!HU000005329T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 005 329
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA G01N 33/561
(21) Magyar ügyszám: E 04 292651 (22) A bejelentés napja: 2004. 11. 09. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040292651 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1531332 A1 2005. 05. 18. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1531332 B1 2008. 12. 24.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 0313246 2003. 11. 12.
(73) Jogosult: SEBIA, 91090 Lisses (FR)
FR
(72) Feltalálók: Robert, Frédéric, 91540 Mennecy (FR); André, Régis, 75013 Paris (FR) (54)
C07K 16/00 G01N 33/68 G01N 27/447
(2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01)
(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Monoklonális proteinek vizsgálata és tipizálása kapilláriselektroforézis és immunáthelyezés („immunodisplacement”) eljárásokkal
(57) Kivonat
HU 005 329 T2
A találmány tárgyát képezi biológiai minták vizsgálata kapilláriselektroforézissel, amely vizsgálat tartalmazza negatív töltésû, módosított ellenanyagok alkalmazását oly módon, hogy azok az elektroforetikus elválasztás során a minta proteinjeinek a migrációs zónáján kívül esõ zónába vándoroljanak, és amely módosított ellenanyagok meghatározott célprotein elleni antigénspecificitást mutatnak. A biológiai minta egyik aliquot részének az összetevõit kapilláriselektroforé-
zissel elválasztják, olyan, negatív töltésû, módosított ellenanyagok jelenlétében, amelyek a mintában feltehetõen jelen levõ proteinnel antigén-ellenanyag komplexet képesek létrehozni, majd az elválasztott összetevõket detektálják. Az elsõ vizsgálatban kapott elektroforetikus profilt összehasonlítják ugyanazon minta elektroforézissel elválasztott összetevõinek a profiljával, módosított ellenanyagok alkalmazása nélkül.
A leírás terjedelme 50 oldal (ezen belül 35 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 005 329 T2
A találmány tárgyát képezi biológiai minták vizsgálata kapilláriselektroforézis és immunáthelyezés („immunodisplacement”) eljárásokkal. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezi biológiai minták kapilláriselektroforézissel történõ vizsgálatára szolgáló eljárás, ahol a minta összetevõinek elektroforetikus elválasztása a minta immunológiai eljárással történõ kezelésével társul. A leírásban az „immunkivonás” kifejezés alatt azt értjük, hogy adott elektroforetikus profilban bizonyos proteineknek megfelelõ csúcsot elnyomunk azáltal, hogy ezt a proteincsúcsot immunáthelyezés révén az elektroforetikus profil egy másik pozíciójába helyezzük át. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezi eljárás, amely alkalmazható diagnosztikai protokollokban, elõnyösen biológiai minták olyan proteinjeinek vizsgálatára és tipizálására, amelyek monoklonális rendellenességekre, más néven monoklonális gammapátiára vagy paraproteinémiára utalnak. A B¹limfociták normális fejlõdése azt eredményezi, hogy érett B¹sejtek felszínén M és G izotípusú immunglobulinok termelõdnek, amelyek idiotípusa kezdetben közös. A plazmocitás rendellenességek, amelyek a monoklonális betegségek eredõ okai, úgy alakulnak ki, hogy szabályozási hiba jön létre a sejtek ellenanyagot szekretáló sejtekké történõ érése folyamatában, a felszíni immunglobulin specifikus antigénnel történõ érintkezését követõen. Ebben a helyzetben, az immunglobulinok, amelyek affinitást mutatnak olyan antigén iránt, amellyel a gazdaszervezet érintkezett, az antigén eltûnését követõen tovább szekretálódnak. Általánosságban, egy adott faj immunglobulinjai különbözõ ellenanyagosztályokba sorolhatók, az egyes osztályokat egy izotípus azonosítja, a különbözõ, azonosított izotípusok közösek a fajhoz tartozó, minden normális egyedben. Az immunglobulinokat általában nehéz láncok (2 nehéz lánc) és könnyû láncok (2 könnyû lánc) építik fel. A négy láncból álló szerkezetben öt nehézlánc-izotípust (M, G, A, D és E) és két könnyûlánc-izotípust (kappa és lambda) azonosítottak. Izotípusuk mellett, az immunglobulinokat az adott faj egyedei közötti eltéréseknek megfelelõ determinánsok jellemzik, amelyeket allotípusnak nevezünk, valamint idiotípusuk, amely az immunglobulin-molekula antigént kötõ egyik részének felel meg. Ennek megfelelõen, az idiotípus jellemzi az ellenanyag-termelõ sejtek adott klónja által termelt molekulákat. A plazmocitómás betegségeket tehát elsõsorban bizonyos immunglobulinok vagy immunglobulinláncok termelõdésének a megváltozása jellemzi, és a változás detektálása és jellemzése nagy klinikai jelentõséggel bír. Adott biológiai minta elektroforézises vizsgálata lehetõvé teszi szérumproteinek, elsõsorban immunglobulinok azonosítását és mennyiségi meghatározását. Elektromos mezõben a proteinek méretük és töltésük szerint vándorolnak, elektroforetikus profilt alkotnak, amely csúcsok (más néven frakciók) sorát tartalmazza, a csúcsok mindegyike egy vagy több proteinnek felel meg. A gammának nevezett frakciót elsõsorban im-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
munglobulinok alkotják, döntõen G típusú immunglobulinok. Monoklonális proteinek (más néven Mc proteinek) szekretálódását kiváltó plazmocitás betegségben szenvedõ egyénekben, az ismert izotípusok egyikének megfelelõ immunglobulinok mennyisége a normál mennyiséghez képest jelentõsen megemelkedhet, ami az elektroforetikus profil változásához vezet azáltal, hogy a szérummintából elválasztott proteinekhez tartozó egy vagy több csúcs módosul. Monoklonális proteinek detektálása, elsõsorban adott immunglobulin-izotípus fokozott termelõdésének a detektálása nagy jelentõséggel bír plazmocitás betegségek vizsgálata esetén, de akkor is, ha paraproteinémiás betegek állapotát követjük nyomon. Megfigyelték például, hogy esettõl függõen és leginkább a tumor fejlõdése alatt, a szérumban az Mc protein mennyisége közvetlenül összefügghet a betegség progressziójával. Ennek megfelelõen, az Mc protein lehet tumormarker, amelyet más tünetekkel összevetve, a diagnózis felállításánál figyelembe lehet venni. Mc proteinek abnormális termelõdése nem csak plazmocitómás betegségekkel jár együtt; Mc proteinek termelõdésével járó kóros rendellenességek közé tartoznak limfoid neoplazmák, mint például a krónikus limfoid leukémia, vagy B¹ vagy T¹limfocitás eredetû limfómák, olyan nem limfoid proliferációk, mint például krónikus mieloid leukémia, valamint az emlõ vagy vastagbél rákjai. Mc proteinek termelõdhetnek továbbá olyan, nem malignus betegségekben, mint például cirrózis, szarkoidózis, parazitózis vagy Gaucher-kór. Detektálhatók továbbá monoklonális proteinek olyan autoimmun betegségekben, mint például reumatoid poliartritisz, miaszténia vagy hideg agglutinin betegség. Az agarózgél- és kapilláriselektroforézis azáltal, hogy lehetõvé teszik biológiai mintákban monoklonális proteinek jelenlétének a detektálását, valamint a detektált monoklonális proteinek változásának a követését az idõben, elõnyös eljárások diagnózis felállításához és betegek állapotának követésére. Adott betegségek szerint, az Mc protein különbözõ természetû lehet, állhat érintetlen ellenanyag-molekulából, vagy ellenanyag fragmensébõl. Ennek megfelelõen, termelõdhetnek kizárólag nehéz láncok, vagy kizárólag könnyû láncok. Ez utóbbi eset áll fenn Bence Jones proteinek esetében, amelyek mielómás betegek vizeletébe szekretálódnak és kizárólag könnyû láncot tartalmaznak. Az immunglobulinok esetében meghatározott izotípusok lehetõvé teszik, hogy nehéz és/vagy könnyû láncuk természete szerint tipizálhatók legyenek. Ennek megfelelõen, az immunglobulinok tipizálására alkalmazott eljárások lehetõvé teszik minden egyes monoklonális proteinnel asszociált nehéz vagy könnyû lánc meghatározását egy adott biológiai mintában. Az Mc proteinek detektálásán túlmenõen, tipizálásuk azért tûnik fontosnak, hogy jellemezhessük az azokkal összefüggõ betegséget. Erre a célra számos megközelítést javasoltak, mint például oszlopkromatográfiás, agarózgél-elektroforézises vagy kapilláris-
1
HU 005 329 T2
elektroforézises eljárásokat. Agarózgél-elektroforézist alkalmazó eljárások esetében, a biológiai mintában található proteineket elektroforézissel választják szét elektroforetikus profil formájában, amelyben a proteinek, és elsõsorban a globulinok, csúcsok vagy csíkok formájában jelennek meg, amelyek tartalmazhatnak Mc proteint, amelynek a természetét ezt követõen meg kell erõsíteni, például agarózgél-immunkötõdés eljárással. Ez az eljárás két lépést kombinál azáltal, hogy elõször agarózgél-elektroforézist, majd immunprecipitációt alkalmaz. Ugyanazon biológiai minta több aliquot részét helyezik fel párhuzamosan agarózgélre, majd elektromos teret alkalmaznak a proteinek, elsõsorban az immunglobulinok elválasztásához. Ezt követõen az egyes sávokat a vizsgált immunglobulinok típusára specifikus ellenanyaggal (IgG, IgA, IgM, kappa és lambda, valamint lehetõség szerint szabad kappa, szabad lambda, IgD és IgE elleni ellenanyaggal) inkubálják, ami a mintában található immunglobulinok és az ellenanyagok között immunkomplexek kialakulásához vezet. Azt követõen, hogy a gélt mossák, hogy eltávolítsák a nem precipitálódott proteineket, egy festési lépés megjeleníti az immunkomplexek pozícióját; monoklonális proteinek hiányában mindössze diffúz festett háttér jelenik meg (amely a „poliklonális háttért” képezõ monoklonális ellenanyagok sokaságának felel meg); monoklonális proteinek jelenlétében festett csíkok jelennek meg a gélspecifikus régiójában. Ezt követõen, (antiszérum nélküli) referenciasáv alkalmazásával a gélen látható monoklonális csík tipizálható. Kapilláriselektroforézis esetében alkalmazott egyik tipizálási eljárás az immunkivonás („immunosoustraction”, „immunosubtraction”), amint azt az US 5 228 960 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti. Ez az eljárás tartalmazza biológiai minták aliquot részeinek inkubálását olyan specifikus antiszérumokkal, amelyek képesek kivonni egy adott összetevõt (például immunglobulint) a mintából. Ez az összetevõ adszorbeálódva marad szilárd fázison, amelyhez az ellenanyagot rögzítették: ennek megfelelõen, már nincs jelen a kapilláriselektroforézissel vizsgált mintában. A különbözõ módon kezelt minták aliquot részeit, amelyekbõl az alkalmazott ellenanyagok specificitásától függõen bizonyos immunglobulinokat kivontak, kapillárisba injektálták, majd a minták aliquot részeiben levõ proteineket úgy választották el, hogy a kapilláris végeire elektromos teret alkalmaztak. A kapott profilokat kezeletlen minta profiljával hasonlították össze. Mintából kapilláriselektroforézissel elválasztott monoklonális proteinek azonosítására alkalmas további eljárásokat javasoltak például az EP B1 0 690 988 európai szabadalmi leírásban. Ez az európai szabadalmi leírás kapilláriselektroforézises elválasztást immunkivonásos lépéssel kombinálja azzal a céllal, hogy lehetõvé tegye Mc proteinek osztályozását. Ebben a szabadalmi leírásban, az immunkivonást „kapillárison belül” végzik el, olyan eljárás alkalmazásával, amely tartalmazza a minta egyik részének különbözõ alkotórészekre történõ elektroforetikus elválasztását és az al-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
kotórészek detektálásának a lépését, majd a minta másik részének elegyítését legalább egy olyan partnerrel, amely képes specifikusan kötni a mintában található, elõre meghatározott analitot, hozzátéve, hogy a kötõpartner elektroforetikus mobilitása eltér az analit elektroforetikus mobilitásától. Ezt követõen, a minta második részét kapilláriselektroforézissel különbözõ alkotóelemeire választják szét, és az alkotóelemeket detektálják. Ezután összehasonlítják az elválasztott alkotórészeket a kívánt analitot kötõ specifikus partner nélkül végzett elválasztás alkotórészeivel. Az EP B1 0 690 988 számú európai szabadalmi leírás ismerteti, hogy az analitot kötni kívánt partner módosított molekula, közelebbrõl Mc protein elleni, módosított ellenanyag, amelyet kémiailag úgy módosítottak, hogy migrációs ideje a kapilláriselektroforézis során kívül helyezi az elektroforetikus profil gamma régiójából. Ellenanyagok kémiai módosítására javasolt egyik eljárás szerint az ellenanyagokat borostyánkõsavanhidriddel reagáltatják, hogy további karbonsavcsoportokat hordozzanak, és alkalikus pH mellett negatív tulajdonságot mutassanak. Az ismertetett vizsgálati körülmények mellett (pH=10), az ellenanyagok összegezett negatív töltése így fokozódik. Az EP B1 0 690 988 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett, ellenanyagok módosítására alkalmazott körülmények és kísérleti eredmények, amelyek nem szérumok vizsgálatát, hanem kizárólag tisztított G immunglobulinok vizsgálatát és elválasztását ismerteti, kétségessé teszi a javasolt eljárás alkalmazhatóságát monoklonális proteinek „valódi” biológiai mintában, például szérumban végzett vizsgálata esetében. A WO 96/33412 számú nemzetközi közzétételi irat vegyületeket, eszközöket és eljárásokat és ismertet ultragyors vizsgálatok végzéséhez kötéssel, elõnyösen kapilláriselektroforézissel. Egyik megvalósítási mód szerint, egy elsõ kötõpartner detektálható jelölést hordoz, és egy másik kötõpartnert (például antitestet) erõs töltés céljából módosítottak. Példákat ismertetnek töltött vegyületekre. Néhány közülük a módosított antitestek minden kémiailag módosított csoportjára egy vagy több negatív töltést visz fel. Vannak közöttük több savas karbonsavcsoportot hordozó polimerek, amelyek kötõágenseken keresztül kapcsolódnak. Olyan, a két kötõpartnerrel kölcsönhatásba lépõ és azokkal kapcsolódó analitot tartalmazó minta érintkeztetése a két kötõpartnerrel a három összetevõ komplexének képzõdését váltja ki. A szabad forma és az elsõ, jelölt kötõpartner komplexéhez kötött forma elektroforetikus mobilitásának a különbsége olyan, hogy lehetõvé teszi az analit elektromos térben történõ késõbbi elválasztását és detektálását. A fenti dokumentumban ismertetett összetevõk, eszközök és eljárások lehetõvé teszik a mintában jelen levõ, adott analit koncentrációjának mennyiségi meghatározását. Az analit lehet monoklonális ellenanyag. Ismertetnek továbbá kiteket és/vagy vizsgálókészleteket. Találmányunk alternatív eljárást javasol, amely hatékonyan alkalmazható biológiai mintákon, és amely
1
HU 005 329 T2
összekapcsolja a kapilláriselektroforézist biológiai minta összetevõinek elválasztására, valamint az immunkivonást, amely lehetõvé teszi a vizsgált biológiai mintában jelen levõ Mc proteinek tipizálását. A találmány szerinti eljárás egyik elõnye, hogy lehetõvé teszi adott biológiai mintában feltételezetten jelen levõ, és kapilláriselektroforézissel elválasztott Mc proteinnek megfelelõ elektroforetikus csúcs áthelyezését a minta proteinjeinek megfelelõ migrációs profilzónán kívülre, elõnyösen a globulinok migrációs zónáján kívülre. Az áthelyezés kivonja az elválasztott Mc proteinnek megfelelõ csúcsot a migrációs lépés végén várt pozíciójából anélkül, hogy a minta többi proteinjének az elválasztását befolyásolná. Az US 5 228 960 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárással szemben, az ellenanyagok által felismert monoklonális protein jelen van a kapilláriselektroforézis elvégzéséhez injektált mintában. A monoklonális proteint egyszerûen kivonjuk a profilból, mivel eredeti pozíciójából áthelyezzük. Ennek következtében, az eljárás lehetõvé teszi a vizsgálat eredményeinek a megbízható leolvasását, valamint elhárít minden, a mintából elválasztott, szomszédos csúcsoknak megfelelõ proteinek közötti azonosítási bizonytalanságot. A találmány tárgyát képezik továbbá kémiailag oly módon módosított ellenanyagok, hogy azok további olyan kémiai csoportokat hordozzanak, amelyek alkalikus pH mellett negatív töltésûek (például karbonsavcsoportokat), azáltal, hogy az ellenanyagok bizonyos kémiai csoportjait módosító ágensekkel reagáltatjuk: a módosított kémiai csoportok mindegyike az ellenanyagot további negatív töltésekkel látja el. Ezeket az ellenanyagokat ezt követõen biológiai mintákban levõ Mc proteineknek megfelelõ csúcsok specifikus immunkivonására és/vagy immunáthelyezésére alkalmazzuk. A kiindulási ellenanyagokkal szemben, amelyek alkalikus pH¹érték mellett eleve negatív töltésûek, a találmány szerint elõállított ellenanyagok további negatív töltést hordoznak alkalikus pH¹érték mellett, mivel további csoportokat, például további karbonsavcsoportokat hordoznak. Ezeket az ellenanyagokat a továbbiakban „negatívan túltöltött, módosított ellenanyagoknak” („anticorps modifiés surchargés négativement”, „negatively surcharged modified antibodies”) vagy „módosított ellenanyagoknak” nevezzük. A találmány tárgyát képezik továbbá vizsgálókészletek, amelyek alkalmasak proteinek biológiai mintából történõ elválasztására kapilláriselektroforézissel, valamint azok detektálására immunkivonásos eljárással, abból a célból, hogy vizsgált biológiai mintában feltehetõen jelen levõ monoklonális proteineket azonosítsák és adott esetben mennyiségileg meghatározzák. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás módosított ellenanyagok elõállítására oly módon, hogy az ellenanyagokra alkalikus pH¹érték mellett negatív töltést mutató, további csoportokat viszünk fel („negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok”) olyan körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik az ellenanyagok alkalmazását immunkivonásos eljárás céljára.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezi eljárás biológiai minta kapilláriselektroforézissel történõ vizsgálatára, amely eljárás tartalmazza negatívan túltöltött ellenanyagok alkalmazását oly módon, hogy azok olyan zónába vándoroljanak, amely kívül esik a biológiai minta elektroforézis során elválasztott proteinjeinek migrációs zónáján, és amely ellenanyagok meghatározott monoklonális protein elleni antigénspecificitást mutatnak. A találmányt a szabadalmi igénypontokban definiáljuk. Adott biológiai minta proteinjeinek elektrolittal töltött kapillárisban történõ elválasztásakor a proteinek elektromos tér hatására vándorolnak: a proteinek az adódtól a katód irányába vándorolnak. Saját elektroforetikus sebességük (a protein töltésétõl függõen) és az elektroozmotikus áramlás (a kapilláris belsõ felszínének a töltésétõl függõen) különbsége teszi lehetõvé, hogy a detektálni kívánt proteineket elválasszuk. A kapillárisba injektált minta proteinjei tehát elektroforetikus migrációs profilt határoznak meg, amely számos zónára osztható fel, amint azt a leíráshoz csatolt ábrák illusztrálják, ezek gamma (katódhoz legközelebbi), béta-2, béta-1, alfa-2, alfa¹1 és albumin (ez utóbbi az anódhoz legközelebbi) zónáknak felelnek meg. A biológiai mintában található immunglobulinok, monoklonális proteineket beleértve, az alfa¹1 zónától a gamma-zónáig vándorolnak. Abból a célból, hogy lehetõvé tegyük adott biológiai mintában található monoklonális proteinek elektroforetikus elválasztását, valamint megbízható tipizálásukat immunkivonásos eljárás alkalmazásával, meghatároztuk az immunkivonás olyan körülményeit, amelyek lehetõvé teszik adott monoklonális proteinnek megfelelõ csúcskivonását a minta proteinjeinek elektroforetikus profiljából (elõnyösen a globulinok migrációs profiljából) és áthelyezését a gamma-zóna és az alfa¹1 zóna közötti régión kívülre. Közelebbrõl, a mintában vizsgált monoklonális proteint nem vonjuk ki a vizsgált közegbõl, hanem áthelyezzük azáltal, hogy olyan, negatívan túltöltött, módosított ellenanyaggal kapcsoljuk, amely azt specifikusan felismeri, és olyan körülmények mellett, hogy a monoklonális protein és a módosított ellenanyag által képezett komplex áthelyezõdik a mintában található globulinok migrációs profilján kívülre (az elektroforetikus profilon a globulinok a gamma, béta-2, béta-1, alfa¹2 és alfa¹1 elektroforetikus frakcióknak felelnek meg). Még közelebbrõl, a monoklonális protein, és az alkalikus pH mellett negatívan túltöltött ellenanyag által képezett komplex az elektroforetikus migrációt követõen az elválasztott proteinek profiljában az anódhoz legközelebbi zónában helyezkedik el. A módosított ellenanyag és a monoklonális protein által képezett komplex így az elválasztott immunglobulinok által meghatározott profilon kívül látható, közelebbrõl, a gamma-zónából az albuminzóna irányába tolódik el, valószínûleg az albumin és alfa¹1 zóna szomszédságában látható anélkül, hogy zavarná bármely, anódhoz közeli mobilitású (azaz alfa¹1 és/vagy
1
HU 005 329 T2
alfa¹2 zónába vándorló) monoklonális protein detektálását, mivel a komplex mobilitása a monoklonális protein és a módosított ellenanyag mobilitása közötti átmenetnek felel meg. A módosított ellenanyagot elvileg fölöslegben adjuk a reakcióelegyhez, és a nem reagált ellenanyag az anódnál látható, az albuminnak megfelelõ csúcs mögött (azaz az albuminon túl vándorol az anód irányában). A találmány szerinti egyik eljárás, amely alkalmas biológiai minta kapilláriselektroforézissel és immunkivonással végzett vizsgálatára, az alábbi lépéseket tartalmazza: a) a biológiai minta egyik aliquot része összetevõinek elválasztását kapilláriselektroforézissel, olyan, negatívan túltöltött, módosított, meghatározott specificitású ellenanyagok jelenlétében, amelyek antigén-ellenanyag típusú komplexet képesek alkotni a biológiai mintában feltehetõen jelen lévõ monoklonális proteinnel, valamint a biológiai minta elválasztott összetevõinek a detektálását; és b) az a) lépésben kapott elektroforetikus profil összehasonlítását ugyanazon biológiai minta másik aliquot része kapilláriselektroforézissel elválasztott összetevõinek elektroforetikus profiljával, negatívan túltöltött, módosított, meghatározott specificitású ellenanyagok jelenléte nélkül. Megfigyelhetõ, hogy a biológiai minták általában tartalmazzák immunglobulinok poliklonális frakcióját, amely „poliklonális hátteret” alkot, és amely az elektroforetikus profil gamma-régiójában (vagy annak közelében) helyezkedik el. Olyan körülmények mellett, amelyek alkalmasak monoklonális proteinek kapilláriselektroforézissel történõ elválasztására, a poliklonális immunglobulinok olyan csúcs formájában jelennek meg, amely nagyobb, mint a monoklonális proteinnek megfelelõ csúcs (mivel a poliklonális csúcs nagyon nagy számú, nagyon hasonló mobilitású immunglobulint tartalmaz); ez a poliklonális háttér csökkenthetõ azáltal, hogy a mintát negatívan túltöltött, módosított ellenanyagokkal érintkeztetjük, az összetevõ immunglobulinok típusától függõen (G, A, M, kappa vagy lambda). A monoklonális csúcs, illetve poliklonális háttér megkülönböztetése ez esetben úgy történik, hogy azonosítjuk a detektálni kívánt, fókuszált monoklonális protein csúcsot a nagy poliklonális csúcshoz viszonyítva. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, párhuzamosan érintkeztetjük egyazon adott biológiai minta aliquot részeit negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok sorozatával, ahol a sorozatba tartozó minden ellenanyagtípus egy immunglobulinizotípus elleni antigénspecificitást mutat. Ennek megfelelõen, az eltérõ specificitású, módosított ellenanyagokkal ugyanazon biológiai minta vizsgálata végezhetõ el, ahol az ellenanyagok specificitását a vizsgált, az ellenanyagok által felismerni kívánt monoklonális proteinektõl, valamint az elektroforézis berendezésre felhelyezett kapillárisok számától függõen választjuk meg.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
A találmány egy további, elõnyös megvalósítási módja szerint, a fentebb ismertetett egyik eljárásnak megfelelõen, a biológiai mintát legalább két aliquot részre osztjuk, és mielõtt a biológiai minta összetevõit elektroforézissel elválasztjuk, az eljárás az alábbiakat tartalmazza: 1) meghatározott specificitású, negatívan túltöltött, módosított ellenanyagot tartalmazó közeg érintkeztetését a biológiai minta egy aliquot részével olyan inkubációs körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik az ellenanyagok és a biológiai mintában feltehetõen jelen levõ, az ellenanyagok által specifikusan felismert célprotein közötti immunológiai reakciót, valamint a biológiai minta egy másik aliquot részének érintkeztetését olyan közeggel, amely azonban módosított ellenanyagoktól mentes; 2) az 1) pont szerint inkubált biológiai minták aliquot részeinek injektálását elektroforézis berendezésre helyezett kapillárisokba. A találmány egy további, elõnyös megvalósítási módja szerint, a kapilláriselektroforézissel végzett vizsgáló eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza, mielõtt a biológiai minta összetevõit elektroforézissel elválasztjuk: 1) meghatározott antigénspecificitású, negatívan túltöltött, módosított ellenanyagokat tartalmazó közeg elektroforéziskapillárisba történõ injektálását, valamint a közeg egy másik, módosított ellenanyagoktól mentes aliquot részének injektálását egy másik elektroforéziskapillárisba; és 2) a biológiai minta injektálását az 1) pont szerint kezelt elektroforéziskapillárisba olyan körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik az ellenanyagok és a biológiai mintában feltehetõen jelen levõ, az ellenanyagok által specifikusan felismert célprotein vagy célproteinek közötti immunológiai reakciót. Adott biológiai minta vizsgálata során, ha a negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok sorozata n típusú, különbözõ, meghatározott specificitású ellenanyagot tartalmaz, a biológiai mintát legalább n+1 aliquot részre osztjuk. Negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok elõállítása céljából alkalmazott ellenanyagokat IgG elleni, IgA elleni, IgM elleni, IgE elleni, IgD elleni, kappa elleni, lambda elleni, szabad kappa elleni és szabad lambda elleni ellenanyagok közül választjuk. Elõnyösen, az ellenanyagokat IgG elleni, IgA elleni, IgM elleni, kappa elleni és lambda elleni ellenanyagok közül választjuk. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, ezt az öt ellenanyagot tartalmazó ellenanyag-sorozatot alkalmazzuk. A találmány egyik további elõnyös megvalósítási módja szerint, az összes ellenanyag elegyét, vagy közülük néhány elegyét alkalmazzuk, például öt ellenanyag elegyét (pentavalens antiszérum), vagy három ellenanyag elegyét (trivalens antiszérum), például amely IgG, IgA vagy IgM nehéz lánc elleni ellenanyagokat tartalmaz. A találmány megvalósítási módja a fent ismertetett ellenanyagok közül mindössze néhánynak az alkalmazására is korlátozódhat.
1
HU 005 329 T2
Abból a célból, hogy a találmány szerint alkalmazható, negatívan túltöltött ellenanyagokat állítsunk elõ, választott antigénspecificitású ellenanyagokat reagáltattunk olyan vegyülettel, amely alkalikus pH¹érték mellett további negatív töltést biztosít, például negatív töltésû anhidriddel. Például reagáltathatjuk az ellenanyagok amincsoportjait anhidriddel, ami minden egyes módosított amincsoport esetében további karbonsavcsoportot (és ezáltal alkalikus pH¹érték mellett további negatív töltést) eredményez. A találmány szerint az anhidrid a reagálás elõtt legalább egy karbonsavcsoportot tartalmaz. A fenti, negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok elõállításához alkalmazott anhidrid elõnyösen benzol-trikarbonsavanhidrid. Ez az anhidrid minden egyes módosított amincsoport esetében két karbonsavcsoportot (és ennek megfelelõen, alkalikus pH¹érték mellett, két további két negatív töltést) hordoz: az egyik csoportot az anhidrid és az amincsoport reakciójának köszönhetõen, a másik csoportot szerkezete alapján. A találmány szerinti anhidridet a továbbiakban negatív töltésû anhidridnek nevezzük, mivel legalább egy, alkalikus pH¹érték mellett negatív töltésû karbonsavcsoportot hordoz. Elegendõ mértékben módosított, azaz alkalikus pH¹érték mellett elegendõ mértékû negatív töltést hordozó ellenanyagokat úgy állítunk elõ, hogy az ellenanyagokat negatív töltésû anhidriddel, elõnyösen benzol-trikarbonsavanhidriddel reagáltatjuk oly módon, hogy az elõzõleg dimetil-formamidban (DMF) oldott anhidridet, elõnyösen benzol-trikarbonsavanhidridet, érintkeztetjük az oldott ellenanyaggal abból a célból, hogy az ellenanyagokra negatív töltéseket vigyünk át, amely reakciót 37 °C¹on végezzük és olyan körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik, hogy a karbonsavcsoportok az ellenanyagokra kapcsolódjanak. Az anhidrid ellenanyagra történõ kapcsolása nagyobb hatékonysággal végezhetõ, ha a DMF-ben oldott anhidridet, további karbonsavcsoportot (és ezáltal alkalikus pH mellett további negatív töltést) hordozó ellenanyagok elõállítása céljából lehetõleg az utolsó pillanatban érintkeztetjük az ellenanyaggal, megakadályozva, hogy az ellenanyagoldatban jelen levõ víz módosítsa az anhidridet. Az alábbiakban a leírásban részletesebben ismertetünk egy eljárást módosított ellenanyagok elõállítására. Abból a célból, hogy további karbonsavcsoportokat (és ezáltal alkalikus pH¹érték mellett további negatív töltéseket) vigyünk fel az ellenanyagra, az egyik megoldás szerint alkalmazhatunk mellitsavat (amely alkalikus pH¹érték mellett negatív töltést biztosít), amelyhez EDCI, vagyis 1¹(3¹dimetil-amino-propil)-3-etil-karbodiimid-hidroklorid kötõágenst adunk. A mellitsav EDCI jelenlétében reagál az ellenanyagok amincsoportjaival. A találmány szerinti kapilláriselektroforézises vizsgáló eljárás során alkalmazott, módosított ellenanyagok általában fölöslegben vannak a célproteinhez viszonyítva, amelyet felismernek, ha a mintában jelen vannak.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
Ez a fölösleg nemcsak a célzott monoklonális protein teljes eltüntetését teszi lehetõvé a proteinprofilból, hanem biztosítja továbbá a módosított ellenanyagok és a monoklonális protein által képezett komplex optimális elhelyezkedését a profilon: a meghatározott antigénspecificitású, módosított ellenanyagok, és a mintában található, a módosított ellenanyagok által felismert célproteinek közötti túl alacsony arány, a magasabb aránnyal szemben, nem teszi lehetõvé a monoklonális proteincsúcs teljes kivonását, és a komplex inkább katód irányába történõ vándorlását eredményezi. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, az egyes specificitásokat mutató, negatív töltésû ellenanyagok immunkivonáshoz alkalmazott koncentrációja körülbelül 10 g/l. A találmány tárgyát képezik továbbá negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok, amelyeket ellenanyagok és legalább két karbonsavcsoportot hordozó anhidrid, elõnyösen 1,2,4-benzol-trikarbonsavanhidrid reagáltatásával állítunk elõ. A kapilláriselektroforézises és immunkivonásos vizsgálati eljárás során alkalmazott ellenanyagokat ennek megfelelõen úgy állítjuk elõ, hogy ellenanyagot reagáltatunk negatív töltésû anhidriddel, amely reakció tartalmazza az anhidrid elõzetes oldását dimetilformamidban (DMF), valamint az oldott anhidrid érintkeztetését oldott ellenanyaggal, hogy lehetõvé tegyük az anhidrid és az ellenanyag reakcióját, a reakciót 37 °C¹on végezzük olyan körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik további kémiai csoportok, elõnyösen karbonsavcsoportok felvitelét az ellenanyagra, amelyek alkalikus pH¹érték mellett negatív töltésûek. A biológiai minták vizsgálatára alkalmas eljárás különbözõ biológiai mintákon végezhetõ, például szérumon, plazmán, vizeleten vagy agy-gerincvelõi folyadékon. Az alkalmazott biológiai minta természetétõl és/vagy eredetétõl (azaz a beteg kórtörténetétõl) függõen, az elektroforézises elválasztás eredményének interpretálása során figyelembe kell venni az interferenciát, amely a negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok és a minta proteinjei között felléphet. Ilyen interferenciát figyelhet meg és elemezhet szakember például fibrinogént tartalmazó minták esetében, nevezetesen véralvadásgátló vegyületekkel kezelt betegekbõl származó szérum- és plazmaminták esetében. Megfigyeltük, hogy a fibrinogén nemspecifikus reakció (azaz nem antigén-ellenanyag típusú reakció) során reagálhat a találmány szerinti, negatívan túltöltött, módosított ellenanyagokkal. Ilyen esetben, amennyiben fibrinogén van jelen, amit a b¹ és g¹zónák közötti csúcs jelöl az elektroforetikus profilon, a minta találmány szerinti, negatívan túltöltött, módosított ellenanyagokkal történõ kezelését követõen ez a csúcs elmozdul megszokott migrációs zónájából, és ez az elmozdulás az alkalmazott negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok specificitásától függetlenül megtörténik. Más szavakkal, a mintában a fibrinogén jelenlétét jelzõ csúcs kizárólag a kontroll elektroforetikus profilon (ELP) jelenik meg, és eltûnik olyan proteinek profiljából, amelyek
1
HU 005 329 T2
a negatívan túltöltött, módosított ellenanyagokkal immunológiai reakción estek át (a profilon kívül esõ zónába történõ immunáthelyezõdés révén). A folyadékfázisú kapilláriselektroforézishez alkalmazott körülmények olyan körülmények, amelyeket szakember szokásosan alkalmaz a minta kapilláriscsõbe történõ injektálás lépése során, valamint a mintából az összetevõk elektroendozmotikus áramlás alatti elektroforetikus migráció révén történõ elválasztás lépése során. Ezek a lépések tartalmazzák olyan elektroforézispufferek alkalmazását, mint amelyeket a WO–A–02/057736 és WO–A–02/057737 számú nemzetközi közzétételi iratok ismertetnek, ahol a puffereket természetesen úgy választották ki, hogy azok lehetõvé tegyék a monoklonális proteinek csúcsok formájában történõ elválasztását. Kapilláriselektroforézis végzéséhez alkalmas körülmények olyan körülmények, amelyek mellett például a Capillarys (SEBIA) automatizált berendezés alkalmazható, ilyen pufferek közé tartoznak például a SEBIA által CAPILLARYS B1B2+, Capillarys protein(e) 6 és CAPILLARYS Protein(e) 5 védjegy alatt forgalmazott pufferek. Például az elektroforetikus vándorláshoz alkalmazott vizsgálati puffer elõnyösen alkalikus puffer, amelynek pH¹értéke a 9–11, elõnyösen 10 körüli tartományba esik, és amely elõnyösen egy pufferkomponenst, és legalább egy, a vizsgálati puffer ionerõsségét fokozó adalékot tartalmaz. Az immunkivonásos lépés végzéséhez alkalmazott ellenanyagok mobilitását érintõ kémiai módosítások hatására, a fentebb ismertetett kapilláriselektroforézises vizsgálati eljárás elhárítja azokat a következményeket, amelyeket a monoklonális proteineknek és a minta protein-összetevõinek az elektroforetikus elválasztás lépés alatti, együttes migrációja eredményez. Ennek megfelelõen, a találmány szerinti eljárás elkerüli a negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok által felismert monoklonális proteinek és a biológiai minta protein-összetevõi közötti interferenciákat. Ez, a monoklonális proteinek biológiai mintából történõ megbízható detektálása során mutatkozó lényeges elõny abból a ténybõl fakad, hogy a monoklonális protein és a módosított ellenanyag által képezett komplex a globulinok mögött vándorol, és így lehetõvé válik a negatívan túltöltött, módosított ellenanyag által felismert monoklonális protein tipizálása, függetlenül a monoklonális proteinnek az elektroforetikus migráció alatt elfoglalt pozíciójától. Ezen túlmenõen, a monoklonális protein és a módosított ellenanyag által képezett komplexnek megfelelõ csúcs immunkivonása teljesen megtörténik abban az értelemben, hogy a monoklonális proteinnek megfelelõ csúcs a továbbiakban nem detektálható a globulinok migrációs profiljának megfelelõ zónában. Ennek következtében, a találmány szerinti eljárás elõnyösen alkalmazható bármely típusú, monoklonális IgG, IgA, IgM, IgD, IgE és immunglobulin szabad láncok detektálására, mobilitásuktól függetlenül, mivel a migrációs profil gamma¹, béta- és alfa-zónái nem interferálnak sem a negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok migrációs zónájával, sem a mintában feltehe-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
tõen jelen levõ monoklonális proteinnel képezett komplexének a migrációs zónájával. A találmány szerinti eljárás tehát alkalmazható biológiai mintában jelen levõ monoklonális proteinek kapilláriselektroforézissel történõ vizsgálatára. Abból a célból, hogy biológiai mintában jelen levõ monoklonális proteineket detektáljunk és tipizáljunk, elõnyösen több kapillárisvizsgálatot végzünk párhuzamosan, a biológiai mintát különbözõ aliquot részekre osztjuk, az aliquot részek száma legalább egyenlõ a monoklonális proteinek vizsgálatához alkalmazott immunglobulin-típusok számával, vagy annál több. Biológiai mintában jelen levõ monoklonális protein tipizálásához szokásosan legalább 6 párhuzamos kapillárisvizsgálatot végzünk. Elõnyösen, a negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok olyan immunglobulinok, amelyek antigénspecificitása az alábbiak közül választott: IgG, IgA, IgM, kappa, lambda és/vagy szabad kappa és/vagy szabad lambda elleni specificitás. Alkalmazhatók továbbá IgD és/vagy IgE elleni immunglobulinok. Azon túlmenõen, hogy a találmány szerinti eljárással a biológiai mintában feltehetõen jelen levõ monoklonális proteinek tipizálhatók, a monoklonális protein, amennyiben jelen van, mennyiségileg is meghatározható. Ebbõl a célból, meghatározzuk a migrációs profilból kivont, a monoklonális proteinnek megfelelõ csúcs területét. A találmány szerinti eljárás alkalmas továbbá az elektroforetikus profilon látható, más proteinek (nem immunglobulinok) azonosítására; alkalmazhatók például humán haptoglobulin, alfa-1-antitripszin, komplement C3, komplement C4, transzferrin, RBP, béta-2mikroglobulin, alfa-1-mikroglobulin elleni, vagy más specificitású ellenanyagok. Ilyen ellenanyagokkal lehetõvé válik adott elektroforetikus profil frakcióját képezõ proteinek azonosítása, vagy normálistól eltérõ mobilitású proteinek adott fenotípusának meghatározása. A leírásban ismertetett találmány nem immunglobulin természetû proteinek detektálására történõ alkalmazásának a körülményei analóg módon alkalmazhatók. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás negatívan túltöltött ellenanyagok elõállítására, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: – legalább egy karbonsavcsoportot tartalmazó anhidrid alkalmi (ex tempore) oldását dimetilformamidban (DMF); – az ellenanyagok érintkeztetését az oldott anhidriddel olyan körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik az ellenanyag és az anhidrid reakcióját abból a célból, hogy alkalikus pH mellett negatívan túltöltött, módosított ellenanyagokat állítsunk elõ. Az anhidrid, amelyet abból a célból választunk, hogy az ellenanyagot alkalikus pH mellett további negatív töltéssel lássa el, olyan anhidrid, amely legalább egy karbonsavcsoportot tartalmaz. Az anhidrid, amelyet abból a célból választunk, hogy az ellenanyagot alkalikus pH mellett további ne-
1
HU 005 329 T2
gatív töltéssel lássa el, elõnyösen benzol-trikarbonsavanhidrid. Negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok elõállítását részletesen ismertetjük a leírás kísérletes részében. Hangsúlyozzuk, hogy annak érdekében, hogy a negatív töltések átvitele hatékony legyen, a fenti lépések elõnyösen tartalmazzák az anhidrid oldását vegytiszta dimetil-formamidban, majd az anhidridoldat elegyítését abban a pillanatban, amikor azt az ellenanyaggal reagáltatjuk, azaz azt követõen. A körülmények betartása megakadályozza, hogy az ellenanyagoldatban levõ víz károsítsa az anhidridet, mivel ez a károsítás befolyásolná a negatív töltésû ellenanyagok elõállításának a hatékonyságát, csökkentve az alkalikus pH mellett negatív töltések hozzáadását. Elõnyösen, az anhidrid és az ellenanyag, közelebbrõl a benzol-trikarbonsavanhidrid és az ellenanyag közötti reakciót például körülbelül egy órán át, 37 °C¹on, vagy olyan megfelelõ hõmérsékleten végezzük, amely lehetõvé teszi az ellenanyagra felvitt anhidridmolekulák számának a növelését. Az anhidriddel való érintkeztetés elõtt, az alkalmazni kívánt ellenanyagot PBS- vagy foszfátpufferoldattal szemben dializáljuk. Ezen túlmenõen, amikor az ellenanyagot DMF-ben oldott anhidridoldattal érintkeztetjük, az elegyhez elõnyösen nátrium-hidroxidot adunk, amely jobban pufferezi a benzol-trikarbonsavanhidrid már jelen levõ karbonsavcsoportjait, valamint azokat, amelyek az anhidrid és az ellenanyag közötti reakció alatt sorban képzõdnek (abból a célból, hogy a reakcióközeget semlegesen tartsuk, hogy lehetõvé tegyük az anhidrid és az ellenanyag amincsoportjai közötti reakció folytatódását). A találmány egyik kiemelten elõnyös megvalósítási módja szerint, a DMF-ben oldott anhidriddel érintkeztetett, PBS-pufferrel vagy foszfátpufferrel (pH=7,4) szemben elõzõleg dializált ellenanyagot 5 N nátrium-hidroxiddal érintkeztetjük, és a hozzáadott nátrium-hidroxid ekvivalensek száma elõnyösen megegyezik a reakció során keletkezett karbonsavcsoportok számával (1), amelyeket az anhidrid szolgáltat (2). A módosított ellenanyagokat ezt követõen olyan közeggel szemben dializáljuk, amely tartósítja az ellenanyagokat, majd az oldatokat megfelelõ munkahígításra állítjuk be (körülbelül 10 g/l), amely olyan körülményeknek felel meg, ahol az ellenanyag/antigén arány optimális. A találmány tárgyát képezik továbbá negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok, azzal jellemezve, hogy olyan felvitt karbonsavcsoportokat tartalmaznak, amelyek azzal a tulajdonsággal ruházzák fel azokat, hogy kapilláriselektroforézis eljárással, azonos elválasztási körülmények mellett, adott biológiai minta immunglobulinjainak migrációs profilján kívülre vándorolnak.* A negatív töltésû ellenanyagok lehetnek monoklonális ellenanyagok. Más megoldás szerint, lehetnek poliklonális ellenanyagok. Az ellenanyag és a minta antigénproteinjei közötti érintkeztetés két módon érhetõ el: a módosított ellen-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
anyag oldatának a biológiai mintával, elõnyösen a hígított biológiai mintával történõ elegyítésével a mintatartóban, elõnyösen a kapillárisba történõ injektálást megelõzõen a „Capillarys” fejben, vagy más megoldás szerint, a módosított ellenanyagoldat, majd a hígított minta kapillárisba történõ, egymást követõ injektálásával. Az érintkeztetés lépésének ez a második módja lehetõvé teszi, hogy antigén/ellenanyag reakció menjen végbe a kapillárison belül („in-capillaire”, „in-capillary”), amely éppen olyan hatékony, mint a két oldat szokásos elegyítése a fejekben vagy más mintatároló eszközben, és amelyet a módosított ellenanyagok és a minta proteinjeinek a mobilitásbeli eltéréseik, valamint a két oldat injektálásának a sorrendje tesz lehetõvé: a módosított ellenanyagok (erõs negatív töltésük miatt) sokkal lassúbb mobilitást mutatnak, mint a minta proteinjei, és elsõnek injektálva, majd a mintát a módosított ellenanyagok után injektálva az történik, hogy a minta áthalad az ellenanyagzónán, ami lehetõvé teszi az ellenanyagok által felismert antigének kivonását a proteinprofilból. A találmány tárgyát képezi továbbá vizsgálókészlet (kit), amely alkalmas monoklonális proteinek biológiai mintából történõ detektálására, amely tartalmazza a találmány szerinti ellenanyagokat és más összetevõket, például az ellenanyagokat tartalmazó közeget, azonban ellenanyagok nélkül (referenciaprofil felvétele céljából), és/vagy elektroforézispuffereket, és/vagy kapillárisok öblítésére szolgáló oldatokat és/vagy specifikus, csökkentett térfogatú hígítófejeket és/vagy a vizsgálandó mintához hígítóoldatot, amely például lehetõvé teszi különbözõ vizsgálatok során kapott eltérõ görbék egymásra helyezését. A készlet adott esetben használati útmutatót tartalmaz elektroforézises és immunáthelyezéses vizsgálat végzésére monoklonális proteinek kimutatása és tipizálása céljából. Elõnyösen, a vizsgálókészlet ellenanyagok sorozatát tartalmazza IgG, IgA, IgM, kappa és lambda elleni specificitással.* Egy más típusú vizsgálókészlet IgG, IgA, IgM, kappa és lambda elleni specificitású ellenanyagok elegyét tartalmazza. Ez az elegy, amelyet pentavalens antiszérumnak hívhatunk, lehetõvé teszi az elektroforetikus profilon megjelenõ, adott csúcs, vagy a profil egy frakciójában található rendellenesség monoklonális természetének a megerõsítését. Ez a vizsgálókészlet különös jelentõséggel bír, mivel a monoklonális immunglobulinok nemcsak a gamma-zónában jelenhetnek meg, hanem a béta- és alfa-zónákban, és azokat a kapott kapilláriselektroforetikus profilban elfedhetik olyan proteinek, amelyek ezekben a zónákban szokásosan megjelennek. A találmány ezen megvalósítási módja szerint, a mintát két nyomon (kapillárisban) vizsgáljuk: egy referencianyomon (amely csak az ellenanyagok közegét tartalmazza, ellenanyagok nélkül), és egy másik nyomon, amely lehetõvé teszi adott monoklonális csúcs jelenlétének a kimutatását az elektroforetikus profilban (pentavalens antiszérum alkalmazásával). Egy további típusú vizsgálókészlet tartalmazhatja nehéz lánc elleni specificitású ellenanyagok elegyét (g,
1
HU 005 329 T2
a és m, azaz IgG, IgA és IgM elleni ellenanyagokat, amelyet nevezhetünk trivalens antiszérumnak) és/vagy kappa és lambda (szabad vagy kötött) könnyû láncok elleni specificitású ellenanyagokat, és/vagy szabad kappa és szabad lambda könnyû láncok elleni specificitású ellenanyagokat. Ez a vizsgálókészlet lehetõvé teszi Bence–Jones-proteinek, vagy monoklonális (kappa vagy lambda) szabad könnyû láncok kapilláriselektroforézissel történõ detektálását és azonosítását emberi vizeletbõl vagy szérumból. E megvalósítási mód szerint, a fenti ellenanyagok alkalmazásakor, a mintát hat nyomon vizsgáljuk: egy referencianyomon (amely csak az ellenanyagok közegét tartalmazza, ellenanyagok nélkül), öt nyomon jellemezzük a monoklonális sávot vagy sávokat: trivalens antiszérum alkalmazásával a nehéz láncok jelenlétét, könnyû láncok elleni szérumok alkalmazásával a könnyûlánc-típusokat (kappa vagy lambda; szabad vagy kötött). Módosított ellenanyagok elegyét elõállíthatjuk úgy, hogy kezeletlen ellenanyagok elegyét módosítjuk, vagy ellenanyagtípusonként elõzõleg már módosított ellenanyagokat elegyítünk össze. A találmány szerint, elõnyösen elõzõleg már negatívan túltöltöttre módosított ellenanyagokat elegyítünk össze. A találmány szerint, az elektroforetikus elválasztás eredményeit ábrázolhatjuk úgy, ahogy azt a példákban tettük, elektroforetikus profilok formájában, ahol a negatívan túltöltött ellenanyagok által specifikus immunológiai reakcióval azonosított proteinnek megfelelõ csúcs eltûnt a profilból. Más megoldás szerint, az eredményeket ábrázolhatjuk olyan elektroforetikus profilok formájában, amelyek csak a negatívan túltöltött ellenanyagok által specifikus immunológiai reakcióval azonosított proteinnek megfelelõ csúcsot mutatják. A találmány szerinti eljárás kivitelezésének a szempontjából, ez a csúcs eltûnik az elválasztott proteinek profiljából. Az eredményeket azonban úgy dolgozzuk fel, hogy csak azt a csúcsot mutassák. Ebbõl a célból, megfelelõ adatfeldolgozási eljárást alkalmazunk, hogy kivonjuk a negatívan túltöltött módosított ellenanyagokkal kezelt, vizsgált minta aliquot részének minden egyes elektroforetikus profilját ugyanazon minta nem kezelt aliquot részének a profiljából. A kezelt aliquot részek egyes profiljainak a kivonása az immunkötõdéssel kapott típus képét eredményezi.* Példák és ábrák Az 1–13. ábrák példákkal illusztrálják monoklonális proteinek biológiai mintákból történõ detektálását és tipizálását, és ezáltal javítják ezen betegségek prognózisát és kezelését. A 2–13. ábrákon a profilok szürke felülete a találmány szerinti ellenanyagok jelenlétében elválasztott szérumproteineket jelzik; az ellenanyagok jelenléte nélkül elválasztott szérumproteinek profilja szintén látható, azonban halványabb vonallal. A találmány szerinti ellenanyagokkal nem kezelt, elválasztott proteinek profiljai külön is láthatók az egyes ábrákon, ELP megjelölés alatt.
2
Kapilláriselektroforézis A klinikai minták kapilláriselektroforézises vizsgálatát 8, egybeolvasztott szilikakapillárissal felszerelt CE berendezéssel végeztük, amelyek belsõ átmérõje 5 25 mikron volt (CAPILLARYS, Sebia). A detektálás 200 nm hullámhosszon történt. A mintákat a berendezés mintaadagolójába helyeztük és hidrodinamikai injektálással automatikusan injektáltuk. A mintákat öt percen belül választottuk el, körülbelül 400 V/cm erõs10 ségû elektromos tér alkalmazásával. Az egyes vizsgálatok elõtt a kapillárisokat 0,25 mol/l koncentrációjú nátrium-hidroxiddal, majd vizsgálati pufferrel öblítettük át.
15 a)
20 b) c) 25 d)
30 e)
f) 35 g)
h) 40 i)
45
Ellenanyagok módosítása benzoltrikarbonsavanhidriddel Tíz ml, 10 g/l koncentrációjú, módosítani kívánt ellenanyagot (humán eredetû IgG, IgA, IgM, kappa vagy lambda elleni, DAKO, Dánia) dializáltunk 100 mmol/l koncentrációjú, foszfáttal pufferezett oldattal (pH=7,4) szemben. 100 mmol/l koncentrációjú 1,2,4-benzol-trikarbonsavanhidridet állítottunk elõ DMF-ben. A dializált ellenanyagoldatot elõször 5 N nátriumhidroxiddal, majd a DMF-ben oldott anhidriddel elegyítettük (213 ml 5 N nátrium-hidroxid+10 ml ellenanyagoldat+5,33 ml DMF-ben oldott anhidrid). A reakcióelegyet ezt követõen rázóberendezésen kíméletes mozgatás mellett inkubáltuk 37 °C¹on, 1 órán át. Az elegyet ezt követõen foszfátpufferoldattal (100 mmol/l, pH=7,4) szemben dializáltuk, a dializálóoldatot többször cserélve. A dialízist követõen a zsákot PEG 6000 porba helyeztük 1 órán át. Miután a koncentrálás befejezõdött, a zsákot foszfátot (100 mmol/l, pH=7,4) és 1 g/l nátrium-nitridet tartalmazó oldattal szemben dializáltuk. A zsák tartalmának térfogatát foszfátot (100 mmol/l, pH=7,4) és 1 g/l nátrium-nitridet tartalmazó oldattal 10 ml¹re egészítettük ki. Az így kapott oldatot 0,45 mm porozitású membránon szûrtük, majd 4 °C¹on tároltuk. Bármely más tárolóközeg megfelelõ, feltéve, hogy ionerõssége elegendõ az ellenanyagok tartósításához (azaz közel áll a fiziológiás konyhasóoldatéhoz).
Ellenanyagok módosítása mellitsavval a) Tíz ml, 10 g/l koncentrációjú, módosítani kívánt ellenanyagot (humán eredetû IgG, IgA, IgM, kappa vagy lambda elleni, DAKO, Dánia) dializáltunk 50 40 mmol/l koncentrációjú, foszfáttal pufferezett oldattal (pH=7,4) szemben. b) Ötven ml/ml mennyiségben 5 N nátrium-hidroxidot adtunk hozzá. 55 c) Tizennyolc mg/ml mennyiségben mellitsavat, majd 50 mg/ml mennyiségben EDCI reagenst adtunk hozzá. d) A reakcióelegyet ezt követõen rázóberendezésen kíméletes mozgatás mellett inkubáltuk 37 °C¹on, 1 órán át. 60 9
1
HU 005 329 T2
e) Az elegyet ezt követõen foszfátpufferoldattal (100 mmol/l, pH=7,4) szemben dializáltuk, a dializálóoldatot többször cserélve. f) A dialízist követõen a zsákot PEG 6000 porba helyeztük 1 órán át. g) Miután a koncentrálás befejezõdött, a zsákot foszfátot (100 mmol/l, pH=7,4) és 1 g/l nátrium-nitridet tartalmazó oldattal szemben dializáltuk. h) A zsák tartalmának térfogatát foszfátot (100 mmol/l, pH=7,4) és 1 g/l nátrium-nitridet tartalmazó oldattal 10 ml¹re egészítettük ki. i) Az így kapott oldatot 0,45 mm porozitású membránon szûrtük, majd 4 °C¹on tároltuk. Szérumok immuntipizálása A Capillarys (Sebia) olyan berendezés, amely párhuzamosan 8 kapillárisvizsgálatot végez. Az immuntipizáló fej elõnyösen tipizálásra alkalmas Capillarys fej, amely 6 db, 100 ml térfogatú tárolóból, és egy 400 ml térfogatú dupla tárolóból áll. Az 1. tároló 60 ml, 100 mmol/l koncentrációjú foszfátpuffert, a 2. tároló 60 ml módosított, IgG elleni ellenanyagot, a 3. tároló 60 ml módosított, IgA elleni ellenanyagot, a 4. tároló 60 ml módosított, IgM elleni ellenanyagot, az 5. tároló 60 ml módosított, kappa-könnyûlánc elleni ellenanyagot, a 6. tároló 60 ml módosított, lambda-könnyûlánc elleni ellenanyagot, és a 7/8. dupla tároló 380 ml immuntipizáló hígítót tartalmaz (0,02 mol/l benzil-alkoholt a Sebia által alkalmazott vizsgálati pufferben). a) A tipizálni kívánt szérum csövét a Capillarys hordozó 1. pozíciójába helyezzük, amelyre „immuntipizáló” fejet erõsítettünk. b) A hordozót csatlakoztatjuk a berendezéshez: automatikus gépezet 1:20 arányban hígítja a szérumot a 7/8. dupla tárolóban, a dupla tároló tartalmát homogenizálja, majd 40 ml¹es aliquot részeket oszt szét az 1–6. tárolók mindegyikébe, majd a tárolók tartalmának mindegyikét homogenizálja. c) Ezt követõen, a kapilláriselektroforézis vizsgálatot az alábbi körülmények mellett végeztük: A vizsgálati puffer lehet Sebia Capillarys B1B2+ vagy Sebia Capillarys Protein Puffer; B1B2+ puffer esetében: hõmérséklet: 32 °C, migrációs feszültség: 7 kV, akvizíciós ablak: 100–235 másodperc, injektálás: 250 mbar 5 másodpercen át; Sebia Capillarys Protein(e) puffer esetében: hõmérséklet: 37 °C, migrációs feszültség: 6,5 kV, akvizíciós ablak: 110–275 másodperc, injektálás: 250 mbar 5 másodpercen át; d) A vizsgált szérum tipizálása céljából az 1. tároló esetében kapott vizsgálati eredményt összehasonlítjuk az öt további tároló esetében kapott eredményekkel. Adott szérumok esetében alkalmazott vizsgálati körülmények Abban az esetben, ha a szérum gamma-frakciójának a szintje alacsony, a b) pont szerinti hígítás mértéke 1:10. A gamma-frakció szintjét akkor tekintjük alacsonynak, ha Capillarys berendezésen, B1B2+ pufferrel végzett vizsgálata ezzel a pufferrel a normál érték-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
nél alacsonyabb, azaz körülbelül 10% alatti (vagyis <7,5 g/l) értéket mutat. Abban az esetben, ha a szérum gamma-frakciójának a szintje magasabb, mint körülbelül 20 g/l, a b) pont szerinti hígítás mértéke 1:40. Protokoll változása szérumok immuntipizálása során: kapillárison belüli immunkivonás Ebben az esetben két fejet alkalmazunk: Egy fej 6 tárolót tartalmaz, amelyek az alábbiakat tartalmazzák: az 1. tároló 100 ml, 100 mmol/l koncentrációjú foszfátpuffert, a 2. tároló 100 ml módosított, IgG elleni ellenanyagot, a 3. tároló 100 ml módosított, IgA elleni ellenanyagot, a 4. tároló 100 ml módosított, IgM elleni ellenanyagot, az 5. tároló 100 ml módosított, kappa-könnyûlánc elleni ellenanyagot, a 6. tároló 100 ml módosított, lambda-könnyûlánc elleni ellenanyagot; Egy, szérum hígítására szolgáló fej 7 tárolót tartalmaz, amely 380 ml immuntipizáló hígítót (0,02 mol/l benzil-alkoholt a Sebia által alkalmazott vizsgálati pufferben) tartalmaz a 7/8. dupla tárolóban. a) Az antiszérumfejet tartalmazó elsõ hordozót csatlakoztatjuk a berendezéshez; ezt követõen, automatikus gépezet injektálja az ellenanyagokat a kapillárisokba (250 mbar, 5 másodperc alatt). b) Az 1. pozícióban levõ, szérumot tartalmazó csövet és a szérumhígító fejet tartalmazó, második hordozót csatlakoztatjuk a berendezéshez: az automata gépezet ezt követõen elvégzi az 1:20 arányú hígítást a 7/8. dupla tárolóban, a tároló tartalmát homogenizálja, majd szétosztja az 1–6. tárolókba (tárolónként az 1:20 arányban hígított szérum 40 ml¹ét, plusz 60 ml vizsgálati puffert); a hígított szérumokat ezt követõen a kapillárisokba injektálja (250 mbar, 5 másodperc alatt). c) A vizsgálati puffer lehet Sebia Capillarys B1B2+ puffer vagy Sebia Capillarys Protein(e) puffer: B1B2+ puffer esetében: hõmérséklet: 32 °C, migrációs feszültség: 7 kV, akvizíciós ablak: 100–235 másodperc; Sebia Capillarys Protein(e) puffer esetében: hõmérséklet: 37 °C, migrációs feszültség: 6,5 kV, akvizíciós ablak: 110–275 másodperc. d) A vizsgált szérum tipizálása céljából az 1. tároló esetében kapott vizsgálati eredményt összehasonlítjuk az öt további tároló esetében kapott eredményekkel.
Eredmények 1. példa: Humán eredetû IgG elleni ellenanyag (Dako) vizsgálata 1,2,4-benzol-trikarbonsavanhidriddel 50 történt módosítás elõtt és után, Capillarys berendezésen, Sebia Capillarys B1B2+ puffer alkalmazásával (akvizíciós ablak: 105–350 másodperc); az ellenanyag módosítása erõsen késleltette annak vándorlását: a migrációs idõ 122 másodpercrõl 267 másodpercre vál55 tozott (1a. és 1b. ábra). 2. példa: Béta¹2 vándorlású, A lambda típusú monoklonális proteint tartalmazó szérum immuntipizálása Capillarys berendezésen, Sebia B1B2+ puffer alkalmazásával (akvizíciós ablak: 100–235 másodperc): a szé60 rum hat aliquot részét elegyítettük öt, 1,2,4-benzol-tri10
1
HU 005 329 T2
karbonsavanhidriddel módosított, (IgG, IgA, IgM, kappa és lambda elleni) ellenanyaggal és ellenanyagot nem tartalmazó közeggel (ellenanyagok nélkül: ELPnyom). Az ELP-nyommal történõ összehasonlítás (feketében; 2. ábra) az IgA és lambda elleni ellenanyagokkal kezelt aliquot részek esetében világosan mutatja a monoklonális csúcs eltûnését a béta¹2 pozícióból. Más nyomok esetében mindössze a poliklonális háttér csökkenése figyelhetõ meg. Megfigyelhetõ továbbá, hogy nincs ineterferencia az immunkomplexek és módosított ellenanyagok, valamint a globulinok migrációja között. A gamma elõtt vándorló csúcs egy injektált marker, amely megkönnyíti a profilok egymásra illesztését. 3. példa: Béta¹1 vándorlású G lambda típusú monoklonális proteint tartalmazó szérum immuntipizálása Capillarys berendezésen, Sebia B1B2+ puffer alkalmazásával (akvizíciós ablak: 100–235 másodperc): a szérum hat aliquot részét elegyítettük öt, 1,2,4-benzol-trikarbonsavanhidriddel módosított, (IgG, IgA, IgM, kappa és lambda elleni) ellenanyaggal és ellenanyagot nem tartalmazó közeggel (ellenanyagok nélkül: ELPnyom). Az ELP-nyommal történõ összehasonlítás (feketében; 3. ábra) az IgG és lambda elleni ellenanyagokkal kezelt aliquot részek esetében világosan mutatja a monoklonális csúcs eltûnését a béta¹1 pozícióból. Más nyomok esetében mindössze a poliklonális háttér csökkenése figyelhetõ meg. Megfigyelhetõ továbbá, hogy nincs ineterferencia az immunkomplexek és módosított ellenanyagok, valamint a globulinok migrációja között. A gamma elõtt vándorló csúcs egy injektált marker, amely megkönnyíti a profilok egymásra illesztését. 4. példa: Béta¹1 és béta¹2 közötti vándorlású A kappa típusú monoklonális proteint tartalmazó szérum immuntipizálása Capillarys berendezésen, Sebia B1B2+ puffer alkalmazásával (akvizíciós ablak: 100–235 másodperc): a szérum hat aliquot részét elegyítettük öt, 1,2,4-benzol-trikarbonsavanhidriddel módosított, (IgG, IgA, IgM, kappa és lambda elleni) ellenanyaggal és ellenanyagot nem tartalmazó közeggel (ellenanyagok nélkül: ELP-nyom). Az ELP-nyommal történõ összehasonlítás (feketében; 4. ábra) az IgA és kappa elleni ellenanyagokkal kezelt aliquot részek esetében világosan mutatja a monoklonális csúcs eltûnését a béta-1/béta¹2 pozícióból. Más nyomok esetében mindössze a poliklonális háttér csökkenése figyelhetõ meg. Megfigyelhetõ továbbá, hogy nincs ineterferencia az immunkomplexek és módosított ellenanyagok, valamint a globulinok migrációja között. A gamma elõtt vándorló csúcs egy injektált marker, amely megkönnyíti a profilok egymásra illesztését. 5. példa: Gamma vándorlású G lambda típusú monoklonális proteint tartalmazó szérum immuntipizálása Capillarys berendezésen, Sebia B1B2+ puffer alkalmazásával (akvizíciós ablak: 100–235 másodperc): a szérum hat aliquot részét elegyítettük öt, 1,2,4-benzol-trikarbonsavanhidriddel módosított, (IgG, IgA, IgM, kappa és lambda elleni) ellenanyaggal és ellenanyagot nem tartalmazó közeggel (ellenanyagok nélkül: ELPnyom). Az ELP-nyommal történõ összehasonlítás (feketében; 5. ábra) az IgG és lambda elleni ellenanya-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 11
2
gokkal kezelt aliquot részek esetében világosan mutatja a monoklonális csúcs eltûnését a gamma pozícióból. Más nyomok esetében mindössze a poliklonális háttér csökkenése figyelhetõ meg. Megfigyelhetõ továbbá, hogy nincs ineterferencia az immunkomplexek és módosított ellenanyagok, valamint a globulinok migrációja között. A gamma elõtt vándorló csúcs egy injektált marker, amely megkönnyíti a profilok egymásra illesztését. 6. példa: Béta¹1 és béta¹2 közötti vándorlású A lambda típusú monoklonális proteint tartalmazó szérum immuntipizálása Capillarys berendezésen, Sebia B1B2+ puffer alkalmazásával (akvizíciós ablak: 100–235 másodperc): a szérum hat aliquot részét elegyítettük öt, 1,2,4-benzol-trikarbonsavanhidriddel módosított, (IgG, IgA, IgM, kappa és lambda elleni) ellenanyaggal és ellenanyagot nem tartalmazó közeggel (ellenanyagok nélkül: ELP-nyom). Az ELP-nyommal történõ összehasonlítás (feketében; 6. ábra) az IgA és lambda elleni ellenanyagokkal kezelt aliquot részek esetében világosan mutatja a monoklonális csúcs eltûnését a béta-1/béta¹2 pozícióból. Más nyomok esetében mindössze a poliklonális háttér csökkenése figyelhetõ meg. Megfigyelhetõ továbbá, hogy nincs ineterferencia az immunkomplexek és módosított ellenanyagok, valamint a globulinok migrációja között. A gamma elõtt vándorló csúcs egy injektált marker, amely megkönnyíti a profilok egymásra illesztését. 7. példa: Gamma vándorlású M kappa típusú monoklonális proteint tartalmazó szérum immuntipizálása Capillarys berendezésen, Sebia B1B2+ puffer alkalmazásával (akvizíciós ablak: 100–235 másodperc): a szérum hat aliquot részét elegyítettük öt, 1,2,4-benzol-trikarbonsavanhidriddel módosított, (IgG, IgA, IgM, kappa és lambda elleni) ellenanyaggal és ellenanyagot nem tartalmazó közeggel (ellenanyagok nélkül: ELPnyom). Az ELP-nyommal történõ összehasonlítás (feketében; 7. ábra) az IgM és kappa elleni ellenanyagokkal kezelt aliquot részek esetében világosan mutatja a monoklonális csúcs eltûnését a gamma pozícióból. Más nyomok esetében mindössze a poliklonális háttér csökkenése figyelhetõ meg. Megfigyelhetõ továbbá, hogy nincs ineterferencia az immunkomplexek és módosított ellenanyagok, valamint a globulinok migrációja között. A gamma elõtt vándorló csúcs egy injektált marker, amely megkönnyíti a profilok egymásra illesztését. 8. példa: Gamma vándorlású szabad lambda típusú monoklonális proteint tartalmazó szérum immuntipizálása Capillarys berendezésen, Sebia B1B2+ puffer alkalmazásával (akvizíciós ablak: 100–235 másodperc): a szérum nyolc aliquot részét elegyítettük hét, 1,2,4benzol-trikarbonsavanhidriddel módosított, (IgG, IgA, IgM, kappa, lambda, szabad kappa és szabad lambda elleni) ellenanyaggal és ellenanyagot nem tartalmazó közeggel (ellenanyagok nélkül: ELP-nyom). Az ELPnyommal történõ összehasonlítás (feketében; 8. ábra) a lambda és szabad lambda elleni ellenanyagokkal kezelt aliquot részek esetében világosan mutatja a monoklonális csúcs eltûnését a gamma pozícióból. Más nyomok esetében mindössze a poliklonális háttér csökkenése figyelhetõ meg. Megfigyelhetõ továbbá, hogy
1
HU 005 329 T2
nincs ineterferencia az immunkomplexek és módosított ellenanyagok, valamint a globulinok migrációja között. A gamma elõtt vándorló csúcs egy injektált marker, amely megkönnyíti a profilok egymásra illesztését. 9. példa: 1,2,4-Benzol-trikarbonsavanhidriddel vagy mellitsav/EDCI eleggyel módosított, humán eredetû IgG elleni ellenanyaggal kapott immuntipizálás összehasonlítása gamma vándorlású G kappa típusú monoklonális proteint tartalmazó szérumon, Capillarys berendezésen, Sebia B1B2+ puffer alkalmazásával (akvizíciós ablak: 100–235 másodperc): a szérum három aliquot részét elegyítettük két, 1,2,4-benzol-trikarbonsavanhidriddel vagy mellitsav/EDCI eleggyel módosított, humán eredetû IgG elleni ellenanyaggal és ellenanyagot nem tartalmazó közeggel (ellenanyagok nélkül: ELP-nyom). Az ELP-nyommal történõ összehasonlítás (feketében; 9. ábra) a két módosított ellenanyagokkal kezelt aliquot részek esetében világosan mutatja a monoklonális csúcs eltûnését a béta¹1 pozícióból. Mindkét esetben megfigyelhetõ továbbá, hogy nincs interferencia az immunkomplexek és módosított ellenanyagok, valamint a globulinok migrációja között. A gamma elõtt vándorló csúcs egy injektált marker, amely megkönnyíti a profilok egymásra illesztését. 10. példa: Gamma vándorlású G kappa típusú monoklonális proteint tartalmazó szérum kapillárison belüli immuntipizálása Capillarys berendezésen, Sebia B1B2+ puffer alkalmazásával (akvizíciós ablak: 100–235 másodperc): ellenanyagközeget (ellenanyag nélkül) és öt (IgG, IgA, IgM, kappa és lambda elleni), 1,2,4-benzol-trikarbonsavanhidriddel módosított ellenanyagot helyeztünk az elsõ fejbe, a szérum hat aliquot részét hígítottuk injektálási markert tartalmazó, Sebia Capillarys B1B2+ pufferben (2. fej). Az ellenanyagokat, majd a hígított szérumaliquotokat kapillárisokba injektáltuk és elvégeztük a hat migrációt. Az ELP-nyommal történõ összehasonlítás (feketében; 10. ábra) az IgG és kappa elleni ellenanyagokkal kezelt szérumaliquotok esetében világosan mutatja a monoklonális csúcs eltûnését a gamma pozícióból. Más nyomok esetében mindössze a poliklonális háttér csökkenése figyelhetõ meg. Megfigyelhetõ továbbá, hogy nincs interferencia az immunkomplexek és módosított ellenanyagok, valamint a globulinok migrációja között. A gamma elõtt vándorló csúcs egy injektált marker, amely megkönnyíti a profilok egymásra illesztését. 11. példa: Pentavalens antiszérum (1,2,4-benzoltrikarbonsavanhidriddel módosított, IgG, IgA, IgM, kappa és lambda elleni ellenanyagok) alkalmazása béta¹1 pozíció mellett vállat képezõ csúcs monoklonális természetének az igazolására szérumból, Capillarys berendezésen, Sebia Capillarys B1B2+ pufferrel végzett vizsgálattal (akvizíciós ablak: 100–235 másodperc): a szérum két aliquot részét pentavalens ellenszérummal és az ellenanyagok közegével (ellenanyagok nélkül) elegyítettük. Az ELP-nyommal történõ összehasonlítás (feketében; 11. ábra) a pentavalens ellenszérummal kezelt nyomok esetében világosan mutatja a béta¹1 pozícióban vállat képezõ csúcs eltûnését, ami a csúcs monoklonális természetére utal (M
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2
kappa típusú monoklonális protein). Ezen szérum esetében megfigyelhetõ továbbá a poliklonális háttér eltûnése, a béta¹2 frakció hiánya, valamint hogy nincs interferencia az immunkomplexek és módosított ellenanyagok, valamint a globulinok migrációja között. A gamma elõtt vándorló csúcs egy injektált marker, amely megkönnyíti a profilok egymásra illesztését. 12. példa: Gamma vándorlású szabad lambda típusú monoklonális proteint tartalmazó szérum immuntipizálása Capillarys berendezésen, Sebia B1B2+ puffer alkalmazásával (akvizíciós ablak: 100–235 másodperc): a szérum hat aliquot részét 1,2,4-benzol-trikarbonsavanhidriddel módosított, öt ellenanyaggal [trivalens ellenszérummal (IgG, IgA és IgM elleni ellenanyagok elegyével) és kappa, lambda, szabad kappa és szabad lambda elleni ellenanyagokkal] és az ellenanyagok közegével (ellenanyagok nélkül: ELP nyom) elegyítettük. Az ELP-nyommal történõ összehasonlítás (feketében; 12. ábra) a trivalens ellenszérummal kezelt nyom esetében világosan mutatja, hogy a poliklonális háttér eltûnt, ellentétben a monoklonális csúccsal. Ezzel párhuzamosan, a monoklonális csúcs eltûnését figyeltük meg a lambda elleni és szabad lambda elleni ellenanyagokkal kezelt nyomok esetében. A kappa elleni és szabad kappa elleni ellenanyagokkal kezelt nyomok esetében csak a poliklonális háttér csökkenését figyeltük meg. Megfigyeltük továbbá a szérumban a béta¹2 frakció hiányát, valamint hogy nincs interferencia az immunkomplexek és módosított ellenanyagok, valamint a globulinok migrációja között. A gamma elõtt vándorló csúcs egy injektált marker, amely megkönnyíti a profilok egymásra illesztését. 13. példa: Gamma vándorlású, M kappa típusú monoklonális proteint tartalmazó szérum immuntipizálása Capillarys berendezésen, Capillarys Protein(e) puffer alkalmazásával (akvizíciós ablak: 110–275 másodperc): a szérum hat aliquot részét 1,2,4-benzol-trikarbonsavanhidriddel módosított, öt ellenanyaggal (IgG, IgA, IgM, kappa és lambda elleni ellenanyagokkal) és az ellenanyagok közegével (ellenanyagok nélkül: ELP nyom) elegyítettük. Az ELP-nyommal történõ összehasonlítás (feketében; 13. ábra) az IgM és kappa elleni ellenanyagokkal kezelt nyomok esetében világosan mutatja, hogy a monoklonális csúcs eltûnt. A többi nyomon csak a poliklonális háttér csökkent. Megfigyeltük továbbá, hogy nincs interferencia az immunkomplexek és módosított ellenanyagok, valamint a globulinok migrációja között. A gamma elõtt vándorló csúcs egy injektált marker, amely megkönnyíti a profilok egymásra illesztését.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás biológiai minta kapilláriselektroforézissel történõ vizsgálatára, amely eljárás módosított, negatívan túltöltött ellenanyagok alkalmazását tartalmazza oly módon, hogy azok az elektroforézis alatt, az elválasztás során a biológiai minta globulinjainak migrációs 60 zónáján kívül elhelyezkedõ zónába vándorolnak, és 55
12
1
HU 005 329 T2
amely ellenanyagok meghatározott monoklonális célproteinek elleni antigénspecificitást mutatnak, és amelyeket (i) EDCI [1¹(3¹dimetil-amino-propil)-3-etil-karbodiimid-hidroklorid] jelenlétében mellitsavval, vagy (ii) legalább egy karbonsavcsoportot tartalmazó anhidriddel reagáltatva állítunk elõ. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás biológiai minta kapilláriselektroforézises vizsgálatára, amely tartalmazza az alábbi lépéseket: a) a biológiai minta egyik aliquot része összetevõinek elválasztását kapilláriselektroforézissel olyan, negatívan túltöltött, módosított, meghatározott antigénspecificitású ellenanyagok jelenlétében, amelyek antigén-ellenanyag típusú komplexet képesek képezni monoklonális proteinnel, amely jelen lehet a biológiai mintában, majd a biológiai minta elválasztott összetevõinek a detektálását; és b) az a) lépésben kapott elektroforetikus profil összehasonlítását ugyanazon biológiai minta másik aliquot része kapilláriselektroforézissel – a negatívan túltöltött, módosított, meghatározott specificitású ellenanyagok jelenléte nélkül – elválasztott összetevõinek elektroforetikus profiljával. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol negatívan túltöltött, módosított ellenanyagokat alkalmazunk, amely ellenanyagok különbözõ antigénspecificitású ellenanyagok sorozatát alkotják, és amelyeket a biológiai minta ugyanazon aliquot részeivel érintkeztetünk abból a célból, hogy a minta összetevõit kapilláriselektroforézissel elválasszuk. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, ahol az ellenanyag-sorozatot alkotó minden ellenanyagtípus az immunglobulinok egyetlen izotípusa elleni, meghatározott antigénspecificitást mutat. 5. A 2–4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás legalább két aliquot részre osztott biológiai minta kapilláriselektroforézises vizsgálatára, amely a biológiai minta összetevõinek elektroforézissel történõ elválasztását megelõzõen tartalmazza az alábbi lépéseket: 1) meghatározott antigénspecificitású, negatívan túltöltött, módosított ellenanyagot tartalmazó közeg érintkeztetését a biológiai minta egy aliquot részével olyan inkubációs körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik az ellenanyagok és az ellenanyagok által specifikusan felismert, monoklonális célprotein közötti immunológiai reakciót, amennyiben azok jelen vannak a biológiai mintában, valamint a biológiai minta egy másik aliquot részének érintkeztetését olyan közeggel, amely azonban módosított ellenanyagoktól mentes; 2) az 1) lépés szerinti, inkubált biológiai minták aliquot részeinek injektálását az elektroforéziskapillárisba. 6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás biológiai minta összetevõinek kapilláriselektroforézissel történõ elválasztására, amely eljárás a biológiai minta összetevõinek elektroforézissel történõ elválasztását megelõzõen az alábbi lépéseket tartalmazza: 1) meghatározott antigénspecificitású, negatívan túltöltött, módosított ellenanyagot tartalmazó közeg
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 13
2
injektálását az elektroforéziskapillárisba, valamint módosított ellenanyagot nem tartalmazó közeg injektálását egy másik elektroforéziskapillárisba; 2) a biológiai minta injektálását az 1) lépés szerint kezelt elektroforéziskapillárisba olyan körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik az ellenanyagok és az ellenanyagok által specifikusan felismert monoklonális célprotein vagy monoklonális célproteinek közötti immunológiai reakciót, amennyiben jelen vannak a biológiai mintában. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amely szerint, ha a különbözõ, meghatározott specificitású, negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok sorozata n számú ellenanyagot tartalmaz, a biológiai mintát legalább n+1 aliquot részre osztjuk. 8. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ellenanyag IgG elleni, IgA elleni, IgM elleni, kappa elleni és lambda elleni ellenanyagok közül választott. 9. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy IgG elleni ellenanyagokat, IgA elleni ellenanyagokat, IgM elleni ellenanyagokat, kappa elleni ellenanyagokat, lambda elleni ellenanyagokat, szabad kappa elleni ellenanyagokat és szabad lambda elleni ellenanyagokat alkalmazunk. 10. Az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a negatívan túltöltött, módosított ellenanyag fölöslegben van a monoklonális célproteinhez vagy célproteinekhez képest, amelyet vagy amelyeket felismer, ha az vagy azok jelen van vagy vannak a biológiai mintában. 11. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok 1,2,4-benzol-trikarbonsavanhidriddel történt reakció termékei. 12. Az 1–11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a negatívan túltöltött ellenanyag legalább egy karbonsavcsoportot tartalmazó anhidrid és az ellenanyag reakciójának a terméke, amely reakció tartalmazza az anhidrid azonnali (ex tempore) feloldását dimetil-formamidban (DMF), majd az oldott anhidrid érintkeztetését az ellenanyaggal oldatban, hogy az anhidrid és az ellenanyag reagáljanak, és amely reakciót 37 °C¹on végezzük olyan körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik negatív töltések felvitelét az ellenanyagra. 13. Az 1–12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a kapilláriselektroforézist 9–11 pH¹tartományú, alkalikus pufferben végezzük, amely pufferhatású vegyületet és legalább egy olyan adalékot tartalmaz, amely fokozza a vizsgálati puffer ionerõsségét. 14. Az 1–13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a biológiai minta az alábbiak közül választott: plazma, vizelet vagy agy-gerincvelõi folyadékminták. 15. Az 1–13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a biológiai minta szérumminta. 16. Eljárás monoklonális proteinek (Mc proteinek) vizsgálatára és tipizálására biológiai mintában, amely tartalmazza a biológiai minta különbözõ aliquot részeinek az 1–15. igénypontok bármelyike szerinti, kapillá-
1
HU 005 329 T2
riselektroforézissel végzett vizsgálatát oly módon, hogy az egyes aliquot részeket rendre IgG elleni, IgA elleni, IgM elleni, kappa elleni, lambda elleni, szabad kappa elleni vagy szabad lambda elleni ellenanyagok közül választott immunglobulinokkal érintkeztetjük, amelyeket negatív töltésûekre módosítottunk. 17. Eljárás monoklonális proteinek (Mc proteinek) vizsgálatára és tipizálására biológiai mintában, ahol a biológiai mintában levõ monoklonális protein jelenlétét a monoklonális proteinnek megfelelõ csúcsnak a biológiai minta proteinjeinek az elektroforetikus profiljából történõ immunkivonásával detektáljuk, ahol a negatívan túltöltött, módosított ellenanyag és az Mc protein által képzett komplex migrációja a biológiai minta globulinjainak elektroforetikus profilján kívülre esik, és ahol a negatívan túltöltött ellenanyagokat (i) EDCI [1¹(3¹dimetilamino-propil)-3-etil-karbodiimid-hidroklorid] jelenlétében mellitsavval, vagy (ii) legalább egy karbonsavcsoportot tartalmazó anhidriddel reagáltatva állítunk elõ. 18. Eljárás negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok elõállítására, amely tartalmazza az alábbi lépéseket: – legalább egy karbonsavcsoportot tartalmazó anhidrid alkalmi (ex tempore) feloldását dimetilformamidban (DMF); – az ellenanyagok érintkeztetését az oldott anhidriddel olyan körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik az ellenanyag és az anhidrid reakcióját abból a célból, hogy alkalikus pH mellett negatívan túltöltött, módosított ellenanyagokat kapjunk. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, ahol az anhidrid benzol-trikarbonsavanhidrid. 20. A 18. vagy 19. igénypont szerinti eljárás, ahol az anhidridet alkalmilag (ex tempore) oldjuk fel vegytiszta DMF-ben. 21. Negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok, azzal jellemezve, hogy a savas csoportok az ellenanyagokra lettek felvive úgy, hogy azonos kapilláriselektroforézises elválasztási körülmények mellett elvá-
5
10
15
20
25
30
35
14
2
lasztva, az IgG, IgA, IgM, IgE és IgD immunglobulinok migrációs profilján kívül történõ elektroforetikus migráció képességével ruházzuk fel azokat, és a savas funkciós csoportokat úgy visszük fel a ellenanyagokra, hogy azokat (i) EDCI [1¹(3¹dimetil-amino-propil)-3-etilkarbodiimid-hidroklorid] jelenlétében mellitsavval, vagy (ii) legalább egy karbonsavcsoportot tartalmazó anhidriddel reagáltatjuk. 22. A 21. igénypont szerinti, negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok, amelyeket a 18–20. igénypontok bármelyike szerinti eljárással állítunk elõ. 23. A 21. vagy 22. igénypontok bármelyike szerinti, negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok, amelyek IgG elleni, IgA elleni, IgM elleni, kappa elleni, lambda elleni, szabad kappa elleni és szabad lambda elleni immunglobulinok közül választottak. 24. A 21. vagy 22. igénypontok bármelyike szerinti, negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok, amelyeket a negatívan túltöltött, módosított, IgG elleni, IgA elleni, IgM elleni, kappa elleni és lambda elleni ellenanyagokat tartalmazó pentavalens antiszérum, vagy a negatívan túltöltött, módosított, IgG elleni, IgA elleni és IgM elleni ellenanyagokat tartalmazó, trivalens antiszérum formájában elegyítünk. 25. A 21–24. igénypontok bármelyike szerinti, negatívan túltöltött, módosított ellenanyagok, azzal jellemezve, hogy azok poliklonális ellenanyagok. 26. Készlet monoklonális proteinek detektálására és tipizálására biológiai mintában, amely készlet a 21–25. igénypontok bármelyike szerinti, negatívan túltöltött, módosított ellenanyagokat, valamint megfelelõ hígítóanyagot tartalmaz. 27. A 21–25. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagok alkalmazása biológiai mintában jelen levõ monoklonális proteinek detektálására kapilláriselektroforézis és immunáthelyezés eljárásokkal. 28. A 21–25. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagok alkalmazása biológiai mintában jelen levõ monoklonális proteinek tipizálására.
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
15
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
16
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
17
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
18
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
19
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
20
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
21
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
22
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
23
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
24
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
25
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
26
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
27
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
28
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
29
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
30
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
31
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
32
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
33
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
34
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
35
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
36
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
37
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
38
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
39
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
40
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
41
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
42
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
43
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
44
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
45
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
46
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
47
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
48
HU 005 329 T2 Int. Cl.: G01N 33/561
49
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
