!HU000007943T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 943
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C07K 14/34
(21) Magyar ügyszám: E 06 723804 (22) A bejelentés napja: 2006. 03. 21. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20060723804 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1861420 A1 2006. 09. 28. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1861420 B1 2009. 11. 25.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 0505996 2005. 03. 23.
(73) Jogosult: GlaxoSmithKline Biologicals SA, 1330 Rixensart (BE)
GB
(72) Feltalálók: DEHOTTAY, Phillippe, Marc, Helene, B-1330 Rixensart (BE); DESSOY, Sandrine, B-1330 Rixensart (BE); LALOUX, Olivier, Marc, Serge, Ghislain, B-1330 Rixensart (BE); ORVAL, Marc, Roger, Fernand, B-1330 Rixensart (BE) (54)
(2006.01) C12N 1/20 (2006.01) C12N 15/77 (2006.01) C12P 21/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06100108 PCT/EP 06/002835
(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Fermentációs eljárás diftériatoxin elõállítására
(57) Kivonat
HU 007 943 T2
A találmány tárgyát fermentációs eljárás képezi, amely magában foglal egy fermentációs lépést, melynek során egy Corynebacterium diphtheriae törzset fermentorban, tápközegben, homogén tenyészet fenntartásá-
hoz elégséges keverési feltételek között és korlátozott levegõztetéssel tenyésztenek, oly módon, hogy a tenyészeten belül a pO2 a fermentációs lépés nagyobb részében 4%¹nál kisebb értékre csökkenjen.
A leírás terjedelme 20 oldal (ezen belül 6 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 943 T2
A jelen találmány tárgyköre a diftériaantigének területe. Közelebbrõl, a találmány tárgyát toxinok (beleértve a diftériatoxin mutáns alakjait, mint például a CRM197¹et) és ilyen antigének nagy volumenû tenyészeteinek elõállítására szolgáló fermentációs eljárások képezik. A diftériatoxin egy exotoxinfehérje, amelyet a Corynebacterium diphtheria nevû baktérium termel. A diftériatoxin egy részbõl álló polipeptidként termelõdik, amely a 190., 192. vagy 193. aminosavnál bekövetkezõ hasítás eredményeként könnyen két – egymáshoz diszulfidkötéssel kapcsolódó – alegységgé (A és B¹fragmens) alakulhat [lásd Moskaug és munkatársai: Biol. Chem. 264, 15709–15713 (1989)]. Az A¹fragmens a katalitikusan aktív rész; ez egy NAD-dependens ADP-riboziltranszferáz, amely specifikusan az EF–2 proteinszintézis-faktort célozza meg, inaktiválva ezáltal az EF¹2¹t, ami a sejtben a fehérjeszintézis leállását eredményezi. A bakteriális toxinok (mint például a diftériatoxin) elleni immunitás természetes módon fertõzés következményeként szerezhetõ, illetve mesterségesen a toxin detoxifikált alakjának (toxoid) injektálásával alakítható ki [Germanier, er, Bacterial Vaccines, Academic Press, Orlando, Fl., (1984)]. A toxoidokat hagyományosan a natív toxinok kémiai módosításával állítják elõ [lásd Lingood és munkatársai: Brit. J. Exp. Path. 44, 177 (1963)], ami megszünteti toxicitásukat, miközben megmarad antigenitásuk, ami a vakcinált állatot megvédi a természetes toxinnal bekövetkezõ késõbbi találkozás következményeitõl. Alternatív módon, több mutagenizált – s ezáltal csökkentett toxicitással bíró – diftériatoxint is leírtak (US4709017, US4950740). A CRM197 a diftériatoxin egy nem toxikus alakja, amely immunológiailag megkülönböztethetetlen a diftériatoxintól. A CRM197¹et – toxinogén Corynephage¹b nitrozo-guanidin mutagenezisével létrehozott nem toxinogén „b197tox¹” fággal fertõzött – C. diphtheriae termeli [Uchida és munkatársai: Nature New Biology (1971) 233, 8–11]. A CRM197-protein molekulatömege azonos a diftériatoxinéval, de szerkezeti génjében egy báziscserét hordoz, ami az 52. pozícióban glicin®glutamin helyettesítést eredményez, ami az A¹fragmenst képtelenné teszi a NAD megkötésére, miáltal elveszíti toxicitását [Pappenheimer: Ann. Rev. Biochem. 46, 69–94 (1977); Rappuoli Applied and Environmental Microbiology, 560–564. oldal (1983. szept.)]. A diftériatoxoid és a csökkent toxicitású CRM197mutáns sok, Corynebacterium diphtheriae ellen immunitást biztosító vakcina komponenseként szerepel. Több kombinált vakcina ismeretes, amelyek képesek a Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, és, adott esetben, Hepatitis B vírus és/vagy Haemophilus influenzae b¹típus okozta fertõzések megelõzésére (lásd például: WO 93/24148 és WO 97/00697, WO 02/055105). A diftériatoxint és mutáns alakjait (beleértve a CRM197¹et) vakcinákban szacharidok biztonságos és hatékony T¹sejt-dependens hordozóiként is alkalmazzák. A CRM197¹et jelenleg a Haemophilus influenzae
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
b¹típus elleni oligoszacharid-CRM197 konjugált vakcinában alkalmazzák (HibTitre®; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N. Y.). A diftériatoxoid (DT) elõállítási eljárásai a szakirodalomból jól ismertek. Például a diftériatoxoid elõállítható Corynebacterium diphtheriae tenyészetébõl származó toxin tisztításával, majd kémiai detoxifikálásával, vagy a toxin rekombináns vagy genetikailag detoxifikált analógjának tisztításával (például a CRM197 vagy egyéb mutánsok, melyek leírását illetõen lásd az US 4 709 017 US 5 843 711 US 5 601 827 és US 5 917 017 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat). A Corynebacterium diphtheriae-t aerob körülmények között tenyésztik. Rappuoli és munkatársai (Biotechnology, 161–163., 1985. február) felvetették, hogy a pO2¹t – levegõ és oxigén keverékével végzett szellõztetéssel – 25%¹ra kell beállítani, és az elegy a kívánt pO2-érték fenntartásának megfelelõen automatikusan szabályozható. A vakcinákban alkalmazható diftériatoxinok (például CRM197) jelentõs mennyiségben történõ elõállítását hátráltatta a protein csekély elõfordulási gyakorisága. Ezt a problémát korábban a diftériatoxint vagy mutáns alakját kódoló gén további kópiáinak Corynebacterium diphtheriae-be történõ bejuttatásával próbálták megoldani (lásd a 4 925 792 és 5 614 382 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat). Az ilyen eljárások a protein termelõdésének körülbelül háromszoros növekedését eredményezik. A diftériatoxin hozamának további javítását eredményezõ eljárások elõnyösek lennének ezen értékes antigének nagyobb mennyiségben történõ termelõdésének biztosításához. Ennek megfelelõen, a találmány értelmében feltárunk egy javított fermentációs eljárást, amely magában foglal egy fermentációs lépést, melynek során egy Corynebacterium diphtheriae törzset fermentorban, tápközegben, homogén tenyészet fenntartásához elégséges keverési feltételek között és korlátozott levegõztetéssel tenyésztünk, oly módon, hogy a tenyészetben a pO2érték a fermentációs lépés nagyobb részében 4% alá csökkenjen. A fermentáció aerob, de korlátozott levegõztetési feltételekkel megy végbe, oly módon, hogy az oxigén a fermentáció nagyobb része során, amint bejut a tenyészetbe, azonnal felhasználásra kerül, azaz a kiindulási fázist követõen, amelyben a C. diphtheriae sûrûsége viszonylag kicsi, és a pO2-szint nagyobb lehet. Azt találtuk, hogy az ilyen feltételek között végzett tenyésztés – a nagyobb pO2-értékeknél végzett fermentációs eljárásokhoz viszonyítva – a diftériatoxin vagy mutáns alakja hatékonyabb és/vagy egyenletesebb expresszálódását eredményezi. A találmány szerinti eljárás nagyobb teljesítményû, mint a nagyobb oxigénmennyiséggel végzett fermentáció, és még akkor is nagyobb diftériatoxin-hozamot biztosít, ha a tenyésztõ tápközeg hozzáadott vasat tartalmaz vagy ha változó minõségû komplex nyersanyagokat alkalmazunk. A találmány egy másik szempontjának megfelelõen, eljárást tárunk fel diftériatoxint vagy mutáns alakját tartalmazó készítmény elõállítására, mely eljárás magá-
1
HU 007 943 T2
ban foglalja a találmány szerinti fermentációs eljárás végrehajtását és a diftériatoxin vagy mutáns változata izolálását a tenyészetbõl. Bár a találmány értelmében diftériatoxint és mutáns alakjait írjuk le, úgy véljük, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmazásával bármely Corynebacterium diphtheriae antigén izolálható. A találmány szerinti eljárás a diftériatoxin vagy mutáns változata (például a CRM197) nagyobb hozamát eredményezi, mint az 5% vagy nagyobb (például 20%) pO2-érték fenntartásával végzett eljárások. A találmány egy következõk szempontjának megfelelõen, diftériatoxin vagy mutáns változata alkalmazását tárjuk fel bakteriális betegség (különösen Corynebacterium diphtheriae okozta betegség) kezelésére vagy megelõzésére való gyógyszer elõállítására. A találmány egy további szempontjának megfelelõen, eljárást tárunk fel bakteriális fertõzés (különösen Corynebacterium diphtheriae fertõzés) megelõzésére vagy kezelésére, mely eljárás a találmány szerinti gyógyászati készítmény páciensnek történõ adagolását foglalja magában. Az ábrák leírása Az 1. ábrán grafikonon mutatjuk be az oxigenizálási profilt és annak alkalmazását egy fermentáció KLa-értékének meghatározására. Az „A” panelen az oxigenizálás (nitrogénrõl levegõre történõ váltást követõ) idõbeli lefutása látható. A „B” panelen ln(100–pO2) vs. idõ grafikon látható, amely a görbe gradiensének meghatározásával lehetõvé teszi a KLa kiértékelését. A 2. ábrán a Corynebacterium diphtheriae fermentációs eljárásának vázlatát mutatjuk be. A 3. ábrán a Corynebacterium diphtheriae tenyészet jellemzõ kinetikáit szemléltetõ grafikon látható. A kör alakú pontokkal jelölt görbe a tenyésztés különbözõ idõpontjaiban 650 nm¹nél mért OD¹értékeket ábrázolja. A rombusz alakú pontokkal jelölt görbe a tenyészet pH¹ját mutatja. A 4. ábrán a tenyészeti felülúszók SDS-PAGE-géljeit mutatjuk be. Sávok: 1. sáv: molekulatömeg-markerek; 2. sáv: 1 mg CRM197 standard; 3. sáv: 0,5 mg CRM197 standard; 4. sáv: 0,25 mg CRM197 standard; 5–11. sáv: Corynebacterium diphtheriae fermentálásokból származó felülúszók. Az „A” gélen az 5. sávban CDT082-bõl származó felülúszó; a 6–8. sávokban CDT198-ból származó felülúszók (a 6. sávban 22,5 órás fermentálás után, a 7. sávban 24 órás fermentálás után, a 8. sávban pedig 28 órás fermentálás után eltávolított felülúszó); a 9., 10. és 11. sávban CDT199-bõl származó felülúszó (9. sávban 22 óra 45 perces fermentálás után, a 10. sávban 24 óra 45 perces fermentálás után, a 11. sávban pedig mikroszûrés és szûrés után kapott felülúszó) látható. A „B” gélen az 5. sávban
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
CDT082-bõl származó felülúszó, a 6–9. sávokban CDT205-bõl származó felülúszók (a 7. sávban 21 óra 43 perces fermentálás után, a 8. sávban 23 órás fermentálás után, a 9. sávban 24 órás fermentálás után eltávolított felülúszó), és a 10–13. sávban CDT206-ból származó felülúszók (a 10. sávban 22 óra 10 perces fermentálás után, a 11. sávban 23 óra 49 perces fermentálás után, a 12. sávban 24 óra 30 perces fermentálás után, a 13. sávban pedig mikroszûrés és szûrés után kapott felülúszó) látható. Az 5. ábrán grafikonon mutatjuk be egy 150 literes fermentor – különbözõ keverési sebességek mellett, percenként 23 literes levegõztetéssel kapott – KLa-értékét. A találmány részletes leírása Ahogy a találmány leírásában használjuk, a „tartalmazó” és „tartalmaz” kifejezések, minden esetben, opcionálisan helyettesíthetõk a „valamibõl álló”, illetve „valamibõl áll” kifejezésekkel. A találmány egyik szempontjának megfelelõen egy fermentációs eljárást tárunk fel, amely magában foglal egy fermentációs lépést, melynek során egy Corynebacterium diphtheriae törzset fermentorban, tápközegben, homogén tenyészet fenntartásához elégséges (például 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 vagy 1 másodpercnél rövidebb elegyítési idõ eléréshez elégséges) keverési feltételek között és korlátozott levegõztetéssel tenyésztünk, oly módon, hogy a tenyészeten belül a pO2 a fermentációs lépés nagyobb részében 5%, 4%, 3%, 1% vagy 0,5% alá csökkenjen. Az egyik elõnyös megvalósítási mód szerint a pO2 nulla közelébe csökken, elõnyösen a fermentációs lépés nagyobb részében. Például a tenyészeten belül a pO2 – attól az idõponttól kezdõdõen, amikor a Corynebacterium diphtheriae olyan sejtsûrûségre szaporodott, amely elégséges ahhoz, hogy az oxigén legnagyobb részét (annak tenyészetbe történõ bejutását követõen) azonnal elfogyasszák – 5%, 4%, 3%, 1% vagy 0,5% alá csökken, a fermentáció azon pontjáig, amikor a pO2-koncentráció – a fermentációs lépés végéhez közeledve – ismét emelkedni kezd (például a latens fázis után 16, 18, 20, 22 vagy 24 órával). A fermentáció jellemzõen akkor ér véget, és a tenyészetet akkor takarítjuk be, amikor a pO2 a korlátozott levegõztetési feltételeknek megfelelõ szint fölé emelkedik. Meg kell jegyezni, hogy eltérõ beoltási feltételek alkalmazásakor (például, ha a fermentort sokkal nagyobb Corynebacterium diphtheriae tenyészettel oltjuk be) a korlátozott levegõztetési feltételek már röviddel a fermentáció megkezdése után érvényesek (például, a fermentáció megkezdése után 1, 5, 10, 20, 30, 40 vagy 60 perccel). A 100% pO2 az az oxigénmennyiség, amely akkor van jelen, ha sûrített levegõ tápközegen keresztül végzett buborékoltatását követõen a tápközeg 34,5 °C¹on,
1
HU 007 943 T2
0,5 bar nyomáson (tenyésztés nélkül) oxigénnel telítetté válik. 150 literes fermentor esetén a levegõztetést sebességet 23 liter/perc értékre, a keverési sebességet pedig 240¹es percenkénti fordulatszámra kell állítani, míg 20 literes fermentorban ezek az értékek a következõk: levegõztetési sebesség 3 liter/perc, keverési sebesség 300 fordulat/perc. Ezek az értékek a teljesen átlevegõztetett fermentációs tápközegben a beoltás elõtt jelen lévõ oxigénmennyiségként állíthatók be. Egy homogén tenyészet olyan tenyészet, amelyben a baktériumok az egész fermentáló tartályban egyenletesen oszlanak el, oly módon, hogy a baktériumok legalább 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10 százaléka a tenyésztõ tápközeg felsõ 10%-ában helyezkedik el. A fermentációs lépést olyan lépésként definiáljuk, melynek során Corynebacterium diphtheriae-t fermentorban tenyésztünk. A fermentációs lépés az elõtenyészet fermentorba történõ betáplálásával kezdõdik és akkor ér véget, ha a pO2 (a fentebb leírt levegõztetési feltételek között) végül 10% fölé nõ. A fermentációs lépés jellemzõen 12, 14, 16, 18, 20 vagy 24 óránál hosszabb ideig, például, 16–40 óra hosszat vagy például 22–28 óra hosszat tart. A keverést, adott esetben, a tenyészet fermentorban történõ keverésével végezzük, ami bármely egyéb megfelelõ módon is végrehajtható, például, vibrációs keverõvel és/vagy gázbuborékoltatással. A keverésnek elégségesnek kell lennie ahhoz, hogy a tenyészet elegyítési ideje 20, 15, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 vagy 1 másodpercnél rövidebb legyen. Egy tenyészet elegyítési ideje üveg fermentorban mérhetõ. Ez az az idõ, amely egy színes vizes oldat betáplálását követõen ahhoz szükséges, hogy a színes vizes oldatot egyenletesen eloszlassuk a tenyésztõ tápközegben. A fermentor baktériumtenyészetek ipari elõállítására alkalmas, tetszõleges berendezés. Mindazonáltal, ez a kifejezés nem foglalja magában a tenyésztõlombikokat, melyeket jellemzõen a baktériumok kisebb léptékben történõ tenyésztésére alkalmaznak. A „fermentációs lépés nagyobb része” kifejezés a fermentációs lépés teljes idõtartamának 50%-ánál, 60%-ánál, 70%-ánál, 80%-ánál vagy 90%-ánál hosszabb idõt jelent. A fermentációt jellemzõen 12, 14, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 vagy 28 órán át korlátozott levegõztetési feltételek között végezzük. A „korlátozott levegõztetés” olyan levegõztetési feltételekre vonatkozik, amelyek a Corynebacterium diphtheriae számára aerob légzést tesznek lehetõvé, de úgy korlátozzák a hozzáférhetõ oxigén mennyiségét, hogy – miután a tenyészet sûrûsége megnövekedett (például legalább 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10 órás fermentációt követõen) – az oxigén a tenyészetbe történõ bejutás után nagyon rövid idõ alatt annyira elfogy, hogy a pO2 kevesebb mint 5, 4, 3, 2, 1 vagy 0,5% lesz. Tudni kell, hogy a fermentor beoltására alkalmazott tenyészet mennyiségének növelésével a korlátozott levegõztetési feltételek a beoltás után nagyon rövid idõvel elérhetõk (például a fermentáció megkezdése után 1, 5, 10, 20 vagy 30 perccel).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
Az ilyen korlátozott levegõztetési feltételek a toxin (például diftériatoxin vagy mutáns alakja) erõteljes expresszióját eredményezik. A nulla százalékot megközelítõ pO2-érték olyan levegõztetési és keverési sebességgel érhetõ el, amelynek eredményeként a tenyészetbe bejuttatott oxigént nem sokkal bejuttatása után a tenyészet respirációhoz felhasználja, így a tenyészet levegõztetése ellenére a pO2-érték oxigénmonitoron nulla, vagy nullához közeli értékként olvasható le. A fermentációs lépés során, adott keverési és levegõztetési sebesség mellett a pO2 magasabb értékrõl indul. Ennek oka, hogy a tenyészetben a baktériumok sûrûsége a fermentációs lépés kezdetén alacsony, és a fermentációs lépés elõrehaladása során növekszik. Általában bizonyos idõre (például legfeljebb 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10 órára) van szükség, mielõtt a pO2 5% alá csökken. Ettõl a ponttól kezdve a pO2 5%, 4%, 3%, 2%, 1% vagy 0,5% alatt (elõnyösen nullát megközelítõ értéken) marad, egészen a fermentációs lépés befejezéséig (például a fermentor betakarításáig). A fermentációs lépést, adott esetben, úgy hajtjuk végre, hogy a KLa az egész fermentációs lépés során állandó marad. Más módon, a fermentációs lépést egy vagy több KLa-értéken végezzük, oly módon, hogy a korlátozott levegõztetést a fermentáció nagyobb részében (legalább 50%-ában, 60%-ában, 70%-ában, 80%ában, 90%-ában, 95%-ában) jellemzõ KLa-értékeken valósítjuk meg. A KLa az oxigéntenyészetbe való bejuttatási sebességének mérõszáma. Minél nagyobb a KLa, annál nagyobb az oxigén bejuttatási sebessége. Egy adott fermentációs lépés KLa-értékét több tényezõ is befolyásolja, beleértve a tápközeg térfogatát és összetételét, a keverést, levegõztetést, nyomást, hõmérsékletet, valamint a fermentor mozgó részeinek pozícióját és tulajdonságait. Az oxigént jellemzõen sûrített levegõ tenyészeten keresztüli buborékoltatásával juttatjuk a fermentációs tenyészetbe. Ha a tenyészetbe juttatott levegõben az oxigén eltérõ koncentrációkban van jelen, az áramlási sebességet ennek figyelembevételével kell beállítani. Például, ha a tenyészetbe 100%¹os oxigént juttatunk be, az áramlási sebesség, ennek megfelelõen, kisebb lehet, míg a levegõnél kisebb mennyiségû oxigént tartalmazó gáz bejuttatása esetén nagyobb áramlási sebesség alkalmazható. A KLa az 1. példában leírt eljárás alkalmazásával mérhetõ. Az eljárás során a fermentort beállítjuk azokra az üzemi feltételekre (tápközeg térfogata, hõmérséklet, nyomás, keverés és levegõztetés), amelyeknél a KLa¹t mérni kívánjuk, majd a fermentort nitrogéngázzal kiöblítve légtelenítjük, a levegõztetés visszaállításával levegõvel töltjük fel, és mérjük azt a sebességet, amelynél a pO2 egyensúlyi szintre tér vissza. ln(100–pO2)=–KLaT+C Az ln(100–pO2) idõ függvényében történõ ábrázolásával a görbe meredeksége (vagy iránytényezõje)–KLa.
1
HU 007 943 T2
Egy fermentációs lépés KLa-értékét számos tényezõ befolyásolja, beleértve a tenyészet keverésének intenzitását és levegõztetésének sebességét. Például a tenyészet keverésének csökkentésével és a levegõztetési sebesség növelésével (vagy fordítva) állandó KLaérték tartható fenn. Mindazonáltal, az egyik megvalósítási mód szerint, a fermentációs lépés során a tenyészet keverési sebessége és levegõztetési sebessége egyaránt állandó. A fermentációs lépést, például, 10–200 óra –1 , 10–150 óra–1, 10–100 óra–1, 10–80 óra–1, 10–50 óra–1, 10–40 óra–1, 10–30 óra–1, 20–150 óra–1, 20–100 óra–1, 20–50 óra–1, 20–60 óra–1, 20–80 óra–1, 20–30 óra–1, 20–40 óra–1, 30–60 óra–1, 60–80 óra–1, 60–150 óra–1 vagy 60–200 óra–1 KLa-értéken hajtjuk végre. A találmány szerinti fermentációs eljárás KLa-értéke, a fermentációs tenyészet méretétõl függõen, eltérõ lehet. 10–30 literes tenyészetek esetében 10–30 óra–1, 15–30 óra–1, 20–30 óra–1 vagy 22–28 óra–1 KLa alkalmazható. 30–250 literes tenyészetek esetében 30–60 vagy 40–50 óra–1 KLa-érték alkalmazható. 250–800 literes tenyészetekben 30–50, 40–50, 40–60, 30–60, 30–80 vagy 60–150 óra–1 LKa-érték alkalmazható, míg 800–3000 literes tenyészetek esetében a KLa 30–50, 40–50, 40–60, 30–60, 30–80, 60–150 vagy 60–200 óra–1 lehet. 10–30 literes fermentációs tenyészet esetében a 10–30 óra–1 KLa-érték, például, 1–5 liter/perc levegõáramlási vagy levegõztetési sebesség és 200–400 fordulat/perc keverési sebesség (például, 2–4 liter/perc levegõztetési sebesség és 250–350 fordulat/perc keverési sebesség) alkalmazásával érhetõ el. 30–250 literes fermentációs tenyészetnél a 30–60 óra–1 KLa-érték, például, 15–25 liter/perc levegõáramlási sebesség és 150–250 fordulat/perc keverési sebesség (például 20–25 liter/perc levegõáramlási sebesség és 200–250 fordulat/perc keverési sebesség, például, 15–20 liter/perc levegõáramlási sebesség és 200–250 fordulat/perc keverési sebesség) alkalmazásával érhetõ el. A fermentációs lépés során a Corynebacterium diphtheriae CY¹tápközegben készített tenyészetének pH¹ja a tenyészet levegõztetési és keverési feltételeitõl függ [lásd Nikolajewski és munkatársai: J. Biological Standardization, 10, 109–114 (1982)]. A fermentációs lépés megkezdésekor a CY¹tápközeg pH¹ja 7,4. Alacsony szintû levegõztetés vagy KLa-érték esetén a pH=5 körüli értékre csökken, míg nagy levegõztetésnél a pH=8,5 körüli értékre nõ. A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a C. diphtheriae-t CY¹tápközegben vagy SOC-tápközegben [Sambrook J. és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)] vagy hasonló tápközegben tenyésztjük. A fermentorban a pH¹t a levegõztetés mértékének beállításával (adott esetben sav vagy bázis hozzáadásának igénye nélkül) 7,0 és 7,8 közötti értéken tarthatjuk. A találmány szerinti eljárás bármely Corynebacterium diphtheriae törzs esetében alkalmazható. Az ilyen
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
törzsek termelhetnek vad típusú diftériatoxint, továbbá diftériatoxint vagy fragmensét magukban foglaló fúziós proteineket (például az US 5 863 891 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban feltártakat) vagy a diftériatoxin mutáns alakjait vagy fragmenseit (elõnyösen olyanokat, amelyek csökkentett toxicitásúak). Az ilyen mutáns toxinok példái közé tartoznak a következõk: CRM176, CRM 197, CRM228, CRM45 [Uchida és munkatársai: J. Biol. Chem. 218, 3838–3844 (1973)]; CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 és CRM107, valamint egyéb, Nicholls és Youle által leírt mutációk [lásd „Geneticaly Engineered Toxins”, szerk.: Frankel, Marcel Dekker Inc, (1992)]; a Glu148 deléciója vagy Asp¹t, Gln¹t vagy Ser¹t eredményezõ mutációja deléciója és/vagy az Ala158 Gly¹t eredményezõ mutációja és az US 4709017 vagy US 4950740 számú iratokban feltárt mutációk; továbbá a következõk közül legalább egy vagy több aminosavat érintõ mutáció: Lys516, Lys526, Phe530 és/vagy Lys534, és az US 5917017 vagy US 6455673 számú iratokban feltárt mutációk; vagy az US 5843711 számú iratban feltárt fragmens. A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a Corynebacterium diphtheriae törzs CRM197¹et termel. A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a találmány szerinti eljárásokban a következõ Corynebacterium diphtheriae törzseket alkalmazzuk: ATCC39255, ATCC39526, ATCC11049, ATCC11050, ATCC11051, ATCC11951, ATCC11952, ATCC13812, ATCC14779, ATCC19409, ATCC27010, ATCC27011, ATCC27012, ATCC296, ATCC43145, ATCC51280 vagy ATCC51696. A találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazható tápközeg a következõ összetevõk közül egyet vagy többet tartalmazhat: 5–20 g/L, 10–16 g/L vagy 10 g/L kazaminosavak vagy kazein-hidrolizátum; 5–20 g/L, 7–15 g/L vagy 9–12 g/L szójapepton és/vagy 10–40 g/L, 14–32 g/L vagy 18–22 g/L élesztõkivonat. Ismert, hogy a tenyésztõ tápközeg vastartalma befolyásolhatja a Corynebacterium diphtheriae szaporodását és a toxintermelést (lásd a WO 00/50449 számú nemzetközi közzétételi iratot). A vas nélkülözhetetlen a baktériumok szaporodásához, azonban kimutatták, hogy nagy koncentrációban gátolja a toxintermelõdést. A találmány szerinti eljárás során a tápközeg vastartalmának alsó szintje 10, 50, 75, 100, 120 vagy 150 ppb, és felsõ határértéke 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 vagy 5000 ppb. Például a tápközeg vaskoncentrációi a következõk: 50–1000 ppb, 100–1000 ppb, 200–1000 ppb, 400–1000 ppb, 500–1500 ppb, 700–1300 ppb, 50–2000 ppb, 100–2000 ppb, 200–2000 ppb, 400–2000 ppb, 700–2000 ppb, 50–3000 ppb, 100–3000 ppb, 200–3000 ppb, 400–3000 ppb, 700–3000 ppb, 1000–3000 ppb, 1500–3000 ppb, 1700–3000 ppb, 50–4000 ppb, 100–4000 ppb, 200–4000 ppb, 400–4000 ppb, 700–4000 ppb, 1000–4000 ppb, 1500–4000 ppb, 1700–4000 ppb vagy 2000–4000 ppb. A tápközegben a vas Fe2+ és/vagy Fe3+ alakban lehet jelen.
1
HU 007 943 T2
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a találmány szerinti eljárás elég toleráns a tápközegben lévõ vas sók jelenlétével szemben, így felhasználás elõtt nincs szükség a tápközeg vastalanító kezelésére. A fermentációs lépést a Corynebacterium diphtheriae tenyésztésére alkalmas hõmérsékleten, például 25–45 °C¹on 25–40 °C¹on, 30–38 °C¹on vagy 34–35 °C¹on hajtjuk végre. A fermentációs lépés nagymértékû habképzõdéssel jár. A habképzõdés visszaszorítása céljából a fermentorhoz, adott esetben, habzásgátlót adunk. A fermentorban, a habzásgátló mellett, adott esetben, például habzásérzékelõ vagy mechanikai habtörõ is alkalmazható. A találmány egy másik szempontja értelmében eljárást tárunk fel antigén (például diftériatoxin vagy mutáns alakja vagy fragmense) készítményének elõállítására, mely eljárás magában foglalja a következõ lépéseket: a fentebb leírt, találmány szerinti fermentációs eljárás végrehajtása, és az antigén (például, diftériatoxin vagy mutáns alakja vagy fragmense) tenyészetbõl történõ izolálása. A diftériatoxin toxicitását, adott esetben, kémiai kezeléssel csökkentjük, beleértve a keresztkötõ reagensekkel toxoid kialakítása céljából végzett kezelést. A toxin kifejezés jelentése magában foglalja a toxoidokat is. A találmány szerinti gyógyászati készítmény, adott esetben, kombinációs vakcinában további antigéneket is tartalmaz. Az egyik megvalósítási mód szerint a diftériatoxinnal, annak mutáns alakjával vagy fragmensével kombinálható antigének közé tartozik a következõk közül egy vagy több: tetanusztoxoid, teljes sejtes pertussis (Pw), acelluláris pertussis (Pa; lásd lentebb), Hepatitis¹B felületi antigén, Hepatitis¹A vírus, Haemophilus influenzae b oligoszacharidok, Neisseria-eredetû (például N. meningitidis) poliszacharidok vagy olgioszacharidok, N. meningitidis B¹szerotípusú proteinek (adott esetben külsõ membránvezikula részeként), pneumococcus-poliszacharidok vagy ¹oligoszacharidok, pneumococcus-proteinek, vagy az alábbiakban felsorolásra kerülõ antigének bármelyike. A bakteriális poliszacharidok hordozóproteinhez lehetnek kapcsolva. Hordozóproteinként alkalmazható a diftériatoxin vagy ¹toxoid, vagy a diftériatoxin mutáns alakjai (például CRM197) vagy fragmensei (amelyek például a találmány szerinti eljárással állíthatók elõ). Mindazonáltal, egyéb hordozóproteinek is alkalmazhatók, mint például tetanusztoxoid, tetanusztoxoid C¹fragmens, pneumolizin vagy protein¹D (US6342224). Egy adott gyógyászati készítmény, adott esetben, több poliszacharidot vagy oligoszacharidot különbözõ hordozóproteinekhez kapcsolva tartalmaz. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával elõállított diftériatoxin vagy mutáns alakjai (például CRM197) vagy fragmense a következõk közül egy vagy több mikroorganizmusból származó tok-poliszachariddal vagy oligoszachariddal formulálhatók: Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneu-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
moniae, A¹csoportba tartozó Streptococcusok, B¹csoportba tartozó Streptococcusok, Staphylococcus aureus és Staphylococcus epidermidis. Például a gyógyászati vagy immunogén készítmény olyan tok-poliszacharidokat tartalmazhat, amelyek a Neisseria meningitidis egy vagy több (A¹, C¹, W–135- vagy Y¹) szerocsoportjából származnak. Például a CRM197-tel a következõ szerocsoportok formulálhatók: A és C; A és W, A és Y; C és W, C és Y, W és Y; A, C és W; A C és Y; A, W és Y; C, W és Y vagy A, C, W és Y. Egy másik példa szerint az immunogén készítmény Streptococcus pneumoniae-bõl származó tok-poliszacharidokat tartalmaz. A pneumococcus eredetû tok-poliszacharid antigéneket elõnyösen a következõ szerotípusok közül választjuk ki: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F és 33F, illetve, legelõnyösebben az 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F és 23F szerotípusok közül. Egy további példa a b¹típusú Haemophilus influenzae PRP tok-poliszacharidjait (vagy oligoszacharidjait) tartalmazhatja. Egy további példa a Staphylococcus aureus 5. típusú, 8. típusú, 336. típusú, PNAG vagy dPNAP tok-poliszacharidjait tartalmazhatja. Egy másik példa a Staphylococcus epidermidis I. típusú, II. típusú, III. típusú vagy PIA tok-poliszacharidjait tartalmazhatja. Egy további példa a Streptococcus B¹csoport Ia típusú, Ic típusú, II. típusú vagy III. típusú tok-poliszacharidjait tartalmazhatja. Egy további példa az A¹csoportba tartozó Streptococcus tok-poliszacharidjait tartalmazhatja, adott esetben legalább egy M¹proteinnel együtt, még elõnyösebben az M¹protein többféle típusával együtt. A találmány értelmében alkalmazható bakteriális poliszacharidok teljes hosszúságúak lehetnek (natív poliszacharidokból tisztítva). Alternatív lehetõség szerint, a poliszacharidokban az alapegység ismétlõdése 2¹szeres és 20¹szoros közötti, például 2–5-szörös, 5–10-szeres, 10–15-szeres vagy 15–20-szoros, miáltal a poliszacharidok, a jobb kezelhetõség érdekében, kisebb méretûek. Az oligoszacharidok jellemzõen 2–20 ismétlõdõ egységet tartalmaznak. Az ilyen tok-poliszacharidok konjugálatlanok vagy hordozóproteinhez konjugáltak lehetnek, mely hordozóproteinek példái a tetanusztoxoid, tetanusztoxid C¹fragmense, diftériatoxoid vagy CRM197 (mely utóbbi kettõ, például a találmány szerinti eljárással van elõállítva), pneumolizin vagy protein¹D (US6342224). A tetanusztoxin, diftériatoxin és pneumolizin genetikai mutációval és/vagy kémiai kezeléssel van detoxifikálva. A poliszacharid- vagy oligoszacharidkonjugátum bármely ismert kapcsolási technikával elõállítható. Például a poliszacharid tioéterkötéssel kapcsolható. Ez a konjugálási eljárás a poliszacharid 1¹ciano-4-(dimetilamino)-piridinium-tetrafluor-boráttal (CDAP) végzett, cianát-észtert eredményezõ aktiválásán alapul. Az aktivált poliszacharid közvetlenül vagy távtartó csoporton keresztül kapcsolható a hordozóprotein aminocsoportjához. A cianát-észtert, adott esetben, hexán-diaminnal kapcsoljuk össze, és az aminoderivatizált poliszacharidot – a tioéterkötés kialakulását magában foglaló heteroligálási eljárás alkalmazásával – konjugáljuk a hordo-
1
HU 007 943 T2
zóproteinhez. Az ilyen konjugátumok leírását illetõen lásd a WO93/15760 számon közzétett PCT szabadalmi bejelentést (Uniformed Services University). A konjugátumok közvetlen reduktív aminálási eljárásokkal is elõállíthatók [lásd az US 4365170 számú (Jennings) és az US 4673574 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást (Anderson)]. További eljárások leírását illetõen lásd az EP–0–161–188, EP–208375 és EP–O–477508 számú iratokat. Egy további eljárás adipinsav-hidraziddal (ADH) derivatizált, cianogén-bromiddal aktivált poliszacharid karbodiimidkondenzációval hordozóproteinhez történõ kapcsolását foglalja magában [Chu, C. és munkatársai: Infect. Immunity, 245, 256 (1983)]. Közelebbrõl, a diftériatoxin vagy fragmense vagy mutáns alakja (például a CRM197) a gyógyászati készítmény 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 vagy 20 további antigénjéhez lehet konjugálva. Az egyik megvalósítási mód szerint a toxin (vagy mutáns alakja vagy fragmense) poliszacharidkomponens(ek)hez (például bakteriális poliszacharidokhoz, beleértve a fentebb felsoroltakat) van konjugálva. A találmány szerinti gyógyászati vagy immunogén készítmény további proteinkomponenseket is tartalmazhat. A találmány szerinti készítmény, adott esetben, olyan antigénekkel van formulálva, amelyek tetanusz vagy Bordetella pertussis okozta fertõzés (vagy mindkettõ) ellen nyújtanak védettséget. A pertussiskomponens elölt teljes sejtes B. pertussis (Pw) vagy acelluláris pertussis (Pa) lehet, amely a PT, FHA és 69 kD¹os pertaktin antigének közül legalább egyet tartalmaz (elõnyösen kettõt vagy mind a hármat). Bizonyos egyéb acelluláris pertussiskészítmények tartalmaznak agglutinogéneket (például Fim2¹t és Fim3¹at), és az ilyen vakcinák szintén alkalmasak a találmány szerinti megoldás céljaira. A tetanus ellen védettséget biztosító antigén jellemzõen a tetanusztoxoid, amely lehet kémiailag inaktivált (például formaldehiddel kezelt) toxin vagy egy vagy több pontmutáció beépítésével inaktivált toxin. A találmány szerinti gyógyászati vagy immunogén készítmény, adott esetben, pneumococcus eredetû proteinantigéneket tartalmaz, például a pneumococcus külsõ felületén megtalálható pneumococcus-proteineket (melyeket a gazdaszervezet immunrendszere a pneumococcus életciklusának legalább egy részében képes felismerni) vagy olyan proteineket, amelyeket a pneumococcus szekretál vagy szabadít fel. Például a protein lehet toxin, adhezin, kétkomponensû szignál transzducer, Streptococcus pneumoniae lipoproteinje vagy ezek fragmensei. Az ilyen proteinek példái közé tartoznak többek között a következõk: pneumolizin (elõnyösen kémiai kezeléssel vagy mutációval detoxifikálva) [Mitchell és munkatársai: „Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.”, Nucleic Acids Res. 18(13), 4010 (1990. július 11.); Mitchell és munkatársai: „Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties”, Biochim
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
Biophys Acta 1007(1). 67–72 (1989. jan. 23.); WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton és munkatársai), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA és transzmembrán deléciós változatai (US 5804193 – Briles és munkatársai); PspC és transzmembrán-deléciós változatai (WO 97/09994 – Briles és munkatársai); PsaA és transzmembrán deléciós változatai [Berry & Paton: „Sequence heterogeneity of PsaA, a 37¹kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae”, Infect. Immun. 64(12) 5255–62 (1996. dec.)]; pneumococcus eredetû kolinkötõ proteinek és azok transzmembrán-deléciós változatai; CbpA és transzmembrán-deléciós változatai (WO 97/41151; WO 99/51266); gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz [Infect. Immun. 64, 3544 (1996)]; HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato és mtsai.: FEMS Microbiol Lett 164, 207–14 (1998); M¹szerû protein (EP 0837130) és adhezin-18627 (EP 0834568). Az immunogén készítménybe foglalható további pneumococcus-proteinek a WO 98/18931, WO 98/18930 és PCT/US99/30390 számú iratokban feltárt proteinek. A találmány szerinti immunogén készítménnyel formulálható Neisseria-eredetû proteinek példái közé tartoznak a következõk: TbpA (WO93/0686; EP586266; WO92/03467; US5912336), TbpB (WO93/06861; EP586266), Hsf (WO99/31132), NspA (WO96/29412 Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85, más néven D15 (WO00/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO96/31618, lásd SEQ ID NO: 38), FrpA vagy FrpC vagy mindkettõben közös, konzervált részlet, amely legalább 30, 50, 100, 500, 750 aminosavas (WO92/01460), LbpA és/vagy LbpB [PCT/EP98/05117; Schryvers és munkatársai: Med. Microbiol. 32, 1117 (1999)], FhaB (WO98/02547, SEQ ID NO: 38), HasR (PCT/EP99/05989), Iipo02 (PCT/EP99/08315), MltA (WO99/57280) és ctrA (PCT/EP00/00135). A Neisseria-eredetû proteineket, adott esetben, egy külsõ membrán készítmény részeként adjuk hozzá. A találmány szerinti gyógyászati vagy immunogén készítmény, adott esetben, egy vagy több olyan antigént tartalmaz, amely(ek) képesek megvédeni a gazdaszervezetet a nem tipizálható Haemophilus influenzae-tõl, RSV-tõl és/vagy egy vagy több olyan antigént tartalmazhat, amely a gazdaszervezet számára védettséget képes nyújtani az influenzavírussal szemben. A nem tipizálható H. influenzae proteinantigének példái közé tartoznak a következõk: Fimbrin-protein (US 5766608), az abból származó peptideket tartalmazó fúziós proteinek (például LB1-fúzió; US 5843464 – Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, D¹protein, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap és D15. Az influenzavírus-antigének példái közé tartoznak a következõk: teljes, élõ vagy inaktivált vírus, hasított influenzavírus (tojásokon vagy MDCK-sejteken vagy Vero-sejteken szaporítva), teljes influenza viroszómák [lásd R. Gluck: Vaccine 10, 915–920 (1992)] vagy azok tisztított vagy rekombináns proteinjei, például HA¹, NP¹, NA¹ vagy M¹protein (vagy ezek kombinációi).
1
HU 007 943 T2
Az RSV- (légúti óriássejtes vírus) antigének példái közé tartozik az F¹glikoprotein, a G¹glikoprotein, a HN¹protein, az M¹protein, valamint ezek származékai. Tudni kell, hogy a találmány szerinti antigéntartalmú készítmények egyetlen baktériumfajból származó egy vagy több tok-poliszacharidot tartalmazhatnak. Az antigéntartalmú készítmények egy vagy több baktériumfajból származó tok-poliszacharidokat is tartalmazhatnak. Az immunogén készítmény vagy vakcina, adott esetben, adjuvánst is tartalmaz, olyan mennyiségben, amely elégséges az immunogén elleni immunreakció fokozására. Az ilyen célra alkalmas adjuvánsok közé tartoznak, többek között, a következõk: alumíniumsók, szkvalénelegyek (SAF–1), muramilpeptid, szaponinszármazékok, mycobaktérium sejtfal-készítmények, monofoszforil-lipid¹A, mikolsavszármazékok, nemionos blokk-kopolimer felületaktív anyagok, Quil A, koleratoxin B¹alegység, polifoszfazén és származékai, valamint immunstimuláló komplexek (ISCOM¹ok), mint például a Takahashi és munkatársai által leírtak [Nature 344, 873–875 (1990)]. Állatgyógyászati felhasználásra és antitestek állatokban történõ termeltetésére a Freund-féle adjuváns mitogén komponensei alkalmazhatók. Csakúgy, mint az összes immunogén készítmény vagy vakcina esetében, az immunogének immunológiailag hatásos mennyiségét empirikus úton kell meghatározni. A figyelembe veendõ tényezõk közé tartozik az immunogenitás (függetlenül attól, hogy az immunogén komplexálódik¹e vagy kovalens kötéssel adjuvánshoz, hordozóproteinhez vagy egyéb hordozóhoz kötõdik¹e), az adagolás módja, valamint a beadandó immunizálódózisok száma. Ezek a tényezõk a vakcinálással foglalkozó szakirodalomból ismertek, s immunológus számára elvárható mennyiségû kísérleti munka alkalmazásával meghatározhatók. Az aktív hatóanyag a találmány szerinti gyógyászati készítményben vagy vakcinában változó koncentrációban lehet jelen. Az anyag minimális koncentrációja jellemzõen a kívánt cél eléréséhez szükséges mennyiség, míg a maximális koncentráció az a maximális mennyiség, amely a kiindulási elegyben oldott vagy homogén módon szuszpendált állapotban marad. Például egy terápiás hatóanyag minimális mennyisége olyan mennyiség, amely egyetlen, terápiásan hatásos dózist eredményez. Biológiailag aktív hatóanyagok esetében a minimális koncentráció az a mennyiség, amely rekonstitúciót követõen a biológiai aktivitás kifejtéséhez szükséges, míg a maximális koncentráció annál a pontnál van, amelynél homogén szuszpenzió már nem tartható fenn. Egydózisú egységek esetében a mennyiség egy terápiás alkalmazáskor felhasznált mennyiség. Általában minden egyes dózis 1–100 mg, elõnyösen 5–50 mg, legelõnyösebben 5–25 mg proteinantigént tartalmaz. A bakteriális poliszacharidok elõnyös dózisa 10–20 mg, 10–5 mg, 5–2,5 mg vagy 2,5–1 mg. Az anyag elõnyös mennyisége anyagtól függõen változik, de szakember számára egyszerûen meghatározható.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
A találmány szerinti vakcinakészítmények fertõzésre érzékeny emlõs (például ember) védettségének kialakítására vagy kezelésére alkalmazhatók, oly módon, hogy a vakcinát szisztémásan vagy nyálkahártyán keresztül adagoljuk. Az adagolás történhet injektálással (intramuszkulárisan, intraperitoneálisan, intradermálisan vagy szubkután); illetve nyálkahártyán keresztül (orálisan/bélcsatornán keresztül, légzõszerveken keresztül vagy húgyivarszerveken keresztül). Bár a találmány szerinti vakcina beadható egy dózisként, komponensei egyidejûleg vagy eltérõ idõpontban beadhatók külön-külön is (például ha egy vakcinában poliszacharidok vannak jelen, azok a bakteriális proteinkombináció beadásával egyidejûleg vagy azt követõen 1¹2 héttel, külön adagolhatók, hogy az immunreakciók egymáshoz képest optimálisan legyenek koordinálva. Az egyféle adagolási mód helyett két különbözõ adagolási mód is alkalmazható. Például a virális antigének intradermálisan (ID) adagolhatók, míg a bakteriális proteinek intramuszkulárisan (IM) vagy intranazálisan (IN) adagolhatók. Ha poliszacharidok vannak jelen, azok intramuszkulárisan (vagy intradermálisan), míg a bakteriális proteinek intranazálisan (vagy intradermálisan) adagolhatók. Ezen túlmenõen, a találmány szerinti vakcinák kezdõ dózisként intramuszkulárisan, emlékeztetõ dózisként pedig intranazálisan adagolhatók. A vakcinák elõállításának általános leírását illetõen lásd Vaccine Design, „The subunit and adjuvant approach” [szerk.: Powell M. F. & Newman M. J., Plenum Press, New York (1995)]. A liposzómákba történõ kapszulázás („encapsulation”) leírását Fullerton tárta fel (4 235 877 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A találmány egy további szempontja értelmében eljárást tárunk fel gyógyászati készítmény elõállítására, amely magában foglalja a diftériatoxin vagy fragmense vagy mutáns alakja (például CRM197) találmány szerinti fermentációs eljárás alkalmazásával végzett elõállítását és a termék gyógyászatilag elfogadható hordozóval történõ elegyítését és adott esetben, a fentebb említett további antigének bármelyikének hozzáadását. A szóban forgó eljárás magában foglalhat egy további lépést, melynek során a diftériatoxint vagy fragmensét vagy mutáns alakját (például a CRM197¹et) a gyógyászati készítmény egy vagy több további komponenséhez (elõnyösen a fentebb leírt bakteriális poliszacharidokhoz vagy oligoszacharidokhoz) konjugáljuk. A találmány egy további szempontjának megfelelõen, diftériatoxin vagy fragmense vagy mutáns alakja (például CRM197) alkalmazását tárjuk fel bakteriális betegség – közelebbrõl, C. diphtheriae okozta betegség – kezelésére vagy megelõzésére való gyógyszer elõállítására. A találmány egy következõ szempontjának megfelelõen, eljárást tárunk fel bakteriális fertõzés – közelebbrõl, C. diphtheriae okozta betegség – megelõzésére vagy kezelésére, mely eljárás magában foglalja a találmány szerinti gyógyászati készítmény, immunogén készítmény vagy vakcina páciensnek történõ adagolását.
1
HU 007 943 T2
A találmányt a mellékelt példák bemutatásán keresztül szemléltetjük. Az alábbi példákat szakember számára jól ismert, rutinszerûen elvégezhetõ standard technikák alkalmazásával valósítottuk meg, kivéve azokat az eseteket, amelyeket részletesen leírunk. A példákat szemléltetési célból mutatjuk be, anélkül, hogy e példák a találmány oltalmi körét korlátoznák.
5
Példák 10 1. példa: KLa-érték mérése A fermentációs lépés KLa-értékének mérése céljából a fermentort kívánt térfogatú vízzel töltöttük fel, beállítottuk a fermentációs paramétereket (például hõmérséklet, nyomás, keverés és levegõztetés), és a rendszert egyensúlyi állapot eléréséig mûködtettük. A pO2 szondát 100%¹ra kalibráltuk. A levegõztetést gyorsan nitrogéngáz beáramoltatására cseréltük (azonos áramlási sebesség fenntartásával). A pO2¹t addig követtük nyomon, míg 5% alá nem csökkent. Ekkor a szellõztetést gyorsan levegõ beáramoltatására állítottuk vissza (azonos áramlási sebesség fenntartásával). A pO2-szintet több idõpontban az eredeti egyensúlyi állapotra jellemzõ szint (100%) százalékaként regisztráltuk. A KLa¹t a log(100–pO2%) idõ függvényében történõ grafikus ábrázolásával számítottuk ki. A görbe lineáris részének iránytényezõje (meredeksége) –KLa-nak felel meg. Jellemzõen csak a 20% és 80% pO2 közötti adatokat vesszük figyelembe.
15
20
25
30
Eredmények A különbözõ idõpontokban meghatározott pO2-értékeket a következõ, 1. táblázatban mutatjuk be. 35
1. táblázat Idõ (mp)
Idõ (óra)
pO2 (%)
ln (100–pO2)
200
0,056
20
4,382026635
210
0,058
21,9
4,357990057
220
0,061
23
4,343805422
230
0,064
25
4,317488114
240
0,067
27
4,290459441
250
0,069
29
4,262679877
260
0,072
32
4,219507705
Az eredményeket az 1. ábrán bemutatottak szerint ábrázoltuk grafikusan, és a KLa¹t az 1/B ábrán látható görbe meredekségébõl határoztuk meg. 2. példa: C. diphtheriae ATCC 39255 törzs fermentálása 150 literes nagyságrendben A CRM197 (keresztreakciót mutató anyag) elõállítására alkalmazott baktérium egy – A. Pappenheimer eljárása [Nature New Biol. 233, 8–11 (1971)] szerint végzett nitrozoguanidines kezeléssel kapott – mutáns Corynebacterium diphtheriae törzs. Ez a törzs detoxifikált diftériatoxint tartalmaz, amely az 52. aminosavpo-
40
45
50
55
60 9
2
zícióban glicin®glutaminsav mutációt hordoz. A törzset az ATCC-tõl kaptuk (nyilvántartási száma: 39255). A fermentációs eljárás általános vázlatát a 2. ábrán mutatjuk be. A fagyasztóból (–70 °C) kivett 1,1×1010 cfu/ml kolóniaképzõ egységet tartalmazó oltócsíra-szaporítóanyagot („working seed”) szobahõmérsékleten felolvasztottuk. Közvetlenül a felolvadás után a fiolát vortexeztük, és a szaporítóanyag 250 ml¹ét tûvel felszerelt 1 ml¹es fecskendõvel felszívtuk. Ezt a térfogatot 100 ml steril sóoldatba (0,9%) fecskendeztük. A lombikot kevertettük. A szuszpenzióból tûvel felszerelt 2 ml¹es fecskendõvel két ml¹t felszívtunk, melyet – a 4 925 792 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírt tápközeget (500 ml) tartalmazó – 3 literes Erlenmeyer-lombik beoltására alkalmaztunk. A lombikot 250¹es percenkénti fordulatszámmal végzett keverés közben 34,5±0,5 °C¹on inkubáltuk, mindaddig, míg az optikai denzitás (650 nm) 4,0–6,0 értéket nem ért el (16–19 órás inkubálás után). Egy 150 literes fermentort sterilizáltunk és aszeptikus feltételek között 100 liter tenyésztõ tápközeget töltöttünk bele. A savballonba 500 ml 25 térfogat%¹os (%V/V) H3PO4¹t töltöttünk; a tápközeg pH¹ja kezdetben körülbelül 7,4 volt, és nem szabályoztuk. A fermentort a beoltás elõtti napon készítettük elõ, és a beoltásig készenléti állapotban tartottuk (34,5 °C hõmérséklet, 0,5 bar nyomás, a gõztérben 23 N L/perc légáram, 50¹es percenkénti fordulatszám 16–20 órán keresztül). A beoltást megelõzõen a fermentorban a következõ tenyésztési feltételeket állítottuk be: 34,5 °C hõmérséklet, 0,5 bar nyomás, 23 N L/perc légáram (a tápközegbe keverve), és 240¹es percenkénti fordulatszám. A 240¹es percenkénti fordulatszám 1,76 m/s csúcssebességet és 3,9 másodperces elméleti keverési idõt eredményez. Az oldott oxigént nem szabályoztuk, csak ellenõriztük, a habzásszabályozó rendszert bekapcsoltuk, és a pH¹t hagytuk 7,8¹es értéket elérni, majd H3PO4 hozzáadásával ezen az értéken tartottuk. A beoltás elõtt a PO2-érzékelõt 100%¹ra állítottuk. A keverési sebességet 240¹es percenkénti fordulatszámra állítottuk be, ami 1,76 m/s kerületi sebességnek felel meg. A 23–L/perc levegõztetési sebességgel kombinált 240 fordulat/perc keverési sebesség 42 óra–1 becsült KLa-értéket eredményezett (20–80%, 30 °C víz, 0,5 bar; lásd a 6. ábrát). A fermentort a beoltónyíláson keresztül a fentebb leírt szaporítótenyészet 400 ml¹ével oltottuk be. A fermentációt addig folytattuk, míg a következõ feltételek közül mindkettõ nem teljesült: 20 órás fermentálási idõ és az oldott oxigén szintjének 10%¹ra emelkedése. A teljes fermentációs idõ általában 22 és 28 óra között volt. A fermentáció végén a hõmérsékletet 20 °C¹ra állítottuk be, a pH¹szabályozást lekapcsoltuk, és a levegõáramot – a habzás csökkentése érdekében – a gõztérbe váltottuk át, a habzásgátló rendszert kikapcsoltuk, a többi paramétert viszont nem változtattuk meg. A fermentorhoz mikroszûrõ rendszert csatlakoztattunk, és amikor a szuszpenzió hõmérséklete elérte a
1
HU 007 943 T2
21 °C¹ot, megkezdtük a mikroszûrést. A mikroszûrést két szakaszban hajtottuk végre: betöményítés és diafiltráció. A betöményítési szakaszban a következõ paramétereket alkalmaztuk: bemeneti nyomás: 0,6 bar; kimeneti nyomás: körülbelül 0,1 bar; permeátumáramlás: kalibrált perisztaltikus szivattyúval alkalmazásával 2 liter/perc állandó értéken tartva (a permeátumnyomás körülbelül 0,3 bar volt). A szuszpenzió betöményítését addig folytattuk, míg a következõ események egyike be nem következett: a bemeneti nyomás elérte a 0,9 bart vagy 75 liter permeátum keletkezett. A diafiltrációs szakasz során a következõ paramétereket alkalmaztuk: a bemeneti nyomást a betöményítési lépés végén elért értéken (maximum 0,9 bar) tartottuk; víz hozzáadása 2 liter/perc sebességgel; az összes hozzáadott víz mennyisége a retentát (koncentrátum) térfogatának háromszorosa volt. A retentátot 0,22 mm¹es membránon szûrtük és +4 °C¹on tároltuk. Az ilyen szuszpenzióban a
5
10
15
2
CRM197 stabilitását legfeljebb négy napos tárolást követõen, +4 °C¹on vagy szobahõmérsékleten (+20 °C<szobaT<23 °C) teszteltük. Kvantitatív ELISAanalízissel, illetve SDS-PAGE analízissel lebomlást és eltéréseket nem tapasztaltunk. A növekedés hiányának igazolására alkalmas tesztet 36 °C¹on inkubált BABagaron végeztük. Eredmények A fentebb leírt fermentációs protokoll alkalmazásával két, 150 literes fermentációt végeztünk (CDT199 és CDT206). Az elõtenyésztési és tenyésztési feltételeket a 2. és 3. táblázatban, a CRM197 hozamát pedig a 4. táblázatban mutatjuk be. A 3. ábrán egy elõtenyészet jellemzõ szaporodási kinetikájának grafikonját mutatjuk be. Ha a 650 nm¹nél mért optikai denzitás (O. D.) 4,0 és 6,0 között volt, a tenyészet egyértelmûen exponenciális növekedési fázisban volt, és a pH csak csekély mértékben változott.
2. táblázat Elõtenyésztési feltételek Tenyészetazonosító
Elõtenyésztés idõtartama (óra:perc)
Az elõtenyészet O. D.650-értéke
Végsõ pH¹érték
CDT199
16:44
5,88
7,30
CDT206
17:53
4,03
7,25
3. táblázat Tenyésztési feltételek Tenyészetazonosító
Fermentálás idõtartama (óra:perc)
Felhasznált 25% H3PO4 (g)
Végsõ O. D.650-érték
Összes szükséges habzásgátló mennyiség (g)
CFU-becslés (bakt./ml)
CDT199
24:45
2
17,2
102
4,9 E9
CDT206
24:31
2
13,9
119
nem mértük
4. táblázat CRM197 becslés Tenyészetazonosító
Sûrûség SDS-PAGE¹en (mg/liter)
ELISA (mg/liter)
CDT199
89/106
138
CDT206
92/83
116
A fermentáció során különbözõ szakaszokat figyeltünk meg. Az elsõ szakaszra az oldott oxigén mennyiségének csökkenése (egészen 0% eléréséig) volt jellemzõ (kö- 50 rülbelül 6¹7 órás idõtartam). E szakaszban a pH változatlan marad vagy csekély mértékben csökken (körülbelül 0,1 pH¹egységgel). A második szakaszban a pH megnövekedett és körülbelül 7,8-nél maximális szintet ért el, amelynél meg- 55 kezdtük a pH¹szabályozást, bár e fermentációs feltételek között gyakran egyáltalán nem volt szükség sav hozzáadására. A pH¹érték tetõzése közben az oldott oxigén mennyisége 0% fölé emelkedett, majd vissza60 esett 0%¹ra. 10
A harmadik szakaszra a pH körülbelül 7,4¹re történõ csökkenése volt jellemzõ. Végül, a fermentálás 22. és 24. órája között a pO2 növekedését tapasztaltuk. Ez a jel a betakarítás megkezdéséhez. A fermentorból távozó gázokat tömegspektrométerrel analizáltuk. Jellemzõ CO2-képzõdési profilt figyeltünk meg. A két bemutatott fermentálást a betakarítás megkezdésének jele után is folytattuk, hogy meghatározzuk a CRM197-termelõdés kinetikáját. Azt tapasztaltuk, hogy a CRM197-szint a betakarítási jel elérését követõen nem növekedett, a habképzõdés azonban fokozódott. A habzásgátló-fogyasztás korlátozása érde-
1
HU 007 943 T2
kében elõnyös, ha a fermentálást a betakarítási jelnél leállítjuk. Mindazonáltal, úgy tûnik, a CRM197-termelõdést a túlzott habzás nem befolyásolta, és lebomlás sem következett be. 5 Mikroszûrés A CDT206 mikroszûrési adatait mutatjuk be. Amikor a bemeneti nyomás 0,9 bar értéket ért el, a permeátum 74,3 literét gyûjtöttük össze. A betöményítési lépés során a kimeneti nyomás 0,15 bar és 0,10 bar között volt. A betöményítés során a permeátum nyomása 0,3–0,4 bar volt. A diafiltrációs lépés idõtartama 39 perc volt. A diafiltrációs szakaszban fokozatosan 75 liter vizet (2 liter/perc) adagoltunk, miközben a permeátumot azonos átfolyási sebességgel extraháltuk. Kezdetben a bemeneti nyomás 0,9 bar volt, amely a diafiltráció végén 0,7 bar¹ra csökkent. A kimeneti nyomás állandó 0,1 bar volt. A diafiltrációs lépés idõtartama 39 perc volt. A CRM197 mennyiségi meghatározása Az alacsony levegõztetési feltételek között elért CRM197-expresszió általában 2–4-szer nagyobb volt, mint a magasabb szintû levegõztetési feltételek között elért szint (amikor a pO2¹t a fermentáció során 5% vagy nagyobb értéken tartottuk). Tenyészeti felülúszók festett SDS-PAGE géljei A tenyészeti felülúszókat SDS-PAGE-géleken (4. ábra), redukáló feltételek között futtattuk, ami lehetõséget nyújtott az esetleges degradációs csíkok detektálására. Hasítás után két, hozzávetõleg 35 kD¹os és 23 kD¹os alegységet detektáltunk, melyeket késõbb Coomassie Blue-val festettünk. Eredmények A két fermentációból származó minták Coomassiefestett géljeit a 4/A ábrán (CDR199) és a 4/B ábrán (CDT206) mutatjuk be. A CRM197 a várt molekulatömegûnek bizonyult (elméleti molekulatömeg: 58.4 kD). A CRM197 nem bomlott le, hiszen a fermentáció végét jelentõ jel után vett mintákban nem tapasztaltuk a mintázat megváltozását (4/A ábra; 9. és 10. sáv). A CRM197 mennyiségét a mikroszûrés és a 0,22 mm¹es filteren végzett utolsó szûrés nem befolyásolta; a 4/A ábrán a 9. és 11. sávban egyforma mennyiségû CRM197 látható. A hõmérséklet negatív hatást gyakorolhat a CRM stabilitására (4/B ábra, 12. sáv). Ezt a mintát akkor vettük, amikor a mintavevõ szelep meleg volt, és az e mintában lévõ CRM197 redukálódott. 3. példa: C. diphtheriae ATCC 39255 törzs fermentálása 20 liter térfogatban A C. diphtheriae fermentálására a 2. példában leírthoz hasonló eljárást alkalmaztunk, azzal a különbséggel, hogy 20 literes fermentort használtunk. A tenyészetet 300¹as percenkénti fordulatszámmal kevertük, és a légáramlást 3 liter/perc értékre állítottuk be. A fer-
2
mentálás során sav vagy bázis hozzáadására nem volt szükség, mivel a pH a fermentáció alatt semlegeshez közeli értéken maradt. A tenyészet 18,3¹es végsõ OD650-érték eléréséig szaporodott. A CRM197 hozama – festett gélen végzett denzitometria alapján – 103 mg/liternek bizonyult.
4. példa: A C. diphtheriae ATCC 39255 törzs fermentálása különbözõ nagyságrendekben Az állandó KLa feltételek között szaporított Corynebacterium diphtheriae fermentációs eljárása adaptálható más méretû és konstrukciójú fermentorokban való alkalmazáshoz is. Az 5. táblázatban feltüntetett fer15 mentorméretet, levegõáramlást és keverési sebességet alkalmazva jó hozamú CRM197-termelést értünk el. A három 150 liter térfogatú fermentálást különbözõ konstrukciójú fermentorokban végeztük. 10
5. táblázat
20
25
30
35
40
45
50
Térfogat (liter)
Levegõáramlás (liter/perc)
Keverési sebesség (fordulat/perc)
KLa (óra–1)
20
3
300
22–28
150
23
240
~42
150
23
185
~50
150
17
200
~40
Ahogy az 5. táblázatban látható, a KLa fontosabb volt, mint a levegõáramlási vagy a keverési sebességi feltételek. Ilyenformán, kisebb levegõáramlás – hasonló KLa-érték elérése érdekében – nagyobb keverési sebességgel kompenzálható, miáltal továbbra is jó CRM197 hozamok érhetõk el. A keverési sebességet úgy kell beállítani, hogy homogén szuszpenziót kapjunk, miközben a levegõztetést alacsony pO2-érték fenntartásához megfelelõen korlátozzuk. A 20 literes fermentálásokhoz különbözõ fermentorokat alkalmaztunk. A különbözõ fermentorok eltérõ geometriája az 5. táblázatban bemutatott tartományba esõ KLa-értékeket eredményezte. Mindazonáltal, a különbözõ KLa-feltételek különbözõ nagyságrendû fermentálásokhoz voltak optimálisak. Ennek megfelelõen, a 20 literes fermentorban végzett fermentáláshoz kisebb KLa-érték (22–28 óra–1) volt optimális. Azok a KLa-feltételek optimálisak, amelyek korlátozott levegõztetést tesznek lehetõvé, miáltal a tenyészetben a pO2 alacsony szintre csökken. Szakember számára nem okoz gondot az ilyen feltételek adott fermentorméretre és ¹geometriára történõ meghatározása.
55 5. példa: A vaskoncentráció hatása a különbözõ pO2-értékeknél végzett fermentálások hozamára A 3. példában leírt eljárással, 20 literes térfogatban a C. diphtheriae ATCC 39255 törzs fermentálási soro60 zatát hajtottuk végre, oly módon, hogy a pO2-érték a 11
1
HU 007 943 T2
fermentálás nagyobb részében alacsony legyen vagy 5% állandó pO2-értékre legyen beállítva. A jelen lévõ Fe3+ mennyiségét a következõ lehetõségek közül választottuk ki: Fe3+ hozzáadása nélkül, 250 ppb Fe3+ hozzáadása, 500 ppb Fe3+ hozzáadása és 500 ppb Fe2+ hozzáadása. A fermentáció végén a CRM197 hozamát SDS-PAGE-gél denzitometriás analízisével mértük. Ez az eljárás az ELISA-analízissel kapott eredményekhez viszonyítva hozzávetõleg 20%-kal kisebb eredményeket adott.
2
aránt – 250¹es percenkénti fordulatszámmal végzett keverés közben, 34,5 °C¹on 46 órán át inkubáltuk. A mintákat 0,22 mm¹es filteren leszûrtük. Az expressziót – Coomassie-blue-val (Gelcode 5 blue festék; Pierce) festett SDS-PAGE-gélen (XT Criterion 4–12% „bis tris”; a BioRad terméke), denzitometriás eljárással mértük. A mennyiségi meghatározáshoz referenciaként a List Biological Laboratories INC-tõl származó diftériatoxin CRM-mutánst alkalmaztuk, me10 lyet különbözõ koncentrációkban vittünk fel a gélre.
5% pO2-értékû tápközeg, Fe3+ hozzáadása nélkül
38
5% pO2-értékû tápközeg, 250 ppb Fe3 hozzáadásával
14
5% pO2-értékû tápközeg, 500 ppb Fe3 hozzáadásával
18
Eredmények A 7. táblázatban a mikrotiterlemezek üregeiben korlátozott levegõztetési feltételek között, különbözõ vas15 koncentrációk jelenlétében tenyésztett Corynebacterium diphtheriae CRM197 expresszióját mutatjuk be. A CRM197-expresszió csekély mértékben volt érzékeny a Fe3+ által okozott represszióra, és 1 ppm vagy 2 ppm Fe3+ hozzáadása nem befolyásolta jelentõs 20 mértékben. Csak 3 ppm Fe3+ hozzáadása okozott jelentõs expressziócsökkenést, de a CRM197 expressziója még ennél a Fe3+-koncentrációnál is 79%¹a volt a Fe3+ hozzáadása nélkül elért expressziónak.
5% pO2-értékû tápközeg, 500 ppb Fe2+ hozzáadásával
13
25
Eredmények 6. táblázat Fermentációs feltételek
Alacsony pO2, állandó KLa, Fe3+ hozzáadása nélkül
CRM197 hozam (mg/liter)
7. táblázat CRM197¹et expresszáló Corynebacterium diphtheriae
100
Alacsony pO2, állandó KLa, 250 ppb Fe3+ hozzáadásával
88
Alacsony pO2, állandó KLa, 500 ppb Fe3+ hozzáadásával
97
Ahogy a 6. táblázatban látható, ha a Corynebacterium diphtheriae¹t 5% pO2-értéknél fermentáljuk, a vas hozzáadása a hozam csökkenését eredményezi. Ezzel szemben, ha a pO2-értéket csökkentjük, és a fermentációt a 3. példában leírtak szerint, állandó KLa-értéknél és alacsony pO2-érték mellett végezzük, nagyobb hozamok érhetõk el, s a hozamot a Fe3+ hozzáadása nem befolyásolja. 6. példa: A vaskoncentráció hatása a diftériatoxin vagy a CRM197 hozamára alacsony szintû levegõztetési feltételek között A CRM197 expresszióját nem befolyásoló vaskoncentráció-tartományt mikrotiterlemezeken határoztuk meg. A mikrotiterlemezekkel a találmány szerinti fermentációs eljárásban létezõ korlátozott levegõztetési feltételeket szimuláljuk. A mikrotiterlemezeken végzett tenyésztést a fentebb leírt fermentálásoknál alkalmazott tápközegben végeztük (CY-tápközeghez hasonló tápközegben). A tápközeghez FeCl3·6H2O törzsoldatból 1 g/L koncentrációjú Fe3+-iont adtunk. A mikrotiterlemez üregeibe tápközeget töltöttünk, és 8×105 baktérium/ml sejtsûrûséggel beoltottuk. A mikrotiterlemezeket – a CRM197¹et expresszáló Corynebacterium diphtheriae és a diftériatoxint expresszáló Corynebacterium diphtheriae esetében egy-
30
pH
CRM (%)
18,1
7,66
100
200 ppb
17,9
7,72
96
300 ppb
16,9
7,77
97
400 ppb
16,9
7,8
106
500 ppb
17,2
7,83
109
600 ppb
17,7
7,81
112
700 ppb
17,2
7,77
109
800 ppb
17,2
7,77
103
Hozzáadott Fe3+ (ppm)
0
35
40
45
Optikai denzitás (46. óra)
900 ppb
16,5
7,79
101
1 ppm
16,9
7,75
96
2 ppm
17
7,79
88
3 ppm
16,9
7,83
79
A CRM197 hozamait a plusz Fe3+ hozzáadása nélkül elért hozam százalékaként fejeztük ki. A megadott 50 feltételek között mikrotiterlemez üregeiben tenyésztett Corynebacterium diphtheriae diftériatoxin expressziójának eredményeit a 8. táblázatban adjuk meg. A korlátozott levegõztetési feltételek között tapasztalt diftériatoxin-termelés szintén alig volt érzékeny a Fe3+ általi re55 presszióra. A diftériatoxin expressziója a növekvõ Fe3+-koncentráció növekedésével fokozódott (a maximális diftériatoxin-termelõdést 700 ppb-nél tapasztaltuk). A diftériatoxin expressziója csak akkor kezdett csökkenni, amikor a Fe3+ koncentrációját 3 ppm¹re nö60 veltük. 12
1
HU 007 943 T2
8. táblázat Diftériatoxint expresszáló Corynebacterium diphtheriae Optikai denzitás (46. óra)
pH
CRM (%)
4,16
8,66
100
200 ppb
4,72
8,42
106
300 ppb
4,6
8,47
107
400 ppb
4,9
8,51
125
500 ppb
4,22
8,59
155
600 ppb
4,48
8,51
148
700 ppb
4,04
8,63
167
800 ppb
4,28
8,52
164
900 ppb
4,58
8,62
168
1 ppm
4,48
8,64
166
2 ppm
4,7
8,68
176
3 ppm
4,2
8,68
141
Hozzáadott Fe3+ (ppm)
0
A diftériatoxin hozamait a plusz Fe3+ hozzáadása nélkül elért hozam százalékaként fejeztük ki.
5
10
15
20
25
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Fermentációs eljárás, amely magában foglal egy fermentációs lépést, melynek során egy Corynebacterium diphtheriae törzset fermentorban, tápközegben, homogén tenyészet fenntartásához elégséges keverési feltételek között és korlátozott levegõztetéssel tenyésztünk, oly módon, hogy a tenyészetben a pO2-érték a fermentációs lépés nagyobb részében 4% alá csökken, ahol a fermentációs lépés a) 100–250 literes fermentorban, 30–60 óra–1 KLa-értéken vagy b) 250–800 literes fermentorban, 60–150 óra–1 KLa-értéken megy végbe. 2. Az 1. igénypont szerinti fermentációs eljárás, ahol a pO2 a fermentációs lépés nagyobb részében nullát megközelítõ értékre csökken. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a 4%¹nál kisebb pO2-értéket attól az idõponttól, amelynél a Corynebacterium diphtheriae olyan sûrûségre szaporodott, amely elégséges ahhoz, hogy a pO2 a gyors oxigénfogyasztás következtében 4%¹nál kisebb
30
35
40
45
13
2
értékre csökkenjen, egészen a fermentációs lépés befejezéséig tartjuk fenn. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a fermentációs lépést állandó KLa-értéken hajtjuk végre. 5. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a fermentációs lépést állandó keverési sebesség és levegõztetési sebesség mellett hajtjuk végre. 6. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a fermentációs lépést változó KLa-feltételek között hajtjuk végre. 7. Az 1–6. igénypontok szerinti eljárás, ahol a fermentációs lépés 15–25 L/perc sûrített levegõvel biztosított levegõáramlás és 150–250 fordulat/perc sebességgel végzett keverés közben játszódik le. 8. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a tápközeg CY, SOC vagy hasonló tápközeg, és a fermentorban a pH¹t a levegõztetés mértékével 7,0 és 7,8 közötti értéken tartjuk, anélkül hogy sav vagy bázis hozzáadására lenne szükség. 9. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a Corynebacterium diphtheriae törzs diftériatoxint vagy annak mutáns alakját, különösen CRM197¹et termel. 10. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a Corynebacterium diphtheriae törzs az ATCC 39255 törzs. 11. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a tápközeg 10 ppb és 4000 ppb közötti mennyiségû vasat tartalmaz. 12. Eljárás C. diphtheriae-bõl származó antigén készítményének elõállítására, amely magában foglalja a következõ lépéseket: az 1–11. igénypontok bármelyike szerinti fermentációs eljárás végrehajtása, és a C. diphtheriae-bõl származó antigéntenyészetbõl történõ izolálása. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol a C. diphtheriae-bõl származó antigén diftériatoxin vagy annak fragmense vagy mutáns alakja (például CRM197). 14. A 11–12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amely egy vagy több további antigén C. diphthariaebõl származó antigénhez történõ hozzáadásának lépését is magában foglalja. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, amely a diftériatoxin vagy annak fragmense, vagy mutáns alakja egy vagy több további antigénhez történõ konjugálásának lépését is magában foglalja.
HU 007 943 T2 Int. Cl.: C07K 14/34
14
HU 007 943 T2 Int. Cl.: C07K 14/34
15
HU 007 943 T2 Int. Cl.: C07K 14/34
16
HU 007 943 T2 Int. Cl.: C07K 14/34
17
HU 007 943 T2 Int. Cl.: C07K 14/34
18
HU 007 943 T2 Int. Cl.: C07K 14/34
19
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
