!HU000004028T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 004 028
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 39/385
(21) Magyar ügyszám: E 03 730424 (22) A bejelentés napja: 2003. 05. 15. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030730424 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1506009 A1 2003. 11. 27. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1506009 B1 2008. 05. 14.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 0211118 2002. 05. 15. GB (72) (73) Feltalálók és szabadalmasok: Polonelli, Luciano, 43100 Parma (IT); Cassone, Antonio, 00147 Roma (IT)
(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
(54)
(2006.01) A61P 31/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 03097091 PCT/IB 03/002460
béta-Glükánalapú gombaellenes vakcinák
(57) Kivonat
HU 004 028 T2
A találmány tárgya immunogén készítmény, amely mannoproteintõl lényegében mentes, gombaeredetû b¹glükánt és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz, amelyet ha emlõsszervezetnek beadnak, a ké-
szítmény védõ antiglükán ellenanyagok termelõdését idézi elõ, de nem idézi elõ olyan ellenanyagok termelõdését, amelyek gátolják az antiglükán ellenanyagok védõhatását.
A leírás terjedelme 26 oldal (ezen belül 7 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 004 028 T2
A találmány tárgyát képezik vakcinák, pontosabban gombafertõzések és gombás megbetegedések elleni vakcinák. Gombafertõzések elterjedtek számos klinikai helyzetben, különösen legyengült immunrendszerrel rendelkezõ páciensekben. Antimikotikumok, különösen azolok elleni rezisztencia kialakulása egyre nagyobb érdeklõdésre tart számot az ilyen gombák elleni terápiás és profilaktikus vakcinációban [1]. Gombaeredetû patogének között a Candida albicans az egyik legelterjedtebb. Ez az organizmus egy alapvetõ ágens a széles körben elterjedt, opportunista fertõzések között emberekben, és kandidiázist (candidosist) okoz, amely normál- és legyengült immunrendszerrel rendelkezõ páciensekben egyaránt elõforduló állapot. Számos próbálkozás történt anti-Candida-vakcinák elõállítására. Orvosi mikológiai körökben általános egyetértés van abban, hogy a celluláris immunitás döntõ fontosságú egy gazdaszervezet gombák elleni védekezésében [2], bár figyelmet keltett a humorális immunitás potenciális hatása is két fontos gombapatogén (C. albicans és C. neoformans) ellen [2, 3]. C. neoformans esetén a tokban található glükuronoxilomannánról kimutatták, hogy védettséget közvetít fertõzek ellen állatmodellekben. C. albicansról kimutatták, hogy C. albicans sejtfelszíni mannoproteinjei domináns antigenikus komponensek [1], és mannánra, proteázokra és hõsokkfehérjékre specifikus ellenanyagok társultak fertõzéssel szembeni védelemben. Más anyagok is felmerültek vakcinajelöltként történõ alkalmazásra: aszpartilproteáz-család (Sap2); 65 kDa tömegû mannoprotein (MP65) [4]; foszfomannán-sejtfalkomplexbõl izolált adhéziós molekulák [5]; peptidek, amelyek a Candidában elõforduló foszfomannánkomplex mannánrészének epitópjait mimetizálják [6]; és hemolizinszerû fehérjék [7]. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tûztünk ki további és jobb antigének elõállítását védõ- és/vagy terápiás immunválaszok elõidézésére fertõzések, különösen gombafertõzések ellen. Candida-sejtek tartalmaznak minden szóba jöhetõ, nem szekretált, védõantigént, és bár ezek képesek nagymértékû humorális és sejtközvetített immunválaszokat kiváltani különféle antigének ellen, teljes sejtet tartalmazó vakcinák mégsem hatékonyak. Meglepõ módon azt találtuk, hogy ez az alacsony védelmi hatékonyság nem adott antigénekre adott immunválaszok hiánya miatt van, hanem inkább az állatszérumban lévõ, olyan blokkoló ellenanyagok jelenlétének tulajdonítható, amelyek képesek kölcsönhatást létesíteni az intakt gombasejt felszínével. Ilyen blokkoló ellenanyagok hiányában, antiglükán ellenanyagokról azt találtuk, hogy védõhatást képesek kifejteni szisztémás gombafertõzések ellen, de a védõhatást gátolja, ha blokkoló ellenanyagok vannak jelen. Gombaeredetû glükánok természetes körülmények között gyenge immunogének, és régebben nem tartották úgy, hogy védõhatást képesek kifejteni. Tehát a találmány tárgya immunogén készítmény, amely glükánt és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz, amelyet ha emlõsszervezetnek beadunk, a
2
készítmény védõ antiglükán ellenanyagok termelõdését idézi elõ, de nem idézi elõ olyan ellenanyagok termelõdését, amelyek gátolják az antiglükán ellenanyagok védõhatását. 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
A glükán A glükánok glükóztartalmú poliszacharidok, amelyek többek között gombasejtfalakban találhatók. Az a¹glükánok egy vagy több a¹kötést tartalmaznak a glükózalegységek között, a b¹glükánok pedig egy vagy több b¹kötést tartalmaznak a glükózalegységek között. Az a¹glükánok megtalálhatók különféle organizmusokban, például Streptococcus mutansban, amelynek sejtfala a-1,3- és a-1,6-glükánokat egyaránt tartalmaz. b-1,6-Glükánok gyakran elõfordulnak gombákban, azonban ritkábban kültéri gombákban [8]. Egy tipikus gombasejtfalban b-1,3-glükánmikrofibrillumok átszövik és keresztezik a kitinmikrofibrillumokat, ezáltal kialakítják a belsõ vázréteget, míg a külsõ réteg b-1,6-glükánból és mannoproteinekbõl áll, amely a belsõ réteghez kitinen és b-1,3-glükánon keresztül kapcsolódik. C. albicansban a sejtfal 50–70%-kal b-1,3- és b-1,6-glükánokból áll. C. albivans nem tartalmaz b-1,2-glükán(oka)t vagy b-1,4-glükán(oka)t. A teljes hosszúságú, natív b¹glükánok nem oldhatóak és általában elágazóak. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott glükánok a¹ és/vagy b¹kötéseket tartalmazhatnak. Ahol b¹kötések jelen vannak, a b¹kötések:a-kötések aránya a glükánban tipikusan legalább 2:1 (például 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, 20:1 vagy magasabb). A találmány elõnyös megvalósítási módjai szerint azonban a glükán csak b¹kötéseket tartalmaz. A b¹glükánokat részesítjük elõnyben. A b¹glükán egy vagy több b-1,3-kötést és/vagy egy vagy több b1,6-kötést tartalmazhat. Tartalmazhat egy vagy több b1,2-kötést és/vagy b-1,4-kötést is. Különösen elõnyösen a glükánok egy vagy több b-1,6-kötést tartalmaznak. A glükán lehet elágazó. Az elõnyösen alkalmazott glükánok Candida, például C. albicans sejtfalából származó b¹glükánok. Más organizmusok, amelyekbõl származó b¹glükánokat alkalmazni lehet: Coccidioides immitis, Trichophyton verrucosum, Blastomyces dermatidis, Ctyptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Saccharomyces cerevisiae, Paracoccidioides brasiliensis és Pythium insidiosum. Az elõnyösen alkalmazott glükánok gombaeredetû glükánok, azaz gombákban található glükánok. „Gombaeredetû” glükánhoz általában egy gombából juthatunk, de ha egy adott glükánstruktúra megtalálható gombákban és gombáktól eltérõ organizmusokban (például baktériumokban, alacsonyabb rendû növényekben vagy algákban) egyaránt, akkor a gombáktól eltérõ organizmus is használható alternatív forrásként. Teljes hosszúságú natív b¹glükánok nem oldhatóak, és molekulatömegük megadaltonos tartományban van. A találmány szerinti immunogén készítményekben elõnyösen oldható glükánokat alkalmazunk.
1
HU 004 028 T2
A szolubilizálás elérhetõ hosszú, nem oldható glükánok fragmentálásával. Ezt hidrolízissel, vagy célszerûbben glükanázos (például b-1,3-glükanázos vagy b1,6-glükanázos) emésztéssel lehet elérni. Egy alternatív módszer szerint rövid glükánokat szintetikusan lehet preparálni monoszacharid építõelemek összekapcsolásával. Elõnyösen alacsony molekulatömegû glükánokat alkalmazunk, különösen olyanokat, amelyek molekulatömege kisebb, mint 100 kDa (például kisebb, mint 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20 vagy 15 kDa). Olyan oligoszacharidokat is lehet alkalmazni, amelyek például 60 vagy kevesebb (például 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4) glükóz monoszacharidegységet tartalmaznak. Ebben a tartományban elõnyösen 10 és 50, vagy 20 és 40 közötti monoszacharidegységbõl felépülõ oligoszacharidok elõnyösek. Gombaeredetû b¹glükánok forrásai különfélék lehetnek. Például tiszta b¹glükánok kereskedelmi forgalomban elérhetõk, például pustulan (Calbiochem) Umbilicaria papullosából tisztított b-1,6-glükán. A b¹glükánokat gombasejtfalból különbözõ módszerekkel lehet tisztítani. A 9. hivatkozásban például leírnak egy kétlépéses eljárást vízben oldható b¹glükánextraktum elõállítására Candidából, amely sejtfalmannántól mentes, ahol az eljárásban NaClO-oxidációt és DMSO-extrakciót alkalmaznak. Az eredményül kapott termék („Candidából származó, szolubilis b¹glükán” vagy CSBG) fõleg lineáris b-1,3-glükánból áll, lineáris b-1,6-glükáncsoportokkal. b¹Glükán tisztítására szolgáló további módszereket leírunk a példákban, és a glükánrészecskék (más néven „ghost”¹ok, azaz kiürített sejtek, amik csak sejtfalból állnak) nagy tisztaságú b¹glükánt tartalmaznak. b-1,3-Glükánokról ismeretes, hogy egészséges étrend-kiegészítõként alkalmazzák [10]. A példákban leírtak szerint, elõnyösen olyan glükánokat alkalmazunk, amelyeket C. albicansból lehet kinyerni, különösen (a) b-1,3-glükánoldalláncokat tartalmazó b-1,6-glükánokat, és amelyek átlagos polimerizációs foka körülbelül 30, és (b) b-1,6-glükánoldalláncokat tartalmazó b-1,3-glükánokat, és amelyek átlagos polimerizációs foka körülbelül 4. Tiszta b¹glükánok azonban gyengén immunogének. Hatékony védelem céljából ezért a b¹glükánokat immunogén formában kell bemutatni az immunrendszernek. Ezt különféle módokon lehet elérni. A találmány két elõnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti készítményben lévõ b¹glükán: (a) proteázzal kezelt és/vagy mannoproteintõl kimerített gombasejtfal, amelyen felszíni b¹glükánok vannak; vagy (b) glükánból és hordozóból álló konjugátumok.
proteázzal, például Proteináz-K-val) kell kezelni. Az ilyen proteázos kezelés kimerítheti a mannoproteineket, és eltávolít olyan molekulákat, amelyek blokkoló ellenanyagok termelõdését idézik elõ. Tehát a találmány tárgyát képezi proteázzal kezelt 5 gombasejt, amely a felszínén hozzáférhetõ b¹glükánokkal rendelkezik. A gombasejt sejtfala elõnyösen mentes vagy lényegében mentes mannoproteinektõl. Szintén a találmány tárgyát képezi immunogén ké10 szítmény, amely gombaeredetû b¹glükánt és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz, amelyben a gombaeredetû b¹glükán proteázzal kezelt gombasejt egyik komponense. A gombasejt sejtfala elõnyösen mentes vagy lényegében mentes mannoproteintõl. 15 A készítmény elõnyösebben teljes egészében mentes vagy lényegében mentes mannoproteintõl. A gombasejt elõnyösen Candida, és elõnyösebben C. albicans. 20
25
30
35
40
45
50
55 Proteázzal kezelt gombasejtek b-Glükánokat gombasejtek felszínén lehet bemutatni az immunrendszernek. Mivel a b¹glükánok normálisan nem elegendõen immunogének a gombasejtek felszínén, a sejteket proteázzal (például egy aspecifikus
2
60 3
Glükán/hordozó konjugátumok Glükánokat glükán/hordozó konjugátumok formájában lehet bemutatni az immunrendszernek. Hordozófehérjéhez való konjugálás alkalmazása a szénhidrátantigének immunogenitásának fokozása céljából jól ismert [összefoglaló irodalom például 11–19 stb.], és különösen gyermekgyógyászatban használatos vakcinákban alkalmazzák [20]. A találmány tárgyát képezi (i) hordozófehérjébõl és (ii) glükánból álló konjugátum. A glükán elõnyösen a fentebb definiált b¹glükán, és elõnyösebben gombaeredetû b¹glükán, például amely b-1,6-kötéseket tartalmaz. A hordozófehérje elõnyösen kovalensen lehet konjugálva közvetlenül a glükánhoz, vagy linkert lehet alkalmazni. A fehérjéhez való közvetlen kapcsolásban a glükánt oxidálhatjuk, azt követõen reduktív aminálást lehet végezni a fehérjével, például a 21. és 22. hivatkozásban leírtak szerint. Linkercsoporton keresztüli kapcsolást bármilyen ismert módszerrel lehet végezni, például a 23. és 24. hivatkozásban leírt eljárások szerint. A kapcsolás elõnyös típusa adipinsavlinker, amelyet úgy lehet kialakítani, hogy egy szabad aminocsoportot kapcsolunk adipinsavval aminált glükánra (például diimidaktiválás alkalmazásával), és azután egy fehérjét kapcsolunk az eredményül kapott szacharid-adipinsav intermedierhez [15, 25, 26]. Egy másik elõnyös kapcsolási típus karbonillinker, amelyet úgy lehet kialakítani, hogy egy módosított glükán szabad hidroxilcsoportját CDI-vel reagáltatjuk [27, 28], azt követõen egy fehérjével reagáltatjuk, így karbamátkötést alakítunk ki. Más linkerek lehetnek b¹propionamido [29], nitro-fenil-etil-amin [30], haloacilhalidok [31], glikozidos kötések [32], 6¹amino-kapronsav [33], ADH [34], C4–C12-csoportok [35] stb. Hordozófehérjeként elõnyösen bakteriális toxinokat vagy toxoidokat alkalmazunk, például diftéria- vagy tetanusztoxoidot. Ezek általánosan alkalmazottak konjugátumot tartalmazó vakciákban. A CRM197 diftériatoxoid különösen elõnyös [36]. Más alkalmas hordozófe-
1
HU 004 028 T2
hérje például N. meningitidis külsõ membránfehérje [37], szintetikus peptidek [38, 39], hõsokkfehérjék [40, 41], pertussisfehérjék [42, 43], H. influenzaeból származó protein¹D [44], citokinek [45], limfokinek [45], hormonok [45], növekedési faktorok [45], C. dificilebõl származó A¹ vagy B¹toxin [46], vasfelvétellel társult fehérje [47] stb. Hordozófehérjéket lehet keverten is alkalmazni. Egyetlen hordozófehérjéhez több, különbözõ glükán is lehet kapcsolva [48]. Ha a glükánkomponens a találmány szerinti immunogén készítményben konjugátum formában van, a készítmény tartalmazhat szabad hordozófehérjét is [49]. Konjugálás után a szabad és a konjugált glükánokat el lehet választani. Több alkalmas módszer van, például hidrofób kölcsönhatásra alapuló kromatográfia, tangenciális ultraszûrés, diafoltráció stb. [lásd az 50., 51. hivatkozást is]. Elõnyösen tangenciális ultraszûrést alkalmazunk. A konjugátumban a glükáncsoport alacsony molekulatömegû glükán vagy oligoszacharid, a fentebb definiáltak szerint. Az oligoszacharidok tipikusan megfelelõ méretre vannak alakítva konjugálás elõtt. A fehérjehordozó konjugátum elõnyösen vízben és/vagy fiziológiás pufferben oldható. Ellenanyagok A találmány tárgyát képezi (1) glükánt felismerni képes ellenanyagot és (2) gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmazó készítmény. A glükán elõnyösen a fentebb definiált b¹glükán, és elõnyösebben gombaeredetû b¹glükán, például amely b-1,6-kötéseket tartalmaz. Az ellenanyag elõnyösen védõhatású ellenanyag, amely védettséget biztosít mikroorganizmusfertõzések és/vagy mikroorganizmusok által okozott betegségek ellen. A mikroorganizmus lehet gomba vagy baktérium, amelyekre példákat lentebb megadunk. A készítmény elõnyösen mentes vagy lényegében mentes olyan ellenanyagoktól, amelyek gátolják az antiglükán ellenanyagok védõhatását. Ha a glükán például gombaeredetû b-1,6-glükán, akkor a készítmény elõnyösen mentes vagy lényegében mentes nemglükán sejtfalalkotó komponensek elleni ellenanyagoktól, például antimannoprotein ellenanyagoktól. Az „ellenanyag” kifejezés a leírásban bármilyen rendelkezésre álló, természetes és mesterséges ellenanyagot és ellenanyagból származtatott fehérjét jelent. Tehát az „ellenanyag” kifejezés poliklonális ellenanyagokat, monoklonális ellenanyagokat, Fab-fragmenseket, F(ab)2-fragmenseket, Fv¹fragmenseket, egyláncú Fv(scFv¹) ellenanyagokat, oligotesteket stb. jelent. A találmány szerinti ellenanyag-tartalmú készítményeket passzív immunizálásra lehet alkalmazni. A humán immunrendszerrel való kompatibilitás fokozása céljából humán ellenanyagok alkalmazása elõnyös. Egy alternatív módszerben a találmány szerinti ellenanyagok lehetnek nem humán ellenanyagok kiméra vagy humanizált változatai [például 52. és 53. hivatkozás].
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2
Kiméra ellenanyagokban nem humán konstans régiók vannak helyettesítve humán konstans régiókkal, de a variábilis régiók megmaradtak nem humánnak. Humanizált ellenanyagokhoz különféle módszerek alkalmazásával lehet eljutni, például (1) komplementaritást meghatározó régiók (CDR¹ek) beültetésével nem humán variábilis régióból humán vázrégióba („CDRgrafting”), adott esetben egy vagy több vázrégiót alkotó, további aminosav bevitelével nem humán ellenanyagból („humanizálás”); (2) teljes, nem humán variábilis domének beültetésével, de humánszerû felszínnel „fedve” a felszínen elhelyezkedõ aminosavak cseréjével („veneering” azaz burkolás). A találmány szerinti megoldásban a humanizált ellenanyagok CDR-beültetéssel, humanizálással és variábilis régiók burkolásával lettek elõállítva [54–60. hivatkozások]. A humanizált ellenanyagok konstans régiói humán ellenanyagokból származnak. A konstans régió nehéz láncát az öt izotípus bármelyikébõl választhatjuk: a, b, e, g vagy m. Humanizált vagy teljesen humán ellenanyagokat olyan transzgenikus állatok alkalmazásával is elõállíthatunk, amelyek úgy lettek genetikailag módosítva, hogy humán Ig¹lókuszokat tartalmaznak. Például a 61. hivatkozásban leírnak olyan transzgenikus állatokat, amelyek humán Ig¹lókuszokkal rendelkeznek, ahol az állatok nem termelnek funkcionális endogén immunoglobulinokat az endogén nehéz és könnyû láncok lókuszainak inaktiválása miatt. A 62. hivatkozásban leírnak olyan transzgenikus nem fõemlõs emlõs gazdaszervezeteket, amelyek képesek immunválaszt elõidézni egy immunogénre, amelyekben az ellenanyagok fõemlõsbõl származó konstans és/vagy variábilis régiókat tartalmaznak, és amelyben az endogén immunoglobulint kódoló lókuszok szusztituálva vagy inaktiválva vannak. A 63. hivatkozásban leírják a Cre/Lox rendszer alkalmazását immunoglobulin-lókuszok módosítására emlõsszervezetben, például a konstans vagy variábilis régió egészének vagy részének helyettesítésére, módosított ellenanyag-molekula kialakítása céljából. A 64. hivatkozásban leírnak nem humán emlõs gazdaszervezeteket, amelyek inaktivált endogén Ig¹lókuszokkal és fukcionális humán Ig¹lókuszokkal rendelkeznek. A 65. hivatkozásban leírnak eljárásokat olyan transzgenikus egerek elõállítására, ahol az egérbõl hiányoznak az endogén nehéz láncok, és exogén immunoglobulin-lókuszt expresszálnak, amely egy vagy több xenogén konstans régiót tartalmaz. A találmány szerinti ellenanyagokat bármilyen alkalmas módszerrel elõ lehet állítani (például rekombináns expresszióval).
Gyógyászati kezelések és alkalmazások A találmány szerinti gyógyászati készítmények (a) 55 glükánt (például proteázzal kezelt sejt vagy hordozóglükán konjugátum formájában) és (b) gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaznak. A találmány tárgyát képezi glükán alkalmazása gombafertõzések emlõsszervezetben történõ prevenciójára 60 vagy kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására is. 4
1
HU 004 028 T2
Az emlõsszervezet elõnyösen ember. Az ember lehet felnõtt, vagy elõnyösen gyerek. Az ember immunrendszere lehet legyengült. A találmány szerinti megoldásban egyaránt alkalmazhatunk (i) immunogént és (ii) antiglükán ellenanyagot vagy az ellenanyagot kódoló nukleinsavat, egyidejûleg aktív és passzív immunizálás létrehozása céljából. Ezeket beadhatjuk külön-külön vagy kombinációban. Ha a beadás külön-külön történik, akkor a beadások tipikusan 7 napon belül lezajlanak. Együtt csomagolhatók egy reagenskészletben. Mivel a glükánok (és különösen b¹glükánok) lényegi és alapvetõ poliszacharidalkotó részek valamennyi patogén gombában, különösen azokban, amelyek legyengült immunrendszerû alanyok fertõzésében játszanak szerepet, és bakteriális patogénekben és protozoákban is, antiglükán ellenanyagok tág spektrumban hatásosak lehetnek patogének és betegségek ellen. Például S. cerevisiaevel végzett immunizálás után termelõdött glükánantiszérum keresztreagál C. albicansszal. Széles spektrumú immunitás különösen hasznos, mivel ezekkel a humán gombás fertõzõ ágensekkel szemben a kemoterápia elégtelen, gombaellenes gyógyszerekkel szemben rezisztencia alakul ki, és preventív és terápiás vakcinákkal szembeni igény egyre elfogadottabb. A találmány szerinti alkalmazások és eljárások különösen hasznosan az alábbi fertõzések kezelésére és ezekkel szemben védelemre: Candida fajok, például C. albicans; Cryptococcus fajok, például C. neoformans; Aspergillus fajok, például A. fumigatus és A. flavus; Pneumocystis fajok, például P. carinii; Coccidioides fajok, például C. immitis; Trichophyton fajok, például T. verrucosum; Blastomyces fajok, például B. dermatidis; Histoplasma fajok, például H. capsulatum; Paracoccidiodes fajok, például P. brasiliensis; és Pythium fajok, például P. insidiosum. Az alkalmazások és eljárások különösen hasznosak például az alábbi betegségek prevenciójára/kezelésére: candidosis, aspergillosis, cryptococcosis, dermatomycosis, sporothrychosis és más szubkután mycosis, blastomycosis, histoplasmosis, coccidiomycosis, paracoccidiomycosis, pneumocystosis és szájpenész. Anti- C. albicans-aktivitás különösen hasznos AIDSben szenvedõ páciensek fertõzéseinek kezelésében. A terápiás kezelés hatékonyságát a mikroorganizmusfertõzés követésével lehet tesztelni a találmány szerinti készítmény beadása után. A profilaktikus kezelés hatékonyságát b¹glükánnal szemben kialakult immunválasz (például anti-b-glükán ellenanyagok) követésével lehet tesztelni a készítmény beadása után. A találmány szerinti készítményeket általában közvetlenül egy páciensnek adjuk be. Közvetlen célba juttatást elvégezhetjük parenterális injekcióval (például szubkután, intraperitoneális, intravénás, intramuszkuláris vagy egy szövet intersticiális terébe), vagy rektális, orális, vaginális, topikális, transzdermális, okuláris, nazális, aurális vagy pulmonáris beadással. Injekció vagy intranazális beadás elõnyös.
2
A találmány szerinti megoldást szisztémás és/vagy mukozális immunitás elõidézésére lehet alkalmazni. A kezelés dózisadagolási rendje állhat egyetlen dózisból vagy több dózisból. 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
A gyógyászatilag elfogadható hordozó A gyógyászatilag elfogadható hordozó lehet bármilyen olyan anyag, amely önmagában nem indukál olyan ellenanyag-termelést, ami veszélyes a készítményt szedõ páciensre nézve, és amit be lehet adni nemkívánatos toxicitás nélkül. Alkalmas hordozók lehetnek nagyméretû, lassan lebomló makromolekulák, például fehérjék, poliszacharidok, politejsavak, poliglikolsavak, polimer aminosavak, aminosavkopolimerek és inaktív vírusrészecskék. Ilyen hordozók szakember számára jól ismertek. Gyógyászatilag elfogadható hordozók lehetnek folyadékok, például víz, nátrium-kloridoldat, glicerin és etanol. Segédanyagok, például nedvesítõ- vagy emulgeálóágensek, pH¹t pufferelõ anyagok és hasonlók szintén jelen lehetnek ilyen vivõanyagokban. Liposzómák alkalmas hordozók. Gyógyászatilag elfogadható hordozók alapos tárgyalása megtalálható a 94. hivatkozásban. Mikroorganizmusok fertõzései a test különféle területeit érinthetik, és ennek megfelelõen a találmány szerinti készítményeket különbözõ formákban lehet elõállítani. Például a készítményeket elõ lehet állítani injektálható formákban, akár folyékony oldatként vagy szuszpenzióként. Szilárd formák folyékony hordozókban alkalmasak oldatok vagy szuszpenziók elõállítására felhasználás elõtt. A készítményt elõ lehet állítani helyi felvitel céljára, például kenõcsként, krémként vagy porként. A készítményt elõ lehet állítani orális beadás céljára, például tablettaként vagy kapszulaként, vagy szirupként (adott esetben ízesítve). A készítményt elõ lehet állítani pulmonáris beadás céljára, például inhalálószerként, finom por vagy spray alkalmazásával. A készítményt elõ lehet állítani kúpként vagy pesszáriumként. A készítményt elõ lehet állítani nazális, aurális vagy okuláris beadás céljára, például cseppként, sprayként vagy porként [például 95. hivatkozás]. A készítményt tartalmazhatja szájvíz. A készítményt liofilizálni lehet. A gyógyászati készítmény elõnyösen steril. Elõnyösen pirogénmentes. Elõnyösen pufferolt, például pH=6 és pH=8 közötti, általában pH=7 körüli értékre. A találmány tárgyát képezi célba juttató eszköz is, amely találmány szerinti gyógyászati készítményt tartalmaz. Az eszköz lehet például fecskendõ vagy inhalálóeszköz.
Immunogén készítmények Az immunogén készítmények immunológiailag hatásos mennyiségû immunogént, valamint szükséges 55 esetben bármilyen más specifikált összetevõt tartalmaznak. Az „immunológiailag hatásos mennyiség” kifejezésen a leírásban azt értjük, hogy az ilyen mennyiség beadása egy egyednek akár egyetlen dózisban, akár egy sorozat részeként, hatásos kezelésre vagy preven60 cióra. Ez a mennyiség változhat a kezelendõ egyén 5
1
HU 004 028 T2
egészségi és fizikai állapotától, korától, a kezelendõ egyed taxonómiai csoportjától (például nem humán fõemlõs, fõemlõs stb.), az egyed immunrendszerének ellenanyag-szintetizáló kapacitásától, a védettség kívánt mértékétõl, a vakcina formájától, a kezelõorvos megítélésétõl az orvosi helyzetre vonatkozóan, és más releváns faktortól függõen. A mennyiség várhatóan viszonylag tág tartományba esik, amit rutinkísérletekkel meg lehet határozni. A kezelésre alkalmazott dózisadagolás történhet egyetlen dózisból vagy több dózisból álló adagolási rendben (például ismétlõdózisokat tartalmazhat). A készítményt beadhatjuk más immunszabályozó ágensekkel együtt. Bár a b¹glükánok önmagukban is adjuvánsok, az immunogén készítmények tartalmazhatnak további adjuvánst is. A készítmény hatékonyságát növelõ, elõnyösen alkalmazható adjuvánsok például: A) alumíniumvegyületek (például alumínium-hidroxid, alumínium-foszfát, alumínium-hidroxi-foszfát, oxihidroxid, ortofoszfát, szulfát stb., lásd például a 96. hivatkozás 8 & 9. fejezeteit) vagy különbözõ alumíniumvegyületek keverékei, a vegyületeket bármilyen alkalmas formában véve (például gél, kristályos, amorf állapot stb.), és az adszorpció elõnyös; B) MF59 (5% Squalene, 0,5% Tween–80 és 0,5% Span–85, szubmikronos részecskékre formázva mikrofluidizáló alkalmazásával) [lásd a 96. hivatkozás 10. fejezetét; és még a 97. hivatkozást is]; C) liposzómák [lásd a 96. hivatkozás 13 & 14. fejezeteit]; D) ISCOMs [lásd a 96. hivatkozás 23. fejezetét], amelyben elkerülhetõ további detergens alkalmazása [98. hivatkozás]; (E) SAF, amely 10% Squalene¹t, 0,4% Tween–80¹at, 5% L–121 jelû pluronicblokkolt polimert és thr-MDP¹t tartalmaz szubmikronos emulzióra mikrofluidizálva vagy vortexel nagyobb részecskeméretû emulzióként elõállítva [lásd a 96. hivatkozás 12. fejezetét]; (F) Ribi™ adjuvánsrendszer (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), amely 2% Squalene¹t, 0,2% Tween–80¹at és egy vagy több bakteriális sejtfalkomponenst tartalmaz az alábbiak közül: monofoszforil-lipid¹A (MPL), trehalóz-dimikolát (TDM) és sejtfalváz (CWS), elõnyösen MPL+CWS (Detox™); (G) szaponinadjuvánsok, például QuiIA vagy QS21 [lásd a 96. hivatkozás 22. fejezetét], amely Stimulon™-ként is ismert; (H) chitosan [például 99. hivatkozás]; (I) komplett Freund-adjuváns (CFA) és inkomplett Freund-adjuváns (IFA); (J) citokinek, például interleukinek (például IL–1, IL–2, IL–4, IL–5, IL–6, IL–7, IL–12 stb.), interferonok (például interferon-gamma), makrofág kolóniastimuláló faktor, tumornekrózis-faktor stb. [lásd a 96. hivatkozás 27. & 28. fejezeteit]; (K) mikrorészecskék (azaz körülbelül 100 nm és körülbelül 150 nm közötti részecskeátmérõvel, elõnyösebben körülbelül 200 nm és körülbelül 30 mm közötti részecskeátmérõvel, és a legelõnyösebb körülbelül 500 nm és körülbelül 10 mm közötti részecskeátmérõvel), amelyek biológiailag lebontható és nem toxikus anyagokból lettek elõállítva [például poli-(a-hidroxisav), például poli-(laktid-koglikolid), polihidroxi-vajsav, egy poli-orto-észter, egy polianhidrid, egy polikaprolakton stb.]; (L) monofoszforil-lipid¹A (MPL) vagy 3¹O-dezacetilált MPL (3dMPL) [például a 96. hivatko-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
zás 21. fejezete]; (M) 3dMPL kombinációi például QS21¹el és/vagy „olaj a vízben” emulziókkal [100]; (N) oligonukleotidok, amelyek CpG-motívumokat tartalmaznak [101], azaz legalább egy CG¹dinukleotidot tartalmaznak, adott esetben citozin helyett 5¹metil-citozin alkalmazásával; (O) poli(oxi-etilén)-éter vagy poli(oxietilén)-észter [102]; (P) poli(oxi-etilén)-szorbitán-észter felületaktív anyag egy oktoxinollal kombinációban [103], vagy poli(oxi-etilén)-alkil-éter vagy észter felületaktív anyag legalább egy további, nemionos felületaktív anyaggal, például egy oktoxinollal kombinációban [104]; (Q) egy immunstimuláns oligonukleotid (például egy CpG-oligonukleotid) és egy szaponin [105]; (R) egy immunstimuláns és egy fémsó-részecske [106]; (S) egy szaponin és „olaj a vízben” emulzió [107]; (T) egy szaponin (például QS21)+3dMPL+IL–12 (adott esetben + egy szterol) [108]; (U) E. coliból származó hõlabilis enterotoxin („LT”), vagy detoxikált mutánsai, például a K63 vagy R72 jelû mutánsok [lásd például a 109. hivatkozás 5. fejezetét]; (V) koleratoxin („CT”), vagy detoxikált mutánsai [lásd például a 109. hivatkozás 5. fejezetét]; (W) dupla szálú RNS; (X) monofoszforil-lipid-A-mimetikumok, például amino-alkil-glükózaminid-foszfát-származékok, például RC–529 [110]; (Y) polifoszfazén (PCPP); vagy (Z) bioadhezív anyag [111], például észteresített hialuronsav-mikrorészecskék [112] vagy mukoadhezív anyag az alábbiak által alkotott csoportból kiválasztva: poli-(akrilsav) keresztkötött származékai, poli(vinil-alkohol), poli(vinil-pirrolidon), poliszacharidok és karboxi-metil-cellulóz. Más olyan anyagokat is lehet alkalmazni, amelyek immunstimuláns ágensként képes mûködni a készítmény hatékonyságának fokozása céljából [lásd például a 96. hivatkozás 7. fejezetét]. Alumíniumsók (különösen alumínium-foszfátok és/vagy hidroxidok) elõnyösen alkalmazott adjuvánsok parenterális immunizálásra. Mutáns toxinok mukozális adjuvánsként elõnyösek. Muramilpeptidek közé tartoznak N¹acetil-muramil-Ltreonil-D-izoglutamm (thr-MDP), N¹acetil-normuramil-Lalanil-D-izoglutamin (nor-MDP), N¹acetil-muramil-L-alanil-D-izoglutamil-L-alanin-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero3-hidroxi-foszforil-oxi)-etil-amin MTP¹PE) stb. Készítménybe formázva a találmány szerinti készítmények közvetlenül beadhatók az alanynak. A kezelendõ alanyok lehetnek állatok; különösen emberi alanyokat lehet kezelni. A vakcinák különösen gyerekek és tizenévesek oltására alkalmasak. A találmány szerinti immunogén készítményeket terápiásan (azaz meglévõ fertõzések kezelésére) vagy profilaktikusan (azaz egy jövõbeli fertõzés megelõzésére) lehet alkalmazni. A terápiás immunizálás különösen alkalmas legyengült immunrendszerrel rendelkezõ alanyokban Candida-fertõzés kezelésére. A b¹glükánon kívül a készítmény tartalmazhat további antigenikus komponenseket. A készítmény tartalmazhat például egy vagy több, további szacharidot. A készítmény tartalmazhat például Neisseria meningitidis A¹, C¹, W135- és/vagy Y¹szerocsoportjaiból származó szacharidokat. Ezek tipikusan hordozófehérjéhez lehetnek konjugálva, és Neisseria meningitidis kü-
1
HU 004 028 T2
lönbözõ szerocsoportjaiból származó szacharidok ugyanahhoz vagy különbözõ hordozófehérjékhez lehetnek konjugálva. Abban az esetben, ha egy keverék A¹ és C¹szerocsoportból egyaránt tartalmaz tokot felépítõ szacharidokat, a MenA-szacharid és a MenCszacharid (tömeg¹) aránya elõnyösen 1¹nél nagyobb (például 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 vagy nagyobb). Megfigyelték a MenA-komponens javított immunogenitását, ha feleslegben (tömeg/dózis) volt a MenC-komponenshez képest. A készítmény tartalmazhat fehérjeantigéneket is. A találmány szerinti készítmény által tartalmazott antigének az alábbiak lehetnek: – Heliobacter pyloriból származó antigének, például CagA [113–116], VacA [117, 118], NAP [119, 120,121], HopX [például 122], HopY [például 122] és/vagy ureáz; – N. meningitidis B¹szerocsoportból származó fehérjeantigén, például a 123–129. hivatkozásokban leírtak, különösen elõnyösen protein-’287’-tel (lásd lentebb) és származékaival (például ’DG287’); – N. meningitidis B¹szerocsoportból származó külsõmembrán-vezikulum- (OMV) preparátum, például a 130, 131, 132, 133 stb. hivatkozásokban leírtak; – N. meningitidis C¹szerocsoportból származó szacharidantigén, például a 134. hivatkozásban leírt, C¹szerocsoportból származó oligoszacharid [lásd még a 135. hivatkozást]; – Streptococcus pneumoniaeból származó szacharidantigén [például 136, 137, 138]; – hepatitis A¹vírusból származó antigén, például inaktivált vírus [például 139, 140]; – hepatitis B¹vírusból származó antigén, például felszíni és/vagy magantigének [például 140,141]; – hepatitis C¹vírusból származó antigén [például 142]; – Bordatella pertussisból származó antigén, például pertussisholotoxin (PT) és B. pertussis filamentumos hemagglutinin (FHA), adott esetben kombinációban pertactinnnal és/vagy 2. és 3. agglutinogénekkel [például 143. és 144. hivatkozások]; – diftériaantigén, például diftériatoxoid (például a 145. hivatkozás 3. fejezete), például a CRM197mutáns [például 146]; – tetanuszantigén, például tetanusztoxoid [például a 145. hivatkozás 4. fejezete]; – Haemophilus influenzae B¹bõl származó szacharidantigén [például 135]; – N. gonorrhoeaeból származó antigén [például 123, 124, 125]; – Chlamydia pneumoniaebõl származó antigén [például 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153]; – Chlamydia trachomatisból származó antigén [például 154]; – Porphyromonas gingivalisból származó antigén [például 155]; – polioantigén(ek) [például 156, 157], például IPV vagy OPV;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
– veszettség (rabies) antigén(ek) [például 158], például liofilizált inaktivált vírus [például 159, RabAvert™]; – kanyaró¹, mumpsz- és/vagy rubeolaantigének [például a 145. hivatkozás 9., 10. és 11. fejezete]; – influenzavírusból származó antigén(ek) [például a 145. hivatkozás 19. fejezete], például hemagglutinin és/vagy neuraminidáz felszíni fehérjék; – paarmyxovírusból, például respirációs syncytialis vírusból (RSV) [160, 161] és/vagy parainfluenzavírusból [PIV3, 162] származó antigén(ek); – Moraxella catarrhalisból származó antigén [például 163]; – Streptococcus agalactiaebõl (streptoccus B¹csoport) származó antigén [például 164, 165]; – Streptococcus pyogenesbõl (streptoccus A¹csoport) származó antigén [például 165, 166, 167]; – Streptococcus aureusból származó antigén [például 168]; – Bacillus anthracisból antigén [például 169, 170, 171]; – flaviviridae-családhoz (genus flavivirus) tartozó vírusból, például sárgaláz vírusából, japán encephalitis vírusából, Dengue-vírus négy szerotípusából, kullancsok által terjesztett encephalitis vírusából, West Nile vírusból származó antigén; – pestivírusból, például klasszikus sertésláz vírusából, marhában elõforduló vírusos hasmenés vírusából és/vagy borderbetegség vírusából származó antigén; – parvovírusantigén, például parvovírus-B19-antigén. A készítmény ezekbõl a további antigénekbõl egyet vagy többet tartalmazhat. Toxikus fehérjeantigének szükséges esetben detoxikálva lehetnek (például pertussistoxin kémiai és/vagy genetikai módszerekkel lehet detoxikálva) [144]. Ha a készítmény diftériaantigént tartalmaz, abban az esetben elõnyösen tetanuszantigént és pertussisantigéneket is tartalmaz. Ehhez hasonlóan, ha tetanuszantigént tartalmaz, abban az esetben elõnyösen diftéria- és pertussisantigéneket is tartalmaz. Az antigének elõnyösen alumíniumsóhoz vannak adszorbeálva. A készítményben lévõ antigének tipikusan egyenként legalább 1 mg/ml koncentrációban vannak jelen. Egy adott antigén koncentrációja általában elegendõ immunválasz elõidézéséhez az antigén ellen. A találmány szerinti készítményben fehérjeantigének alkalmazásának egy alternatív lehetõsége lehet az antigént kódoló nukleinsav alkalmazása. A találmány szerinti készítmények fehérjekomponensét tehát a fehérjét kódoló nukleinsavval (elõnyösen DNS-sel, például plazmid formájában) lehet helyettesíteni. A találmány szerinti készítményeket gombaölõ szerekkel együtt lehet alkalmazni, különösen olyan esetben, ha a páciens már megfertõzõdött. A gombaölõ szerek azonnali terápiás hatást biztosítanak, míg az immunogén készítmény hosszan tartó hatást biztosít. Alkalmas gombaölõ szerek lehetnek például azolok
1
HU 004 028 T2
(fluconazol, itraconazol), poliének (például amfotericin¹B), flucytozin és szkvalénepoxidáz-inhibitorok (például terbinafine) [lásd még a 172. hivatkozást is]. A gombaölõ szert és az immunogén készítményt be lehet adni külön-külön vagy kombinációban. Ha különkülön adjuk be, tipikusan egymáshoz képest 7 nap különbséggel adjuk be. Az immunogén készítmény elsõ beadása után a gombaölõ szert egynél több alkalommal is be lehet adni.
5
10 Definíciók A „tartalmaz” kifejezés a leírásban egyaránt jelentheti azt, hogy „benne van” és „áll valamibõl”, például egy készítmény X¹et „tartalmaz”, akkor állhat kizárólag X¹bõl, vagy tartalmazhat valami mást is, például lehet X+Y. Az ábrák rövid leírása Az 1. ábrán bemutatjuk az immunfluoreszcensadatokat. A sejtek kezeletlen ’Y’ gombasejtek (1A, 1C, 1E), vagy proteázzal kezelt ’YDP’ sejtek (1B, 1D, 1F). A jelölésre használt ellenanyag Y¹antiszérum (1A, 1B), YDP-antiszérum (1C, 1D) vagy antimannoprotein ellenanyag AF1 (1E, 1F). A 2. ábrán bemutatjuk az átlagos stimulációs index értékeit (± szórás), melyet a kísérleti csoportokban mértünk nem stimulált kontrolltenyészetekhez képest. A csillagok szignifikáns különbségeket jelölnek a kontrollokhoz képest (* p<0,05 vagy ** p<0,001, ANOVA és Bonferroni-féle többmintás t¹próbával meghatározva). Az összes többi változás a proliferatív válaszban nem volt szignifikáns. A 3. ábrán bemutatjuk a letális fertõzési kísérletek eredményeit. A 3A. és 3B. ábrán bemutatjuk a túlélõ állatok számát a fertõzés után. A 3C. ábrán bemutatjuk a vesefertõzés adatait. A 4. és 5. ábrán bemutatjuk szérumok elõzetes adszorpciójának hatását passzív immuntranszferre. A 6. ábrán látható egy tipikus C. albicans sejtfalának vázlatos szerkezete, amelyben bemutatjuk a különbözõ rétegeket: plazmamembrán (PM), mannoproteinzóna (M1), glükánkitin (GC), glükán (G), mannoprotein (M2) és külsõ fibrilláris réteg (F). A 7. ábrán bemutatjuk glükán-CRM197-konjugátum elúciós képét, és a 8–11. ábrákon bemutatjuk a konjugátum analízisét. A 8. és 10. ábrán a konjugátum SDSPAGE-géljei láthatók, ultraszûrés elõtt (8) és után (10). A 9. és 11. ábrán a konjugátum immunoblotjai láthatók, ultraszûrés elõtt (9) és után (11).
15
20
25
30
2
A 12. ábrán bemutatjuk a Bio-Gel P–2 oszlop elúciós képét. A frakciószámokat a X tengelyen, az OD214-értékeket az Y tengelyen tüntetjük fel. A 13. ábrán bemutatjuk a laminarin–CRM197-konjugátumok SDS-PAGE analízisét. Mannoproteinre kimerített élesztõsejtek elõállítása Rutinszerûen fenntartotuk az „Istituto Superiore di Sanitá” törzsgyûjteménybõl (Róma, Olaszország) származó C. albicans BP¹törzset (A¹szerotípus) ferde Sabouraud-agaron. Valamennyi kísérlethez a gombákat élesztõ formában tenyésztettük folyékony Winge-tápközegben, 28 °C¹on, kétszer mostuk nátrium-klorid-oldattal, a sejteket hemocitométerben számláltuk, és újra felszuszpendáltuk kívánt koncentrációban steril nátrium-klorid-oldatban. Normálsejtek („Y-sejtek”) elõállítása céljából, élesztõsejt-szuszpenziókat (108 sejt/ml) 80 °C¹on inaktiváltunk 30 percig, 4 °C¹on mostuk és tároltuk egy hétnél nem tovább. Mannoproteinre kimerített sejtek („YDP-sejtek”) elõállítása céljából, a fentebb leírtak szerint kezelt, hõinaktivált Y¹sejteket 5 mM EDTA-Na2-ban oldott, 50 mM DTT-vel kezeltünk (1 óra, 37 °C), 500 mg/ml ProteinázK¹t (Sigma) adtunk az emésztõkeverékhez, és a sejteket egy további óráig kezeltük 37 °C¹on. A gombasejteket alaposan mostuk nátrium-klorid-oldattal az enzim eltávolítása céljából, újra felszuszpendáltuk nátriumklorid-oldatban és közvetlenül ezután felhasználtuk. C. albicans csíratömlõ („germ tube”, röv. GT) vagy fonalas formáihoz Lee-féle tápközegben való tenyésztéssel jutottunk 37 °C¹on.
Immunizálás Y¹sejtekkel vagy YDP-sejtekkel Nõstény, 4 hetes CD2F1- és SCID-egereket (Charles River Laboratory, Calco, Olaszország) immunizáltunk Y¹ vagy YDP-sejtekkel. Az egereket szubkután injektáltuk Y¹ vagy YDP-sejtekkel kétszer, egyhetes idõ40 közt hagyva (106 sejt/100 ml/egér) komplett Freund-adjuvánsban (Sigma), és ötször intraperitoneálisan ugyanilyen számú sejttel adjuváns nélkül. Kontrollállatokat csak Freund-adjuvánssal és nátrium-klorid-oldattal injektáltunk. 45 Az immunválasz analízise Az Y¹sejtek tartalmaztak minden, C. albiacansból származó, antigenikus sejtfalalkotó részt és citoplazmás összetevõt, és így alkalmasnak kell lenniük ege50 rek immunizálására valamennyi ilyen antigén ellen. A proteázkezelés miatt viszont az YDP-sejteknek nem kell képesnek lenniük konzisztens immunreakciót indukálni sejtfelszíni alkotórészek ellen. Az ellenanyag-válaszok meghatározása céljából 55 immunizált állatokat retroorbitális szúrással elvéreztettük, és az egyes immunizálási csoportokba tartozó, egyesített szérumokat ellenanyag-tartalmukra vizsgáltuk immunfluoreszcensvizsgálati eljárásokkal. Y¹ vagy YDP-sejteket vittünk fel mikroszkóp-tárgylemezekre, 60 és különbözõ hígításban rágcsálóból származó anti¹Y35
8
1
HU 004 028 T2
vagy anti-YDP-szérumokkal vagy AF1 jelû monoklonális ellenanyaggal (C. albicans felszínén nagymértékben expresszálódó b-1,2-mannooligoszacharid-epitópra specifikus) reagáltattuk 0,01 M PBS-ben. Alapos mosások után a tárgylemezeket FITC-konjugált, antiegérIgM ellenanyaggal kezeltük, és Leitz Diaplan fluoreszcensmikroszkóppal vizsgáltuk azokat. Anti-YDP-szérum erõsen reaktív volt immunfluoreszcenciában YDP-sejtekkel (1B. ábra), de nagyon gyengén volt reaktív Y¹sejtekkel (1D. ábra). Viszont az AF1 jelû antimannoprotein ellenanyag Y¹sejtekkel reagált (1E. ábra), de YDP-sejtekkel nem (1F. ábra). YDPsejtek felszíni, mintázata tehát nagyon eltér Y¹sejtek felszíni mintázatától. A szérumokat ELISA-val is vizsgáltuk. Polisztirol mikrotitertálcákat burkoltunk antigénekkel 5,0 mg/ml koncentrációban, karbonátpufferben, pH=9,6–n. A tálcákat 3% kazeinnel blokkoltuk foszfátpufferolt nátriumkloridban (PBS-ben), kétszeres hígítású egérszérummal reagáltattuk 0,05% Tween 20¹at tartalmazó PBSben, és szekunder ellenanyagként alkalikus foszfatázzal konjugált, nyúlban termeltetett, antiegér-IgG-vel vagy IgM-mel hívtuk elõ, az enzim szubsztrátjaként p¹nitro-fenil-foszfát nátriumsót adtunk hozzá. Az adjuvánssal immunizált egerektõl vett, egyesített szérumokat használtuk negatív kontrollként. A tálcákat leolvastuk 405 nm¹en, és az ellenanyagtitereket úgy definiáltuk, mint az egérszérum legnagyobb olyan hígítása, amelyre leolvasott OD legalább kétszerese volt a negatív kontrollra leolvasott OD¹értéknek. Hét antigént alkalmaztunk: – C. albicans Y¹sejtek (106/mérõhely); – C. albicans csíratömlõsejtek (106/mérõhely); – laminarin (b-1,3-glükán, Sigma); – pustulan (b-1,6-glükán, CalbioChem); – gombaeredetû mannoprotein (’Secr-MP’), Lee-féle tápközegben 28 °C¹on tenyésztett, 24 órás gombatenyészet felülúszójából preparált; – mannoprotein-frakció MP¹F2, C. albicans sejtfalból tisztított; és – C. albicans szolubilis glükánantigének (GG-zym), amelyet (i) elõállítottunk glükánrészecskéket („ghost”) gombasejtfalak forró lúgos-savas extrakciójával, így jutottunk tisztított b-1,3- és b-1,6-glükánokhoz, és (ii) a glükánrészecskéket („ghost”okat) b-1,3-glükanázzal (Zymoliase 100T, Seikagaku), 1 óra hosszáig, 37 °C¹on emésztettük. Az eredményeket az alábbiakban bemutatjuk, az értékek három közül az egyik reprezentatív kísérlet eredményei, mindháromban hasonló eredményekhez jutottunk. Antigén
Antigén
anti-YDP-szérum
Y-sejtek
1,28
40
Csíratömlõ
1,28
40
b-1,3-Glükán
2,56
2,56
Ellenanyagtiterek (´103) anti-Y-szérum
5
b-1,6-Glükán Secr-MP MP-F2
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ellenanyagtiterek (´103) anti-Y-szérum
2
55
60 9
GG-Zym
2,56
anti-YDP-szérum
1,28
2,56
80
>2,56
320
2,56
2,56
Tehát az Y¹sejt ellen termeltetett szérum valamennyi fontos sejtfalalkotó rész ellen tartalmazott ellenanyagokat, amelyek akár Y, akár GT formában voltak, ideértve b-1,6 és b-1,3-glükánokat, valamint a fõ citoplazmás antigénekkel szemben is. Ezzel ellentétben, és a várakozásnak megfelelõen, YDP-sejtek ellen termeltetett szérum megnövekedett titerben tartalmazott antiglükán ellenanyagokat, de alacsony titerben tartalmazott a teljes élesztõ- vagy csíratömlõsejtekre, valamint a felszínen elhelyezkedõ vagy szekretált mannoproteinekre specifikus ellenanyagokat. Sejtközvetített immunitás indukálásának vizsgálata céljából Y¹ vagy YDP-sejtekkel végzett immunizálás után kontroll- vagy immunizált egerek lépsejtjeit indukáltuk in vitro proliferációra Y¹ vagy YDP-sejtek, valamint a b¹glükánpreparátum jelenlétében. Röviden összefoglalva, 3 ml, 0,16 M Tris-pufferolt ammónium-kloridban, pH=7,2¹n splenocitaszuszpenziót adtunk 9 ml komplett tápközeghez (5% magzati borjúszérummal, 100 U/ml penicillinnel, 100 mg/ml sztreptomicinnel, 1 mM nátrium-piruváttal, 2 mM L¹glutaminnal, MEM nem esszenciális aminosavakkal, 10--5 M 2¹merkapto-etanollal kiegészített RPMI 1640). A splenocitákat centrifugálással mostuk, és több tenyésztõhelyet tartalmazó tálcákra szélesztettük (106/ml, 200 ml/tenyésztõhely), és Y¹ vagy YDP-sejtekkel (105/tenyésztõhely), a GG¹zym-frakcióval (50 mg/ml) vagy Concanavalin-A-val (2 mg/ml=kontroll) stimuláltuk. Az egyes állapotokat három párhuzamos kísérletben vizsgáltuk. Splenocitatenyészeteket inkubáltunk 37 °C¹on, 5% szén-dioxid-atmoszférában. A proliferációt 3H-timidin-beépülésként elemeztük 4 nap múlva az antigénstimulusokra, és 2 napos inkubálás után a poliklonális kontrollstimulálásra. A stimulációs indexeket úgy számítottuk, hogy a stimulált splenocitatenyészetekre kapott átlagos c.p.m. értékét elosztottuk a nem stimulált kontrolltenyészetek ugyanilyen értékével. A 2. ábrán bemutatottak szerint, Y¹ vagy YDP-sejtekkel végzett immunizálás nagymértékben keresztreagált splenocitaproliferáció konzisztens mértékû stimulálásában, bár intenzívebb válasz volt látható a specifikus immunizáló antigénpreparátummal in vitro stimulált splenocitákkal. Valamennyi állatból származó splenociták, beleértve a nem immunizált kontrollállatokat is, választ adtak ConA-val végzett poliklonális stimulálásra. Nem detektáltunk proliferációt C. albicansból származó b¹glükánnal in vitro stimulált splenocitatenyészetekben. Tehát összefoglalva: Y¹ és YDP-sejtekkel végzett immunizálás nagymértékben keresztreaktív humorális és CMI-válaszokat indukált mindkét celluláris prepará-
1
HU 004 028 T2
tumban jelen lévõ antigénekkel szemben. Azonban MP¹re és Y¹sejtfelszínre specifikus ellenanyagok csak olyan egerekben voltak jelen, amelyeket teljes Y¹sejttel immunizáltunk. Védelem letális fertõzés ellen Miután kimutattuk, hogy Y¹sejtekkel történõ immunizálás konzisztens humorális és sejtközvetített immunválaszokat indukált a gomba fõbb antigenikus alkotórészei ellen, a sejtek védettséget biztosító képességét akut, letális, egérben létrehozott kandidiázismodellben teszteltük. A védettséget úgy elemeztük, hogy C. albicans letális dózisával intravénásan fertõztünk, és ezután 60 napig követtük az állatok (csoportonként 15) túlélését. A dózis 1×106 (3A. ábra) vagy 2×106 (3B. ábra) sejt volt 0,1 ml¹ben, vagy csak adjuváns kontrollként. A nem immunizált, kontrollcsoportban az egerek túlélésének átlagos ideje 1¹2 nap a nagyobb dózisban (3B. ábra). Y¹sejtekkel immunizált állatok átlagos túlélési ideje a gombafertõzés után megnövekedett, de 15–17 nappal a fertõzés után mind elpusztult, és a végsõ túlélési arány statisztikailag nem különbözött a kontrollokétól. Ezzel ellentétben, YDP-sejtekkel immunizált állatok sokkal rezisztensebbek voltak, az átlagos túlélés 60 napnál több volt. Az YDP-sejtekkel immunizált állatok túlélési arányának különbsége az adjuvánssal kezelt állatokhoz képest és az Y¹sejttel immunizált állatokhoz képest statisztikailag szignifikáns volt (p<0,05, Fisher-féle exakt teszt) mindkét dózis esetén. A védettséget a Candida-kinövés kiterjedésének mennyiségi meghatározásával is elemeztük a 106 sejttel fertõzött állatok veséjében. Ehhez a fertõzés utáni 7. napon steril körülmények között eltávolítottuk elpusztított állatok bal veséjét, ezt követõen homogenizáltuk steril, 0,1% Triton-X100¹at (Sigma) tartalmazó nátrium-kloridban. Meghatároztuk a kolóniaformáló egységek (CFU) számát szervenként tálcás hígítási módszerrel, Sabouraud-féle dextrózagaron. Az egyes veséket külön-külön vizsgáltuk, és legalább három külön hígítást készítettünk, három párhuzamossal egyegy, mintából. A 3C. ábrán bemutatottak szerint, az átlagos gombaterhelés a vesében sokkal alacsonyabb volt az YDPsejtekkel immunizált egerekben (CFU <103), mint az Y¹sejttel immunizált csoportban (15,4±0,6×10 3 ;
Recipiens egér
CD2F1
p<0,05, Kruskal–Wallis-féle ANOVA-analízis és Bonferroni-típusú, nem paraméteres többmintás összehasonlító teszt) és a kontrollcsoportban (körülbelül 60×103; p<0,05). A különbség az Y¹sejtekkel immuni5 zált és a kontrollcsoport között statisztikailag nem volt szignifikáns. SCID-egerekkel is végeztünk kísérleteket ugyanolyan vakcinációs program szerint, mint az immunológiailag normál állatok esetén. Nem figyeltünk meg vé10 dettséget, ami azt mutatja, hogy adaptív immunválaszokra lényegi szükség van a védettséghez. A 173. hivatkozásban C. neoformansra leírtakkal ellentétben, ezért CD4+-sejtek nem játszanak szerepet az ellenanyag-közvetített védelemben. 15 Passzív immunizálás Mivel a fõ különbség Y¹ vagy YDP-sejtekre adott immunválaszban a sejtfalalkotó részekre irányuló ellenanyag-specifitásban van, azt teszteltük, hogy az im20 munszérumok milyen mértékben képesek átvinni a védettséget immunológiai védettséggel nem rendelkezõ állatokba. Ezekkel a kísérletekkel azt is elemeztük, hogy a recipiens egerek immunrendszere potenciálisan hozzájá25 rul¹e a védettséghez, melyet a passzívan átadott szérum biztosított. CD2F1- vagy SCID-egereket passzívan immunizáltunk egyetlen intraperitoneális injekcióban, 0,5 ml Y¹ vagy YDP-sejt ellen termeltetett szérummal. Kontrollál30 latok adjuvánssal immunizált egerektõl kaptak szérumot. Az egyes szérumokat átvitel elõtt hõkezeltük (56 °C, 30 perc), hogy inaktiváljuk a hõre nem stabil, nem ellenanyag-alkotó részeket. Az egereket intravénásan fertõztük két órával a szérumok bevitele után, C. 35 albicans szubletális dózisával (5×105 sejt), és a védettséget két nap múlva vizsgáltuk a fentebb leírt vesemodell alkalmazásával. Ezeket a kísérleteket különbözõ „batch” szérummal végeztük, amelyek az YDP- vagy Y¹sejtekkel egymástól függetlenül immunizált állatok40 ból származtak. Az eredmények 2 nappal a fertõzés után az alábbiak voltak, amelyben az adatok egyedi CFU-beütések súlyozott átlagainak felelnek meg, számba véve minden egércsoportot. A statisztikai analízis Kruskal–Wal45 lis-féle ANOVA-analízis volt, azt követõen nem paraméteres Bonferroni-típusú többmintás összehasonlító tesztet végeztünk.
Kezelés fertõzés elõtt
Gombaterhelés vesén (CFU×10–3 ±SD)
p
kontrollszérum (csak adjuvánssal)
361,7±17,6
–
anti-Y-sejt-szérum 1
393,8±7,7
n. s.
8,7±0,4
<0,05
kontrollszérum (csak adjuvánssal)
214,4±1,8
–
anti-Y-sejt-szérum 1
392,2±7,7
n. s.
anti-YDP-sejt-szérum 1
44,2±0,8
<0,05
anti-YDP-sejt-szérum 1 SCID
2
n. s.=nem szignifikáns
10
<0,01
<0,05
1
HU 004 028 T2
Tehát azokban az állatokban, amelyek Y¹sejt ellen termeltetett szérumot kaptak, ugyanolyan megnövekedett mértékû gombaterhelés volt veséjükben, mint azoknak, amelyek kontroll, nem immunizált szérumot kaptak. Viszont azokban az állatokban, amelyek az YDP-sejt ellen termeltetett szérumot kaptak, jelentõsen kevesebb gombasejt volt veséjükben, mint azokban az állatokban, amelyek kontrollszérumot kaptak. Ezt megfigyeltük az adott immunszérumok különbözõ „batch”-eivel, valamint legyengült immunrendszerrel rendelkezõ állatokban és a SCID-egerekben egyaránt. Mivel a bemutatott adatok alapján feltételezzük, hogy ellenanyagok jelentõs szerepet játszanak a védelemben, az YDP-vel immunizált egerek szérumából tisztítottuk az IgM-frakciót, és passzív immunizálásra alkalmaztuk. Ugyanezt a frakciót tisztítottuk olyan állatok szérumából is, amelyeket kontrollként alkalmaztunk, és csak adjuvánst kaptak. Egyetlen kísérletben a vese gombaterhelése 106 C. albicans-sejt intravénás injekcióval történt fertõzése után 2 nappal 290±8 (×103) sejt volt, ezzel szemben kontrollegerekben 1359±18 (×103) sejt volt a vesében (p<0,01). Az YDP-szérum IgM-frakciója nagymértékben reaktív volt C. albicansból készült glükánextraktummal szemben. Passzív immunizálás hatásának megszüntetése YDP-sejtekkel végzett immunizálás eredményeként, a szérumban lévõ ellenanyagok b¹glükánalkotó részeket képesek felismerni (lásd fentebb). Ezeket az ellenanyagokat eltávolítottuk, és újrateszteltük az immunitás passzív transzferjét. Y- vagy YDP-sejtek ellen termeltetett szérumokat szelektíven adszorbeáltunk glükánspecifikus vagy felszíni mannoproteinekre specifikus ellenanyagok eltávolítása céljából. 2 ml szérumot kezeltünk 1 óra hosszáig, 0 °C¹on 10 mg szemcsés glükánnal (glükán„ghost”-okkal) vagy 2×108 C. albicans-élesztõsejttel. Az adszorbeált anyagot centrifugálással elkülönítettük, és az eljárást háromszor megismételtük. Az adszorpciós eljárás hatékonyságát ELISA-val értékeltük, burkolóantigénként élesztõsejtek vagy GG¹zym alkalmazásával. Az eljárás tipikusan 2¹3 nagyságrenddel (log) csökkentette az anti-YDP-szérumok anti-b-glükántiterét és az anti-Y-szérumok anti-MP-titerét. b¹Glükánra specifikus ellenanyagokat nem távolítottunk el adszorpcióval intakt Y¹sejtekkel. Meghatároztuk az elõadszorpció hatását az YDPszérumokra is a veseterhelési modellben (4. ábra). Nem adszorbeált vagy elõadszorbeált szérumokat (0,5 ml/egér) adtunk ip. egereknek (csoportonként háromnak) két órával azelõtt, hogy intravénásan szubletálisan megfertõztük C. albicanssal (5×105 sejt/egér). A vesére terjedõ fertõzést 48 órával a fertõzés után határoztuk meg egyedi CFU-számlálással. Az YDP-szérum sokkal jobb volt (p<0,05), mint a kontrollszérum, de az elõadszorpció b¹glükánnal meg-
2
szüntette ezt a hatást (p<0,05), úgyhogy nem volt statisztikailag szignifikáns különbség a kontrollszérum és az adszorbeált szérum között. Tehát érzékelhetõ mértékû védettséget át lehetett 5 vinni naív állatoknak YDP-sejtekkel szemben termeltetett szérummal recipiens állatoknak, a védettséget biztosító szérum hõstabil, és a szérum immunoglobulin-frakciója szintén védettséget biztosít. A védettséget biztosító szérum gazdag anti-b-glükán ellenanya10 gokban, és szegény anti¹MP ellenanyagokban. Ha tiszta b¹glükánra adszorbeáltuk, a szérum elvesztette védettséget biztosító kapacitásának nagy részét. Továbbá Y¹sejt ellen termeltetett szérum akkor is védõhatást biztosított, ha elvesztette az antimannop15 roteineket, de akkor viszont nem biztosított védettséget, ha elvesztette az anti-b-glükán ellenanyagokat. Összefoglalva, a tények alapján feltételezzük, hogy b¹glükánt felismerni képes védõ-IgM¹et tartalmaznak. 20 Védõ és nem védõ antagonisztikus ellenanyagok Elõzõleg közölt adatok alapján feltételezzük, hogy anti-b-glükán ellenanyagok játszanak szerepet az 25 YDP-sejteket tartalmazó vakcina által nyújtott védettségben. Azonban az Y¹vakcinával immunizált állatok szérumai is nagy titerben tartalmaztak anti-b-glükán ellenanyagokat (lásd fentebb). Tehát az Y¹szérumok egy olyan anyagot tartalmazhatnak, amelyek nincsenek je30 len az YDP-szérumokban, és amelyek gátolják anti-bglükán ellenanyagok aktivitását. Az Y¹sejtek és YDP-sejtek, és az ellenük termeltetett szérumok közötti különbséget véve úgy tûnik, hogy az anyag gombasejtfelszínének alkotórészére specifi35 kus ellenanyag. Az elmélet tesztelése céljából, Y¹sejtekkel immunizált állatokból származó szérumokat adszorbeáltunk Y¹sejtekre, és az eredményül kapott szérumokat beadtuk SCID-egereknek. Az Y¹sejtekre adszorbeált szérumokban lényegi módon lecsökkentek 40 az anti-MP-ellenanyagok, de megmaradt a magas antib-glükán ellenanyagszint. Az 5. ábrán bemutatottak szerint, olyan állatok, amelyek elõzõleg adszorbeált Y¹szérumokat kaptak (5. oszlop), veseterhelése körülbelül 2 nagyságrenddel alacsonyabb volt, mint olyan 45 állatoké, amelyek nem adszorbeált Y¹szérumot kaptak (4. oszlop), és az elõbbi összehasonlítható mértékû volt olyan állatokéval, amelyek védõhatású YDP-szérumokat kaptak (2. oszlop). Így tehát az Y¹szérum az élesztõ sejtfelszínére spe50 cifikus ellenanyagokat tartalmaz, amelyek gátolják azt a védettséget, amit az alatta elhelyezkedõ sejtfalantigénekre (b-glükánra) specifikus ellenanyagok biztosítanak. Ezek az adatok megmagyarázhatják, hogy anti55 Candida-szérumokról miért találták azt, hogy nem képesek konzisztensen átvinni a védettséget, és teljes, inaktivált C. albicans-sejtekkel történõ immunizálás miért biztosított változó mértékû védettséget, pedig minden esetben megnövekedett DTH¹t, sejtközvetített 60 immunitást és nagymértékû anti-Candida ellenanyag11
1
HU 004 028 T2
termelést stimulált. Az adatok alapján jó okunk van feltételezni, hogy C. albicans ellen ellenanyag-közvetített védelemhez nem csak a jó ellenanyag jelenlétére van szükség, hanem bizonyos más ellenanyagok hiányára is. Mivel a nagymértékben expresszálódó sejtfelszíni alkotórészek ellen termelõdött ellenanyagok jelentõs mennyiségben jelen vannak olyan egészséges emberekben, akikben megtelepedett C. albicans, antagonisztikus vagy blokkoló ellenanyagok képzõdése lehet egy olyan mechanizmus, amellyel a gombák védik magukat más ellenanyagok pusztító hatásától. b-Glükánra specifikus ellenanyagokat régebben megfigyeltek normál humán szérumokban [például 174]. Mivel ezek nem reagálnak sejtfelszíni komponensekkel, és nem egyértelmûen opszonizálnak gombasejteket, a védelem mechanizmusában játszott szerepüket elvetették. A 174. hivatkozásban az antib-glükán IgG2-rõl konkrétan leírták, hogy nem szükséges az opszonizációs aktivitáshoz tokkal nem rendelkezõ, b¹glükánt hozzáférhetõ módon tartalmazó, C. neoformans-sejtekkel szemben. Az itt közölt adatok alapján szükség lehet az elõbbi nézet újraértékelésére, mivel anti-b-glükán ellenanyagokról kimutatták, hogy szerepet játszanak a védelemben, legalábbis akkor, ha blokkoló ellenanyagok nincsenek jelen. Még ha blokkoló ellenanyagok jelen is vannak, és az antimannoprotein ellenanyagok mennyisége magasabb, mint az antiglükán ellenanyagok mennyisége természetes körülmények között végbemenõ fertõzés és megtelepedés alatt, az immunogén glükánok beadása elbillentheti a gátló- és védõhatású ellenanyagok egyensúlyát a védekezés javára. Továbbá anti-C. albicans-blokkoló ellenanyagok valószínûleg nem gátolják antiglükán ellenanyagok aktivitását más patogénekkel szemben (például olyanokkal szemben, amelyek sejtfala glükánt tartalmaz, de mannoproteint nem). Glükánhordozó konjugátumok elõállítása A fentebb leírtak szerint, GG¹zymet C. albicans-sejtekbõl preparált glükánrészecskék („ghost”¹ok) glükanázos emésztésével állítottunk elõ. A GG¹zym tiszta (>99%) b¹glükán. GG¹zym-szacharidot konjugáltunk CRM197 hordozófehérjéhez, így „CRM-GG”-hez jutottunk. A CRM¹GG elõállítására szolgáló konjugálási eljárás reduktív aminálási reakcióval kezdõdik, amelyben egy terminális aminocsoportot hozzáadtunk lánconként. Ezt az aminocsoportot adipinsav di¹N-hidroxiszukcinimid-észterével reagáltattuk, így jutunk aktivált linkerhez. Az aktivált szacharidokat CRM197-fehérjéhez konjugáltuk, és a konjugátumintermediert ultraszûréssel tisztítottuk. A reduktív aminálást úgy végeztük, hogy vizes b¹glükán-szacharid-oldatot (2 mg/ml GG¹zym) reagáltattunk ammónium-acetáttal (300 g/l) nátrium-ciano-bo-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 12
2
rohidrid (28,9 g/l) jelenlétében. Az acetátot és a cianoborohidridet egy tölcsérrel adtuk a szacharidoldathoz, és a keveréket addig kevertettük, amíg a komponensek feloldódnak. Azután a pH¹t 7,2¹re állítottuk, és a keveréket átvittük egy üvegedénybe, amelyet lezártunk és 50±1 °C¹on vízfürdõben inkubáltunk 5 napig. A reakció végeredménye terminális aminocsoporttal rendelkezõ szacharid. Az aminált szacharidot azután kromatográfiával tisztítottuk Sephadex G–10 oszlopon. Valamennyi kromatográfiás lépést szobahõmérsékleten végeztünk, 24 cm/óra áramlási sebesség alkalmazásával, és az elfolyót vezetõképesség és 214 nm¹es abszorbancia alapján követtük. Az oszlopot elõször 2 l (5 oszloptérfogat) desztillált vízzel mostuk a 20% etanolos tároló oldat eltávolítása céljából. Azután az oszlopot 2 l 0,2 M NaCl-dal ekvilibráltuk. Felvittük a, mintát az oszlopra, és frakciókat szedtünk (7. ábra). Mivel a szacharidnak nincs abszorbanciája 214 nm¹en, a frakciókat glükózanalízissel [fenol-kénsavas módszer, 175] vizsgáltuk, és a szacharidot tartalmazó frakciókat egyesítettük. A szacharid 1,5 oszloptérfogat 0,2 M NaCl¹os mosás után eluálódott az oszlopról. A tisztított terméket töményítettük és tisztítottuk a NaCl eltávolítása céljából. A membránokat (1 K microsep, PALLFILTRON) desztillált vízzel mostuk, „minifuge T” centrifugában 3000 rpm¹en, 1 óra hosszáig, 4 °C¹on centrifugáltuk. Ráadagoltuk a szacharidot a membránra, és 3 óra hosszáig, 4000 rpm¹en centrifugáltuk, így 0,5 ml térfogathoz jutottunk. Hozzáadtunk 1,5 ml desztillált vizet, és a keveréket újra centrifugáltuk a fentebb leírtak szerint. Ezt a ciklust addig ismételtük, amíg a NaCl koncentrációja 0,02 M¹nál alacsonyabb lett. A mintákat egyesítettük. A membránokat végül desztillált vízzel mostuk, és a mosóoldatot hozzáadtuk az egyesített mintákhoz. A tisztított szacharidot glükózra [175] és aminocsoportra [176] analizáltuk. A szacharidot azután rotációs bepárlóban szárítottuk (Buchi rotoevaporator, Model EL 131; 90 rpm), ami KNF Neuberger Laboport vákuumpumpával, Buchi 461 vízfürdõvel (37 °C) és Pharmacia Biotech „multitemp” recirkulációs kondenzátorhûtõvel (4 °C) volt összekötve. A vákuum értékét lassan növeltük a forrás elkerülése céljából. A bepárlás elsõ fázisában folyadék látható volt. A fázis végén a termék többsége száraznak tûnt, néhány buborék volt abban a folyadékban, ami mozgásban volt. Az elsõ fázisnak akkor lett vége, amikor folyadék egyértelmûen nem mozgott. A szárítás második fázisa további idõt vett igénybe ugyanilyen körülmények között, amíg az anyag üvegesnek és repedezettnek nézett ki. A szárított szacharidot azután úgy aktiváltuk, hogy szabad aminocsoportjait adipinsav di¹N-hidroxi-szukcinimid-észterével (bisz-NHS-észterrel) reagáltattuk. A szacharidot feloldottuk DMSO-ban, hogy az aminkoncentráció 40 mmol/l legyen. Trietil-amint (TEA) adtunk hozzá TEA-amin=1,113 térfogatarányban, és a keveréket homogenitásig kevertettük.
1
HU 004 028 T2
Borostyánkõsav-diésztert feloldottunk DMSO-ban, ötszörös térfogat DMSO¹t alkalmazva annál, mint amit a szacharid feloldására alkalmaztunk. A borostyánkõsav-diészter számított mennyisége annyi volt, hogy a borostyánkõsav-diészter:amincsoportok moláris aránya 12:1 legyen. A borostyánkõsav-diészter-oldathoz kevertetés közben lassan hozzáadtuk a szacharidkeveréket, és azután szobahõmérsékleten inkubáltuk további kevertetés közben 1‚5¹2 óra hosszáig, azután a reakciókeveréket lassan hozzáadtuk szobahõmérsékletû dioxánhoz (4 térfogat polipropilén centrifugacsõ) kevertetés közben, az aktivált szacharid kicsapása, és DMSO-tól, bisz-NHS-észter és TEA-tól való elválasztása céljából. A kicsapás után 75 perccel a csöveket lezártuk és kevertettük további 10 percig. A keveréket azután 7000 g¹n, 20 percig, 15 °C¹on centrifugáltuk. A felülúszót elkülönítettük és a dioxános mosást megismételtük összesen 5¹ször. A keveréket azután megszárítottuk vákuumszárítóban (Lyovac GT 2). A szárított szacharidot aktív észterre analizáltuk [177]. Konjugáláshoz az aktív észtert és CRM197¹et összekevertük olyan arányban, hogy 20 mmol aktivált szacharid jutott 1 mmol CRM197¹re, 0,01 M nátriumfoszfát-pufferben, pH=7,2. A fehérjeoldatot úgy állítottuk be, hogy a CRM197 koncentációja 45 g/l legyen, és lassan kevertettük egy üvegedényben, mágneses keverõbottal. Az aktivált szacharidot lassan adagoltuk az üvegbe, amelyet azután lezártunk. A kevertetés sebességét úgy állítottuk be, hogy egy kis örvény alakuljon ki túlzott habképzõdés nélkül. A konjugálás 14–22 óra hosszáig tartott. A végterméket SDS-PAGEval (8. ábra; 1: MW¹markerek; 2: CRM197; 3: konjugátum; 4: konjugátum felülúszó) és western-blottal vizsgáltuk anti-CRM-ellenanyagok alkalmazásával (9. ábra; 1: konjugátum felülúszó; 2: konjugátum; 3: CRM197). Végül a konjugátumot immunogenitási vizsgálatokhoz tisztítottuk ultraszûrõmembránok alkalmazásával, amelyek névleges visszatartása 100 kDa-nál volt (membránok: 100K Microcon SK, Amicon). A membránokat 0,5 ml desztillált vízzel mostuk, 10 perces centrifugálással (Biofuge Picot) 2500 rpm¹en. Azután hozzáadtuk a konjugátumot, és 3 percig cenrtifugáltuk 13,000 rpm¹en. A felülúszót eltávolítottuk, újra a membránra adagoltuk, és 25 percig centrifugáltuk 2500 rpm¹en. Hozzáadtunk 0,3 ml, 0,01 M nátriumfoszfát-puffert (pH=7,2), és 25 percig centrifugáltuk 2500 rpm¹en. Ezt megismételtük összesen 7¹szer. A végsõ tisztított terméket fehérjére [178], glükózra (nagynyomású anioncserélõ kromatográfia, pulzáló amperometriás detektálással), SDS-PAGE-val (10. ábra; 1: CRM197; 2: tisztított konjugátum) és antiglükán ellenanyagok alkalmazásával western-blotban analizáltuk (11. ábra). GG-zym analízise A GG¹zym-b-glükán preparátumot gélszûrést alkalmazó kromatográfiával és 1H és 13C–NMR-rel vizsgál-
2
tuk. Azt találtuk, hogy két b¹glükánfrakciót tartalmazott, amelyek körülbelül 50 tömeg% GG¹zym-antigént tartalmaztak: az 1. egyesített részlet („pool”) alapvetõen b-1,65 glükán-láncokat tartalmaz b-1,3-láncok elágazásaival. A b-1,6-láncok polimerizációjának megközelítõ foka (DP) 36 glükóz monoszacharidegység, míg a b-1,3-láncoké megközelítõleg 9¹10 monoszacharidegység. Az elágazás foka (BB) körülbelül 0,6. A 2. egyesített részlet („pool”) rövid b-1,3-glükán10 láncokat tartalmaz kevés b-1,6-kötéssel. A DP körülbelül 3,9, a DB körülbelül 0,03.
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 13
Konjugátumok immunogenitása CRM-GG¹t ELISA-val teszteltük YDP-sejtekkel immunizált egerekbõl származó immunszérumokkal szemben. A konjugátum nagymértékben reaktív volt valamennyi vizsgált szérummal, ami azt mutatja, hogy CRM¹GG antigenikusan ekvivalens C. albicans-sejteken expresszálódó glükánnal. A konjugátum immunogenitásának tesztelése céljából beadtuk azt az alábbi három tesztelési program szerint: A) program: 7 egeret intraperitoneálisan oltottunk CRM-GG-konjugátummal (egyenként 20 mg fehérje). 21 nap múlva minden immunizált állattól vett, egyesített szérumokat („pool”) indirekt ELISA-ban teszteltük. Egyik egér sem mutatta jelét, hogy szenvedne vagy beteg lenne az immunizálás alatt. B) program: 7 egeret a 0. és a 7. napon szubkután oltottunk CRM-GG-konjugátummal (egyenként 10 mg fehérje) inkomplett Freund-adjuvánsban. Egy intraperitoneális ismétlõoltást adtunk a 28. napon, 10 mg konjugátum alkalmazásával, adjuváns nélkül. 7 nappal késõbb a szérumokat egyesítettük, és az A) programban leírtak szerint teszteltük. A B) programban néhány állat szenvedett és egy elpusztult. C) program: 12 egeret a 0. napon szubkután oltottunk CRM-GG-konjugátummal (egyenként 10 mg fehérje) komplett Freund-adjuvánsban. Intraperitoneális ismétlõoltást adtunk a 28. napon, 10 mg konjugátum alkalmazásával, adjuváns nélkül. 3 nappal késõbb szérumokat vettünk és egyesítettük analízishez, a fentebb leírtak szerint. Egyik egér sem mutatta jelét, hogy szenvedne vagy beteg lenne az immunizálás alatt. Negatív kontrollként beadtunk nem konjugált CRM197¹et a B) program szerint. Nem konjugált GG¹zym ellen egerekben, többszörös agresszív immunizálással termeltetett szérumot alkalmaztunk pozitív kontrollként az ellenanyagválaszok elõidézésére (2×10 mg intranazális becsepegtetéssel 1 mg koleratoxinadjuvánssal, azt követõen öthetente ip. fertõzés 50 mg antigénnel). Az immunizált állatokból származó szérumok IgMés IgG-titereit indirekt ELISA-val határoztuk meg, specifikus, alkalikus foszfatázzal konjugált, antiegér-IgM vagy antiegér-IgG szekunder ellenanyagok alkalmazásával.
1
HU 004 028 T2
2
Burkolóantigén GGZYM Szérum
Hígítás
Anti-GG-CRM [A) program]
Anti-GG-CRM [B) program]
Anti-CRM (negatív kontroll)
Anti-GG-zym (pozitív kontroll)
CRM
anti-IgM
anti-IgG
anti-IgM
anti-IgG
1:30
1,15
–
0,13
0,39
1:60
0,91
–
0,10
0,30
1:120
0,69
–
0,09
0,22
1:240
0,43
–
–
0,17
1:480
0,28
–
–
0,12
1:920
0,18
–
–
0,10
1:1920
0,14
–
–
0,10
1:30
1,28
–
0,94
0,84
1:60
1,22
–
0,69
0,83
1:120
1,18
–
0,47
0,77
1:240
1,1
–
0,31
0,76
1:480
0,93
–
0,21
0,73
1:920
0,68
–
0,13
0,68
1:1920
0,5
–
0,10
0,53
1:30
0,44
0,09
0,72
0,93
1:60
0,28
–
0,78
0,8
1:120
0,21
–
0,64
0,65
1:240
0,16
–
0,50
0,48
1:480
0,13
–
0,31
0,30
1:920
0,11
–
0,21
0,20
1:1920
0,1
–
0,20
0,15
1:30
0,94
–
0,09
0,09
1:60
0,75
–
0,09
0,09
1:120
0,54
–
0,09
0,09
1:240
0,51
–
0,09
0,09
1:480
0,33
–
0,09
0,09
1:920
0,22
–
0,09
0,09
1:1920
0,16
–
0,09
0,09
A C) programban az ellenanyag ELISA-titerei (a legnagyobb hígítás, amely esetben a 405 nm¹en mért
45 OD¹érték legalább a kontroll kétszerese) és izotípusai az alábbiak voltak.
Burkolóantigén (50 mg/ml) GG-ZYM Szérum
1. részlet
2. részlet
IgM
IgG
IgM
IgG
IgM
Anti-GGCRM
>1920
>1920
>1920
1920
1920
Anti-GG-zym
240
<15
480
15
120
Jelentékeny anti-CRM ellenanyagtiterekhez jutottunk tehát, különösen IgG esetén, a konjugátummal végzett immunizálás után. Még nagyobb a jelentõsége,
IgG
Pustulan
Laminarin
IgM
IgG
IgM
IgG
480
480
>>1920
960
<15
<15
120
<15
120
<15
hogy az immunizálás megnövekedett anti-GG-zym ellenanyagtitereket is indukált. Az A) és B) program al60 kalmazásával az ellenanyagok kizárólag IgM-izotípus14
1
HU 004 028 T2
hoz tartoztak. A C) program alkalmazásával azonban az állatokban következetesen GG¹re specifikus IgG-ellenanyagok termelõdtek, különösen az 1. részletben lévõ b-1,6-glükánok ellen. Tehát a konjugálás egy gyenge immunogént átalakított erõssé, izotípusváltást és memóriaválaszokat eredményezett. Immunválaszok analízise A GG¹CRM-konjugátum ellen termeltetett szérumokat [B)program] teszteltük az egyes részletekkel szemben abból a célból, hogy valamelyik domináns¹e. Ugyanazt a pozitív kontrollt alkalmaztuk, amit az elõzõekben. Indirekt ELISA-eredményeit az alábbiakban bemutatjuk, amelyben az értékek anti-GG-CRM-szérumtitereket (IgM) jelentenek. Szérum
Anti-GG-CRM
1. részlet
2. részlet
>2500
160
Anti-GG-zym
320
40
Szérum
Inhibitor
1. részlet Anti-GG-CRM (1:250 hígítás) 2. részlet
1. részlet Anti-GG-zym (1:80 hígítás) 2. részlet
Dózis (mg/ml)
Keresztreagáló immunválaszok GG-zym C. albicansból származott. Egereket immunizáltunk C. albicansból vagy S. cerevisiaeból származó YDP-sejtekkel, ugyanolyan programot alkalmaz5 va, mint fentebb, YDP-sejtekre leírt program, és az eredményül kapott szérumokat ELISA-val teszteltük GG¹zym¹el való reaktivitásra. A titerek megfelelnek a szérum legnagyobb hígításának, amelyre leolvasott érték kétszerese a burkolóantigént nem tartalmazó mérõ10 helyen leolvasott értéknek. A szekunder ellenanyag nyúlban termeltetett anti-egér-IgM. Szérum
15
%¹os gátlás
60
93
30
92
15
90
0
0
60
62
30
53
15
30
0
0
60
82
30
82
15
80
0
0
60
63
30
55
15
42
0
0
Tehát a CRM-GG-konjugátum fõleg az 1. egyesített részletben lévõ b¹glükánláncok, azaz nagyobb molekulatömegû, elsõsorban b-1,6-glükán ellen indukált ellenanyagokat. Összefoglalva: egerek CRM-GG-konjugátummal való immunizálásának eredményeként kapott adatok azt mutatták, hogy a konjugátum nagymértékben immunogén, és hogy az ellenanyagválasz jóval nagyobb mértékû, ellenanyagtiterekben kifejezve, mint a GG¹Zym-poliszachariddal egymagában végzett immunizálás eredménye. Még nagyobb a jelentõsége, hogy a CRM-GG-konjugátummal végzett immunizálás eredményeként kapott ellenanyag antigénspecifitása ugyanaz, mint a védõhatású anti-b-glükán ellenanyagoké.
Burkolóantigén GG-Zym
Csak adjuváns
20
ELISA-gátlási eredmények az alábbiak.
2
<20
Laminarin
Pustulan
<20
<20
YDP-C. albicans
>2560
320
>2560
YDP-S. cerevisiae
>2560
>2560
>2560
S. cerevisiae-eredetû YDP-sejtek ellen termeltetett ellenanyagok tehát keresztreagálnak C. albicansból származó GG¹zym-antigénnel. S. cerevisiae és C. albicans ellen az immunválaszok nem azonosak, azonban C. albi25 cans ellen termeltetett szérum sokkal kevésbé reaktív laminarinnal, mint S. cerevisiae ellen termeltetett szérum.
30
35
40
45
50
55
60 15
Alternatív konjugálási eljárások A glükán fentebb leírt tisztítási és konjugálási eljárását megismételtük az alábbi változtatások közül az egyikkel vagy mindkettõvel. Reduktív aminálás után, oligoszacharid tisztítására 0,2 M NaCl helyett 20 mM NaCl¹ot alkalmaztunk. Az alternatív eljárásban csökkentett sókoncentráció volt gélszûrés után, és javult a késõbbi oligoszacharidaktiválás. Az aminált szacharid Sephadex G–10 oszlopról 1,5 oszloptérfogat 20 mM NaCl után eluálódott. A konjugátum tisztítására az elsõ konjugátumot ultraszûréssel tisztítottuk (a fentebb leírtak szerint) 100 kDa nominális molekulatömegnél visszatartó membrán alkalmazásával. Más konjugátumokat ultraszûréssel tisztítottunk 30 kDa nominális vagy 50 kDa nominális molekulatömegnél visszatartó membránok alkalmazásával, a konjugátum jellemzõitõl függõen: keresztkötött, nagy molekulatömegû konjugátumokhoz 50 kDa membránt alkalmaztunk; keresztkötés nélküli konjugátumokhoz 30 kDa membránt alkalmaztunk. A 30 kDa és 50 kDa membránokat Centrikon™ (centrifugába helyezhetõ szûrõegység) technikával vagy tangenciális áramlási technikával alkalmaztuk. A Centrikon™ technikához a 30 kDa és 50 kDa membránokat a Millipore™ cégtõl szereztük be Minifuge T centrifugában (Heraeus Sepatech) történõ alkalmazásra. Az eszközöket 10 perces, 3500 rpm¹en végzett centrifugálással mostuk 3 ml desztillált vízzel. A konjugátumot azután 3500 rpm¹en, 3 percig centrifugáltuk. A felülúszót eltávolítottuk, és az eszközbe tettük, azután 25 percig centrifugáltuk 3500 rpm¹en. Azután hozzáadtunk 1,5 ml, 0,01 M nátrium-foszfát-puffert (pH=7,2), és 25 percig centrifugáltuk 3500 rpm¹en. Ezt a folyamatot összesen 8¹szor végeztük el.
1
HU 004 028 T2
Tangenciális ultraszûréshez Holder Labscale (Millipore) berendezést alkalmaztunk 505U pumpákkal (W. Marlow), és PLCIC¹C 30 kDa-nál visszatartó, 50 cm2¹es membránokat (Millipore). A rendszert addig mostuk desztillált vízzel, amíg a permeátum pH¹ja 7,00-nél kisebb lett. A rendszert azután 100 ml, 0,01 M nátriumfoszfát-pufferrel (pH=7,2) ekvilibráltuk. Azután betöltöttük a mintát a mintatartó tartályba, és az alábbi körülményeket alkalmaztuk ultraszûréshez: nyomás 25,7 psi (1 psi=6894,757 Pa); kimenõnyomás 18,3 psi (1 psi=6894,757 Pa); áramlási sebesség 7,6 ml/perc. Negyven diafiltrációs térfogatú 0,01 M nátrium-foszfátpuffert (pH=7,2) használtunk. Végül a mintát átvittük egy másik edénybe, és a rendszert mostuk, elõször 0,1 M NaOH-dal, azután vízzel és végül 0,05 M NaOH-dal. 1. és 2. egyesített részlet elválasztása A fentebb említettek szerint, a GG¹zym-b-glükánpreparátumok két fõ frakciót tartalmaztak, az 1. és 2. egyesített részletet („pool”¹t). Ezt a két részletet gélszûréssel választottuk el. Pharmacia™ FPLC-rendszerben, szobahõmérsékleten és 0,37 cm/óra áramlási sebesség alkalmazásával, Bio-Gel P–2 Fine oszlopot (Bio Rad) ekvilibrálrunk 450 ml 0,02 M PBS¹el (pH=7,4). A kevert GG¹zymmintát felvittük az oszlopra és 1,0 oszloptérfogat 0,02 M PBS-sel (pH=7,4) eluáltuk. A frakciók szedése után az oszlopot lemostuk 1,5 oszloptérfogat ugyanilyen pufferrel, azután 3 oszloptérfogat desztillált vízzel és tárolóoldatként 3 oszloptérfogat 20%¹os etanollal mostuk. Az oszlopról kimenõ oldatot vezetõképességre és 214 nm¹en mért abszorbanciára követtük, a fentebb leírtak szerint. A 12. ábrán bemutatottak szerint az 1. és 2. egyesített részlet külön eluálódott. A két különbözõ glükánpopulációt külön-külön lehet alkalmazni konjugátumok elõállítására, a fentebb leírt eljárás szerint. Laminarinkonjugátumok Összehasonlítás céljára további konjugátumokat készítettünk CRM197-hordozó és laminarin alkalmazásával. A laminarin szerkezete hasonló a 2. részletben lévõ GG¹zym glükánstruktúrájához (azaz 1,3-b-glükánokhoz), de legmagasabb átlagos polimerizációs foka körülbelül 30. Laminarinkonjugátumok elõállítása ugyanúgy történt, mint a GG¹Zym esetében, kivéve az oligoszacharidtisztítás a reduktív aminálás után. Laminarin esetében az eljárásban Holder Labscale (Millipore) berendezést alkalmaztunk, 505U pumpák (W. Marlow) és PLCBC¹C 3 kD¹nál kizáró, 50 cm2¹es membrán (Millipore) alkalmazásával. A berendezést desztillált vízzel mostuk, amíg a permeátum pH¹ja 7,00-nél kisebb lett. A berendezést azután 100 ml, 0,5 M NaCl-dal ekvilibráltuk, és felvittük a mintát a tartályba, és az alábbi ultraszûrési körülményeket alkalmaztuk: bemenõnyomás 19 psi (1 psi=6894,757 Pa) nyomás; kimenõnyomás 16 psi (1 psi=6894,757 Pa) nyomás; áramlási sebesség 0,6 ml/perc. Tizenhárom diafiltrációs térfogat 0,5 M NaCl¹t alkalmaztunk, azután hat diafiltrációs térfogat vi-
5
2
zet. Végül, a mintát egy másik edénybe töltöttük, és a rendszert kimostuk, elõször 0,1 M NaCl-dal, azután vízzel és végül 0,05 M NaOH-dal. A 13. ábrán bemutatjuk a laminarinkonjugátumok SDS-PAGE képét. A bal oldalon lévõ két folt megfelel a nem konjugálódott CRMI197-hordozónak, és a jobb oldalon lévõ két folt megfelel a konjugátumnak.
Összefoglalás Teljes, intakt C. albicans-élesztõsejtek nem biztosítanak védõimmunitást C. albicans ellen, míg proteázzal kezelt sejtek képesek védõimmunitást biztosítani. Proteázzal kezelt sejtekkel indukált, Candida elleni védettséget részben ellenanyagok közvetítenek, 15 amelyben anti-b-glükán ellenanyagok játszanak jelentõs szerepet. Védettséget biztosító, szérummal átvihetõ, ellenanyag-közvetített C. albicans elleni védelem megszüntethetõ sejtfelszínen elhelyezkedõ, immundomináns 20 gombaeredetû antigénekre adott immunválaszokkal. Tehát teljes, intakt sejtekkel végzett immunizálás sejtfelszínnel reaktív, antagonista vagy blokkoló ellenanyagok termelõdését idézi elõ. Fehérjeglükán-konjugátumok hatásos immunogének. Az egyik organizmussal termeltetett antiglükán el25 lenanyagok keresztreagálhatnak más organizmusból származó glükánokkal. 10
Hivatkozások jegyzéke 30 [1] Deepe (1997) Clin. Microbiol. Rev. 10:_585–596. [2] Polonelli et al. (2000) Med. Mycol. 38 Suppl. 1:_281–292. [3] Casadevall (1995) Infect. Immun. 63:_4211–4218. [4] Cassone (2000) Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi 35 41_(4):_219. [5] US patent 5,578,309 (see also WO 95/31998). [6] US patent 6,309,642 (see also WO 98/23287). [7] WO 01/51517 [8] Pitson et al. (1996) Biochem. J. 316:_81–845. 40 [9] Tokunaka et al. (1999) Carbohydr. Res. 316:_161–172. [10] Ley (2001) Discover the Beta Glucan Secret… ISBN 1890766186. [11] Lindberg (1999) Vaccine 17 SuppI2:_S28–36. 45 [12] Buttery & Moxon (2000) JR Coll Physicians Lond 34:_163–8. [13] Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis. Clin. North Am. 13:_113–33, vii. [14] Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:_563–567. 50 [15] EP–_B–_0477 508 [16] US patent 5,306,492 [17] WO 98/42721 [18] Dick et al. in Conjugate Vaccines (eds. Cruse et al.) Karger, Basel, 1989, Vol. 10, 48–114. 55 [19] Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego CA (1996). [20] Ramsay et al. (2001) Lancet 357_(9251):_195–6. [21] US patent 4,761,283 [22] US patent 4,356,170 60 [23] US patent 4,882,317 16
1
HU 004 028 T2
[24] US patent 4,695,624 [25] Mol. Immunol., 1985, 22, 907–919. [26] EP¹_A_–0208375 [27] Bethell G. S. et al., J. Biol. Chem., 1979, 254, 2572–4. [28] Hearn M. T. W., J. Chromatogr., 1981, 218, 509–18. [29] WO 00/10599 [30] Gever et al., Med. Microbiol. Immunol, 165: 171–288 (1979). [31] US patent 4,057,685 [32] US patents 4,673,574; 4,761,283; 4,808,700 [33] US patent 4,459,286 [34] US patent 4,965,338 [35] US patent 4,663,160 [36] Research Disclosure, 453077 (Jan. 2002). [37] EP–_A–_0372501 [38] EP–_A–_0378881 [39] EP–_A–_0427347 [40] WO 93/17712 [41] WO 94/03208 [42] WO 98/58668 [43] EP–_A–_0471177 [44] WO 00/56360 [45] W0 91/01146 [46] WO 00/61761 [47] WO 01/72337 [48] WO 99/42130 [49] WO 96/40242 [50] Lei et al. (2000) Dev. Biol. (Basel) 103_:259–264. [51] WO 00/38711 [52] Breedveld (2000) Lancet 355_(9205):_735–740. [53] Gorman & Clark (1990) Semin. Immunol. 2:_457–466. [54] Jones et al., Nature 321:_522–525 (1986). [55] Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:_6851–6855 (1984). [56] Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:_65–92 (1988). [57] Verhoeyer et al., Science 239:_1534–1536 (1988). [58] Padlan, Molec. Immun. 28:_489–498 (1991). [59] Padlan, Molec. Immunol. 31_(3):_169–217 (1994). [60] Kettleborough, C. A. et al., Protein Eng. 4_(7):_773–83 (1991). [61] WO 98/24893 [62] WO 91/10741 [63] WO 96/30498 [64] WO 94/02602 [65] US Patent 5,939,598 [94] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472. [95] Almeida & Alpar (1996) J. Drug Targeting 3:_455–467. [96] Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995 (ISBN 0–306–44867–_X). [97] WO 90/14837 [98] WO 00/07621 [99] WO 99/27960
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 17
2
[100] European patent applications 0835318, 0735898 and 0761231. [101] Krieg (2000) Vaccine 19:_618–622; Krieg (2001) Curr opin Mol Ther 2001 3:_15–24; WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 and WO 98/5258 etc. [102] WO 99/52549 [103] WO 01/21207 [104] WO 01/21152 [105] WO 00/62800 [106] WO 00/23105 [107] WO 99/11241 [108] WO 98/57659 [109] Del Giudice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine, vol. 19, number 1. [110] Johnson et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:_2273–2278. [111] International patent application WO 00/50078. [112] Singh et al. (2001) J. Cont. Rele. 70:_267–276. [113] Covacci & Rappuoli (2000) J. Exp. Med. 19:_587–592. [114] WO 93/18150 [115] Covacci et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5791–5795. [116] Tummuru et al. (1994) Infect. Immun. 61:_1799–1809. [117] Marchetti et al. (1998) Vaccine 16:_33–37. [118] Telford et al. (1994) J. Exp. Med. 179:_1653–1658. [119] Evans et al. (1995) Gene 153:_123–127. [120] WO 96/01272 & WO 96/01273, especially SEQID NO:_6. [121] WO 97/25429 [122] WO 98/04702 [123] WO 99/24578 [124] WO 99/36544 [125] WO 99/57280 [126] WO 00/22430 [127] Tettelin et al. (2000) Science 287:_1809–1815. [128] WO 96/29412 [129] Pizza et al. (2000) Science 287:_1816–1820. [130] WO 01/52885 [131] Bjune et al. (1991) Lancet 338_(8775):_1093–1096. [132] Fukasawa et al. (1999) Vaccine 17:_2951–2958. [133] Rosenqvist et al. (1998) Dev. Biol. Stand. 92:_323–333. [134] Costantino et al. (1992) Vaccine 10:_691–698. [135] Costantino et al. (1999) Vaccine 17:_1251–1263. [136] Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:_331–332. [137] Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:_269–285, v. [138] Jedrzejas (2001) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65:_187–207. [139] Bell (2000) Pediatr. Infect. Dis. J. 19:_1187–1188. [140] Iwarson (1995) APMIS 103:_321–326. [141] Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Suppl.:_S63–68 & 79–80. [142] Hsu et al. (1999) Clin. Liver Dis. 3:_901–915.
1
HU 004 028 T2
[143] Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med. 334:_349–355. [144] Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:_232–238. [145] Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0–7216–1946–0. [146] Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:_1–70. [147] WO 02/02606 [148] Kalman et al. (1999) Nature Genetics 21:_385–389. [149] Read et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:_1397–406. [150] Shirai et al. (2000) J. Infect. Dis. 181_(Suppl. 3):_S524–S527. [151] WO 99/27105 [152] WO 00/27994 [153] WO 00/37494 [154] WO 99/28475 [155] Ross et al. (2001) Vaccine 19:_4135–4142. [156] Sutter et al. (2000) Pediatr. Clin. North Am. 47:_287–308. [157] Zimmerman & Spann (1999) Am. Fam. Physician 59:_113–118, 125–126. [158] Dreesen (1997) Vaccine 15 Suppl.:_S2–6. [159] MMWR Morb. Mortal Wkly Rep. 1998. Jan. 16;_47_(1):_12, 19. [160] Anderson (2000) Vaccine 19 Suppl. 1:_S59–65. [161] Kahn (2000) Curr Opin Pediatr 12:_257–262. [162] Crowe (1995) Vaccine 13:_415–421. [163] McMichael (2000) Vaccine 19 Suppl. 1:_S101–107. [164] Schuchat (1999) Lancet 353_(9146):_51–6. [165] WO 02/34771 [166] Dale (1999) Infect. Dis. Clin. North Am. 13:_227–43, viii. [167] Ferretti et al. (2001) PNAS USA 98: 4658–4663. [168] Kuroda et al. (2001) Lancet 357_(9264):_1225–1240; see also pages 1218–1219. [169] J. Toxicol. Clin. Toxicol. (2001) 39:_85–100. [170] Domicheli et al. (1998) Vaccine 16:_880–884. [171] Stepanov et al. (1996) J. Biotechnol. 44:_155–160. [172] Wills et al. (2000) Emerging Therapeutic Targets 4:_1–32. [173] Yuan et al. (1997) PNAS USA 94:_2483–2488. [174] Keller et al. (1994) Infect. Immun. 62:_215–220. [175] Dubois et al. (1956) Anal. Chem. 28:_350–356. [176] Habeeb (1966) Analytical Biochemistry 14:_328–336. [177] Miran et al. (1982) Analytical Biochemistry 126:_433–435. [178] Smith et al. (1985) Analytical Biochemistry 150:_76–85.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. (i) Mannoproteintõl lényegében mentes b¹glükán és/vagy (ii) anti-b-glükán ellenanyag alkalmazása gombafertõzés emlõsszervezetben történõ preven-
60 18
2
ciójára vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a b¹glükán egy vagy több b-1,6-kötést tartalmaz. 3. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a b¹glükán proteázzal kezelt gombasejt formájában van. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a b¹glükán fehérje-b-glükán-konjugátum formájában van. 5. A 4. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a b¹glükán CRM197-hez van konjugálva. 6. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a b¹glükán Candida, például C. albicans sejtfalából származik. 7. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a b¹glükán molekulatömege 100 kDa-nál kevesebb. 8. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben az emlõsszervezet emberi szervezet. 9. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a kezelés vagy védelem a következõ csoportból választott fajok fertõzése ellen történik: Candida, Cryptococcus, Aspergillus, Pneumocystis, Coccidioides, Trichophyton, Blastomyces, Histoplasma, Paracoccidioides és Pythium. 10. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás candidosis, aspergillosis, cryptococcosis, dermatomycosis, sporothrychosis és más szubkután mycosis, blastomycosis, histoplasmosis, coccidiomycosis, paracoccidiomycosis, pneumocystosis és szájpenész kezelésére vagy ezekkel szembeni védelemre. 11. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a gyógyszer továbbá a következõket is tartalmazza: Neisseria meningitidis A¹, C¹, W135és/vagy Y¹szerocsoportjaiból származó szacharidantigént; Heliobacter pyloriból származó antigént; N. meningitidis B¹szerocsoportból származó fehérjeantigént; N. meningitidis B¹szerocsoportból származó külsõmembrán-vezikulum (OMV) preparátumot; Streptococcus pneumoniaeból származó szacharidantigént; hepatitis A¹vírusból származó antigént; hepatitis B¹vírusból származó antigént; hepatitis C¹vírusból származó antigént; Bordatella pertussisból származó antigént; diftériaantigént; tetanuszantigént; Haemophilus influenzae B¹bõl származó szacharidantigént; N. gonorrhoeaeból származó antigént; Chlamydia pneumoniaebõl származó antigént; Chlamydia trachomatisból származó antigént; Porphyromonas gingivalisból származó antigént; polioantigént; veszettség (rabies) antigénjét; kanyaró¹, mumpsz- és/vagy rubeolaantigéneket; influenzavírusból származó antigént; paarmyxovírusból, például respirációs syncytialis vírusból vagy parainfluenzavírusból származó antigént; Moraxella catarrhalisból származó antigént; Streptococcus agalactiaebõl származó antigént; Streptococcus pyogenesbõl származó antigént; Streptococcus aureusból származó antigént; Bacillus anthracisból antigént; flaviviridae-családhoz tartozó vírusból származó antigént; pestivírus-
1
HU 004 028 T2
ból származó antigént; parvovírusantigént; prionfehérjét; amiloid fehérjét; és/vagy rákantigént. 12. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a gyógyszer gombaellenes szert is tartalmaz. 13. Immunogén készítmény, amely immunogén komponenst, gyógyászatilag elfogadható hordozót és
5
19
2
adjuvánst tartalmaz, ahol (a) az immunogén komponens mannoproteintõl lényegében mentes, gombaeredetû b¹glükán, és (b) ha a készítményt emlõsszervezetnek beadjuk, védõhatású antiglükán ellenanyagok termelõdését idézi elõ, de nem idézi elõ olyan ellenanyagok termelõdését, amelyek gátolják az antiglükán ellenanyagok védõhatását.
HU 004 028 T2 Int. Cl.: A61K 39/385
20
HU 004 028 T2 Int. Cl.: A61K 39/385
21
HU 004 028 T2 Int. Cl.: A61K 39/385
22
HU 004 028 T2 Int. Cl.: A61K 39/385
23
HU 004 028 T2 Int. Cl.: A61K 39/385
24
HU 004 028 T2 Int. Cl.: A61K 39/385
25
HU 004 028 T2 Int. Cl.: A61K 39/385
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
