!HU000005429T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 005 429
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C07D 223/10
(21) Magyar ügyszám: E 04 765884 (22) A bejelentés napja: 2004. 10. 08. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040765884 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1680405 A1 2005. 05. 19. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1680405 B1 2009. 01. 07.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 10349669 2003. 10. 24.
(73) Jogosult: Sanofi-Aventis Deutschland GmbH, 65929 Frankfurt am Main (DE)
DE
(72) Feltalálók: HOFFMANN, Holger, 64646 Heppenheim (DE); HAAG-RICHTER, Sabine, 65926 Frankfurt (DE); KURZ, Michael, 65926 Frankfurt am Main (DE); TIETGEN, Heiko, 55130 Mainz (DE) (54)
(2006.01) A61K 31/55 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) C07D 223/12 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05044803 PCT/EP 04/011244
(74) Képviselõ: dr. Palágyi Tivadar, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Bengamidszármazékok és alkalmazásuk rákos megbetegedések kezelésére
(57) Kivonat
HU 005 429 T2
A találmány a Myxocococcus virescens ST200611 (DSM 15898) által fermentáció közben képzett bengamidszármazékokra, azok rák kezelésére történõ alkalmazására, bengamidszármazékokat tartalmazó gyógy-
szerekre, (V) képletû bengamidok elõállítására szolgáló módszerre, továbbá Myxocococcus virescens mikroorganizmusra vonatkozik.
A leírás terjedelme 10 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 005 429 T2
A rák az ember és az állat többnyire halálos lefolyású megbetegedése, amelyet a szervezetben keletkezõ sejtek szabályozatlan növekedése idéz elõ. Rák a megjelölése a rosszindulatú daganatok (malignomák), neoplazmák (tumorok, illetve karcinomák) képzõdésének vagy fehérvérsejtek rosszindulatú elfajzásának, valamint érési zavarának (leukémia, vérrák). Rákos vagy tumorsejtek a szervezetben keletkezõ sejtek átalakulása folytán jönnek létre. A rákos sejtek rosszindulata a növekedés autonómiájában jut kifejezésre, vagyis abban a képességükben, hogy gátlástalanul és a szervezetek építkezési tervébe való beilleszkedés nélkül és szövetrombolás mellett beszûrõdve növekednek. A rosszindulatúság biztos jele a tumortól távoli települések (metasztázisok) képzõdése tumorsejtek hematogén vagy limfogén terjeszkedése után. A rák az ember leggyakoribb haláloka, és ezért nagy szükség van a rosszindulatú elfajzások gyógyítására és kezelésére szolgáló módszerekre és eszközökre. A rosszindulatú tumorok gyógyításának lehetõsége felöleli a tumor – lehetõleg radikális – mûtéti eltávolítását, a radiológiás terápiát röntgensugarakkal, a¹, b¹, g¹sugarakkal, az immunterápiát és a kemoterápiát. Az immunterápia jelenleg csak korlátozott mértékben alkalmazható. A tumorok kemoterápiája alatt sejtmérgek (citosztatikumok) adását értjük tumorok és megmaradó tumorsejtek kezelésére, többnyire helyi sebészeti kezelés vagy besugárzás után. Ezek az anyagok a sejtosztódás bizonyos folyamataiba sajátosan avatkoznak be, úgyhogy osztódó sejteket jelentõs mennyiségben tartalmazó szövetek, valamint a gyorsan növekedõ tumorszövetek érzékenyebben reagálnak. Felhasználásra kerülnek alkilezõvegyületek, így például a ciklofoszfamid, antimetabolitok, mint a metotrexát, alkaloidok, mint a vinkrisztin és antibiotikumok, mint a daunomicin vagy az adriamicin. Mindezek a hatóanyagok azonban erõteljes mellékhatások miatt nagy hátrányokat mutatnak, úgyhogy a betegek halála csak kitolódik, de nem akadályozódik meg. Emellett a rosszindulatú (rákos) sejteknél az alkalmazott szerekkel szemben rezisztenciák lépnek fel, úgyhogy a jelenleg alkalmazott gyógyszerek nem hatnak többé citosztatikusan, hanem a mellékhatások következtében toxikusan. Azt is kimutatták, hogy a citosztatikumok kombinált, illetve szekvenciális alkalmazása felülmúlja egyetlen citosztatikum (monoterápia) hatékonyságát, és ezáltal lehetõség nyílik arra, hogy a polikemoterápia esetén a jelentõs mellékhatások ne adódjanak össze. Mindezen okok folytán sürgõsen szükség van új kemoterapeutikumokra, és ezért azokat széles körben kutatják. A bengamidok elsõ példáiként a kaprolaktámgyûrûn dodekanoilszubsztituált bengamid A¹t és B¹t különítették el a Jaspis cf. Coriacea (Coppatiidae család, Choristida B Astrophorida rend) tengeri szivacsból (Adamczewski et al., J. Org. Chem. 1986, 51, 4497–4498), és ezeket eukarióta sejtekkel, nematódákkal és baktériumokkal szemben biotoxikusnak írták le. Olyan bengamidszármazékok példái, amelyeknél tumorellenes hatékonyságot mutattak ki, a bengamid E
2
5
és annak N¹metilezett származéka, a bengamid F. A bengamid E azzal gátolja a sejtproliferációt, hogy a 10 Gl/S restrikciós ponton és a sejtciklus G2/M fázisában leállítja a sejtosztódást. A bengamid B¹származékok gátolják az MDA-MB–435 mellráksejtek proliferációját (Kinder et al., J. Med. Chem. 2001, 44, 3692–3699). Az ismert bengamidszármazékok közös jellemzõje, 15 hogy a tengeri szivacs Jaspis sp. vagy Pachastrissa sp. fajából lettek elkülönítve (Thale et al., J. Org. Chem. 2001, 66, 1733–1741). Most azt találtuk, hogy a Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) mikroorganizmustörzs képes 20 újszerû bengamidszármazékokat képezni, amelyek csekély koncentrációban gátolják a sejtproliferációt, és ennek következtében alkalmasak rákos megbetegedések kezelésére és/vagy megelõzésére. A jelen találmány (I) képletû vegyületekre, 25
30
35
40
45
50
(I) ahol R1 jelentése H vagy (C1–C6)-alkil, R2 jelentése H vagy OH, és R3 jelentése H vagy –C(=O)–(C1–C6)-alkil, vagy egy (I) képletû vegyület fiziológiailag elviselhetõ sójára vonatkozik. Egymástól függetlenül R1 jelentése elõnyösen H vagy metil, és R3 jelentése elõnyösen H. A találmány elõnyösen olyan (I) képletû vegyületekre vonatkozik, amelyekben R1 jelentése H vagy metil, R2 jelentése H vagy OH, és R3 jelentése H. A (C1–C6)-alkil jelentése egyenes vagy elágazó alkilcsoport 6 szénatommal, elõnyösen metil (Me), etil, n¹propil, izopropil, terc-butil vagy n¹hexil, elõnyösen metil. A találmány továbbá olyan (I) képletû vegyületre vonatkozik, amelyre egy (II) képletû vegyület,
55
60 2
(II),
1
HU 005 429 T2
egy (III) képletû vegyület
5
(III),
10
és egy (IV) képletû vegyület jellemzõ
15
20 (IV). A jelen találmány továbbá az (I) képletû vegyületek fiziológiailag elviselhetõ sóira is vonatkozik. Az (I) képletû vegyületekben a kiralitáscentrumok, ha másképp nem adjuk meg, R¹ vagy S¹konfigurációban fordulhatnak elõ. A találmány egyaránt vonatkozik az optikailag tiszta vegyületekre és a sztereoizomerek elegyeire, valamint az enantiomerelegyekre és a diasztereomerelegyekre. Az (I) képletû vegyületek fiziológiailag elviselhetõ sói alatt azok mind szerves mind szervetlen sóit értjük, miként azok le vannak írva a Remington’s Pharmaceutical Sciences címû könyvben [17. kiadás, 1418. oldal (1985)]. A fizikai és kémiai stabilitás, valamint az oldhatóság alapján savas csoportok az elõnyösek, többek között a nátrium¹, kálium¹, kalcium- és ammóniumsók. Bázisos csoportokként többek között a következõ savak sói elõnyösek: sósav, kénsav, foszforsav vagy karbonsavak vagy szulfonsavak, mint az ecetsav, a citromsav, a benzoesav, a maleinsav, a fumársav, a borkõsav és a p¹toluolszulfonsav. (I) képletû vegyületeket úgy lehet elõállítani, hogy 1. a Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) törzset vagy egy variánsát és/vagy mutánsát megfelelõ körülmények között egy tenyészközegben tenyésztünk, amíg egy vagy több (I) képletû vegyület a tenyészközegben fel nem halmozódik, 2. egy (I) képletû vegyületet a tenyészközegbõl elkülönítünk, és 3. az (I) képletû vegyületet adott esetben származékká alakítjuk, és/vagy adott esetben egy fiziológiailag elviselhetõ sóvá alakítjuk. A tenyészközeg egy tápoldat vagy egy szilárd közeg legalább egy szokásos fém- és nitrogénforrással, valamint a szokásos szervetlen sókkal. Ha a tenyészközeghez hidroxilizint adunk, a Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) törzs a hidroxilizin elfogyasztása révén olyan (I) képletû vegyületté alakul át, amelyben R2 jelentése OH.
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
Az eljárást laborméretekben (ml–liter mérték) és ipari méretekben (köbméter mérték) lehet alkalmazni. A fermentáció szénforrásaként alkalmazhatók asszimilálható szénhidrátok és cukoralkoholok, így glükóz, laktóz, szacharóz vagy D¹mannit, valamint szénhidráttartalmú természetes termékek, mint például malátakivonat vagy élesztõkivonat. Nitrogéntartalmú tápanyagok például az aminosavak; peptidek és proteinek, valamint azok lebomlási termékei, például kazein, peptodon vagy triptonok; húskivonatok; élesztõkivonatok; glutén; õrölt magvak, például kukorica¹, búza¹, bab¹, szója- vagy gyapotmag; az alkoholelõállítás desztillációs maradékai; húslisztek; élesztõkivonatok; ammóniumsók; nitrátok. Elõnyös a nitrogénforrás egy vagy több szintetikusan, illetve bioszintetikusan nyert peptidekbõl. Szervetlen sók például az alkáli- vagy földalkálifémek kloridjai, karbonátjai, szulfátjai vagy foszfátjai, továbbá a vas¹, cink¹, kobalt- és mangánsók. Nyomelemek például a kobalt és a mangán. A találmány szerinti bengamidok képzõdéséhez megfelelõ körülmények a következõk: A találmány szerinti bengamidok képzõdése elõnyösen olyan tenyészközegben megy végbe, amely 0,05–5%, elõnyösen 0,1–2,5% élesztõkivonatot; 0,2–5,0%, elõnyösen 0,1–2% kazitont; 0,02–1,0%, elõnyösen 0,05–0,5% CaCl2×2H2O¹ot; 0,02–1,5%, elõnyösen 0,05–0,7% MgSO4×7H2O¹ot, valamint 0,00001%–0,001% cianokobalamint tartalmaz. A százalékos adatok mindig a teljes tápoldat súlyára vonatkoznak. A mikroorganizmus tenyésztése aerob módon, tehát például szubmerz módon megy végbe rázólombikokban vagy fermentorokban rázás vagy keverés mellett vagy szilárd közegen, adott esetben levegõ vagy oxigén bevezetése mellett. Mintegy 18–35 °C, elõnyösen mintegy 20–32 °C hõmérséklet-tartományban, különösen 27–30 °C¹on hajtható végre. A pH¹tartománynak 4 és 10 között kell lennie, elõnyösen 6,5 és 7,5 között. A mikroorganizmust ilyen körülmények között általában 2 naptól 10 napig, elõnyösen 72¹tõl 168 óráig terjedõ idõ alatt tenyésztjük. Elõnyösen több lépcsõben tenyésztünk, vagyis elõször folyékony tápközegben egy vagy több elõkultúrát állítunk elõ, amelyet azután átoltunk a tulajdonképpeni termelõközegbe, a fõtenyészetbe, például 1:10-tõl 1:100¹ig terjedõ térfogatarányban. Az elõtenyészetet például úgy kapjuk, hogy a törzset vegetatív sejtek vagy terméstestek alakjában tápoldatba átoltjuk, és mintegy 20–120 órán, elõnyösen 48–96 órán át növekedni hagyjuk. Vegetatív sejteket és/vagy terméstesteket például olyan módon kaphatunk, hogy a törzset mintegy 1–15 napon át, elõnyösen 4–10 napon át szilárd vagy folyékony táptalajon, például élesztõagaron növekedni hagyjuk. Egy (I) képletû bengamidszármazék elkülönítése, illetve tisztítása a tenyészközegbõl ismert módszerek szerint történik a természetes anyagok vegyi, fizikai és biológiai tulajdonságainak a figyelembevétele mellett. A mindenkori bengamidszármazékok koncentrációjának a tenyészközegben vagy egyes elkülönítõ lépésekben történõ vizsgálatához nagynyomású folyadékkromatográfiát használtunk, ahol a képzõdött anyag
1
HU 005 429 T2
tömegét célszerûen hitelesítõoldattal hasonlítottuk össze. Elkülönítéshez a tenyészoldatot vagy a tenyészközeget szilárd közeggel együtt liofilizáljuk, majd a bengamidszármazékokat szerves oldószerrel, például metanollal vagy 2¹propanollal extraháljuk a liofilizátumból. A szerves oldószerfázis tartalmazza a találmány szerinti természetes anyagokat, amelyeket adott esetben vákuumban betöményítünk és tovább tisztítunk. Egy vagy több találmány szerinti vegyület további tisztítása kromatografálással történik megfelelõ anyagokon, elõnyösen például molekulaszitán, kovasavgélen, alumínium-oxidon, ioncserélõkön vagy adszorber gyantákon, illetve fordított fázisban (reversed phase, RP). Ennek a kromatográfiának a segítségével választjuk el a bengamidszármazékokat. A bengamidszármazékok kromatografálása pufferelt vizes oldatokkal vagy vizes és szerves oldatok elegyeivel történik. Vizes vagy szerves oldatok elegyei alatt vízzel elegyedõ minden szerves oldószert értünk, elõnyösen metanolt, 2¹propanolt és acetonitrilt, 5–95% koncentrációjú oldószert, elõnyösen 5–40% koncentrációjú oldószert vagy minden pufferolt vizes oldatot, amely elegyedik szerves oldószerekkel. A felhasználandó pufferek ugyanazok, mint amilyeneket fentebb adtunk meg. A bengamidszármazékok elkülönítése eltérõ polaritásuk alapján fordított fázisú kromatografálással történik, például MCI® [Mitsubishi (Japán) adszorbens gyantája] vagy Amberlite XAD® (TOSOHAAS) gyantán, vagy további hidrofób anyagokon, amilyen például az RP¹8- vagy RP¹18-fázis. Ezenkívül történhet az elkülönítés normál fázisú kromatografálás segítségével, például kovasavgélen, alumínium-oxidon és hasonlókon. A bengamidszármazékok kromatografálása pufferelt bázisos vagy savanyított vizes oldatokkal vagy vizes oldatok alkoholokkal vagy egyéb, vízzel elegyedõ szerves oldószerekkel képzett elegyeivel történik. Szerves oldószerként elõnyösen acetonitrilt és metanolt használunk. Pufferelt bázisos vagy savanyított vizes oldatok alatt például vizet, foszfátpuffert, ammónium-acetátot, citrátpuffert értünk 0,5 M¹ig terjedõ koncentrációban, valamint hangyasavat, ecetsavat, trifluor-ecetsavat, ammónium-hidroxidot, trietil-amint vagy a szakember számára ismert minden kereskedelmi savat és bázist, elõnyösen 1%¹ig terjedõ koncentrációban. Pufferelt vizes oldatok esetén különösen elõnyös a 0,1%¹os ammónium-acetát. A kromatografálást olyan gradienssel végeztük, amely 100% vízzel kezdõdött és 100% oldószerrel végzõdött, elõnyösen 5–95% acetonitrilgradienssel dolgoztunk. Változatként lehet gélkromatografálást vagy hidrofób fázisokon végzett kromatografálást végezni. A gélkromatografálást poliakrilamid- vagy vegyes polimergéleken végezzük, így például Biogel¹P 2® (Biorad) vagy Fractogel TSK HW 40® (Merck, Németország) gélen. Az elõbb említett kromatografálások sorrendje megfordítható.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
Amennyiben a bengamidok diasztereomerekként fordulnak elõ, azokat ismert módszerekkel lehet elkülöníteni, például királis oszlopon végzett elválasztással. Az (I) képletû vegyületek (R3 jelentése mindig H) oldalláncában levõ OH¹csoportok átalakítása acilcsoporttá [R3 jelentése mindig –C(=O)–(C1–C6)-alkil] önmagában ismert módszerekkel történik (J. March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4. kiadás, 1992), például egy savanhidriddel végzett reagáltatással. Az ecetsavanhidriddel végzett átalakítását olyan (I) képletû vegyületté, amelyben R3 jelentése –C(=O)–CH3, például Adamczeski és munkatársai írták le (J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 647–654). Egy (I) képletû vegyület (ahol R1 jelentése mindig H) kaprolaktámgyûrûjében az NH¹csoport alkilezése szintén önmagában ismert módszerekkel történik (J. March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4. kiadás, 1992), például Me2CO3-tal vagy Me2SO4-tal végzett reakció útján a megfelelõ N¹metilezett származékok elõállításához, vagy pedig (C1–C6)-alkil-bromiddal végzett reakcióval egy bázis jelenlétében. A Myxococcus virescens ST200611 mikroorganizmus törzs egy izolátumát a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)-nél, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig, Németország, a budapesti szerzõdés szabályai szerint helyeztük letétben 2003. 09. 11¹én DSM 15898 számmal. A DSM 15898 törzs vegetatív sejtjei a Myxococcus virescensre jellemzõ pálcika formájúak. Szilárd táptalajokon a Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) narancssárga terméstesteket képez, amelyek gömbölyû mixospórákat tartalmaznak. A Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) törzs helyett annak mutánsait vagy variánsait is alkalmazhatjuk, amelyek a találmány szerinti vegyületek egy vagy több változatát képezhetik. Egy mutáns olyan mikroorganizmus, amelyben a genom egy vagy több génjét módosították, ahol az a gén vagy azok a gének funkcionálisan és örökölhetõen megmaradnak, amelyek felelõsek a szervezetnek azért a képességéért, hogy a találmány szerinti vegyületet hozza létre. Ilyen mutánsokat önmagában ismert módon elõ lehet állítani fizikai eszközökkel, például besugárzással, így ultraibolya vagy röntgensugarakkal, vagy kémiai mutagénekkel, így például etil-metánszulfonáttal (EMS); 2¹hidroxi-4-metoxi-benzofenonnal (MOB) vagy N¹metil-N’-nitroN-nitrozo-guanidinnel (MNNG), vagy a Brock és munkatársai által a „Biology of Microorganism” címû könyvben [Prentice Hall, 238–247. oldal (1984)] leírt módon. Egy variáns a mikroorganizmus fenotípusa. A mikroorganizmusok rendelkeznek azzal a képességgel, hogy alkalmazkodnak környezetükhöz, és ezért kifejezett fiziológiai flexibilitást mutatnak. A fenotípusos alkalmazkodásban a mikroorganizmus összes sejtje részt vesz, ahol a változás módja nincs genetikailag kondicionálva, és megváltozott körülmények között reverzíbilis (H. Stolp: „Microbial ecology: organisms, habitats, activities”, Cambridge University Press, Cambridge, Nagy-Britannia, 180. oldal, 1988).
1
HU 005 429 T2
Az olyan mutánsok és/vagy variánsok szkrínelése, amelyek egy vagy több találmány szerinti vegyületet szintetizálnak, a következõ séma szerint történik: – a fermentációs közeg liofilizálása, – a liofilizátum extrahálása egy szerves oldószerrel, – a vegyület extrahálása a tenyészközeg szûrletébõl szilárd fázisokkal, – elemzés HPLC-vel, DC¹vel vagy a biológiai hatékonyság vizsgálatával. A leírt fermentációs körülmények a Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) törzsre, valamint annak mutánsaira és variánsaira érvényesek. A sejtproliferáció gátlásának kimutatására olyan próbát használunk, amely az intracelluláris ATP-koncentráció meghatározásán alapszik. Felhasználhatunk ismert tumorsejtvonalakat, így például Hep-G2¹t és Colo205¹öt. Ebben a próbában a metabolikusan aktív sejtek ATP-tartalma luciferázreakciót vált ki, amely az élõ sejtek számának mértékét adja meg. A (II)–(IV) képletû vegyületeket a próbában 0,3–40 mM egységdózisban alkalmaztuk, és a dózisfüggést TC50-értékként adtuk meg, ahol (IIA) és (IIB) mindig a (II) képletû vegyület diasztereomerjét jelenti: 1. táblázat A bengamidok hatékonysága a sejtproliferációs próbában mint TC50-érték mM-ben Vegyület
Hep-G2
Colo 205
(II)
16
27
(IIA)
17
33
(IIB)
6
10
(III)
9
15
(IV)
>40
42
Bengamid E (összehasonlító kísérlet)
36
46
Bengamid F (összehasonlító kísérlet)
27
33
A találmány tárgya továbbá az (I) képletû vegyület vagy annak fiziológiailag elviselhetõ sójának az alkalmazása a humán- vagy állatgyógyászatban gyógyszerként, különösen rákos megbetegedések kezelésére és/vagy megelõzésére. A találmány elõnyösen egy (I) képletû vegyület vagy annak fiziológiailag elviselhetõ sójának az alkalmazására vonatkozik olyan gyógyszer elõállítására, amely mellrák, bélrák, májrák, agytumorok, petefészektumorok, nyelõcsõrák, veserák, izomsejt-karcinóma, különösen fej- és tarkóizom-karcinóma kezelésére szolgál. A jelen találmány továbbá olyan gyógyszerre vonatkozik, amely legalább egy (I) képletû vegyületet vagy annak fiziológiailag elviselhetõ sóját tartalmazza, ahol az (I) képletû vegyületet vagy vegyületeket mint olyanokat szubsztanciában lehet adagolni vagy elõnyösen egy vagy több szokásos, farmakológiailag megfelelõ hordozó- vagy segédanyaggal elegyítve. A találmány szerinti vegyületek szilárd állapotban és oldatokban 2 és 9 közötti, különösen 5 és 7 közötti
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2
pH¹tartományban stabilak, és bedolgozhatók a szokásos galenikus készítményekbe. A találmány szerinti gyógyszerek orálisan vagy parenterálisan adagolhatók, de elvileg rektális alkalmazás is lehetséges. Megfelelõ szilárd vagy folyékony galenikus készítményformák például a granulátumok, porok, tabletták, drazsék, (mikro)kapszulák, kúpok, szirupok, emulziók, szuszpenziók, aeroszolok, cseppek vagy injektálható oldatok ampulla alakban, valamint késleltetett hatóanyag-leadású készítmények, amelyek elõállításakor szokásos, gyógyászatilag megfelelõ hordozó- vagy segédanyagokat, így szétesést elõsegítõ, kötõ¹, bevonó¹, duzzasztó¹, csúsztató- vagy kenõanyagokat, ízesítõanyagokat, édesítõszereket vagy oldódást elõsegítõ anyagokat használunk, például magnézium-karbonátot, titán-dioxidot, laktózt és egyéb cukrokat, talkumot, tejfehérjét, zselatint, keményítõt, vitaminokat, cellulózt és annak származékait, állati vagy növényi olajokat, polietilénglikolokat és oldószereket, így például steril vizet, alkoholokat, glicerint és többértékû alkoholokat. A dózisegységeket orális adagoláshoz adott esetben mikrokapszulákba zárhatjuk annak érdekében, hogy késleltessük vagy hosszabb idõtartamra kitoljuk a hatóanyag-leadást, így például azáltal, hogy a hatóanyagot bevonjuk vagy beágyazzuk részecskeformában megfelelõ polimerekbe, viaszokba vagy hasonlókba. A gyógyászati készítményeket elõnyösen dózisegységekben állítjuk elõ és adagoljuk, ahol minden egyes egység hatóanyagként az (I) képletû bengamidszármazékok egy vagy több vegyületének meghatározott dózisát tartalmazza. Szilárd dózisegységeknél, így tablettáknál, kapszuláknál és végbélkúpoknál ez a dózis mintegy 500 mg¹ig, elõnyösen azonban mintegy 0,1-tõl 200 mg¹ig, és injekciós oldatoknál ampulla alakban mintegy 200 mg¹ig, elõnyösen azonban mintegy 0,5-tõl 100 mg¹ig terjedhet, az értékeket napi adagként értve. Az adagolandó napi dózis függ az emlõs testsúlyától, korától, nemétõl és állapotától. Bizonyos körülmények között azonban nagyobb vagy kisebb napi dózisok is alkalmazhatók. A napi dózis adagolása történhet egyszeri alkalommal egyszeri dózisegységek alakjában, vagy több kisebb dózisegységben, vagy pedig meghatározott idõközönként többszöri kisebb dózisok adagolásával is. A találmány szerinti gyógyszereket úgy állítjuk elõ, hogy egy vagy több (I) képletû találmány szerinti vegyületet egy vagy több szokásos hordozó- vagy segédanyaggal megfelelõ adagolási formába viszünk. A következõ példák a találmány közelebbi megvilágítására szolgálnak, anélkül azonban, hogy bármilyen módon korlátoznák a találmány oltalmi körét. Amennyiben nem közlünk egyéb adatokat, a százalékos adatok a súlyra, míg a keverési arányok folyadékoknál a térfogatra vonatkoznak.
55 1. példa: Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) beágyazása –135 °C¹on Egy agarlemezt (1% friss pékélesztõ, 1% CaCl2×2H2O, 20 mM HEPES, 0,00005% ciano-kobala60 min, 1,5% agar, pH 7,2) beoltunk a Myxococcus vires5
1
HU 005 429 T2
cens ST200611 (DSM 15898) törzzsel, és 7 napon át 30 °C¹on inkubáljuk. Ennek a felületi tenyészetnek a sejtjeit steril spatulával levakarjuk az agarfelületrõl, 0,5 ml kaszitonközegben [1% kasziton (Difco), 0,15% MgSO4×7H2O, pH 7,0] újraszuszpendáljuk és –135 °C tároljuk. 2. példa: A Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) elõtenyészetének elõállítása Erlenmeyer-lombikban 300 ml¹es Erlenmeyer-lombikban 100 ml tápoldatot (1% friss pékélesztõ, 1% CaCl2×2H2O, 20 mM HEPES, 0,00005% ciano-kobalamin, pH 7,2) beoltunk Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) törzzsel, és 4 napon át 30 °C¹on 180 percenkénti fordulatszámmal inkubáljuk forgó rázógépen. Ebbõl az elõtenyészetbõl ezután 5 ml¹t használunk a fõtenyészetek elõállítására. 3. példa: Folyékony Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) fõtenyészet elõállítása A következõ tápoldatot (0,5% élesztõkivonat, 0,5% kaziton, 0,1% CaCl 2 ×2H 2 O, 0,2% MgSO 4 ×7H 2 O, 0,00005% ciano-kobalamin, pH 7,4) tartalmazó, 300 ml¹es steril Erlenmeyer-lombikban beoltunk 5 ml elõtenyészettel (lásd a 2. példát) vagy egy friss agarlemezen növesztett tenyészettel (1% friss pékélesztõ, 1% CaCl2×2H2O, 20 mM HEPES, 0,00005% ciano-kobalamin, pH 7,2, hozzáadva 1,5% agar), és 180 percenkénti fordulatszámmal és 30 °C¹on rázógépen inkubáljuk. A találmány szerinti bengamidok maximális termelését 72–96 óra után érjük el. 10–200 literes fermentorok beoltásához elegendõ egy 72–96 óra korú szubmerz tenyészet (oltómennyiség kb. 5–10%) ugyanabból a tápoldatból, mint amilyet a 2. példában leírtunk. 4. példa: Folyékony Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) fõtenyészet elõállítása hidroxi-lizines táplálás mellett a (IV) bengamidszármazék elõállításához 100 ml következõ tápoldatot (0,5% élesztõkivonat, 0,5% kaziton, 0,1% CaCl2×2H2O, 0,2% MgSO4×7H2O, 0,00005% ciano-kobalamin, valamint 1 mM hidroxi-lizin, pH 7,4) tartalmazó, 300 ml¹es steril Erlenmeyer-lombikot beoltunk 5 ml 2. példa szerinti elõtenyészettel vagy egy friss agarlemezen növesztett tenyészettel (1% friss pékélesztõ, 1% CaCl 2 ×2H 2 O, 20 mM HEPES, 0,00005% ciano-kobalamin, pH 7,2, valamint 1,5% agar), és 180 percenkénti fordulatszám mellett 30 °C¹on inkubáljuk rázógépen. A (IV) bengamidszármazék maximális termelését 72–96 óra után érjük el. Az elemzést HPLC-MS-sel végeztük. 10–200 literes fermentorok beoltásához elegendõ egy 72–96 óra korú szubmerz tenyészet (oltómennyiség kb. 5–10%) ugyanabból a tápoldatból, mint amilyet a 2. példában leírtunk. 5. példa: Bengamidszármazékok elõállítása fermentorban A 10 l¹es és 30 l¹es fermentort a következõ körülmények mellett üzemeltettük:
2
Inokulum
Fermentor
5
Tápközeg Inkubálási hõmérséklet Keverési sebesség
10
15
kb. 5%
kb. 9%
301
101
lásd a 2. pél- lásd a 2. példát dát 30 °C
30 °C
112 fordulat/perc
150 fordulat/perc
Inokulum
kb. 5%
kb. 9%
Levegõztetés
8 l/perc
4 l/perc
pH-szabályozás
7,8 pH¹ról 7,5 pH¹ra
8,1 pH¹ról 7,5 pH¹ra
pO2-szabályozás
nincs
nincs
A pH¹szabályozást mindig 10%¹os KOH-dal, illetve 10%¹os H2SO4-tal végeztük. Clerol FBA 265 (Cognis Deutschland GmbH) ismételt hozzáadásával meg lehet gátolni a habképzõdést. A maximális termelést kb. 20 72–96 óra után érjük el. 6. példa: A (II) és (III) bengamidszármazékok elkülönítése, valamint a bengamid E és F elkülönítése (összehasonlító kísérlet) Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) rázott 25 tenyészeteikbõl A Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) fermentációjának befejezése után a 3. példa szerinti tenyészfolyadékot (30 l tenyészfolyadék) a biomasszával 30 együtt liofilizáljuk, és a liofilizátumot (2×5 l) metanollal extraháljuk. A metanolos extraktumot vákuumban 1,2 l¹re betöményítjük, és ezt követõen egy elõkészített oszlopra felvisszük, amely 1,5 l CHP-20P anyaggal (MCI® gél, 75–150 m, Mitsubishi Chemical Corporation) volt megtöltve, 95%¹os metanollal eluáltunk. Az oszlo35 pon átfolyó folyadékot (120 ml/min) felfogtuk, és vákuumban 1,5 l térfogatra betöményítettük. 7. példa: A (II) és (III) bengamidszármazékok elõzetes elkülönítése, valamint a bengamid E és F elõzetes elkülönítése (összehasonlító kísérlet) RP¹18 kromatográfiával A 6. példa szerint kapott 1,5 l oldatot felvittünk egy Phenomenex Luna® 10 m C18 (2) oszlopra (mérete: 45 50 mm×250 mm) Luna® 10 m C18 (2) elõoszloppal (mérete: 21,2 mm×60 mm), és 60 percen át eluáltuk 5%®95% acetonitrilgradienssel vízben (0,1% ammónium-acetát, pH 4,6 ecetsavval beállítva). Az átfolyás 150 ml/min, a frakció nagysága 200 ml volt. Bengami50 dot találtunk az 5–9., 10–11. és 12–14. frakcióban. 40
8. példa: A (II) és (III) bengamidszármazékok tisztítása, valamint a bengamid E és F tisztítása (összehasonlító kísérlet) A 7. példa egyes frakcióit liofilizáltuk, és HPLC-vel 55 egy Phenomenex Luna® 10 mm C18 (2) oszlopon (mérete: 21 mm×250 mm) XTerra® Prep MS C18 10 mm (Waters, mérete: 19×10 mm) elõoszloppal tisztítottuk. Az eluálást 40 percen át végeztük 5%®40% acetonit60 rilgradienssel vízben (0,1% ammónium-acetát-adalék6
1
HU 005 429 T2
kal, pH 8,8 trietil-aminnal beállítva). Az oszlop átfolyását (50 ml/min) frakcionáltan fogtuk fel (7,5 ml¹es frakciókként). A 7. példa 5–9. frakciója a (III) képletû vegyületet tartalmazta, és kromatografálás, valamint liofilizálás után 86 mg bengamid E¹t adott (tisztaság >95%). A 7. példa 10–11. frakciója kromatografálás után 145 mg bengamid (II)¹t (tisztaság >95%, 70/30 arányú diasztereomerelegy) és 5 mg bengamid F¹et adott (tisztaság: >95%). A 7. példa 12–14. frakcióiból 35 mg bengamid (III)¹at kaptunk (tisztaság: >95%) 75:25 arányú diasztereomerelegyként. A diasztereomereknél mindig a megfelelõ C–16 epimerekrõl van szó. 9. példa: A hidroxi-bengamid (IV) elkülönítése Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) rázott tenyészeteibõl A Myxococcus virescens ST200611 (DSM 15898) fermentációjának befejezése után az 5. példa tápfolyadékát (10 l tápfolyadék) a biomasszával együtt liofilizáltuk, és a liofilizátumot (2×3 l) metanollal extraháltuk. A metanolos extraktumot vákuumban 400 ml¹re betöményítettük, és ezt követõen egy elõkészített oszlopra felvittük, amely 0,6 1 CHP-20P anyaggal (MCI® gél, 75–150 m, Mitsubishi Chemical Corporation) volt megtöltve. Az eluálást 5%®95% metanollal vízben végeztük. Az oszlopátfolyást (100 ml/min) 60 percen keresztül frakcionáltan fogtuk fel (0,5 min frakciónként). A kívánt származékot tartalmazó frakciókat (45–109. frakció) egyesítettük és vákuumban 700 ml térfogatra betöményítettük. 10. példa: A hidroxi-bengamid (IV) elõtisztítása RP¹18 kromatográfiával A 9. példa oldatát ezt követõen felvittük egy Phenomenex Luna ® 10 m C18 (2) oszlopra (méret: 50 mm×250 mm) Phenomenex Luna® 10 m C18 (2) elõoszloppal (mérete: 21,2 mm×60 mm), és 60 percen át eluáltuk 5%®40% acetonitrilgradienssel vízben (0,1% ammónium-acetát, pH 8,8 trietil-aminnal beállítva). Az átfolyás 150 ml/min, a frakció nagysága 225 ml volt. A 22¹es frakció tartalmazta a kívánt bengamidszármazékot. 11. példa: A (IV) hidroxi-bengamid tisztítása A 10. példa 22¹es frakcióját liofilizáltuk és HPLC-vel ismét tisztítottuk Phenomenex Luna® 10 mm C18 (2) oszlopon XTerra ® Prep MS C18 10 mm (méret: 19×10 mm) elõoszloppal. Az eluálást 5%®95% acetonitrilgradienssel vízben végeztük 60 percen keresztül (0,1% ammónium-acetát-adalékkal, pH 4,6 ecetsavval beállítva). Az oszlopátfolyást (50 ml/min) frakcionáltan fogtuk fel (7,5 ml¹es frakciókkal). A bengamidtartalmú frakciókat (26–28. frakciók) egyesítettük, sómentesítettük és fagyasztva szárítottuk. Így 7 mg (IV) bengamidot kaptunk 75:25 arányú diasztereomerelegyként. 12. példa: A (II) képletû vegyület jellemzése Összegképlet: C18H32N2O6. Molekulasúly: 372,47. Diasztereomerelegy: 75:25.
2
5
(II) 10
15
2. táblázat A bengamid (II) NMR-kémiai eltolódásai, diasztereomerelegy, c=3 mg/ml DMSO-ban, 300 K Helyzet
1
20
25
35
40
13C
–
173,99
2
7,91
3
3,19/3,06
40,56
4
1,74/1,20
28,75
5
1,87/1,64
27,55
6
1,87/1,36
30,72
7
4,39
51,27
8
7,78
9
30
1H
–
–
– 169,61
10
3,69
81,60
10-OMe
3,25
57,32
11
3,58
70,72
11-OH
4,46
–
12
3,33
72,80
12-OH
4,36
–
13
3,97
72,46
13-OH
4,56
–
14
5,37
129,05
15
5,48
136,57
16
1,99
37,41
16-Me
0,93
19,90
17
1,26
29,15
18
0,81
11,58
45 13. példa: A (III) képletû vegyület jellemzése Összegképlet: C19H34N2O6. Molekulasúly: 386,49. Diasztereomerelegy: 75/25. 50 3. táblázat A bengamid (III) NMR-kémiai eltolódásai, diasztereomerelegy, c=3 mg/ml DMSO-ban, 300 K 55
Helyzet
1
60 7
1H
13C
–
171,95
2
2,91
35,28
3
3,61/3,21
49,20
1
HU 005 429 T2
2
3. táblázat (folytatás) Helyzet
1H
13C
4
1,71/1,31
26,13
5
1,82/1,67
27,11
6
1,84/1,32
30,80
7
4,55
51,14
8
7,84
–
9
–
5
10
169,54
Helyzet
1H
13C
11-OH
4,47
–
12
3,34
72,82
12-OH
4,38
–
13
3,97
72,47
13-OH
4,56
–
14
5,37
129,06
10
3,69
81,55
15
5,48
136,57
10-OMe
3,25
57,28
16
1,99
37,41
11
3,57
70,69
16-Me
0,93
19,90
11-OH
4,45
–
17
1,26
29,15
18
0,81
11,58
12
3,33
72,77
12-OH
4,37
–
13
3,97
72,47
13-OH
4,56
–
14
5,37
129,04
15
5,48
136,58
16
1,99
37,41
16-Me
0,93
19,89
17
1,26
29,15
18
0,81
11,58
15
20
25
30
35 4. táblázat A bengamid (IV) NMR-kémiai eltolódásai, diasztereomerelegy, c=3,1 mg/ml DMSO-ban, 300 K 40 1 2
1H
– 7,55
5. táblázat A bengamid E NMR-kémiai eltolódásai, c=3 mg/ml DMSO-ban, 300 K Helyzet
14. példa: A (IV) képletû vegyület jellemzése Összegképlet: C18H32N2O7. Molekulasúly: 388,46. Diasztereomerelegy: 75/25.
Helyzet
15. példa: A bengamid E jellemzése (összehasonlító kísérlet) Összegképlet: C17H30N2O6. Molekulasúly: 358,44.
13C
1
–
45
13C
–
174,01
2
7,91
3
3,19/3,06
40,56
4
1,74/1,20
28,75
5
1,87/1,64
27,56
6
1,87/1,36
30,72
7
4,39
51,27
8
7,78
–
9
173,45
1H
–
–
169,60
10
3,69
81,61
10-OMe
3,25
57,30
11
3,56
70,74
3
3,35/3,02
45,05
4
3,74
63,48
11-OH
4,49
–
4-OH
4,60
–
12
3,33
72,78
12-OH
4,38
–
5
1,81/1,75
34,28
6
1,68/1,64
24,25
13
3,96
72,38
7
4,32
51,18
13-OH
4,57
–
8
7,77
–
14
5,38
127,68
15
5,58
137,85
9
–
169,63
50
55
10
3,70
81,59
16
2,24
30,08
10-OMe
3,26
57,30
17
0,95
22,27
11
3,58
70,73
18
0,95
22,17
60 8
1
HU 005 429 T2
16. példa: A bengamid F jellemzése (összehasonlító kísérlet) Összegképlet: C18H32N2O6. Molekulasúly: 372,47.
8
6. táblázat A bengamid F NMR-kémiai eltolódásai, diasztereomerelegy, c=33 mg/ml DMSO-ban, 300 K 1H
Helyzet
5
10
1
–
2
2,91
3
3,62/3,21
4
1,69/1,33
5
1,84/1,69
6
1,84/1,33
7
4,56
8
7,84
9
–
10
3,70
10-OMe
3,25
11
3,57
12
3,33
13
3,97
14
5,38
15
5,59
16
2,25
17
0,95
18
0,95
15
20
25
30
35 17. példa: A (II) vegyület diasztereomerjeinek elválasztása A 3. példából származó (II) képletû vegyület diasztereomerelegyének elkülönítését királis oszlopon (AD/H, Daicel, 20×200 mm, 0,5 ml folyadékáram, futtatóanyag: acetonitril:metanol 4:1+0,1% NH4Ac) végeztük. Az optikai tisztaságot analitikai AD/H¹oszlopon (Daicel) (4,6×250 mm, 30 °C, futtatószer: acetonitril:metanol 4:1+0,1% NH4Ac, 0,75 ml folyadékáram, Rt 1¹es csúcs: 9,9 min, Rt 2¹es csúcs: 10,9 min) ellenõriztük.
40
45
7. táblázat A bengamid(II) diasztereomerjeinek NMR-kémiai eltolódásai, c=3 mg/ml DMSO-ban, 300 K 1H(A)
1H(B)
13C(A)
13C(B)
1
–
–
173,99
173,99
2
7,91
7,91
–
–
3
3,19/3,06 3,19/3,06
40,56
40,56
4
1,74/1,20 1,74/1,20
28,75
28,75
5
1,87/1,64 1,87/1,64
27,55
27,55
6
1,87/1,36 1,87/1,36
7
4,39
4,39
2
30,72
30,72
51,27
51,27
1H(A)
1H(B)
13C(A)
13C(B)
7,78
7,78
–
–
9
–
–
169,61
169,61
10
3,69
3,69
81,60
81,60
10-OMe
3,25
3,25
57,32
57,32
11
3,58
3,58
70,72
70,77
11-OH
4,46
4,47
–
–
12
3,33
3,33
72,80
72,85
12-OH
4,36
4,36
–
–
13
3,97
3,97
72,46
72,37
13-OH
4,56
4,56
–
–
14
5,37
5,38
129,05
129,01
15
5,48
5,49
136,57
136,44
16
1,99
1,99
37,41
37,28
16-Me
0,93
0,92
19,90
19,86
17
1,26
1,26
29,15
29,06
18
0,81
0,82
11,58
11,48
18. példa: Sejtproliferáció-mérések különbözõ tumoros sejtvonalakon A sejtproliferáció meghatározásához a Hep¹G2 (ATCC No. HB¹8065) és a COLO 205 (ATCC No. CCL–222) sejtvonalat használtuk. A sejtvonalakat 1000 sejt/lyuk [Hep¹G2], illetve 3500 sejt/lyuk [Colo205] sejtszámmal oltottunk be sejttápközegbe, és 4 órán át 37 °C¹on és 5% CO2 mellett inkubáltuk. A Hep¹G2 közege: Dulbecco-féle módosított Eagle-közeg/Ham’s F12-Mix (Gibco); NEAA (10%; nem esszenciális aminosavak, Gibco), nátrium-piruvát (1%, Gibco), L¹glutamin (1%, Gibco), borjúmagzatszérum (5%; PAA)]. COLO 205 közege: RPMI 1640 (Gibco), L¹glutamin (1%, Gibco), HEPES (1%, Gibco), borjúmagzatszérum (10%; PAA). 4 óra eltelte után a (II), (III), (IV) vegyületeket, valamint a bengamid E¹t és F¹et DMSO/sejttápközegben feloldva különbözõ hígításokban hozzáadtuk, és 72 órán át inkubáltuk 37 °C¹on és 5% CO2¹on. Az intracelluláris ATP-tartalom meghatározását CellTiterGlo (Promega) kísérleti reagens felhasználásával végeztük. A sejtproliferáció-vizsgálatok eredményeit az 1. táblázatban írjuk le.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 50 1. (I) képletû vegyület,
55
60 9
(I)
1
HU 005 429 T2
ahol R1 jelentése H vagy (C1–C6)-alkil, R2 jelentése H vagy OH, és R3 jelentése H vagy –C(=O)–(C1–C6)-alkil, vagy annak fiziológiailag elviselhetõ sója. 2. Az 1. igénypont szerinti vegyület, ahol R1 jelentése n, H vagy metil. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyület, ahol R3 jelentése H. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, ahol R1 jelentése H vagy metil, R2 jelentése H vagy OH és R3 jelentése H. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, jellemezve egy (II) képletû vegyület által
2
5
(III). 10 7. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, jellemezve egy (IV) képletû vegyület által
15
20 (IV). (II). 6. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, jellemezve egy (III) képletû vegyület által
8. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti, (I) képletû vegyület vagy e vegyület fiziológiailag elviselhetõ 25 sójának alkalmazása gyógyszer elõállítására. 9. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti, (I) képletû vegyület vagy e vegyület fiziológiailag elviselhetõ sójának alkalmazása rákos megbetegedések kezelésére és/vagy megelõzésére szolgáló gyógyszer elõállí30 tására. 10. Gyógyszer, amely az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti, legalább egy (I) képletû vegyületet vagy e vegyületnek egy fiziológiailag elviselhetõ sóját tartalmazza.
(III).
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
