. 30 perc inkubáció eltelte után 100 ml mintát vettünk a szerológiai rekeszbõl és mértük a fluoreszcens jelet 485 nm¹es excitációs hullámhosszon 520 nm¹es emisszión (FLUOstarGalaxy®, BMG Labtechnologies, Amerikai Egyesült Államok). A FITC-dextrán fluxusokat pmol FITC-dextrán/cm2/h¹ként számoltuk ki. A statisztikai elemzéseket ANOVA alkalmazásával végeztük (SPSS 10¹es verzió). A zsírsavak (100 mM) hatásának eredményeit a spontán gátintegritásra 72 órás inkubációt követõen adtuk meg az 1. táblázatban. Az 1. táblázat azt mutatja, hogy az ARA, EPA és DHA LC¹PUFA¹k csökkentik a molekuláris fluxust és javítják az epithelialis ellenállást. Ezzel szemben a kontrollkísérletek azt mutatják, hogy a palmitinsavnak ellentétes hatása van, azaz elrontja a gát integritását. Ezek az eredmények mutatják az EPA, DHA és ARA, és különösen az ARA elõnyös alkalmazását a találmány szerinti készítményben és a találmány szerinti eljárásban, azaz a gát integritásának javítására szolgáló eljárásban. Ezen eredmények továbbá alátámasztják a jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharidkombináció szinergisztikus hatásait. Az 1. ábra különbözõ zsírsavaknak (palmitinsav, DHA, GLA, és AA) idõ- és dózisfüggõ (10 mM és 100 mM) hatásait mutatja az alap gátintegritásra (TER). Az 1. ábra azt mutatja, hogy az AA, DHA és GLA LC¹PUFA¹k javítják az epithelialis gát integritását, ahogy ez a megnövekedett ellenállásból (TER) tükrözõdik. Ezek az eredmények jellemzik az EPA, DHA, GLA és ARA, különösen az ARA elõnyös alkalmazását a találmány szerinti készítményben és a találmány szerinti eljárásban, azaz a gát integritására szolgáló eljárásban. Ezek az eredmények továbbá alátámasztják a jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharidkombináció szinergisztikus hatásait. 1. táblázat
45
Összetevõ (LC-PUFA)
50
Fluxus
Ellenállás (TER)
79
1090
161
831
DHA
72
1574
ARA
28
1816
EPA
65
1493
Kontroll Palmitinsav
55
2. példa: Az LC¹PUFA hatása az IL–4 által kiváltott gátsérülésre Intestinalis T84¹es epithelsejtvonalak (ATTC, Ame60 rikai Egyesült Államok) egysejtrétegeit („monolayer”, 7
1
HU 007 206 T2
MC) tenyésztettük Transwell filter (Corning, Costar BV, Hollandia) amely lehetõvé tette mind a nyálka, mind a szerológiai mintavételt és az emberi intestinalis epithelsejtek serkentését. A konfluencia elérését követõen két héttel az egysejtrétegeket inkubáltuk IL–4 (2 ng/ml, szerológiai kompartment, Sigma, Amerikai Egyesült Államok) jelenlétében ARA, DHA, EPA vagy kontroll palmitinsavval többszörösen telítetlen zsírsavakkal, vagy ezek nélkül (10 mM vagy 100 mM, nyálka rekesz, Sigma, St. Louis, Amerikai Egyesült Államok). A sejteket 48 órát elõinkubáltuk ARA-val, DHA-val, EPA-val vagy palmitinsavval az IL¹4¹es inkubációt megelõzõen. A PUFA¹k és a palmitinsav együttes inkubációját az IL¹4-gyel további 48 óráig végeztük; miközben a tenyésztõközeget és az adalékokat minden 24 órában cseréltük. Az epithelialis gátfunkciót a transzepithelialis ellenállás és a permeabilitás megmérésével határoztuk meg az 1. példában ismertetett módon. Az ARA, DHA, EPA és palmitinsav (100 mM) hatásának eredményeit az IL–4 által kiváltott gátsérülésre a 2. táblázatban adtuk meg. A 2. táblázat azt mutatja, hogy az ARA, DHA és EPA LC¹PUFA¹k gátolják az IL–4 által kiváltott megnövekedett fluxust. Ezzel szemben a palmitinsavnak káros hatása volt és csökkentette a gát sérülését a kontrollal összehasonlítva. Ezek az eredmények jellemzõek az ARA, DHA és EPA elõnyös alkalmazására klinikai vagy csecsemõtáplálék-kiszerelésekben az IL–4 által kiváltott gátsérülés megelõzésére vagy csökkentésére, például ahogy ez élelmiszervagy tehéntej-allergia esetén történik. Ezen eredmények további alátámasztást adnak a jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharidkombináció szinergisztikus hatásainak. A 2. ábra adja meg az idõ és dózis (10 mM vagy 100 mM) függõ védõ hatásait a különbözõ FA¹knak (palmitinsav, DHA, GLA, és AA) az IL–4 által kiváltott gátsérülésre (Fluxus). A 2. ábra azt mutatja, hogy az ARA, DHA és GLA védenek az IL–4 által kiváltott gátsérüléssel szemben, ahogy ez a lecsökkent 4 kD dextrán fluxusból tükrözõdik. Ezek az eredmények jellemzõek az ARA, DHA és GLA elõnyös alkalmazására klinikai és csecsemõtáplálék-kiszerelésekben az IL–4 által kiváltott gátsérülés megelõzésére vagy csökkentésére, például ahogy ez élelmiszer- vagy tehéntej-allergia esetén történik. Ezen eredmények további alátámasztást adnak a jelen zsírsav és emészthetetlen oligoszacharidkombináció szinergisztikus hatásainak.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2. táblázat Összetevõ (LC-PUFA)
5
IL–4 Fluxus
IL–4 TER
Kontroll
582
374
Palmitinsav
777
321
DHA
271
547
ARA
218
636
EPA
228
539
55
60 8
2
3. példa: Oligoszacharidok hatása az acetáttermelésre Mikroorganizmusokat vettünk tápszerrel táplált csecsemõk friss székletébõl. Friss székletanyagot gyûjtöttünk 1–4 hónapos korú csecsemõktõl és két órán belül tartósítóközegbe tettük. Szubsztrátként vagy prebiotikumot (TOS; TOS/inulin (HP) 9/1 (tömeg/tömeg) arányú keverék; inulin; oligofruktóz(OS)/inulin 1/1 (tömeg/tömeg) arányú keverékben), vagy semmit sem (üres) alkalmaztunk. A transzgalaktooligoszacharidokat (TOS) a Vivinal GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Hollandia cégtõl szereztük be és emészthetetlen oligoszacharidként a következõket tartalmazta: 33 tömeg% diszacharidok, 39 tömeg% triszacharidok, 18 tömeg% tetraszacharidok, 7 tömeg% pentaszacharidok és 3 tömeg% hexa¹, hepta- és oktaszacharidok. Az inulin (HP) Orafti active food ingredients, Tienen, Belgium, például RaftilineHP®, 23¹as átlagos DP¹vel. Tápközeg: McBain & MacFarlane tápközeg: pufferezett peptonvíz 3,0 g/l, élesztõkivonat 2,5 g/l, mucin [kefeszegély („brush border”)] 0,8 g/l, tripton 3,0 g/l, L¹cisztein-HCl 0,4 g/l, epesavas sók 0,05 g/l, K2HPO4.3H2O 2,6 g/l, NaHCO3 0,2 g/l, NaCl 4,5 g/l, MgSO4.7H2O 0,5 g/l, CaCl2 0,228 g/l, FeSO4.7H2O 0,005 g/l. 500 ml¹es Scott-üvegeket töltöttünk meg a tápközeggel és 15 percig sterilizáltuk 121 °C¹on. Pufferezett tápközeg: K2HPO4.3H2O 2,6 g/l, NaHCO3 0,2 g/l, NaCl 4,5 g/l, MgSO4.7H2O 0,5 g/l, CaCl2 0,228 g/l, FeSO4.7H2O 0,005 g/l. A pH=6,3±0,1¹re állítva K2HPO4-gyel vagy NaHCO3-mal. 500 ml¹es Scott-üvegeket töltöttünk meg a tápközeggel és 15 percig sterilizáltuk 121 °C¹on. Tartósító tápközeg: Pufferezett pepton 20,0 g/l, L¹cisztein-HCl 0,5 g/l, nátrium-tioglikolát 0,5 g/l, resazurin tabletta literenként 1, a pH¹t 6,7±0,1¹re állítottuk 1 M NaOH-val vagy HCl-lel. Mikrohullámban fõzve. Szérumüvegeket töltöttünk meg 25 ml tápközeggel és 15 percig sterilizáltuk 121 °C¹on. Friss székletmintákat kevertünk össze tartósító tápközeggel és több óráig tároltuk 4 °C¹on. A székletek tartósított oldatát 13 000 rpm¹en centrifugáltuk 15 percig, a felülúszót eltávolítottuk és McBain & Mac Farlane közeggel összekevert székletet kevertünk hozzá 1:5 tömegarányban. Ebbõl a székletoldatból 3 ml¹t kevertünk össze 85 mg glukózzal vagy prebiotikummal vagy semmivel (üres) egy üvegben és teljesen elkevertük. t=0 mintát vettünk (0,5 ml). Az eredményül kapott 2,5 ml szuszpenziót dialíziscsõbe tettük egy 60 ml¹es üvegbe, amely 60 ml pufferezett tápközeget tartalmazott. Az üveget jól lezártuk és 37 °C¹on inkubáltuk. A dialíziscsövekbõl (0,2 ml) vagy a dialízispufferbõl (1,0 ml) mintákat vettünk hipodermiás fecskendõvel 3, 24 és 48 órát követõen, és azonnal jégre tettük a fermentáció megállításához. A kísérletet a következõ minták alkalmazásával végeztük: 1. 85 mg TOS 2. 85 mg inulin 3. 85 mg TOS/inulin 9/1 (tömeg/tömeg) arányban és 4. 85 mg OS/inulin 1/1 (tömeg/tömeg) arányban. SCFA¹t (acetát, propionát, butirát) határoztunk meg Varian 3800 gázkromatográf (GC) (Varian Inc., Walnut
1
HU 007 206 T2
Creek, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával, amely lángionizációs detektorral volt ellátva. A mintákból 0,5 ml¹t injektáltunk 80 °C¹on az oszlopba (Stabilwax, 15×0,53 mm, 1,00 mm filmvastagság, Restek Co., Amerikai Egyesült Államok) hélium hordozógáz alkalmazása mellett [20,7 KPa (3,0 psi)]. A minta injektálását követõen a kemencét 160 °C¹ra hevítettük 16 °C/perc sebességgel, amelyet 220 °C¹ra történõ melegítés követett 20 °C/perc sebességgel és végül 220 °C¹on tartottuk 1,5 percig. Az injektor és a detektor hõmérséklete 200 °C volt. 2¹etil-butirsavat alkalmaztunk standardként. A 3. ábra mutatja az abszolút (3A. ábra) és a relatív SCFA profilt (3B. ábra), amely a különbözõ oligoszacharidok fermentációja révén keletkezett. A 3A. ábra azt mutatja, hogy két különbözõ oligoszacharid keveréke (TOS/inulin), amelyben a két különbözõ oligoszacharid homológiája a monoszacharidegységekben 90 alatti, és a különbözõ lánchosszúság azt eredményezi, hogy az SCFA (különösen az acetát) mennyisége egy gramm rostra vetítve szignifikánsan és szinergisztikusan nagyobb, mint az egyedi komponenseké. A 3B. ábra azt mutatja, hogy a TOS/inulin kombináció hozzáadása az elõnyös acetát nagyobb arányának kedvezett (B). Az in vivo acetáttermelés a kehelysejtek általi javított nyálkatermelést és intestinalis nyálkaréteg vastagodást vált ki (lásd 4. példa). Ezen eredmények jellemzik a találmány szerinti készítmény elõnyös alkalmazását.
che Diagnostics, Hollandia) alkalmaztunk. Denzitometriát végeztünk Lumi-Imager (Boehringer Mannheim B. V., Hollandia) alkalmazásával és a jelet fényegységekben fejeztük ki (BLU). A BLU-kat kifejeztük relatíve a kontroll inkubációk5 hoz is (%BLU). Az SCFA-nak a MUC¹2 expresszióra kifejtett serkentõ hatásának összehasonlításához az alap MUC¹2 expressziós szinteket levontuk. A 4. ábra mutatja az SCFA (acetát, propionát, buti10 rát) különbözõ hatásait a MUC¹2 expresszióra intestinalis epithelialis sejtekben (MC T84) és epithelialis-mesenchymalis közös sejttenyészetekben (CC T84). A 4. ábra azt is mutatja, hogy az acetát hatásosabb a MUC¹2 serkentésre (nyálkatermelés)a propionáttal és 15 a butiráttal összehasonlítva. Ennek megfelelõen oligoszacharidok jelen kombinációja [amelyrõl bemutattuk, hogy növeli az acetáttermelést (lásd 3. példa)] különösen alkalmas a nyálkatermelés serkentésére és elõnyösen alkalmazható a gát integritásának javítására 20 szolgáló eljárásban.
25
30 4. példa: Az SCFA hatásai a nyálkatermelésre Intestinalis T84¹es epithelsejtek (ATTC, Amerikai Egyesült Államok) egysejtrétegeit tenyésztettük 24 vagy 96 lyukú szövettenyészet lemezeken (Corning B. V.). A T84¹et inkubáltuk a rövid láncú zsírsavak acetátjával, propionátjával és butirátjával (SCFA, Merck, Amerikai Egyesült Államok) 24 órát 0,025–4,0 mM koncentrációtartományban. Felülúszót és/vagy sejteket gyûjtöttünk és meghatároztuk a MUC¹2 (mucin) termelést. Pontblottolásos technikát alkalmaztunk a sejttenyészetekben a MUC¹2 expresszió meghatározásához, mivel a mucinok különösen nagyméretû glikoproteinek (500 kDa felettiek), amely nehézzé teszi a kezelésüket western blottolásos technikákban. Az eljárást validáltuk preimmunszérum (T84-gyel festve negatív), CCD-18¹Co (ATTC, Amerikai Egyesült Államok) negatív kontrollsejtek és marha-szérumalbumin (BSA) alkalmazásával. Sejtmintákat gyûjtöttünk Laemmliben (fehérje izolációs puffer) és fehérjemeghatározást végeztünk mikrofehérje vizsgálat (Biorad, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával, a gyártó protokollja szerint. Mintákat (0,3–0,7–1,0 mg/2 ml) pöttyöztünk nitrocellulóz membránokra (Schleicher & Schuell, Németország). A membránokat blokkoltuk TBST/5% Protivar-ban (Nutricia, Hollandia) melyet 1 órás inkubáció követett anti-MUC¹2 antitesttel (dr. Einerhand kedves adománya, Erasmus University, Rotterdam, Hollandia). A mosást követõen a blottokat kecske nyúl elleni-HRP-vel inkubáltuk (Santacruz Biotechnology, Amerikai Egyesült Államok) és a szubsztrát detektáláshoz ECL¹t (Ro-
2
35
40
5. példa: Csecsemõtejtápszer I Összetevõk (egy literben), energia 672 Kcal; fehérje 15 g; tejsavó: kazeinarány 60: 40; zsír 36 g; szénhidrát 72 g; A¹vitamin 750 RE; kevert természetes karotinoidok 400 IU; D¹vitamin 10,6 mcg; F¹vitamin 7,4 mg; K¹vitamin 67,0 mcg; B1¹vitamin (thiamin) 1000 mcg; B2¹vitamin (riboflavin) 1500 mcg; B6¹vitamin (piridoxin) 600 mcg; B12-vitamin (cianokobalamin) 2,0 mcg; niacin 9,0 mcg; folsav 80 mcg; pantoténsav 3000 mcg; biotin 90 mcg; C¹vitamin (aszkorbinsav) 90 mg; kolin 100 mg; inozitol 33 mg; kalcium 460 mg; foszfor 333 mg; magnézium 64 mg; vas 8,0 mg; cink 6,0 mg; mangán 50 mcg; réz 560 mcg; jód 100 mcg; nátrium 160 mg; kálium 650 mg; klorid 433 mg és szelén 14 mcg; amelyben a zsírtartalom tartalmaz 3 gramm halolajat és 3 gramm 40%¹os arachidonsav-olajat (DSM Food Specialties, Delft, Hollandia); tartalmaz továbbá 4 gramm transzgalaktooligoszacharidot Elix’or™ (Borculo Domo Ingredients, Hollandia) és 4 gramm Raftiline™¹et (Orafti Active Food Ingredients, Belgium).
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 45 1. Csecsemõtápszer-készítmény, amely tartalmaz 7,5–12,5 energia% fehérjét; 40–55 energia% szénhidrátokat; és 35–50 energia% zsírt, ahol a fehérje hidrolizált tejfehérje, növényi fehérje és aminosavak 50 alkotta csoportból választott fehérjerészt tartalmaz, valamint a) eikozapentaénsavat (EPA), dokozahexaénsavat (DHA) és arachidonsavat (ARA), ahol a 20 és 22 szénatomos hosszú láncú, többszörösen telítetlen zsírsavak aránya nem haladja meg a teljes zsír55 tartalom 15 tömeg%¹át; és b) legalább két különbözõ oligoszacharidot (OL1 és OL2), ahol a két különbözõ oligoszacharid homológiája monoszacharidegységekben kifejezve 90% alatti; és 60 9
1
HU 007 206 T2
c) 1–500 mg nukleozidot és/vagy nukleotidot 100 g tápszer-szárazanyagra vetítve. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol a fehérje hidrolizált tejfehérje. 3. A 2. igénypont szerinti készítmény, ahol a fehérje hidrolizált kazein és/vagy hidrolizált savófehérje. 4. Csecsemõtápszer-készítmény, amely tartalmaz 7,5–12,5 energia% fehérjét; 40–55 energia% szénhidrátokat; és 35–50 energia% zsírt, ahol a fehérje aminosavak és/vagy növényi fehérje, és a) eikozapentaénsavat (EPA), dokozahexaénsavat (DHA) és arachidonsavat (ARA), ahol a 20 és 22 szénatomos hosszú láncú többszörösen telítetlen zsírsavak aránya nem haladja meg a teljes zsírtartalom 15 tömeg%¹át; és b) legalább két különbözõ oligoszacharidot (OL1 és OL2), ahol a két különbözõ oligoszacharid homológiája monoszacharidegységekben kifejezve 90% alatti. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely fruktooligoszacharidok, inulin és ezek keverékei közül választott galaktooligoszacharidot és fruktánt tartalmaz.
2
6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol az oligoszacharid legalább 10 tömeg%¹a 2–5 polimerizációs fokú (DP) és legalább 5 tömeg%ának polimerizációs foka 10–60. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti készít5 mény, amely tartalmaz továbbá savas oligoszacharidot, elõnyösen 2–60 polimerizációs fokú uronsavpolimert. 8. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely készítmény kalóriatartalma 0,6–0,8 kcal/ml; 10 az ozmolaritása 50–500 mOsm/kg; és a viszkozitása 50 mPa·s alatti. 9. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény gyógyszerként történõ alkalmazásra. 10. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti készít15 mény alkalmazása 0 és 2 év közötti korú csecsemõnek való beadásra szolgáló készítmény elõállítására. 11. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása allergia kezelésére vagy megelõzésére, különösen ételallergia kezelésére vagy megelõ20 zésére, szolgáló eljárásban való alkalmazásra szolgáló gyógyszer elõállítására, amely eljárás tartalmazza az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény beadását emlõsnek.
10
HU 007 206 T2 Int. Cl.: A23L 1/29
11
HU 007 206 T2 Int. Cl.: A23L 1/29
12
HU 007 206 T2 Int. Cl.: A23L 1/29
13
HU 007 206 T2 Int. Cl.: A23L 1/29
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
