!HU000006991T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 006 991
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 538348 P 2004. 01. 22.
(73) Jogosult: Merck Patent GmbH, 64293 Darmstadt (DE)
US
(72) Feltaláló: GILLIES, Stephen, D., Carlisle, MA 01741 (US)
(54)
HU 006 991 T2
C07K 16/30
(21) Magyar ügyszám: E 05 701002 (22) A bejelentés napja: 2005. 01. 18. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050701002 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1706428 A2 2005. 08. 04. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1706428 B1 2009. 09. 23.
(2006.01) A61P 35/00 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05070967 PCT/EP 05/000428
(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest
Csökkentett komplementfixálású rákellenes ellenanyagok
A leírás terjedelme 28 oldal (ezen belül 11 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 006 991 T2
Kapcsolódó bejelentések Ez a bejelentés a 2004. január 22¹én benyújtott, 60/538 348 számú amerikai egyesült államokbeli ideiglenes szabadalmi bejelentés elsõbbségét igényli, amelynek teljes kitanítása hivatkozás útján a kitanítás részét képezi. A találmány területe A találmány tárgyát általánosságban daganatsejteket célzó rákellenes ellenanyagok képezik. Közelebbrõl a találmány tárgyát anti-GD2 ellenanyagok képezik a GD2 glikolipidet expresszáló daganatsejtek célzására. A találmány háttere Rák kezelésének gyakori módja ellenanyagok alkalmazását foglalja magában daganatsejtek megtámadására a daganatsejtekkel asszociált antigének specifikus célzásával. Ezen eljárás egy specifikus példája anti-GD2 ellenanyagok alkalmazását foglalja magában GD2 ellen, ami egy olyan glikolipid, amely erõsen expresszálódik bizonyos daganatsejtekben, mint például glioblasztóma, melanóma, kissejtes tüdõkarcinóma és neuroblasztóma. Közelebbrõl teszteltek anti-GD2 ellenanyagokat, mint például a 14.18¹at neuroblasztóma és oszteoszarkóma daganatok ellen (Yu és mtsai., J. Clin. Oncol., [1998]; 16: 2169–2180. old.), sikerrel kecsegtetõ eredményekkel. Azonban mivel a GD2 idegvégzõdésekben is expresszálódik, az anti-GD2 ellenanyagos kezelés súlyos mellékhatása a fájdalom (Kushner és mtsai., J. Clin. Oncol., [2001]; 19: 4189–4194. old.; Frost és mtsai., Cancer, [1997]; 80: 317–333. old.; Yu és mtsai., J. Clin. Oncol., [1998]; 16: 2169–2180. old.). Wallace és mtsai. (Anesth. Analg. 1997, 85: 794–796. old.) arról számolnak be, hogy a 14.18 (ch14.18) kiméra monoklonális ellenanyag infúziója fájdalommal jár, amelyet csak morfin nagy dózisának beadásával lehet kontrollálni. Ily módon szükség van a szakterületen olyan GD2 ellen irányuló ellenanyagokra, amelyek csökkentett mellékhatásokat mutatnak, miközben megtartják hatékonyságukat a GD2 glikolipidet expresszáló rákok kezelésében. A találmány összefoglalása A találmány tárgyát olyan fehérjék képezik, amelyek olyan ellenanyag-részeket tartalmaznak, amelyben a fehérjék kötõdnek a GD2 glikolipidhez, és ellenanyagfüggõ sejtközvetített citotoxicitást (’antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity’, ADCC) indukálnak, de csökkentett a komplementfixálásuk. Amikor pácienseknek adják be, a találmány szerinti ellenanyagok és rokon fehérjék általában azt eredményezik, hogy a páciens alacsonyabb fájdalomszintet tapasztal, összehasonlítva a találmány szerint nem módosított megfelelõ fehérjék beadásával létrehozott szinttel. Ennek eredményeképpen bizonyos kezelési modalitásokban a páciens szenvedése enyhül, és az életminõsége javul. Más kezelési modalitásokban a találmány szerinti terápiás fehérje dózisa magasabb, mint a találmány szerinti módosítások nélküli megfelelõ ellenanyag-alapú fehérjéé.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
A találmány egy megvalósítási módja szerint Fc¹régiót és GD2 kötésére képes variábilis régiót tartalmazó ellenanyag-alapú fehérjét alkalmazunk, ahol az Fc¹régió IgG-bõl, elõnyösebben IgG1-bõl származik. A találmány szerinti ellenanyag-alapú fehérjék CH1 doméneket és/vagy CL doméneket tartalmazhatnak. Egy további megvalósítási mód szerint az ellenanyag-alapú fehérje variábilis régiója kapcsolómolekulán, elõnyösebben polipeptid kapcsolómolekulán keresztül kapcsolódik az Fc¹régióhoz. A polipeptid kapcsolómolekula glicint és/vagy szerint tartalmazhat. Egy megvalósítási mód szerint a kapcsolómolekula polipeptidszekvenciája GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (10. azonosító számú szekvencia). Egy további megvalósítási mód szerint a variábilis régió legalább 60%, 70%, 80% vagy 90% azonosságú a kanonikus 14.18 ellenanyag-variábilis régiójával (Yu és mtsai., J. Clin. Oncol., [1998]; 16: 2169–2180. old.; US 2003–0157054–A1 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés). Egy elõnyös megvalósítási mód szerint az Fc¹régió olyan módosítást tartalmaz, amely csökkenti vagy megszünteti a komplementfixációt, például az ADCC szintjéhez képest. Ebben a megvalósítási módban az IgG1 Fc¹régiója a Lys322Ala mutációval van módosítva. Más olyan mutációkat is alkalmazhatunk, amelyek csökkentik a komplementfixációt, és a mutációk lehetnek aminosavszubsztitúciók, valamint aminosavak deléciói vagy inszerciói. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint az anti-GD2 ellenanyagokat a patkány-eredetû YB2/0 sejtvonalban expresszáltatjuk, ami olyan ellenanyagokat eredményez, amelyeknek magasabb az ADCC-aktivitása, mint a legtöbb más sejtvonalban expresszáltatott anti-GD2 ellenanyagoké. Összefoglalva, a találmány tárgyát képezik az alábbiak: – Polipeptid, amely anti-GD2 ellenanyag-variábilis régióját és immunglobulin (lg) Fc¹régióját tartalmazza, ahol az Fc¹régió egy vagy több olyan aminosavszubsztitúciót tartalmaz, amelyek a komplementfixálás (CDC) csökkenését vagy eliminálását okozzák. – Egy ennek megfelelõ polipeptid, ahol a CDC csökkenése viszonylagos az ellenanyagfüggõ sejtközvetített citotoxicitáshoz (ADCC). – Egy ennek megfelelõ polipeptid, ahol az Fc¹régió CH1 domént és adott esetben és elõnyösen CL domént tartalmaz. – Egy ennek megfelelõ polipeptid, ahol az lg IgG, elõnyösen IgG1. – Egy ennek megfelelõ polipeptid, ahol az Fc¹régió legalább egy pozícióban, elõnyösen a 315–330. pozíciók között, elõnyösebben legalább a 322. pozícióban, és legelõnyösebben csak a 322. pozícióban módosítva van. – Egy ennek megfelelõ polipeptid, ahol a módosítás K322A mutáció. – Egy ennek megfelelõ polipeptid, ahol a variábilis régió humán 14.18 monoklonális ellenanyagból származik, és elõnyösen az 5. azonosító számú aminosavszekvenciát tartalmazza.
1
HU 006 991 T2
– A 14.18 jelû ellenanyag, amely legalább a 322. pozícióban lévõ aminosavszubsztitúciót, elõnyösen K322A szubsztitúciót tartalmaz. – Egy ennek megfelelõ polipeptid vagy ellenanyag, amelynek fokozott az ADCC-aktivitása, amely a polipeptid/ellenanyag YB2/0 sejtekben történõ elõállításával nyerhetõ. – DNS-molekula, amely fent és az igénypontokban definiált polipeptidet vagy ellenanyagot kódol. – Expressziós sejt, amely a DNS-molekulát tartalmazza, elõnyösen YB2/0. – Gyógyászati készítmény, amely fent definiált polipeptid vagy ellenanyag hatásos mennyiségét tartalmazza, együtt gyógyászatilag elfogadható hordozóval, oldószerrel vagy excipienssel. – Polipeptid vagy ellenanyag alkalmazása rák kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására, amely rák elõnyösen a neuroblasztóma, glioblasztóma, oszteoszarkóma, melanóma, kissejtes tüdõkarcinóma, B¹sejtes limfóma, vesekarcinóma és retinoblasztóma által alkotott csoportból van kiválasztva. – Eljárás fokozott ADCC és csökkentett vagy eliminált CDC-aktivitású anti-GD2 elõállítására, amely eljárás magában foglalja olyan polipeptid expresszáltatását YB2/0 sejtekben, amely anti-GD2 ellenanyag-variábilis régióját és IgG1 Fc¹régióját tartalmazza, ahol az Fc¹régió legalább egy aminosavszubsztitúciót tartalmaz a 322. pozícióban. – Egy ennek megfelelõ eljárás, ahol az aminosavszubsztitúció K322A. – Egy ennek megfelelõ eljárás, ahol a polipeptid variábilis régiói humán 14.18 monoklonális ellenanyagból származnak, és elõnyösen az 5. azonosító számú aminosavszekvenciát tartalmazzák. Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra a humán 14.18 IgG1 érett nehézláncának vad típusú aminosavszekvenciáját (1. azonosító számú szekvencia) mutatja be. A 2. ábra a humán 14.18 IgG1 érett nehézláncának K322A mutációt tartalmazó aminosavszekvenciáját (5. azonosító számú szekvencia) mutatja be. A 322. pozícióban szubsztituált alaninoldalláncot aláhúztuk. A 3. ábra az érett humán 14.18 IgG1 könnyûlánc aminosavszekvenciáját mutatja be (2. azonosító számú szekvencia). A 4. ábra a humán 14.18 IgG1 érett nehézláncát kódoló nukleotidszekvenciát (3. azonosító számú szekvencia) mutatja be az intronokkal. Az 5. ábra a humán 14.18 IgG1 érett könnyûláncát kódoló nukleotidszekvenciát (4. azonosító számú szekvencia) mutatja be az intronokkal. A 6. ábra az ellenanyagfüggõ sejtes citotoxicitási vizsgálati eljárás eredményét mutatja be
5
A 7. ábra
10 A 8. ábra
15
A 9. ábra 20
A 10. ábra 25
30
A 11. ábra
35
40
A 12. ábra
2
GD2¹t expresszáló M¹21 sejteken. Az x tengely az ellenanyag koncentrációját mutatja ng/ml-ben, míg az y tengely a célsejtek százalékos lízisét mutatja. az ellenanyagfüggõ sejtes citotoxicitási vizsgálati eljárás eredményét mutatja be GD2¹t expresszáló LN¹229 sejteken. Az x tengely az ellenanyag koncentrációját mutatja ng/ml-ben, míg az y tengely a célsejtek százalékos lízisét mutatja. az ellenanyagfüggõ sejtes citotoxicitási vizsgálati eljárás eredményét mutatja be GD2¹t nem expresszáló EpCAM+ A431 sejteken. Az x tengely az ellenanyag koncentrációját mutatja ng/mlben, míg az y tengely a célsejtek százalékos lízisét mutatja. az komplementfüggõ citotoxicitási vizsgálati eljárás eredményét mutatja be GD2¹t expresszáló M¹21 sejteken. Az x tengely az ellenanyag koncentrációját mutatja ng/ml-ben, míg az y tengely a célsejtek százalékos lízisét mutatja. az komplementfüggõ citotoxicitási vizsgálati eljárás eredményét mutatja be GD2¹t expresszáló LN¹229 sejteken. Az x tengely az ellenanyag koncentrációját mutatja ng/ml-ben, míg az y tengely a célsejtek százalékos lízisét mutatja. az érett humán 14.18 sFv(VL¹VH)¹Fc fúziós fehérje aminosavszekvenciáját (9. azonosító számú szekvencia) mutatja be, amelyben sFv antigénkötõ fragmens van a GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (10. azonosító számú szekvencia) aminosavszekvenciájú polipeptid-kapcsolómolekulán keresztül hozzákapcsolva IgG1 csukló, CH2 és CH3 doménjeit tartalmazó Fc¹fragmenséhez. a 10. ábrán bemutatott érett humán 14.18 sFv(VL¹VH)¹Fc ellenanyag-konstrukciót kódoló nukleinsavszekvenciát (8. azonosító számú szekvencia) mutatja be.
45 A találmány részletes leírása A GD2 glikolipid különféle daganatsejteken expresszálódik, de lényegében nem expresszálódik normális szöveteken, kivéve valamekkora expressziót az 50 idegvégzõdésekben. A GD2 glikolipid ellen irányuló ellenanyagokat teszteltek rákos páciensekben valamekkora sikerrel. Azonban, feltételezhetõen a GD2 idegsejtekben való expresszálódása miatt, a fájdalom az anti-GD2 ellenanyagos kezelés fõ mellékhatása, és en55 nek következtében dózislimitáló toxicitás. A találmány tárgyát anti-GD2 ellenanyagok és rokon molekulák képezik, amelyek kisebb fájdalmat indukálnak. A leírás szerint a GD2 glikolipid vagy GD2 antigén kifejezés alatt olyan glikolipidet értünk, amely képes 60 specifikusan kötõdni találmány szerinti anti-GD2 ellen3
1
HU 006 991 T2
anyaghoz. Az anti-GD2 ellenanyag kifejezés alatt olyan ellenanyagot értünk, amely képes specifikusan kötõdni a GD2 glikolipid antigénhez. A leírás szerint a „kötõdik specifikusan”, „specifikusan kötõdik” és „specifikus kötõdés” kifejezések alatt azt értjük, hogy az ellenanyagnak egy adott antigénre legalább körülbelül 106 M–1, elõnyösebben legalább körülbelül 107 M–1, elõnyösebben legalább körülbelül 108 M–1 és legelõnyösebben legalább körülbelül 1010 M–1 a kötési affinitása. A leírás szerinti értelemben az „ellenanyag” kifejezés alatt a következõket értjük: (i) intakt ellenanyag (például monoklonális ellenanyag vagy poliklonális ellenanyag), (ii) annak antigénkötõ részletei, beleértve például Fab-fragmenst, Fab’-fragmenst, (Fab’)2-fragmenst, Fv¹fragmenst, egyláncú ellenanyag-kötõhelyet, sFv¹t, (iii) bi¹specifikus ellenanyagok és azok antigénkötõ részletei és (iv) multispecifikus ellenanyagok és azok antigénkötõ részletei. Ezenfelül az „ellenanyag” kifejezés magában foglalja az Fab-fragmens, Fab’-fragmens, (Fab’)2-fragmens, Fv¹fragmens, egyláncú ellenanyag-kötõhely vagy sFv-fragmens bármelyikét hozzákapcsolva Fc¹fragmenshez vagy Fc¹fragmens bármely részletéhez. A kapcsolást a szakterületen ismert kapcsoló peptidszekvenciák alkalmazásával érhetjük el. A találmány szerinti ellenanyag lehet természetben elõforduló vagy szintetikus, mint például rekombináns ellenanyag. A leírás szerint az „immunglobulin” kifejezés alatt természetben elõforduló vagy szintetikus úton elõállított olyan polipeptidet értünk, amely homológ intakt ellenanyaggal (például monoklonális ellenanyaggal vagy poliklonális ellenanyaggal) vagy annak fragmensével vagy részletével, mint például annak antigénkötõ részletével. A találmány szerinti immunglobulin bármilyen osztályból származhat, mint például IgA, IgD, IgG, IgE vagy IgM lehet. A IgG immunglobulinok bármilyen alosztályból származhatnak, mint például IgG1, IgG2, IgG3 vagy IgG4. Az immunglobulin kifejezés magában foglalja az immunglobulinokból származó polipeptideket és azok fragmenseit is. Az immunglobulinok lehetnek természetben elõfordulók vagy szintetikusak, mint például rekombináns immunglobulinok. Immunglobulin konstans régióját természetben elõforduló vagy szintetikusan elõállított polipeptidként definiáljuk, amely homológ az immunglobulin C¹terminális régiójával, és tartalmazhat CH1 domént, csuklót, CH2 domént, CH3 domént vagy CH4 domént, különkülön vagy bármilyen kombinációban. A leírás szerinti értelemben az „Fc-régió” kifejezés alatt az anti-GD2 ellenanyag konstans doménjából származó doméneket értünk, beleértve a konstans régió fragmensét, analógját, variánsát, mutánsát vagy származékát. A megfelelõ immunglobulinok közé tartoznak az IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 és más osztályok. Immunglobulin konstans régióját természetben elõforduló vagy szintetikusan elõállított polipeptidként definiáljuk, amely homológ az immunglobulin C¹terminális régiójával, és tartalmazhat CH1 domént, csuklót, CH2 domént, CH3 domént vagy CH4 domént, külön-külön vagy bármilyen kombinációban. A találmány szerint az Fc¹régió tipikusan legalább
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
egy CH2 domént tartalmaz. Például az Fc¹régió csuklóCH2-CH3 részt tartalmazhat. Más megoldásképpen az Fc¹részlet tartalmazhatja a csuklórégió, a CH2 domén és/vagy CH3 domén és/vagy CH4 domén mindegyikét vagy egy részletét. A leírás szerint a variábilis fragmens vagy Fv kifejezés alatt természetben elõforduló vagy szintetikus úton elõállított olyan polipeptidet értünk, amely homológ a nehézlánc variábilis régióval és/vagy könnyûlánc variábilis régióval. Közelebbrõl egy Fv sFv vagy egyláncú variábilis fragmens lehet, ahol a nehézlánc variábilis régió és a könnyûlánc variábilis régió polipeptidmolekula-résszel van összekapcsolva. Ilyen polipeptid-kapcsolómolekulák ismertek a szakterületen. Az ellenanyagok daganatellenes aktivitása vagy komplementfüggõ citotoxicitás (CDC vagy komplementfixálás), vagy ellenanyagfüggõ sejtközvetített citotoxicitás (ADCC) útján következik be. Ezt a két aktivitást a szakterületen „effektorfunkcióként” ismerjük, és azokat ellenanyagok, különösen az IgG osztály közvetíti. Az IgG alosztályok (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) mindegyike közvetíti az ADCC¹t és a komplementfixálást valamilyen mértékben, ahol az IgG1 és IgG3 a leghatásosabb mindkét aktivitásra (3. fejezet, 3. táblázat a Paul: „Essential Immunology” 4. kiadás, 62. old. irodalmi helyen). Úgy vélik, hogy az ADCC akkor következik be, amikor a természetes ölõsejtek (NK) Fc¹receptorai megkötik az antigénhez kötõdõ ellenanyagok Fc¹régióját a sejt felszínén. Az Fc¹receptor-kötés jelzi a sejtnek, hogy pusztítsa el a célsejtet. A CDC-rõl úgy vélik, hogy több mechanizmusa van; az egyik mechanizmust az indítja be, amikor ellenanyag antigénhez kötõdik a sejt felszínén. Ha egyszer az antigén-ellenanyag komplex kialakult, azt gondolják, hogy a C1q molekula megköti az antigén-ellenanyag komplexet. Azután a C1q elhasítja magát, hogy más komplement fehérjék enzimatikus aktiválását és hasítását indítsa be, amelyek azután kötõdnek a célsejt felszínére, és elõsegítik annak elpusztulását, például a sejtlízis és/vagy makrofágok általi bekebelezés útján. A találmány egyik kulcsfelismerése az, hogy a CDC okozza a fájdalom mellékhatást. Anélkül, hogy elméletileg korlátozni kívánnánk magunkat, az idegsejtek különösen érzékenyek lehetnek a komplementfixálásra, mivel ez a folyamat sejtmembránbeli csatornák kialakulásával jár, ami kontrollálatlan ionáramlást tesz lehetõvé. A fájdalomérzékelõ idegsejtekben a komplementfixálásnak még kis mértéke is szignifikáns lehet akciós potenciálok létrehozására. Ily módon az anti-GD2 ellenanyag kötésébõl eredõ CDC bármilyen mértéke az idegsejteken fájdalmat eredményezhet. A találmány szerint elõnyös a komplementfixálás csökkentése, hogy csökkentsük a mellékhatások mértékét a páciensben. Azonban ha csökkentjük vagy elimináljuk a CDC¹t, az anti-GD2 ellenanyag hatásos daganatellenes aktivitása azt igényli, hogy fenntartsuk vagy akár növeljük is az ADCC szintjét. A találmány egy második kulcsfelismerése az, hogy az anti-GD2 ellenanyagok daganatellenes aktivitása elsõdlegesen az ADCC-bõl adódik, és
1
HU 006 991 T2
lényegében nem a komplementfixálásból. Tehát a találmány fontos aspektusa az, hogy lehetséges egy anti-GD2 ellenanyag CDC funkciójának a csökkentése vagy eliminálása anélkül, hogy eliminálnánk az antiGD2 ellenanyag daganatellenes képességeit. Más szóval, egy olyan anti-GD2 ellenanyagnak, amely módosítva van a komplementfixálás csökkentésére vagy eliminálására, még mindig lehetnek daganatellenes képességei, és ezért hatékony lehet a daganatnövekedés kezelésére. Ennek következtében a találmány tárgya mutáció olyan anti-GD2 ellenanyagokban, amely nagymértékben csökkenti a komplementfixálást, miközben minimális a hatása az ADCC¹re, mint például 322¹es lizin mutációja alaninra (K322A) vagy más aminosavra (Thommesen és mtsai., Mol. Immunol., [2000]; 37(16): 995–1004. old.). A találmány szerinti anti-GD2 ellenanyagokat szakterületen ismert rekombináns vektorokkal lehet elõállítani. Az „expressziós vektor” kifejezés alatt DNS expresszálására alkalmazott replikálódásra képes DNSkonstrukciót értünk, amely a kívánt anti-GD2 ellenanyagot kódolja, és amely az alábbi transzkripciós egységet tartalmazza: (1) a génexpresszióban szabályozó szerepet játszó genetikai elemek, például promoterek, operátorok vagy enhanszerek, mûködõképesen kapcsolva (2) a kívánt anti-GD2 ellenanyagot kódoló DNSszekvenciához, amely mRNS¹sé íródik át és fehérjévé transzlálódik, és (3) megfelelõ transzkripciós és transzlációiniciációs és terminációs szekvenciák. A promoter és egyéb szabályozóelemek megválasztása általában változik a tervezett gazdasejttõl függõen. Egy elõnyös példa szerint az anti-GD2 ellenanyagot kódoló nukleinsavat gazdasejtbe transzfektáljuk rekombináns DNS módszerek alkalmazásával. A találmány szerinti értelemben az idegen DNS alatt értendõk a találmány szerinti fehérjéket kódoló szekvenciák. Alkalmas gazdasejtek közé tartoznak prokarióta, élesztõvagy magasabb rendû eukarióta sejtek. A rekombináns anti-GD2 ellenanyagot expresszáltathatjuk élesztõgazdákban, elõnyösen Saccharomyces fajban, mint például S. cerevisiae. Más nemzetségbeli élesztõk, mint például Pichia vagy Kluyveromyces is alkalmazhatók. Az élesztõvektorok általában élesztõplazmidból származó replikációs origót vagy autonóm replikációs szekvenciát (ARS), promotert, az antiGD2 ellenanyagot kódoló DNS¹t, valamint poliadenilációs és transzkripciós terminációs szekvenciákat és szelekciós gént tartalmazhatnak. Élesztõvektorokban alkalmas promoterszekvenciák közé tartozik a metallotionein, 3¹foszfoglicerát-kináz vagy más glikolitikus enzimek, mint például enoláz, gliceraldehid-3-foszfátdehidrogenáz, hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glükóz-4-foszfát-izomeráz, 3¹foszfoglicerát-mutáz, piruvát-kináz, triózfoszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz és glukokináz promotere. Különféle emlõs- vagy rovarsejttenyésztõ rendszereket alkalmazhatunk a találmány szerinti rekombináns fehérje expresszáltatására. Fehérjék rovarsejtekben történõ elõállítására szolgáló bakulovírusrendszerek jól ismertek a szakterületen. Alkalmas emlõsgazdasejt-vo-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
nalak példái közé tartoznak az NS/0 sejtek, L sejtek, C127, 3T3, Kínai hörcsög petefészek (CHO), HeLa, és BHK sejtvonalak. További alkalmas emlõsgazdasejtek közé tartoznak a CV¹1 sejtek (ATCC CCL70) és COS¹7 sejtek, amely mindkettõ majomvesébõl származik. Egy másik alkalmas majomvese-sejtvonal, a CV¹1/EBNA, a CV¹1 sejtvonalból származik, és transzfektálva egy olyan génnel, amely Epstein–Barr-vírus 1¹es nukleáris antigénjét (EBNA¹1) kódolja, és egy olyan vektorral, amely CMV-szabályozó szekvenciákat tartalmaz (McMahan és mtsai., EMBO J., [1991]; 10: 2821–2832. old.). Az EBNA¹1 gén lehetõvé teszi expressziós vektorok, mint például HAV¹EO vagy pDC406 episzomális replikációját, amelyek tartalmazzák az EBV replikációs origót. A találmány szerint különösen elõnyös sejtvonal az anti-GD2 ellenanyagok expresszáltatására az YB2/0 sejtvonal (Shinkawa és mtsai., J. Biol. Chem., [2003]; 278: 3466–3473. old.). Az ebbõl a sejtvonalból elõállított ellenanyagoknak fokozott az ADCC¹je. Amikor ebben a sejtvonalban vannak elõállítva, a találmány szerinti ellenanyagoknak különbözik az N¹kapcsolt oligoszacharid mintázata a fent ismertetett más sejtvonalakban elõállított ellenanyagon láthatótól. A találmány elõnyös megvalósítási módjai olyan YB2/0¹ban termeltetett anti-GD2 ellenanyagokat foglalnak magukban, amelyeknek nincs mutáltatva a konstans régiójuk, valamint olyan anti-GD2 ellenanyagokat, amelyek konstans régiója olyan mutációkat tartalmaz, amelyek csökkentik a komplementfixálást, mint például a Lys322Ala, szintén YB2/0 sejtekben termeltetve. Az emlõs expressziós vektorok tartalmazhatnak nem átíródó elemeket, mint például replikációs origót, az expresszálandó génhez kapcsolódó alkalmas promotert és enhanszert, és egyéb 5’ vagy 3’ szegélyezõ, nem átíródó szekvenciákat, és 5’ vagy 3’ nem transzlálódó szekvenciákat, mint például szükséges riboszómakötõ helyeket, poliadenilációs helyet, splice-donor és akceptor helyeket, és transzkripciós terminációs szekvenciákat. Általánosan alkalmazott promoterek és enhanszerek polióma, 2¹es adenovírus, 40¹es majomvírus (SV40) és humán citomegalovírus eredetûek. Az SV40 virális genomból származó DNS-szekvenciák, például SV40 origó, korai és késõi promoter, enhanszer, splice¹, és poliadenilációs helyek alkalmazhatók a heterológ DNS-szekvencia expressziójához szükséges további genetikai elemekként. Amikor a módosított ellenanyag sejtbõl történõ szekréciója kívánatos, a vektor szignál- vagy vezetõszekvenciákat kódoló DNS¹t tartalmazhat, elõnyösen a nehézlánc és könnyûlánc N¹terminálisára helyezve. A találmányban az ellenanyag-variábilis régiók természetes szignálszekvenciáit alkalmazzuk, vagy más megoldásképpen heterológ szignálszekvenciát alkalmazhatunk, mint például az interleukin–4 szignálszekvenciáját. A találmány tárgyát képezi eljárás is találmány szerinti rekombináns fehérjék elõállítására, amely eljárás magában foglalja az anti-GD2 ellenanyagot kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós vektorral
1
HU 006 991 T2
transzformált gazdasejt tenyésztését olyan körülmények között, amelyek elõsegítik az expressziót. A kívánt fehérjét azután megtisztítjuk tenyésztõ tápközegbõl vagy sejtextraktumokból. Például a rekombináns fehérjét a tenyésztõ tápközegbe szekretáló expressziós rendszerbõl származó felülúszókat elõször töményítünk kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ fehérjetöményítõ szûrõvel, például Amicon vagy Millipore Pellicon ultrafiltrációs egységgel. A töményítési lépést követõen a koncentrátumot felvihetjük megfelelõ tisztítási mátrixra, amint az ismert a szakterületen. Egy „izolált” vagy „tisztított” anti-GD2 ellenanyag vagy annak biológiailag aktív részlete lényegében mentes sejtes anyagoktól vagy azon sejt vagy szöveti forrás szennyezõ fehérjéitõl, amelybõl az anti-GD2 ellenanyag származik, vagy lényegében mentes a kémiai prekurzoroktól vagy más vegyszerektõl, amikor kémiai úton szintetizáljuk. A „lényegében mentes sejtes anyagoktól” kifejezés magában foglal olyan antiGD2 ellenanyag készítményeket, amelyekben a fehérjét elválasztottuk azon sejt sejtbeli komponenseitõl, amelybõl azt izoláltuk vagy rekombináns úton elõállítottuk. Egy megvalósítási mód szerint a „lényegében mentes sejtes anyagoktól” kifejezés olyan anti-GD2 ellenanyag készítményeket foglal magában, amelyekben kevesebb mint körülbelül 30% (száraz tömegre vonatkoztatva) a nem ellenanyag (amit a leírásban „szennyezõ fehérjének” is nevezünk), elõnyösebben kevesebb mint körülbelül 20% a nem ellenanyag fehérje, még elõnyösebben kevesebb mint körülbelül 10% a nem ellenanyag fehérje, legelõnyösebben kevesebb mint körülbelül 5% a nem ellenanyag fehérje. Amikor a módosított anti-GD2 ellenanyagot vagy annak biológiailag aktív részletét rekombináns forrásból tisztítjuk meg, az elõnyösen lényegében mentes a tenyésztõ tápközegtõl, azaz a tenyésztõ tápközeg kevesebb mint körülbelül 20%¹át, elõnyösebben kevesebb mint körülbelül 10%¹át, és legelõnyösebben kevesebb mint körülbelül 5%¹át képviseli a fehérjekészítmény térfogatának. A „lényegében tiszta módosított anti-GD2 ellenanyag” kifejezés alatt olyan készítményt értünk, amelyben a módosított anti-GD2 ellenanyag a készítményben található fehérjék legalább 60%, 70%, 80%, 90%, 95% vagy 99%¹át képviseli. Kezelési eljárások anti-GD2 ellenanyag fehérjék alkalmazásával A találmány szerinti módosított anti-GD2 ellenanyagok hasznosak rákok, mint például GD2¹t expresszáló rákok kezelésére. Ilyen rákok nem korlátozó példái közé tartozik a neuroblasztóma, glioblasztóma, melanóma, kissejtes tüdõkarcinóma, B¹sejtes limfóma, vesekarcinóma, retinoblasztóma és más neuroektodermális eredetû rákok. Beadás A találmány szerinti módosított anti-GD2 ellenanyagokat beadásra alkalmas gyógyászati készítményekbe foglalhatjuk be. Ilyen készítmények tipikusan módosí-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
tott anti-GD2 ellenanyagot és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaznak. A leírás szerinti értelemben a „gyógyászatilag elfogadható hordozó” kifejezés alatt bármilyen és mindenféle oldószert, diszpergálóközeget, bevonatot, baktériumellenes és gombaellenes szereket, izotóniás és abszorpciót késleltetõ szereket és hasonlókat értünk, amelyek kompatibilisek gyógyászati beadással. Az ilyen közegek és szerek alkalmazása gyógyászatilag aktív szerek esetében jól ismert a szakterületen. A találmány szerinti gyógyászati készítményt úgy szereljük ki, hogy kompatibilis legyen a szándékolt beadási útjával. Beadási utak példái közé tartozik a parenterális, például intravénás, intradermális, szubkután, orális (például inhalálás), transzdermális (például topikális), transzmukozális és rektális beadás. Parenterális, intradermális vagy szubkután alkalmazásra használt oldatok és szuszpenziók az alábbi komponenseket tartalmazhatják: steril oldószer, mint például injektálásra alkalmas víz, sóoldat, olajok, polietilénglikolok, glicerin, propilénglikol vagy más szintetikus oldószerek; baktériumellenes szerek, mint például benzil-alkohol vagy metil-parabének; antioxidánsok, mint például aszkorbinsav vagy nátrium-biszulfit; komplexképzõ szerek, mint például etilén-diamin-tetraecetsav; pufferek, mint például acetátok, citrátok vagy foszfátok; és tonitást módosító szerek, mint például nátrium-klorid vagy dextróz. A pH¹t savakkal vagy bázisokkal, mint például sósavval vagy nátrium-hidroxiddal állíthatjuk be. A parenterális készítményt ampullákba, eldobható fecskendõkbe vagy üvegbõl vagy mûanyagból készült többdózisos fiolákba zárhatjuk be. A találmány szerinti anti-GD2 ellenanyagokat tartalmazó gyógyszerek 0,01–100% (w/w) koncentrációjúak lehetnek, habár a mennyiség változik a gyógyszerek adagolási alakjának függvényében. A beadási dózis függ a páciensek testtömegétõl, a betegség súlyosságától és az orvos véleményétõl. Azonban általában ajánlatos körülbelül 0,01 és körülbelül 10 mg/testtömeg-kg/nap közötti, elõnyösen körülbelül 0,02 és körülbelül 2 mg/kg közötti, és elõnyösebben körülbelül 0,5 mg/kg mennyiséget beadni injekció esetében. A dózist naponta egyszer vagy többször adhatjuk be, a betegség súlyosságától és az orvos véleményétõl függõen. A találmány szerinti készítmények hasznosak, amikor egy vagy több más terápiás szerrel együtt vannak beadva, mint például rákterápiában szokásos kezelésként alkalmazott kemoterápiás ágensekkel együtt.
50 Szabadalmi példák 1. példa. Csökkentett komplementfixálású mutációt tartalmazó anti-GD2 ellenanyag expresszáltatása A következõ módon létrehoztunk egy olyan exp55 ressziós plazmidot, amely a humán 14.18 anti-GD2 ellenanyag nehéz- és könnyûláncát expresszálja, amelynek mutáció miatt csökkentett a komplementfixálása. A 14.18 anti-GD2 ellenanyag expressziós plazmidja a 60 pdHL7-hu14.18 volt. A pdHL7 a pdHL2-bõl származott 6
1
HU 006 991 T2
(Gillies és mtsai., J. Immunol. Methods, [1989]; 125: 191–202. old.), és a citomegalovírus enhanszer-promotert alkalmazza az immunglobulin könnyû- és nehézláncgének transzkripciójához egyaránt. A CH2-régió K322A mutációját átfedõ polimeráz-láncreakcióval (PCR) építettük be, amely a pdHL7-hu14.18 plazmidot alkalmazta templátként. Az elülsõ láncindító szekvenciája 5’¹TAC AAG TGC GCT GTC TCC AAC (6. azonosító számú szekvencia) volt, ahol az aláhúzott GCT kódolja a K322A szubsztitúciót, és a reverz láncindító szekvenciája 5’¹T GTT GGA GAC AGC GCA CTT GTA (7. azonosító számú szekvencia) volt, ahol az aláhúzott AGC a beépített alaninoldallánc antikodonja. A PCRterméket megklónoztuk, és a szekvencia igazolása után a K322A mutációt tartalmazó DNS¹t kivágtuk mint egy 190 bázispár (bp) méretû Sac II – Nae I restrikciós fragmens (a Sac II és Nae I restrikciós helyek körülbelül a K322A mutációtól körülbelül 90 bp¹ra vannak a leolvasással ellentétes irányban és 100 bp¹ra a leolvasással megegyezõ irányban, amely fragmenst azután a pdHL7-hu14.18-ban található K322¹t tartalmazó megfelelõ fragmens helyettesítésére alkalmaztunk, ami a pdHL7-hu14.18(K322A) plazmidot eredményezte. A 14.18(K322A) ellenanyag expressziós vektorát, a pdHL7-hu14.18(K322A)¹et a pdHL7-hu14.18 konstrukciójával analóg módon állítottuk elõ. Azonban a szakember számos elfogadható vektor közül válogathat a hu14.18 K322A expresszáltatásra. 2. példa. Az anti-GD2 ellenanyag transzfektálása és expresszáltatása Elektroporációt alkalmaztunk az anti-GD2 ellenanyagot kódoló fent ismertetett DNS-nek egér mieloma NS/0 sejtvonalba vagy az YB2/0 sejtvonalba történõ bejuttatására. Az elektroporáció végrehajtásához sejteket tenyésztettünk Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközegben, amely ki volt egészítve 10% hõvel inaktivált magzati borjúszérummal, 2 mM glutaminnal és penicillin/sztreptomicinnel. Körülbelül 5×106 sejtet megmostunk egyszer PBS-ben, és újra felszuszpendáltuk 0,5 ml PBS-ben. Az 1. példa szerinti, módosított antiGD2 ellenanyagot kódoló 10 mg linearizált plazmid DNS¹t inkubáltunk a sejtekkel Gene Pulser küvettában (0,4 cm elektródrés, BioRad) jégen 10 percen keresztül. Az elektroporációt Gene Pulser készülékkel (BioRad, Hercules, CA) hajtottuk végre 0,25 V és 500 mF beállításokkal. A sejteket 10 percig hagytuk magukhoz térni jégen, ami után újra felszuszpendáltuk azokat tenyésztõ tápközegben, és kiszélesztettük 96 mérõhelyes lemezekre. Stabilan transzfektált klónokat szelektáltunk ki 100 nM metotrexát (MTX) jelenlétében történõ növekedésük alapján, amit két nappal a transzfekciót követõen adtunk hozzá a tenyésztõ tápközeghez. A sejteket 3 naponta tápláltuk további 2¹3 alkalommal, és MTXrezisztens klónok jelentek meg 2¹3 hét múlva. A klónoktól vett felülúszókat megvizsgáltuk anti¹Fc ELISAval, hogy olyan klónokat azonosítsunk, amelyek nagy mennyiségû anti-GD2 ellenanyagot termeltek. A magas termelésû klónokat izoláltuk, és felszaporítottuk
2
100 nM MTX¹et tartalmazó tenyésztõ tápközegben. Tipikusan szérummentes tenyésztõ tápközeget, mint például H¹SFM vagy CD tápközeg (Life Technologies) alkalmaztunk. 5 3. példa. Az anti-GD2 ellenanyag biokémiai elemzése Rutin SDS-PAGE jellemzést alkalmaztunk a módosított ellenanyagok integritásának elemzésére. A mó10 dosított anti-GD2 ellenanyagokat Protein A Sepharose gyöngyökön (Repligen, Needham, MA) fogtuk be azokból a szöveti tenyésztõ tápközegbõl, amelybe szekretálódtak, és fehérje-mintapufferben történõ forralással eluáltuk azokat, redukálószerrel, mint például b¹mer15 kaptoetanollal vagy anélkül. A mintákat elválasztottuk SDS-PAGE-vel, és a fehérjecsíkokat Coomassie-festéssel láthatóvá tettük. Az SDS-PAGE eredményei azt mutatták, hogy az elemzett módosított anti-GD2 ellenanyag-fehérjék lényegében egyetlen csíkban voltak je20 len, ami arra utal, hogy nem volt szignifikáns mértékû a degradáció.
25
30
35
40
45
50
55
60 7
4. példa. A találmány szerinti ellenanyagok ellenanyagfüggõ sejtközvetített citotoxicitása (ADCC) és komplementfüggõ citotoxicitása (CDC) Annak demonstrálására, hogy a találmány szerinti módosított ellenanyagok a kívánt tulajdonságokkal rendelkeznek, megvizsgáltuk az ellenanyagok képességét ADCC közvetítésre szokásos eljárások alkalmazásával, lényegében amint Idusogie és mtsai. (J. Immunol., [2000]; 164: 4178–4184. old.) ismertették. Az ellenanyagokat két GD2-pozitív, EpCAM-negatív sejtvonalon (M¹21 and LN¹229) teszteltük, és kontrollként egy GD2-negatív, EpCAM-pozitív sejtvonalon (A431), effektor sejtekként humán PBMC¹k alkalmazásával, szokásos krómfelszabadítási vizsgálati eljárásban. Az összes ellenanyag humán IgG1 izotípusú volt. Az alábbi ellenanyagokat vizsgáltuk: NS/0 sejtekben expresszáltatott 14.18 anti-GD2 ellenanyag humán IgG2 verziói; NS/0 sejtekben expresszáltatott 14.18 a K322A mutációval; YB2/0 sejtekben expresszáltatott 14.18 a K322A mutációval; és NS/0 sejtekben expresszáltatott 14.18 egyláncú Fv¹Fc fúzióként konfigurálva; azok ADCC-aktivitásának meghatározására, mérve M¹21 célsejtek százalékos lízisét korábban ismertetett szokásos eljárások szerint. Kontrollként a KS¹1/4 ellenanyagot mértük, amely nem kötõdik a célsejtekhez. Amint a 6. ábrán bemutatjuk, az YB2/0 sejteken tenyésztett K322A variánsnak volt a legmagasabb általános ADCC-szintje, összehasonlítva az összes többi tesztelt ellenanyag-konstrukcióval. Ugyanezeket a konstrukciókat teszteltük hasonló vizsgálati eljárásban LN¹229 GD2¹t expresszáló célsejtek alkalmazásával. A KS¹1/4 ellenanyagot alkalmaztuk kontrollként. Amint a 7. ábrán bemutatjuk, az YB2/0 sejteken tenyésztett K322A variánsnak volt a legmagasabb általános ADCC-szintje, összehasonlítva az összes többi tesztelt ellenanyag-konstrukcióval. Kontrollként teszteltük ugyanezen anti-GD2 ellenanyagok ADCC-aktivitását A431 sejtekkel, amelyek
1
HU 006 991 T2
nem expresszálják a GD2 glikolipidet. Amint várható, az anti-GD2 ellenanyagok csak nagyon kicsi vagy semmilyen aktivitást mutattak, míg a KS¹1/4 ellenanyag, amelynek ismert módon ADCC-aktivitása van EpCAM¹ot expresszáló sejtek ellen, megnövekedett aktivitást mutatott, ahogy az ellenanyag koncentrációja növekedett (lásd a 8. ábrát). Ez arra utal, hogy az elõzõ vizsgálati eljárásban anti-GD2 ellenanyaggal M¹21 sejteken elért lízist nem kell korrigálni lízisaktivitás semmiféle háttérszintjére. Annak érdekében, hogy teszteljük az anti-GD2 ellenanyagok képességét komplementfüggõ citotoxicitás (CDC) közvetítésére, a következõ ellenanyagokat vizsgáltuk: NS/0 sejtekben expresszáltatott 14.18 humán IgG1 verziói; NS/0 sejtekben expresszáltatott 14.18 két mintája, a K322A mutációval; YB2/0 sejtekben expresszáltatott 14.18 a K322A mutációval; és NS/0 sejtekben expresszáltatott 14.18 egyláncú Fv¹Fc fúzióként konfigurálva. A találmány szerinti anti-GD2 ellenanyagokat megvizsgáltuk M¹21 és LN¹229 sejtlízis vizsgálati eljárásokban szokásos eljárások alkalmazásával, lényegében amint Idusogie és mtsai. (J. Immunol., [2000]; 164: 4178–4184. old.) ismertették. Humán komplement 1:10 hígítását alkalmaztuk. Kontrollként ismét a KS¹1/4 ellenanyagot alkalmaztuk, amely nem kötõdik a célsejtekhez. Azt találtuk, hogy a találmány szerinti ellenanyagok által közvetített komplementfixálás kifejezetten csökkent. Amint a 9. ábrán bemutatjuk, csak az NS/0 sejteken tenyésztett 14.18 ellenanyag mutatott komplementfixálást alacsony koncentrációknál, míg a K322A mutációt tartalmazó ellenanyagok csak csekély vagy semmilyen CDC-aktivitást mutattak alacsony koncentrációknál. Amint a 10. ábrán bemutatjuk, csak az NS/0 sejteken tenyésztett 14.18 anti-GD2 ellenanyagok demonstráltak komplementfixálási aktivitást LN229 sejteken, a célsejtek százalékos lizálásával mérve. A K322A variánsok mindegyike csekély vagy semmilyen CDC-aktivitást mutatott mindegyik koncentrációnál. Összességében az ADCC- és CDC-vizsgálati eljárások eredményei arra utalnak, hogy a találmány szerinti módosított anti-GD2 ellenanyagok közvetítik az ADCC¹t, de szignifikánsan csökkentett a komplementfixálásuk, különösen összehasonlítva tipikus antiGD2 ellenanyagokkal, amelyeket emberi klinikai kísérletekben alkalmaztak. 5. példa. GD2¹r expresszáló daganatokat hordozó egerek kezelése módosított antiGD2 ellenanyagokkal A találmány szerinti módosított anti-GD2 ellenanyagok hatásosságának demonstrálására az 1. példa szerinti módosított ellenanyagot tesztelünk melanóma vagy neuroblasztóma egérmodelljében. Hu/SCID bézs egereket alkalmazunk. A SCID és bézs mutációk szuppresszálják az egér normális immunrendszerét, ily módon humán immunsejteket alkalmazhatunk az immunrendszer rekonstruálására. Humán perifériásvérmononukleocitákat (PBMC) alkalmaztunk. Szükséges a humán immunsejtek alkalmazása, mert a humán
2
IgG1 Fc¹régióját nem ismerik fel az egér Fc receptorok, hogy bekövetkezzen az ADCC. Azután GD2¹t expresszáló sejteket ültetünk be az egerekbe. Például a sejteket szubkután implantáljuk, 5 és a növekedésüket hetente kétszer ellenõrizzük mérõkörzõvel, hogy megbecsüljük a daganat növekedését. Neuroblasztóma modelljeként a GD2¹t expresszáló NXS2 sejtvonalat alkalmazunk (Greene és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, [1975]; 72: 4923–4927. 10 old.). Melanóma modelljeként a B16 sejtvonalat alkalmazunk, amely módosítva van GD2 expresszálására (Haraguchi és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, [1994]; 91: 10 455–10 459. old.). A szubkután daganatokat hagyjuk növekedni körül15 belül 25–200 köbmilliméter méretûre, és azután megkezdjük a kezelést. Mivel a találmány szerinti módosított ellenanyagok szérum-féléletideje több nap, az állatokat csak hetente háromszor kezeljük. Azt találtuk, hogy a daganatok térfogata gyorsan növekszik a hor20 dozóval vagy kontrollal kezelt egerekben, míg a találmány szerinti módosított ellenanyagokkal kezelt egerekben a térfogat lassabban növekszik vagy stabilizálódik, vagy némely esetben összemegy. 6. példa. A maximális tolerált dózis meghatározása I¹es fázisú klinikai vizsgálatban A találmány szerinti módosított anti-GD2 ellenanyag maximális tolerált dózisának meghatározására 1¹es fázisú klinikai vizsgálatot végzünk, lényegében 30 amint Yu és mtsai. (J. Clin. Oncol., [1998]; 16: 2169–2180. old.) ismertették. A humán IgG1-alapú kiméra 14.18 ellenanyag Yu és mtsai. leközölt maximális tolerált dózisa körülbelül 20 mg/m2 volt. A találmány szerinti módosított anti-GD2 ellenanyag maximális tole35 rált dózisa több mint 20 mg/m2. 25
A szekvencialistában található kötetlen szövegek (<223> kód) magyar fordítása: 40
5. azonosító számú szekvenciához: <223> Hu14.18 IgG1 érett nehézlánc K322A mutációval
6. azonosító számú szekvenciához: 45 <223> Elülsõ láncindító pdHL7-hu14.18 plazmid DNS¹re 7. azonosító számú szekvenciához: <223> Reverz láncindító pdHL7-hu14.18 plazmid DNS¹re 50 8. azonosító számú szekvenciához: <223> 14.18 sFv (VL¹VH)¹Fc érett humán fúziós fehérje DNS-szekvenciája intronokkal 55
9. azonosító számú szekvenciához: <223> 14.18 sFv (VL¹VH)¹Fc érett humán fúziós fehérje aminosavszekvenciája
20. azonosító számú szekvenciához: 60 <223> Polipeptid-kapcsolószekvencia 8
HU 006 991 T2
SZEKVENCIALISTA <110> Gillies, Stephen D. <120> Anti-Cancer Antibodies with Reduced Complement Fixation <130> LEX-031 <150> US 60/538,348 <151> 2004–01–22 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 443 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Asn Ile Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Lys Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 180 185 190 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 9
HU 006 991 T2
Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 340 345 350 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 10
HU 006 991 T2
Pro Lys Leu Leu Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 3 <211> 2150 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3
gaggtgcagc tcctgcaagg atcggcaagt aaccagaagt atgcacctga gagtactggg ccaggcctga caggtgcaca agaacccagg ccacctctct agagcacctc cggtgacggt tcctacagtc tgggcaccca agagagttgg gctcctgcct gtctgcctct tggctttttc cacaaagggg cctgacctaa
tggtgcagtc cctccggctc ccctggagtg tcaagggccg agtccctgcg gccagggcac ccttggcttt cccaatgccc ggcctctgcg tgcagcctcc tgggggcaca gtcgtggaac ctcaggactc gacctacatc tgagaggcca ggacgcatcc tcacccggag cccaggctct caggtgctgg gcccacccca
cggcgccgag ctccttcacc gatcggcgcc cgccaccctg ctccgaggac ctccgtgacc ggggcaggga atgagcccag ccctgggccc accaagggcc gcggccctgg tcaggcgccc tactccctca tgcaacgtga gcacagggag cggctatgca gcctctgccc gggcaggcac gctcagacct aaggccaaac
gtggagaagc ggctacaaca atcgacccct accgtggaca accgccgtgt gtgtcctccg gggggctaag acactggacg agctctgtcc catcggtctt gctgcctggt tgaccagcgg gcagcgtggt atcacaagcc ggagggtgtc gtcccagtcc gccccactca aggctaggtg gccaagagcc tctccactcc 11
ccggcgcctc tgaactgggt actacggcgg agtccacctc actactgcgt gtaagctttt gtgaggcagg ctgaacctcg cacaccgcgg ccccctggca caaggactac cgtgcacacc gaccgtgccc cagcaacacc tgctggaagc agggcagcaa tgctcaggga cccctaaccc atatccggga ctcagctcgg
cgtgaagatc gcgccagaac cacctcctac caccgcctac gtccggcatg ctggggcagg tggcgccagc cggacagtta tcacatggca ccctcctcca ttccccgaac ttcccggctg tccagcagct aaggtggaca caggctcagc ggcaggcccc gagggtcttc aggccctgca ggaccctgcc acaccttctc
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200
HU 006 991 T2
tcctcccaga actcacacat cgggacaggt gtccacctcc ccccccaaaa ggtggacgtg ggtgcataat cagcgtcctc ctccaacaaa ccgtggggtg tgaccgctgt tgcccccatc gcttctatcc acaagaccac ccgtggacaa ctctgcacaa
ttccagtaac gcccaccgtg gccctagagt atctcttcct cccaaggaca agccacgaag gccaagacaa accgtcctgc gccctcccag cgagggccac accaacctct acgggaggag cagcgacatc gcctcccgtg gagcaggtgg ccactacacg
tcccaatctt cccaggtaag agcctgcatc cagcacctga ccctcatgat accctgaggt agccgcggga accaggactg cccccatcga atggacagag gtccctacag atgaccaaga gccgtggagt ctggactccg cagcagggga cagaagagcc
ctctctgcag ccagcccagg cagggacagg actcctgggg ctcccggacc caagttcaac ggagcagtac gctgaatggc gaaaaccatc gccggctcgg ggcagccccg accaggtcag gggagagcaa acggctcctt acgtcttctc tctccctgtc
agcccaaatc cctcgccctc ccccagccgg ggaccgtcag cctgaggtca tggtacgtgg aacagcacgt aaggagtaca tccaaagcca cccaccctct agaaccacag cctgacctgc tgggcagccg cttcctctat atgctccgtg cccgggtaaa
ttgtgacaaa cagctcaagg gtgctgacac tcttcctctt catgcgtggt acggcgtgga accgtgtggt agtgcgctgt aaggtgggac gccctgagag gtgtacaccc ctggtcaaag gagaacaact agcaagctca atgcatgagg
1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2150
ccccctgtcc gagtcttgta gtctccaaag cagtggcagt tctgggagtt gaccaagctg tgtcagctat tctgaggggg cagaaaagca ctttattaag cttcttggtc acatgccctg ccatcctgtt ccatctgatg tatcccagag caggagagtg acgctgagca ggcctgagct
ctgcccgtga caccgtaatg ctcctgattc ggatcaggga tatttctgtt gagctgaaac gtgtgactaa tcggatgacg tgcaaagccc gaataggggg tccttgctat tgattatccg tgcttctttc agcagttgaa aggccaaagt tcacagagca aagcagacta cgcccgtcac
cccccggcga gaaacaccta acaaagtttc cagatttcac ctcaaagtac gtattagtgt tggtaatgtc tggccattct tcagaatggc aagctaggaa aattatctgg caaacaacac ctcaggaact atctggaact acagtggaag ggacagcaag cgagaaacac aaagagcttc
gcccgcctcc tttacattgg caaccgattt actcaagatc acatgttcct gtcagggttt actaagctgc ttgcctaaag tgcaaagagc gaaactcaaa gataagcatg acccaagggc gtggctgcac gcctctgttg gtggataacg gacagcacct aaagtctacg aacaggggag
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1085
<210> 4 <211> 1085 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4
gacgtggtga atctcctgca tacctgcaga tctggggtcc agcagagtgg ccgctcacgt cacaagaggg gggatcccgc cattgagttt tccaacaaaa acatcaagat ctgttttctg agaactttgt catctgtctt tgtgcctgct ccctccaatc acagcctcag cctgcgaagt agtgt
tgacccagac gatctagtca agccaggcca cagacaggtt aggctgagga tcggtgctgg actaaagaca aattctaaac actgcaaggt caatttagaa tttaaatacg tctgtcccta tacttaaaca catcttcccg gaataacttc gggtaactcc cagcaccctg cacccatcag
<210> 5 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu14.18 IgG1 Mature Heavy Chain with K322A Mutation <400> 5
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
12
HU 006 991 T2
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Asn Ile Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Lys Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 180 185 190 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser 305 310 315 320 Asn Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 340 345 350
13
HU 006 991 T2
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer for pdHL7-hu14.18 plasmid DNA <400> 6
tacaagtgcg ctgtctccaa c
21
<210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for pdHL7-hu14.18 plasmid DNA <400> 7
tgttggagac agcgcacttg ta
22
<210> 8 <211> 1655 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Sequence encoding the mature fusion protein Human 14.18 sFv (VL¹VH)¹Fc, with introns <400> 8
gacgtggtga atctcctgca tacctgcaga tctggggtcc agcagagtgg ccgctcacgt ggtggcgggt tccggcgccg
tgacccagac gatctagtca agccaggcca cagacaggtt aggctgagga tcggtgctgg ctggtggtgg aggtggagaa
ccccctgtcc gagtcttgta gtctccaaag cagtggcagt tctgggagtt gaccaagctg aggcagcggt gcccggcgcc
ctgcccgtga caccgtaatg ctcctgattc ggatcaggga tatttctgtt gagctgaaat ggtgggggat tccgtgaaga 14
cccccggcga gaaacaccta acaaagtttc cagatttcac ctcaaagtac ccggaggcgg ccgaggtgca tctcctgcaa
gcccgcctcc tttacattgg caaccgattt actcaagatc acatgttcct tgggtcggga gctggtgcag ggcctccggc
60 120 180 240 300 360 420 480
HU 006 991 T2
tcctccttca tggatcggcg cgcgccaccc cgctccgagg acctccgtga tgcccaggta gtagcctgca ctcagcacct caccctcatg agaccctgag aaagccgcgg gcaccaggac agcccccatc acatggacag ctgtccctac agatgaccaa tcgccgtgga tgctggactc ggcagcaggg cgcagaagag
ccggctacaa ccatcgaccc tgaccgtgga acaccgccgt ccgtgtcctc agccagccca tccagggaca gaactcctgg atctcccgga gtcaagttca gaggagcagt tggctgaatg gagaaaacca aggccggctc agggcagccc gaaccaggtc gtgggagagc cgacggctcc gaacgtcttc cctctccctg
catgaactgg ctactacggc caagtccacc gtactactgc cgagcccaaa ggcctcgccc ggccccagcc ggggaccgtc cccctgaggt actggtacgt acaacagcac gcaaggagta tctccaaagc ggcccaccct cgagaaccac agcctgacct aatgggcagc ttcttcctct tcatgctccg tccccgggta
gtgcgccaga ggcacctcct tccaccgcct gtgtccggca tcttgtgaca tccagctcaa gggtgctgac agtcttcctc cacatgcgtg ggacggcgtg gtaccgtgtg caagtgcaag caaaggtggg ctgccctgag aggtgtacac gcctggtcaa cggagaacaa atagcaagct tgatgcatga aatga
acatcggcaa acaaccagaa acatgcacct tggagtactg aaactcacac ggcgggacag acgtccacct ttccccccaa gtggtggacg gaggtgcata gtcagcgtcc gtctccaaca acccgtgggg agtgaccgct cctgccccca aggcttctat ctacaagacc caccgtggac ggctctgcac
gtccctggag gttcaagggc gaagtccctg gggccagggc atgcccaccg gtgccctaga ccatctcttc aacccaagga tgagccacga atgccaagac tcaccgtcct aagccctccc tgcgagggcc gtaccaacct tcccgggagg cccagcgaca acgcctcccg aagagcaggt aaccactaca
<210> 9 <211> 479 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of the Mature Fusion Protein Human 14.18 sFv (VL¹VH)¹Fc <400> 9
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 130 135 140 Val Glu Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly 145 150 155 160 15
540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1655
HU 006 991 T2
Ser Ser Phe Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Asn Ile Gly 165 170 175 Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr 180 185 190 Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys 195 200 205 Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Lys Ser Leu Arg Ser Glu Asp 210 215 220 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 245 250 255 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 260 265 270 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 275 280 285 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 290 295 300 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 305 310 315 320 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 325 330 335 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 340 345 350 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 355 360 365 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 370 375 380 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 385 390 395 400 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 405 410 415 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 420 425 430 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 435 440 445 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 450 455 460 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475
16
1
HU 006 991 T2
2
<210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide linker sequence <400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Immunglobulin polipeptid, amely anti-GD2 ellenanyag variábilis régióját, CL domént és IgG1 immunglobulin olyan Fc¹régióját tartalmazza, amely CH1 domént tartalmaz és K322A mutációt hordoz a komplementfixálás (CDC) csökkentésére vagy eliminálására, ahol az immunglobulin polipeptid nehézlánca tartalmazza a SEQ ID NO: 5 azonosító számú aminosavszekvenciát, és az immunglobulin polipeptid könnyûlánca tartalmazza a SEQ ID NO: 2 azonosító számú aminosavszekvenciát. 2. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, ahol az ellenanyagfüggõ sejtközvetített citotoxicitás (ADCC) megmarad. 3. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, amelynek fokozott az ADCC-aktivitása, és amely a polipeptid YB2/0 sejtekben történõ elõállításával nyerhetõ. 4. DNS-molekula, amely 1–3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódol. 5. Expressziós sejt, amely 4. igénypont szerinti DNS-molekulát tartalmaz.
20
25
30
35
17
6. Az 5. igénypont szerinti sejt, ahol a sejt YB2/0 sejt. 7. Gyógyászati készítmény, amely 1–3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid hatásos mennyiségét tartalmazza, együtt gyógyászatilag elfogadható hordozóval, oldószerrel vagy excipienssel. 8. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid alkalmazása rákterápiában fájdalom csökkentésére szolgáló gyógyszer gyártására. 9. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a rák a neuroblasztóma, glioblasztóma, oszteoszarkóma, melanóma, kissejtes tüdõkarcinóma, B¹sejtes limfóma, vesekarcinóma és retinoblasztóma által alkotott csoportból van kiválasztva. 10. Immunglobulin polipeptid – amely anti-GD2 ellenanyag variábilis régióját, CL domént és IgG1 immunglobulin olyan Fc¹régióját tartalmazza, amely CH1 domént tartalmaz és K322A mutációt hordoz a komplementfixálás (CDC) csökkentésére vagy eliminálására, miközben az ellenanyagfüggõ sejtközvetített citotoxicitás (ADCC) megmarad – alkalmazása rákterápiában fájdalom csökkentésére szolgáló gyógyszer gyártására.
HU 006 991 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
18
HU 006 991 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
19
HU 006 991 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
20
HU 006 991 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
21
HU 006 991 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
22
HU 006 991 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
23
HU 006 991 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
24
HU 006 991 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
25
HU 006 991 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
26
HU 006 991 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
27
HU 006 991 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
