!HU000008148T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 148
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 39/095
(21) Magyar ügyszám: E 06 727568 (22) A bejelentés napja: 2006. 03. 16. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20060727568 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1858551 A2 2006. 09. 21. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1858551 B1 2010. 05. 05.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 0505518 2005. 03. 17.
(73) Jogosult: Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l., 53100 Siena SI (IT)
GB
(72) Feltalálók: CONTORNI, Mario, Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l., I-53100 Siena (IT); MANNUCCI, Donatella, I-53100 Siena (IT) (54)
(2006.01) A61K 39/102 (2006.01) A61K 39/29 (2006.01) A61K 39/295 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06097851 PCT/IB 06/001124
(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Teljes sejtes szamárköhögés-antigént tartalmazó kombinált oltóanyagok
(57) Kivonat
HU 008 148 T2
A találmány tárgya diftéria-toxoidot, tetanusz-toxoidot, sejtes szamárköhögés-antigént, HBsAg¹t, Hib kapszuláris szacharidot, és legalább egy Neisseria meningitidis
kapszuláris szacharidot tartalmazó oltóanyag, melyben a Hib és N. meningitidis szacharidok külön-külön tetanusz-toxoid hordozó fehérjéhez vannak konjugálva.
A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül 4 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 008 148 T2
A találmány mûszaki területe A jelen találmány mûszaki területe a kombinált oltóanyagok, azaz egynél több kórokozó immunogén anyagainak keverékét tartalmazó oltóanyagok területe, ahol az oltóanyag beadása egyidejûleg egynél több kórokozó ellen tudja immunizálni az alanyt. A találmány mûszaki háttere A kombinált oltóanyagok a betegek számára a kevesebb oltás elõnyét kínálják, ami a megnövekedett együttmûködés klinikai elõnyét eredményezi (lásd az 1. hivatkozás 29. fejezetét). Hatféle kórokozó kiemelten fontos, különösen gyermekekben: a Corynebacterium diphtheriae (a diftéria kórokozója), a Clostridium tetani (a tetanusz/merevgörcs kórokozója), a Bordetella pertussis (szamárköhögés), a hepatitis B vírus (’HepB’, vírusos májgyulladás), a b típusú Haemophilus influenzae (’Hib’, a bakteriális agyhártyagyulladás és tüdõgyulladás egyik kórokozója), és a Neisseria meningitidis (a meningococcusos agyhártyagyulladás és szepszis kórokozója). Ezen kórokozók mindegyike ellen ismeretes oltóanyag, és egy ötértékû, a ’D’, ’T’, ’P’, ’HepB’ és ’Hib’ komponensek mindegyikét tartalmazó oltóanyagot a GlaxoSmithKline tart piacon, TRITANRIX¹HepB/Hib név alatt. Ezen ötértékû oltóanyag ’P’ komponense egy teljes sejtes szamárköhögés-antigénen (’Pw’) alapul. Az oltóanyag DTP és HepB komponensei egy kombinált oldatban vannak, egy edényben (ez a négyértékû DTPwHepB kombináció külön is kapható ’TRITANRIX¹HepB’ név alatt), de a Hib komponens fagyasztva szárított, és külön edényben van. A Hib komponenst felhasználáskor a DTPw-HepB oldattal kell feloldani, így jön létre az ötértékû oltóanyag az edényben. A TRITANRIX¹HepB/Hib nem véd a meningococcus-fertõzés ellen. A 2. hivatkozás 3. példája emberi klinikai kísérletek eredményét hozza nyilvánosságra, mely kísérletekben a négyértékû TRITANRIX¹HepB terméket felhasználás elõtt a Hib és meningococcus A és C szerotípusai (’MenA’ és ’MenC’) konjugált kapszuláris szacharidjaival keverték össze. A szerzõk szerint ezen hétértékû keverék jó immunválaszt váltott ki minden egyes antigén ellen, és a gyermekek jól tûrték. A Hib, MenA és MenC komponensek részleteit nem adták meg. Hasonló információt közöltek a 3. és 4. hivatkozásban. A találmány tárgyát képezik javított kombinált oltóanyagok, melyek a Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Bordetella pertussis, hepatitis B vírus, a Haemophilus influenzae b típusa és a Neisseria meningitidis ellen egyidejûleg védenek. A találmány összefoglalása A találmány olyan oltóanyagok tanulmányozásán alapul, melyek D¹T-Pw-HepB-Hib antigéneket tartalmaznak (mint a TRITANRIX- HepB/Hib termék is), és emellett egy vagy több meningococcalis konjugált antigént is tartalmaznak. Ezen oltóanyagok számos továbbfejlesztése és variációja került felfedezésre, és ezek a találmány tárgyai.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
A találmány szerinti oltóanyagok tartalmaznak: (i) valamely diftéria-toxoidot, ’D’; (ii) valamely tetanusz-toxoidot, ’T’; (iii) valamely sejtes szamárköhögés-antigént, ’wP’; (iv) valamely hepatitis B vírus felszíni antigént, ’HBsAg’; (v) valamely b típusú Haemophilus influenzae (’Hib’) kapszuláris szacharidot hordozó fehérjéhez konjugálva; (vi) legalább egy Neisseria meningitidis kapszuláris szacharidot hordozó fehérjéhez konjugálva, ahol a Hib és N. meningitidis szacharidok külön-külön valamely tetanusz-toxoid hordozó fehérjéhez vannak konjugálva. A meningococcalis szacharidok az A, C, W135 és Y szerológiai csoportok egyikébõl vagy több csoportból származhatnak. Az általánosan használt nevezéktan erre a négy szerológiai csoportra mint ’MenA’, ’MenC’, ’MenW135’ és ’MenY’ utal. Itt általában a konjugált antigéneket ’MenA¹X’ stb. stílusban jelöljük, ahol az ’X’ a konjugátum hordozó fehérjéjét jelöli. Az adott hordozó fehérjét tartalmazó konjugátumot azután ’MenA-CRM’ vagy ’MenC¹D’ stb.¹ként jelöljük. Az elõnyös oltóanyagok legalább a C szerológiai csoport ellen tartalmaznak meningococcalis konjugátumot, elõnyösen az A és C szerológiai csoporttal szemben is. Tehát az elõnyös oltóanyagok hatértékûek (D¹T-Pw-HBsAg-Hib-MenC) vagy hétértékûek (D¹TPw-HBsAg-Hib-MenA-MenC). A fentebb felsorolt (i)…(vi) antigének mellett további antigének szintén jelen lehetnek pl. 8 értékû, 9 értékû, 10 értékû stb. oltóanyagot eredményezve. A találmány szerinti oltóanyagokat a gyártás során folyékony formában is elõ lehet állítani (ahol valamennyi antigén vizes oldatban vagy szuszpenzióban van), vagy a felhasználáskor két komponens összekeverésével is elõállíthatók: (a) a D, T, wP és HBsAg antigéneket tartalmazó elsõ komponens; és (b) a Hib és meningococcalis konjugátumokat tartalmazó második komponens összekeverésével. A két komponens elõnyösen külön tartályban van (például ampullákban vagy fecskendõkben), és a találmány tárgya olyan kit, mely az (a) és (b) komponensekbõl áll. Az elsõ tartály tartalma elõnyösen vizes, a második tartály tartalma elõnyösen liofilizált, ily módon a találmány szerinti oltóanyagokat a liofilizált komponensnek a vizes D¹T-wPHBsAg komponenssel történõ feloldásával lehet elõállítani.
(1) A Hib-konjugátum tömegaránya Hib-konjugátumok jól ismertek, de különbözõ formákban érhetõek el. Példának okáért az 1. hivatkozás 14–7. sz. táblázata négy különbözõ Hib-konjugátum jellemzõit adja meg. Ez a táblázat azt jelzi, hogy a sza55 charid:hordozó tömegaránya 1,4:1-tõl (a ’PRP¹D’, fölös szacharidot tartalmazó konjugátum esetében) 0,06:1¹ig terjed (a ’PRP-OMP’, fölös fehérjét tartalmazó konjugátum esetében). Mindezen konjugátumokat használják kombinált oltóanyagokban, de a találmány egyik tárgya 60 szerint egy meghatározott tömegarány került kiválasz50
2
1
HU 008 148 T2
tásra a meningokokkális konjugátumokat tartalmazó kombinált oltóanyagok esetében. A Hib-konjugátumban a hordozó fehérjének a szacharidhoz mért tömegaránya az irodalom szerint fontos szerepet játszik a kombinált oltóanyag hatékonyságában. Az 5. hivatkozás szerint azon kombinált oltóanyagokban, ahol a hordozó fehérje egyben antigénként is jelen van (példának okáért, ahol a tetanusz-toxoid hordozóként és antigénként is alkalmazásra kerül, mint a jelen találmányban is), a Hib-konjugátumban a szacharid:hordozó tömegaránynak 1:0,3 és 1:2 között kell lennie. Ezzel szemben a jelen találmány szerint a szacharid:hordozó tömegarány ezen tartományon kívül is lehet, és 1:2 és 1:4 között van. Ebben a tartományban a Hib-konjugátumok kiváló immunogenitást mutatnak, ha meningococcalis konjugátumokkal vannak kombinálva gyermekeknek szánt oltóanyagokban, és nem mutatnak semmilyen hátrányos immunológiai kölcsönhatást még akkor sem, ha a hordozó fehérje egyben szabad antigénként is jelen van (például amikor a hordozó fehérje tetanusz-toxoid vagy diftéria-toxoid). A fölös hordozó fehérje hozzájárul a tetanusz vagy a diftéria elleni immunitás kialakulásához. A Hib-konjugátum a hordozó fehérje tömegfeleslegét tartalmazza. A tömegarány 2:1 és 4:1 között van, elõnyösen 2,5:1 és 3,5:1 között. 2,8:1 és 3,2:1 közötti tömegarány szintén alkalmazható, és 3:1 körüli tömegarány elõnyös. A jellemzõ 10 mg¹os (szacharidra vonatkoztatott) dózis esetében ennek megfelelõen, a találmány szerinti készítmény 20–40 mg közötti hordozót fog tartalmazni, elõnyösen mintegy 30 mg¹ot. Ez az arány éles ellentétben áll az 5. hivatkozás által tanított aránnyal. A Hib-konjugátum számára a hordozó fehérje a tetanusz-toxoid, így 10 mg Hib szacharidra vonatkoztatva a készítmény 20–40 mg tetanusz-toxoidot fog tartalmazni a Hib-konjugátum részeként, valamint további tetanusz-toxoidot is a C. tetani-fertõzés ellen védõ ’T’ antigénként. Elõnyös készítmények és eljárások a C szerológiai csoportból származó meningococcalis konjugátumokat alkalmaznak. Még elõnyösebb készítmények és eljárások külön meningococcalis konjugátumokat alkalmaznak az A és C szerológiai csoportokból. Ezek tetanusztoxoid hordozóhoz vannak konjugálva. (2) A hordozó/szacharid kötés a Hibkonjugátumban Amint azt az 1. hivatkozás 14–7. táblázata mutatja, különféle kötési módok használatosak Hib-konjugátumok elõállítására. Egyes konjugátumok a szacharid aktiválása útján kerülnek elõállításra, mások a hordozó aktiválásával, megint mások mindkettõ aktiválásával. A szacharidok aktiválására perjodát és ciano-borohidrát kerül alkalmazásra a ’HbOC’ termék esetében; ADH, CNB és karbodiimid-HCl a ’PRP¹T’ termék esetében. Ezen konjugátumok mindegyikét használták vagy használják is kombinált oltóanyagokban, de a találmány egyik vonatkozása szerint egy meghatározott kö-
2
tésfajta került kiválasztásra meningococcalis konjugátumokat tartalmazó kombinált oltóanyagok esetében. A jelen találmány szerint a poliszacharidot elõször bróm-ciánnal lehet aktiválni, majd valamely adipinsav 5 linkerhez lehet kötni, és ezen linker-szacharid egység kerül azután reagáltatásra valamely hordozó fehérjével, különösen valamely tetanusz-toxoid hordozó fehérjével. Az elsõ lépés a Hib-szacharid valamely szabad 10 –OH csoportjának cianidálása, amit a következõ ábra illusztrál:
15
A reakciót bróm-cián (CNBr) alkalmazásával lehet végrehajtani. Röviden, a CNBr reagáltatásra kerül a 20 szachariddal bázisos körülmények között (jellemzõen pH 10 és 12 között). Ezen a magas pH¹n cianát-észterek képzõdnek a szacharid hidroxilcsoportjaival. A magas pH ionizálja a hidroxilcsoportokat, ami lehetõvé teszi a hidroxilcsoportok nukleofil támadását a cianátio25 non. A magas pH miatt különféle mellékreakciók léphetnek fel, de csak a cianát-észter-képzõdés képezi a találmány tárgyát. A cianát-észter valamely bifunkciós (heterobifunkciós vagy elõnyösen homobifunkciós) reagenssel kerül 30 reagáltatásra távtartó (spacer) kapcsolása céljából. A találmány szerit valamely adipin-hidrazid távtartót lehet alkalmazni. Ezt kényelmesen el lehet érni adipinsav-dihidrazid (AADH) alkalmazásával: 35
40
Az AADH valamely cianát-észterrel végbemenõ reakciójának mechanizmusa (imido-karbamát kötés képzõdése) a következõképpen illusztrálható:
45
50
Az aktivált szacharid ezután reagáltatásra kerül valamely tetanusz-toxoid hordozóval, EDAC (1¹etil-355 (3¹dimetil-amino-propil)-karbodiimid) jelenlétében:
60 3
1
HU 008 148 T2
Az EDAC jellemzõen hidrokloridsó formájában kerül alkalmazásra: (CH3)2N(CH2)3-N=C=N–CH2CH3.HCl Az EDAC lehetõvé teszi, hogy az adipinsav linker szabad végén a karboxilcsoport reagáljon a hordozó fehérjével (jellemzõen valamely aminosav-oldalláncon a szabad –SH, –NH2 vagy –OH csoportokkal), miáltal egy konjugátum keletkezik, amit a következõ ábra illusztrál, ahol az –X– lehet –S–, –O– vagy –NH–, minden esetben a hordozó fehérjébõl:
2
A közvetlen kötés a következõképpen illusztrálható:
5
10
és a reakció konjugált terméke a következõképpen illusztrálható:
15 Vizes körülmények között a C=NH átalakulhat C=O csoporttá, karbamátot képezve:
Vizes körülmények között a C=NH átalakulhat C=O csoporttá, karbamátot képezve: 20
A Hib-konjugátum esetében a hordozó fehérje a tetanusz-toxoid. Elõnyös készítmények és eljárások a C szerológiai csoportból származó meningococcalis konjugátumokat alkalmaznak. Még elõnyösebb készítmények és eljárások külön meningococcalis konjugátumokat alkalmaznak az A és C szerológiai csoportokból. (3) Közvetlen hordozó-szacharid kötés a meningococcalis konjugátumokban A fent leírt Hib-konjugátum távtartóval van a hordozó fehérjéhez kapcsolva. Ezzel szemben a meningococcalis konjugátumok esetében elõnyös közvetlen kapcsolást alkalmazni. A közvetlen kapcsolás különösen alkalmasnak bizonyult a meningococcalis konjugátumok esetében, különösen, ahol D fehérje kerül alkalmazásra hordozóként, és ahol a Hib-konjugátum nem alkalmaz közvetlen kötést (elkerülendõ, hogy a linker elérhessen egy olyan koncentrációt, ahol már immunogénné válhat). Közvetlen kötés esetén a meningococcalis szacharid –OH csoportja elõször cianidálásra kerül (például a fentebb leírtak szerint), cianát-észtert eredményezve. Az –OCN csoport ezután közvetlen kötésre kerül a hordozó valamely oldalláncához, így valamely szabad –NH2 csoporthoz, szabad –SH csoporthoz vagy szabad –OH csoporthoz. Elõnyös valamely lizin oldallánc szabad –NH2 csoportjához való kötés.
25 A bróm-cián cianidálóágensként történõ alkalmazása helyett a cianidálási reakció elõnyösen valamely szerves cianidálóágens alkalmazásával érhetõ el, így 1¹ciano-4-(dimetil-amino)-piridinium-reagenssel 30 (CDAP). A szerves cianidálóreagens a következõk alkotta csoportból kerülhet kiválasztásra: 1¹ciano-4(dimetil-amino)-piridinium-tetrafluoro-borát, p¹nitro-fenilcianát (pNPC), és N¹ciano-trietil-ammónium-tetrafluoroborát (CTEA). Ezen reagensek alkalmazásával az akti35 váló reakciót semleges pH¹n lehet végrehajtani, ami segít a poliszacharid stabilitásának és integritásának megõrzésében; különösen segít az –OAc csoportok megõrzésében (lásd alább). Elõnyös eljárásokban a cianidálóreagens pH=6–8 között kerül alkalmazásra, nem nuk40 leofil pufferben (pl. sóoldat, HEPES, foszfát, víz és egyes szerves oldószerek [6]). A CDAP acetonitrilben oldható és a vizes szacharidoldathoz adható. A konjugálás után a reakció glicin hozzáadásával állítható le, ami az el nem reagált cianátcsoportokat lefogja. 45 (4) A C szerológiai csoportba tartozó konjugátum O¹acetiláltsága A C szerológiai csoportba tartozó meningococcalis kapszuláris szacharid a sziálsav (N¹acetil-neuramin50 sav) a2®9-kötésû homopolimerje, mely jellemzõen a C7 vagy C8 pozíción tartalmaz O¹acetil (OAc)-csoportokat:
R=–H vagy –COCH2 ®9)-Neu p NAc 7/8 OAc-(a2® 4
1
HU 008 148 T2
Egyes MenC törzsek (az invazív izolátumok ~12%¹a) olyan poliszacharidot termel, melybõl hiányzik ez az OAc csoport. Az OAc csoportok jelenléte vagy hiánya egyedi epitópokat eredményez, és a szacharidhoz kötõdõ ellenanyag specificitása befolyásolja baktériumölõ aktivitását az O¹acetilált (OAc–) és dez-O-acetilált (OAc+) törzsekre nézve [7–9]. Az engedélyezett MenC konjugált oltóanyagok között mind OAc– (NeisVac¹C™), mind OAc+ (Menjugate™ és Meningitec™) szacharidok megtalálhatók. A találmány szerint akár OAc+, akár OAc– törzsek alkalmazhatók. Ahol a C szerológiai csoportba tartozó konjugátum sziálsavmaradékainak legalább 50%¹a O¹acetilált, a minimális százalék magasabb lehet, például 60%, 70%, 80%, 90% vagy több. A C szerológiai csoportba tartozó konjugátum termeléséhez elõnyös törzsek az OAc+ törzsek, elõnyösen a 16¹os szerotípusba tartozók, elõnyösen a P1.7a,1 szerológiai altípusba tartozók. Így elõnyösek a C:16:P1.7a,1 OAc+ törzsek. (5) Az A szerológiai csoportba tartozó konjugátum O¹acetiláltsága Az A szerológiai csoportba tartozó meningococcalis kapszuláris szacharid az N¹acetil-mannózamin-foszfát a1®6 kötésû homopolimerje, részleges O¹acetilálással a C¹3 és C¹4 pozíciókon:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
R=–H vagy –COCH3 Az acetilálás a C¹3 pozíción akár 70–95%¹os is lehet. A szacharid tisztításakor alkalmazott körülmények dez-O-acetiláláshoz vezethetnek (pl. lúgos körülmé-
2
nyek között), de a találmány az OAc megtartását célozza. Ahol az A szerológiai csoportba tartozó konjugátum mannózamin-maradékainak legalább 50%¹a O¹acetilált, a minimális százalék magasabb lehet, például 60%, 70%, 80%, 90% vagy több. (6) A konjugátum dozírozása A Hib-konjugátum antigének elõállítása nem olcsó, és számos stratégia került kidolgozásra az alkalmazás gazdaságossá tételére [10–12]. Ezek egyike, hogy két dózisban adják a konjugátumokat, a standard 10 mg/dózis alatti dózisokban (jellemzõen tört adagokban, pl. 1/2, 1/3, 1/4 stb.) [10,12]. A 12. hivatkozásban példának okáért a Hib-konjugátumokat 5 mg/dózis vagy 3,33 mg/dózis mennyiségben adagolták, azaz a normál dózis 1/2 vagy 1/3 részeként. Ugyanezen megközelítés a DTP-Hib oltóanyagokban lévõ Hib-konjugátumokra is ki lett terjesztve. Példának okáért a 13. hivatkozás összehasonlítja a teljes dózisú, felezett és harmadolt dózisú, a DTwP oltóanyaggal kombinált Hib-konjugátumokat és, habár a kombinált DTP-Hib oltóanyagot kapott betegekben az anti-PRP ellenanyagok koncentrációjának mértani közepe csökkent a DTP és a Hib külön-külön történõ alkalmazásához képest, minden esetben elfogadható anti-Hib immunválaszokat lehetett látni. A 14. hivatkozás 10¹szer hígított Hib-konjugátum adagolását alkalmazza oly módon, hogy egyetlen Hib dózist tízszeres dózisú DTwP-vel old fel. A 2. hivatkozás leírja a liofilizált Hib-konjugátum feloldását teljes dózissá, felezett és negyedelt dózissá, a TRITANRIX™ DTwP-HBsAg oltóanyag alkalmazásával. Hasonló dozírozási tanulmányok láttak napvilágot a kombinált oltóanyagokban található meningococcalis konjugátumokra vonatkozóan is. A találmány szerinti kombinált oltóanyagok esetében 8 mg és 12 mg (szacharidként mért) Hib és meningococcalis konjugátumok kerültek kiválasztásra. Ez a mennyiség jelen lehet egy dózisegységben, vagy az oltóanyag egy milliliterjében. Elõnyös oltóanyagokban a szachariddózis 8 mg és 12 mg (milliliterenként vagy egy dózisegységben) a Hib, MenA és MenC konjugátumok mindegyikére vonatkoztatva.
(7) A találmány szerinti oltóanyagok elõállítására szolgáló, beadás elõtti eljárások Amint azt fentebb említettük, a találmány szerinti ol50 tóanyagokat a felhasználás elõtt közvetlenül elõ lehet állítani két komponens: (a) a D, T, wP és HBsAg antigéneket tartalmazó elsõ komponens; és (b) a Hib konjugátumot és legalább egy meningococcalis konjugátumot tartalmazó második komponens összekeverésé55 vel. A két komponens elõnyösen külön csomagolásban van, ennek megfelelõen a találmány tárgya egy kit, mely tartalmazza: (a) a D, T, wP és HBsAg antigéneket tartalmazó elsõ komponenst; és (b) a Hib konjugátumot és legalább egy meningococcalis konjugátumot teta60 nusz-toxoid hordozón tartalmazó második kompo5
1
HU 008 148 T2
nenst. Ez a megközelítés megelõzi a konjugátumok depolimerizálódását, ami vizes tárolási körülmények között felléphet, és ami jelentõs probléma a Hib és MenA konjugátumok esetében, különösen, ha kombinálva vannak. Az (a) és (b) komponensek külön vannak csomagolva, pl. két külön edényben. Az elsõ (a D¹T-wPHBsAg¹t tartalmazó) edény tartalma elõnyösen vizes, a második (a konjugátumokat tartalmazó) edény tartalma elõnyösen liofilizált, ily módon a találmány szerinti oltóanyagokat a liofilizált komponensnek a vizes komponenssel történõ feloldásával lehet elõkészíteni. Tehát a találmány tárgya eljárás a találmány szerinti oltóanyagkészítmény elõkészítésére, mely eljárás a következõ lépéseket tartalmazza: (a) a D, T, wP és HBsAg antigéneket tartalmazó elsõ komponens elõállítása; és (b) a Hib konjugátumot és legalább egy meningococcalis konjugátumot, tetanusz-toxoid hordozón liofilizált formában tartalmazó második komponens elõállítása, és (c) az elsõ és második komponens összekeverése az oltóanyag elõállítása céljából. A keverési lépés jellemzõen az alkalmazást közvetlenül megelõzõen történik. A találmány tárgyát képezi hasonlóképpen egy eljárás a találmány szerinti kit elõállítására, mely eljárás a következõ lépéseket tartalmazza: (a) a D, T, wP és HBsAg antigéneket tartalmazó elsõ komponens beszerzése vagy elõállítása; (b) a Hib konjugátumot és legalább egy meningococcalis konjugátumot, tetanusztoxoid hordozón tartalmazó második komponens beszerzése vagy elõállítása; és (c) a két komponens kombinálása kit formájában. A kit elsõ komponense elõnyösen valamely DTPw komponensnek valamely HBsAg komponenssel történõ keverésével kerül elõállításra. A kit második komponense elõnyösen valamely trivalens konjugátum, mely a következõket tartalmazza: (1) a Haemophilus influenzae kapszuláris szacharidja, tetanusz-toxoidhoz konjugálva; (2) az A szerológiai csoportba tartozó Neisseria meningitidis kapszuláris szacharidja, tetanusz-toxoidhoz konjugálva; és (3) a C szerológiai csoportba tartozó Neisseria meningitidis kapszuláris szacharidja, tetanusz-toxoidhoz konjugálva. (8) A találmány szerinti oltóanyagok elõkészítésére szolgáló eljárások A találmány szerinti elõnyös hétértékû oltóanyagok tartalmazzák a hét antigénkomponenst: D, T, Pw, HBsAg, Hib¹X, MenA¹X és MenC¹X. Bár ezeket elvben bármilyen sorrendben össze lehet keverni, különösen elõnyös, amint az fentebb le van írva, egy elsõ komponens elõállítása (a D, T, Pw és HBsAg antigénekkel), és egy második komponens elõállítása (a Hib, MenA és MenC konjugátumokkal), és ezen két komponens kombinálása a felhasználáskor. Elõnyös továbbá, ha a D¹T-Pw-HBsAg komponens a D¹T¹Pw komponensnek a HBsAg komponenssel történõ keverésével kerül elõállításra. A keverése ezen sorrendje (ti. a HBsAg hozzáadása egy már meglévõ DTFw keverékhez, nem pedig a HBsAg hozzáadása a D, T vagy Pw antigének bármelyike elõtt) különösen al-
5
10
15
20
25
30
35
40
2
kalmasnak bizonyult kombinált oltóanyagok elõállítására, különösen, ahol az oltóanyag egyedi komponensei alumíniumsókra vannak adszorbeálva. Ez a sorrend különbözik a 15. hivatkozásban nyilvánosságra hozott sorrendtõl, ahol elõször egy D¹T-HBsAg keveréket állítanak elõ, amihez azután adják hozzá a Pw törzsoldatot. Szintén eltér a 16. hivatkozásban található keverési sorrendtõl, ahol egy Pw¹HBsAg keveréket kombináltak egy D¹T keverékkel. A háromértékû D¹T¹Pw komponens elõnyösen tartalmaz valamely alumínium-foszfát adjuvánst és/vagy valamely alumínium-hidroxid adjuvánst. Legelõnyösebben alumínium-foszfát adjuvánst és alumínium-hidroxid adjuvánst egyaránt tartalmaz. Az egyértékû HBsAg komponens elõnyösen valamely alumínium-foszfát adjuvánsra van adszorbeálva [17]. A D és T toxoidok elõnyösen valamely alumíniumhidroxid adjuvánsra vannak adszorbeálva. Az összekevert konjugátum komponensek elõnyösen Hib és MenA, Hib és MenC vagy Hib és MenA és MenC konjugátumokat tartalmaznak. Eltérõen az olyan oltóanyagoktól, mint az INFANRIX HEXA™, elõnyös, ha a konjugátum komponensben a három konjugátumból egy sincs alumíniumsóra adszorbeálva [2], még elõnyösebb, ha a konjugátum komponens nem is tartalmaz alumíniumsót. Legelõnyösebben a konjugátum komponensek nem adjuváltak. Tartalmazhatnak azonban cukrokat, így laktózt és/vagy szukrózt. A négyértékû D¹T-Pw-HBsAg komponens elõnyösen vizes formában van, és a háromértékû konjugátum komponens elõnyösen liofilizált formában, valamely vizes D¹T-Pw-HBsAg komponenssel a (c) lépésben történõ feloldás céljából. A négyértékû D¹T-Pw-HBsAg komponens elõállításához a D¹T¹Pw és a HBsAg komponensek elõnyösen vizes formában vannak összekeverésükkor. A háromértékû konjugátum komponens elõállításához a három konjugátumot bármilyen sorrendben össze lehet keverni, pl. mindhármat egyszerre adagolva, vagy kettõt összekeverve (pl. MenA+MenC, MenA+Hib, MenC+Hib) és azután hozzáadva a harmadikat.
(9) Alumínium adjuvánsok Az antigének mellett a találmány szerinti oltóanyagok jellemzõen legalább egy alumíniumsó adjuvánst is tartalmaznak. Az oltóanyagok tartalmazhatnak alumínium-hidroxid és alumínium-foszfát adjuvánsokat. A HBsAg elõnyösen valamely alumínium-foszfát adju50 vánsra van adszorbeálva. A D és T toxoidok elõnyösen valamely alumínium-hidroxid adjuvánsra vannak adszorbeálva. A DTPw elõnyösen mind alumínium-hidroxidot, mind alumínium-foszfátot tartalmaz. Elõnyösen a konjugátumok egyike sincs alumí55 niumsóra adszorbeálva. 45
(10) A meningococcalis konjugátumok hordozószacharid kötése távtartó alkalmazásával A fentebb leírt Hib-konjugátum távtartóval van a 60 hordozó fehérjéhez kapcsolva. Távtartókat a meningo6
1
HU 008 148 T2
coccalis konjugátumokban is lehet alkalmazni, de a közvetlen kötés elõnyös (lásd fent). Ahol távtartók kerülnek alkalmazásra a cianidálással kombinálva, az általános eljárás a cianát-észter elõállítása a fentebb leírtak szerint. Az észter azután aktiválásra kerül a bifunkciós linker (elõnyösen valamely homobifunkcionális linker) egyik funkciós csoportjával történõ reakcióban, szabadon hagyva a másik funkciós csoportot a hordozóhoz történõ kötéshez. Bármely alkalmas bifunkcionális linker alkalmazható, feltéve, hogy rendelkezik egy funkcionális csoporttal a cianidált meningococcalis szacharid kovalens kötéséhez, és egy funkcionális csoporttal a hordozóhoz való kapcsolódáshoz. A két funkciós csoport lehet azonos (homobifunkcionális linker) vagy lehetnek különbözõek (heterobifunkcionális linker) azon csoportoktól függõen, melyekhez a kötés kívánatos. (11) Eljárás valamely konzerválószer hozzáadására Az oltóanyagok jellemzõen tartalmaznak konzerválószereket a veszélyes mikrobiális növekedés megelõzése céljából. Valamely kombinált oltóanyag esetében, mely különféle komponensek összekeverésével jön létre, a szakembernek el kell döntenie, mikor és hol alkalmaz konzerválószert. A találmány szerint a különféle komponensek különféle konzerválószereket tartalmaznak. A higanytartalmú konzerválószer lehet tiomerzál (más néven timerozál vagy mertiolát) vagy timerfonát. Az összekevert konjugátum komponensek (és a második kit komponensei) tartalmazhatják vagy nem a konzerválószert. Elõnyösen nem tartalmaznak konzerválószert. Az egyértékû HBsAg komponens tartalmazhatja vagy nem a konzerválószert. Ha valamely higanytartalmú konzerválószer került alkalmazásra, a tisztított HBsAg¹t dialízisnek lehet alávetni (pl. ciszteinnel), mielõtt a kombinált oltóanyag elõállítására alkalmazásra kerülne [18]. Az összekevert konjugátum komponens elõnyösen tartalmaz valamely Hib-konjugátumot, valamely MenA konjugátumot és valamely MenC konjugátumot. (12) Szennyezések eltávolítása a konjugátumokból A kötési kémia nem mindig pontos vagy sztöchiometrikus, és melléktermékeket eredményezhet, melyek nemkívánatosak a végsõ oltóanyag termékben. A találmány tárgyát képezik eljárások ezen melléktermékek mérésére és/vagy eltávolítására valamely kevert konjugátum komponens elõállításakor. Ezen komponens alkalmazható a találmány szerinti oltóanyagok elõállítására, vagy a találmány szerinti kitek komponenseiként. Az EDAC, 1¹etil-3-(3¹dimetil-amino-propil)-karbodiimid, egy vízoldható karbodiimid, mely karboxilsavakat és elsõdleges aminokat tartalmazó biológiai anyagok keresztkötésére van használatban (lásd fentebb). Jellemzõen sósavas sója formájában kerül alkalmazásra.
2
Az EDU, N¹etil-N’-(3¹dimetil-amino-propil)-urea, az EDAC-kötés egy mellékterméke:
5
Az EDU és a fölös EDAC eltávolíthatók a konjugá10 lási reakció után híg savas vagy vizes mosással [19]. Az 1¹ciano-4-(dimetil-amino)-piridinium-csoport a CDAP-reagensek közé tartozik, melyeket cianidálóreagensként alkalmaznak. Elõnyösen tetrafluoro-borátsóként kerülnek alkalmazásra: 15
20
A ’DMAP’ egy 4¹dimetil-amino-piridin, a CDAP-cianidálás egy reakcióterméke:
25
A DMAP eltávolítható gélszûréssel, gélpermeációs kromatográfiával stb. Valamely gélpermeációs kroma30 tográfiás oszlop alkalmazható a konjugátumok, az el nem reagált hordozó, az el nem reagált szacharid, az el nem reagált CDAP, az el nem reagált glicin és DMAP eltávolítására egy menetben, tisztított konjugátumot eredményezve. A konjugálási reakciók alkalmazhatnak linkereket 35 stb., a fent leírtak szerint (pl. valamely adipin-hidrazid távtartó alkalmazása a Hib¹T elõállítására). Az EDAC/EDU eljárás különösen alkalmas, ahol tetanusz-toxoid a hordozó fehérje. A CDAP/DMAP eljárás 40 különösen alkalmas, ahol D fehérje a hordozó fehérje.
45
50
55
60 7
(14) A diftéria-toxoid A diftériát a Corynebacterium diphteriae okozza, egy Gram-pozitív, nem spórás aerob baktérium. Ez a szervezet egy profág által kódolt ADP-riboziláló exotoxint expresszál (diftéria toxin), ami kezelés (pl. formalin vagy formaldehid alkalmazásával) egy toxoidot eredményez, ami már nem toxikus, de antigénhatású marad, és továbbra is képes specifikus antitoxin ellenanyagok termelését kiváltani beinjekciózás után. A diftéria-toxoidokat részletesebben az 1. hivatkozás 13. fejezete ismerteti. Elõnyös diftéria-toxoidok a formaldehid-kezeléssel elõállítottak. A diftéria-toxoid úgy állítható elõ, hogy C. diphteriae baktériumot tápközegben tenyésztenek (pl. Fenton tápközegben, vagy Linggoud és Fenton-féle tápközegben), ami szarvasmarha-kivonattal lehet kiegészítve, amit formaldehides kezelés, ultraszûrés és kicsapás követ. A toxoidált anyagot azután sterilre szûrést és/vagy dialízist tartalmazó eljárással kezelhetik.
1
HU 008 148 T2
A diftéria-toxoid elõnyösen valamely alumíniumhidroxid adjuvánsra van adszorbeálva. A diftéria-toxoid komponens elõnyösen lényegében mentes bármely higanyos konzerválószertõl. A diftéria-toxoid mennyiségét nemzetközi egységekben lehet kifejezni (IU). Példának okáért az NIBSC szállítja az ’Adszorbeált diftéria-toxoid 3. nemzetközi standard 1999’ készítményt [20,21], amely 160 IU¹t tartalmaz ampullánként. Az IU rendszer alternatívájaként az ’Lf’ egység („flokkulálóegység” vagy „flokkuláló határérték dózis”) definíciója szerint a toxoid azon mennyisége, mely egy nemzetközi egységnyi antitoxinnal keverve optimálisan flokkulálókeveréket alkot [22]. Példának okáért az NIBSC szállítja a ’Diftéria-toxoid, egyszerû’ [23] készítményt, mely 300 LF¹et tartalmaz ampullánként, valamint szállítja az ’Elsõ nemzetközi, flokkulációs teszthez való diftéria-toxoid reagens’¹t [24], mely 900 LF¹et tartalmaz ampullánként. Amikor szarvasmarhából származó anyagokat alkalmaznak a C. diphteriae tenyésztéséhez, ezeket olyan forrásból kell beszerezni, melyek mentesek a szarvasmarha szivacsos agyvelõgyulladástól (BSE) és más átvihetõ szivacsos agyvelõgyulladásoktól (TSE¹k). A diftéria-toxoid és a tetanusz-toxoid aránya a találmány szerinti oltóanyagokban általában 2:1 és 3:1 (Lf egységekben mérve) között van, elõnyösen 2,4:1 és 2,6:1 között, még elõnyösebben 2,5:1. A találmány szerinti oltóanyagokban a diftéria-toxoid mennyisége jellemzõen legalább 30 IU/dózis.
nal keverve optimálisan flokkulálókeveréket alkot [22]. Példának okáért az NIBSC szállítja az ’Elsõ nemzetközi, flokkulációs teszthez való tetanusz-toxoid reagens’¹t [27], mely 1000 LF¹et tartalmaz ampullánként. Amikor szarvasmarhából származó anyagokat al5 kalmaznak a C. tetani tenyésztéséhez, ezeket olyan forrásból kell beszerezni, melyek mentesek a szarvasmarha szivacsos agyvelõgyulladástól (BSE) és más átvihetõ szivacsos agyvelõgyulladásoktól (TSE¹k). A tetanusz-toxoid és a diftéria-toxoid aránya a talál10 mány szerinti oltóanyagokban általában 1:2 és 1:3 (Lf egységekben mérve) között van, elõnyösen 1:2,4 és 1:2,6 között, még elõnyösebben 1:2,5. A találmány szerinti oltóanyagokban a diftéria-to15 xoid mennyisége jellemzõen legalább 60 IU/dózis.
20
25
30 (15) A tetanusz-toxoid A tetanuszt a Clostridium tetani okozza, egy Grampozitív, spórás bacillus. Ezen élõlény egy endopeptidázt (tetanusz-toxin) expresszál, ami kezelhetõ úgy, hogy toxoidot eredményezzen, ami már nem toxikus, de antigénhatású marad, és továbbra is képes specifikus antitoxin ellenanyagok termelését kiváltani beinjekciózás után. A tetanusz-toxoidokat részletesebben az 1. hivatkozás 27. fejezete ismerteti. Elõnyös tetanusztoxoidok a formaldehid-kezeléssel elõállítottak. A tetanusz-toxoid úgy állítható elõ, hogy C. tetani baktériumot tápközegben tenyésztenek (pl. Latham-féle, szarvasmarha-kazeinbõl származó tápközegben), amit formaldehides kezelés, ultraszûrés és kicsapás követ. Az anyagot azután sterilre szûrést és/vagy dialízist tartalmazó eljárással kezelhetik. A tetanusz-toxoid adszorbeálható valamely alumínium-hidroxid adjuvánsra, de ez nem szükséges (pl. a teljes tetanusz-toxoid 0–10% közötti részének adszorbeálása alkalmazható). Elõnyösen a tetanusz-toxoid komponens lényegében mentes bármely higanyos konzerválószertõl. A tetanusz-toxoid mennyiségét nemzetközi egységekben lehet kifejezni (IU). Példának okáért az NIBSC szállítja az ’Adszorbeált tetanusz-toxoid 3. nemzetközi standard 2000’ készítményt [25, 26], amely 469 IU¹t tartalmaz ampullánként. Az IU rendszer alternatívájaként az ’Lf’ egység („flokkulálóegység” vagy „flokkuláló határérték dózis”) definícója szerint a toxoid azon mennyisége, mely egy nemzetközi egységnyi antitoxin-
2
35
40
(16) A sejtes szamárköhögés-antigén Az oltóanyagokban a szamárköhögés-antigének sejtesek (teljes sejtesek) vagy nem sejtesek. A találmány sejtes szamárköhögés antigéneket alkalmaz, inaktivált B. pertussis sejtek formájában. A sejtes szamárköhögés antigének elõállítása jól dokumentált [ld. pl. az 1. hivatkozás 21. fejezetét], példának okáért a B. pertussis I. fázisú tenyészetének hõinaktiválásával lehet antigént nyerni. A sejtes szamárköhögés antigént valamely alumínium-foszfát adjuvánsra lehet adszorbeálni vagy azzal összekeverni. A wP antigének mennyiségét nemzetközi egységekben (IU) lehet kifejezni. Példának okáért az NIBSC szállítja a ’Szamárköhögés Oltóanyag: Harmadik Nemzetközi Standard’ nevû készítményt [28], mely 46 lU¹t tartalmaz ampullánként. Minden egyes ampulla egy vizes oldat 2,0 ml¹jének fagyasztva szárított maradékát tartalmazza, a vizes oldat 10 liter bakteriális szuszpenzió (mely az amerikai opacitási szabvány 180 egységének felel meg) nyolc liter pH=7,0, M/15 Sorensen-féle pufferral történt hígításával keletkezett. Az IU rendszer alternatívájaként az ’OU’ egység („opacity units”) szintén használatos (pl. 4 OU lehet kb. 1 IU). A találmány szerinti oltóanyagokban a wP antigén mennyisége jellemzõen legalább 4 IU/dózis.
(17) A hepatitis B felszíni antigén A hepatitis B vírus (HBV) egyike az ismert kórokozóknak, melyek vírusos májgyulladást okoznak. A HBV virion egy belsõ magból áll, melyet egy külsõ fehérjeköpeny vagy kapszid vesz körül. A vírusmag tartalmazza a DNS-genomot. A kapszid fõbb komponensei a HBV 50 felszíni antigén néven vagy még gyakrabban ’HBsAg’ néven ismert fehérje, mely 226 aminosavból áll, a molekulatömege ~24 kDa. Valamennyi létezõ hepatitis B oltóanyag tartalmaz HBsAg¹t, és amikor ezen antigén beadásra kerül, anti-HBsAg ellenanyagok termelõdé55 sét váltja ki, melyek védenek a HBV-fertõzés ellen. Az oltóanyag termeléséhez a HBsAg két módon állítható elõ. Az elsõ eljárás tartalmazza az antigén tisztítását részecske formájában, krónikus hepatitis B¹hordozók plazmájából, minthogy HBV-fertõzés alatt a máj60 ban nagy mennyiségû antigén szintetizálódik és szaba45
8
1
HU 008 148 T2
dul fel a véráramba. A másik eljárás a fehérje expresszióját tartalmazza rekombináns DNS-módszerek segítségével. A találmány szerinti eljáráshoz a HBsAg bármelyik eljárással elõállítható, de elõnyös a rekombinánsan expresszált HBsAg alkalmazása. Különösen elõnyös a HBsAg expresszióval történõ elõállítása élesztõben, így Saccharomycesben (mint az S. cerevisiae) vagy valamely Hanensulában (mint a H. polymorpha). Az élesztõben expresszált HBsAg általában nem lesz glikozilálva. A HBsAg általában lényegében gömb alakú részecskék formájában van (átlagos átmérõ kb. 20 nm), a foszfolipidtartalmú lipid mátrixszal együtt. Az élesztõben expresszált HBsAg részecskék tartalmazhatnak foszfatidilinozitolt, ami nem található meg a természetes HBV virionokban. A részecskék emellett tartalmazhatnak nem toxikus mennyiségû LPS¹t az immunrendszer stimulálása céljából [29]. A HBsAg elõnyösen a HBV adw2 altípusába tartozik. Bár a HBsAg adszorbeálható valamely alumíniumhidroxid adjuvánsra az oltóanyag-végtermékben (mint a jól ismert ENGERIX¹B™ termékben), vagy maradhat adszorbeálatlanul, általában valamely alumínium-foszfát adjuvánsra kerül adszorbeálásra, mielõtt a találmány szerinti eljárásra alkalmazásra kerül [17]. A HBsAg mennyiségét jellemzõen mikrogrammban fejezik ki. A HBsAg jellemzõ mennyisége oltóanyagdózisonként 10 mg. (18) A Hib-konjugátum A találmány szerinti oltóanyagokban alkalmazott B típusú H. influenzae antigén valamely Hib kapszuláris antigént tartalmaz. A H. influenzae b¹bõl származó szacharid antigének jól ismertek [pl. az 1. hivatkozás 14. fejezete]. A Hib szacharid tetanusz-toxoidhoz van konjugálva immunogenitásának növelése céljából, különösen gyermekek esetében. A Hib kapszuláris szacharid elõállítása jól dokumentált [pl. 30–39. hivatkozások]. Amint azt az 1. hivatkozás 14–7. táblázata mutatja, különféle hordozó fehérjék vannak használatban a Hibkonjugátumokban. A PRP¹D termék diftéria-toxoid hordozó fehérjét alkalmaz, ez a hordozó szintén alkalmazható a jelen találmány szerint. A HbOC termék CRM197 hordozó fehérjét alkalmaz, ez a hordozó szintén alkalmazható a jelen találmány szerint. A PRPOMP termék egy B szerológiai csoportú meningococcusból származó külsõ membránfehérje-komplexet alkalmaz hordozóként, ez a hordozó szintén alkalmazható a jelen találmány szerint. A PRP¹T termék egy tetanusz-toxoid hordozó fehérjét alkalmaz. A jelen találmány szerinti Hib-konjugátumok tetanusz-toxoidot alkalmaznak hordozó fehérjeként, ami alapján a terméket általánosságban ’PRP¹T’ jelöléssel lehet ellátni. Ez a HIBERIX™ termékben jelen lévõ konjugátum. A konjugátum szacharid része tartalmazhat Hib baktériumokból tisztított teljes hosszúságú poliribozil-ri-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
bitol-foszfátot (PRP), és/vagy tartalmazhatja a teljes hosszúságú PRP fragmenseit. A konjugátumokban a szacharid:fehérje arány (w/w) 1:5 (fehérjefelesleg) és 5:1 (szacharidfelesleg) között lehet, példának okáért 1:2 és 5:1 közötti arányokat lehet alkalmazni, és 1:1,25 és 1:2,5 közötti arányokat. Elõnyös oltóanyagokban azonban szacharidnak a hordozó fehérjére vonatkoztatott tömegaránya 1:2,5 és 1:3,5 között van. A szacharidnak a hordozó fehérjére vonatkoztatott tömegaránya a konjugátumban 1:0,3 és 1:2 között lehet [5]. Eltekintve az antigénként beépített tetanusz-toxoidtól, a nem konjugált hordozó elõnyösen nem több mint 5% a hordozó fehérje teljes mennyiségére vonatkoztatva, a készítmény egészét tekintve, elõnyösebben 2 tömeg%-nál kisebb mennyiségben van jelen. A Hib antigén beadása elõnyösen 0,15 mg/ml antiPRP ellenanyag-koncentrációt eredményez, elõnyösebben 1 mg/ml¹t. Ezek a standard elfogadható határértékek. A Hib konjugátumok mennyiségét jellemzõen a szacharid tömegére vonatkoztatva adják meg [tehát a konjugátum dózisa (hordozó+szacharid) mint egész magasabb, mint a feltüntetett dózis], hogy a hordozóválasztástól függõ variabilitást elkerüljék. A Hib szacharid jellemzõ mennyisége oltóanyagdózisonként 10 mg. A Hib-konjugátumokat a találmány szerinti alkalmazásuk elõtt liofilizálni lehet. A fagyasztva szárítás elõtt további komponensek is hozzáadhatók, pl. stabilizálók. Elõnyös stabilizálók a laktóz, szukróz és a mannitol, valamint ezek keverékei, pl. laktóz/szukróz keverékek, szukróz/mannitol keverékek stb. A végsõ oltóanyag ennek megfelelõen tartalmazhat laktózt és/vagy szukrózt. Valamely szukróz/mannitol keverék alkalmazása felgyorsíthatja a szárítási eljárást. (19) A meningococcalis konjugátumok A találmány szerinti oltóanyagokban alkalmazott meningococcalis antigének hordozó fehérjéhez konjugált antigéneket tartalmaznak. Az oltóanyag legalább egy N. meningitidis kapszuláris szacharid-konjugátumot tartalmaz tetanusz-toxoidhoz konjugálva. Az N. meningitidis szacharid-antigénjei jól ismertek: egy kétértékû oltóanyag, a MENCEVAX AC™ és egy négyértékû oltóanyag, a MENCEVAX ACWY™ már évek óta ismertek [40, 41]. Továbbá a C szerológiai csoport elleni konjugált oltóanyagok emberben történõ alkalmazásra engedélyezve vannak, többek közt a MENJUGATE™ [42], MENINGITEC™ és a NEISVAC¹C™. Az A+C szerológiai csoportokba tartozó konjugátumok keverékei is ismertek [43, 44], és az A+C+W135+Y szerológiai csoportokba tartozó konjugátumok keverékei is leírásra kerültek [45–48]. A találmány szerinti termékekben és eljárásokban alkalmazott meningococcalis szacharid(ok) származhatnak egyetlen vagy több szerológiai csoportból: A, C, W135 és Y, pl., A+C, A+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135, A+C+Y, C+W135+Y,
1
HU 008 148 T2
A+C+W135+Y. Elõnyös legalább a C szerológiai csoport alkalmazása, különösen elõnyös az A és C szerológiai csoportokból származó szacharidok alkalmazása. A találmány szerint alkalmazható bármely alkalmas meningococcalis konjugátum, bármely alkalmas kötési kémiával és bármilyen alkalmas távtartóval (kivéve, ahol meghatározott részletek kerülnek megadásra). A MENJUGATE™ és MENINGITEC™ termékek egy CRM197 hordozó fehérjét alkalmaznak, ez a hordozó szintén alkalmazható a jelen találmány szerint. A NEISVAC¹C™ termék egy tetanusz-toxoid hordozó fehérjét alkalmaz, ez a hordozó szintén alkalmazható a jelen találmány szerint. Elõnyös a különféle meningococcalis konjugátumokhoz külön hordozó fehérjéket alkalmazni (lásd az 52. hivatkozást), de elõnyös, ha ezen külön hordozók azonosak, pl. ha a készítményben az összes meningococcalis konjugátum tetanusz-toxoid hordozót alkalmaz. A konjugátum szacharidrésze tartalmazhat meningococcusokból tisztított, teljes hosszúságú szacharidokat, és/vagy tartalmazhatja a teljes hosszúságú szacharidok fragmenseit. Az alkalmazható meningococcalis konjugátumokban a szacharid:fehérje arány (w/w) 1:10 (fehérjefelesleg) és 10:1 (szacharidfelesleg) között lehet, pl. 1:5 és 5:1 közötti arányok, 1:2,5 és 2,5:1 közötti arányok vagy 1:1,25 és 1,25:1 közötti arányok. A meningococcalis konjugátumok beadása elõnyösen a releváns szerológiai csoportra vonatkozó szérum baktericid teszt (SBA) titer legalább 4¹szeres növekedését okozza, még elõnyösebben legalább 8¹szorost. Az SBA titert újszülöttnyúl-komplement vagy emberi komplement alkalmazásával lehet meghatározni [53]. A meningococcalis konjugátumok koncentrációját általában a szacharid tömegére vonatkoztatva adják meg [tehát a konjugátum dózisa (hordozó+szacharid) mint egész magasabb, mint a feltüntetett dózis], hogy a hordozóválasztástól függõ variabilitást elkerüljék. A meningococcalis szacharid jellemzõ mennyisége oltóanyagdózisonként mintegy 5 mg vagy mintegy 10 mg. A meningococcalis konjugátumokat a találmány szerinti alkalmazásuk elõtt liofilizálni lehet. A fagyasztva szárítás elõtt további komponensek is hozzáadhatók, pl. stabilizálók. Elõnyös stabilizálók a laktóz és/vagy a szukróz. A végsõ oltóanyag ennek megfelelõen tartalmazhat laktózt és/vagy szukrózt. (20) Adjuvánsok Az antigénkomponensek mellett a találmány szerinti oltóanyagok jellemzõen legalább egy alumíniumsó adjuvánst is tartalmaznak. Amint azt fentebb említettük, az oltóanyagok tartalmazhatnak alumínium-hidroxid és alumínium-foszfát adjuvánsokat is. Ahol mindkettõ szerepel, a két adjuváns tömegaránya 1:1 körül van, példának okáért az alumínium-hidroxid:alumínium-foszfát arány lehet kb. 1,58:1,6. Bár az alumínium adjuvánsok jellemzõen „alumínium-hidroxid” vagy „alumínium-foszfát” adjuváns né-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 10
2
ven szerepelnek, ezek hagyományos, kényelmes elnevezések, nem a ténylegesen jelen lévõ vegyületek pontos leírásai [ld. pl. az 54. hivatkozás 9. fejezetét]. A találmány szerint bármely „hidroxid” vagy „foszfát” adjuváns alkalmazható, mely adjuvánsként általában használatban van. Az „alumínium-hidroxid”-ként ismert adjuvánsok jellemzõen alumínium-oxi-hidroxid-sók, melyek legalább részben kristályosak. Az alumínium-oxi-hidroxid, melyet az AIO(OH) képlet jellemez, infravörös (IR)-spektroszkópiával különböztethetõ meg más alumíniumvegyületektõl, így az alumínium-hidroxidtól (Al(OH)3), különösen az 1070 cm–1-nél jelen lévõ elnyelési sáv és a 3090–3100 cm–1-nél jelen lévõ erõs váll alapján [az 54. hivatkozás 9. fejezete]. Az „alumínium-foszfát”-ként ismert adjuvánsok jellemzõen alumínium-hidroxi-foszfátok, melyek gyakran egy kis szulfátot is tartalmaznak (alumínium-hidroxifoszfát-szulfát). Ezeket kicsapással lehet nyerni, és a reakciókörülmények és koncentrációk a kicsapás alatt befolyásolják a hidroxil foszfáttal való helyettesítésének mértékét. A hidroxi-foszfátok általában 0,3 és 1,2 PO4/Al moláris arányt mutatnak. A hidroxi-foszfátokat a szigorúan vett AlPC4-tõl a hidroxilcsoportok jelenléte alapján lehet megkülönböztetni. Például az IR¹színképben 3164 cm –1 -nél észlelhetõ sáv (pl. 200 °C¹ra melegítésnél) jelzi a strukturális hidroxilok jelenlétét [az 54. hivatkozás 9. fejezete]. Az adjuvánsok bármely alkalmas formát felvehetnek (pl. gél, kristályos, amorf stb.) A PO4/Al3+ mólarány valamely alumínium-foszfát adjuvánsban általában 0,3 és 1,2 között lesz, elõnyösen 0,8 és 1,2 között, és elõnyösebben 0,95±0,1. Egy jellemzõ adjuváns az amorf alumínium-hidroxi-foszfát 0,84 és 0,92 PO4/Al mólarány között, 0,6 mg Al3+/ml koncentrációban beépítve a termékbe. Az alumíniumfoszfát általában amorf, különösen a hidroxi-foszfát-sók. Az alumínium-foszfát általában szemcsés. A szemcsék jellemzõ átmérõje az 5–20 mm tartományba esik (például mintegy 5–10 mm) az antigén adszorpciója után. Az alumínium-foszfát PZC¹je fordítottan arányos a hidroxilok foszfáthelyettesítésének mértékével, és ez a mérték változik a reakciókörülmények és a reaktánsok koncentrációja függvényében a só kicsapással történõ elõállításakor. A PZC¹t úgyszintén befolyásolja a szabad foszfátionok koncentrációjának változása az oldatban (több foszfát=savasabb PZC) vagy valamely puffer, így hisztidinpuffer hozzáadása (a PZC¹t lúgosítja). A találmány szerint alkalmazott alumínium-foszfátok PZC¹je általában 5,0 és 7,0 között lesz, elõnyösebben 5,5 és 6,0 között, pl. 5,7 körül. Az alumínium-foszfát elõnyösen vizes oldat formájában kerül alkalmazásra, amihez az antigének hozzáadásra kerülnek (NB: általánosan elterjedt a vizes alumínium-foszfátok oldatként való emlegetése annak ellenére, hogy szigorúan fizikokémiai értelemben a só oldhatatlan, és szuszpenziót képez). Elõnyös az alumínium-foszfátot a kívánt koncentrációra hígítani, homogén oldatot biztosítani az antigénkomponensek hozzáadása elõtt.
1
HU 008 148 T2
Az Al3+ koncentrációja az antigének hozzáadása elõtt általában 0 és 10 mg/ml között van. Egy elõnyös koncentráció 2 és 6 mg/ml között van. A találmány szerinti oltóanyag elõállítására alkalmazott alumínium-foszfát-oldat tartalmazhat valamely puffert (pl. foszfát- vagy hisztidinpuffert), de ez nem szükségszerû. Az alumínium-foszfát-oldat elõnyösen steril és pirogénmentes. Az alumínium-foszfát-oldat tartalmazhat szabad vizes foszfátionokat, melyek pl. 1,0 és 20 mM közötti koncentrációban vannak jelen, elõnyösen 5 és 15 mM között, még elõnyösebben 10 mM körül. Az alumínium-foszfát-oldat emellett tartalmazhat nátrium-kloridot. A nátrium-klorid koncentrációja elõnyösen a 0,1–100 mg/ml közötti tartományban van (pl. 0,5–50 mg/ml, 1–20 mg/ml, 2–10 mg/ml) és elõnyösebben kb. 3±1 mg/ml. Az NaCl jelenléte elõsegíti a pontos pH¹mérést az antigének adszorpciója elõtt. Ahol az antigén mint valamely adjuvánshoz „adszorbeált” van leírva, elõnyös, ha az antigén legalább 50%¹a (tömegre vonatkoztatva) adszorbeálva van, pl. 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% vagy több. Egyes megvalósításokban a diftéria-toxoid és a tetanusz-toxoid teljesen adszorbeálva vannak, azaz egyáltalán nem detektálhatók a felülúszóban. A HBsAg teljes adszorpciója szintén elõnyös. (21) Az oltóanyag további komponensei Amellett, hogy antigéneket és adjuváns(oka)t stb. tartalmaz, a találmány szerinti kombinált oltóanyagok további komponenseket is tartalmazhatnak. Ezen komponensek forrása sokféle lehet; példának okáért jelen lehettek a találmány szerinti eljárás során bekeverésre kerülõ antigénkomponensek valamelyikében, vagy az antigénkomponensektõl függetlenül kerülhetnek hozzáadásra az eljárás folyamán. Az oltóanyag-végtermék ozmolaritásának biztosítása céljából elõnyös valamely élettani sóoldat hozzáadása, pl. valamely nátriumsóé. Elõnyös a nátrium-klorid (NaCl), mely az oltóanyag-végtermékben 1 és 20 mg/ml között lehet jelen. Az antigének adszorbeált állapota következtében az oltóanyag-végtermék szuszpenzió lehet, opálos megjelenéssel. Ez a megjelenés azt eredményezi, hogy az esetleges mikrobiális szennyezés nem észlelhetõ könnyen, ezért az oltóanyag elõnyösen antimikrobiális hatóanyagokat is tartalmaz. Ez különösen fontos, ha az oltóanyag többszörös adagolást tartalmazó tartályba van csomagolva. Elõnyös antimikrobiális szerek a 2¹fenoxi-etanol és a timerozál. Elõnyös azonban kerülni a higanytartalmú konzerválószerek alkalmazását (pl. timerozál) a találmány szerinti eljárás során. Mindazonáltal nyomnyi mennyiségek jelenléte elkerülhetetlen lehet, ha az eljáráshoz alkalmazott valamelyik antigén (pl. a HBsAg) elõzetesen ilyen konzerválószeres kezelést kapott. Biztonsági szempontból elõnyös azonban, ha az oltóanyag-végtermék kb. 25 ng/ml-nél kevesebb higanyt tartalmaz. Még elõnyösebb, ha az oltóanyag-végtermék egyáltalán nem tartalmaz kimutatható timerozált. Ezt általában a higanyos konzerválószer-
5
10
15
20
25
30
35
40
2
nek az antigénpreparátumból való eltávolításával lehet elérni annak a találmány szerinti eljáráshoz való hozzáadása elõtt, vagy az egyes antigénkomponensek elõállítása során a timerozál alkalmazásának mellõzésével. A timerozálhoz hasonlóan az egyes antigénekbõl eredõ más maradék komponensek is jelen lehetnek nyomnyi mennyiségben a találmány szerinti oltóanyagvégtermékben. Példának okáért, ha a diftéria¹, tetanusz- és szamárköhögés-toxoidok elõállításakor formaldehidet alkalmaztak, az oltóanyag-végtermék tartalmazhat nyomnyi mennyiségû formaldehidet (pl. 10 mg/ml, elõnyösen <5 mg/ml). Szabad aminosavak (pl. alanin, arginin, aszpartát, cisztein és/vagy cisztin, glutamát, glutamin, glicin, hisztidin, prolin és/vagy hidroxi-prolin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenil-alanin, szerin, treonin, triptofán, tirozin és/vagy valin), vitaminok (pl. kolin, aszkorbát stb.), dinátrium-foszfát, monokálium-foszfát, kalcium, glükóz, adenin-szulfát, fenolvörös, nátrium-acetát, kálium-klorid stb. maradhat a végtermékben egyenként £100 mg/ml koncentrációban (pl. £50 mg/ml, £10 mg/ml). A végsõ oltóanyag további komponensei, melyek az antigénkészítményekbõl erednek, az antigének teljességet el nem érõ tisztításából származnak. A B. pertussis, C. diphteriae, C. tetani és S. cerevisiae fehérjéi és/vagy genom-DNS¹e tehát jelen lehet. Ezen maradék komponensek mennyiségének minimalizálására az antigénkészítményeket elõnyös az eltávolításukat célzó kezelésnek alávetni, mielõtt az antigének alkalmazásra kerülnének a találmány szerinti eljárásban. Ahol alumíniumsók vannak jelen a végsõ oltóanyagban, az alumínium teljes mennyisége, Al3+ formájában kifejezve, elõnyösen £2 mg/ml lehet (pl. 1,2–1,5 mg/ml között, vagy mintegy 1,4 mg/ml; vagy 0,4 és 0,8 mg/ml között, vagy 0,6 mg/ml körül). A találmány szerinti eljárás során a komponensek hígítása a kívánt végkoncentráció elérése céljából általában injekcióminõségû vízzel történik. Az antigének, különösen a konjugált antigének közötti interferenciák megelõzésére valamely polianionos polimer, így poli-L-glutaminsav hozzáadása lehetséges [55].
(22) A kombinált oltóanyag csomagolása Jellemzõ alkalmazásban a találmány szerinti eljárás nagy mennyiségû ömlesztett kombinált oltóanyag elõállítására lesz alkalmazva, mely oltóanyag alkalmas lesz kiszerelésre, majd terjesztésre és beadásra. A fentebb említett koncentrációk a végsõ, kiszerelt oltó50 anyag jellemzõ koncentrációi, a koncentrációk az ömlesztett oltóanyagban lehetnek magasabbak is (pl. hígítással érve el a végkoncentrációkat). A találmány szerinti eljárás ennek megfelelõen tartalmazhatja az oltóanyag tartályokba történõ kiszerelé55 sének további lépését. Az alkalmas tartályok közé tartoznak az ampullák és az eldobható fecskendõk (elõnyösen a sterilek). Ha az oltóanyag ampullába kerül, ezek elõnyösen üvegbõl vagy mûanyagból készülnek. Az ampulla elõ60 nyösen sterilizálásra kerül, mielõtt az oltóanyagot bele45
11
1
HU 008 148 T2
mérik. A latexérzékeny betegekkel kapcsolatos problémák elkerülésére az ampullákat valamely latexmentes dugóval lehet lezárni. Az ampullában lehet egyetlen oltóanyagdózis, vagy egynél több dózis (többszörös dózisú ampulla), pl. 10 dózis. Többszörös dózisú ampulla használatakor minden egyes dózist steril tûvel és fecskendõvel kell szigorúan aszeptikus körülmények között kivenni, kerülve az ampulla tartalmának szennyezõdését. Elõnyös ampullák színezett üvegbõl készülnek. Ha az oltóanyag fecskendõbe van adagolva, a fecskendõ általában tûvel is fel van szerelve, bár tût elkülönítve is lehet mellékelni. A biztonsági tûk az elõnyösek. 1 hüvelyk hosszú 23¹as, 1 hüvelyk hosszú 25¹ös és 5/8 hüvelyk hosszú 25¹ös tûk a jellemzõek. A fecskendõket leszedhetõ címkével lehet ellátni, melyre a sorozatszám és a lejárati idõ van nyomtatva, a nyilvántartás elõsegítése céljából. A fecskendõben a dugattyú elõnyösen egy akadállyal van ellátva, mely megakadályozza a dugattyú véletlen kihúzását a felszívás során. A fecskendõk latexgumi kupakkal és/vagy dugattyúval lehetnek ellátva. Az eldobható fecskendõk az oltóanyag egyetlen adagját tartalmazzák. A fecskendõk általában csõrvédõ kupakkal vannak ellátva, ami védi a csõrt a tû felhelyezéséig, és a csõrvédõ kupak elõnyösen butilgumiból van. Ha a fecskendõ és a tû elkülönítve vannak csomagolva, a tû elõnyösen egy butilgumi védõsapkával van felszerelve. A szürke butilgumi elõnyös. Elõnyös fecskendõk a „Tip-Lok”™ kereskedelmi név alatt forgalmazottak. Ha üvegtartály (pl. fecskendõ vagy ampulla) kerül alkalmazásra, úgy elõnyös boroszilikát üveg alkalmazása, szemben a nátronmész üveggel. Ha külön kerülnek kiszerelésre, a konjugált antigének jellemzõen fagyasztva szárítottak (liofilizáltak) egy külön tartályban, így a kiszerelt oltóanyag legalább két külön tartályt tartalmaz. Betegnek történõ beadás elõtt a fagyasztva szárított anyag feloldásra és hígításra kerül a másik tartályban lévõ folyadékkal. Jellemzõen tehát a konjugátum tartálya egy ampulla, és a másik tartály tartalmazza a folyadékot egy ampullában vagy elõre töltött fecskendõben. A második tartály folyékony tartalma átvitelre kerül a fagyasztva szárított konjugált antigénporba, ily módon feloldva a konjugált antigéneket a betegnek történõ beadás céljából. A liofilizált konjugátumok tartálya elõnyösen olyan ampulla, melynek a dugója (pl. Luer-záras csatlakozó) oly módon van kialakítva, hogy az elõre töltött fecskendõ illeszkedik a dugóba, a fecskendõ tartalma bevihetõ az ampullába az abban lévõ fagyasztva szárított anyag feloldásához, és az ampulla tartalmát vissza lehet szívni a fecskendõbe. A fecskendõnek az ampulláról történõ leválasztása után tût lehet feltenni rá, és az oltóanyagot be lehet adni a betegnek. A dugó elõnyösen egy védõkupak vagy takaró belsejében van, ily módon a zárókupakot vagy takarót el kell távolítani, mielõtt a kupakhoz hozzá lehetne férni. A találmány szerinti kombinált oltóanyag elõnyösen 0,5 ml dózisokban adható a betegeknek. A találmány szerinti eljárás tehát tartalmazhatja az ömlesztett oltóanyag 0,5 ml¹es adagjának kinyerését és edénybe töl-
5
10
15
20
25
30
35
40
2
tését. Többszörös dózisú helyzetekben a többszörös dózis mennyisége kerül kinyerésre és együttes letöltésre egyetlen tartályba. Ha az oltóanyag kitként kerül prezentálásra egy liofilizált komponenssel, a végsõ dózis feloldás után elõnyösen 0,5 ml. A 0,5 ml dózis alatt itt 0,5 ml±0,05 ml értendõ. A tartály, melybe az oltóanyag kiszerelésre kerül, általában egy dobozban kerül terjesztésre, pl. egy kartondobozban, és a doboz jelölve lesz az oltóanyag részletes adataival, pl. a kereskedelmi nevével, az oltóanyagban található antigének nevével (pl. ’Diftéria, tetanusz, inaktivált teljes sejtes szamárköhögés és rekombináns hepatitis B, adszorbeált oltóanyag’ stb.), a tartály fajtájával (pl. ’eldobható, elõre töltött Tip-Lok fecskendõk’ vagy ’10 db 0,5 ml egydózisú ampulla’), a dózissal (pl. ’egyenként 0,5 ml dózist tartalmaz’), figyelmeztetésekkel (pl. ’csak gyermekgyógyászati célra’), lejárati dátummal stb. A dobozban lehet egynél több kiszerelt oltóanyag, pl. öt vagy tíz kiszerelt oltóanyag (különösen ampulla). Ha az oltóanyag fecskendõben van, a csomagoláson megjelenhet a fecskendõ ábrázolása. Az oltóanyag csomagolható együtt (pl. ugyanazon dobozban) egy ismertetõvel, mely az oltóanyagról részleteket tartalmaz, pl. beadási utasításokat, az oltóanyagban lévõ antigéneket stb. Az utasítások figyelmeztetéseket is tartalmazhatnak, pl. hogy adrenalinoldatot kell kéznél tartani a vakcinációt követõ esetleges anafilaxiás reakció esetére stb. A kiszerelt oltóanyagok elõnyösen sterilek. A kiszerelt oltóanyagok elõnyösen nem pirogének, pl. <1 EU (endotoxinegység, egy standard mérõszám) pirogén anyagot tartalmaznak dózisonként, elõnyösen <0,1 EU¹t dózisonként. A kiszerelt oltóanyagok elõnyösen gluténmentesek. Bármely vizes kiszerelt oltóanyag pH¹ja elõnyösen 6 és 8 között van, pl. 6,5 és 7,5 között. A találmány szerinti eljárás tehát tartalmazhat egy lépést, melynek során az ömlesztett oltóanyag pH¹ja beállításra kerül kiszerelés elõtt. Bármely vizes anyag a kiszerelt oltóanyagban elõnyösen zavaros, fehér szuszpenzió. A kiszerelt oltóanyag elõnyösen 2 °C és 8 °C között tárolható, és nem fagyasztható.
45 (23) Az oltóanyag beadása A találmány szerinti oltóanyag-kombinációk alkalmasak embereknek történõ beadásra, különösen gyermekek számára. Az oltóanyag jellemzõ adagolási sé50 mái közé tartozik – a maximális hatékonyság érdekében – egynél több dózis beadása az elsõdleges immunizálás során. Egy jellemzõ elsõdleges immunizálási séma három dózist tartalmaz kb. 6–8 hetes idõközönként, az elsõ dózist a gyermek 6–9 hetes korában 55 adva. Elõnyös egy 3 dózisú elsõdleges séma 6, 10 és 14 hetes korban, amit egy negyedik dózis követhet 18 hónapos korban. Az oltóanyag alkalmazható valamely más oltóanyaggal kezdett elsõdleges immunizálási séma befe60 jezésére. 12
1
HU 008 148 T2
A találmány szerinti készítmények az orvoslásban alkalmazhatók. A gyógyszerek általában közvetlenül a betegnek kerülnek beadásra. A közvetlen beadás történhet parenterális injekció formájában (pl. intravénásan, szubkután, intraperitoneálisan, intramuszkulárisan, vagy valamely szövetközti térbe), vagy rektális, orális, vaginális, helyi, transzdermális, intranazális, okuláris, aurális, pulmonáris vagy más nyálkahártyán keresztül történõ bejuttatással. Általában azonban intramuszkuláris injekcióval kerülnek beadásra. Elõnyös helyek az injekcióra az anterolaterális comb vagy a felsõkar deltaizma. A beteg elõnyösen emberi lény, és lehet gyermek (pl. egy kisgyermek vagy csecsemõ), tizenéves vagy felnõtt, de általában gyermek. Az elõnyös betegek 0–36 hónapos kor között vannak, pl. 0–24 hónap között, 0–12 hónap között, vagy 0–6 hónap között. Az egyes antigének hatékonyságának ellenõrzésére szolgáló eljárások a szakmában ismertek. A találmány szerinti oltóanyagokat lényegében egyidejûleg lehet adni valamely orális polio-oltóanyaggal, így valamely háromértékû orális polio-oltóanyaggal, pl. amelyik 1. típusú poliovirust, 2. típusú poliovirust és 3. típusú poliovirust tartalmaz. A találmány szerinti oltóanyagot elsõ alkalommal megkapó gyermek elõzõleg már kaphatott orális polio-oltóanyagot és/vagy Bacillus Calmette-Guérin (BCG) oltóanyagot. Tehát az immunizálás szempontjából elõnyös betegcsoportok közé tartoznak nem korlátozó módon: (a) gyermekek, akik elõzõleg már kaptak orális polio-oltóanyagot; (b) gyermekek, akik elõzõleg már kaptak BCG-oltóanyagot; (c) gyermekek, akik elõzõleg már kaptak orális polio- és BCG-oltóanyagot is; (d) az (a), (b) vagy (c) csoportba tartozó gyermekek, akik elõzõleg nem kaptak semmilyen D, T, Pw, HBsAg, Hib-konjugátumot és meningococcalis konjugátumot; és (e) gyermekek, akik elõzõleg már kaptak orális polio-oltóanyagot, BCG¹t, D, T, Pw, HBsAg, Hib konjugátumokat és legalább egy meningococcalis konjugátumot. Ezek a gyermekek bármely, fentebb megadott korcsoportba tartozhatnak, pl. 0–36, 0–24, 0–12 vagy 0–6 hónap között. Ha a találmány szerinti oltóanyag valamely alumíniumalapú adjuvánst tartalmaz, tárolás közben a komponensek ülepedhetnek. Az oltóanyagot ennek megfelelõen fel kell rázni a betegnek történõ beadás elõtt. A felrázott oltóanyag zavaros, fehér szuszpenzió lesz.
2
A konjugálási technikákkal kapcsolatos általános információ a 39. hivatkozásban található.
5
10
15
20
25
30
Az ábrák rövid leírása Az 1. ábra Western-blot-eredményeket mutat a HBsAg stabilitására vonatkozóan egy készítményben. Az 1A. ábrán a csíkok a következõk: (1) Laemmli mintapuffer (LSB); (2) molekulatömeg-markerek; (3–5) három különbözõ HBsAg kontrollkészítmény 1¹1 mg¹ja; (6–8) három különbözõ ötértékû sarzs felülúszója; (9–10) LSB. Az 1B. ábrán a csíkok a következõk: (1) molekulatömeg-markerek; (2–4) három különbözõ HBsAg kontrollkészítmény 1¹1 mg¹ja; (5–7) három különbözõ ötértékû sarzs felülúszója, 2 hétig tárolva 2–8 °C¹on; (8–10) három különbözõ ötértékû sarzs felülúszója, 2 hétig tárolva 36–38 °C¹on. A 2. ábra a pH idõbeli változásait mutatja egy ötértékû készítményben. A 3. ábra Western-blot-eredményeket mutat a HBsAg stabilitására vonatkozóan egy nyolcértékû készítményben. A 3A. és 3B. ábrán: az 1. csík molekulatömegmarkereket tartalmaz; a 2. csík egy HBsAg kontrollkészítményt tartalmaz 1 mg/ml koncentrációban; a 3. csík tartalmazza a nyolcértékû készítményt. A 3B. ábrán: a 4. csík LSB¹t tartalmaz; az 5. csík ugyanazt a kontrollt tartalmazza, mint a 2. csík; a 6. csík egy DOCITCA kivonatot tartalmaz.
35 A találmány megvalósítási módjai Nyolcértékû D¹T-Pw-HBsAg-Hib-MenC-MenW135MenY oltóanyag Élesztõben expresszált HBsAg¹t, diftéria-toxoidot, 40 tetanusz-toxoidot és teljes sejtes szamárköhögés-antigéneket adtunk egy alumíniumsó adjuváns szuszpenziójához. A keverék pH¹ját beállítottuk, majd egy HibCRM197 konjugátumot adtunk, ily módon az már nem adszorbeálódott az alumínium adjuvánsra. Ezen eljá45 rás a következõ összetételû ötértékû oltóanyagot eredményezte: Komponens
Általános definíciók A „tartalmaz” kifejezés jelentheti, hogy „magában foglal” vagy „áll belõle”. Például valamely X¹et „tartalmazó” készítmény állhat kizárólag X¹bõl, vagy tartalmazhat mást is, pl. X+Y. A „lényegében” nem zárja ki a „teljesen”¹t, pl. egy készítmény, mely „lényegében mentes” Y¹tól, lehet teljesen Y¹mentes is. Ahol szükséges, a „lényegében” szó elhagyható a találmányból. A „körül”, „mintegy” kifejezések jelentése valamely numerikus értékkel, pl. x¹szel összefüggésben például x±10%.
50
Diftéria-toxoid Tetanusz-toxoid
55
60 13
Koncentráció
15 Lf/ml 6,5 Lf/ml
Teljes sejtes szamárköhögés-antigén
30 OU/ml
HBsAg
20 mg/ml
CRM-Hib
20 mg/ml (szacharidként)
Al3+
0,6 mg/ml
NaCl
9 mg/ml
1
HU 008 148 T2
A továbbiakban a CRM-Hib komponens után a C, W135 és Y szerológiai csoportokba tartozó, különálló meningococcalis CRM197 konjugátumokat adtunk, amivel nyolcértékû oltóanyaghoz jutottunk: 5 Komponens
Diftéria-toxoid
Koncentráció
15 Lf/ml
Tetanusz-toxoid
6,5 Lf/ml
10
Teljes sejtes szamárköhögés-antigén
30 OU/ml
HBsAg
20 mg/ml
CRM-Hib
20 mg/ml (szacharidként)
CRM-MenC
20 mg/ml
CRM-MenW135
20 mg/ml
CRM-MenY
20 mg/ml
Al3+
0,6 mg/ml
NaCl
9 mg/ml
Sarzs
1.
2.
3.
Idõ
15
20
(a)
(b)
2
Az oltóanyag stabilitása és hatékonysága szempontjából fontos tényezõ a Hib konjugátum százalékos hidrolízise, a klinikai határérték 25% szabad szacharid (az 56. hivatkozás szerint 20% nem befolyásolta károsan a klinikai immunogenitást). Ezt a paramétert az ötértékû oltóanyagból mértük HPAEC-PAD módszerrel, ami lehetõvé teszi a nem konjugált szénhidrátok közvetlen mennyiségi meghatározását pikomólos szinten, minimális elválasztási és tisztítási igénnyel. Az elemzés a szabad szacharid mennyiségére koncentrált. A szacharidokat a következõkre teszteltük: (a) teljes mennyiség mg/ml-ben (b) a mennyiség a felülúszóban (nem adszorbeálódott) mg/ml-ben (c) szabad mennyiség (a CRM197-Hib konjugátum hidrolízise) mg/ml-ben A (c) értéket (d) a (b) százalékában vagy (e) az elméleti teljes szacharidkoncentráció (20 mg/ml) százalékában fejeztük ki. Az eredmények a következõk voltak:
(c)
(d)
(e)
0
23,47
21,30
1,26
5,3%
6,3%
2 hét, 2–8 °C
18,39
19,12
1,04
5,7%
5,2%
2 hét, 36–38 °C
19,84
17,18
1,36
6,8%
6,8%
4 hét, 2–8 °C
22,51
20,57
1,49
6,5%
7,3%
4 hét, 36–38 °C
21,30
18,15
2,47
11,6%
12,3%
0
23,23
22,26
0,70
3,0%
3,5%
2 hét, 2–8 °C
21,06
19,36
0,65
3,1%
3,3%
2 hét, 36–38 °C
21,54
16,70
1,19
5,5%
5,9%
4 hét, 2–8 °C
23,72
19,84
0,87
3,7%
4,4%
4 hét, 36–38 °C
23,72
18,63
1,91
8,1%
9,6%
0
24,20
23,23
0,80
3,3%
4,0%
2 hét, 2–8 °C
20,09
17,67
0,80
4,0%
4,0%
2 hét, 36–38 °C
18,15
17,18
1,14
6,3%
5,7%
4 hét, 2–8 °C
22,99
23,23
0,94
4,1%
4,7%
4 hét, 36–38 °C
22,26
18,39
1,94
8,7%
9,7%
Klinikailag legfeljebb 25% szabad szacharid fogadható el. Minden érték ezen küszöb alatt van, és 6,5% alatt volt 4 hétig 2–8 °C¹on. Hõmérsékleti stressz körülményei között (4 hét 36–38 °C¹on) magasabb szinteket láttunk, melyek azonban még mindig jóval a 25% alatt 50 vannak, a maximum 11,6% volt az 1. sarzsnál. A többértékû Hib oltóanyagokkal végzett korábbi munka megmutatta, hogy egy hónapos tárolás 36–38 °C¹on magasabb CRM-Hib hidrolízist eredményez, mint kétévnyi tárolás 2–8 °C¹on. Elfogadható hidrolízis várható en- 55 nek megfelelõen 2 évnyi idõskálán normál tárolási körülmények között. A szabad szacharidok HPAEC-PAD elemzését 6 hónapos 2–8 °C¹on történt tárolás után is elvégeztük. 60 Az adatok a következõk voltak: 14
Sarzs
(c)
(d)
(e)
1.
1,65
9,8%
8,3%
2.
1,09
5,8%
5,5%
3.
1,16
6,6%
5,8%
Tehát 6 hónap tárolás után a 4 hetes tároláshoz képest csak kismértékû növekedés volt tapasztalható a szabad szacharid mennyiségét illetõen, és az értékek még mindig jóval a 25%¹os küszöb alatt maradtak. A CRM197-Hib tehát nagyon stabil ebben a három készítményben. A 2A. ábra mutatja a pH változásait az ötértékû oltóanyag három sarzsa esetében, 6 hónap 2–8 °C¹on
1
HU 008 148 T2
történõ tárolás alatt. A 2B. ábra mutatja a pH változásait a három sarzs esetében, 4 hétig 36–38 °C¹on történõ tárolás alatt. 2–8 °C¹on a pH stabil maradt 6 hónap alatt, míg hõmérsékleti stressz körülményei között csekély, 0,1 pH¹egységnyi csökkenés következett be 2 hét alatt, és további kismértékû csökkenés 4 hét alatt. Ezzel együtt minden pH¹érték az elfogadható 6,0–7,0 közötti tartományban maradt. Mindhárom ötértékû sarzs ozmolaritása 312 és 315 mOsm/kg között volt, az injektálható oltóanyagok esetében elfogadható 240–360 mOsm/kg tartomány közepén. Az antigének potenciáljának és immunogenitásának értékelése fontos a kombinált oltóanyag hatékonyságának megítélésében. Az ötértékû oltóanyagban a diftéria, tetanusz és szamárköhögés antigéneket értékeltük, valamint a CRM-Hib és a HBsAg immunogenitását vizsgáltuk. ELISA analízist végeztünk a specifikus ellenanyagok szintjeinek megítélésére immunizálás után. A HBsAg immunogenitását egy egérmodell alkalmazásával vizsgáltuk, a HBV potenciáljának meghatározására alkalmazottól eltérõ immunizálási sémával. A DTP potenciálértékek a következõk: D
T
P
1. sarzs
41
161
4
2. sarzs
39
138
5
3. sarzs
39
143
6
Enzygnost
Válaszolók %¹a
15
20
35
40
45
50
Ausab EIA
válaszolók %¹a
GMT
válaszolók %¹a
1. sarzs
1008
100
192
100
2. sarzs
1518
100
194
100
3. sarzs
461
90
127
100
2
0
2
0
1. sarzs
100
2. sarzs
100
3. sarzs
100
Csak adjuváns
30
GMT
Csak adjuváns
Ezzel az egér immunogenitási teszttel kapott GMTértékek az irodalomban leírt értékeknél magasabbak. A válaszolók százalékos aránya következetesen magas mindkét antigén esetében, az optimális 100% kö5 zelében. A Hib immunogenitás megítéléséhez 8 CDI egérbõl álló csoportoknak adtuk az ötértékû oltóanyagot szubkután injekcióval (0,5 ml, 1:4 hígítás sóoldattal) a 0., 10. és 20. napon. Az egerek vérét vettük a 34. napon, 10 és a Hib-specifikus ellenanyagokat ELISA segítségével határoztuk meg. Az eredmények a következõk:
25
Mindhárom antigén esetében a potenciálértékek jelentõsen az elfogadható alsó határértékek felett vannak, és az eredmények jó hatásfokot jeleznek ezen három antigén esetében. A HBsAg immunogenitásának meghatározására 10 CDI egérbõl álló csoportoknak adtuk az ötértékû oltóanyagot szubkután injekcióval (0,5 ml, 1:4 hígítás sóoldatban) a 0. és 14. napon. Az egerek vérét vettük a 21. napon, és a HBsAg-specifikus ellenanyagokat ELISA-val határoztuk meg (a) „Enzygnost Anti-HBs II” vizsgálattal (Dade Behring) vagy (b) „Ausab EIA” teszttel (Abbott). Ezek az ELISA tesztek különbözõ formátumúak és különbözõ érzékenységet mutatnak a HBsAgspecifikus ellenanyagokkal szemben. A titerek mértani középértékei így nem összehasonlíthatók a két teszt között. Mindazonáltal az egyes teszteken belül a szérumok mértani középértékei (GMT) optimálisak voltak. Az eredmények a következõk:
2
55
60 15
0
A HBsAg adszorpciója az alumínium adjuvánsra fontos tényezõ az oltóanyag immunogenitása szempontjából, és ezt a paramétert immunoblottal ellenõriztük. A követett immunoblot eljárás lényege a következõ: 1 ml oltóanyag-felülúszót DOCITCA segítségével kicsaptunk, LSB-vel denaturáltuk, és azután egy 12% akrilamid SDS-gélre felvittük; minden HBsAg sarzsból 1 mg¹ot kontrollként tettünk fel; egy kecskében termelt anti-HBsAg ellenanyag-készítményt alkalmaztunk elsõ ellenanyagként (1:1000¹es hígítás) és egy antikecske peroxidáz-konjugátumot (1:2 500¹as hígítás) második ellenanyagként. Az ötértékû oltóanyagra vonatkozó eredményeket az 1. ábra mutatja. Az 1A. ábra 6–8. csíkja mutatja, hogy nem volt észlelhetõ szolubilis HBsAg a készítményben a kiindulási idõpontban, és az 1B. és 1C. ábra 5–10. csíkjai megerõsítik, hogy ez igaz marad 2 hét és 4 hét után 2–8 °C¹on vagy 36–38 °C¹on is. Három különbözõ sarzsnál a HBsAg kb. 99%¹a az adjuvánsra adszorbeálva marad ezen különféle körülmények között. Egy további stabilitási tesztet végeztünk 6 hónapig 2–8 °C¹on történõ tárolás után (1D. ábra). Az adszorpció kb. 99% maradt mindhárom sarzsban. Az 1. ábrán alkalmazott pozitív kontrollok 1 mg HBsAg¹t tartalmaztak. Az S peptidnek megfelelõ csík (24 kDa) látható volt, valamint egy aggregátumokra jellemzõ csík (kb. 45 kDa). A pre¹S2 nem volt látható. A nyolcértékû oltóanyagot szintén vizsgáltuk HBsAg adszorpcióra, hasonló módon. 1 ml¹es mintát centrifugáltunk 3500 rpm-mel 10 percig. A felülúszót egy tiszta csõbe leszívtuk, és DOCITCA segítségével kicsaptuk. A csapadékot 200 ml extrakciós pufferben felvettük, 5 percig forraltuk, majd 1300 rpm-mel 10 percig centrifugáltunk. Ezen kivonat 20 ml-jét és a DOCITCA segítségével kicsapott anyag felülúszóját 12% SDS-gélre tettük fel Western-blotra. A 3A. ábra mutatja a nyolcértékû oltóanyagot a kiindulási idõpontban, és a 3B. ábra mutatja az oltóanyagot 8 hónapig 2–8 °C¹on történt tárolás után. A 3B. ábra 3. és 6. csíkjain nincs jelentõs festõdés (bi-
1
HU 008 148 T2
zonyosan kevesebb mint az 1 mg HBsAg-val a 2. és 5. kontrollcsíkban) mutatja, hogy a HBsAg-adszorpció stabil marad ezen tárolási idõszak alatt. Hétértékû D¹T-Pw-HBsAg-Hib-MenA-MenC oltóanyag Öt antigénkomponenst a következõk szerint állítunk össze: Háromértékû D¹T¹Pw komponens: a D¹T¹Pw komponens alumínium-hidroxid adjuvánsra adszorbeált diftéria-toxoidot, szintén alumínium-hidroxid adjuvánsra adszorbeált tetanusz-toxoidot, és alumínium-foszfáttal kevert teljes sejtes szamárköhögés-antigéneket tartalmaz. Ez a komponens timerozált tartalmaz, de nem tartalmaz 2¹fenoxi-etanolt. HBsAg komponens: A HBsAg rekombináns S. cerevisiae-ben van expresszálva és abból van tisztítva. A tisztított fehérje alumínium-foszfát adjuvánsra van adszorbeálva [17]. Hib-konjugátum komponens: A Hib poliszacharidot Hib 20752¹es törzsbõl tisztítjuk, majd cián-bromidos aktiválás és adipil-hidrazid távtartóval történt származékoltatás után kovalensen kötjük tetanusz-toxoidhoz karbodiimid-kondenzációval, kb. 1:3 szacharid:hordozó tömegarány mellett. EDAC¹ot alkalmazó reakció után az EDU-szinteket mérjük. MenA konjugátum komponens: Az A szerológiai csoportba tartozó meningococcusból szacharidot tisztítunk és kovalensen konjugáljuk H. influenzae D fehérjéhez, CDAP technikával. A CDAP-reakció után a maradék DMAP-tartalmat mérjük, és a C¹3 pozíciókon lévõ OAc csoportok megtartását igazoljuk. Tetanusztoxoid hordozót alkalmazó konjugátumot szintén készítünk, szintén CDAP konjugálással. MenC konjugátum komponens: C szerológiai csoportba tartozó OAc+ meningococcus kapszuláris szacharidját tisztítjuk és kovalensen kötjük H. influenzae D fehérjéhez, a CDAP technika alkalmazásával. A CDAP-reakció után, a maradék DMAP-tartalmat mérjük. Egy OAc-törzsbõl szintén készítünk konjugátumokat. Tetanusz-toxoid hordozót alkalmazó konjugátumot is készítünk, szintén CDAP konjugálással. A D¹T¹Pw komponenst elkeverjük a HBsAg komponenssel, és ezt a négyértékû keveréket vizes formában ledugózott ampullákba töltjük. A HBsAg-szint 10 mg/dózis. A három konjugátumot a 2. hivatkozásban leírtak szerint keverjük és liofilizáljuk. A liofilizált port ledugózott ampullába töltjük. Minden konjugátum 5 mg/dózis koncentrációban van jelen. Ezen koncentráció kétszeresével szintén készítünk keveréket. A konjugátumkeverék adjuvánsmentes. A két ampullát egy dobozba csomagoljuk össze. A betegnek való beadáshoz a vizes D¹T-Pw-HBsAg anyagot fecskendõbe szívjuk, és a liofilizált konjugátum ampullájába átnyomjuk. Miután a liofilizált anyag feloldódott, visszaszívjuk a fecskendõbe, ezzel az a betegnek történõ beadásra készen áll. Csecsemõknek 3 dózisú elsõdleges vakcinációt adunk 6, 10 és 14 hetes korban, intramuszkuláris injek-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
cióval. Összehasonlításképpen 140 csecsemõ a GSK TRITANRIX¹HepB/Hib oltóanyagát kapja. Az oltóanyag kiváló immunogenitást mutat. Követéses vizsgálatban a csecsemõk 7 értékû oltóanyagot kapnak 6, 10 és 14 hetes korban. A kontrollbetegek TRITANRIX¹HepB/Hib¹t vagy TRITANRIX¹HepB/Hib és MENINGITEC oltóanyagot kapnak. A szérumellenanyag-szinteket ezen elsõdleges vakcinálás elõtt és egy hónappal utána mérjük. Minden egyes oltóanyagdózis után a helyi és szisztémás mellékhatásokat nyolc napig aktívan, majd 30 napig passzívan dokumentáljuk. Az elsõdleges immunizálás után a 7 értékû oltóanyagot kapott alanyok 99%–100% eléri a 0,15 mg/ml anti-PRP szintet, összehasonlítva a 100%-kal a TRITANRIX¹HepB/Hib kontrollcsoportban. A 7 értékû oltóanyagot kapott alanyok 99–100%-ának az SBA-MenC titere 1:8 (szemben a Meningitec¹et kapott alanyok 100%-ával). A 7 értékû oltóanyagot kapott alanyok legalább 97,7%-ának SBA-MenA titere 1:8 (szemben a Meningitec¹et kapott alanyok <10%-ával). A 7 értékû oltóanyag által kiváltott szerológiai védelmi szintek, a diftéria, tetanusz és hepatitis B antigének és az B. pertussis toxoid elleni ellenanyagok koncentrációi magasak, hasonlóan a kontroll-oltóanyagokéhoz. A klinikailag releváns, aktívan/passzívan dokumentált mellékhatások aránya alacsony, és egyenlõen oszlik meg az összes csoport között. A vakcinálással kapcsolatban semmilyen súlyos mellékhatás nem észlelhetõ. A 7 értékû oltóanyag kiváló immunogenitást és jó biztonsági profilt mutat, ami arra utal, hogy alkalmas kombinált oltóanyag lesz a MenA és MenC endemikus régiókban élõ csecsemõk számára. Egy további vizsgálatban 10 hónapos csecsemõkben vizsgáljuk az oltóanyag Hib, MenA és MenC komponensei által kiváltott immunológiai emlékezetet és az ellenanyagszintek állandóságát. Az ellenanyagok perzisztenciája és az immunológiai emlékezet a Hib, MenA és MenC ellen a 7 értékû oltóanyaggal korábban oltott csecsemõkben kiváló: a konjugátumok egyenként 10 mg¹ja a megfelelõ ellenanyagok magas szintjét váltja ki, megmutatva ezzel, hogy a konjugált oltóanyaggal történt elsõdleges oltás megfelelõ, hiszen a válasz magasabb, mint az elõzõleg nem oltott gyermekekben (a MenA és MenC esetében), és hasonló a Hiberix™-hez (a Hib esetében). A találmány példákon keresztül került leírásra, és módosítások végrehajthatók, mindvégig a találmány keretei között maradva.
Hivatkozások [1] Vaccines. (eds. Plotkin & Orenstein). 4th edition, 50 2004, ISBN: 0–7216–9688–0. [2] WO02/00249. [3] Gatchalian et al. (2004) Abstract SI¹68 of Fourteenth International Pathogenic Neisseria Conference. [4] Gatchalian et al. (2004) Abstract SI¹69 of Four55 teenth International Pathogenic Neisseria Conference. [5] WO96/40242. [6] US patent 5693326. [7] Arakere & Frasch (1991) Infect. Immun. 59:4349–4356. [8] Michon et al. (2000) Dev. Biol. 103:151–160. 60 16
1
HU 008 148 T2
[9] Rubinstein & Stein (1998) J. Immunol. 141:4357–4362. [10] Campbell et al. (2002) Pediatr Infect Dis J 21:822–826. [11] Guimaraes et al. (2002) Int J Infect Dis 6:113–117. [12] Lagos et al. (1998) Lancet 351:1472–1476. [13] Fernandez et al. (2000) Am J Trop Med Hyg 62:485–490. [14] Nicol et al. (2002) Pediatr Infect Dis J 21:138–141. [15] WO02/05846. [16] Korean patent 92–9729 (1992–0009729). [17] WO93/24148. [18] WO03/066094. [19] Beuvery et al. (1986) Dev Biol Stand 63:117–28. [20] Sesardic et al. (2001) Biologicals 29:107–22. [21] NIBSC code: 98/560. [22] Module 1 of WHO’s The immunological basis for immunization series (Galazka). [23] NIBSC code: 69/017. [24] NIBSC code: DIFT. [25] Sesardic et al. (2002) Biologicals 30:49–68. [26] NIBSC code: 98/552. [27] NIBSC code: TEFT. [28] NIBSC code: 66/303. [29] Vanlandschoot et al. (2005) J Gen Virol 86:323–31. [30] Ramsay et al. (2001) Lancet 357(9251):195–196. [31] Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28–36. [32] Buttery & Moxon (2000) J R Coll Physicians Lond 34:163–168. [33] Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113–133, vii. [34] Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563–567. [35] European patent 0477508. [36] US patent 5,306,492. [37] WO98/42721. [38] Conjugate Vaccines (eds. Cruse et al.) ISBN 3805549326, particularly vol. 10:48–114. [39] Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques ISBN: 0123423368 or 012342335X. [40] Armand et al. (1982) J. Biol. Stand 10:335–339. [41] Cadoz et al. (1985) Vaccine 3:340–342. [42] Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47–49. [43] Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691–8. [44] Lieberman et al. (1996) JAMA 275:1499–503. [45] WO02/058737. [46] WO03/007985. [47] Rennels et al. (2002) Pediatr Infect Dis J 21:978–979. [48] Campbell et al. (2002) J Infect Dis 186:1848–1851. [49] WO91/18926 and US patents 5858677, 5888517, 5989828, 6025484 & 6139846.
5
2
[50] Janson et al. (1991) Infect Immun 59:119–25. [51] WO00/56360. [52] WO99/42130. [53] W.H.O. Tech. Rep. Ser. 594:51, 1976. [54] Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0–306–44867¹X). [55] WO2004/110480. [56] Sturgess et al. (1999) Vaccine 17:1169–1178.
10 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Oltóanyag-készítmény, mely tartalmazza a kö15 vetkezõket: (i) diftéria-toxoidot, ’D’; (ii) tetanusz-toxoidot, ’T’; (iii) sejtes szamárköhögés-antigént, ’wP’; (iv) b típusú Haemophilus influenzae (’Hib’) kapszuláris szacharidot hordozó fehérjéhez konjugálva; 20 (v) hepatitis B vírus felszíni antigént, ’HBsAg’; és (vi) legalább egy Neisseria meningitidis kapszuláris szacharidot hordozó fehérjéhez konjugálva, ahol a b típusú Haemophilus influenzae kapszuláris 25 szacharid és az N. meningitidis szacharid(ok) mindegyike tetanusz-toxoid hordozó fehérjéhez van konjugálva. 2. Az 1. igénypont szerinti oltóanyag, ahol a (vi) komponens az N. meningitidis A és C szerológiai cso30 portjaiból származó szacharidokat tartalmaz. 3. Az 1. igénypont szerinti oltóanyag, ahol a (iv) komponens konjugátumában a hordozó tömegfeleslegben van, és ahol a szacharidnak a hordozóra vonatkoztatott tömegaránya 1:2 és 1:4 között van. 4. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltó35 anyag, ahol a (iv) komponens konjugátuma a következõ lépéseket tartalmazó eljárással állítható elõ: (a) b típusú Haemophilus influenzae kapszuláris szacharid aktiválása bróm-ciánnal, cianát-észtert eredményezve; 40 (b) adipin-hidrazid távtartó hozzáadása a cianát-észterhez, aktivált szacharidot eredményezve; és (c) az aktivált szacharid kötése hordozó fehérjéhez karbodiimid-kondenzációval. 5. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltó45 anyag, ahol a (iv) komponens konjugátuma a következõ szerkezetû távtartót tartalmazza:
50
6. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltó55 anyag, ahol a (vi) komponens konjugátuma(i) a következõ lépéseket tartalmazó eljárással állítható(k) elõ: (a) meningococcalis kapszuláris szacharid cianát-észtert eredményezõ cianidálása; és (b) a cianát-észter közvetlen kötése hordozó fehérjéhez. 60 17
1
HU 008 148 T2
7. A 6. igénypont szerinti oltóanyag, ahol a meningococcalis kapszuláris szacharid az A szerológiai csoportból származik. 8. A 6. igénypont szerinti oltóanyag, ahol a meningococcalis kapszuláris szacharid a C szerológiai csoportból származik. 9. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol a (vi) komponens konjugátuma(i) C szerológiai csoportból származó, dez-O-acetilált meningococcalis kapszuláris szacharidot tartalmaz(nak). 10. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol a (vi) komponens konjugátuma(i) C szerológiai csoportból származó, O¹acetilált meningococcalis kapszuláris szacharidot tartalmaz(nak). 11. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol a (vi) komponens konjugátuma(i) A szerológiai csoportból származó meningococcalis kapszuláris szacharidot tartalmaz(nak), melyben a mannózamid-maradékok legalább 80%¹a O¹acetilált a C¹3 pozíción. 12. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol az oltóanyag a (iv) komponens konjugátumának 8 mg/ml és 12 mg/ml közötti mennyiségét tartalmazza. 13. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol az oltóanyag egységnyi dózisa a (iv) komponens konjugátumának 8 mg/ml és 12 mg/ml közötti mennyiségét tartalmazza. 14. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol az oltóanyag a (vi) komponens konjugátumainak 8 mg/ml és 12 mg/ml közötti mennyiségét tartalmazza. 15. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol az oltóanyag egységnyi dózisa a (vi) komponens konjugátumainak 8 mg/ml és 12 mg/ml közötti mennyiségét tartalmazza. 16. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol az oltóanyag mind alumínium-foszfát adjuvánst, mind alumínium-hidroxid adjuvánst tartalmaz. 17. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol a HBsAg alumínium-foszfát adjuvánsra van adszorbeálva. 18. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol a diftéria-toxoid alumínium-hidroxid adjuvánsra van adszorbeálva. 19. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol a tetanusz-toxoid alumínium-hidroxid adjuvánsra van adszorbeálva. 20. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol az oltóanyag higanytartalmú konzerválószert és 2¹fenoxi-etanol konzerválószert tartalmaz. 21. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol a diftéria-toxoidnak a tetanusz-toxoidra vonatkoztatott aránya 2:1 és 3:1 között van, Lf egységekben mérve. 22. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol a HBsAg nincs glikozilálva, és olyan részecskék formájában van, melyek foszfolipideket és foszfatidil-inozitolt tartalmazó lipid mátrixot tartalmaznak.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 18
2
23. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol a HBsAg a HBV adw2 altípusából származik. 24. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, ahol az oltóanyag pácienseknek 0,5 ml adagban való beadásra szolgál. 25. Eljárás az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag elõállítására, ahol az eljárás tartalmazza a következõ lépéseket: (a) háromértékû D¹T¹Pw komponens kombinálása egyértékû HBsAg komponenssel, ami négyértékû D¹TPw-HBsAg komponenst eredményez; (b) Hib-konjugátum kombinálása legalább egy meningococcalis konjugátummal, ami kevert konjugátum komponenst eredményez; és (c) a négyértékû D¹T-Pw-HBsAg komponens kombinálása a kevert konjugátum komponenssel, ami az oltóanyagot eredményezi. 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, ahol a háromértékû D¹T¹Pw komponens mind alumínium-hidroxid, mind alumínium-foszfát adjuvánst tartalmaz. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, ahol a háromértékû D¹T¹Pw komponensben lévõ D és T komponensek alumínium-hidroxid adjuvánsra vannak adszorbeálva. 28. A 25–27. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az egyértékû HBsAg komponens alumíniumfoszfát adjuvánsra van adszorbeálva. 29. A 25–28. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a kevert konjugátum komponens nem adjuvált. 30. A 25–29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a háromértékû D¹T¹Pw komponens higanytartalmú konzerválószert tartalmaz. 31. A 30. igénypont szerinti eljárás, ahol a higanytartalmú konzerválószer tiomerzál. 32. A 25–31. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a kevert konjugátum komponens nem tartalmaz higanytartalmú konzerválószert. 33. A 25–32. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az oltóanyag tartalmaz 2¹fenoxi-etanol konzerválószert, de a háromértékû D¹T¹Pw komponens nem tartalmaz 2¹fenoxi-etanol konzerválószert. 34. A 25–33. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a Hib-konjugátum a Hib szacharidnak tetanusz-toxoid hordozóhoz történõ, 1¹etil-3-(3¹dimetilamino-propil)-karbodiimidet alkalmazó konjugálásával, és azután az N¹etil-N’-(3¹dimetil-amino-propil)-urea eltávolításával készül. 35. A 25–34. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a meningococcalis konjugátum(ok) a meningococcalis szacharidnak tetanusz-toxoid hordozóhoz történõ, 1¹ciano-4-(dimetil-amino)-piridiniumot alkalmazó konjugálásával, és azután a 4¹dimetil-amino-piridin eltávolításával készül(nek). 36. Kit az 1–24. igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag-készítmény elõállítására, mely tartalmazza a következõket: (a) elsõ komponenst, mely D, T, wP és HBsAg antigéneket tartalmaz; és
1
HU 008 148 T2
(b) második komponenst, mely Hib- és meningococcalis konjugátumokat tartalmaz, ahol minden egyes konjugátum tetanusz-toxoid hordozó fehérjéhez van konjugálva, ahol a két komponens külön tartályokban van.
5
19
2
37. A 36. igénypont szerinti kit, ahol a második komponensben lévõ konjugátumok liofilizáltak. 38. A 36. igénypont szerinti kit, ahol a második komponens laktózt, szukrózt és/vagy mannitolt tartalmaz.
HU 008 148 T2 Int. Cl.: A61K 39/095
20
HU 008 148 T2 Int. Cl.: A61K 39/095
21
HU 008 148 T2 Int. Cl.: A61K 39/095
22
HU 008 148 T2 Int. Cl.: A61K 39/095
23
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
