!HU000008248T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 248
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 785912 (22) A bejelentés napja: 2003. 12. 22. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030785912 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1576187 A1 2004. 07. 08. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1576187 B1 2009. 09. 09.
(51) Int. Cl.: C12Q 1/68 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04057024 PCT/EP 03/014719
(30) Elsõbbségi adatok: MI20022743 2002. 12. 23.
(73) Jogosult: ISTITUTO NAZIONALE PER LO STUDIO E LA CURA DEI TUMORI, I-20133 Milano (IT)
IT
(72) Feltaláló: SOZZI, Gabriella, I-20133 Milano (IT)
HU 008 248 T2
(54)
(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Eljárás a plazmában keringõ DNS mennyiségének meghatározására és a rák kimutatására
A leírás terjedelme 10 oldal (ezen belül 3 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.
1
HU 008 248 T2
A találmány tárgya in vitro eljárás a rák korai diagnosztizálására, elõrejelzésére és nyomon követésére, vagy a rák kifejlõdése kockázatának meghatározására. A találmány szerinti eljárás alapja a DNS plazmamintából történõ mennyiségi meghatározása PCR-amplifikációval. A találmány háttere Számos tudományos és szabadalmi publikáció ír le a keringõ DNS vagy RNS specifikus genetikai változásain azonosításán alapuló eljárást a rák kimutatására. Az US 5 496 699 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat eljárást ismertet biológiai folyadékokból – például vérbõl, szérumból vagy plazmából – származó nukleinsavszekvenciákban, különösen a K¹ras gén szekvenciájában elõforduló mutációk kimutatására. Az US 5 068 175 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat eljárást ismertet a ras onkogén rosszindulatú elváltozásokkal kapcsolatos jelenlétének kimutatására, amely eljárásban a gént szérum- vagy plazmamintákban mennyiségileg meghatározzák. A WO01/42504 számú nemzetközi közzétételi irat extracelluláris nukleinsav meghatározását ismerteti, például K¹ras és APC gének DNS-ének, szérum- vagy plazmamintákból, daganatos megbetegedésekkel kapcsolatos kockázati faktor értékelése céljából. A WO02/18652 számú nemzetközi közzétételi irat eljárást ismertet emberi telomerázt kódoló RNS és telomeráz-reverztranszkriptázt kódoló RNS plazmában vagy szérumban történõ minõségi/mennyiségi meghatározására számos daganatos megbetegedés diagnosztizálása, nyomon követése, kezelése vagy értékelése céljából. Lényegében a génváltozások molekuláris jellemzésére szolgáló eljárások érzékenysége alacsony és nagyszámú génmarkert kell ellenõrizni ahhoz, hogy elfogadható szintû információhoz juthassunk. Nemrég közöltek egy eljárást a keringõ csupasz DNS mennyiségi meghatározására tüdõrákos betegekbõl származó plazmában. Az eljárás olyan kolorimetrikus vizsgálaton alapul, amely képes különbséget tenni a betegek és egészséges személyek között, és az utánkövetés során korán kimutatni a betegség rosszabbodását [Sozzi, és munkatársai, Cancer Research 61, 4675–4678 (2001)]. A keringõ DNS mennyiségi értékelésére szolgáló kolorimetriás eljárás (például DNA Dipstick) azonban egy keskeny – 0,1–10 ng/ml – linearitási tartományra korlátozódik, és csökkent érzékenységû az alacsonyabb értékekre. Emellett a teszt eredményeinek leolvasása szubjektív értékelésen alapul. Egy ennél újabb keletû publikáció [Hsueh-Wei és munkatársai, Journal of the National Cancer Institute, 94 (2002)] szerzõi plazmamintákban a DNS koncentrációjának analízisét és az SNP¹k vizsgálatát javasolják a daganatos megbetegedések – elõnyösen petefészekrák – kimutatására. Mennyiségi DNS-meghatározást a kettõs szálú DNS-hez kapcsolt PicoGreen® fes-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
ték által generált fluoreszcencia intenzitásának analízisével végeztek. Az eredmények azt mutatták, hogy – az SNP-analízissel ellentétben – a plazma-DNS koncentrációjának mérésére alkalmazott eljárás érzékenysége és specifikussága gyenge, ennélfogva nem alkalmas a populáció daganatos megbetegedésekre való szûrésére. A találmány összefoglalása A találmány tárgya eljárás keringõ összes DNS mennyiségi meghatározására rákos betegtõl, rákra ismerten fogékony vagy rák kifejlõdése kockázatának kitett személytõl származó plazmamintában, amely eljárás az alábbiakat tartalmazza: 1) a mintából DNS¹t vonunk ki; 2) a DNS-készítményhez a) az emberi telomeráz reverz transzkriptázát (hTERT) kódoló gén fragmentumának PCR-amplifikálására alkalmas oligonukleotidláncindítók keverékét, b) a PCR-reakció végrehajtására alkalmas körülmények között a láncindítók által behatárolt régión belüli szekvenciához temperálás során illeszkedõ („annealing”), 3’¹ és 5’¹végein legalább egy kioltó („quencher”) és egy riporter („reporter”) fluorofórt tartalmazó oligonukleotidpróbát, és 3) 5’¹3’ exonukleáz aktivitású, hõstabil DNS-polimerázt adunk, majd amplifikáljuk a hTERT génfragmentumot; 4) mérjük a képzõdött fluoreszcenciát. A tesztelt mintában jelen lévõ DNS relatív mennyiségét könnyen kiszámíthatjuk oly módon, hogy a mért fluoreszcenciaértékeket ismert DNS-mennyiségekkel elõállított kalibrációs görbéhez interpoláljuk. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a láncindítókat és próbákat a hTERT gén (GenBank katalógusszáma: AF128893) 13059–13156. fragmentumának amplifikálására terveztük. A leírt – valós idejû PCR-ként ismert – eljárás automatizálható a GeneAmp 5700 Detection System (Applied Biosystem) berendezés alkalmazásával, amely pontos mennyiségi DNS-amplifikációt biztosít a fluorogén PCR-reakció folyamatos optikai nyomon követésével. A berendezés akár 1 genom ekvivalens (=6 pg genomikus DNS) DNS¹t képes mennyiségileg meghatározni. A keringõ DNS meghatározására szolgáló, találmány szerinti eljárás alkalmazható korai különféle rákos megbetegedéstõl – például vastagbél-végbél rák, fej-nyak rák és különösen a tüdõrák – szenvedõ betegeknél a rák korai diagnosztizálására, elõrejelzésére vagy klinikai nyomon követésére. A találmány szerinti eljárás alkalmazható továbbá a környezeti vagy életmódra visszavezethetõ kockázati tényezõknek – például tüdõrák esetében a cigarettázás – kitett egészséges személyekben a rák kifejlõdése kockázatának vagy valószínûségének meghatározására. Ezen személyekben a plazma-DNS mennyiségi növekedése fokozott kockázatot jelez elõre, és ezért a tesztet egy függetlenül gyûjtött mintán azonnal meg kell ismételni, vagy átfogóbb és specifikus klinikai vizsgálatokat kell végezni.
1
HU 008 248 T2
A találmány részletes leírása Plazma-DNS valós idejû PCR-eljárással való mennyiségi meghatározásával egyszerû, pontos in vitro eljárást találtunk a daganatos betegségek jelenlétének meghatározására vagy a rák kifejlõdésével kapcsolatos kockázat értékelésére. Pontosabban, a találmány tárgya eljárás a keringõ DNS mennyiségi meghatározására, amely eljárásban egy adott plazmamintán, az emberi telomeráz reverz transzkriptázát kódoló (hTERT) génnel párt alkotó oligonukleotidpróbák és láncindítók alkalmazásával végzett fluorogén PCR-reakciót optikai úton folyamatosan nyomon követjük. A vizsgált mintában lévõ DNS összes mennyiségének indikátoraként a hTERT amplifikációs rátáját alkalmazzuk. Az eljárást nagy populáción (200 személy) értékeltük. A populációt egyrészt olyan, korai tüdõrákos betegek alkották, akiknél a rák sebészi eltávolítása után plazma-DNS szinteket határoztunk meg az utánkövetési idõszakban, másrészt pedig kor, nem és dohányzási szokások szerint egyeztetett, egészséges, erõs dohányos személyek alkották. A vizsgálat eredményei kimutatták, hogy 1. a találmány szerinti eljárás nagyon specifikus és érzékeny [ahogyan azt az AUC és ROC görbék is tanúsítják (globális érték: 0,94, intervallum: 0,907–0,973)], 2. a betegekben – ideértve a korai stádiumú (IA stádium) rákos betegeket is – a keringõ plazma-DNS szintjei körülbelül nyolcszor magasabbak, mint az egészséges betegeknél mért értékek, 3. a rák sebészi eltávolítását követõ utánkövetési szakaszban lévõ betegekben a DNS-szintek gyorsan lecsökkentek az egészséges személyeknél megfigyeltekhez hasonló értékekre, viszont ismételten jelentkezõ ráktól vagy áttéttõl szenvedõ egyedekben akár 20¹szoros növekedést is tapasztaltunk. Bár a legmagasabb érzékenységi (90%), specificitási összeget (86%), pozitív elõrejelzési értéket (PPV90%) és negatív elõrejelzési értéket (NPV-90%) 9 ng/ml DNS-koncentrációnál kaptuk, e diagnosztikai jelzõk körüli konfidencia intervallumok (CI¹k) a szomszédos koncentrációértékeknél kapottakkal átfedésben vannak. Az optimális levágási érték kiválasztásánál figyelembe kell venni e változékonyságot. A 25 ng/ml¹es érték az egyetlen olyan érzékenységi választópont, amely nincs átfedésben más választópontok érzékenységével, bár alacsony érzékenységet mutat (46%, 95% CI, 36%, 56%). A széles konfidenciahatárok ellenére a jelentett esélyarányok (Odds Ratio, OR) nagyságrendje igazolja a plazma-DNS koncentrációja és az NSCLC kockázata közötti szoros összefüggést. Hasonló OR értékeket korábban még sohasem írtak le egyetlen biológiai markerre sem, és ennek lényeges haszna lehet a klinikai gyakorlatban. Megnövekedett mennyiségû keringõ plazma-DNS¹t figyeltünk meg bármilyen stádiumból és bármilyen méretû daganatból származó mintákban. Ez különösen a kisebb léziók esetében jelentõs, mivel ezek szisztematikus kimutatása segíthet csökkenteni a tüdõrák morbiditását és mortalitását. A találmány szerinti mennyiségi elemzés egyik fontos szempontja az, hogy így a rák sebészi eltávolítása
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
után követni lehet a hosszanti változásokat. A 35 rákos betegrõl elérhetõ adatok szerint a tüdõ sebészi eltávolítása után a keringõ DNS értékei gyorsan lecsökkentek. Ezzel szemben a plazma-DNS szintjében nem találtunk sem csökkent, sem pedig emelkedett értékeket az olyan betegeknél, akiknél a betegség ismételten jelentkezett (24,7 ng/ml vs. 7,1 ng/ml nem rákos betegek, p=0,002), ami felveti azt, hogy a plazma-DNS mennyiségi meghatározása egy újszerû megközelítés lehet a sebészeti beavatkozáson átesett betegek nyomon követésére vagy a kemoradioterápiás kezelés hatékonyságának értékelésére. Annak érdekében, hogy kiderítsük a szabad DNS dohányzásnak való kitettség miatti felszabadulásának lehetséges modulációt, 20, eddig még nem dohányzó, 55 év feletti életkorú személyt vizsgáltunk. Ezek átlagos (medián) DNS-értéke 0,61 ng/ml volt. Az esetkontroll vizsgálat nagyfokú kockázatnak kitett csoportján (erõs dohányosok, 50 éve feletti életkor, évi 20¹nál több dobozt elszívók) elvégzett ugyanilyen analízis 4,6 ng/ml átlagértéket mutatott ki. Ezen eredmények nagyon alacsony keringõ DNS¹t jeleznek a ki nem tett személyekben. A klinikai vizsgálatok eredményei megmutatták a keringõ DNS mennyiségi meghatározására szolgáló, találmány szerinti eljárás hatékonyságát a tüdõrák korai diagnosztizálásában a nagyfokú kockázatnak kitett személyekben, és különösen az erõs dohányosokban. Az ábrák leírása 1. ábra: A valós idejû kvantitatív PCR amplifikációs görbéi hTERT¹re NSCLC¹es betegekbõl származó plazma-DNS-ben (A) és kontrollmintákban (B). A plazma-DNS relatív mennyisége sokkal magasabb a betegekbõl származó mintákban (bal oldali görbék), mint a kontrollokban (jobb oldali görbék). A plazma-DNS mennyiségének kiszámítása olyan ciklusszámon alapul, ahol minden reakció fluoreszcenciája meghaladja az amplifikáció geometriai fázisának hátterére beállított küszöbértéket (CT). Az X tengelyen a kvantitatív PCRreakció ciklusszáma van feltüntetve. Az Y tengely a hátteret meghaladó fluoreszcenciaintenzitás logaritmusa (DRn). 2. ábra: Plazma-DNS koncentrációk dobozdiagramja NSCLC esetekben és egyeztetett kontrollokban. A doboz a 25%¹os és 75%¹os érték alatt és felett be van keretezve, a dobozban lévõ egyenes vonal a középértéket, az alsó és felsõ hibaoszlop az értékek 90%¹át jelzi. Mini=minimális kimutatott érték, max=maximális kimutatott érték, sd=standard hiba. 3. ábra: Plazma-DNS értékek alkalmazásával készített ROC görbék az NSCLC diagnosztizálására. Görbét és görbe alatti területet a SAS (Cary, NC) logisztikus eljárásának alkalmazásával becsültünk meg.
1
HU 008 248 T2
Anyagok és eljárások Eset- és kontrollsorozatok Száz egymást követõ, nem kissejtes tüdõrákos (NSCLC), kemoradioterápiával korábban nem kezelt és az Európai Onkológiai Intézet [European Institute of Oncology (IEO)] szövetbankjába 2000 és 2001 között került, 81 férfibõl és 19 nõbõl származó mintát értékeltünk. Minden esetre egy-egy – nemre, korra és dohányzási szokásra egyeztetett – kontrollt is választottunk. Az átlagos életkor (±s. d.) 65,1 (±8,9) év volt a rákos esetekben, és 64,1 (±8,2) volt a kontrollokban. Az átlagos dohányzási idõtartam a rákos esetekben 40,5 (±10,9) év, a kontrolloknál pedig 41,7 (±10,9) év volt. A populáció részét képezte 7, még eddig nem dohányzó eset-kontroll pár. Az IEO korai kimutatási programban részt vevõk között 93 erõsen dohányos kontrollt választottunk ki, akiknek a mellkasi spirális CT eredménye negatívnak bizonyult. A nem dohányzó kontrollokat egészséges véradók közül választottuk ki az intézet immunohematológiai egységében. A korábban dohányzók száma kismértékben eltért az esetek és a kontrollok között (28 eset és 11 kontroll). Egy gyenge és csak néha dohányzó esetet (naponta 5 cigarettánál kevesebb) egyeztettünk egy eddig még nem dohányzóval. Az életkort tekintve páronkénti 1 év különbség statisztikailag szignifikáns volt (p<0,02), emiatt a plazma-DNS kockázati faktorként való elemzésében szükség volt az életkor beállítására.
5
10
15
20
25
Mintagyûjtés és DNS-izolálás A spirális CT vizsgálat idõpontjában a mûtét elõtti betegektõl és kontrollokból 7,5 ml periferiális vérmintát gyûjtöttünk EDTA alkalmazásával, és a mintákat –140 °C¹on tároltuk. A plazma elválasztása és a DNSextrakció a korábban leírtak szerint történt (25). Az 1 ml plazmából tisztított DNS¹t 50 ml végtérfogatú vízben eluáltuk. A plazma-DNS tesztelése az eset/kontroll státus ismerete nélkül történt.
30
Mennyiségi DNS-meghatározás plazmában A plazmában keringõ DNS mennyiségi meghatározására az 5’¹nukleotid-eljáráson alapuló valós idejû PCR megközelítést alkalmaztuk. E módszertan progresszív fluorogén PCR optikai rendszerrel való folyamatos nyomon követésén alapul (28, 29). A PCR-rendszer két amplifikációs láncindítót és egy további, amplikonra specifikus, és fluorogén hibridizációs próbát alkalmaz, mely utóbbi célszekvenciája az amplikonon belül található. A próba két fluoreszcens festékkel van jelölve. Az egyik az 5’¹végen lévõ riporterfesték (VIC™ festék). Ennek emissziós spektrumát egy második, a 3’¹végen lévõ fluoreszcens festék (TAMRA) oltja ki („quenching”). Amplifikáció esetén az AmpliTaq© DNS-polimeráz 5’®3’ exonukleáz aktivitása a kiterjesztési fázisban lehasítja a riportert a próbáról, és így az felszabadul a kioltómolekula hatása alól. A PCR-folyamat során a riporterfesték emissziójában bekövetkezett növekedést követjük nyomon. A láncindítók és próbák az érdeklõdésre számot tartó, ubikviter (mindenütt jelen levõ) gén – az emberi
40
35
45
2
telomeráz reverz transzkriptázának (hTERT) az 5p15.33¹on térképezett egykópiás génjének – specifikus amplifikációjára lettek tervezve. A hTERT gén amplikonjának mérete 98 bp volt (a GenBankban az AF128893 elérhetõségû számú gén 13059–13156. pozíciója). A láncindítók és a próba szekvenciája az alábbi volt: elõre láncindító: 5’¹GGC ACA CGT GGC TTT TCG¹3’; vissza láncindító: 5’¹GGT GAA CCT CGT AAG TTT ATG CAA¹3’; próba: VIC5’- TCA GGA CGT CGA GTG GAC ACG GTG¹3’ TAMRA. A fluorogén PCR-eket 50 ml reakció-térfogatban egy GeneAmp© 5700 Sequence Detection System rendszeren (Applied Biosystem, Foster City, CA) végeztük. A fluorogén próbát és láncindítókat rendelésre készítette az Applied Biosystems. Az összes PCR-reakciókeverék az alábbiakból állt: 25 ml TaqMan© Universal Master Mix (Applied Biosystem); 0,67 ml próba [15 mM]; 0,45 ml elõre láncindító [10 mM]; 0,45 ml vissza láncindító [10 mM]; 18,43 ml steril víz. Minden valós idejû PCRreakcióban 5 ml DNS-oldatot alkalmaztunk. A hõciklizálást elõször egy denaturációs lépéssel (50 °C, 2 min, majd 95 °C, 10 min) indítottuk. A PCR hõprofilja: 95 °C 15 mp¹ig és 60 °C 1 percig. Ötven amplifikációs ciklus során nyert adatokat analizáltunk. Az amplifikálást 96 lyukú lemezen végeztük egy GeneAmp© 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystem) rendszeren. A lemezeken a betegekbõl származó minták (háromszoros ismétlésben) mellett negatív kontrollként több vizes blank is szerepelt. Minden lemezen a kalibrációs görbe készítéséhez standard „TaqMan Control Human Genomic DNA” DNS (Applied Biosystem) 10 ng/ml¹es oldatából megfelelõ hígítási sorozatokat készítettünk (50 ng, 5 ng, 2,5 ng, 0,5 ng, 250 pg, 50 pg és 10 pg). Minden vizsgálatban lineáris amplifikációt kaptunk le egészen a 10 pg cél-DNS-nek megfelelõ utolsó hígítási pontig (korrelációs koefficiens: 0,999–0,995; meredekség: 3,25–3,35). Az összes adatot az Applied Biosystem, Sequence Detection System szoftverének alkalmazásával analizáltuk oly módon, hogy az ismert mennyiségû DNS-sel felvett standard amplifikációs görbét az ismeretlen célminta amplifikálási CT¹jével interpoláltuk, hozzájutva ezzel a kísérleti mintában lévõ DNS relatív mennyiségéhez. Az utánkövetési vizsgálatban minden, az adott betegtõl egymást követõen gyûjtött plazmamintát szimultán analizáltunk ugyanazzal a valós idejû PCR-kísérlettel, hogy a megfigyelési idõben gyûjtött minták mennyiségileg összehasonlítók legyenek.
Patológiai és immunhisztokémiai eljárások Minden esettel kapcsolatban rendelkezésre álltak klinikopatológiai adatok. A vizsgálatban 58 adenokarcinóma, 34 pikkelyes sejtes karcinóma, 3 óriássejtes karcinóma, 3 pleomorf karcinóma, és 3 adenosquamosus 55 karcinóma szerepelt. A tüdõkarcinómák WHO besorolása szerint (31) 19 (32,6%) acináris növekedési mintázatot mutatott, 19 papilláris, 17 (29,3%) tömör és 3 (5,2%) bronchioalveoláris volt. A tüdõrák felülvizsgált stádiumbesorolási rendszere (32) szerint a daganatok stádium 60 szerinti eloszlása az alábbi volt: pT1 18%, pT2 55%, 50
4
1
HU 008 248 T2
pT3 21% és pT4 6%. A betegek 47%¹a volt pN0, 20%¹a pN1, és 32% pedig pN2 vagy N3. Az I. stádiumba 34%, a IIB¹be 25%, a IIIA¹ba 33%, és a IIIB/IVB¹be pedig 8% tartozott. Három esetben az analízist csak medasztinális nyirokcsomók metasztázisán végeztük. Minden esetben a tumornekrózis vagy limfoid beszûrõdés elõfordulását félkvantitatíven értékeltük egy skála segítségével [a skála beosztása a „hiányzik”-tól a 2+¹ig terjedt (1+, ha a teljes tumor 50%-nál kevesebb mértékû, és 2+, ha 50%-nál nagyobb)]. Immunhisztokémiai analízishez a sebészi beavatkozáskor vett, formalinnal fixált és paraffinba ágyazott mintákat vizsgáltuk sejtapoptózissal kapcsolatos (p53) és daganatnövekedési (CD-117, Ki¹67 és mikroérsûrûségi) markerekre a korábban finomított eljárás szerint (33). Minden esetet vakon, a beteg azonosságának, patológiai diagnózisának, klinikai kimenetelének vagy a plazma-DNS státusának ismerete nélkül értékeltünk. A p53¹, EGFR¹, CD117- és Ki¹67¹re immunreaktív tumorsejtek százalékos arányát az immunfestés reprezentatív mezeiben lévõ, minimálisan 1000 daganatsejt pontozásával értékeltük. Daganatneoangiogenesisre az endotél sejtek CD34¹re való immunfestõdésébõl következtettünk a korábban leírtak szerint (34). Statisztikai eljárások A DNS-értékek normalitástól eltérõ megoszlását logaritmusos transzformáció alkalmazásával csillapítottuk. Tesztelési célokra a koncentráció logaritmusát alkalmaztuk, míg a jelentésekben a nem transzformált értékeket adtuk meg. A plazma-DNS – mint az NSCLC kockázati faktora – becsléséhez az esélyarányokat [Odds ratios (OR)] és a megfelelõ 95%¹os konfidencia intervallumokat a SAS program (Cary, NC, USA) kondicionális logisztikus regressziójával számítottuk ki. Mûködés-jellemzõ görbét [receiver-operating characteristic curve (ROC)] készítettünk a plazma-DNS koncentrációk diagnosztikai teljesítményének értékelésére. Minden egyedi DNS-értéket cut-point-ként alkalmazva számítottuk ki a görbét és a görbe alatti területet (AUC) meghatározó érzékenységi és specificitási értékeket. A területre vonatkozó 95%¹os konfidencia intervallum biztosításához külön számítottunk standard hibákat a van der Schouw által leírtak (35) szerint. Rákos esetekben a DNS-koncentráció és a folyamatos klinikai és patológiai paraméterek közötti lehetséges összefüggést a paraméterek megoszlásától függõen a Pearson- (életkormegoszlás) vagy Spearmanféle korrelációs koefficiensek (az EGFR marker megoszlása) kiszámításával derítettük ki. Utánkövetési adatokkal bíró betegekben a Kruskal–Wallis-teszt alkalmazásával hasonlítottuk össze a DNS átlagos koncentrációit a plazmákban.
rázolt görbéit, rákos betegekbõl és egyeztetett kontrollokból származó minták esetében. Minden görbe a mintában lévõ cél-DNS kiindulási mennyiségének felel meg. Az amplifikációs görbék jobbra tolódtak el, ami a 5 cél-DNS csökkent mennyiségére utalva egyértelmûen elkülöníti a kontrollokat a rákos betegektõl. A betegek és egyeztetett kontrollok között a plazma-DNS koncentráció megoszlása alapján – bizonyos átfedés ellenére – két külön populáció különíthetõ el (2. ábra). 10 A betegeknél a koncentráció középértéke (24,3 ng/ml) csaknem nyolcszor magasabb, mint a kontrolloknál kimutatott érték (3,1 ng/ml). Nagyon magas koncentrációkat csak a betegeknél figyeltünk meg, míg a megoszlás másik végén volt néhány nagyon alacsony 15 DNS-koncentráció (például 0,5 ng/ml). A betegeknél a keringõ DNS¹t illetõen nagyobb variabilitást figyeltünk meg, mint a kontrolloknál (lásd 2. ábra). Plazma-DNS koncentráció, mint az NSCLC kockázati tényezõje Ha a keringõ plazma-DNS koncentrációja magasabb, akkor az NSCLC kockázata is nagyobb. A harmadolásos rétegzés kimutatta, hogy a kockázat exponenciálisan nõ, ha kondicionális logisztikus regresszió25 val összehasonlítjuk a második és harmadik rétegbe sorolt plazmakoncentrációjú személyeket az elsõ rétegben levõkkel (akár 85¹szörös növekedés, 1. táblázat). Folyamatosként elemezve, a plazma-DNS egy egységnyi növekedésével (ng/ml) 21%-kal nõ az 30 NSCLC kockázata (OR=1,21, 95% konfidenciaintervallum=1,11, 1,31). Betegség esetén a keringõ DNS koncentrációja és az életkor között összefüggést találtunk (a plazmakoncentráció logaritmusával végzett regresszió esetén az életkor együtthatója=0,029, standard 35 hiba=0,013, p=0,026). A plazma-DNS szintjei és a dohányzás erõssége vagy idõtartama között nem találtunk összefüggést. 20
A kvantitatív valós idejû PCR-vizsgálat diagnosztikai teljesítménye A 3. ábrán bemutatott ROC görbe alatti terület 0,94 volt (95%¹os konfidenciaintervallum: 0,907–0,973), ami a molekuláris vizsgálat erõs diszkriminációs teljesítményét sugallja. A 2. táblázatban bemutatunk néhányat 45 azokból a DNS-koncentrációs levágási pontokból, amelyeket az azok érzékenységét, specificitását, pozitív elõrejelzési értékét és negatív elõrejelzési értékét ábrázoló görbe elõállítására alkalmaztunk. A becslési értékek körüli 95%¹os konfidenciaintervallum átfedésben volt a 2. 50 táblázatban bemutatott egymást követõ koncentrációk között, a két utolsó koncentráció (20 és 25 ng/ml) kivételével. 40
A plazma-DNS szintek korrelációja klinikopatológiai sajátságokkal A vizsgált morfológiai és immunhisztokémiai markerek közül szignifikáns összefüggést találtunk az EGFR expresszióval és a mikroerek sûrûségével (3. táblázat). A Ki67 proliferációs marker a plazma-DNS 60 növekvõ koncentrációjával párhuzamosan nõtt, bár a 55
Eredmények A plazmában keringõ DNS mennyiségi analízise rákos betegekben és kontrollokban Az 1. ábrán mutatjuk be az amplifikáció fluoreszcenciaintenzitásának PCR-ciklusok függvényében áb-
2
5
1
HU 008 248 T2
korreláció statisztikailag nem volt szignifikáns (p=0,15). Az életkor volt az egyetlen olyan klinikai paraméter, amely szignifikánsan összefüggött a DNS-felszabadulással a plazmában. Nem figyeltünk meg összefüggést a plazma-DNS szintek és a nekrózis, limfoid beszûrõdés vagy növekedési mintázat között. A plazma-DNS szintek változása az utánkövetés során A 100 rákos betegbõl 35¹öt még az I–II. stádiumú daganat sebészi eltávolítása elõtt értékeltünk a plazmaDNS mennyiségeire nézve, majd a mûtét után 3–15 hó-
2
nappal (az eltelt idõ középértéke 8 hónap) egy második plazmamintát vettünk tõlük és analizáltunk a klinikai utánkövetés során a DNS-szintek változására. Az utánkövetéskor gyûjtött plazmamintákban általánosan a 5 DNS-koncentrációk középértéke 8,4 ng/ml volt, ami egyértelmû csökkenési trendet mutat a 24,5 ng/ml¹es átlagos alapszinthez képest (p<.0001). Ha e betegeket klinikai státusuk szerint hasonlítjuk össze, utánkövetéskor az átlagos DNS-koncentráció szignifikánsan alacso10 nyabb volt a betegségtõl mentes 30 személyben a visszaesést mutató 5 rákos beteghez képest (7,1 ng/ml vs. 24,7 ng/ml; p=0,002).
1. táblázat Plazma-DNS koncentráció, mint az NSCLC kockázati tényezõje Kontrollok N=100
Kontrollok N=100
Odds Ratio Feltételes*
95% CI¹
DNS-harmadok megoszlása (ng/ml) †
<=4
4
62
1‡
4,1–20
27
36
5,5
(1,9–16,3)
>20
69
2
85,5
(16,5–445)
* Életkorhoz igazítva † Betegeknél és kontrolloknál mért plazma-DNS értékek egyesített („pooled”) megoszlásából származik ‡ Referenciacsoport
2. táblázat A plazma-DNS koncentráció szûrési teljesítménye Cut-point
Érzékenység
95% CI†
Specificitás
95% CI†
PPV
NPV
4
97
91,5–99,4
60
49,7–69,7
71
95
7
92
84,8–96,5
77
67,5–84,8
80
91
10
88
80,0–93,6
86
77,6–92,1
88
88
15
78
68,6–85,7
95
88,7–98,4
94
81
20
69
58,9–77,9
98
93,0–99,8
97
76
25
79
35,9–56,3
99
94,5–100
98
65
PPV=pozitív elõrejelzési érték, NPV=negatív elõrejelzési érték A „cut-pointnál” alacsonyabb ellentétes koncentrációk vs. a specifikált értékkel azonos vagy annál magasabb koncentrációk † Az érzékenységi és specificitási becsléseket binominális paraméterként kezelve számítottuk ki a 95%¹os konfidenciaintervallumokat [Statxact program (Cambridge, MA)]
3. táblázat A plazma-DNS szintek korrelációja klinikopatológiai paraméterekkel Log (DNS-koncentráció)
Életkor
Dohányzás ideje (évek)
Log MVD
Ki67
Egfr
Koefficiens*
0,22
0,04
0,25
0,15
0,2†
p-érték
0,026
0,71
0,016
0,15
0,044
n‡
100
93
97
97
97
* Pearson-féle korrelációs koefficiens † Spearman-féle korrelációs koefficiens ‡ A mintaméretet 93 dohányzó kontrollra (jelenleg is vagy régebben) és primer rákos mintát adott 97 kontrollra csökkentettük
6
1
HU 008 248 T2
2
Szekvencialista <110> ISTITUTO NAZIONALE PER LO STUDIO E LA CURA DEI TUMORI <120> METHOD FOR THE DETECTION OF CANCER <130> 6798MEUR <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1
ggcacacgtg gcttttcg
18
<210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2
ggtgaacctc gtaagtttat gcaa
24
<210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3
tcaggacgtc gagtggacac ggtg SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás teljes keringõ plazma-DNS koncentrációjának meghatározására rákos betegtõl, rákra fogékony személytõl vagy rák kifejlõdése kockázatának kitett személytõl vett plazmamintában, amely eljárás az alábbiakat tartalmazza: 1) a DNS kivonását a plazmamintából; 2) a DNS-készítményhez a következõk hozzáadását PCR-reakció kivitelezésére alkalmas körülmények között, amely temperálás során illeszkedni képes: a) az emberi telomeráz reverz transzkriptázát (hTERT) kódoló gén fragmentumának specifikus PCR-amplifikálására alkalmas oligonukleotid-láncindítók keveréke, és b) oligonukleotidpróba, amely a 3’¹ és 5’¹végein legalább egy kioltó és egy riporter fluorofórt tartalmaz, a láncindítók által behatárolt régión belüli szekvenciával, 3) 5’¹3’ exonukleáz aktivitású, hõstabil DNS-polimeráz hozzáadása, és a hTERT génfragmentum amplifikálása; 4) a képzõdött fluoreszcencia mérése. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, amelyben a tesztmintában a DNS-koncentráció meghatározása ismert DNS-mennyiségekkel számított kalibrációs görbe interpolálásával történik. 3. Az 1–2. igénypontok bármelyike szerint igényelt eljárás, amely tartalmazza továbbá a keringõ DNS kon-
24 30
35
40
45
50
55
7
centrációjának összehasonlítását referenciakoncentrációval. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, amelyben a referenciakoncentráció 9–25 ng/ml. 5. Az 1. igénypontban igényelt eljárás, amelyben az emberi telomeráz reverz transzkriptázát (hTERT) kódoló gén fragmentuma az AF128893 GenBank hozzáférési számú szekvencia 13059–13156. nukleotidjai. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, amelyben az emberi telomeráz reverz transzkriptázát (hTERT) kódoló gén fragmentumának amplifikálása a SEQ ID No. 1 szerinti „elõre” láncindító, a SEQ ID No. 2 szerinti „vissza” láncindító és a SEQ ID No. 3 szerinti próba alkalmazásával történik. 7. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerint igényelt eljárás rákos betegek korai diagnosztizálására, elõrejelzésére és klinikai nyomon követésére. 8. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerint igényelt eljárás rák kifejlõdése kockázatának értékelésére egészséges egyedekben vagy rákos megbetegedésre ismert érzékenységet mutató egyedekben. 9. A 8. igénypont szerint igényelt eljárás rákos megbetegedés kockázatának értékelésére dohányzókban. 10. Az 1. igénypont szerint igényelt eljárás, amelyben a rák tüdõrák, vastag- és végbélrák, fej- és nyakrák, májrák vagy hasnyálmirigyrák. 11. A 10. igénypont szerint igényelt eljárás, amelyben a rák tüdõkarcinóma.
HU 008 248 T2 Int. Cl.: C12Q 1/68
8
HU 008 248 T2 Int. Cl.: C12Q 1/68
9
HU 008 248 T2 Int. Cl.: C12Q 1/68
Kiadja a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
