!HU000005756T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 005 756
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 51/04
(21) Magyar ügyszám: E 03 749396 (22) A bejelentés napja: 2003. 09. 02. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030749396 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1536844 A1 2004. 03. 18. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1536844 B1 2009. 03. 04.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 02078743 2002. 09. 03.
(73) Jogosult: UNIVERSITY OF ZURICH, 8006 Zürich (CH)
EP
(72) Feltalálók: ALBERTO, Roger, CH-8400 Winterthur (CH); MUNDWILER, Stefan, CH-5000 Aarau (CH) (54)
(2006.01) A61K 51/12 (2006.01) C07F 1/08 (2006.01) C07F 13/00 (2006.01) C07F 15/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04022105 PCT/US 03/027665
(74) Képviselõ: dr. Fehérvári Flóra, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Eljárás M(CO)3-komplexek elõállítására szilárd fázisú módszerrel, szilárd hordozóról fémmel elõsegített hasítás útján
(57) Kivonat
HU 005 756 T2
A találmány vízoldható fémmel komplexált anyag elõállítási eljárására vonatkozik, amelynek során egy (I) képletû, szerves fázishoz kötött szerves konjugátumot egy [M(H 2 O 3 )CO 3 ] n+ -ionnal érintkeztetnek az [M(H2O3)CO3]n+-ion és a szilárd fázishoz kötött szerves konjugátum tercier amin nitrogénatomja közötti
koordinációs kötés kialakításához megfelelõ körülmények között, ezáltal az így képzõdött fémmel komplexált anyag felszabadul a hordozóról. A találmány kiterjed az (I) képletû konjugátumra és az eljárás végrehajtására alkalmas kitre.
A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 9 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 005 756 T2
A találmány a rádiofarmakonok területére vonatkozik. Közelebbrõl a találmány egy fémmel komplexált anyag szilárd hordozóról fémmel elõsegített lehasítás útján történõ elõállítására vonatkozik. A találmány kiterjed egy ligandum és egy biomolekula új szilárd fázishoz kötött konjugátumára. A találmány kiterjed továbbá új, fémmel komplexált ligandum-biomolekula konjugátumokra, ezen új komplexeket tartalmazó készítményekre és ezek alkalmazására. A találmány kiterjed továbbá egy, diagnosztikai vagy terápiás gyógyszerészeti készítmény elõállítására alkalmas kitre. Radiojelzett bioaktív molekulák, például klinikai rutindiagnózisban vagy ¹terápiában használt peptidek alkalmazásánál nagyon kívánatos, hogy csak jelzett vegyületeket injektáljunk a megfelelõ receptorok in vivo telítõdésének vagy a „hideg” jelzetlen vegyületek toxikus mellékhatásainak elkerülése céljából. Továbbá, a nagy mennyiségû jelzetlen biomolekulák receptorokhoz történõ kötõdése zavarja a tiszta képalkotást (szcintigrammokat), és így gyakran lehetetlenné teszi a világos diagnózist. A technika állásából ismert, hogy egy normális homogén jelzési eljárásban csak akkor érhetõ el nagymértékben specifikus aktivitás, ha a derivatizált biomolekulákat (vagy a 99mTc-hez alkalmazott ligandumot, amely a biomolekulához kapcsolódik) a lehetõ legkisebb olyan mennyiségben (koncentrációban) használjuk, amelynél még kvantitatív jelzés érhetõ el. A ligandumtól és a komplex prekurzortól függõen ezeknek a mennyiségeknek gyakran viszonylag magasnak kell lenniük, mivel kis koncentrációknál a komplexképzés sebessége másodrendû kinetika szerint zajlik, és így a jelzés túl lassú, és a ligandum vagy a 99mTc prekurzor bomlása kíséri. A legalacsonyabb koncentrációhatár rutin alkalmazásra gyakran nem megfelelõ, mivel ilyen koncentrációknál a körülmények (hõmérséklet, idõ) kismértékû megváltozása nem eredményez kvantitatív jelzési hatásfokot. Ennek megfelelõen a végtermékoldatban mellék- és bomlástermékek, valamint kiindulási anyagok lesznek jelen. A „hideg” vegyület „forró” vegyülettõl történõ fizikai elválasztásának szokásos módja a ligandum-biomolekula konjugátum szilárd fázisú anyaghoz történõ kapcsolása, valamint onnan történõ lehasítása, amellyel egyidejûleg komplex képzõdik. A szilárd fázisról ilyen, fémmel elõsegített lehasításra ritkán találunk példát. Az US–5,789,555 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (Pollak és munkatársai) eljárást ismertettek peptidek technécium-99m-mel, rénium-186-tal vagy rénium-188-cal történõ jelzésére. Az eljárás peptidek szilárd hordozóhoz történõ kovalens kapcsolásának lépéseit foglalja magában, amelynek során tioétert kapcsoltak maleimid-összekötõ csoporttal. A hordozóra pertechnetátot vittek fel, így egy 99mTcV(=O)-peptid komplex képzõdött. Komplexképzõdés közben a 99mTcV(=O) a C–S kötés felhasításával katalizálta a peptid lehasadását a hordozóról, ezáltal a 99mTcV(=O)-peptid komplex felszabadult a hordozóról.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
A szakirodalomban ismert, hogy a védett tiolokról a védõcsoportot egy Tc=O centrummal való koordináció útján szabadul fel. Ezen felismerések alapján Pollak és munkatársai [lásd J. Am. Chem. Soc. 121, 11 593–11 594 (1999)] négyfogú kelátképzõt tioéterkötéssel kötöttek aranyfelülethez. A Tc(V) ezen ligandummal való koordinációja során a 99mTc-komplex szelektíven felszabadult az oldatba az S–Au kötés felszakadásával, miközben a kén a Tc¹vel koordinációba lépett. Nemrégiben Dunn-Dufault és munkatársai [lásd Nucl. Med. Biol. 27, 803–807 (2000)] ennek az eljárásnak olyan változatát ismertették, ahol a kelátképzõt kovalensen kötötték egy szerves polimer hordozóhoz. A Tc¹vel és Re¹vel jelzett szerves komplexek elõállítására alkalmas fent említett eljárások mindegyike egy C–S vagy Au–S kötés hasításától függ. Ez a C–S és Au–S kötés, amellyel a ligandum kovalensen kötõdik a szilárd hordozóhoz, oxidációra érzékeny. Ezért a C–S kötéssel kovalensen kötõdõ ligandumokat tartalmazó szilárd hordozókat redukálókörülmények között kell tartani. Ez különösen hosszú idejû tárolás esetében igaz. A redukálókörülmények között történõ tároláshoz további lépésekre van szükség a tárolás során. Ezen túlmenõen, ha a hordozókat gyógyszerben alkalmazható vegyületek elõállítására szeretnék használni, redukálószerek jelenléte nagyon nemkívánatos a gyógyszerészetben betartandó biztonságosság szempontjából. Ezért az ismert szilárd anyaghoz kötött ligandumok ilyen célra történõ alkalmazásánál bizonyos megkötésekre van szükség. Ezen túlmenõen az ilyen fém-oxid-speciesek alkalmazásánál az ezekkel alkalmazható ligandumokra vonatkozóan megkötések vannak, nevezetesen hogy ezek négyfogúak. Innen eredhet, hogy a 99mTcV(=O) centrummal együtt használható peptidligandumok szakirodalmában egyetlen leírás található. Schibli és munkatársai [lásd Bioconjugate Chem. 11, 3445 (2000)] számos többfogú komplex oldatban végrehajtott szintézisét ismertették [99mTc(OH2)3(CO)3]+-ion alkalmazásával. Schibli és munkatársai [Bioconjugate Chem. 13, 750 (2002)] többfogú komplexek oldatfázisú szintézisét ismertették [188Re(H2O)3(CO)3]+-ion alkalmazásával. Seifert és munkatársai [Inorg. Chim. Acta 322, 79 (2001)] Tc(I) tioéter-karbonil-komplexek oldatfázisú szintézisét és az oldatfázisban lévõ ligandum hisztidinnel való cserereakcióját ismertették. La Bella és munkatársai [Bioconjugate Chem. 13, 599 (2002)] egy jelzett bombesin-analóg oldatban történõ elõállítását ismertették [99mTc(OH2)3(CO)3]+-ion alkalmazásával. Jang és munkatársai [J. Korean Nucl. Soc. 34, 146 (2002)] számos biomolekula oldatban történõ rádiojelzését ismertették [99mTc(OH2)3(CO)3]+-ion alkalmazásával. Langer és munkatársai [Bioconjugate Chem. 12, 1028 (2001)] hasonló megközelítést ismertettek rádiojelzett Y neuropeptidszármazékok oldatban történõ elõállítására. Rénium-trikarbonil-komplexek oldatban történõ szintézisét ismertették Correia és munkatársai (NEt4)2[ReBr3(CO)3] alkalmazásával [Inorg. Chem. 40, 5147 (2001)]. Jelzett cukorszármazékok oldatban történõ elõállítását ismer-
1
HU 005 756 T2
tették Petrig és munkatársai [M(H2O)3(CO)3]+ (M=Tc, Re) ion alkalmazásával [Chem. Eur. J. 7, 1868 (2001)]. Faller és munkatársai réniumkomplexek foszfortartalmú háromfogú ligandummal történõ elõállítását ismertették Re(CO)5 Br¹oldatban történõ alkalmazásával [J. Organometallics Chem. 626, 181 (2001)]. Alberto és munkatársai [99mTc(OH2)3(CO)3]+-ion bifunkciós háromfogú ligandummal végbemenõ szilárd fázisú reakcióját is ismertették [J. Am. Chem. Soc. 120, 7987 (1998)]. Stor és munkatársai Re(CO)3 diimintartalmú komplexek oldatfázisú szintézisét ismertették [Organometallics 14, 1115 (1995)]. A Tc(CO)3-tartalmú komplexek szilárd fázisú szintézisét is ismertették Alberto és munkatársai [Radiochimica Acta 63, 153 (1993)]. Wijnkoop és munkatársai a komplexek szilárd fázisú elõállítását ismertették Ru(CO)3-alapú prekurzor alkalmazásával [Organometallics 11, 3607 (1992)]. A WO01/00637 számú nemzetközi közzétételi iratban számos (VII) oszlopba tartozó átmenetifém komplex oldat fázisú szintézisét írták le [M(CO)3(OH)2)3]+-ion prekurzor alkalmazásával, valamint a szintézis végrehajtására alkalmas kittel együtt. Hasonló a tárgya a WO01/89586 számú nemzetközi közzétételi iratnak. Oldatból elõállított Tc(CO)3 és Re(CO)3 komplexeket ismertettek az EP1013642 számú európai szabadalmi leírásban. Biomolekula szilárd fázisú módosítását ismertették Kheyong és munkatársai [Tetrahedron Lett. 38, 973 (1997)]. Azonban a biomolekula szilárd hordozóról történõ hasítása során fémet nem használtak, õk olyan nemspecifikus lépést hajtottak végre, amelyben pusztán sav jelenlétére volt szükség. Tehát fennáll az igény fémmel jelzett komplexek szilárd fázisú technikával, a szilárd hordozóról fémmel elõsegített hasítással végrehajtott elõállítására alkalmas új eljárásra, amely olyan szilárd fázishoz kötött biomolekula-ligandum konjugátumok alkalmazásával végezhetõ, amelyek gyógyszerészetileg elfogadható körülmények között stabilabbak, mint a szakirodalomból ismert konjugátumok. Ezen túlmenõen azért elõnyös, ha a fémmel komplexált ligandum-biomolekula konjugátumok szilárd fázisú módszerrel fémmel elõsegített hasítás útján történõ elõállításában további ligandumok állnak rendelkezésre, mert ez a módszer rugalmasabb alkalmazhatóságát biztosítja. A jelen találmány tárgya jelzett diagnosztikai és terápiás vegyületek elõállítására alkalmas javított módszerek rendelkezésre bocsátása. A jelen találmány kidolgozásával kapcsolatos kutatások során azt találtuk, hogy bizonyos, fémmel koordinálható és szilárd hordozóhoz tercier amincsoporttal kötött szerves molekulák (ligandumok) [Tc(H2O)3(CO)3]+ion jelenlétében lehasadnak a szilárd hordozóról [Tc(CO)3-ligandum]-komplexek képzõdése közben. A C–N kötés szelektív hidrolitikus hasítását nyilvánvalóan a komplexképzõdés közben képzõdõ alacsony vegyértékû [Tc(H2O)(CO)3]+ karbonilcentrum közvetíti, és ez ugyanilyen reakciókörülmények között [99mTc(H2O)3(CO)3]+-ion távollétében nem következik be. A szilárd hordozóról való felszabadulás után a ko-
5
10
15
20
25
30
2
rábbi tercier amin koordinált szekunder amin formában van jelen. A [Tc(CO)3-ligandum]-komplex mechanizmusa feltételezésünk szerint az alábbi. Mivel a szilárd anyaghoz kötött kelátképzõ tercier aminocsoportja (az úgynevezett ligandum) az [M(H2O)3(CO)3]n+-ion fémkation centrumához koordinálódik, így részben pozitívvá válik, és ezért a szomszédos szénatom nukleofil támadáshoz aktivált állapotba kerül. A maradék hidroxilcsoport megtámadja a kelátképzõ metiléncsoportját, és kiváltja a C–N kötés hasadását (2. ábra). A kelátképzõ harmadik donor helye a fémcentrumhoz koordinálódik, és a termékként képzõdõ komplex felszabadul az oldatba. A komplexet nem alkotó kelátképzõ és a lehasítatlan komplex a szilárd fázishoz kötve marad. Azt találtuk, hogy a [99mTc(H2O)3(CO)3]+-iont tartalmazó szilárd hordozóról a ligandum fent ismertetett hidrolitikus hasításával kapott jelzett vegyületek nagyon nagy specifikus aktivitást mutatnak, azaz nagyon kevés komplexálatlan ligandum van az oldatban. A komplexálatlan ligandum mennyisége az oldatban 10–7 mol/l nagyságrendû. Ezért ezen specifikus hasadási reakció elõnyös módon technécium és egyéb hasonló kémiai reaktivitással rendelkezõ fémkomplexek úgynevezett „hordozóanyag hozzáadása nélküli” („no carrier added”, n.c.a.) elõállítására használható. Tehát a találmány egy fémmel komplexált anyag elõállítására alkalmas új eljárásra vonatkozik, amelynek során egy (I) képletû, szilárd fázishoz kötött szerves konjugátumot
35
40
45
50
55
60 3
(I) ahol: a gömb jelentése szilárd fázisú hordozó; C jelentése metiléncsoport; R4 és R5 jelentése egymástól függetlenül a H¹atom, alifás helyettesítõk, aromás helyettesítõk, RO, RS és (R)2N képletû csoportok, ahol R jelentése alifás csoport vagy arilcsoport, közül van kiválasztva; L jelentése összekötõ csoport vagy egyes kötés, amely összekötõ csoport – amennyiben jelen van – a szilárd hordozóhoz van kötve és a C csoport nukleofil támadásánál aktiváló tulajdonságú; és R1 és R2 helyettesítõk azonosak vagy különbözõk, és jelentésük fémet koordináló csoport vagy nem koordináló szerves csoport, egy biológiailag aktív molekulával derivatizált fémet koordináló csoport vagy egy biológiailag aktív molekulával derivatizált nem koordináló szerves csoport, egy (II) [M(H2O)3(CO)3]n+-ionnal érintkeztetjük, ahol M jelentése a technécium (Te), rénium (Re), ródium (Rh), ruténium (Ru), platina (Pt), irídium (Ir) és réz (Cu) csoportjából van kiválasztva; és n értéke 1, 2 vagy 3 a fémtõl függõen; az [M(H2O)3(CO)3]n+-ion és a szilárd fázishoz kötött szerves konjugátum tercier amin nitrogénatomja között koordinációs kötés kialakításához
1
HU 005 756 T2
megfelelõ körülmények között, ezáltal az így képzõdött fémmel komplexált anyag felszabadul a hordozóról. Összekötõ csoport vagy van jelen vagy nincs jelen. Jelen lehet már a hozzáférhetõ hordozóban vagy hozzáadható késõbb is. Amikor jelen van, elõnyösen a C¹atomon végbemenõ nukleofil támadásban jó aktiválócsoportként mûködik, és a fenil¹, vinil¹, aril- és egyéb nem alifás vagy alifás csoportok közül van kiválasztva. A fenil¹, vinil¹, aril¹, egyéb nem alifás vagy alifás csoportok helyettesítve lehetnek, és ha helyettesítettek, akkor a helyettesítõk elõnyösen egy az OR, R, NR2 – ahol R jelentése alifás vagy arilcsoport – elektronszívó csoportok közül vannak kiválasztva. Egy elõnyös kiviteli alak szerinti az összekötõ csoport a (II) képlettel szemléltethetõ
5
10
15
20
(II) ahol X1 jelentése O és X2 jelentése mindegyik elõfordulási helyén H atom vagy egy elektronszívó helyettesítõ, azzal a megkötéssel, hogy legalább az egyik X2 csoport jelentése egy elektronszívó helyettesítõ, elõnyösen egy –OCH3 csoport. Amikor R1 és R2 vagy R1 és R2 egyike egy nem koordináló szerves csoport, akkor ezek alkil¹, fenilvagy benzilcsoport vagy ezek származékai közül választhatók. R1¹et és/vagy R2¹t elõnyösen a következõket tartalmazó csoportból választjuk
25
R3–NH2 ahol R3 jelentése egy 1–3 szénatomot tartalmazó alifás lánc. Az M fém jelentése a Tc¹, Re¹, Ru¹, Rh¹, Ir¹, Cu¹ és Pt¹atomokat tartalmazó csoportból van kiválasztva. A fém legelõnyösebben 99mTc, 186Re vagy 188Re. A fém elõnyösen leképezõ anyagként, például nagy energiájú részecskék vagy paramágneses karakterisztikák átvitelére vagy radionukleotidként alkalmazható. A [M(H2O)3(CO)3]n+-ion bármilyen, a szakirodalomban ismert megfelelõ eljárással elõállítható. [M(H2O)3(CO)3]n+-ion elõállítására alkalmas módszerek például az Alberto és munkatársai által [J. Am. Chem. Soc. 123, 3135–3136 (2001)] vagy a WO 98/48848 számú nemzetközi közzétételi iratban (Alberto és munkatársai) ismertetett permetalátképzés. A szilárd hordozó nélküli (I) képletû molekulát a jelen leírásban ligandumnak nevezzük. A ligandum lehet egy háromfogú ligandum, ha R1¹et és R2¹t
40
30
35
45
50
55
60 4
2
R3–NH2 csoportjából választjuk, de kétfogú kelátképzõnek is nevezhetjük, ha R1 és R2 vagy ezek egyike alifás vagy aromás nem koordináló csoport. A találmány szerinti megoldásban az [M(H2O)3(CO)3]n+-ionnal kombinációban használt ligandumok különbözõ háromfogú ligandumok lehetnek, a fõ követelmény ezekkel szemben, hogy a ligandum központi részeként egy tercier amincsoport legyen jelen, amely a szilárd hordozóval összekapcsolt C–N kötést alkotja és komplexképzõdés közben elhasad. Donorokként elõnyösen alifás vagy aromás aminokon vagy karboxilátokon vagy ezek kombinációján alapuló ligandumokat használunk. A ligandum kétfogú kelátképzõ is lehet, ha R1 és R2 – de nem mindkettõ – nem koordináló alifás vagy aromás csoport. Ezt a 10. példában mutatjuk be. Közelebbrõl, a jelen találmány szerinti megoldásban ligandumként használható a dietilén-triamin, a pikolil-amin-N-ecetsav, az N¹(2¹amino-etil)-glicin vagy az imino-diecetsav. A ligandum a szilárd hordozóhoz kovalensen kapcsolható oly módon, hogy elõször elõállítjuk a halogénezett gyantát például Ngu és Patel által ismertetett eljárással [Tet. Lett. 38, 973–976 (1997)]. Ezután ezt a halogénezett gyantát a védett ligandummal reagáltatjuk. A védõcsoport eltávolítása után ligandumhoz kötött gyantát kapunk. Ha a ligandumot a szilárd fázishoz ezen eljárással kapcsoljuk, a szilárd hordozóhoz kapcsolódó kovalens kötés egy C–N kötés lesz. A ligandum a szilárd hordozón is szintetizálható egy aminogyantából kiindulva, például az 5., 6., 8. és 9. példában ismertetett reduktív aminálással és/vagy alkilhalogenidekkel végzett alkilezéssel. A felvitt gyanta elõállítását részletesebben ismertetjük az 1–9. példákban. A jelen leírásban a ligandum kifejezés egy olyan vegyületre vonatkozik, amely legalább egy, fémmel koordinációs kötés kialakítására alkalmas fémet koordináló atomot tartalmaz és stabil fém-ligandum komplexet alkot. Az egynél több fémet koordináló atomot tartalmazó ligandumot kelátképzõnek vagy többfogú ligandumnak nevezhetjük. A kétfogú ligandumok olyan ligandumok, amelyek két fémkoordinációs atomot tartalmaznak, a háromfogú ligandumok olyan ligandumok, amelyek három fémkoordinációs atomot tartalmaznak, és a négyfogú ligandumok olyan ligandumok, amelyek négy fémkoordinációs atomot tartalmaznak. A ligandumhoz kapcsolható biológiailag aktív molekula (ezt „biomolekulának” is nevezzük) bármilyen molekula lehet, amely diagnózisban vagy terápiában aktivitást mutat. A molekula bármilyen helyzetben kapcsolható, kivéve a szilárd hordozóhoz kapcsolódó nitrogént. A molekula lehet egy olyan célba juttató molekula, amely a radioaktív terméket azon helyre irányítja, amelyet diagnosztizálni vagy kezelni szeretnénk, vagy
1
HU 005 756 T2
rendelkezhet terápiás hatással, amely független a rádiojelzéstõl. A biológiailag aktív molekula a következõket tartalmazó csoportból választható: aminosavak, szteroidok, proteinek, meghatározott szerkezetû proteinek, enzimek vagy antitestek; szénhidrátok; poliszacharidok és oligoszacharidok; nukleozidok, nukleotidok, oligonukleotidok és polinukleotidok; lipidek, peptidek és gyógyhatású kis molekulák, például központi idegrendszeri receptorhoz kötõdõ vegyületek. A biomolekula a ligandumhoz bármilyen, a szakterületen ismert megfelelõ módszerrel hozzákapcsolható, például egy aldehidnek egy ligandum kimer aminocsoportjával történõ reduktív aminálásával vagy az arilrendszerre egy kötõdési hely bevitelével. A biomolekula a ligandumhoz hozzákapcsolható a ligandum szilárd hordozóhoz történõ kötése elõtt vagy után. Arra a felismerésre jutottunk, hogy a szilárd hordozó megfelelõ kiválasztásával tovább javítható a találmány szerinti eljárás hatékonysága. A szilárd hordozónak duzzadnia kell vízben, a reakciókörülmények között stabilnak kell lennie és nem tartalmazhat fémet koordináló egységeket. Ennek különösen akkor van jelentõsége, amikor a szilárd hordozó egy polietilénglikolgyanta vagy egy polietilénglikolt és polisztirolt tartalmazó hibrid, például egy benzil-alkohol rögzítõcsoportot tartalmazó polietilén glikol térköztartó csoportot tartalmazó polisztirolgyanta. A találmány szerinti eljárás tartalmazhat egy további lépést, amely a fémmel komplexált anyag (azaz a radiofarmakon) további felhasználáshoz való összegyûjtésére vonatkozik. A 99mTc radiofarmakon n.c.a. elõállítása után a szilárd fázisú polimer összegyûjthetõ, mosható és újra felhasználható. Az eljárást elõnyösen körülbelül pH=6,0–11,0 tartományban, elõnyösen körülbelül pH=7,5–9,5 tartományban végezzük. A reakció kivitelezéséhez megfelelõ hõmérséklet körülbelül 40–100 °C tartományban van. A reakciót elõnyösen körülbelül 70–82 °C tartományban végezzük. A találmány kiterjed az (I) képletû, szilárd fázishoz kötött szerves konjugátumra, valamint az ezen vegyületet tartalmazó készítményekre. Ezek a készítmények elõnyösen gyógyszerészetileg elfogadható körülmények között hosszú idõn át tárolható formában vannak. A találmány szerinti eljárással nagy fajlagos aktivitású, fémmel komplexált ligandum-bio molekula konjugátumok állíthatók elõ szûréssel, a jelzés után további tisztítás nélkül. A találmány szerinti eljárással elõállítható konjugátumok általában a találmány szerinti eljárással nyerhetõ készítménybe foglalhatók, és ezeket az jellemzi, hogy lényegében nem tartalmaznak komplexálatlan ligandum-biomolekula konjugátumot, például a komplexálatlan ligandum-biomolekula konjugátum koncentrációja az ezeket tartalmazó készítményben 10–7 mol/l tartományban van. A radiofarmakonokban használt egyes izotópok, például a 99mTc, rövid felezési ideje következtében a komplexált konjugátum fajlagos aktivitása szempontjá-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
ból fontos lehet, hogy ezen ligandum-biomolekula konjugátumokat közvetlenül felhasználásuk elõtt lássuk el jelzéssel. Az elbomlott komplex mennyisége egy frissen jelzett készítményben alacsonyabb lesz, összehasonlítva azzal a helyzettel, amikor a konjugátumot a felhasználás elõtt lényegesen hosszabb idõvel alakítottuk komplexszé. Ezért találmányunk kiterjed a diagnosztikai vagy terápiás gyógyszerészeti készítmény elõállítására alkalmas kitre, amely egy az (I) képletû molekulát tartalmazó tartályt tartalmaz, amelyben az [M(H2O)3(CO)3]n+iont tartalmazó oldattal a reakció végbemegy. A tartály egy edény vagy egy oszlop lehet. A reakciót úgy indítjuk meg, hogy az [M(H2O)3(CO)3]n+-ion oldatát az edénybe vagy oszlopra visszük. Az oldat lehet a kit része vagy más módon biztosítható. A kiviteli alakok egyik változatában az [M(H2O)3(CO)3]n+ fém-karbonilion elõállításához használt reagenseket a kit tartalmazza. Ezen túlmenõen a kit tartalmazhat egy szûrésre alkalmas eszközt. A kit alkalmazásával a fémkomplex elõállítása rugalmasan végezhetõ, mivel a megfelelõ fém kiválasztható közvetlenül a komplexképzési reakció elõtt. A találmány szerinti, fémmel komplexált vegyületek hordozóanyag hozzáadása nélkül (n.c.a.) történõ elõállításának elvét az 1. ábrán mutatjuk be. Egy háromfogú ligandumot, például dietilén-triamint egy összekötõ csoporton keresztül, ez itt egy benzilszármazék, kapcsoljuk a szilárd fázishoz egy tercier aminnal. A kelátképzõhöz (ligandum) egy biomolekulát kapcsolunk, így egy ligandum-biomolekula konjugátumot állítunk elõ. A [Tc(H 2 O) 3 (CO) 3 ] + hozzáadásakor végbemegy a komplexképzõdés, és a háromfogú ligandum két vízligandumot helyettesít. A [Tc(H2O)2(OH)(CO)3]+-ionon maradó hidroxilligandum most már meg tudja támadni az aktivált metiléncsoportot, és így kiváltja a C–N kötés hasadását. A metiléncsoport aktiválódása a tercier aminocsoport technéciumcentrummal történõ komplexképzése útján megy végbe, ami a kelátképzõtõl elszívja az elektronsûrûséget és azt nukleofil támadásra érzékennyé teszi. A szilárd fázishoz kötött biomolekula-ligandum konjugátum tercier aminatomja iránt reaktivitást mutató fõ species az [M(OH)(H 2 O) 2 (CO) 3 ]. Az oldatban az [M(OH)(H2O)2(CO)3] egyensúlyban van a konjugátummal [M(H2O)3(CO)3]n+-ion formában, valamint további disszociált formákban az oldat kémhatásától függõen. Nyilvánvaló, hogy az egyensúly következtében az [M(OH)(H2O)2(CO)3] a pH¹tól függõen legalább részben felcserélhetõ ezekkel a speciesekkel. Találmányunkat az alábbi nem korlátozó értelmû példákkal szemléltetjük. A példákban a következõ ábrákra hivatkozunk: Az 1. ábrán a találmány szerinti, fémmel komplexált vegyületek hordozóanyag hozzáadása nélkül (n.c.a.) végrehajtott elõállításának elve látható. A 2. ábrán a komplexképzés mechanizmusa látható. A 3. ábrán a hasítási reakció pH¹függése látható.
1
HU 005 756 T2
A 4. ábrán a hasítás hatásfokának hõmérsékletfüggése látható. Az 5. ábrán az 1., 2., 3., 4. és 10. példa reakcióvázlata láthatók. A 6. ábrán az 5., 6., 7., 8. és 9. példa reakcióvázlata láthatók. A 7. ábrán a 11., 12. és 13. példa reakcióvázlata látható. A 8. ábrán a 14. példa és az 1. táblázat szerinti vegyületek szerkezeti képlete látható. A 9. ábrán a biológiailag aktív molekulájú vegyületek szerkezeti képlete látható.
5
10
Példák 15 1. példa Egy modell ligandumot kovalensen kötünk egy megfelelõ szilárd fázisú gyantához. A szilárd fázisú gyantának vízben duzzadnia kell, a Tc¹species diffúziójának biztosításához, és annak a rögzítõcsoportnak, amelyhez a ligandum kapcsolódik, a nukleofil támadásban aktiváló csoportnak kell lennie. Ezen kívánalmaknak eleget tesz a TentaGel S AC polisztirol/polietilénglikol gyanta (Rapp Polymere GmbH, Tübingen, Németország). Ennek aktív helye, egy benzil-alkoholszármazék, a megfelelõ 1 bromiddá van átalakítva [Ngu és Patel, Tet. Lett. 38, 973–976 (1997)]. N,N’’-bisz(1¹(4,4-Dimetil-2,6-dioxo-ciklohexilidén)etil)-dietilén-triamint (2) (101,8 mg, 235,9 mmol) oldunk DMF-ben (5 ml), 1 gyantát (196,6 mg, 47,2 mol) adunk hozzá, és a keveréket szobahõmérsékleten 22 órán át óvatosan keverjük. A reakciókeveréket leszûrjük, és a gyantát DMF-fel (3¹szor), DMF-fel és metanollal (felváltva 3¹szor) és DMF-fel (5¹ször) mossuk. A védõcsoportokat úgy távolítjuk el, hogy a gyantát hidrazin-hidrát 2%¹os DMF¹es oldatával (1 ml) 10¹szer mossuk 5 percig. A reakciókeveréket leszûrjük, és a gyantát DMF-fel (3¹szor), DMF-fel és metanollal (váltakozva 5¹ször), DMF-fel (3¹szor) és dietil-éterrel (3¹szor) mossuk. A gyantát nagyvákuumban megszárítva kapjuk a 3 terméket 192,3 mg kitermeléssel (97,8%; kapacitás 0,236 mmol/g, kapcsolási hatékonyság 100%). A szilárd fázisú gyantán lévõ szabad aminocsoportokat színezési teszttel tesszük láthatóvá: alkáligyanták esetén bróm-fenolkék vizes oldatában és kizárólag primer aminok esetén trinitro-toluolszulfonsav (TNBS) DMF/diizopropil-etil-amin 10:1 arányú elegyében. A 3 gyanta mindkét tesztben pozitív volt, míg a védett köztitermék a TNBS megfestésnél negatív volt. A gyanták kapacitását (mmol kötött kelátképzõ per gramm) és a kelátképzõ szilárd hordozóhoz való kapcsolódásának hatékonyságát a gyanták N¹tartamából számítjuk ki, amelyet elemanalízissel határozunk meg. A 3 gyanta kelátképzõ kapacitását szobahõmérsékleten 1 mmol/l [99Tc(H2O)3(CO)3]+-ion 1 mmol/l¹es oldatában (7 ekvivalens) keverve igazoljuk. A szûrt oldat b– folyadék szcintillációs számlálással végzett analízise az aktivitás 14%¹os csökkenését mutatja, ami összhangban van a gyantán bekövetkezõ kvantitatív komplexképzõdéssel. A HPLC analízisek csak a kiindulási
20
25
30
35
40
45
50
2
anyag csúcsát mutatják, ami azt jelzi, hogy a szilárd fázisról nincs lehasadás ilyen enyhe körülmények között. Amint a 99Tc-komplex kialakul, stabilnak mutatkozik a jelzéshez használt körülmények között. Még 80 °C¹on pH=7,5 kémhatású foszfátpufferben 5 órán át történõ melegítéskor is csak 3% béta-aktivitás jelenik meg az oldatban, ez a vártnál legalább egy nagyságrenddel alacsonyabb. 2. példa Egy másik háromfogú ligandumot, amely töltéssel nem rendelkezõ komplexeket eredményez, rögzítünk ugyanahhoz a gyantához, mint az 1. példában. N¹pikolil-amin-ecetsav-etil-észtert (54 mg, 280 mmol) oldunk DMF-ben (3 ml), és 1 gyantát (280 mg, 67 mmol) adunk hozzá. A keveréket szobahõmérsékleten 15 órán át óvatosan keverjük, a reakciókeveréket leszûrjük, és a gyantát DMF-fel (3¹szor), DMF-fel és metanollal (váltakozva 3¹szor) és dietil-éterrel (3¹szor) mossuk. A védett köztitermék bróm-fenolkékre pozitív, és TNBS megfestésre negatív. A védõcsoportokat a gyanta vízzel (5 ml) és 1 mol/l¹es nátrium-hidroxid-oldattal (0,30 ml) keverékében 28 órán át történõ óvatos keverésével eltávolítjuk. A gyantát szûrjük, DMF-fel (3¹szor), DMF-fel és metanollal (váltakozva 3¹szor), DMF-fel (3¹szor) és dietil-éterrel (3¹szor) mossuk és nagyvákuumban megszárítjuk, így kapjuk a 4 terméket 268 mg kitermeléssel (96%; kapacitás 0,209 mmol/g, kapcsolási hatékonyság 87,1%). A 4 gyanta az összes megfestési reakcióban negatívnak mutatkozik. 3. példa Egy másik háromfogú ligandumot, amely negatívan töltött komplexeket eredményez, ugyanahhoz a gyantához rögzítünk, mint az 1. példában. Dimetil-iminodiacetát-hidrokloridot (6,4 mg, 33 mmol) és diizopropiletil-amint (11,2 ml, 66 mmol) oldunk DMF-ben (0,5 ml), és 1 gyantát (280 mg, 67 mmol) adunk hozzá. A keveréket szobahõmérsékleten 24 órán át óvatosan keverjük, a reakciókeveréket szûrjük, és a gyantát DMF-fel (3¹szor), DMF-fel és metanollal (váltakozva 3¹szor), metanollal és vízzel (váltakozva 3¹szor) mossuk. A védett köztitermék bróm-fenolkékre pozitívnak és TNBS megfestésre negatívnak mutatkozik. A védõcsoportokat a gyanta vizes NaOH-dal (0,1 mol/l 3 órán át, majd 0,01 mol/l 12 órán át) történõ öblítésével eltávolítjuk. A gyantát szûrjük, 0,1 mol/l¹es NaOH-oldattal (2¹szer), vízzel (5¹ször), vízzel és metanollal (váltakozva 3¹szor), metanollal (3¹szor) és dietil-éterrel (3¹szor) mossuk és nagyvákuumban megszárítjuk, így kapjuk az 5 terméket 35 mg kitermeléssel (100%; kapacitás 4 mmol/g, kapcsolási hatékonyság 18%). Az 5 gyanta az összes megfestési reakcióban negatívnak mutatkozik.
4. példa Egy másik háromfogú ligandumot, amely töltéssel nem rendelkezõ komplexeket eredményez, ugyanahhoz a gyantához kapcsolunk, mint az 1. példában. N5-terc-Butil-(oxi-karbonil)-5-amino-3-aza-pentán60 sav-etil-észtert (74 mg, 280 mmol) oldunk DMF-ben 55
6
1
HU 005 756 T2
(3 ml), és 1 gyantát (300 mg, 72 mmol) adunk hozzá. A keveréket szobahõmérsékleten 15 órán át óvatosan keverjük, a reakciókeveréket leszûrjük, és a gyantát DMF-fel (3¹szor), DMF-fel és metanollal (váltakozva 3¹szor) és dietil-éterrel (3¹szor) mossuk. A védett köztitermék bróm-fenolkékre pozitívnak és TNBS megfestésre negatívnak mutatkozik. Az etil-észter-csoportot úgy távolítjuk el, hogy a gyantát víz (5 ml) és 1 mol/l¹es nátrium-hidroxid-oldat (1,40 ml) keverékében 28 órán át óvatosan keverjük. A gyantát leszûrjük, DMF-fel DMF (3¹szor), DMF-fel és metanollal (váltakozva 3¹szor), DMF-fel (3¹szor) és dietil-éterrel (3¹szor) mossuk és nagyvákuumban megszárítjuk, így kapjuk a Boc-védett savat. A Boc-csoportot a gyanta TFA és DCM (1:1 arányú) keverékében 5 percig történõ keverésével eltávolítjuk, szûrjük, és a gyantát ismét TFA és DCM (1:1 arányú) keverékében, ez esetben 10 percig végzett keverésével eltávolítjuk. A fentiekben ismertetett mosással kapjuk a 6 terméket 72 mg kitermeléssel (96%, kapacitás 22 mmol/g, kapcsolási hatékonyság 94%). A 6 gyanta TNBS megfestésre pozitívnak mutatkozik. 5. példa A NovaSyn TG gyanta alifás amino-rögzítõcsoportot tartalmaz. Ebben a példában a pikolil-amin-ecetsav kelátképzõ szilárd hordozón történõ szintézisét ismertetjük. NovaSyn TG gyantát (100 mg, 30 mmol) és piridin2-karbaldehidet (14,3 ml, 150 mmol) metanolban (3 ml) keverünk szobahõmérsékleten 20 órán át. A reakciókeveréket szûrjük, és a gyantát DMF-fel (3¹szor) és DMFfel és metanollal (váltakozva 3¹szor) mossuk. A gyantához nátrium-triacetoxi-bór hidridet (31,8 mg, 150 mmol) adunk DMF-ben (2 ml). Szobahõmérsékleten 5 órán át keverjük, a reakciókeveréket szûrjük, és a gyantát DMF-fel (4¹szer) és metanollal (3¹szor) mossuk. A gyantához NaHCO3¹ot (10%¹os vizes oldat) adunk. 3 óra elteltével a gyantát DMF-fel (3¹szor), vízzel (3¹szor), etanollal (3¹szor) és dietil-éterrel (3¹szor) mossuk és megszárítjuk, így kapjuk az amino-piridin köztiterméket, amely bróm-fenolkékre pozitívnak és TNBS megfestésre enyhén pozitívnak mutatkozik. A gyantához bróm-ecetsav-etil-észter (16,6 ml, 150 mmol) és diizopropil-etil-amin (5,1 ml, 30 mmol) etanolban (2,5 ml) készült keverékét adjuk. Szobahõmérsékleten 24 órán át keverjük, majd a reakciókeveréket leszûrjük, és a gyantát etanollal (5¹ször) mossuk és megszárítjuk. A gyantához NaOH-oldatot (1 mol/l) adunk az etil-észter-védõcsoport eltávolítására. Egy napig szobahõmérsékleten keverjük, majd a reakciókeveréket szûrjük, és a gyantát vízzel (5¹ször), etanollal (3¹szor) és dietil-éterrel (2¹szer) mossuk és megszárítjuk, így kapjuk a 8 terméket 86,4 mg kitermeléssel (83,7%); kapacitás 0,10 mmol/g, kapcsolási hatékonyság 43%). 6. példa NovaSyn TG gyantát (100 mg, 30 mmol), etil-brómacetátot (33,2 ml, 300 mmol) és diizopropil-etil-amint
2
(12,9 ml, 75 mmol) reagáltatunk az 5. példa második lépésében ismertetett módon, így kapjuk a 9 terméket 96,2 mg kitermeléssel (93%). 7. példa A NovaSyn TGT gyanta hidroxi-tritil-rögzítõcsoportot tartalmaz. A hidroxilcsoportot ismert módon kloriddá alakítjuk át (J. M. J. Frechert és munkatársai, Tetrahedron Lett. 1975, 3055). Dimetil-imino-diacetát-hidrokloridot (16,2 mg, 10 82 mmol) és diizopropil-etil-amint (21 ml, 123 mmol) oldunk DMF-ben (2 ml). Klórozott Novasyn TGT gyantát (41 mmol) adunk hozzá. A kapcsolási reakciót, valamint az észter hidrolízisét a 3. példában ismertetett módon 15 hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy 3 óra reakcióidõ elteltével diizopropil-etil-amint (14 ml, 82 mmol) adunk hozzá. 10 terméket kapunk 132 mg kitermeléssel (81%; kapacitás 0,015 mmol/g, kapcsolási hatékonyság 6%). 20 8. példa A NovaSyn TGR gyanta amino-metil-rögzítõcsoportot tartalmaz, amelynek a metiléncsoporton két arilhelyettesítõje van. A 11 gyantát a 8 termék 5. példá25 ban ismertetett szintézisével analóg módon állítjuk elõ. NovaSyn TGR gyantát (166 mg, 30 mmol) reagáltatunk az 5. példában megadottal azonos mennyiségû reagensekkel, így kapjuk a 11 terméket 153 mg kiter30 meléssel (90%; kapacitás 0,08 mmol/g, kapcsolási hatékonyság 44%). 5
9. példa A 12 gyantát a 9 termék 6. példában ismertetett 35 szintéziséhez hasonlóan állítjuk elõ. NovaSyn TGR gyantát (166 mg, 30 mmol) reagáltatunk a 6. példában megadottal azonos mennyiségû reagensekkel, így kapjuk a 12 terméket 142,2 mg kitermeléssel (84%). 10. példa Ebben a példában kétfogú kelátképzõt rögzítünk az 1 Tentagel S AC bromidhoz. N,N’-Dimetil-etilén-diamint (110 ml, 1040 mmol) oldunk DMF-ben (1 ml), 1 gyantát (108,6 mg, 26 mmol) 45 adunk hozzá, és a keveréket szobahõmérsékleten 24 órán át óvatosan keverjük. A reakciókeveréket szûrjük, és a gyantát DMF-fel (3¹szor), DMF-fel és metanollal (váltakozva 3¹szor), vízzel (3¹szor), DMF-fel és izopropanollal (váltakozva 3¹szor), vízzel (3¹szor), izopro50 panollal (3¹szor) és dietil-éterrel (3¹szor) mossuk. A gyantát nagyvákuumban megszárítjuk, így kapjuk a 13 terméket 101,6 mg kitermeléssel (98,1%; kapacitás 0,24 mmol/g, kapcsolási hatékonyság 100%). A 13 gyanta bróm-fenolkékre pozitívnak és TNBS megfes55 tésre negatívnak mutatkozik. 40
11. példa Ebben a példában egy bioaktív komplexet eredményezõ konjugátum szintézisét ismertetjük, amely kettõs 60 standard DNS¹be interkalálódik. A bioaktív egység, egy 7
1
HU 005 756 T2
pirénszármazék, a szilárd hordozón lévõ kelátképzõ egységhez kötõdik. N-Boc-N’’-Dde-vel védett dietilén-triamint kapcsolunk az 1 termékhez, ahogy ezt a 3 termék elõállításánál ismertettük. A kétszeresen védett köztitermék brómfenolkékre pozitívnak és TNBS megfestésre negatívnak mutatkozik. A Dde-védõcsoportot úgy távolítjuk el, hogy a gyantát hidrazin-hidrátban (1,5 ml, 2%¹os DMF-oldatban) ötször 10 percig keverjük, majd szûréssel eltávolítjuk. A TNBS-sel történõ pozitív megfestés megerõsíti, hogy a Dde-védõcsoport távozott. A piréncsoportot reduktív aminálással visszük be. Egyik védõcsoportjától megfosztott gyantához (103 mg, 24 mmol) 1¹pirén-aldehidet (28,5 mg, 120 mmol) és metanolt (4 ml) adunk, és a keveréket szobahõmérsékleten 20 órán át keverjük. Szûrés és DMF-fel végzett mosás után nátrium-triacetoxi-bór-hidridet (25 mg, 120 mmol) adunk hozzá DMFben (5 ml), és a keveréket szobahõmérsékleten 24 órán át keverjük. DMF-fel és metanollal mosva (a fentiek szerint) kapjuk a Boc-kal védett gyantához kötött piréndietilén-triamin-származékot, amely bróm-fenolkékre pozitívnak és TNBS megfestésre negatívnak bizonyult. Végül, a Boc-védõcsoportot a gyanta trifluorecetsavban (50%¹os CH2Cl2-oldatban) 5 percig történõ keverésével, majd szûréssel és egy újabb, ezúttal 10 percig végzett trifluor-ecetsavas (50%¹os CH2Cl2-oldatban) kezeléssel eltávolítjuk. Mosás után (a fent leírtak szerint) kapjuk a 7 terméket (kapacitás 0,18 mmol/g, kapcsolási hatékonyság 82%). A 7 gyanta bróm-fenolkékre és TNBS megfestésre is pozitívnak mutatkozik. 12. példa Ebben a példában biotint (H¹vitamint) kapcsolunk a kelátképzõ egységhez. A 11. példával ellentétben a kelátképzõ/biomolekula konjugátumot a szilárd hordozóhoz történõ kötés elõtt szintetizáljuk. Trietilén-tetramint (0,150 ml, 1,00 mmol) oldunk THF-ben (30 ml), és az oldatot –78 °C¹ra hûtjük. Etil-trifluor acetát (0,109 ml, 1,00 mmol) THF-ben (5 ml) készült oldatát adjuk hozzá 30 perc alatt –78 °C¹on, és az oldatot ezen a hõmérsékleten 4 órán át keverjük. Ezután 0 °C¹ra melegítjük. Közben (+)-biotint (244 mg, 1,00 mmol) DMF-ben (8 ml) hevítünk 80 °C¹on, így színtelen oldatot kapunk. A forró oldathoz N,N’-diciklohexil-karbodiimidet (216 mg, 1,05 mmol) és N¹hidroxi-szukcinimidet (121 mg, 1,05 mmol) adunk. A keveréket lassan szobahõmérsékletre hagyjuk hûlni. Fehér por csapódik ki. A keverést 4 órán át folytatjuk. A két keveréket 0 °C¹on összekeverjük és 30 percig együtt keverjük, így fehér színû gélt kapunk. A THF¹et elpárologtatva fehér szuszpenziót kapunk. Szobahõmérsékleten 18 órán át keverjük, az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a visszamaradó anyaghoz vizet adunk. A pH¹t 3¹4 értékre beállítjuk. A keveréket szûrjük, az eluátumot semlegesítjük, és a vizet vákuumban eltávolítjuk. A nyersterméket oszlopkromatográfiával tisztítjuk (szilícium-dioxid, diklór-metán/metanol/trietilamin 5:1:0,1 arányban), így N¹biotinil-N’’’-trifluor-acetiltrietil-tetramint kapunk 60,5 mg kitermeléssel
2
(0,129 mmol, 12,9%). A szerkezetet tömegspektroszkópiával és NMR-rel igazoljuk. N-Biotinil-N’’’-trifluor-acetil-trietil-tetramint (40,3 mg, 86 mmol), trietil-amint (1,8 ml, 17 mmol) és 1 gyantát 5 (71,7 mg, 17 mmol) reagáltatunk az 1. példában ismertetett módon. A TFA-gyanta terméket nagyvákuumban megszárítjuk, így kapjuk a 14 terméket 67 mg kitermeléssel (85%, kapacitás 3 mmol/g, kapcsolási hatékonyság 13%). A 14 gyanta bróm-fenolkékre pozitívnak és 10 TNBS megfestésre negatívnak mutatkozik. A TFA-védõcsoport nátrium-karbonáttal (10%¹os vizes oldat) történõ eltávolítására tett kísérletek a TNBS megfestésre kapott negatív eredmények szerint nem voltak sikeresek. 15 13. példa Ebben a példában jelzett peptidszármazékok elõállítási eljárását ismertetjük. A védett dipeptidet szabad karbonsav-végcsoporttal kapcsoljuk egy részlegesen 20 védett poliaminhoz. Az összes védõcsoportot eltávolítjuk, és Dde-védõcsoportot viszünk be a peptiden és a kelátképzõn a primer aminocsoportok szelektív blokkolása céljából. Ez lehetõvé teszi, hogy a szilárd hordozóhoz kapcsolódó konjugátum a kelátképzõ egyik vé25 detlen szekunder aminocsoportjáról tercier aminocsoport képzõdése útján lehasadhasson. N,N’,N’’-tri(terc-Butil-oxi-karbonil)-trietilén-tetramint (103,3 mg, 234,5 mmol), Boc-Phe-Gly-OH¹t (75,6 mg, 234,5 mmol), PyBOP¹t (183 mg, 352 mmol) és diizopro30 pil-etil-amint (20 ml, 117 mmol) oldunk diklór-metánban (2,5 ml). Az oldatot szobahõmérsékleten 4 órán át keverjük. Idõnként diizopropil-etil-amint (20 ml, 117 mmol) adunk hozzá a kémhatás pH>7 értéken tartása céljából. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a vissza35 maradó anyagot etil-acetátban oldjuk és sós vízzel (3¹szor), hideg 0,5 mol/l¹es HCl-oldattal (3¹szor), 10%¹os NaHCO 3 -oldattal (2¹szer) és sós vízzel (3¹szor) mossuk. A szerves fázist MgSO4 fölött megszárítjuk, és az oldószert vákuumban eltávolítjuk, így 40 N¹(terc-butil-oxi-karbonil-fenil-alanil-glicil)-N,N’,N’’-tri(terc-butil-oxi-karbonil)-trietilén-tetramint állítunk elõ 175,2 mg kitermeléssel (231,6 mmol, 98,8%). A szerkezetet tömegspektroszkópiával és NMR-rel igazoljuk. A Boc-védõcsoportokat a termék (162,2 mg, 45 0,169 mmol) etil-acetátos HCl-oldatban (körülbelül 1 mol/l, 3 ml) történõ keverésével eltávolítjuk. Szobahõmérsékleten 9 órán át keverjük, majd az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk és 1 órán át keverjük (pH=2–3), majd NaOH-olda50 tot (1 mol/l, 313 mmol) adunk hozzá az oldat semlegesítése céljából, és az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, így H¹Phe-Gly-NH–C2H4–NH–C2H4–NH–C2H4–NH2¹t állítunk elõ kvantitatív kitermeléssel. A szerkezetet tömegspektroszkópiával és NMR-rel igazoljuk. H-Phe-Gly-NH–C2H4–NH–C2H4–NH–C2H4–NH2¹t 55 (113 mg, 0,152 mmol) és 2¹acetil-dimedont (Dde–OH) (70,0 mg, 0,335 mmol) oldunk etanolban (4 ml). Szobahõmérsékleten 20 órán át keverjük, majd TLC analízissel kimutatjuk az amin egyetlen termékké történõ teljes 60 átalakulását. Az oldószert eltávolítva Dde-Phe-Gly8
1
HU 005 756 T2
NH–C 2 H 4 –NH–C 2 H 4 –NH–C 2 H 4 –NH-Dde¹t kapunk. A szerkezetet tömegspektroszkópiával igazoljuk. A nyersterméket a 2¹acetil-dimedon feleslegtõl való elválasztás nélkül használjuk fel. Dde-Phe-Gly-NH–C2H4–NH–C2H4–NH–C2H4–NHDde¹t (76 mmol) és 1 gyantát (79,2 mg, 19 mmol) reagáltatunk az 1. példában ismertetett módon. A védett köztitermék bróm-fenolkékre pozitívnak és TNBS megfestésre negatívnak mutatkozik. A Dde-védõcsoportokat az 1. példában ismertetett módon eltávolítva kapjuk a 15 terméket. A 15 gyanta bróm-fenolkékre és TNBS megfestésre pozitívnak mutatkozik. 14. példa Jelzési körülmények: [99mTc (H2O)3(CO)3]+-iont állítunk elõ [99TcO4]–-ionból bór-karbonát kit alkalmazásával [Alberto és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 123, 3135–3136 (2001)]. 1 mg kelátképzõhöz kötött szilárd fázist (0,2 mmol) adunk a [99mTc(H2O)3(CO)3]+-oldathoz (1 ml), a keverékeket lassan ultrahangkezelésnek vetjük alá, majd 82 °C¹on melegítjük 30 percig. Az oldatokat a szerves fázisú gyantától szûréssel elválasztjuk és HPLC-vel analizáljuk gamma-detektálás alkalmazásával. Oldható komplexek képzõdését észleljük az összes szerves fázishoz kötött kelátképzõvel. A kitermelés a kelátképzõ típusától és a reakciókörülményektõl függõen 5–50% között változik (1. táblázat). 15. példa A 3 és 4 gyantákat szintén egy edényben végrehajtott eljárásban látjuk el jelzéssel a [99mTc(H2O)3(CO)3]+ion képzõdési és a hasítási reakció kombinálásával. A bór-karbonát kithez 1 mg szerves fázishoz kötött kelátképzõt (0,2 mmol) adunk [Mallinckrodt Medical, Petten, Hollandia; Alberto és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 123, 3135–3136 (2001)]. A kémcsõbe generátorról eluált NaTcO4¹et adunk, és a keveréket 78–82 °C¹on tartjuk 20–60 percig. Kémhatása pH=11. A hasítás hatásfoka 8–32% közötti, a pertechnetát átalakulása 40% és 54% közötti.
5
10
15
20
25
30
35
40
2
16. példa A 4 gyantán végrehajtandó jelzési reakcióhoz a reakciókörülményeket, úgymint pH és reakció-hõmérséklet, az optimális reakciókörülmények meghatározása céljából változtatjuk. Radioaktív nyomjelzéshez a [99mTc(H2O)3(CO)3]+ kiindulási anyag teljes konverziójára és egyetlen termék képzõdésére van szükség. A jelzési eljárás után a tisztítási lépések kerülendõk a minták radioaktivitása, valamint ezek gyors lebomlása miatt (t1/2=6,2 óra). A magas hasítási hatásfok azért kívánatos, hogy nagy radioaktivitású oldatokat kapjunk. A hasítási reakció pH¹függése a 3. ábrán látható. A hasítás hatásfoka pH=6-tól növekszik, és pH=8,5-nél maximumot ér el. Ez összhangban van a [99mTc(H2O)3(CO)3]+-ion [99mTc(OH)(H2O)2(CO)3]-vegyületté történõ deprotonálódásával [a réniumanalóg pKS-értéke: 7,5; Egli és munkatársai, Organometallics 16, 1833–1840 (1997)], és ezért azt feltételezzük, hogy a Tc¹koordinált hidroxilion az a nukleofil, amely a CH2csoportot megtámadva hasad el a C–N kötés. A pH=11 értékre történõ emelésével a hasadás hatásfoka ismét csökken. Ez a negatívan töltött [99mTc(OH)2(H2O)(CO)3]– species képzõdésére vezethetõ vissza, ami csökkenti a koordinált aminocsoport elektrofil jellegét. A 4 gyanta [99mTc(H2O)3(CO)3]+-ionnal végbemenõ reakciójának hõmérsékletfüggését a [99mTc(H2O)3(CO)3]+-ion teljes konverziója után a reakciótermékek analizálás útján tanulmányozzuk. Szobahõmérsékleten a gyantán csak komplexképzõdés meg végbe, a szerves fázisról szûréssel történõ eltávolítás után az oldat nem mutat radioaktivitást. 43 °C¹on a hasadás hatásfoka észlelhetõ, de alacsony. Ezután a hõmérséklet emelkedésével nõ (4. ábra). Jól látható, hogy a gyantán a komplexképzõdés és a hasadási reakció kompetitív folyamatok, ahol a hasadási reakció aktiválásienergia-gátja magasabb. Azonban a nagyon magas hõmérsékletek hátrányosak lehetnek a szerves fázisú gyanta és a megkötött biomolekulák stabilitása szempontjából. A 4 gyanta esetében elõnyös, ha a reakció-hõmérséklet 70 °C és 82 °C között van.
1. táblázat Szilárd fázishoz kötött kelátképzõ (gyanta)
Hasított 99mTc-komplex
Hasítás hatásfoka
Körülmények
3 (TentaGel)
27%
1 óra 82 °C
4 (TentaGel)
52% 28%
1 óra 82 °C 2 óra 56 °C
9
HU 005 756 T2
1. táblázat (folytatás) Szilárd fázishoz kötött kelátképzõ (gyanta)
Hasított 99mTc-komplex
Hasítás hatásfoka
Körülmények
5 (TentaGel)
20%
1 óra 82 °C
6 (TentaGel)
22%
1 óra 82 °C
7 (TentaGel)
5%
1 óra 82 °C
8 (NovaSyn TG)
8%
1 óra 82 °C
9 (NovaSyn TG)
11% 4%
1 óra 82 °C 3 óra 56 °C
10 (NovaSyn TGT)
93% 79%
1 óra 82 °C 3 óra 56 °C
11 (NovaSyn TGR)
53% 15%
1 óra 82 °C 3 óra 56 °C
12 (NovaSyn TGR)
83% 78%
1 óra 82 °C 3 óra 56 °C
13 (TentaGel)
10%
1 óra 82 °C
10
1
HU 005 756 T2
2
1. táblázat (folytatás) Szilárd fázishoz kötött kelátképzõ (gyanta)
Hasított 99mTc-komplex
Hasítás hatásfoka
Körülmények
14 (TentaGel)
14%
1 óra 82 °C
14 (TentaGel)
13%
2 óra 82 °C
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
20
1. Eljárás fémmel komplexált anyag elõállítására, amelynek során: egy (I) képletû, szilárd fázishoz kötött szerves konjugátumot [M(H2O)3(CO)3]n+-ionnal érintkeztetünk,
25
(I) ahol a gömb jelentése szilárd fázisú hordozó; C jelentése metiléncsoport; R 4 és R 5 jelentése egymástól függetlenül a H¹atom, alifás helyettesítõk, aromás helyettesítõk, RO, RS és (R)2N képletû csoportok, ahol R jelentése alifás csoport vagy arilcsoport, közül van kiválasztva; L jelentése összekötõ csoport vagy egyes kötés; és R1 és R2 helyettesítõk mindegyike egymástól függetlenül fémet koordináló csoport, nem koordináló szerves csoport, egy biológiailag aktív molekulával derivatizált, fémet koordináló csoport vagy egy biológiailag aktív molekulával derivatizált, nem koordináló szerves csoport, ahol M jelentése a technécium (Tc), rénium (Re), ródium (Rh), platina (Pt), irídium (Ir), ruténium (Ru) és réz (Cu) csoportjából van kiválasztva; és n értéke 1, 2 vagy 3. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol L jelentése egy, a fenilén¹, vinil¹, alkilén¹, allilén¹, arilén- és egyéb nem alifás és alifás csoportok közül kiválasztott összekötõ csoport. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol L egy, az OR, R és (R)2N képletû csoportok, ahol R jelentése alifás csoport vagy arilcsoport, közül választott elektronszívó csoporttal van helyettesítve. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol L jelentése
ahol X1 jelentése O, és az X2 csoportok mindegyikének jelentése H¹atom vagy elektronszívó helyettesítõ, azzal 30 a megkötéssel, hogy legalább az egyik X2 csoport jelentése elektronszívó helyettesítõ. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol R1 és R2 legalább egyike a következõ csoportból van kiválasztva: 35
40
45
50
55
60 11
R3–NH2 ahol R3 jelentése 1, 2 vagy 3 szénatomot tartalmazó alifás lánc. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol R1 és R2 legalább egyike alifás vagy aromás helyettesítõ. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amely magában foglalja továbbá egy koordinációs kötés kialakítását az [M(H2O)3(CO)3]n+-ion és egy, a szilárd fázishoz kötött szerves konjugátum tercier aminjának nitrogénatomja között és az így képzõdött, fémmel komplexált anyag felszabadítását. 8. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol M jelentése a 99mTc, 186Re és 188Re csoportjából van kiválasztva. 9. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a biológiailag aktív molekula aminosavak, szteroidok, peptidek, proteinek, szénhidrátok, poliszacharidok, oligoszacharidok, nukleozidok, nukleotidok, oligonukleotidok, polinukleotidok, lipidek és gyógyászati hatású kis molekulák csoportjából van kiválasztva.
1
HU 005 756 T2
10. Az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a szilárd fázisú hordozó egy polietilénglikolgyanta vagy egy polietilénglikolt és polisztirolt tartalmazó hibrid. 11. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az eljárást körülbelül pH=6,0–11,0 tartományban végezzük. 12. Az 1–11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amely eljárást körülbelül 40–100 °C hõmérséklettartományban végezzük. 13. (I) képletû, szilárd fázishoz kötött szerves konjugátum
5
2
15. A 13. vagy 14. igénypont szerinti szilárd fázishoz kötött szerves konjugátum, ahol a szilárd fázisú hordozó egy polietilénglikolgyanta vagy egy polietilénglikolt és polisztirolt tartalmazó hibrid. 16. Kit diagnosztikai vagy terápiás gyógyszerészeti készítmény elõállítására, amely kit tartalmaz egy tartályt; és egy (I) képletû molekulát
10
(I) 15
(I) 20 ahol a gömb jelentése szilárd fázisú hordozó; C jelentése metiléncsoport; R4 és R5 jelentése egymástól függetlenül H atom, alifás helyettesítõk, aromás helyettesítõk, RO, RS és (R)2N képletû csoport, ahol R jelentése alifás csoport vagy arilcsoport, közül van kiválasztva; L jelentése összekötõ csoport vagy egyes kötés; és R1 és R2 mindegyike egymástól függetlenül fémet koordináló csoport, nem koordináló szerves csoport, biológiailag aktív molekulával derivatizált, fémet koordináló csoport vagy biológiailag aktív molekulával derivatizált, nem koordináló szerves csoport. 14. A 13. igénypont szerinti, szilárd fázishoz kötött szerves konjugátum, ahol a biológiailag aktív molekula aminosavak, szteroidok, peptidek, proteinek, szénhidrátok, poliszacharidok, oligoszacharidok, nukleozidok, nukleotidok, oligonukleotidok, polinukleotidok, lipidek és gyógyászati hatású kis molekulák csoportjából van kiválasztva.
25
30
35
40
12
ahol a gömb jelentése szilárd fázis; C jelentése metiléncsoport; R4 és R5 jelentése egymástól függetlenül H¹atom, alifás helyettesítõk, aromás helyettesítõk, RO, RS és (R)2N képletû csoport, ahol R jelentése alifás csoport vagy arilcsoport, közül van kiválasztva; L jelentése összekötõ csoport vagy egyes kötés; és R1 és R2 mindegyike egymástól függetlenül fémet koordináló csoport, nem koordináló szerves csoport, biológiailag aktív molekulával derivatizált, fémet koordináló csoport vagy biológiailag aktív molekulával derivatizált, nem koordináló szerves csoport, amelyben a reakció [M(H2O)3(CO)3]n+-ion oldatával végezhetõ. 17. A 16. igénypont szerinti kit, ahol a tartály egy edény vagy egy oszlop. 18. A 16. vagy 17. igénypont szerinti kit, amely egy [M(H2O)3(CO)3]n+-iont, ahol M jelentése fém, és n értéke 1, 2 vagy 3, tartalmazó oldatot is tartalmaz. 19. A 16–18. igénypontok bármelyike szerinti kit, amely az [M(H2O)3(CO)3]n+-ion, ahol M jelentése fém, és n értéke 1, 2 vagy 3, elõállítására alkalmas reagenseket is tartalmaz. 20. A 16–19. igénypontok bármelyike szerinti kit, amely egy szûrésre alkalmas eszközt is tartalmaz.
HU 005 756 T2 Int. Cl.: A61K 51/04
13
HU 005 756 T2 Int. Cl.: A61K 51/04
14
HU 005 756 T2 Int. Cl.: A61K 51/04
15
HU 005 756 T2 Int. Cl.: A61K 51/04
16
HU 005 756 T2 Int. Cl.: A61K 51/04
17
HU 005 756 T2 Int. Cl.: A61K 51/04
18
HU 005 756 T2 Int. Cl.: A61K 51/04
19
HU 005 756 T2 Int. Cl.: A61K 51/04
20
HU 005 756 T2 Int. Cl.: A61K 51/04
21
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest