!HU000007494T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 494
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 660208 P 2005. 03. 10.
(73) Jogosult: Theravance, Inc., South San Francisco, CA 94080 (US)
US
(72) Feltalálók: AXT, Sabine, Sunnyvale, California 94085 (US); CHURCH, Timothy J., San Mateo, California 94403 (US); MALATHONG, Viengkham, Irvine, California 92617 (US) (54)
HU 007 494 T2
C07D 211/46
(21) Magyar ügyszám: E 06 737787 (22) A bejelentés napja: 2006. 03. 09. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20060737787 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1856050 A1 2006. 09. 21. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1856050 B1 2009. 11. 25.
(2006.01) A61K 31/45 (2006.01) A61P 11/06 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06099165 PCT/US 06/008644
(74) Képviselõ: dr. Molnár István, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Difenilvegyület kristályos formái
A leírás terjedelme 42 oldal (ezen belül 13 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 494 T2
A találmány difenilvegyület újszerû kristályos formáira és azok szolvátjaira vonatkozik, amelyek elõreláthatólag hasznosak tüdõ-rendellenességek kezelésében. A találmány a kristályos vegyületeket tartalmazó vagy ilyen vegyületekbõl elõállított gyógyszerkészítményekre, ilyen kristályos vegyületek elõállítására szolgáló eljárásokra és intermedierekre, és tüdõ-rendellenesség kezelése céljából ilyen vegyületek alkalmazási módjaira is vonatkozik. A Mammen és munkatársaira együttesen átruházott 2005/0203133 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi közzétételi irat újszerû difenilvegyületeket ismertet, amelyek elõreláthatólag hasznosak tüdõ-rendellenességek, úgymint krónikus obstruktív tüdõbetegség (COPD; „chronic obstructive pulmonary disease”) és asztma kezelésében. Közelebbrõl a difenil2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-ilmetil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észtervegyületet kifejezetten úgy írják le ebben a bejelentésben, mint amely muszkarin receptor antagonista vagy antikolinerg aktivitással rendelkezik. A difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin4-il-észter kémiai szerkezetét az I képlettel mutatjuk be:
5
10
15
20
25
30
I Az I képlet szerinti vegyület elnevezése a kereskedelemben beszerezhetõ AutoNom szoftver (MDL, San Leandro, Kalifornia) alkalmazásával történt. Tüdõ- vagy légzési rendellenességek kezelésében hasznos gyógyászati hatóanyagokat elõnyösen közvetlenül a légutakba juttatják inhalálás segítségével. Ebbõl a szempontból gyógyszerészeti inhalációs eszközök különféle típusait fejlesztették ki a gyógyászati hatóanyagok inhalációval történõ beadásához, köztük a szárazpor-inhalátorokat (DPI; „dry powder inhaler”), a meghatározott dózist adagoló inhalátorokat (MDI; metered-dose inhaler) és a porlasztós inhalátorokat. Ilyen eszközökben történõ alkalmazásra szolgáló gyógyszerkészítmények és ¹formulációk elõállításakor igen kívánatos, hogy a gyógyászati hatóanyag kristályos formában álljon rendelkezésre, amely se nem higroszkópos, se nem folyósodó, és amelynek viszonylag magas (jellemzõen körülbelül 150 °C¹nál magasabb) olvadáspontja van, ezáltal lehetõvé téve, hogy az anyagot jelentõs bomlás nélkül mikronizálják. Korábban nem számoltak be az I képlet szerinti vegyület kristályos formáiról. Következésképpen szükség van az I képlet szerinti vegyület stabil, nem folyósodó kristályos formáira, amelyek a higroszkóposság elfogadható szintjeivel és viszonylag magas olvadáspontokkal rendelkeznek.
35
40
45
50
55
60 2
2
Az alábbiakban röviden ismertetjük a találmány szerinti megoldást. A találmány tárgyát a difenil-2-il-karbaminsav-1(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]-metilamino}-etil)-piperidin-4-il-észter (I képlet) kristályos formái képezik. A kristályos forma lehet szabad bázis („freebase”), gyógyszerészetileg elfogadható só, úgymint egy difoszfát¹, monoszulfát- vagy dioxalátsó, vagy ilyen só gyógyszerészetileg elfogadható szolvátja. Meglepõ módon a találmány szerinti kristályos formákkal kapcsolatban azt tapasztaltuk, hogy nem folyósodóak még levegõnedvesség hatásának kitéve sem. Azonkívül a találmány szerinti kristályos formák a higroszkóposság elfogadható szintjeivel és megfelelõ, körülbelül 70 °C¹nál magasabb olvadásponttal rendelkeznek. Például a difoszfátsónak 150 °C körüli olvadáspontja van. Több alkalmazás között az I képlet szerinti vegyület kristályos formái hasznosak olyan gyógyszerkészítmények elõállításában, amelyek elõreláthatólag felhasználhatóak tüdõ-rendellenességek kezelésében. Következésképpen a találmány egy szempontból gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot és az I képlet szerinti vegyület kristályos formájának gyógyászatilag hatásos mennyiségét tartalmazó gyógyszerkészítményre vonatkozik. Még egy másik szempontból a találmány az I képlet szerinti vegyület kristályos formáját egy vagy több más gyógyászati hatóanyaggal alkotott kombinációban tartalmazó készítményekre vonatkozik. Ennek megfelelõen egy kiviteli alakban a találmány egy olyan készítményre irányul, amely az alábbiakat tartalmazza: (a) gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyag és az I képlet szerinti vegyület kristályos formájának gyógyászatilag hatásos mennyisége; és (b) egy olyan hatóanyag gyógyászatilag hatásos mennyisége, amely szteroid gyulladásellenes hatóanyag, úgymint egy kortikoszteroid; b2-adrenerg receptor agonista; foszfodiészteráz¹4 inhibitor; vagy ezek kombinációja közül választott; és amely készítményben a kristályos forma és a hatóanyag együtt vagy külön formulázott. Amikor a hatóanyag külön formulázott, egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyag belefoglalható. Egy további szempontból a találmány az I képlet szerinti vegyület kristályos formáját tartalmazó vizes izotóniás sóoldatot magában foglaló gyógyszerkészítményre vonatkozik, amelyben az oldat pH¹értéke a körülbelül 4¹tõl 6¹ig terjedõ tartományba esik. Egy konkrét kiviteli alakban vizes porlasztós formulációt citrátpufferrel körülbelül pH=5 kémhatásra pufferolunk. Egy másik konkrét kiviteli alakban a vizes porlasztós formuláció difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil) piperidin-4-il-észter körülbelül 0,5 mg/ml szabad bázis egyenértékét tartalmazza. Egy kiviteli alakban a találmány tárgya gyógyszerhordozó eszköz, amely gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot és az I képlet szerinti vegyület kristályos formáját tartalmazó gyógyszerkészítményt magában foglaló szárazpor-inhalátort tartalmaz.
1
HU 007 494 T2
Az I képlet szerinti vegyület muszkarin receptor antagonista aktivitással rendelkezik. Következésképpen az I képlet szerinti vegyület kristályos formái hasznosak tüdõ-rendellenességek, úgymint asztma és krónikus obstruktív tüdõbetegség kezelésében. Így egy másik szempontból a találmány tárgya egy, az I képlet szerinti vegyület tüdõ-rendellenesség kezelésére szolgáló eljárásban történõ alkalmazás céljára, amelynek során beadjuk az I képlet szerinti vegyület kristályos formájának gyógyászatilag hatásos mennyiségét egy betegnek. Egy még további szempontból a találmány egy, az I képlet szerinti vegyületre vonatkozik betegben hörgõtágulás elõidézésének eljárásában történõ alkalmazás céljára, amelynek során a betegnek beadjuk az 1 képlet szerinti vegyület kristályos formájának hörgõtágulást elõidézõ mennyiségét. Egy kiviteli alakban a vegyületet inhalálás útján adjuk be. A találmány tárgya egy, az I képlet szerinti vegyület krónikus obstruktív tüdõbetegség vagy asztma kezelésének eljárásában is, amelynek során beadjuk az I képlet szerinti vegyület kristályos formájának gyógyászatilag hatásos mennyiségét egy betegnek. Egy másik szempontból a találmány egy, az I képlet szerinti vegyületre irányul muszkarin receptor antagonizálására szolgáló eljárásban történõ alkalmazás céljára emlõsben, amelynek során az emlõsnek beadjuk az I képlet szerinti vegyület kristályos formájának gyógyászatilag hatásos mennyiségét. A találmány az I képlet szerinti vegyület kristályos formáinak elõállítására szolgáló eljárásokra is irányul. A találmány tárgya az I képlet szerinti vegyület tisztítására szolgáló eljárás is, amelynek során difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter kristályos sóját vagy kristályos szabad bázisát alakítjuk ki. A találmány továbbá az itt leírt eljárásokkal elõállított készítményekre irányul. A találmány az I képlet szerinti vegyület kristályos formájára irányul mikronizált alakban is; és irányul olyan gyógyszerkészítményekre, amelyek gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot és az I képlet szerinti vegyület mikronizált kristályos formáját tartalmazzák. A találmány az I képlet szerinti vegyület kristályos formájára irányul gyógykezelési eljárásban vagy gyógyszerként történõ alkalmazás céljára is. Azonkívül a találmány tárgyát képezi az I képlet szerinti vegyület kristályos formájának alkalmazása gyógyszer elõállítására; különösen emlõsben tüdõ-rendellenesség kezelésére vagy muszkarin receptor antagonizálására szolgáló gyógyszer elõállítására. Az alábbiakban röviden megadjuk az ábrák leírását. A találmány különféle szempontjait a kísérõ ábrákra történõ hivatkozás útján világítjuk meg. Az 1. ábra a d i f e n i l - 2 - i l - k a r b a m i n s a v - 1 (2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4-ilészter (az I képlet szerinti vegyület) kristályos difoszfátsójának por-röntgendif-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
2
frakciós (PXRD; „powder x¹ray diffraction”) képét mutatja. A 2. ábra differenciális pásztázó kalorimetriás (DSC; „differential scanning calorimetry”) görbét mutat erre a kristályos sóra vonatkozóan. A 3. ábra termogravimetriás (TGA; „thermal gravimetric analysis”) görbét mutat erre a kristályos sóra vonatkozóan. A 4. ábra a nedvesség dinamikus szorpciós (DMS; „dynamic moisture sorption”) görbéjét mutatja erre a kristályos sóra vonatkozóan. Az 5. ábra ennek a kristályos sónak a mikrografikus képét mutatja. A 6. és 7. ábra külön-külön egy PXRD-képet és egy DSC-görbét mutat kristályos difoszfátsó kevésbé stabil formájára vonatkozóan. A 8. ábra az I képlet szerinti vegyület kristályos monoszulfátsójának PXRD-képét mutatja. Ezen kristályos só további jellemzõit adjuk meg a 9. ábrán a TGA-görbével, a 10. ábrán a DSC-görbével, a 11. ábrán a DMS-görbével és a 12. ábrán a mikrografikus képpel. A 13. ábra az I képlet szerinti vegyület kristályos dioxalátsójának PXRD-képét mutatja. Ezen kristályos só további jellemzõit adjuk meg a 14. ábrán a TGA-görbével, a 15. ábrán a DSC-görbével, a 16. ábrán a DMS-görbével és a 17. ábrán a mikrografikus képpel. A 18. ábra az I képlet szerinti vegyület kristályos szabad bázisa I formájának PXRD-képét mutatja. Ezen kristályos szabad bázis további jellemzõit adjuk meg a 19. ábrán a DSC-görbével, a 20. ábrán a TGA-görbével, a 21. ábrán a DMS-görbével és a 22. ábrán a mikrografikus képpel. A 23. ábra az l képlet szerinti vegyület kristályos szabad bázisa II formájának PXRD-képét mutatja. Ezen kristályos szabad bázis további jellemzõit adjuk meg a 24. ábrán a DSC-görbével, a 25. ábrán a TGAgörbével és a 26. ábrán a DMS-görbével. Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást. A találmány tárgyát difenil-2-il-karbaminsav-1(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]-metilamino}-etil)-piperidin-4-il-észter kristályos formái képezik. A kristályos forma lehet szabad bázis, gyógyszerészetileg elfogadható só, úgymint difoszfát¹, monoszulfát- vagy dioxalátsó, vagy ilyen só gyógyszerészetileg elfogadható szolvátja. Egy konkrét kiviteli alakban a kristályos forma difoszfátsó.
Meghatározások A találmány szerinti vegyületek, készítmények, eljá60 rások és folyamatok leírásakor a következõ szakkifeje3
1
HU 007 494 T2
zéseket az alábbiakban megadott értelemben használjuk, hacsak nincs másképpen jelezve. A „szolvát” szakkifejezés alatt oldott anyag – úgymint egy, az I képlet szerinti kristályos vegyület – egy vagy több molekulája, és oldószer egy vagy több molekulája által alkotott komplexet vagy aggregátumot értünk. Ilyen szolvátok jellemzõen az oldott anyag és oldószer lényegében állandó mólarányával rendelkeznek. Ez a szakkifejezés magában foglalja klatrátokat, köztük a vízzel alkotott klatrátokat is. Jellegzetes oldószerek közé tartoznak például a víz, a metanol, az etanol, az izopropanol, az ecetsav és más hasonlók. Amikor az oldószer víz, a képzõdött szolvát egy hidrát. Az „I forma” szakkifejezés arra a kristályos szabad bázisra vonatkozik, amelyet olyan eljárással állítunk elõ, amely a közömbös oldószerként vizet alkalmaz egy oldószerkeverék részeként. A „II forma” szakkifejezés arra a kristályos szabad bázisra vonatkozik, amelyet olyan eljárással állítunk elõ, amely a közömbös oldószerként szerves oldószerkeveréket alkalmaz, vagyis nem vizet. A „gyógyászatilag hatásos mennyiség” szakkifejezés alatt olyan mennyiséget értünk, amely elegendõ kezelés megvalósításához, amikor beadjuk kezelést igénylõ betegnek. Például muszkarin receptor antagonizálásának céljára gyógyászatilag hatásos mennyiség az a mennyiség, amely eléri a kívánt antagonizáló hatást. Hasonlóan, tüdõ-rendellenesség kezelésének céljára gyógyászatilag hatásos mennyiség az a mennyiség, amely eléri a kívánt gyógyászati eredményt, ami lehet betegség megelõzése, jobbra fordítása, feltartóztatása vagy enyhítése, amint azt az alábbiakban leírjuk. A „kezelés” vagy „gyógymód” szakkifejezés a leírás szerinti értelemben beteg, úgymint emlõs (különösen ember) betegségének vagy orvosi kezelésre szoruló állapotának (úgymint COPD) kezelését vagy gyógymódját jelenti, amely magában foglalja a következõket: (a) a betegség vagy orvosi kezelésre szoruló állapot elõfordulásának megelõzése, vagyis vélhetõen ilyen betegség vagy orvosi kezelésre szoruló állapot fellépése veszélyének kitett, vagy azokra hajlamos beteg profilaktikus kezelése; (b) a betegség vagy orvosi kezelésre szoruló állapot enyhítése, vagyis ilyen betegséggel vagy orvosi kezelésre szoruló állapottal rendelkezõ betegben a betegség vagy orvosi kezelésre szoruló állapot kiküszöbölése vagy visszafejlõdésének elõidézése; (c) a betegség vagy orvosi kezelésre szoruló állapot feltartóztatása, vagyis ilyen betegséggel vagy orvosi kezelésre szoruló állapottal rendelkezõ betegben a betegség vagy orvosi kezelésre szoruló állapot kifejlõdésének lassítása vagy megállítása; vagy (d) ilyen betegséggel vagy orvosi kezelésre szoruló állapottal rendelkezõ betegben a betegség vagy orvosi kezelésre szoruló állapot tüneteinek enyhítése. A „gyógyszerészetileg elfogadható” szakkifejezés olyan anyagra vonatkozik, amely biológiailag vagy más tekintetben nem nemkívánatos. Például a „gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyag” szakkifejezés
2
olyan anyagra vonatkozik, amely belefoglalható egy készítménybe, és betegnek beadható anélkül, hogy nemkívánatos biológiai hatásokat okozna, vagy a készítmény más alkotórészeivel ártalmas módon köl5 csönhatásba lépne. Ilyen gyógyszerészetileg elfogadható anyagok jellemzõen teljesítik a toxikológiai és gyártási ellenõrzések elõírt kívánalmait, és magukban foglalják azokat az anyagokat, amelyeket az Amerikai Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatóság megfelelõ inak10 tív alkotórészekként azonosít. Az „egységdózisforma” szakkifejezés olyan fizikailag különálló egységre vonatkozik, amely alkalmas betegnek történõ adagolásra, vagyis minden egyes egység a találmány szerinti vegyület elõre meghatározott 15 mennyiségét tartalmazza, amelyet úgy számítunk ki, hogy elõidézze a kívánt gyógyhatást akár önmagában, akár egy vagy több további egységgel alkotott kombinációban. Például ilyen egységdózisformák lehetnek kapszulák, tabletták, pirulák és más hasonlók. 20 Szintetizálás A találmány szerinti kristályos vegyületek könnyen hozzáférhetõ kiindulóanyagokból szintetizálhatók, amint azt az alábbiakban és a Példák fejezetben leír25 juk. A késõbbiekben érthetõvé válik, hogy bár meghatározott technológiai jellemzõket (úgymint reakció-hõmérsékleteket, idõtartamokat, reagensek mólarányait, oldószereket, nyomásokat stb.) adunk meg, más technológiai jellemzõk szintén alkalmazhatók, hacsak nincs 30 másképpen kijelentve. Általában a reakciókat megfelelõ közömbös oldószerben hajtjuk végre, amelyre vonatkozó példák közé tartoznak, nem korlátozva azonban ezekre, a metanol, az etanol, az izopropanol, az izobutanol, az etil-acetát, az acetonitril, a diklór-metán, a 35 metil-t-butil-éter és más hasonlók, és ezek jellemzõen vizet tartalmazó keverékei. Bármely már említett reakció befejezésekor a kristályos vegyületek elkülöníthetõk a reakciókeveréktõl bármilyen hagyományos módon, úgymint kicsapással, koncentrálással, centrifugá40 lással és más hasonlókkal. A találmányban alkalmazott difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter könnyen elõállítható kereskedelemben elérhetõ kiindulóanyagokból és 45 reagensekbõl a Példákban leírt eljárások alkalmazásával, vagy a Mammen és munkatársaira átruházott 2005/0203133 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi közleményben leírt eljárások alkalmazásával. A találmány szerinti eljárásokban leírt mólarányok 50 könnyen meghatározhatók szakemberek számára hozzáférhetõ különféle eljárások segítségével. Például ilyen mólarányok könnyen meghatározhatók 1H–NMR segítségével. Másik lehetõség szerint elemanalízis és 55 HPLC eljárások alkalmazhatók a mólarány meghatározásához. Difoszfátsókristály Egy, a találmány szerinti difoszfátsó jellemzõen kö60 rülbelül 1,8 mólekvivalens és 2,2 mólekvivalens közötti 4
1
HU 007 494 T2
mennyiségben tartalmaz foszfátot az I képlet szerinti vegyület mólekvivalensére számítva, magában foglalva körülbelül 1,9 mólekvivalens és 2,1 mólekvivalens közötti mennyiségû foszfátot az I képlet szerinti vegyület mólekvivalensére számítva. Általában az I képlet szerinti vegyület kristályos difoszfátsója vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható szolvátja elõállítható difenil-2-il-karbaminsav-1(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]-metilamino}-etil)-piperidin-4-il-észter foszforsavval történõ érintkezésbe hozásával. Például az észter érintkezésbe hozható hígított vizes foszforsavval, hogy amorf difoszfátsót képezzen, amelyet azután közömbös oldószerrel hozunk érintkezésbe. Az amorf difoszfátsó elõállításához az észtert jellemzõen vizes foszforsavban oldjuk, vízzel hígítjuk és liofilizálással elkülönítjük. Általában ezt a reakciót körülbelül 0 °C és 30 °C közötti hõmérsékleten, úgymint körülbelül 24 °C¹on hajtjuk végre. Az észter milligrammjainak 1 M foszforsav mikroliterjeihez viszonyított aránya körülbelül 1:3 és körülbelül 1:4 közötti, magában foglalva a körülbelül 1:3,5 arányt. A kapott amorf difoszfátsót azután jellemzõen érintkezésbe hozzuk körülbelül 15 mg/ml és körülbelül 25 mg/ml közötti koncentrációban közömbös oldószerrel. Általában ezt a reakciót körülbelül 50 °C és 70 °C közötti hõmérsékleten, úgymint körülbelül 60 °C¹on hajtjuk végre. Egy konkrét kiviteli alakban felvesszük az észter 500 mg¹ját 5 ml vízben és 1,5 ml 1M foszforsavban. A pH¹értéket megközelítõleg pH=5,3¹re állítjuk be további (2,1 mólekvivalenssel megegyezõ) 1 M foszforsavval. A tiszta oldatot szûrjük, fagyasztjuk és olyan szárazságúra liofilizáljuk, hogy amorf difoszfátsót biztosítsunk. A kapott amorf difoszfátsót hozzáadjuk (1:1) arányú izopropanol:acetonitril oldathoz, amit víz hozzáadása követ. Ebben a reakcióban az amorf difoszfátsó milligrammjainak izopropanol:acetonitril milliliterjeihez viszonyított aránya körülbelül 2:0,9 és körülbelül 2:2 közötti, magában foglalva a körülbelül 2:1 arányt. Egy másik lehetõség szerint kristályos difoszfátsó elõállítható oly módon, hogy észtert érintkezésbe hozunk körülbelül 2,0 mólekvivalens és körülbelül 2,1 mólekvivalens közötti mennyiségû foszforsavval. Általában ezt a reakciót közömbös oldószerben körülbelül 40 °C és 60 °C közötti hõmérsékleten, úgymint körülbelül 50 °C¹on hajtjuk végre. Egy konkrét kiviteli alakban az észtert hozzáadjuk (1:1) arányú izopropanol:acetonitril oldathoz, amit víz hozzáadása követ. Melegítés után foszforsavat adunk hozzá. Ebben a reakcióban az észter grammjainak foszforsav milliliterjeihez viszonyított aránya körülbelül 5:14 és körülbelül 5:18 közötti, magában foglalva a körülbelül 5:16 arányt. Kristályos difoszfátsók elõállításának mindkét fent említett eljárása egy önálló, kevésbé stabil difoszfátkristály-forma kialakulásához vezethet. A 6. és 7. ábra ezen kevésbé stabil formára vonatkozóan külön-külön egy PXRD-képet és egy DSC-görbét mutat. A stabilabb difoszfátkristály a gyakori forma; azonban amikor a kevésbé stabil difoszfátforma jelen van, könnyen átalakítható a stabilabb kristállyá oly módon, hogy megnövel-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
jük az oldószerkeverékben a víztartalmat, és újra felmelegítjük a szuszpenziót körülbelül 50 °C és körülbelül 70 °C közötti, jellemzõen körülbelül 60 °C hõmérsékletre körülbelül 2 óra és körülbelül 6 óra közötti, jellemzõen körülbelül 2 óra idõtartamra, azt követõen szobahõmérsékletre hûtjük másnapig lassú keverés mellett. Monoszulfátsó-kristály Egy, a találmány szerinti monoszulfátsó jellemzõen körülbelül 0,8 mólekvivalens és 1,2 mólekvivalens közötti mennyiségben tartalmaz szulfátot az I képlet szerinti vegyület mólekvivalensére számítva, magában foglalva körülbelül 0,9 mólekvivalens és 1,1 mólekvivalens közötti mennyiségû szulfátot az I képlet szerinti vegyület mólekvivalensére számítva. Az I képlet szerinti vegyület kristályos monoszulfátsója vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható szolvátja elõállítható difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4il-észter kénsavval történõ érintkezésbe hozásával. Például az észter érintkezésbe hozható 1 N vizes kénsavval, hogy monoszulfátsót képezzen, amelyet azután közömbös oldószerrel hozunk érintkezésbe. A monoszulfátsó elõállításához az észtert jellemzõen (1:1) arányú acetonitril:víz oldatban oldjuk, vizes kénsavval hígítjuk, vízzel hígítjuk és liofilizálással elkülönítjük. Általában ezt a reakciót körülbelül 0 °C és 30 °C közötti hõmérsékleten, úgymint körülbelül 24 °C¹on hajtjuk végre. Az észter milligrammjainak 1 N vizes kénsav milliliterjeihez viszonyított aránya körülbelül 325 mg/ml és körülbelül 285 mg/ml közötti, magában foglalva a körülbelül 305 mg/ml arányt. Egy konkrét kiviteli alakban vesszük az észter 442 mg¹ját 5 ml (1:1) arányú acetonitril:víz oldatban, és 1,45 ml 1 N kénsavat adunk hozzá lassan, miközben folyamatosan ellenõrizzük a pH¹értéket. Azután a pH¹értéket megközelítõleg pH=3,3¹re állítjuk be. A tiszta oldatot szûrjük, fagyasztjuk és liofilizáljuk olyan szárazságúra, hogy monoszulfátsót biztosítsunk. A kapott monoszulfátsót azután jellemzõen érintkezésbe hozzuk körülbelül 10 mg/ml és körülbelül 20 mg/ml közötti koncentrációban közömbös oldószerrel. Egy kiviteli alakban ezt a reakciót egy elsõ hõmérsékleten és ezt követõen egy alacsonyabb második hõmérsékleten hajtjuk végre úgy, hogy mindkét hõmérséklet körülbelül 50 °C és 80 °C közötti, úgymint körülbelül 60 °C és 70 °C közötti. Egy konkrét kiviteli alakban a monoszulfátsót (10:1) arányú izopropanol:acetronitril oldathoz adjuk hozzá. Ebben a reakcióban a monoszulfátsó milligrammjainak izopropanol:acetonitril oldat milliliterjeihez viszonyított aránya körülbelül 15:3 és körülbelül 15:0,8 közötti, magában foglalva a körülbelül 15:1 arányt. Egy másik kiviteli alakban ezt a reakciót egy elsõ hõmérsékleten és ezt követõen két alacsonyabb hõmérsékletciklusban hajtjuk végre. Az elsõ hõmérséklet körülbelül 50 °C és 80 °C közötti, úgymint körülbelül 70 °C. Az elsõ alacsonyabb hõmérsékletciklus körülbelül 60 °C¹tól 30 °C¹ig változik. A második alacsonyabb hõmérsékletciklus körülbelül 40 °C¹tól 30 °C¹ig változik.
1
HU 007 494 T2
Egy konkrét kiviteli alakban a monoszulfátsót (10:1) arányú izopropanol:acetonitril oldathoz adjuk hozzá. Ebben a reakcióban a monohidrátsó milligrammjainak izopropanol:acetonitril oldat milliliterjeihez viszonyított aránya körülbelül 161:7 és körülbelül 161:11 közötti, magában foglalva a körülbelül 161:9 arányt. Dioxalátsó-kristály Egy, a találmány szerinti dioxalátsó jellemzõen körülbelül 1,8 mólekvivalens és 2,2 mólekvivalens közötti mennyiségben tartalmaz oxalátot az I képlet szerinti vegyület mólekvivalensére számítva, magában foglalva körülbelül 1,9 mólekvivalens és 2,1 mólekvivalens közötti mennyiségû oxalátot az I képlet szerinti vegyület mólekvivalensére számítva. Difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin4-il-észter kristályos dioxalátsója vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható szolvátja elõállítható difenil2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-ilmetil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter oxálsavval történõ érintkezésbe hozásával. Például az észter érintkezésbe hozható 1M vizes oxálsavval, hogy dioxalátsót képezzen, amelyet azután közömbös oldószerrel hozunk érintkezésbe. A dioxalátsó elõállításához az észtert jellemzõen (1:1) arányú acetonitril:víz oldatban oldjuk, vizes oxálsavval hígítjuk, vízzel hígítjuk és liofilizálással elkülönítjük. Általában ezt a reakciót körülbelül 0 °C és 30 °C közötti hõmérsékleten, úgymint körülbelül 24 °C¹on hajtjuk végre. Az észter milligrammjainak 1M vizes oxálsav milliliterjeihez viszonyított aránya körülbelül 320 mg/ml és körülbelül 280 mg/ml közötti, magában foglalva a körülbelül 300 mg/ml arányt. Egy konkrét kiviteli alakban vesszük az észter 510 mg¹ját 5 ml (1:1) arányú acetonitril:víz oldatban, és 1,7 ml 1M vizes oxálsavat adunk hozzá lassan, miközben folyamatosan ellenõrizzük a pH¹értéket. Azután a pH¹értéket megközelítõleg pH=3,0¹re állítjuk be. A tiszta oldatot szûrjük, fagyasztjuk és liofilizáljuk olyan szárazságúra, hogy dioxalátsót biztosítsunk. Egy kiviteli alakban a kapott dioxalátsót azután jellemzõen érintkezésbe hozzuk körülbelül 5 mg/ml és körülbelül 15 mg/ml közötti koncentrációban közömbös oldószerrel. Általában ezt a reakciót körülbelül 50 °C és 70 °C közötti hõmérsékleten, úgymint körülbelül 60 °C¹on hajtjuk végre. Egy konkrét kiviteli alakban a dioxalátsót (94:6) arányú izopropanol:víz oldathoz adjuk hozzá. Ebben a reakcióban a dioxalátsó milligrammjainak izopropanol:víz oldat milliliterjeihez viszonyított aránya körülbelül 10:0,8 és körülbelül 10:3 közötti, magában foglalva a körülbelül 10:1 arányt. Kristályos dioxalátsó elõállítható oly módon is, hogy kialakítjuk az észter (fentiekben leírt úton szintetizált) kristályos dioxalátsójának magkristályát, az észtert oxálsavval érintkezésbe hozva létrehozzuk az észter dioxalátsóját, és a sót közömbös oldószerben feloldjuk, hogy oldatot képezzen, és a magkristályt hozzáadjuk az oldathoz. Egy kiviteli alakban dioxalátsót jellemzõen körülbelül 5 mg/ml és körülbelül 15 mg/ml közötti koncentrációban
2
közömbös oldószerrel hozunk érintkezésbe. Általában ezt a reakciót körülbelül 50 °C és 70 °C közötti elsõ hõmérsékleten, úgymint körülbelül 60 °C¹on hajtjuk végre. A keveréket azután lehûtjük körülbelül 3 °C és 10 °C kö5 zötti második hõmérsékletre, úgymint körülbelül 4 °C¹ra. Ezt követõen az észter kristályos dioxalátsójának magkristályát hozzáadjuk. Egy konkrét kiviteli alakban a dioxalátsót (94:6) arányú izopropanol:víz oldathoz adjuk. Ebben a reakcióban a dioxalátsó milligrammjainak izo10 propanol:víz oldat milliliterjeihez viszonyított aránya körülbelül 150:10 és körülbelül 150:16 közötti, magában foglalva a körülbelül 150:13 arányt.
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
Szabad bázis kristály A difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin4-il-észter egy kristályos szabad bázisa vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható szolvátja elõállítható difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter közömbös oldószerrel történõ érintkezésbe hozásával. Kristályos szabad bázis egyik formájának (I forma) elõállítása céljából az észtert jellemzõen érintkezésbe hozzuk körülbelül 5 mg/ml és körülbelül 15 mg/ml közötti koncentrációban közömbös oldószerrel. Általában ezt a reakciót körülbelül 20 °C és 30 °C közötti hõmérsékleten, úgymint körülbelül 25 °C¹on hajtjuk végre. Egy konkrét kiviteli alakban az észtert hozzáadjuk (1:1) arányú víz:acetonitril oldathoz. Ebben a reakcióban az észter milligrammjainak víz:acetonitril oldat milliliterjeihez viszonyított aránya körülbelül 100:0,3 és körülbelül 100:1 közötti, magában foglalva a körülbelül 100:0,5 arányt. Egy másik lehetõség szerint a reakció végrehajtható egy elsõ, körülbelül 20 °C és 30 °C közötti hõmérsékleten, úgymint körülbelül 25 °C¹on, és azután lehûthetõ egy második, körülbelül 3 °C és 10 °C közötti hõmérsékletre, úgymint körülbelül 4 °C¹ra. Kristályos szabad bázis elõállítható oly módon is, hogy kialakítjuk (a fentiekben leírt úton szintetizált) kristályos szabad bázis magkristályát, az észtert közömbös oldószerrel érintkezésbe hozva kristályos szabad bázist hozunk létre, és a kapott kristályos észtert feloldjuk, hogy oldatot képezzen, és a magkristályt hozzáadjuk az oldathoz. Egy kiviteli alakban az észtert jellemzõen érintkezésbe hozzuk körülbelül 5 mg/ml és körülbelül 15 mg/ml közötti koncentrációban közömbös oldószerrel. Általában ezt a reakciót egy elsõ, körülbelül 50 °C és 70 °C közötti hõmérsékleten, úgymint körülbelül 60 °C¹on hajtjuk végre. A keveréket azután lehûtjük egy második, körülbelül 3 °C és 10 °C közötti hõmérsékletre, úgymint körülbelül 4 °C¹ra. Ezt követõen hozzáadjuk az észter kristályos szabad bázisának magkristályát, amit több melegítõ- és hûtõciklus követ. Az elsõ melegítõciklus például körülbelül 30 °C¹tól 40 °C¹ig, és azután körülbelül 50 °C¹ig tart, amit szobahõmérsékletre történõ hûtés követ. A második, harmadik stb. melegítõciklusok magukban foglalják a minta felmelegítését körülbelül 50 °C és 70 °C közötti hõmér-
1
HU 007 494 T2
sékletre, úgymint körülbelül 60 °C¹ra, amit szobahõmérsékletre történõ hûtés követ. Egy konkrét kiviteli alakban az észtert hozzáadjuk (1:1) arányú víz:acetonitril oldathoz, amit víz és további acetonitril hozzáadása követ. Ebben a reakcióban az észter milligrammjainak acetonitril és víz milliliterjeihez viszonyított aránya körülbelül 230:0,1 és körülbelül 230:0,5 közötti, magában foglalva a körülbelül 230:0,2 arányt. Kristályos szabad bázis másik formájának (II forma) elõállítása céljából az észtert jellemzõen érintkezésbe hozzuk körülbelül 200 mg/ml és körülbelül 100 mg/ml közötti koncentrációban közömbös oldószerrel. Általában ezt a reakciót körülbelül 20 °C és 30 °C közötti hõmérsékleten, úgymint körülbelül 25 °C¹on hajtjuk végre. Különösen megfelelõ közömbös oldószer egy acetonitril és metil-t-butil-éter alkotta kombináció. Egy konkrét kiviteli alakban difenil-2-il-karbaminsav-1(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]-metilamino}-etil)-piperidin-4-il-észtert acetonitrilhez adunk, amit metil-t-butil-éter és további acetonitril hozzáadása követ. Ebben a reakcióban az észter milligrammjainak (1:2) arányú acetonitril:metil-t-butil-éter-oldat milliliterjeihez viszonyított aránya körülbelül 200 mg/ml és körülbelül 100 mg/ml közötti, magában foglalva a körülbelül 70:0,45 arányt. Kristályjellemzõk Több elõny között felismertük, hogy az I képlet szerinti kristályos vegyület kialakítása hasznos az I képlet szerinti vegyület tisztítása céljából. Például: a kristályos difoszfátsó tisztasága nagyobb, mint 96% és jellemzõen nagyobb, mint 98%. Amint az ismeretes a por-röntgendiffrakció (PXRD) szakterületén, a PXRD-spektrumok relatív csúcsmagasságai számos, a minta elõkészítésével és a mûszer geometriájával kapcsolatos tényezõtõl függnek, míg a csúcsok elhelyezkedése viszonylag érzéketlen a kísérlet részleteire. Így egy kiviteli alakban a találmány szerinti kristályos vegyületeket meghatározott csúcshelyekkel rendelkezõ PXRD-képpel jellemezzük. Egy kiviteli alakban az I képlet szerinti vegyület kristályos difoszfátsóját olyan PXRD-képpel jellemezzük, amely kettõ vagy több diffrakciós csúccsal rendelkezik a következõk közül választott 2q értékeknél: 6,4±0,2, 7,6±0,2, 8,6±0,2, 13,7±0,2, 15,0±0,2, 19,4±0,2, 21,6±0,2, 22,1±0,2, 22,9±0,2 és 23,7±0,2. Egy konkrét kiviteli alakban ezt a kristályos formát olyan PXRD-képpel jellemezzük, amely diffrakciós csúcsokat tartalmaz a következõ 2q értékeknél: 15,0±0,2, 19,4±0,2, 21,6±0,2 és 23,7±0,2. Egy másik kiviteli alakban kristályos difoszfátsót olyan PXRD-képpel jellemzünk, amelyben a csúcshelyek lényegében az 1. ábrán bemutatottaknak felelnek meg. Figyeljük meg a különbségeket az 1. ábrán látható PXRD-kép és a kevésbé stabil difoszfátsó 6. ábra szerinti PXRD-képe között! Egy kiviteli alakban az I képlet szerinti vegyület kristályos monoszulfátsóját olyan PXRD-képpel jellemezzük, amely kettõ vagy több diffrakciós csúccsal rendelkezik a következõk közül választott 2q értékeknél: 7,7±0,2, 8,4±0,2, 8,8±0,2, 12,6±0,2, 13,7±0,2,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
14,1±0,2, 15,3±0,2, 16,0±0,2, 19,7±0,2, 20,6±0,2, 23,0±0,2 és 24,4±0,2. Egy konkrét kiviteli alakban ezt a kristályos formát olyan PXRD-képpel jellemezzük, amely diffrakciós csúcsokat tartalmaz a következõ 2q értékeknél: 12,6±0,2, 19,7±0,2, 23,0±0,2 és 24,4±0,2. Egy másik kiviteli alakban kristályos monoszulfátsót olyan PXRD-képpel jellemzünk, amelyben a csúcshelyek lényegében a 8. ábrán bemutatottaknak felelnek meg. Egy kiviteli alakban az I képlet szerinti vegyület kristályos dioxalátsóját olyan PXRD-képpel jellemezzük, amely kettõ vagy több diffrakciós csúccsal rendelkezik a következõk közül választott 2q értékeknél: 7,7±0,2, 8,7±0,2, 13,5±0,2, 14,0±0,2, 14,8±0,2, 15,4±0,2, 15,8±0,2, 19,4±0,2, 22,9±0,2, 23,3±0,2 és 24,6±0,2. Egy konkrét kiviteli alakban ezt a kristályos formát olyan PXRD-képpel jellemezzük, amely diffrakciós csúcsokat tartalmaz a következõ 2q értékeknél: 8,7±0,2, 14,0±0,2, 19,4±0,2 és 22,9±0,2. Egy másik kiviteli alakban kristályos dioxalátsót olyan PXRD-képpel jellemzünk, amelyben a csúcshelyek lényegében a 13. ábrán bemutatottaknak felelnek meg. Egy kiviteli alakban az I képlet szerinti vegyület (1 formájú) kristályos szabad bázisát olyan PXRD-képpel jellemezzük, amely kettõ vagy több diffrakciós csúccsal rendelkezik a következõk közül választott 2q értékeknél: 4,7±0,2, 9,6±0,2, 12,7±0,2, 13,7±0,2, 16,7±0,2, 17,4±0,2, 18,5±0,2, 19,4±0,2, 20,8±0,2, 21,4±0,2, 24,2±0,2 és 25,6±0,2. Egy konkrét kiviteli alakban ezt a kristályos formát olyan PXRD-képpel jellemezzük, amely diffrakciós csúcsokat tartalmaz a következõ 2q értékeknél: 4,7±0,2, 18,5±0,2, 20,8±0,2 és 25,6±0,2. Egy másik kiviteli alakban (I formájú) kristályos szabad bázist olyan PXRD-képpel jellemzünk, amelyben a csúcshelyek lényegében a 18. ábrán bemutatottaknak felelnek meg. Egy kiviteli alakban az I képlet szerinti vegyület (II formájú) kristályos szabad bázisát olyan PXRD-képpel jellemezzük, amely kettõ vagy több diffrakciós csúccsal rendelkezik a következõk közül választott 2q értékeknél: 4,6±0,2, 9,3±0,2, 12,9±0,2, 13,6±0,2, 14,0±0,2, 14,6±0,2, 16,5±0,2, 18,6±0,2, 19,1±0,2, 20,9±0,2, 22,1±0,2, 22,7±0,2 és 25,7±0,2. Egy konkrét kiviteli alakban ezt a kristályos formát olyan PXRD-képpel jellemezzük, amely diffrakciós csúcsokat tartalmaz a következõ 2q értékeknél: 4,6±0,2, 18,6±0,2, 22,1±0,2 és 22,7±0,2. Egy másik kiviteli alakban (II formájú) kristályos szabad bázist olyan PXRD-képpel jellemzünk, amelyben a csúcshelyek lényegében a 23. ábrán bemutatottaknak felelnek meg. Egy még további kiviteli alakban az I képlet szerinti kristályos vegyületeket differenciális pásztázó kalorimetriás (DSC¹) görbéjükkel jellemezzük. Így az I képlet szerinti vegyület kristályos difoszfátsóját a DSC-görbéjével jellemezzük, amely maximális endotermikus hõáramot mutatott körülbelül 154,5 °C¹nál, amint azt a 2. ábrán szemléltettük. Figyeljük meg a 2. ábra szerinti DSC-görbe és a 7. ábrán ábrázolt, kevésbé stabil difoszfátsóra vonatkozó DSC-görbe közötti különbséget! A stabil kristályos difoszfátsóra vonatkozó DSC-görbe
1
HU 007 494 T2
(2. ábra) jellegzetes alacsony hõmérsékletû átmenetet mutat, amit egy viszonylag hegyes csúcs követ körülbelül 154,5 °C¹on. Ezzel szemben a labilis kristályos difoszfátsó DSC-görbéje (7. ábra) határozott lépcsõt mutat egy sokkal kisebb olvadási átmenetet megelõzõen körülbelül 150,3 °C¹on. Hasonlóan, az I képlet szerinti vegyület kristályos monoszulfátsóját a DSC-görbéjével jellemezzük, amely maximális endotermikus hõáramot mutatott körülbelül 76,5 °C¹nál, amint azt a 10. ábrán szemléltettük; kristályos dioxalátsót a DSC-görbéjével jellemezzük, amely maximális endotermikus hõáramot mutatott körülbelül 73,7 °C¹nál, amint azt a 15. ábrán szemléltettük; (I formájú) kristályos szabad bázist a DSC-görbéjével jellemezzük, amely maximális endotermikus hõáramot mutatott körülbelül 102,7 °C¹nál, amint azt a 19. ábrán szemléltettük; és (II formájú) kristályos szabad bázist a DSC-görbéjével jellemezzük, amely maximális endotermikus hõáramot mutatott körülbelül 98,6 °C¹nál, amint azt a 24. ábrán szemléltettük. A találmány szerinti kristályos vegyületekrõl kimutattuk, hogy reverzíbilis szorpciós/deszorpciós jelleggörbével rendelkeznek a higroszkóposság elfogadható, mérsékelt szintjével: az I képlet szerinti vegyület kristályos difoszfátsója 2%¹nál kisebb tömegnövekedést mutat, amikor 90%¹ot elérõ relatív nedvességtartalom hatásának tesszük ki; kristályos monoszulfátsója 4%¹nál kisebb tömegnövekedést mutat, amikor 90%¹ot elérõ relatív nedvességtartalom hatásának tesszük ki; kristályos dioxalátsója 3%¹nál kisebb tömegnövekedést mutat, amikor 90%¹ot elérõ relatív nedvességtartalom hatásának tesszük ki; (I formájú) kristályos szabad bázisa 6%¹nál kisebb tömegnövekedést mutat, amikor 90%¹ot elérõ relatív nedvességtartalom hatásának tesszük ki; és (II formájú) kristályos szabad bázisa 4%¹nál kisebb tömegnövekedést mutat, amikor 90%¹ot elérõ relatív nedvességtartalom hatásának tesszük ki. Azonkívül a találmány szerinti kristályos vegyületeket stabilnak találtuk megemelt hõmérséklet és nedvesség hatásának kitéve. Például 1 hónapig 40 °C¹on és 75% relatív nedvességtartalom mellett történt tárolás után nagy teljesítményû folyadékkromatográfia (HPLC) segítségével végzett analízis nem mutatott detektálható kémiai bomlást (vagyis a bomlás 0,5%-nál kisebb volt) a találmány szerinti kristályos vegyületekre vonatkozóan. A találmány szerinti kristályos vegyületek ezen jellemzõinek további szemléltetését adjuk az alábbi példákban.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50 Gyógyszerkészítmények és ¹formulációk Az I képlet szerinti kristályos vegyületet jellemzõen gyógyszerkészítmény vagy ¹formuláció formájában adjuk be betegnek. Ilyen gyógyszerkészítmények beadhatók a betegnek a beadás bármilyen elfogadható útján, beleértve, nem korlátozva azonban ezekre, az inhalációval történõ, az orális, a nazális, a helyi (beleszámítva a transzdermális) és parenterális beadási módokat. Azonban szakemberek számára világos, hogy amint a találmány szerinti kristályos sót formuláztuk, az
55
60 8
2
többé nem lehet kristályos formában, azaz a só alkalmas hordozóanyagban fel lehet oldva. Következésképpen egy kiviteli alakban a találmány gyógyszerkészítményre irányul, amely gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot vagy kötõanyagot, és kristályos difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin4-il-észtert vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható szolvátját tartalmazza. A gyógyszerkészítmény kívánság szerint tartalmazhat más gyógyászati és/vagy formulázás céljára szolgáló hatóanyagokat. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények jellemzõen kristályos difenil-2-il-karbaminsav-1(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]-metilamino}-etil)-piperidin-4-il-észter vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható szolvátja gyógyászatilag hatásos mennyiségét tartalmazzák hatóanyagként. Jellemzõ módon ilyen gyógyszerkészítmények körülbelül 0,01 tömeg% és körülbelül 95 tömeg% közötti koncentrációban tartalmaznak hatóanyagot, magában foglalva a hatóanyag körülbelül 0,01 tömeg% és körülbelül 30 tömeg% közötti, úgymint a körülbelül 0,01 tömeg% és 10 tömeg% közötti koncentrációját. Bármely hagyományos hordozóanyag vagy kötõanyag alkalmazható a találmány szerinti gyógyszerkészítményekben. Egy meghatározott hordozóanyag vagy kötõanyag, vagy hordozóanyagok és kötõanyagok kombinációjának kiválasztása egy konkrét beteg kezeléséhez alkalmazott beadási módtól, vagy az orvosi kezelésre szoruló állapot vagy a betegségi állapot típusától függ. Ebbõl a szempontból tekintve, meghatározott beadási módra alkalmas gyógyszerkészítmény elõállítása a gyógyszerészeti szakmában járatos szakemberek szakterületéhez tartozik. Azonkívül ilyen készítmények számára az alkotórészek kereskedelemben beszerezhetõk például a Sigma, P. O. Box 14508, St. Louis, MO 63178 vállalattól. További magyarázatként utalunk arra, hogy hagyományos formulációs eljárásokat írnak le a [Remington, „The Science and Practice of Pharmacy”, A gyógyszerészet tudománya és gyakorlata, 20. kiadás, kiad.: Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); és H. C. Ansel és munkatársai, „Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems”, Gyógyszerészeti dózisformák és gyógyszerhordozó rendszerek, 7. kiadás, kiad.: Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999)] szakirodalmi kiadványokban. Olyan anyagokra vonatkozó jellegzetes példák, amelyek gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagokként szolgálhatnak, magukban foglalják a következõket, nem korlátozva azonban ezekre: cukrok, úgymint laktóz, glükóz és szacharóz; keményítõk, úgymint kukoricakeményítõ és burgonyakeményítõ; cellulóz és származékai, úgymint nátrium-karboxi-metil-cellulóz, etil-cellulóz és cellulóz-acetát; porított tragakant; maláta; zselatin; talkum; kötõanyagok, úgymint kakaóvaj és viaszok kúp számára; olajok, úgymint földimogyoróolaj, gyapotmagolaj, pórsáfrányolaj, szezámolaj, olívaolaj, kukoricaolaj és szójababolaj; glikolok, úgymint propilénglikol; poliolok, úgymint glicerin, szorbit, mannit
1
HU 007 494 T2
és polietilénglikol; észterek, úgymint etil-oleát és etillaurát; agar-agar; pufferanyagok, úgymint magnéziumhidroxid és alumínium-hidroxid; alginsav; pirogénmentes víz; izotóniás sóoldat; Ringer-oldat; etil-alkohol; foszfátpufferoldatok; sûrített hajtógázok, úgymint klórfluor-szénhidrogének és hidrofluor-szénhidrogének; és más nem mérgezõ, kompatibilis anyagok, amelyeket gyógyszerkészítményekben alkalmaznak. A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket jellemzõen úgy állítjuk elõ, hogy a találmány szerinti vegyületet teljesen és alaposan összekeverjük vagy elegyítjük gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal és egy vagy több választható alkotórésszel. Ha szükséges vagy megkívánt, akkor a kapott, egyenletesen elegyített keveréket azután alakra lehet formázni, vagy tablettákba, kapszulákba, pirulákba, fémtartályokba, patronokba, adagolókba és más hasonlókba lehet tölteni hagyományos eljárások és berendezések alkalmazásával. Egy kiviteli alakban a találmány szerinti gyógyszerkészítmények alkalmasak inhalációval történõ beadásra. Inhalációval történõ beadásra alkalmas gyógyszerkészítmények jellemzõen aeroszol vagy por formában állnak rendelkezésre. Ilyen készítményeket általában jól ismert hordozóeszközök alkalmazásával adunk be, úgymint porlasztós inhalátorral, meghatározott dózist adagoló inhalátorral (MDI-vel), szárazpor-inhalátorral (DPl-vel) vagy hasonló hordozóeszközzel. A találmány egy konkrét kiviteli alakjában a hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítményt inhalálás útján adjuk be porlasztós inhalátor alkalmazásával. Ilyen porlasztós eszközök jellemzõen nagy sebességû levegõ áramlatát hozzák létre, amely a hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmény olyan ködként való porlasztását okozza, amelyet a beteg légutaiba továbbítunk. Következésképpen amikor a hatóanyagot porlasztós inhalátorban történõ alkalmazás céljára formulázzuk, jellemzõen szétoszlatjuk egy alkalmas hordozóanyagban, hogy oldatot képezzen. Megfelelõ porlasztós eszközök kereskedelemben hozzáférhetõk, például a PARI GmbH (Starnberg, Németország) vállalattól. További porlasztós eszközök közé tartozik a Respimat (Boehringer Ingelheim) és azok, amelyeket leírnak például a 6,123,068 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Lloyd és mtsai, és a WO 97/12687 számú nemzetközi közzétételi iratban (Eicher és munkatársai), amelyek feltárásai hivatkozás útján a kitanítás részét képezik teljes egészükben. Porlasztós inhalátorban történõ alkalmazásra szolgáló jellegzetes gyógyszerkészítmény olyan vizes oldatot tartalmaz, amely az I képlet szerinti kristályos vegyületet vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható szolvátját körülbelül 0,05 mg/ml és körülbelül 10 mg/ml közötti koncentrációban foglalja magában. Egy kiviteli alakban a vizes formuláció izotóniás. Egy kiviteli alakban a vizes formuláció pH¹értéke a körülbelül 4¹tõl 6¹ig terjedõ tartományba esik. Egy konkrét kiviteli alakban a vizes formulációt citrátpufferrel körülbelül pH=5 értékre pufferoljuk. Egy másik konkrét kiviteli alakban a vizes formuláció difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
piperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin4-il-észter körülbelül 0,1 mg/ml és körülbelül 1,0 mg/ml közötti szabad bázis egyenértékét tartalmazza. A találmány egy további konkrét kiviteli alakjában a hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítményt inhalálás útján DPI¹t alkalmazva adjuk be. Ilyen DPI¹k jellemzõen olyan ömleszthetõ porként juttatják be a hatóanyagot, amely eloszlik beteg levegõáramlatában belélegzés alatt. Ömleszthetõ por elérése céljából a hatóanyagot jellemzõen megfelelõ kötõanyaggal, úgymint laktózzal vagy keményítõvel formulázzuk. A mikronizálás egy szokásos eljárása a kristályméret olyan mértékû csökkentésének, hogy az megfelelõ legyen pulmonális gyógyszerbejuttatáshoz. Jellemzõ módon a hatóanyagot mikronizáljuk és megfelelõ hordozóanyaggal kombináljuk, hogy belélegezhetõ méretû mikronizált részecskék szuszpenzióját képezzük, ahol a „mikronizált részecskék” vagy „mikronizált forma” kifejezések azt jelentik, hogy a részecskék legalább körülbelül 90%¹a körülbelül 10 mm-nél kisebb átmérõvel rendelkezik. Részecskeméret csökkentésének más eljárásai szintén alkalmazhatók, úgymint a finomõrlés, az aprítás, a zúzás, a darálás, az õrlés, a szitálás, a porrá morzsolás, a porítás stb., feltéve hogy a kívánt részecskeméretet el lehet érni. DPI-ben történõ alkalmazásra szolgáló jellegzetes gyógyszerkészítmény körülbelül 1 mm és körülbelül 100 mm közötti részecskemérettel rendelkezõ száraz laktózt, és az I képlet szerinti kristályos vegyület mikronizált részecskéit vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható szolvátját tartalmazza. Ilyen szárazpor-formuláció készíthetõ például a laktóznak a hatóanyaggal történõ kombinálásával, és azután az alkotórészek szárazelegyítésével. Másik lehetõség szerint, ha megkívánt, a hatóanyag kötõanyag nélkül formulázható. A gyógyszerkészítményt akkor jellemzõen egy szárazpor-adagolóba, vagy szárazporos hordozóeszközzel történõ alkalmazásra szolgáló inhalációs patronokba vagy kapszulákba töltjük. DPI hordozóeszközökre vonatkozó példák közé tartoznak a Diskhaler (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC; lásd pl. Newell és munkatársai 5,035,237 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírását); a Diskus (GlaxoSmithKline; lásd pl. Davies és munkatársai 6,378,519 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírását); a Turbuhaler (AstraZeneca, Wilmington, DE; lásd pl. Wetterlin 4,524,769 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírását); a Rotahaler (GlaxoSmithKline; lásd pl. Hallworth és munkatársai 4,353,365 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírását) és a Handihaler (Boehringer Ingelheim). Megfelelõ DPI eszközökre vonatkozó további példákat írnak le Casper és munkatársai az 5,415,162 számú, Evans az 5,239,993 számú, és Armstrong és munkatársai az 5,715,810 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban, és az azokban idézett hivatkozásokban. A fent említett szabadalmak feltárásai hivatkozás útján a kitanítás részét képezik teljes egészükben. A találmány egy még további meghatározott kiviteli alakjában a hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészít-
1
HU 007 494 T2
ményt inhalálás útján MDI¹t alkalmazva adjuk be, amely jellemzõen a hatóanyag vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható sója, vagy szolvátja, vagy sztereoizomere kimért mennyiségét bocsátja ki sûrített hajtógáz felhasználásával. Ennek megfelelõen MDI alkalmazásával beadott gyógyszerkészítmények jellemzõen a hatóanyag cseppfolyós hajtógázban képzett oldatát vagy szuszpenzióját tartalmazzák. Bármilyen megfelelõ cseppfolyós hajtógáz alkalmazható beleértve a klór-fluor-szénhidrogéneket, úgymint a CCl3F¹t, és a hidrofluor-alkánokat (HFA-kat), úgymint az 1,1,1,2tetrafluor-etánt (HFA 134a¹t) és az 1,1,1,2,3,3,3-heptafluor-n¹propánt (HFA 227¹et). Azon megfontolások miatt, hogy a klór-fluor-szénhidrogének hatással vannak az ózonrétegre, HFA-kat tartalmazó formulációk általában elõnyösek. HFA-formulációk további választható alkotórészei magukban foglalnak koszolvenseket, úgymint etanolt vagy pentánt, és felületaktív anyagokat, úgymint szorbitán-trioleátot, olajsavat, lecitint, és glicerint. Lásd például Purewal és munkatársai 5,225, 183 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírását, az EP 0717987 A2 jelû európai közzétételi iratot (Minnesota Mining and Manufacturing Company) és a WO 92/22286 számú nemzetközi közzétételi iratot (Minnesota Mining and Manufacturing Company), amelyek feltárásai hivatkozás útján a kitanítás részét képezik teljes egészükben. Meghatározott dózist adagoló inhalátorban történõ alkalmazásra szolgáló jellegzetes gyógyszerkészítmény a következõket tartalmazza: körülbelül 0,01 tömeg% és 5 tömeg% közötti koncentrációban az I képlet szerinti kristályos vegyület vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható szolvátja; körülbelül 0 tömeg% és 20 tömeg% közötti koncentrációban etanol; és körülbelül 0 tömeg% és 5 tömeg% közötti koncentrációban felületaktív anyag; miközben a maradék HFA hajtógáz. Ilyen készítmények jellemzõen úgy készülnek, hogy hûtött vagy túlnyomásos hidrofluor-alkánt adagolunk egy megfelelõ tartályba, amely a hatóanyagot, (ha jelen van) etanolt és (ha jelen van) a felületaktív anyagot tartalmazza. Szuszpenzió elõállítása céljából a hatóanyagot mikronizáljuk, és azután a hajtógázzal kombináljuk. A formulációt azután aeroszol-fémtartályba töltjük, amely meghatározott dózist adagoló inhalátor eszköz részét képezi. Kifejezetten HFA hajtógázokkal történõ alkalmazásra kifejlesztett, meghatározott dózist adagoló inhalátor eszközökre vonatkozó példákat írnak le Marecki a 6,006,745 számú, és Ashurst és munkatársai a 6,143,277 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban. Másik lehetõség szerint szuszpenziós formuláció készíthetõ a hatóanyag mikronizált részecskéin felületaktív anyagból képzett bevonat porlasztva szárításával. Lásd például a WO 99/53901 számú (Glaxo Group Ltd.) és a WO 00/61108 számú (Glaxo Group Ltd.) nemzetközi közzétételi iratokat. A fent említett szabadalmak és publikációk feltárásai hivatkozás útján a kitanítás részét képezik teljes egészükben. Belélegezhetõ részecskék elõállításának eljárásaira, és inhalációs adagolásra megfelelõ formulációkra
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 10
2
és eszközökre vonatkozó további példákat illetõen lásd Gao és munkatársai 6,268,533 számú, Trofast 5,983,956 számú, Briggner és munkatársai 5,874,063 számú, és Jakupovic és munkatársai 6,221,398 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásait, és a WO 99/55319 számú (Glaxo Group Ltd.) és WO 00/30614 számú (AstraZeneca AB) nemzetközi közzétételi iratokat, amelyek feltárásai hivatkozás útján a kitanítás részeit képezik teljes egészükben. Egy másik kiviteli alakban a találmány szerinti gyógyszerkészítmények alkalmasak orális beadásra. Orális beadásra alkalmas gyógyszerkészítmények a következõ formákban állhatnak rendelkezésre: kapszulák, tabletták, pirulák, szopogatós tabletták, ostyák, drazsék, porok, granulátum; vagy vizes vagy nemvizes folyadékban létrehozott oldatként vagy szuszpenzióként; vagy „olaj a vízben” vagy „víz az olajban” folyékony emulzióként; vagy elixírként vagy szirupként; és más hasonlók; amelyek mindegyike hatóanyagként egy, a találmány szerinti só elõre meghatározott mennyiségét tartalmazza. A gyógyszerkészítményt egységdózisformában lehet csomagolni. Amikor a találmány szerinti gyógyszerkészítményeket orális beadásra szánjuk szilárd dózisformában (vagyis kapszulákként, tablettákként, pirulákként és más hasonlókként), akkor azok jellemzõen hatóanyagként egy, a találmány szerinti kristályos vegyületet, és egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot, úgymint nátrium-citrátot vagy dikalciumfoszfátot tartalmaznak. Adott esetben vagy másik lehetõség szerint ilyen szilárd dózisformák tartalmazhatják az alábbiakat is: töltõanyagok vagy térfogatnövelõ szerek, úgymint keményítõk, laktóz, szacharóz, glükóz, mannit és/vagy kovasav; kötõanyagok, úgymint karboxi-metil-cellulóz, alginátok, zselatin, poli(vinil-pirrolidon), szacharóz és/vagy akáciagumi; nedvességet visszatartó szerek (humektánsok), úgymint glicerin; lazítóanyagok, úgymint agar-agar, kalcium-karbonát, burgonya- vagy tápiókakeményítõ, alginsav, bizonyos szilikátok és/vagy nátrium-karbonát; oldatkésleltetõ szerek, úgymint paraffin; abszorpciógyorsító szerek, úgymint kvaterner ammóniumvegyületek; nedvesítõszerek, úgymint cetil-alkohol és/vagy glicerin-monosztearát; abszorbensek, úgymint kaolin és/vagy bentonit agyag; kenõanyagok, úgymint talkum, kalcium-sztearát, magnézium-sztearát, szilárd polietilénglikolok, nátrium-lauril-szulfát és/vagy ezek keverékei; színezékek, és pufferanyagok. Tapadásgátló anyagok, nedvesítõszerek, bevonóanyagok, édesítõszerek, aroma- és illatanyagok, tartósítószerek és antioxidánsok szintén jelen lehetnek a találmány szerinti készítményekben. Gyógyszerészetileg elfogadható antioxidánsokra vonatkozó példák közé tartoznak: vízben oldható antioxidánsok, úgymint aszkorbinsav, cisztein-hidroklorid, nátrium-biszulfát, nátrium-metabiszulfát, nátrium-szulfid és más hasonlók; olajban oldható antioxidánsok, úgymint aszkorbil-palmitát, butilezett hidroxi-anizol (BHA), butilezett hidroxitoluol (BHT), lecitin, propil-gallát, alfa-tokoferol és más
1
HU 007 494 T2
hasonlók; és fémkelátképzõk, úgymint citromsav, etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA), szorbit, borkõsav, foszforsav és más hasonlók. Tabletták, kapszulák, pirulák és hasonlók számára szolgáló bevonóanyagok közé tartoznak azok, amelyeket bélben oldódó bevonathoz alkalmaznak, úgymint cellulóz-acetát-ftalát (CAP), polivinil-acetát-ftalát (PVAP), hidroxi-propil-metil-cellulóz-ftalát, metakrilsav-metakrilsav-észter kopolimerek, cellulóz-acetát-trimellitát (CAT), karboxi-metiletil-cellulóz (CMEC), hidroxi-propil-metil-cellulózacetát-szukcinát (HPMCAS) és más hasonlók. Ha megkívánt, a találmány szerinti gyógyszerkészítményeket úgy is lehet formulázni, hogy a hatóanyag lassú vagy szabályozott leadását biztosítsák például hidroxi-propil-metil-cellulózt változó arányokban, vagy más polimer beágyazóanyagokat, liposzómákat és/vagy mikrogömböket alkalmazva. Azonkívül a találmány szerinti gyógyszerkészítmények adott esetben tartalmazhatnak opálosítóanyagokat, és oly módon lehetnek formulázottak, hogy a hatóanyagot csak, vagy elõnyösen, a gasztrointesztinális szervek bizonyos részén adják le adott esetben késleltetett módon. Alkalmazható beágyazókompozíciókra vonatkozó példák magukban foglalnak polimer anyagokat és viaszokat. A hatóanyag rendelkezésre állhat mikrokapszulázott formában is, ha megfelelõ, akkor egy vagy több, a fentiekben leírt kötõanyaggal. Orális beadásra alkalmas folyékony dózisformák közé tartoznak példának okáért gyógyszerészetileg elfogadható emulziók, mikroemulziók, oldatok, szuszpenziók, szirupok és elixírek. Ilyen folyékony dózisformák jellemzõen a következõket tartalmazzák: a hatóanyag és egy közömbös hígítószer, úgymint például víz vagy más oldószerek, oldódást könnyítõ szerek és emulgálószerek, úgymint etil-alkohol, izopropil-alkohol, etil-karbonát, etil-acetát, benzil-alkohol, benzil-benzoát, propilénglikol, 1,3-butilénglikol, olajok (különösen gyapotmag¹, földimogyoró¹, kukorica¹, csíra¹, olíva¹, ricinus¹, és szezámolajok), glicerin, tetrahidrofuril-alkohol, polietiléngliokolok és szorbitán zsírsav-észterei, és ezek keverékei. Szuszpenziók a hatóanyagon kívül tartalmazhatnak szuszpendálószereket, úgymint például etoxilezett izosztearil-alkoholokat, polioxi-etilén-szorbités ¹szorbitán-észtereket, mikrokristályos cellulózt, alumínium-metahidroxidot, bentonitot, agar-agart és tragakantot, és ezek keverékeit. A találmány szerinti kristályos vegyületeket be lehet adni transzdermálisan is ismert transzdermális hordozórendszerek és kötõanyagok alkalmazásával. Például egy találmány szerinti vegyületet össze lehet keverni permeációt fokozó szerrel, úgymint propilénglikollal, polietilénglikol-monolauráttal, aza-cikloalkán-2-onokkal és más hasonlókkal, és bele lehet foglalni ragtapaszba vagy hasonló hordozórendszerbe. További kötõanyagok, köztük gélesítõszerek, emulgálószerek és pufferek alkalmazhatók ilyen transzdermális készítményekben, ha megkívánt. A találmány szerinti kristályos vegyületeket be lehet adni más gyógyászati hatóanyagokkal együtt is. Ez a kombinációs gyógymód magában foglalja egy, a talál-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 11
2
mány szerinti vegyület alkalmazását ezen másodlagos hatóanyagok közül eggyel vagy többel alkotott kombinációban akár úgy, hogy együtt formulázottak (pl. együtt csomagoltak egyetlen formulációban), akár úgy, hogy külön formulázottak (pl. külön egységdózisformákként csomagoltak). Több hatóanyag ugyanabban a formulációban történõ együttes, vagy külön egységdózisformákban megvalósuló formulázásának eljárásai jól ismertek a szakmában. A további gyógyászati hatóanyag(ok) az alábbiak közül választható(k): más hörgõtágítók (pl. PDE3 inhibitorok, adenozin¹2b modulátorok és b2-adrenerg receptor agonisták); gyulladásellenes hatóanyagok [pl. szteroid gyulladásellenes hatóanyagok, úgymint kortikoszteroidok; nemszteroid gyulladásellenes hatóanyagok (NSAID¹k; „non-steroidal anti-inflammatory drugs”) és PDE4 inhibitorok]; más muszkarin receptor antagonisták (azaz antikolinerg hatóanyagok); fertõzésgátló hatóanyagok (pl. Gram-pozitív és Gram-negatív kórokozók elleni antibiotikumok vagy vírusellenes szerek); antihisztaminok; proteáz inhibitorok; és afferens blokkolók (pl. D2 agonisták és neurokinin modulátorok). A találmány egy konkrét kiviteli alakja egy olyan készítményre irányul, amely az alábbiakat tartalmazza: (a) gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyag és az I képlet szerinti vegyület kristályos formájának gyógyászatilag hatásos mennyisége; és (b) gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyag és egy olyan hatóanyag gyógyászatilag hatásos mennyisége, amely szteroid gyulladásellenes hatóanyag, úgymint egy kortikoszteroid; b2-adrenerg receptor agonista; foszfodieszteráz¹4 inhibitor; vagy ezek kombinációja közül választott; és amely készítményben az I képlet szerinti vegyület és a hatóanyag együtt vagy külön formulázott. Egy további kiviteli alakban (b) alkotórészt gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyag, és b2-adrenerg receptor agonista és szteroid gyulladásellenes hatóanyag gyógyászatilag hatásos mennyisége alkotja. A másodlagos hatóanyagok alkalmazhatók gyógyszerészetileg elfogadható sók vagy szolvátok formájában, és ha megfelelõ, akkor optikailag tiszta sztereoizomerekként. A találmány szerinti kristályos vegyületekkel való kombinációban alkalmazható jellegzetes b2-adrenerg receptor agonisták közé tartoznak, nem korlátozva azonban ezekre, az alábbiak: szalmeterol, szalbutamol, formoterol, szalmefamol, fenoterol, terbutalin, albuterol, izoetarin, metaproterenol, bitolterol, pirbuterol, levalbuterol és más hasonlók, vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható sói. További alkalmazható b2-adrenerg receptor agonisták közé tartoznak, nem korlátozva azonban ezekre, az alábbiak: 3¹(4¹{[6¹({(2R)-2-hidroxi-2[4¹hidroxi-3-(hidroxi-metil)-fenil]-etil}-amino)-hexil]-oxi}butil)-benzolszulfonamid és 3¹(¹3-{[7¹{(7¹({(2R)-2-hidroxi-2-[4¹hidroxi-3-(hidroxi-metil)-fenil]-etil}-amino)-heptil]oxi}-propil)-benzolszulfonamid és rokon vegyületek, amelyeket leírnak a WO 02/066422 számú (Glaxo Group Ltd.) nemzetközi közzétételi iratban; 3¹[3¹(4¹{[6¹([(2R)-2-hidroxi-2-[4¹hidroxi-3-(hidroxi-metil)fenil]-etil}-amino)-hexil]-oxi}-butil)-fenil]-imidazolidin-2,4dion és rokon vegyületek, amelyeket leírnak a
1
HU 007 494 T2
WO 02/070490 számú (Glaxo Group Ltd.) nemzetközi közzétételi iratban; 3¹(4¹{[6¹({(2R)-2-[3¹(formil-amino)-4hidroxi-fenil]-2-hidroxi-etil}-amino)-hexil]-oxi}-butil)-benzolszulfonamid, 3¹(4¹{[6¹({(2S)-2-[3¹(formil-amino)-4hidroxi-fenil]-2-hidroxi-etil}-amino)-hexil]-oxi}-butil)-benzolszulfonamid, 3¹(4¹{[6¹({(2R/S)-2-[3¹(formil-amino)-4hidroxi-fenil]-2-hidroxi-etil}-amino)-hexil]-oxi}-butil)-benzolszulfonamid, N¹(terc-butil)-3-(4¹{[6¹({(2R)-2-[3¹(formil-amino)-4-hidroxi-fenil]-2-hidroxi-etil}-amino)-hexil]oxi}-butil)-benzolszulfonamid, N¹(terc-butil)-3(4¹{[6¹({(2S)-2-[3¹(formil-amino)-4-hidroxi-fenil]-2-hidroxi-etil}-amino)-hexil]-oxi}-butil)-benzolszulfonamid, N¹(terc-butil)-3-(4¹{[6¹({(2R/S)-2-[3¹(formil-amino)-4-hidroxi-fenil]-2-hidroxi-etil}-amino)-hexil]-oxi}-butil)-benzolszulfonamid és rokon vegyületek, amelyeket leírnak a WO 02/076933 számú (Glaxo Group Ltd.) nemzetközi közzétételi iratban; 4¹{(1R)-2-[(6¹{2¹[(2,6-diklór-benzil)oxi]-etoxi}-hexil)-amino]-1-hidroxi-etil}-2-(hidroxi-metil)fenol és rokon vegyületek, amelyeket leírnak a WO 03/024439 számú (Glaxo Group Ltd.) nemzetközi közzétételi iratban; N¹{2¹[4¹((R)-2-hidroxi-2-fenil-etilamino)-fenil]-etil}-(R)-2-hidroxi-2-(3¹formamido-4-hidroxi-fenil)-etil-amin és rokon vegyületek, amelyeket Moran és munkatársai leírnak a 6,576,793 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban; N¹{2¹[4¹(3¹fenil-4-metoxi-fenil)-amino-fenil]-etil}-(R)-2hidroxi-2-(8¹hidroxi-2(1H)-kinolinon-5¹il)-etil-amin és rokon vegyületek, amelyeket Moran és munkatársai leírnak a 6,653,323 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban; és ezek gyógyszerészetileg elfogadható sói. Egy konkrét kiviteli alakban a b2-adrenoreceptor agonista N¹{2¹[4¹((R)-2-hidroxi-2-fenil-etil-amino)-fenil]-etil}-(R)-2-hidroxi-2-(3¹formamido-4-hidroxi-fenil)-etil-amin kristályos monohidrokloridsója. Alkalmazása esetén a b2-adrenoreceptor agonista gyógyászatilag hatásos mennyiségben van jelen a gyógyszerkészítményben. Jellemzõen a b2-adrenoreceptor agonista olyan mennyiségben van jelen, amely elegendõ körülbelül 0,05 mg és 500 mg közötti dózisonkénti mennyiség biztosításához. A fent említett szabadalmak és publikációk feltárásai hivatkozás útján a kitanítás részét képezik teljes egészükben. A találmány szerinti kristályos vegyületekkel való kombinációban alkalmazható jellegzetes szteroid gyulladásellenes hatóanyagok közé tartoznak, nem korlátozva azonban ezekre, az alábbiak: metilprednizolon, prednizolon, dexametazon, flutikazon-propionát. 6a,9a-difluor-17a-[(2¹furanil-karbonil)-oxi]-11b-hidroxi16a-metil-3-oxo-androszta-1,4-dién-17b-tiokarbonsavS¹fluor-metil-észter, 6a,9a-difluor-11b-hidroxi-16a-metil-3-oxo-17a-propionil-oxi-androszta-1,4-dién-17b-tiokarbonsav-S¹(2¹oxo-tetrahidrofurán-3S¹il)-észter, beklometazon-észterek (pl. a 17¹propionát-észter vagy a 17,21-dipropionát-észter), budezonid, flunizolid, mometazon-észterek (pl. a furoát-észter), triamkinolonacetonid, rofleponid, ciklezonid, butixokort-propionát, RPR-106541, ST¹126 és más hasonlók, vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható sói. Alkalmazása esetén a szteroid gyulladásellenes hatóanyag gyógyászatilag hatásos mennyiségben van jelen a készítmény-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 12
2
ben. Jellemzõen a szteroid gyulladásellenes hatóanyag olyan mennyiségben van jelen, amely elegendõ körülbelül 0,05 mg és 500 mg közötti dózisonkénti mennyiség biztosításához. Példaként szolgáló kombináció az I képlet szerinti vegyület kristályos formája vagy annak szolvátja együtt beadva szalmeterollal mint a b2-adrenerg receptor agonistával, és flutikazon-propionáttal mint a szteroid gyulladásellenes hatóanyaggal. További példaként szolgáló kombináció az I képlet szerinti vegyület kristályos formája vagy annak szolvátja együtt beadva N¹{2¹[4¹((R)-2-hidroxi-2-fenil-etil-amino)-fenil]-etil}-(R)2-hidroxi-2-(3¹formamido-4-hidroxi-fenil)-etil-amin kristályos monohidrokloridsójával mint a b2-adrenoreceptor agonistával, és 6a,9a-difluor-17a-[(2¹furanil-karbonil)-oxi]-11b-hidroxi-16a-metil-3-oxo-androszta-1,4dién-17b-tiokarbonsav-S¹fluor-metil-észterrel mint a szteroid gyulladásellenes hatóanyaggal. Amint azt a fentiekben megjegyeztük, ezek a hatóanyagok lehetnek együtt vagy külön formulázottak. További megfelelõ kombinációk magukban foglalják például a következõket: más gyulladásellenes hatóanyagok, pl. NSAID¹k (pl. nátrium-kromoglikát, nedokromil-nátrium, és foszfodiészteráz (PDE) inhibitorok, úgymint teofillin, PDE4 inhibitorok és kevert PDE3/PDE4 inhibitorok); leukotrién antagonisták (pl. montelukaszt); leukotriénszintézis inhibitorai; iNOS inhibitorok (iNOS: „inducible nitric oxide synthase”, indukálható nitrogén-monoxid-szintáz); proteáz inhibitorok, úgymint triptáz és elasztáz inhibitorok; béta-2-integrin antagonisták és adenozin receptor agonisták vagy antagonisták (pl. adenozin¹2a agonisták); citokin antagonisták [pl. kemokin antagonisták, úgymint egy interleukin antitest (alL antitest), különösen egy aIL–4 terápia, egy aIL–13 terápia vagy ezek kombinációja]; vagy citokinszintézis inhibitorai. A találmány szerinti kristályos vegyületekkel való kombinációban alkalmazható jellegzetes foszfodiészteráz¹4 (PDE4) inhibitorok vagy kevert PDE3/PDE4 inhibitorok közé tartoznak, nem korlátozva azonban ezekre, az alábbiak: cisz-4-ciano-4-(3¹ciklopentil-oxi-4-metoxifenil)-ciklohexán-1-karbonsav, 2¹karbometoxi-4-ciano4-(3¹ciklopropil-metoxi-4-difluor-metoxi-fenil)-ciklohexán-1¹on; cisz-[4¹ciano-4-(3’-ciklopropil-metoxi-4-difluor-metoxi-fenil)-ciklohexán-1¹ol]; cisz-4-ciano-4[3¹(ciklopentil-oxi)-4-metoxi-fenil]-ciklohexán-1-karbonsav és más hasonlók, vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható sói. További jellegzetes PDE4 vagy kevert PDE4/PDE3 inhibitorok közé tartoznak a következõk: AWD-12–281 (elbion); NCS-613 (INSERM); D¹4418 (Chiroscience and Schering-Plough); CI¹1018 vagy PD¹168787 (Pfizer); a WO 99/16766 számú (Kyowa Hakko) nemzetközi közzétételi iratban leírt benzodioxolvegyületek; K¹34 (Kyowa Hakko); V¹11294A (Napp); roflumilaszt (Byk-Gulden); a WO 99/47505 számú (BykGulden) nemzetközi közzétételi iratban leírt ftalazinonvegyületek; pumafentrin (Byk-Gulden, most már Altana); arofillin (Almirall-Prodesfarma); VM554/UM565 (Vernalis); T¹440 (Tanabe Seiyaku); és T2585 (Tanabe Seiyaku).
1
HU 007 494 T2
A találmány szerinti kristályos vegyületekkel való kombinációban alkalmazható jellegzetes muszkarin antagonisták (azaz antikolinerg hatóanyagok) közé tartoznak, nem korlátozva azonban ezekre, az alábbiak: atropin, atropin-szulfát, atropin-oxid, metil-atropinnitrát, homatropin-hidrobromid, hioszciamin(d,l)-hidrobromid, szkopolamin-hidrobromid, ipratropium-bromid, oxitropium-bromid, tiotropium-bromid, metantelin, propantelin-bromid, anizotropin-metil-bromid, klidiniumbromid, glikopirrolát, (Robinul), izopropamid-jodid, mepenzolát-bromid, tridihexetil-klorid (Pathilone), hexociklium-metil-szulfát, ciklopentolát-hidroklorid, tropikamid, trihexifenidil-hidroklorid, pirenzepin, telenzepin, AF¹DX 116 és metoktramin, és más hasonlók, vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható sója; vagy sóként felsorolt vegyületek esetében azoknak gyógyszerészetileg elfogadható sóváltozata. A találmány szerinti kristályos vegyületekkel való kombinációban alkalmazható jellegzetes antihisztaminok (azaz H1 receptor antagonisták) közé tartoznak, nem korlátozva azonban ezekre, az alábbiak: etanolaminok, úgymint karbinoxamin-maleát, klemasztin-fumarát, difenil-hidramin-hidroklorid és dimenhidrinát; etilén-diaminok, úgymint piril-amin-maleát, tripelennaminhidroklorid és tripelennamin-citrát; alkil-aminok, úgymint klórfeniramin és akrivasztin; piperazinok, úgymint hidroxizin-hidroklorid, hidroxizin-pamoát, ciklizin-hidroklorid, ciklizin-laktát, meklizin-hidroklorid és cetirizinhidroklorid; piperidinek, úgymint asztemizol, levokabasztin-hidroklorid, loratadin vagy annak deszkarboetoxi analógja, terfenadin- és fexofenadin-hidroklorid; azelasztin-hidroklorid; és más hasonlók, vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható sója; vagy sóként felsorolt vegyületek esetében azoknak gyógyszerészetileg elfogadható sóváltozata. Hacsak nincs másképpen feltüntetve, a találmány szerinti kristályos vegyülettel való kombinációban beadott további gyógyászati hatóanyagok számára példaként szolgáló megfelelõ dózisok a körülbelül 0,05 mg/nap-tól 100 mg/nap¹ig terjedõ tartományba esnek. A következõ formulációk a találmány szerinti jellegzetes gyógyszerkészítményeket, valamint az elõállítás példaként szolgáló eljárásait szemléltetik. Egy vagy több másodlagos hatóanyag adott esetben a találmány szerinti kristályos vegyülettel (az elsõdleges hatóanyaggal) formulázható. Másik lehetõség szerint a másodlagos hatóanyago(ka)t külön lehet formulázni, és együtt lehet beadni az elsõdleges hatóanyaggal akár egyidejûleg, akár egymást követõen. Például egy kiviteli alakban külön szárazpor-formulációt lehet elõállítani, hogy magában foglalja mind a találmány szerinti kristályos vegyületet, mind az egy vagy több másodlagos hatóanyagot. Egy másik kiviteli alakban elõállítunk egy formulációt, hogy a találmány szerinti kristályos vegyületet tartalmazza, és külön formuláció(ka)t készítünk, hogy a másodlagos hatóanyago(ka)t foglalja magában (foglalják magukban). Ilyen szárazpor-formulációkat azután önálló fóliacsomagokba lehet csomagolni, és be lehet adni egy külön DPI eszközzel.
5
2
Példaként szolgáló szárazpor-formuláció inhalálás útján történõ beadáshoz A találmány szerinti kristályos vegyület 0,2 mg¹ját mikronizáljuk, és azután 25 mg laktózzal elegyítjük. Az elegyített keveréket azután zselatin inhalációs patronba töltjük. A patron tartalmát porinhalátor alkalmazásával adjuk be.
Példaként szolgáló szárazpor-formuláció szárazpor-inhalátorral történõ beadáshoz Szárazport készítünk a találmány szerinti mikronizált kristályos vegyület (a hatóanyag) laktózhoz viszonyított 1:200¹as ömlesztett formulációs aránya mellett. A port szárazporos inhalációs eszközbe töltjük, amely 15 képes dózisonként körülbelül 10 mg és 100 mg közötti hatóanyag leadására. 10
20
25
30
35
40
Példaként szolgáló formulációk kimért dózist adagoló inhalátorral történõ beadáshoz A találmány szerinti kristályos vegyületet (a hatóanyagot) 5 tömeg%-ban és lecitint 0,1 tömeg%-ban tartalmazó szuszpenziót készítünk oly módon, hogy 10 mm-nél kisebb közepes méretû mikronizált részecskékként rendelkezésre álló hatóanyag 10 g¹ját eloszlatjuk egy olyan oldatban, amelyet 0,2 g lecitin 200 ml ioncserélt vízben való feloldásával kapunk. A szuszpenziót porlasztva szárítjuk, és a kapott anyagot olyan részecskékké mikronizáljuk, amelyek közepes átmérõje kisebb, mint 1,5 mm. A részecskéket patronokba töltjük túlnyomásos 1,1,1,2-tetrafluoretánnal. Másik lehetõség szerint a hatóanyagot 5 tömeg%ban, lecitint 0,5 tömeg%-ban és trehalózt 0,5 tömeg%ban tartalmazó szuszpenziót készítünk oly módon, hogy 10 mm-nél kisebb közepes méretû mikronizált részecskékként rendelkezésre álló hatóanyag 5 g¹ját eloszlatjuk egy olyan kolloidális oldatban, amelyet 0,5 g trehalóz és 0,5 g lecitin 100 ml ioncserélt vízben való feloldásával kapunk. A szuszpenziót porlasztva szárítjuk, és a kapott anyagot olyan részecskékké mikronizáljuk, amelyek közepes átmérõje kisebb, mint 1,5 mm. A részecskéket fémtartályokba töltjük túlnyomásos 1,1,1,2-tetrafluor-etánnal.
Példaként szolgáló vizes aeroszol formuláció porlasztóval történõ beadáshoz Gyógyszerkészítményt állítunk elõ oly módon, hogy a találmány szerinti kristályos vegyület (a hatóanyag) 0,5 mg¹ját feloldjuk citromsavval savanyított 0,9%¹os 50 nátrium-klorid-oldat 1 ml¹jében. A keveréket addig keverjük és szonikáljuk, amíg a hatóanyag fel nem oldódik. Az oldat pH¹értékét NaOH lassú hozzáadásával 3¹tól 8¹ig terjedõ tartományba esõ értékre (jellemzõen körülbelül 5¹re) állítjuk be. 55 Példaként szolgáló keményzselatin-kapszula formuláció orális beadáshoz A következõ alkotórészeket alaposan elegyítjük, és azután keményzselatin-kapszulába töltjük: a találmány 60 szerinti kristályos vegyület 250 mg¹ja, 200 mg laktóz 45
13
1
HU 007 494 T2
(porlasztva szárított) és 10 mg magnézium-sztearát, összesen 460 mg készítmény kapszulánként. Példaként szolgáló szuszpenziós formuláció orális beadáshoz Az alábbi alkotórészeket összekeverjük, hogy olyan szuszpenziót hozzunk létre, amely 100 mg hatóanyagot tartalmaz a szuszpenzió 10 ml¹jében. Alkotórészek Mennyiség A találmány szerinti kristályos vegyület 1,0 g Fumársav 0,5 g Nátrium-klorid 2,0 g Metil-parabén 0,15 g Propil-parabén 0,05 g Kristálycukor 25,5 g Szorbit (70%¹os oldat) 12,85 g Veegum k (Vanderbilt Co.) 1,0 g Aromaanyag 0,035 ml Színezékek 0,5 mg Desztillált víz q.s. 100,ml¹ig Példaként szolgáló befecskendezhetõ formuláció Az alábbi alkotórészeket elegyítjük, és a pH¹értéket 4±0,5¹re állítjuk be 0,5 N HCl vagy 0,5 N NaOH alkalmazásával. Alkotórészek Mennyiség A találmány szerinti kristályos vegyület 0,2 g Nátrium-acetát-pufferoldat (0,4 M) 2,0 ml HCl (0,5 N) vagy NaOH (0,5 N) q.s. pH=4¹ig Víz (desztillált, steril) q.s. 20,ml¹ig Használhatóság Az I képlet szerinti vegyület muszkarin receptor antagonista aktivitással rendelkezik, és emiatt az I képlet szerinti vegyület kristályos formája elõreláthatólag hasznos muszkarin receptorok mediálta orvosi kezelésre szoruló állapotok kezelésében, azaz olyan orvosi kezelésre szoruló állapotok esetében, amelyeket muszkarin receptor antagonistával történõ kezelés javít. Ilyen orvosi kezelésre szoruló állapotok közé tartoznak példának okáért tüdõ-rendellenességek vagy ¹betegségek, köztük azok, amelyek visszafordítható légúti elzáródással kapcsolatosak, úgymint a krónikus obstruktív tüdõbetegség (pl. a krónikus és asztmatikus hörghurut, és az emfizéma), az asztma, a tüdõfibrózis, az allergiás nátha, az orrfolyás és más hasonlók. További, muszkarin receptor antagonistákkal kezelhetõ orvosi kezelésre szoruló állapotok a következõk: húgy- és ivarszervi rendellenességek, úgymint a túlzottan aktív húgyhólyag vagy a detrusor-hiperaktivitás és ezek tünetei; gasztrointesztinális szervek rendellenességei, úgymint az irritábilis bél szindróma, a divertikuláris betegség, az akhalázia, a gasztrointesztinális hipermotilitással járó rendellenességek és a hasmenés; szívritmuszavarok, úgymint a sinus bradycardia; Parkinson-kór; kognitív rendellenességek, úgymint az Alzheimer-kór; fájdalmas havivérzés; és más hasonlók.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 14
2
Ennek megfelelõen egy kiviteli alakban a találmány tüdõ-rendellenesség kezelésére szolgáló eljárásra irányul, amelynek során beadjuk betegnek kristályos difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-ilmetil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter vagy gyógyszerészetileg elfogadható szolvátjának gyógyászatilag hatásos mennyiségét. Tüdõ-rendellenesség kezelése céljából történõ alkalmazás esetén a találmány szerinti kristályos vegyületet jellemzõen inhalálás útján adjuk be naponkénti több dózisban, naponkénti egyetlen dózisban vagy hetenkénti egyetlen dózisban. Általában a tüdõ-rendellenesség kezelésére szolgáló dózis a körülbelül 10 mg/nap-tól 200 mg/nap¹ig terjedõ tartományba esik. Inhalálás útján történõ beadáskor a találmány szerinti kristályos vegyületek jellemzõen hörgõtágulást elõidézõ hatással rendelkeznek. Következésképpen egy további kiviteli alakban a találmány betegben hörgõtágulás elõidézésének eljárására irányul, amelynek során beadjuk betegnek kristályos difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter vagy gyógyszerészetileg elfogadható szolvátjának hörgõtágulást elõidézõ mennyiségét. Általában a hörgõtágulás elõidézésére szolgáló gyógyászatilag hatásos dózis körülbelül a körülbelül 10 mg/nap-tól 200 mg/nap¹ig terjedõ tartományba esik. Egy kiviteli alakban a találmány krónikus obstruktív tüdõbetegség vagy asztma kezelésének eljárására irányul, amelynek során beadjuk betegnek kristályos difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-ilmetil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter vagy gyógyszerészetileg elfogadható szolvátjának gyógyászatilag hatásos mennyiségét. COPD vagy asztma kezelése céljából történõ alkalmazás esetén a találmány szerinti sót jellemzõen inhalálás útján adjuk be naponkénti több dózisban vagy naponkénti egyetlen dózisban. Általában a COPD vagy asztma kezelésére szolgáló dózis a körülbelül 10 mg/nap-tól 200 mg/nap¹ig terjedõ tartományba esik. A leírás szerinti értelemben a COPD szakkifejezés magában foglalja a krónikus obstruktív hörghurutot és az emfizémát {lásd pl. a [Bames, „Chronic Obstructive Pulmonary Disease”, Krónikus obstruktív tüdõbetegség, N. Engl. J. Med., 343, 269–278, (2000)] szakirodalmi helyen}. Tüdõ-rendellenesség kezelésé céljából történõ alkalmazás esetén a találmány szerinti kristályos vegyületeket adott esetben további gyógyászati hatóanyagokkal való kombinációban adjuk be. Ennek megfelelõen egy konkrét kiviteli alakban a találmány szerinti gyógyszerkészítmények és eljárások magukban foglalják továbbá b2-adrenoreceptor agonista, kortikoszteroid, nemszteroid gyulladásellenes hatóanyag vagy ezek kombinációjának gyógyászatilag hatásos mennyiségét. Egy további kiviteli alakban a találmány szerinti kristályos vegyületeket abból a célból alkalmazzuk, hogy muszkarin receptort antagonizáljunk biológiai rendszerben és emlõsben, különösen úgymint egerekben, patkányokban, tengerimalacokban, nyulakban,
1
HU 007 494 T2
kutyákban, sertésekben, emberekben stb. Ebben a kiviteli alakban az I képlet szerinti kristályos vegyület gyógyászatilag hatásos mennyiségét adjuk be az emlõsnek. Ha megkívánt, a muszkarin receptor antagonizálásának hatásait azután meghatározhatjuk hagyományos eljárások és berendezések alkalmazásával. A találmány szerinti kristályos vegyületek tulajdonságai és használhatósága bemutathatók különféle in vitro és in vivo vizsgálatok alkalmazásával, amelyek jól ismertek szakemberek számára. Például jellegzetes vizsgálatok leírását adjuk meg további részletekre kiterjedõen a következõ példákban. Példák A következõ elõállítási példákat és példákat abból a célból biztosítjuk, hogy a találmány meghatározott kiviteli alakjait szemléltessük. Ezekkel a meghatározott kiviteli alakokkal azonban nem szándékozzuk korlátozni a találmány oltalmi körét semmilyen módon, kivéve hogyha kifejezetten erre utalunk. A következõ rövidítések az alábbi jelentésekkel rendelkeznek, kivéve hogyha másképpen tüntetjük fel, és bármely más, a leírásban alkalmazott és nem meghatározott rövidítés a szokásos jelentését hordozza. AC adenilil-cikláz ACh acetil-kolin ACN acetonitril BSA szarvasmarhaszérum-albumin cAMP 3’¹5’ ciklikus adenozin-monofoszfát CHO kínaihörcsög-petefészek cM5 klónozott csimpánz M5 receptor DCM diklór-metán (azaz metilén-klorid) DIPEA N,N-diizopropil-etil-amin dPBS Dulbecco-féle foszfátpufferes sóoldat DMSO dimetil-szulfoxid EDC 1-etil-3-(3¹dimetil-amino-propil)-karbodiimid EDTA etilén-diamin-tetraecetsav FBS magzati szarvasmarhaszérum FLIPR fluorometriás képalkotással mûködõ mikrolemezolvasó HBSS Hanks-féle pufferezett sóoldat HEPES 4-(2¹hidroxi-etil)-1-piperazin-etánszulfonsav hM1 klónozott humán M1 receptor hM2 klónozott humán M2 receptor hM3 klónozott humán M3 receptor hM4 klónozott humán M4 receptor hM5 klónozott humán M5 receptor HOBT N¹hidroxi-benzo-triazol HPLC nagy teljesítményû folyadékkromatográfia IPA izopropanol MCh metil-kolin MTBE metil-t-butil-éter TFA trifluor-ecetsav Bármely más, a leírásban alkalmazott, de nem meghatározott rövidítés a szokásos, általánosan elfogadott jelentését hordozza. Hacsak nincs másképpen jelezve, reagenseket, kiindulóanyagokat és oldószereket kereskedelmi beszállítóktól szereztünk be (úgymint a Sigma-Aldrich, a Fluka és más hasonló vállalatoktól), és azokat további tisztítás nélkül alkalmaztuk.
2
Hacsak nincs másképpen feltüntetve, a HPLC analízist egy Agilent (Palo Alto, CA) 1100¹as készülékkel hajtottuk végre, amely 3,5 mm¹es részecskeméretû Zorbax Bonus RP 2,1×50 mm¹es oszloppal (Agilent) 5 volt felszerelve. A detektálás UV¹abszorbancia mérésével történt 214 nm¹en. Az alkalmazott mozgófázisok a következõk voltak (térfogatra vonatkozóan): ’A’ – ACN (2%), víz (98%) és TFA (0,1%); és ’B’ – acetonitril (90%), víz (10%) és TFA (0,1%). HPLC 10–70 adato10 kat kaptunk 10%–70% ’B’ 0,5 ml/perc térfogatáramát alkalmazva 6 perces gradiens során (miközben a maradék az ’A’ volt). Hasonlóan HPLC 5–35 adatokat és HPLC 10–90 adatokat kaptunk, 5%¹35% ’B’; vagy 10%–90% ’B’ alkalmazásával 5 perces gradiens során. Kapcsolt folyadékkromatográfia-tömegspektromet15 ria (LCMS, „liquid chromatography mass spectrometry”) technikával nyert adatokat kaptunk egy Applied Biosystems (Foster City, CA) API-150EX készülékkel. LCMS 10–90 adatokat kaptunk 10%–90% ’B’ mozgófá20 zis alkalmazásával 5 perces gradiens során.
25
30
35
40
45
1. elõállítási példa Difenil-2-il-karbaminsav-piperidin-4-il-észter (97,5 g, 521 mmol) difenil-2-izocianátot és (105 g, 549 mmol) 4¹hidroxi-N¹benzil-piperidint melegítettünk együtt 70 °C¹on 12 órán keresztül. A reakciókeveréket azután lehûtöttük 50 °C¹ra, és (1 l) etanolt adtunk hozzá, majd ezután (191 ml) 6 M HCl¹ot adtunk hozzá lassan. Ezt követõen a kapott keveréket környezeti hõmérsékletre hûtöttük, és (98,5 g, 1,56 mol) ammóniumformiátot adtunk hozzá, majd azután erõteljesen nitrogéngázt buborékoItattunk keresztül az oldaton 20 percig. (20 g, szárazanyagra vonatkoztatva 10 tömeg%) aktív szén hordozós palládiumkatalizátort adtunk ezután hozzá, és a reakciókeveréket 40 °C¹on 12 órán keresztül melegítettük, és ezt követõen Celite szûrõlapon átszûrtük. Azután az oldószert eltávolítottuk csökkentett nyomáson, és (40 ml) 1 M HCl¹ot adtunk a nyers maradékhoz. Majd a keverék pH¹értékét 10 N NaOH-dal pH=12¹re állítottuk be. A vizes réteget (2×150 ml) etil-acetáttal extraháltuk, és a szerves réteget szárítottuk (magnézium-szulfáttal), szûrtük, és az oldószert eltávolítottuk csökkentett nyomás mellett, hogy a nevezett intermedier 155 g¹ját nyújtsuk (100% kihozatal). HPLC (10–70) Rt=2,52; m/z: [M+H + ] C18H20N2O2¹re számítva 297,15; mért 297,3.
2. elõállítási példa N¹Benzil-N¹metil-amino-acetaldehid 2 l¹es háromnyakú lombikba (30,5 g, 0,182 mol) 50 N¹benzil-N¹metil-etanol-amint, (0,5 l) DCM¹et, (95 ml, 0,546 mol) DIPEA¹t és (41 ml, 0,728 mol) DMSO¹t adagoltunk. Jégfürdõ alkalmazásával a keveréket körülbelül –10 °C¹ra hûtöttük, és (87 g, 0,546 mol) kén-tiroxid-piridin 55 komplexet adtunk hozzá 4 részletben 5 perces idõközönként. A reakció során keverést alkalmaztunk –10 °C¹on 2 órán keresztül. A jégfürdõ eltávolítása elõtt a reakciót (0,5 I) víz hozzáadásával elfojtottuk. A vizes fázist elkülönítettük, és a szerves fázist (0,5 l) vízzel és (0,5 l) sóol60 dattal mostuk, és azután magnézium-szulfáttal szárítot15
1
HU 007 494 T2
tuk, és szûrtük, hogy a nevezett vegyületet biztosítsuk, amelyet további tisztítás nélkül alkalmaztunk. 3. elõállítási példa Difenil-2-il-karbaminsav-1-[2¹(benzil-metil-amino)etil]-piperidin-4-il-észter A 2. elõállítási példa (0,5 I) DCM-ben tartalmazott termékét magában foglaló 2 l¹es lombikba adagoltuk az 1. elõállítási példa (30 g, 0,101 mol) termékét, amit (45 g, 0,202 mol) nátrium-triacetoxi-borohidrid hozzáadása követett. A reakciókeveréket másnapig kevertük, és azután elfojtottuk (0,5 I) 1 N sósav hozzáadásával erõteljes keverés mellett. Három fázist figyeltünk meg, és a vizes fázist eltávolítottuk. (0,5 l) 1 N NaOH-dal történõ mosás után homogén szerves fázist kaptunk, amelyet azután vizes NaCl (0,5 l) telített oldatával mostunk, magnézium-szulfáttal szántottunk, szûrtünk, és az oldószert eltávolítottuk csökkentett nyomás mellett. A maradékot minimális mennyiségû izopropanolban történõ feloldással, és szilárd anyag képzése céljából ezen oldat 0 °C¹ra való lehûtésével tisztítottuk, amit összegyûjtöttünk, és hideg izopropanollal mostunk, hogy a nevezett vegyület 42,6 g¹ját biztosítsuk (95% kihozatal). MS m/z: [M+H+] C28H33N3O2¹re számítva 444,3; mért 444,6. Rf=3,51 perc (10–70 ACN:H2O, fordított fázisú HPLC). 3A. elõállítási példa Difenil-2-il-karbaminsav-1-[2¹(benzil-metil-amino)etil]-piperidin-4-il-észter A nevezett vegyületet N¹benzil-N¹metil-etanol-amin mezilezése útján állítottuk elõ, amelyet azután difenil2-il-karbaminsav-piperidin-4-il-észterrel reagáltattunk egy alkilezési reakcióban. Egy 500 ml¹es lombikba (reakciós lombikba) (24,5 ml) N¹benzil-N¹metil-etanol-amint, (120 ml) DCM¹et, (80 ml; 30 tömeg%) NaOH¹ot és tetrabutil-ammónium-kloridot töltöttünk. A reakció során végig alacsony sebességgel keverve, a keveréket lehûtöttük –10 °C¹ra (hûtõfürdõben), és az adagolótölcsérbe (30 ml) DCM¹et és (15,85 ml) mezil-kloridot töltöttünk, amelyet cseppenként adagoltunk állandó sebességgel 30 percen keresztül. A hozzáadás hõfelszabadulással járt, és a keverést 15 percig folytattuk, amíg a hõmérséklet egyensúlyba került –10 °C¹ra visszaállva. A reakciót legalább 10 percen át fenntartottuk, hogy biztosítsuk a mezil-klorid-felesleg teljes hidrolízisét. Egy 250 ml¹es lombikba (26 g; az 1. elõállítási példában leírtak szerint elõállított) difenil-2-il-karbaminsavpiperidin-4-il-észtert és (125 ml) DCM¹et töltöttünk, szobahõmérsékleten 15 percen keresztül kevertük, és a keveréket rövid idõ alatt lehûtöttük 10 °C¹ra, hogy sûrû szuszpenziót képezzen. A sûrû szuszpenziót azután a reakciós lombikba töltöttük az adagolótölcséren keresztül. A hûtõfürdõt eltávolítottuk, és a reakciókeveréket 5 °C¹ra melegítettük. A keveréket átjuttattuk egy választótölcsérbe, hagytuk, hogy a fázisok szétváljanak, és a vizes fázist eltávolítottuk. A szerves fázist visszajuttattuk a reakciós lombikba, a keverést folytattuk, a keveréket szobahõmérsékleten tartottuk, és a reakciót HPLCvel figyeltük összesen 3,5 órán keresztül.
5
2
A reakciós lombikba (1 M oldat; 100 ml) NaOH¹ot töltöttünk, kevertük, és hagytuk, hogy a fázisok szétváljanak. A szerves fázist elkülönítettük, (telített NaCl-oldattal) mostuk, a térfogatát részlegesen lecsökkentettük vákuum alatt, és ismételt IPA-val történõ mosásoknak tettük ki. A szilárd anyagot összegyûjtöttük, és hagytuk levegõn száradni (25,85 g, 98% tisztaság). További szilárd anyagot kaptunk az anyaoldat újbóli feldolgozásával (térfogatcsökkentés, IPA, hûtés).
10 4. elõállítási példa Difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹metil-amino-etil)piperidin-4-il-észter Parr hidrogénezõlombikba a 3. elõállítási példa 15 (40 g, 0,09 mol) termékét és (0,5 l) etanolt adagoltunk. A lombikot nitrogéngázzal átöblítettük, és [15 g, (szárazanyagra vonatkoztatva) 10 tömeg%, 37% tömeg/tömeg] aktív szén hordozós palládiumkatalizátort adtunk hozzá (20 ml) ecetsavval együtt. A keveréket a Parr 20 hidrogénezõlombikban tartottuk (~50 psi, 344 738 Pa) hidrogénatmoszférában 3 órán keresztül. A keveréket azután szûrtük, és etanollal mostuk. A szûrletet kondenzáltuk, és a maradékot minimális mennyiségû DCM-ben feloldottuk. (10 térfogat) izopropil-acetátot 25 adtunk hozzá lassan, hogy szilárd anyagot képezzünk, amit összegyûjtöttünk, hogy a nevezett vegyület 22,0 g¹ját biztosítsuk (70% kihozatal). MS m/z: [M+H+] C21H27N3O2¹re számítva 354,2; mért 354,3. Rf=2,96 perc (10–70 ACN:H2O, fordított fázisú HPLC). 30 5. elõállítási példa Difenil-2-il-karbaminsav-1-{2¹[(4¹(formil-benzoil)metil-amino]-etil}-piperidin-4-il-észter 1 l¹es háromnyakú lombikba (4,77 g, 31,8 mmol) 35 4¹karboxi-benzaldehidet, (6,64 g, 34,7 mmol) EDC¹t, (1,91 g, 31,8 mmol) HOBT¹t és (200 ml) DCM¹et adagoltunk. Amikor a keverék homogén volt, a 4. elõállítási példa (10 g, 31,8 mmol) termékének (100 ml) DCM-ben készült oldatát lassan hozzáadtuk. A reakciókeveréket szo40 bahõmérsékleten kevertük megközelítõleg 16 órán keresztül, és azután (1×100 ml) vízzel, (5×60 ml) 1 N HCldal, (1×100 ml) 1 N NaOH-dal, (1×50 ml) sóoldattal mostuk, nátrium-szulfáttal szárítottuk, szûrtük és koncentráltuk, hogy a nevezett vegyület 12,6 g¹ját kapjuk (92% ki45 hozatal; 85%¹os tisztaság HPLC alapján). MS m/z: [M+H+] C29H31N3O4¹re számítva 486,2; mért 486,4. Rf=3,12 perc(?) (10–70 ACN:H2O, fordított fázisú HPLC).
50
1. példa Difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)piperidin-4-il-észter
55
2 l¹es háromnyakú lombikba (5,99 g, 40,0 mmol) 60 izonipekotamidot, (2,57 ml) ecetsavat, (6,44 g) nát16
1
HU 007 494 T2
rium-szulfátot és (400 ml) izopropanolt adagoltunk. A reakciókeveréket lehûtöttük 0 °C–10 °C¹ra jégfürdõvel, és (11 g, 22,7 mmol; az 5. elõállítási példában leírtak szerint elõállított) difenil-2-il-karbaminsav-1{2¹[(4¹(formil-benzoil)-metil-amino]-etil}-piperidin-4-ilészter (300 ml) izopropanolban készített oldatát lassan hozzáadtuk. A reakciókeveréket szobahõmérsékleten kevertük 2 órán keresztül, és azután 0 °C–10 °C¹ra hûtöttük. Részletekben (15,16 g, 68,5 mmol) nátrium-triacetoxi-borohidridet adtunk hozzá, és ezt a keveréket szobahõmérsékleten 16 órán keresztül kevertük. A reakciókeveréket azután koncentráltuk csökkentett nyomás alatt körülbelül 50 ml¹es térfogatra, és ezt a keveréket (200 ml) 1 N HCl-dal pH=3 értékre savanyítottuk. A kapott keveréket szobahõmérsékleten 1 órán keresztül kevertük, és azután (3×250 ml) DCM-mel extraháltuk. A vizes fázist ezt követõen 0 °C–5 °C¹ra hûtöttük jégfürdõvel, és 50%¹os vizes NaOH-oldatot adtunk hozzá, hogy beállítsuk a keverék pH¹értékét 10¹re. Ezt a keveréket azután (3×300 ml) izopropil-acetáttal extraháltuk, és a kevert szerves rétegeket (100 ml) vízzel, (2×50 ml) sóoldattal mostuk, nátrium-szulfáttal szárítottuk, szûrtük és koncentráltuk, hogy a nevezett vegyület 10,8 g¹ját kapjuk (80% kihozatal. MS m/z: [M+H+] C35H43N5O4¹re számítva 598,3; mért 598,6. Rf=2,32 perc (10–70 ACN:H2O, fordított fázisú HPLC). 2. példa Difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)piperidin-4-il-észter kristályos difoszfátsója 500 mg difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4il-észtert (96%¹os tiszta anyag 0,826 mmol¹ja; az 1. példában leírtak szerint elõállítva) felvettünk 5 ml vízben és 1,5 ml 1 M foszforsavban. A pH¹értéket megközelítõleg pH=5,3¹re állítottuk be további 0,25 ml 1 M foszforsavval (ami egyenlõ 2,1 mólekvivalenssel). A tiszta oldatot 0,2 mm¹es szûrõn keresztül szûrtük, fagyasztottuk és olyan szárazságúra liofilizáltuk, hogy amorf difoszfátsót szolgáltassunk. Az amorf difoszfátsó 20 mg¹ját feloldottuk (1:1) IPA:ACN 2 ml¹jében. Hozzáadtunk 0,1 ml vizet, és a keveréket 60 °C¹ra melegítettük keverés közben. Majdnem az összes szilárd anyag feloldódott. A szuszpenziót hagytuk környezeti hõmérsékletre hûlni keverés közben másnapig. A kapott kristályokat szûréssel összegyûjtöttük, és levegõn szárítottuk 20 percig, hogy a nevezett vegyületet nyújtsuk (18,5 mg, 93% kihozatal) fehér kristályos szilárd anyagként. Amikor polarizált fény alkalmazásával mikroszkóp alatt megvizsgáltuk a kristályokat, némi kettõs törést mutattak. 3. példa Difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)piperidin-4-il-észter kristályos difoszfátsója 5,0 g difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin4-il-észtert (szabad bázis; az 1. példában leírtak szerint
2
elõállítva) vegyítettünk 80 ml (1:1) lPA:ACN-nel. 4,0 ml vizet adtunk hozzá, és a keveréket 50 °C¹ra melegítettük keverés közben tiszta oldatot képezve. Ehhez 50 °C¹on 16 ml 1 M foszforsavat adagoltunk cseppen5 ként. A kapott zavaros oldatot 50 °C¹on kevertük 5 órán keresztül, majd hagytuk, hogy környezeti hõmérsékletre hûljön lassú keverés mellett másnapig. A kapott kristályokat szûréssel összegyûjtöttük, és levegõn 1 órán keresztül, majd vákuum alatt 18 órán keresztül szárítot10 tuk, hogy a nevezett vegyületet nyújtsuk (5,8 g, 75% kihozatal) fehér kristályos szilárd anyagként (98,3% tisztaság HPLC alapján).
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 17
4. példa Difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)piperidin-4-il-észter kristályos monoszulfátsója 442 mg difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4il-észtert (96%¹os tiszta anyag 0,739 mmol¹ja; az 1. példában leírtak szerint elõállítva) felvettünk 5 ml (1:1) H2O:ACN-ben, és 1,45 ml 1 N kénsavat adtunk hozzá lassan, miközben folyamatosan ellenõriztük a pH¹értéket. A pH¹értéket megközelítõleg pH 3,3¹ra állítottuk be. A tiszta oldatot 0,2 mm¹es szûrõn keresztül szûrtük, fagyasztottuk és olyan szárazságúra liofilizáltuk, hogy monoszulfátsót szolgáltassunk. A monoszulfátsó 30,3 mg¹ját feloldottuk 1,65 ml (10:1) lPA:ACN-ben. A szuszpenziót oly módon melegítettük, hogy a fiolát elõmelegített 60 °C¹os vízfürdõbe helyeztük 30 percre. Viszkózus anyag képzõdött, és a hõmérsékletet 70 °C¹ra emeltük 30 percig. Mivel az anyag viszkózus maradt, a hõmérsékletet lecsökkentettük 60 °C¹ra, és a keveréket további egy órán át melegítettük. A melegítést elzártuk, és a keveréket hagytuk szobahõmérsékletre hûlni. 4 nap elteltével az anyag szilárdnak tûnt, és a mintát állni hagytuk további kilenc napig. A szilárd anyagot azután szûrtük, és vákuumszivattyú alkalmazásával 1 órán keresztül szárítottuk, hogy a nevezett vegyületet nyújtsuk (23 mg, 76% kihozatal). 5. példa Difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)piperidin-4-il-észter kristályos monoszulfátsója A (4. példában leírtak szerint elõállított) monoszulfátsó 161 mg¹ját feloldottuk 8,77 ml (10:1) lPA:ACNben. A szuszpenziót oly módon melegítettük, hogy a fiolát elõmelegített 70 °C¹os vízfürdõbe helyeztük 1,5 órára. Olajcseppek képzõdtek 5 percen belül. A hõmérsékletet 60 °C¹ra csökkentettük, és a keveréket további 1,5 órán keresztül melegítettük, amit 50 °C¹on 40 perces, 40 °C¹on 40 perces, majd 30 °C¹on 45 perces melegítés követett. A melegítést elzártuk, és a keveréket hagytuk lassan szobahõmérsékletre hûlni. A következõ nap az anyagot megtekintettük mikroszkóp alatt, és az tûket és lemezeket mutatott. Az anyagot azután 40 °C¹on 2 órán keresztül, 35 °C¹on 30 percig és ezt követõen 30 °C¹on 30 percig melegítettük. A melegítést elzártuk, és a keveréket hagytuk
1
HU 007 494 T2
lassan szobahõmérsékletre hûlni. A szilárd anyagot azután szûrtük, és vákuumszivattyú alkalmazásával 1 órán keresztül szárítottuk, hogy a nevezett vegyületet nyújtsuk (117 mg, 73% kihozatal). 6. példa Difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)piperidin-4-il-észter kristályos dioxalátsója 510 mg difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4il-észtert (96%¹os tiszta anyag 0,853 mmol¹ja; az 1. példában leírtak szerint elõállítva) felvettünk 5 ml (1:1) H2O:ACN-ben, és 1,7 ml 1 M vizes oxálsavat adtunk hozzá lassan, miközben folyamatosan ellenõriztük a pH¹értéket. A pH¹értéket megközelítõleg pH=3,0¹re állítottuk be. A tiszta oldatot 0,2 mm¹es szûrõn keresztül szûrtük, fagyasztottuk és olyan szárazságúra liofilizáltuk, hogy dioxalátsót szolgáltassunk. A dioxalátsó 31,5 mg¹ját feloldottuk 2,76 ml 94% lPA/6% H2O-ban. A keveréket elõmelegített 60 °C¹os vízfürdõben 2,5 órán keresztül kevertük. 25 perc elteltével a minta egésze oldatban volt. A melegítést elzártuk, és a keveréket hagytuk szobahõmérsékletre hûlni. A következõ nap kis mennyiségû viszkózus anyag volt jelen. A fiolát 4 °C¹on hûtöttük. 4 nap elteltével a viszkózus anyag még mindig jelen volt. Azután a fiolát szobahõmérsékleten helyeztük el, és 1 hónappal késõbb megfigyeltük. Az anyag szilárdnak tûnt, és mikroszkóp alatt kristályosnak észleltük. A szilárd anyagot azután szûrtük, és vákuumszivattyú alkalmazásával 1 órán keresztül szárítottuk, hogy a nevezett vegyületet nyújtsuk (20 mg, 63,5% kihozatal). 7. példa Difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)piperidin-4-il-észter kristályos dioxalátsója A (6. példában leírtak szerint elõállított) dioxalátsó 150 mg¹ját feloldottuk 13,1 ml 94% IPA/6% H2O-ban. A keveréket elõmelegített 60 °C¹os vízfürdõben 2,5 órán keresztül kevertük. A melegítést elzártuk, és a keveréket hagytuk szobahõmérsékletre hûlni. A fiolát 4 °C¹on hûtöttük. 6 nap elteltével olajos anyagot észleltünk a fiola oldalán kristálynak tûnõ képzõdménnyel. Azután hagytuk, hogy a fiola elérje a szobahõmérsékletet, amelyen pontszerû magkristályokat (a 6. példából származó kristályos anyagot) adagoltunk, és állni hagytuk 16 napig. Ez alatt az idõ alatt több kristályt figyeltünk meg kiválni az oldatból. A szilárd anyagot ezután szûrtük, és vákuumszivattyú alkalmazásával 14 órán keresztül szárítottuk, hogy a nevezett vegyületet nyújtsuk (105 mg, 70% kihozatal). 8. példa Kristályos szabad bázis difenil-2-il-karbaminsav-1(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter (I forma) Az (1. példában leírtak szerint elõállított) difenil-2-ilkarbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-
2
benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter 109 mg¹ját feloldottuk 0,56 ml (1:1) H2O:ACN-ben. A szuszpenziót egy fiolában hagytuk (a kupakját lazán a tetejére téve), hogy figyelembe vegyük a hosszabb 5 párolgási idõt. A fiolát nitrogénáramlásos környezetbe helyeztük, bár a nitrogént nem párolgás céljából, hanem csak környezetként alkalmaztuk. Csapadék volt látható 1 nap múlva, amelyet kristályosnak figyeltünk meg mikroszkóp alatt. A szilárd anyagot azután nagy10 vákuum-vezetékbe helyeztük, hogy eltávolítsuk az összes oldószert a nevezett vegyület nyújtása céljából. Kvantitatív visszanyerés, 97,8% tisztaság HPLC alapján. Egy másik választható eljárásban (1:1) H2O:ACN15 ben (megközelítõleg 350 mg/ml koncentrációban) történõ feloldás után a fiolát 5 °C¹on tároltuk, és a csapadék a 2. napon látható volt. A szilárd anyagot szûrtük, vízzel öblítettük, és nagyvákuumban szárítottuk másnapig. A visszanyerés 55% volt a szilárd anyag 20 98,2%¹os tisztasága és a folyadék 92,8%¹os tisztasága mellett. 9. példa Kristályos szabad bázis difenil-2-il-karbaminsav-1(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]25 metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter (I forma) Az (1. példában leírtak szerint elõállított) difenil-2-ilkarbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter 30 50,4 mg¹ját feloldottuk 0,144 ml (1:1) H2O:ACN-ben. A szuszpenziót egy fiolában hagytuk (a kupakját lazán a tetejére téve), hogy figyelembe vegyük a hosszabb párolgási idõt. A fiolát 4 °C¹on hûtöttük 6 napon keresztül. Csapadék volt látható 2 nap elteltével. A szilárd 35 anyagot szûrtük és nagyvákuum-vezetékbe helyeztük, hogy eltávolítsuk az összes oldószert, és a nevezett vegyületet nyújtsuk fehér szilárd anyagként (27,8 mg, 55,2% kihozatal). 40
45
50
55
60 18
10. példa Kristályos szabad bázis difenil-2-il-karbaminsav-1(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter (I forma) Az (1. példában leírtak szerint elõállított) difenil-2-ilkarbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter 230 mg¹ját feloldottuk 0,2 ml (1:1) H2O:ACN-ben csekély hõ alkalmazásával. A keveréket azután 70 °C¹os vízfürdõben 2 órán keresztül melegítettük. A melegítést elzártuk, és a keveréket hagytuk szobahõmérsékletre hûlni, azután 4 °C¹on hûtöttük 1 órán keresztül. Ezt követõen 50 ml vizet adtunk hozzá (olajként kivált), amit 40 ml ACN hozzáadása követett, hogy oldatban kapjuk vissza a mintát. Magkristályokat (a 8. példából származó kristályos anyagot) adtunk hozzá lassú keverés mellett szobahõmérsékleten. Kristályok kezdtek képzõdni, és a keveréket lassú keverés mellett másnapig pihentettük. A következõ nap egy melegítõ¹/hûtõciklust alkalmaztunk (30 °C 10 percig, 40 °C 10 percig majd 50 °C 20 percig). A meleget elzártuk, és a keveréket hûlni
1
HU 007 494 T2
hagytuk másnapig lassú keverés mellett. A következõ nap egy második melegítõ¹/hûtõciklust alkalmaztunk (60 °C 1 órán keresztül, 70 °C¹on oldódás megfigyelésével). A melegítést elzártuk, és a keveréket hûlni hagytuk másnapig lassú keverés mellett. A következõ nap kristályok voltak jelen, és egy harmadik melegítõ¹/hûtõciklust alkalmaztunk (60 °C 3 órán keresztül). A melegítést elzártuk, és a keveréket hûlni hagytuk másnapig lassú keverés mellett. A következõ nap egy melegítõ¹/hûtõciklust alkalmaztunk (60 °C 3 órán keresztül, lassú hûtés majd 60 °C 3 órán keresztül). A melegítést elzártuk, és a keveréket hûlni hagytuk másnapig lassú keverés mellett. 3 nap elteltével a szilárd anyagot szûrtük, és nagyvákuum-vezetékbe helyeztük, hogy eltávolítsuk az összes oldószert, és a nevezett vegyületet nyújtsuk. 11. példa Kristályos szabad bázis difenil-2-il-karbaminsav-1(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter (II forma) Az (1. példában leírtak szerint elõállított) difenil-2-ilkarbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter 70 mg¹ját feloldottuk 0,1 ml ACN-ben. 0,3 ml MTBE hozzáadása után az oldat zavarosnak tûnt. További 50 ml ACN¹t adtunk hozzá az oldat tisztulása céljából (155 mg/ml ACN:MTBE=1:2). A keveréket a fiolában hagytuk, és kupakkal lezártuk. Kristályok jelentek meg a következõ napra. Ezt követõen a szilárd anyagot szûrtük, és nagyvákuum-vezetékbe helyeztük, hogy eltávolítsuk az összes oldószert, és a nevezett vegyületet nyújtsuk. 12. példa Por-röntgendiffrakció Por-röntgendiffrakciós képeket kaptunk Rigaku típusú diffraktométerrel Cu Ka (30,0 kV, 15,0 mA) sugárzás alkalmazásával. Az analízist úgy végeztük el, hogy a goniométert 3°/perc¹es folyamatos letapogatás üzemmódban 0,03° lépésnagysággal 2°¹tól 45°¹ig terjedõ tartományban mûködtettük. A mintákat kvarc mintatartókon készítettük el porított anyag vékony rétegeként. A mûszert szilíciumfém etalonnal hitelesítettük. A 2. példa szerinti difoszfátsó mintájára vonatkozó PXRD-kép az anyagot kristályosnak mutatta. A 3. példa szerinti kristályos difoszfátsó mintájára vonatkozó jellegzetes PXRD-képet mutatunk az 1. ábrán. A 4. példa szerinti monoszulfátsó mintájára vonatkozó PXRDkép az anyagot kristályosnak mutatta. Az 5. példa szerinti kristályos monoszulfátsó mintájára vonatkozó jellegzetes PXRD-képet mutatunk a 8. ábrán. A 6. példa szerinti dioxalátsó mintájára vonatkozó PXRD-kép az anyagot kristályosnak mutatta. A 7. példa szerinti kristályos dioxalátsó mintájára vonatkozó jellegzetes PXRD-képet mutatunk a 13. ábrán. A 8. és 9. példák szerinti (I formájú) szabad bázis mintájára vonatkozó PXRD-kép az anyagot kristályosnak mutatta. A 10. példa szerinti (I formájú) szabad bázis mintájára vonatkozó jellegzetes PXRD-képet mutatunk a 18. ábrán. A 11.
2
példa szerinti (II formájú) szabad bázis mintájára vonatkozó jellegzetes PXRD-képet mutatunk a 23. ábrán.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 19
13. példa Termikus analízis Differenciális pásztázó kalorimetriát (DSC¹t) végeztünk a TA Instruments vállalat Q10 típusú egységét egy Thermal Analyst szabályozóval alkalmazva. Az adatokat a TA Instruments vállalat Thermal Solutions szoftverét használva rögzítettük és analizáltuk. Körülbelül 1 mg–4 mg¹os mintát mértünk ki pontosan egy fedõvel ellátott alumíniumedénybe. A mintát oly módon értékeltük ki, hogy 10 °C/perc¹es lineáris melegítési felfutást alkalmaztunk környezeti hõmérsékletrõl megközelítõleg 300 °C¹ra. A DSC-cellát jól kitisztítottuk száraz nitrogénnel a használat során. A 3. példa szerinti kristályos difoszfátsó mintájára vonatkozó jellegzetes DSC-görbe két átmenetet mutatott körülbelül 63,8 °C¹on és 154,3 °C¹on, amint az a 2. ábrán látható. Ez a DSC-görbe szemlélteti, hogy ez a kristályos difoszfátsó elfogadható–jó termikus stabilitással rendelkezik az olvadási csúcspont körülbelül 154,5 °C¹os értékével, és nincs hõ hatására történõ bomlás 150 °C alatt. A DSC-görbe endotermikus hõáram kezdetét is mutatta körülbelül 135 °C¹on. A 4. példa szerinti monoszulfátsó mintájára vonatkozó jellegzetes DSC-görbe két átmenetet mutatott körülbelül 57 °C¹on és 73,2 °C¹on. Az 5. példa szerinti kristályos monoszulfátsó mintájára vonatkozó jellegzetes DSC-görbe átmenetet mutatott 76 °C¹on, amint az a 10. ábrán látható, szemléltetve, hogy ez a kristályos monoszulfátsó olvadási csúcsponttal rendelkezik körülbelül 76,5 °C¹on. A 6. példa szerinti kristályos dioxalátsó mintájára vonatkozó jellegzetes DSC-görbe két átmenetet mutatott 69,2 °C¹on és 122,8 °C¹on. A 7. példa szerinti kristályos dioxalátsó mintájára vonatkozó jellegzetes DSCgörbe átmenetet mutatott 73 °C¹on, amint az a 15. ábrán látható. Ez a DSC-görbe szemlélteti, hogy ez a kristályos dioxalátsó olvadási csúcsponttal rendelkezik körülbelül 73,7 °C¹on. A 8. példa szerinti (I formájú) kristályos szabad bázis mintájára vonatkozó jellegzetes DSC-görbe átmenetet mutatott 90,4 °C¹on. A 9. példa szerinti (I formájú) kristályos szabad bázis mintájára vonatkozó DSC-görbe két átmenetet mutatott 86,1 °C¹on és 103,6 °C¹on. A 10. példa szerinti (I formájú) kristályos szabad bázis mintájára vonatkozó jellegzetes DSC-görbe zárt edényben két átmenetet (83,9 °C¹on és 102,1 °C¹on), de nyitott edényben 102,5 °C¹on egy átmenetet mutatott (a korai csúcs a víz és/vagy az oldószerek miatt mutatkozik), amint az a 19. ábrán látható. Ez a DSCgörbe szemlélteti, hogy ez a kristályos szabad bázis kitûnõ termikus stabilitással rendelkezik az olvadási csúcspont körülbelül 102,7 °C¹os értékével, és nincs hõ hatására történõ bomlás 80 °C alatt. A DSC-görbe endotermikus hõáram kezdetét is mutatta körülbelül 90 °C¹on. A 11. példa szerinti (II formájú) kristályos szabad bázis mintájára vonatkozó jellegzetes DSC-görbe átmene-
1
HU 007 494 T2
tet mutatott 98,6 °C¹on, amint az a 24. ábrán látható, szemléltetve, hogy ez a kristályos szabad bázis kitûnõ termikus stabilitással rendelkezik az olvadási csúcspont körülbelül 98,6 °C¹os értékével, és nincs hõ hatására történõ bomlás 75 °C alatt. A DSC-görbe endotermikus hõáram kezdetét is mutatta körülbelül 75 °C¹on. Termogravimetriás analízist (TGA¹t) végeztünk a TA Instruments vállalat Q50 típusú, nagy felbontóképességgel felruházott egységét alkalmazva. Az adatokat a TA Instruments vállalat Thermal Solutions szoftverét használva rögzítettük és analizáltuk. Egy körülbelül 10 mg tömegû mintát helyeztünk platinaedénybe, és végigpásztáztuk nagy felbontású melegítési sebességgel környezeti hõmérséklettõl 300 °C¹ig. A mérleget és a kemencetereket nitrogénáramokkal tisztítottuk a használat során. A 3. példa szerinti kristályos difoszfátsó mintájára vonatkozó jellegzetes TGA-görbe oldószerek és/vagy víz (8,2%) elvesztését mutatta 155 °C alatti hõmérsékleteken, amint az a 3. ábrán látható. A 4. példa szerinti kristályos monoszulfátsó mintájára vonatkozó TGA-görbe oldószerek és/vagy víz (12,6%) elvesztését mutatta 116 °C alatti hõmérsékleteken. Az 5. példa szerinti kristályos monoszulfátsó mintájára vonatkozó jellegzetes TGA-görbe oldószerek és/vagy víz (13,7%) elvesztését mutatta 150 °C alatti hõmérsékleteken, amint az a 9. ábrán látható. A 6. példa szerinti kristályos dioxalátsó mintájára vonatkozó TGA-görbe oldószerek és/vagy víz (15,4%) elvesztését mutatta 125 °C alatti hõmérsékleteken. A 7. példa szerinti kristályos dioxalátsó mintájára vonatkozó jellegzetes TGA-görbe oldószerek és/vagy víz (12,7%) elvesztését mutatta 125 °C alatti hõmérsékleteken, amint az a 14. ábrán látható. A 8. példa szerinti (I formájú) kristályos szabad bázis mintájára vonatkozó TGA-görbe oldószerek és/vagy víz (7,3%) elvesztését mutatta 75 °C alatti hõmérsékleteken. A 9. példa szerinti (I formájú) kristályos szabad bázis mintájára vonatkozó TGA-görbe oldószerek és/vagy víz (5,2%) elvesztését mutatta 70 °C alatti hõmérsékleteken. A 10. példa szerinti (I formájú) kristályos szabad bázis mintájára vonatkozó jellegzetes TGA-görbe oldószerek és/vagy víz (3,8%) elvesztését mutatta 98 °C alatti hõmérsékleteken, amint az a 20. ábrán látható. A 11. példa szerinti (II formájú) kristályos szabad bázis mintájára vonatkozó jellegzetes TGA-görbe oldószerek és/vagy víz (3,0%) elvesztését mutatta 98 °C alatti hõmérsékleteken, amint az a 25. ábrán látható. Ezek a TGA-görbék azt mutatják, hogy a találmány szerinti kristályos vegyületek kis mennyiségû tömeget veszítenek szobahõmérséklettõl a mérsékelten megemelt hõmérsékletekig (pl. 75 °C–150 °C), ami megegyezik a maradék nedvesség vagy oldószer elvesztésével. 14. példa Nedvesség dinamikus szorpciós értékelése Nedvesség dinamikus szorpciós (DMS) értékelését végeztük el (ami nedvesség szorpciós-deszorpciós jel-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 20
2
leggörbe-meghatározásaként is ismeretes) VTI SGA100 típusú atmoszferikus mikromérleg (VTI Corp., Hialeah, FL 33016) alkalmazásával. Megközelítõleg 10 mg¹os mintanagyságot használtunk, és a nedvesség a környezeti értékre volt beállítva az analízis kezdetén. Egy jellegzetes DMS-analízis három pásztázásból állt: környezeti értéktõl 2% relatív nedvességtartalomig (RH; „relative humidity”), 2% RH¹tól 90% RH¹ig, 90% RH¹tól 5% RH¹ig a pásztázási sebesség 5% RH/lépés értéke mellett. A tömeget megmértük minden 2. percben, és az RH¹t a következõ értékre változtattuk (+/–5% RH¹val) amikor a minta tömege stabil, 5 egymást követõ mérési idõpontra vonatkozóan 0,01%¹os eltérésen belüli volt. A 3. példa szerinti kristályos difoszfátsó mintájára vonatkozó jellegzetes DMS-görbe reverzíbilis szorpciós/deszorpciós jelleggörbét mutatott alacsony higroszkóposság mellett 3,3% tömegnövekedéssel 2%–90% RH¹nak kitéve, és 0,6% tömegnövekedéssel a 40%–75% RH nedvességtartalom-tartományban, amint azt a 4. ábra mutatja. Az 5. példa szerinti kristályos monoszulfátsó mintájára vonatkozó jellegzetes DMS-görbe reverzíbilis szorpciós/deszorpciós jelleggörbét mutatott alacsony higroszkóposság mellett 10% tömegnövekedéssel 2%–90% RH¹nak kitéve, és 1‚8% tömegnövekedéssel a 40%–75% RH nedvességtartalom-tartományban, amint azt a 11. ábra mutatja. A 7. példa szerinti kristályos dioxalátsó mintájára vonatkozó jellegzetes DMS-görbe reverzíbilis szorpciós/deszorpciós jelleggörbét mutatott alacsony higroszkóposság mellett 5,3% tömegnövekedéssel 2%–90% RH¹nak kitéve, és 1,1% tömegnövekedéssel a 40%–75% RH nedvességtartalom-tartományban, amint azt a 16. ábra mutatja. A 10. példa szerinti (1 formájú) kristályos szabad bázis mintájára vonatkozó jellegzetes DMS-görbe reverzíbilis szorpciós/deszorpciós jelleggörbét mutatott alacsony higroszkóposság mellett 10% tömegnövekedéssel 2%–90% RH¹nak kitéve, és 1,2% tömegnövekedéssel a 40%–75% RH nedvességtartalom-tartományban, amint azt a 21. ábra mutatja. A 11. példa szerinti (II formájú) kristályos szabad bázis mintájára vonatkozó jellegzetes DMSgörbe reverzíbilis szorpciós/deszorpciós jelleggörbét mutatott alacsony higroszkóposság mellett 9% tömegnövekedéssel 2%–90% RH¹nak kitéve, és 1,3% tömegnövekedéssel a 40%–75% RH nedvességtartalom-tartományban, amint azt a 26. ábra mutatja. Ezek a DMS-görbék szemléltetik, hogy a találmány szerinti kristályos vegyületek reverzíbilis szorpciós/deszorpciós jelleggörbével rendelkeznek alacsony higroszkóposság mellett. A kristályos vegyületek elfogadható tömegnövekedést szenvednek nedvesség hatásának kitéve széles nedvességtartalom-tartományban. A nedvesség reverzíbilis szorpciós/deszorpciós jelleggörbéi szemléltetik, hogy a találmány szerinti kristályos vegyületek elfogadható higroszkópossággal rendelkeznek, és nem folyósodóak.
1
HU 007 494 T2
15. példa Szilárd halmazállapotú stabilitás értékelése A 3. példa szerinti kristályos difoszfátsó egyenként körülbelül 1 mg–2 mg¹os mintáit több 3 ml¹es boroszilikát fiolában tároltuk –20 °C¹on (zárt tartály), és 40 °C/75% RH körülmények között (nyitott és zárt tartály). Meghatározott idõközönként egy jellemzõ fiola teljes tartalmát a következõ HPLC eljárást követve analizáltuk: Oszlop: Xterra Ms C18, 4,6×250 mm, 5 mm (alkatrésszáma: 186000494); ’A’ mozgó fázis: 0,1 M NH4Ac, pH 7,0; ’B’ mozgó fázis: 100% ACN; térfogatáram: 1 ml/perc; injektált térfogat: 10 ml; detektor: 240 nm; gradiens idõ percekben (% ’B’ mozgó fázis): 0,0 (8); 5,00 (28); 22,00 (42); 30,00 (100); 35,00 (100); 35,10 (8); és 45,00 (8). A mintákat 0,5 mg/ml¹es anyaoldatként készítettük el 10 mM, citráttal pufferolt pH=5 fiziológiás konyhasóoldatban. A 3. példa szerinti kristályos difoszfátsó esetében a minták kezdeti tisztasága 98,3% volt HPLC területszázalék alapján meghatározva. Hat hét tárolás után a mintákra vonatkozóan az összes tárolási körülmény esetében nem volt kimutatható változás a kémiai tisztaságban, nem volt megfigyelhetõ változás az anyag megjelenésében, és DSC és TGA segítségével végzett elemzések nem mutattak észlelhetõ különbségeket. 16. példa Elemanalízis A találmány szerinti kristályos vegyületek mintáiban található elemek alábbi százalékait határoztuk meg égetéses analízissel Flash EA 1112 Elemental Analyzer (CE Elantech, Lakewood, NJ) berendezést alkalmazva. Az 5. példa szerinti kristályos monoszulfátsóra vonatkozóan: 52,88% szén, 7,10% hidrogén, 8,81% nitrogén, 27,17% oxigén és 4,03% kén (várt értékek); 52,11% szén, 6,90% hidrogén, 8,42% nitrogén, 24,94% oxigén és 4,06% kén (eredmények). A 7. példa szerinti kristályos dioxalátsóra vonatkozóan: 54,54% szén, 6,57% hidrogén, 8,15% nitrogén és 30,74% oxigén (várt értékek); 56,33% szén, 6,90% hidrogén, 8,22% nitrogén és 26,32% oxigén (eredmények). 17. példa Mikronizálás A 3. példa szerinti kristályos difoszfátsó 13 g¹os mintáját mikronizáltuk sugármalommal, hogy mikroszkópos vizsgálat során megfigyelt kettõs törésû gördülékeny fehér por 8,7 g¹ját nyújtsuk (67% visszanyerés). Mikronizálás elõtt a kristályos difoszfát kezdeti tisztasága 98,1% volt HPLC területszázalék alapján meghatározva. A mikronizált anyag tisztasága ugyanannyi volt. A mikronizálás elõtti anyag víztartalma 6,54% volt, és a mikronizált anyag víztartalma 6,23% volt. Semmilyen probléma nem merült fel a mikronizálási eljárás során. A részecskeméret eloszlása a következõ volt:
5
2
Mikronizálás elõtt
Mikronizálás után
D (v, 0,9)
38,6 mm
5,2 mm
D (v, 0,5)
9,9 mm
2,2 mm
D (v, 0,1)
1,7 mm
0,4 mm
A mikronizált anyagot a nem mikronizált anyaggal összehasonlítva nem észleltünk jelentõs változásokat 10 a por-röntgendiffrakciós képben, a TGA¹, DSC¹, DMSgörbében, a kémiai tisztaságban, a királis tisztaságban és a nedvességtartalomban. Például, ahogy azt a 14. példában megjegyeztük, a 3. példa szerinti kristályos difoszfátsó mintájára vonatkozó jellegzetes DMS-görbe 15 0,6% tömegnövekedést mutatott a 40%–75% RH nedvességtartalom-tartományban, miközben a mikronizált anyag 0,7% tömegnövekedést mutatott ebben a nedvességtartalom-tartományban. 18. példa Inhalációs oldat stabilitása Oldatot készítettünk 0,5 mg/ml szabad bázis egyenértékkel (a 3. példában leírtak szerint elõállított kristályos difoszfátsót alkalmazva) 10 mM, citráttal puf25 ferolt pH=5 fiziológiás konyhasóoldatban. A kristályos só oldhatósága nagyobb volt szabad bázis egyenérték 40 mg/ml-jénél a pufferben. Kevesebb, mint 0,5% lebomlás volt megfigyelhetõ 1 hónapos, 40 °C/75% RH körülmények közötti tárolás után. 30 1. vizsgálat Radioligand kötési vizsgálat Membrán elõállítása hM1, hM2, hM3 és hM4 muszkarin receptor altípusokat expresszáló sejtekbõl Klónozott humán hM1, hM2, hM3 és hM4 muszkarin 35 receptor altípusokat külön-külön stabilan expresszáló CHO-sejtvonalakat tenyésztettünk majdnem konfluencia eléréséig 10% FBS-sel és 250 mg/ml Geneticinnel kiegészített HAM’s F¹12¹t tartalmazó közegben. A sej40 teket egy 5% CO2, 37 °C körülményeket biztosító inkubátorban tenyésztettük, és dPBS-ben vett 2 mM EDTAval felszedtük. A sejteket 5 perces 650×g centrifugálással összegyûjtöttük, és a sejtpelleteket vagy fagyasztva tároltuk –80 °C¹on, vagy membránokat állítottunk elõ 45 azonnal. Membrán elõállítása céljából a sejtpelleteket reszuszpendáltuk lízispufferben, és egy Polytron PT¹2100 szövetbontóval (Kinematica AG; 20 másodperc×2 menet) homogenizáltuk. A nyers membránokat 40 000×g¹n 15 percig 4 °C¹on centrifugáltuk. A memb50 ránpelleteket azután reszuszpendáltuk reszuszpenziós pufferral, és ismét homogenizáltuk a Polytron szövetbontóval. A membránszuszpenzió fehérjekoncentrációját a [Lowry O. és munkatársai, Journal of Biochemistry, (193), 265, (1951)] szakirodalmi publikációban leírt 55 eljárással határoztuk meg. Minden membránt fagyasztva tároltunk egyenlõ részekre elosztva –80 °C¹on vagy azonnal felhasználtuk. Egyenlõ mennyiségû részekben elõkészített hM5 receptor membránokat szereztünk be közvetlenül a PerkinElmer vállalattól, és felhasználásu60 kig –80 °C¹on tároltuk azokat. 20
21
1
HU 007 494 T2
Radioligand kötési vizsgálat a hM1, hM2, hM3, hM4 és hM5 muszkarin receptor altípusokon Radioligand kötési vizsgálatokat hajtottunk végre 96 lyukú mikrotiterlemezekben 100 ml¹es teljes vizsgálati térfogaton. Vagy a hM1, hM2, hM3, hM4, vagy a hM5 muszkarinaltípust stabilan expresszáló CHO sejtmembránokat hígítottunk vizsgálati pufferben a következõ meghatározott cél-fehérjekoncentrációkra (mg/lyuk): 10 mg a hM1, 10 mg–15 mg a hM2, 10 mg–20 mg a hM3, 10 mg–20 mg a hM4, és 10 mg–12 mg a hM5 számára. A membránokat rövid idõ alatt homogenizáltuk Polytron szövetromboló (10 másodperces) alkalmazásával a vizsgálólemezbe való adagolás elõtt. A radioligand KDértékeinek meghatározása céljából szaturációs kötési vizsgálatokat hajtottunk végre L¹[N¹metil- 3 H]szkopolamin-metil-klorid ([ 3 H]-NMS) (TRK666, 84,0 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Anglia) alkalmazásával 0,001 nM¹tól 20 nM¹ig terjedõ tartományba esõ koncentrációknál. A tesztvegyületek Ki-értékeinek meghatározása céljából leszorításos vizsgálatokat hajtottunk végre [3H]-NMSsel 1 nM¹nál és tizenegy különbözõ tesztvegyület-koncentrációnál. A tesztvegyületeket kezdetben 400 mM koncentrációra oldottuk hígítópufferben, és azután sorozatban ötször hígítottuk hígítópufferral 10 pM¹tól 100 mM¹ig terjedõ tartományba esõ végsõ koncentrációkra. A vizsgálólemezekhez történõ adagolás rendje és térfogatai a következõk voltak: 25 ml radioligand, 25 ml hígított tesztvegyület és 50 ml membrán. A vizsgálólemezeket 60 percig 37 °C¹on inkubáltuk. A kötési reakcióknak 1% BSA-ban elõkezelt GF/B üvegszálas szûrõlemezeken (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) keresztüli gyorsszûréssel vetettünk véget. A szûrõlemezeket háromszor öblítettük (10 mM HEPES) mosópufferrel, hogy a nem kötött radioaktivitást eltávolítsuk. A lemezeket azután levegõn szárítottuk, és 50 ml Microscint¹20 folyékony szcintillációs folyadékot (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) adtunk mindegyik lyukhoz. A lemezeken azután egy PerkinElmer Topcount folyadékszcintillációs számlálóban (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) számlálást végeztünk. A kötési adatokat nemlineáris regresszióanalízis útján analizáltuk a GraphPad Prism szoftvercsomaggal (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) a „one-site competition” modellt alkalmazva. A tesztvegyületekre vonatkozó Ki-értékeket az észlelt IC 50 -értékekbõl és a radioligand K D -értékébõl a Cheng–Prusoff-egyenlet [Cheng Y, Prusoff W. H., Biochemical Pharmacology, 22(23), 3099–3108, (1973)] alkalmazásával számítottuk. A Ki-értékeket pKi-értékekké számítottuk át, hogy meghatározzuk a mértani közepet és a 95% konfidenciaintervallumokat. Ezeket az összesítõ statisztikákat azután visszaalakítottuk Ki-értékekké az adatok jegyzõkönyvezése céljából. Ebben a vizsgálatban alacsonyabb Ki-érték azt jelzi, hogy a tesztvegyület nagyobb kötési affinitással rendelkezik a vizsgált receptor vonatkozásában. Úgy találtuk, hogy az I képlet szerinti vegyület az M3 muszkarin receptor altípusra nézve kevesebb mint körülbelül 5 nM Ki-értékkel rendelkezik, amikor ebben vagy hasonló vizsgálatban analizáltuk.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 22
2
2. vizsgálat Muszkarin receptor funkcionális hatóképességének vizsgálata cAMP-akkumuláció agonista mediálta gátlásának blokkolása Ebben a vizsgálatban tesztvegyület funkcionális hatóképességét határoztuk meg oly módon, hogy megmértük a tesztvegyület forskolin mediálta cAMP-akkumuláció oxotremoringátlásának blokkolásában mutatkozó képességét a hM 2 receptort expresszáló CHO¹K1 sejtekben. cAMP-vizsgálatokat radioimmunvizsgálat formátumban végeztünk el a Flashplate Adenilil-Cikláz Aktivációs Vizsgálati Rendszert 125 I-cAMP-vel (NEN SMP004B, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) alkalmazva a gyártó használati utasításának megfelelõen. A sejteket dPBS-sel egyszer öblítettük, és (0,05% tripszin/0,53 mM EDTA) tripszin-EDTA-oldattal felszedtük, amint azt a fenti, a sejtkultúra és membrán elõkészítésérõl szóló szakaszban leírtuk. Az elkülönített sejteket kétszer mostuk 50 ml dPBS-ben 5 percen keresztül végzett 650×g¹s centrifugálással. A sejtpelletet azután reszuszpendáltuk 10 ml dPBS-ben, és a sejteket megszámláltuk egy Coulter Z1 Dual részecskeszámlálóval (Beckman Coulter, Fullerton, CA). A sejteket ismét centrifugáltuk 650×g¹n öt percen keresztül, és reszuszpendáltuk stimulációs pufferben 1,6×10 6 –2,8×10 6 sejt/ml vizsgálati koncentrációra. A tesztvegyületeket kezdetben 400 mM koncentrációra oldottuk hígítópufferben [dPBS kiegészítve (0,1%) 1 mg/ml BSA-val], és azután sorozatban hígítottuk hígítópufferral 100 mM-tól 0,1 nM¹ig terjedõ tartományba esõ végsõ mólkoncentrációkra. Oxotremorint hígítottunk hasonló módon. Az AC¹aktivitás oxotremoringátlásának mérése céljából 25 ml forskolint (25 mM végsõ koncentrációban dPBS-ben hígítva), 25 ml hígított oxotremorint és 50 ml sejtet adtunk az agonistát tartalmazó vizsgálati lyukakhoz. Tesztvegyület oxotremorin gátolta AC¹aktivitás blokkolásában mutatkozó képességének méréséhez 25 ml forskolint és oxotremorint (külön-külön 25 mM és 5 mM végsõ koncentrációkban dPBS-ben hígítva), 25 ml hígított tesztvegyületet és 50 ml sejtet adtunk a megmaradt vizsgálati lyukakhoz. A reakciókat 10 percen keresztül 37 °C¹on inkubáltuk, és 100 ml jéghideg detektációs puffer hozzáadásával leállítottuk. A lemezeket légmentesen lezártuk, másnapig inkubáltuk szobahõmérsékleten, és a következõ reggel számlálást végeztünk egy PerkinElmer Topcount folyadékszcintillációs számlálóban (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). A képzõdött cAMP mennyiségét (pmol/lyuk) a minták esetében észlelt számlálási eredmények és cAMP-etalonok alapján számítottuk, amint azt a gyártó felhasználói kézikönyvében leírták. Az adatokat nemlineáris regresszióanalízis útján analizáltuk a GraphPad Prism szoftvercsomaggal (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) a nemlineáris regressziót, „one-site competition” egyenletet alkalmazva. A Cheng–Prusoff-egyenletet használtuk a Ki kiszámításához az oxotremorinkoncentráció-válasz görbe EC50-
1
HU 007 494 T2
értékét, és az oxotremorin vizsgálati koncentrációt a KD¹ és [L]-értékekként alkalmazva külön-külön. A Ki-értékeket pKi-értékekké számítottuk át, hogy meghatározzuk a mértani közepet és a 95% konfidenciaintervallumokat. Ezeket az összesítõ statisztikákat azután visszaalakítottuk Ki-értékekké az adatok jegyzõkönyvezése céljából. Ebben a vizsgálatban alacsonyabb Ki-érték azt jelzi, hogy a tesztvegyület nagyobb funkcionális aktivitással rendelkezik a vizsgált receptoron. Úgy találtuk, hogy az I képlet szerinti vegyület a hM2 receptort expresszáló CHO¹K1 sejtekben forskolin mediálta cAMPakkumuláció oxotremoringátlásának blokkolására vonatkozó körülbelül 5 nM¹nél kisebb Ki-értékkel rendelkezik, amikor ebben vagy hasonló vizsgálatban analizáltuk. Agonista mediálta [35S]GTPgS-kötés blokkolása Egy második funkcionális vizsgálatban a tesztvegyületek funkcionális hatóképességét meg lehet határozni oly módon, hogy megmérjük a vegyületek oxotremorin stimulálta [35S]GTPgS-kötés blokkolásában mutatkozó képességét a hM 2 receptort expresszáló CHO¹K1 sejtekben. A felhasználás idõpontjában a fagyasztott membránokat felolvasztottuk, és vizsgálati pufferben hígítottuk 5 mg–10 mg fehérje/lyuk végsõ szöveti célkoncentrációval. A membránokat rövid idõ alatt homogenizáltuk Polytron PT¹2100 szövetromboló alkalmazásával, és azután a vizsgálólemezekbe adagoltuk. Meghatároztuk a [35S]GTPgS-kötés agonista oxotremorin általi stimulációjára vonatkozó EC90-értéket (90% maximális válaszhoz tartozó effektív koncentrációt) mindegyik kísérletben. Tesztvegyület oxotremorin stimulálta [35S]GTPgSkötés gátlásában mutatkozó képességének meghatározása céljából a következõket adagoltuk a 96 lyukú lemezek mindegyik lyukába: 25 ml vizsgálati puffer [35S]GTPgS-sel (0,4 nM), 25 ml oxotremorin (EC90) és GDP (3 mM), 25 ml hígított tesztvegyület és 25 ml, a hM2 receptort expresszáló CHO-sejtmembrán. A vizsgálólemezeket azután 60 percig 37 °C¹on inkubáltuk. A vizsgálólemezeket 1% BSA-ban elõkezelt GF/B szûrõkön keresztül szûrtük PerkinElmer 96 lyukú gyûjtõ („harvester”) alkalmazásával. A lemezeket jéghideg mosópufferrel öblítettük 3×3 másodpercig, és azután levegõn vagy vákuumban szárítottuk. (50 ml) Microscint¹20 szcintillációs folyadékot adtunk mindegyik lyukhoz, és mindegyik lemezt légmentesen lezártuk, majd radioaktivitást számláltunk Topcount számlálón (PerkinElmer). Az adatokat nemlineáris regresszióanalízis útján analizáltuk a GraphPad Prism szoftvercsomaggal (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) a nemlineáris regressziót, „one-site competition” egyenletet alkalmazva. A Cheng–Prusoff-egyenletet használtuk a Ki-érték kiszámításához a tesztvegyületre vonatkozó koncentráció-válasz görbe IC50-értékeit, és a vizsgálatban az oxotremorinkoncentrációt a KD¹ és [L]¹, ligandkoncentráció-értékekként alkalmazva külön-külön.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 23
2
Ebben a vizsgálatban alacsonyabb Ki-érték azt jelzi, hogy a tesztvegyület nagyobb funkcionális aktivitással rendelkezik a vizsgált receptoron. Úgy találtuk, hogy az I képlet szerinti vegyület a hM2 receptort expresszáló CHO¹K1 sejtekben oxotremorin stimulálta [35S]GTPgS-kötés blokkolására vonatkozó körülbelül 5 nM¹nél kisebb Ki-értékkel rendelkezik, amikor ebben vagy hasonló vizsgálatban analizáltuk. Agonista mediálta kalciumfelszabadulás blokkolása FLIPR vizsgálatok útján Muszkarin receptor altípusok (M1, M3, és M5 receptorok), amelyek Gq fehérjékhez kapcsolódnak, aktiválják a foszfolipáz¹C (PLC) útvonalat a receptorhoz kötõdõ agonistán. Ennek eredményeként az aktivált PLC foszfatidil-inozitol-difoszfátot (PIP2¹t) diacil-glicerinné (DAG¹gá) és foszfatidil-1,4,5-trifoszfáttá (IP3¹má) hidrolizál, ami viszont kalciumfelszabadulást idéz elõ a sejten belüli raktárakból, vagyis az endoplazmatikus és szarkoplazmatikus retikulumból. A FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) vizsgálat ezt a sejten belüli kalciumnövekedést használja ki kalciumérzékeny festékanyag (Fluo-4AM, Molecular Probes, Eugene, OR) alkalmazásával, amely fluoreszkál, amikor szabad kalcium kötõdik. Ezt a fluoreszcenciás eseményt mérjük valós idõben a FLIPR segítségével, amely észleli humán M1 és M3, és csimpánz M5 receptorokkal klónozott sejtek monomolekuláris rétegébõl származó fluoreszcenciában bekövetkezõ változást. Antagonista hatóképesség meghatározható antagonistáknak a sejten belüli kalcium mennyiségében bekövetkezõ agonista mediálta növekedések gátlásában megmutatkozó képessége alapján. FLIPR kalciumstimulációs vizsgálatok céljából a hM1, hM3 és cM5 receptorokat stabilan expresszáló CHO-sejteket 96 lyukú FLIPR-lemezekbe helyezzük a vizsgálat elvégzése elõtti éjszakán. Az elhelyezett sejteket kétszer mossuk Cellwash (MTX Labsystems, Inc.) berendezésben FLIPR-pufferral (10 mM HEPES, pH=7,4, 2 mM kalcium-klorid, 2,5 mM probenecid HBSS-ben kalcium és magnézium nélkül), hogy eltávolítsuk a tenyésztõközegeket és 50 ml/lyuk FLIPR-puffert hagyjunk meg. A sejteket azután 50 ml/lyuk-nyi 4 mM FLUO-4AM-mel inkubáljuk (egy kétszeresére hígított oldatot készítettünk) 40 percig 37 °C¹on 5% szén-dioxid mellett. A festékanyag inkubációs idõszakaszát követõen a sejteket kétszer FLlPR-pufferrel mostuk 50 ml/lyuk végsõ térfogatot meghagyva. Antagonista hatóképesség meghatározása céljából oxotremorinra vonatkozóan a sejten belüli Ca2+-felszabadítás dózisfüggõ stimulációját elõször úgy határozzuk meg, hogy az antagonista hatóképességet késõbb meg lehet mérni az oxotremorinstimuláció ellenében EC90-értékû koncentrációnál. A sejteket elõször többalkotós hígítópufferrel inkubáljuk 20 percig, amit agonista hozzáadása követ, amelyet FLIPR segítségével hajtunk végre. Oxotremorin EC90-értékét képezzük az alábbi, FLlPR-mérésre és adattömörítésre vonatkozó szakaszban részletezett eljárás szerint az ECF=[(F/100–F)^1/H]*EC50 képlettel együtt. 3×ECF-ér-
1
HU 007 494 T2
tékû oxotremorinkoncentrációt állítunk elõ a stimulációs lemezeken úgy, hogy EC90-értékû koncentrációban oxotremorint adunk minden lyukhoz az antagonista gátló hatást mérõ vizsgálólemezeken. A FLIPR során alkalmazott paraméterek a következõk: 0,4 másodperc expozíciós idõtartam, 0,5 W lézerteljesítmény, 488 nm gerjesztési hullámhossz és 550 nm emissziós hullámhossz. Meghatározzuk a kiindulási értékeket a fluoreszcenciában bekövetkezõ változás mérésével 10 másodpercen át az agonista hozzáadása elõtt. Az agonistastimulációt követõen a FLIPR folyamatosan mérte a fluoreszcencia változását minden fél és egész másodpercben 1,5 percig, hogy megtalálja a maximális fluoreszcenciaváltozását. A fluoreszcencia változását úgy fejezzük ki, hogy maximális fluoreszcencia mínusz a kiindulási fluoreszcencia mindegyik lyukra kiszámítva. Az elsõdleges adatokat a hatóanyag-koncentráció logaritmusa ellenében analizáljuk nemlineáris regresszió segítségével a GraphPad Prism szoftvercsomaggal (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) ’S’ alakú dózisválasz számára szolgáló beépített modellt alkalmazva. Az antagonista Ki-értékeket a Prism szoftverrel határozzuk meg az oxotremorin EC50-értékét a KD-értékként, és az oxotremorin EC90-értékét a ligandkoncentrációra alkalmazva a Cheng–Prusoff-egyenlet szerint (Cheng & Prusoff, 1973). Ebben a vizsgálatban alacsonyabb Ki-érték azt jelzi, hogy a tesztvegyület nagyobb funkcionális aktivitással rendelkezik a vizsgált receptoron. Úgy találtuk, hogy az I képlet szerinti vegyület a hM3 receptort stabilan expresszáló CHO-sejtekben agonista mediálta kalciumfelszabadítás blokkolására vonatkozó körülbelül 5 nM¹nél kisebb Ki-értékkel rendelkezik, amikor ebben vagy hasonló vizsgálatban analizáltuk. 3. vizsgálat Bronchoprotekció idõtartamának meghatározása acetil-kolin indukálta hörgõszûkület tengerimalac modelljében Ezt az in vivo vizsgálatot alkalmazzuk a muszkarin receptor antagonista aktivitást mutató tesztvegyületek bronchoprotektív hatásainak értékelése céljából. Hat, 250 g és 350 g közötti tömegû hím tengerimalac [Duncan-Hartley (HsdPoc:DH) Harlan, Madison, WI] csoportjait egyenként azonosítjuk ketreckártyákkal. A vizsgálat során az állatokat hagyjuk élelemhez és vízhez jutni tetszés szerint. A tesztvegyületeket inhalálás útján adjuk be 10 percen keresztül egy teljes testre ható adagolókamrában (R&S Molds, San Carlos, CA). Az adagolókamrák úgy vannak elrendezve, hogy aeroszolt juttattunk egyidejûleg 6 különálló kamrába egy központi elosztócsõbõl. A tengerimalacokat egy tesztvegyület vagy hordozóközeg (WFI) aeroszolja hatásának tesszük ki. Ezeket az aeroszolokat vizes oldatokból hozzuk létre LC Star porlasztóegység (22F51¹es modell, PARI Respiratory Equipment, Inc. Midlothian, VA) alkalmazásával, amelyet 22 psi (151 685 Pa) nyomású (CO2=5%, O2=21% és N2=74%) gázkeverék mûködtet. A porlasztón ke-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 24
2
resztüli gázáram ezen az üzemi nyomáson megközelítõleg 3 l/perc. A létrehozott aeroszolokat a kamrákba pozitív nyomás segítségével vezetjük be. Nem alkalmazunk hígítólevegõt az aeroszollá alakított oldatok továbbítása során. A 10 perces porlasztás alatt megközelítõleg 1,8 ml oldatot porlasztunk. Ezt gravimetrikusan mérjük a töltött porlasztó porlasztás elõtti és utáni tömegeinek összehasonlításával. Az inhalálás útján beadott tesztvegyületek bronchoprotektív hatásait teljes test pletizmográfia alkalmazásával értékeljük ki 1,5, 24, 48 és 72 órával az adagolás után. A pulmonális kiértékelés megkezdése elõtt negyvenöt perccel mindegyik tengerimalacot érzéstelenítjük (43,75 mg/kg) ketamin, (3,50 mg/kg) xilazin és (1,05 mg/kg) acepromazin intramuszkuláris befecskendezésével. Azután, hogy a mûtéti helyet leborotváljuk és 70%¹os alkohollal megtisztítjuk, a nyak hasi oldalán 2 cm–3 cm¹es középvonali bemetszést készítettünk. Ezután a juguláris vénát elkülönítjük és kanüláljuk egy sóoldattal töltött polietilénkatéterrel (PE¹50, Becton Dickinson, Sparks, MD) tekintettel ACh (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) sóoldatban készített intravénás infúzióira. A légcsövet ezt követõen metszéssel szabaddá tesszük, és egy 14G¹S tefloncsõvel (#NE-014, Small Parts, Miami Lakes, FL) kanüláljuk. Ha szükséges, az érzéstelenítést fenntartjuk a fent említett érzéstelenítõ keverék további intramuszkuláris befecskendezéseivel. Az érzéstelenítés alaposságát folyamatosan ellenõrizzük, és utánállítjuk, ha az állat reagál a mancsa csipkedésére, vagy ha a légzés szaporasága nagyobb, mint 100 légzés/perc. Amint a kanülálás elkészült, az állatot pletizmográfba (#PLY3114, Buxco Electronics, Inc., Sharon, CT) helyezzük, és egy nyelõcsövi nyomásmérõ kanült (PE160, Beckton Dickinson, Sparks, Mod) vezetünk be a pulmonális hajtónyomás (nyomás) mérése céljából. A légcsõbe vezetett tefloncsövet a pletizmográf nyílásához csatlakoztatjuk, hogy engedjük a tengerimalacot kamrán kívüli helyiséglevegõt lélegezni. A kamrát azután légmentesen lezárjuk. Egy melegítõlámpát alkalmazunk, hogy fenntartsuk a testhõmérsékletet, és a tengerimalac tüdejét 3¹szor felfújjuk 4 ml levegõvel egy 10 ml¹es kalibrációs fecskendõt (#5520 sorozat, Hans Rudolph, Kansas City, MO) alkalmazva annak biztosítása céljából, hogy az alsóbb légutak ne essenek össze, és hogy az állat ne szenvedjen hiperventilációtól. Amint megállapítjuk, hogy a kiindulási értékek a tágulékonyság („compliance”) esetében a 0,3 ml/cm H2O – 0,9 ml/cm H2O tartományon belülre, és az ellenállás („resistance”) esetében a másodpercenként 0,1 cm H2O/ml – 0,199 cm H2O/ml tartományon belülre esnek, a pulmonális kiértékelést megkezdjük. Egy Buxco pulmonális mérõ-számítógépes program teszi lehetõvé a pulmonális értékek rögzítését és leszármaztatását. Ezen program elindítása elkezdi a kísérleti protokollt és az adatrögzítést. A térfogat idõbeli változásait, amelyek a pletizmográfon belül jelentkeznek minden egyes lélegzettel, Buxco nyomás-jelátalakító segítségével mérjük. Ezt a jelet idõ szerint integrálva kiszámít-
1
HU 007 494 T2
juk az áramlás mértékét minden egy lélegzetre vonatkozóan. Ezt a jelet a pulmonális hajtónyomás-változásokkal együtt, amelyeket Sensym nyomás-jelátalakító (#TRD4100) alkalmazásával rögzítünk, rákapcsoljuk egy Buxco (MAX2270) elõerõsítõn keresztül egy adatgyûjtõ interfészre (#SFT3400 és #SFT3813). Az összes többi pulmonális paramétert ebbõl a két bemenõadatból származtatjuk. Kiindulási adatokat rögzítünk 5 percen keresztül, amely idõ elteltével a tengerimalacokat reagálásra kényszerítjük ACh-val. (0,1 mg/ml) ACh¹t adunk be intravénás infúzióban 1 percen át fecskendõs pumpából (sp210iw, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL) a következõ dózisokban és a kísérlet kezdetétõl számított kijelölt idõpontokban: 1,9 mg/perc az 5. percben, 3,8 mg/perc a 10. percben, 7,5 mg/perc a 15. percben, 15,0 mg/perc a 20. percben, 30 mg/perc a 25. percben és 60 mg/perc a 30. percben. Ha az ellenállás vagy a tágulékonyság nem tért vissza a kiindulási értékekre minden egyes ACh-dózist követõen a 3. percben, a tengerimalacok tüdejét 3¹szor felfújjuk 4 ml levegõvel egy 10 ml¹es kalibrációs fecskendõbõl. A rögzített pulmonális paraméterek közé tartozik a légzésfrekvencia (lélegzet/perc), a tágulékonyság (ml/cm H2O) és a pulmonális ellenállás (másodpercenkénti cm H2O/ml). Amint a pulmonális mûködésre vonatkozó méréseket befejezzük ezen protokoll 35. percében, a tengerimalacot eltávolítjuk a pletizmográfból, és eutanáziát alkalmazunk szén-dioxid okozta fulladás elõidézésével. Az adatokat a következõ módszerek egyike vagy mindkettõje szerint értékeljük ki: (a) pulmonális ellenállást (RL, másodpercenkénti cm H2O/ml) számítunk a „nyomásváltozás” „áramlásváltozás”-hoz viszonyított arányából. A (60 mg/perc, 1H) ACh¹ra adott RL-választ kiszámítjuk a hordozóközegre és a tesztvegyületcsoportokra vonatkozóan. A hordozóközeggel kezelt állatokban az átlagos ACh-választ minden egyes elõkezelési idõpontban meghatározzuk, és felhasználjuk az AChválasz %¹os gátlásának kiszámításához a megfelelõ elõkezelési idõpontban minden egyes tesztvegyület-dózisra. Az ’RL’-hez tartozó gátlásra vonatkozó dózis-válasz görbéket egy négyparaméteres logisztikus egyenlettel illesztjük a GraphPad Prism, Windows rendszerre fejlesztett 3.00 verziójának (GraphPad Software, San Diego, California) alkalmazásával, hogy megbecsüljük a bronchoprotektív ID50-értéket [ami az a dózis, amely ahhoz szükséges, hogy 50%-kal gátoljuk a (60 mg/perc) ACh hörgõszûkítõ válaszát]. Az alkalmazott egyenlet a következõ: Y=Min+(Max–Min)/(1+10 ((log ID50–X)*Meredekség)) (b) ahol X a dózis logaritmusát, Y a választ (ACh indukálta, RL-ben bekövetkezõ növekedés %¹os gátlását) jelenti. Az Y a Min-nél indul és aszimptotikusan közelít a Max-hoz ’S’ alakban. (c) Kiszámítjuk a PD2-mennyiséget, amit a kiindulási pulmonális ellenállás megkétszerezõdésének elõidézéséhez szükséges ACh vagy hisztamin mennyiségeként határozunk meg, azoknak a pul-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 25
2
monális ellenállásértékeknek az alkalmazásával, amelyeket az áramlás-ból és a nyomás-ból nyerünk ACh- vagy hisztaminpróbák tartományán, az alábbi egyenlet felhasználásával {ami egy olyan egyenletbõl származik, amely PC20-értékek számításához használatos az [American Thoracic Society (Amerikai Mellkasi Társaság), „Guidelines for methacholine and excercise challenge testing – 1999”, Irányelvek metakolin és terheléses provokációs teszteléshez – 1999, Am. J. Respir. Crit. Care Med., (161), 309–329, (2000)] szakirodalmi helyen leírtak szerint}: PD2=antilogaritmus [log C1+(log C2–log C1)(2R0–R1)/(R2–R1)] (d) ahol C1 jelentése ACh- vagy hisztaminkoncentráció C2¹t megelõzõen; C2 jelentése a pulmonális ellenállásban (RL) legalább 2¹szeres növekedést eredményezõ ACh- vagy hisztaminkoncentráció; R0 a kiindulási RL-értéket jelenti; R1 az RL-értéket jelenti C1 után; és R2 az RL-értéket jelenti C2 után. Hatásos dózist úgy határozunk meg, mint egy olyan dózist, amely az ACh 50 mg/ml¹es dózisára adott hörgõszûkítõ választ a kiindulási pulmonális ellenállás megkétszerezõdésére korlátozza (PD2(50)). Az adatok statisztikai analízisét hajtjuk végre kétoldali Student-féle t¹próba alkalmazásával. A 0,05-nál kisebb P¹értéket tekintjük szignifikánsnak. Általában a dózis beadása utáni 1,5. órában az ACh indukálta hörgõszûkítésre vonatkozó körülbelül 200 mg/ml-nél kisebb PD2(50)-nel rendelkezõ tesztvegyületek ebben a vizsgálatban elõnyösek. Az I képlet szerinti vegyület várhatóan a dózis beadása utáni 1,5. órában az ACh indukálta hörgõszûkítésre vonatkozó körülbelül 200 mg/ml-nél kisebb PD2(50)-nel rendelkezik, amikor ebben vagy hasonló vizsgálatban teszteljük. 4. vizsgálat Inhalálást végzett tengerimalac nyálképzõdési vizsgálata 200 g és 350 g közötti tömegû tengerimalacokat (Charles River, Wilmington, MA) szoktatunk a házon belüli tengerimalac-kolóniához a megérkezést követõ legalább 3 napon keresztül. Tesztvegyületet vagy hordozóközeget adagolunk inhalálás (1H) útján 10 perces idõtartamon át egy tortaszelet alakú adagolókamrában (R&S Molds, San Carlos, CA). Tesztoldatokat oldunk fel steril vízben, és adagolóoldat 5,0 ml¹jével töltött porlasztó alkalmazásával juttatjuk célba. A tengerimalacokat az inhalációs kamrában tartjuk 30 percen keresztül. Ezen idõ alatt a tengerimalacokat egy megközelítõleg 110 cm2¹es területre korlátozzuk. Ez a tér megfelelõ ahhoz, hogy az állatok szabadon megforduljanak, új helyzetet vegyenek fel, és figyelembe veszi a tisztántartást. 20 perces akklimatizáció után a tengerimalacokat aeroszol hatásának tesszük ki, amelyet 22 psi (151 685 Pa) nyomású beltéri levegõ mûködtette LS Star porlasztóegységbõl (22F51¹es modell, PARI Respiratory Equipment, Inc. Midlothian, VA) fejlesztünk. A porlasztás befejezésekor a tengerimalacokat kiértékeljük a kezelés utáni 1,5., 6., 12., 24., 48. vagy 72. órában.
1
HU 007 494 T2
A vizsgálat elõtt egy órával a tengerimalacokat érzéstelenítjük 43,75 mg/kg ketamin, 3,50 mg/kg xilazin és 1,05 mg/kg acepromazin keverékének intramuszkuláris (IM) befecskendezésével 0,88 ml/kg-nak megfelelõ térfogatban. Az állatokat hassal felfele, melegített (37 °C¹os) takaróra helyezzük 20°¹os lejtõn a fejükkel lejtõirányban lefelé mutatva. 4 rétegû 2 inch×2 inch (5,1 cm×5,1 cm) nagyságú gézpárnát (Nu-géz, általános felhasználású tamponok, Johnson and Johnson, Arlington, TX) illesztünk a tengerimalac szájába. Öt perccel késõbb, a muszkarin agonista (3,0 mg/kg, SC) pilokarpint beadjuk, és a gézpárnát azonnal eldobjuk, és kicseréljük egy új gézpárnával, amelynek tömegét elõzetesen lemértük. Nyálat gyûjtünk 10 percig, amely idõpont elteltével a gézpárna tömegét megmérjük, és a tömegben jelentkezõ különbséget feljegyezzük, hogy meghatározzuk az összegyûlt nyál mennyiségét (mg-ban). Kiszámítjuk a hordozóközeget és tesztvegyület minden egyes dózisát megkapó állatok esetében összegyûjtött nyál átlagos mennyiségét. A hordozóközeget kapó csoport átlagát tekintjük 100% nyálképzõdésnek. Az eredményeket az eredményátlagokat (n=3 vagy nagyobb) felhasználva számítjuk. (95%) konfidenciaintervallumokat határozunk meg minden egyes dózisra minden idõpontban kétutas ANOVA alkalmazásával. Ez a modell egy módosított változata annak az eljárásnak, amelyet a [Rechter, „Estimation of anticholinergic drug effects in mice by antagonism against pilocarpine-induced salivation”, Antikolinerg hatóanyag hatásainak becslése egerekben pilokarpin indukálta nyálképzõdés elleni antagonizmus útján, Ata. Pharmacol. Toxicol., (24), 243–254, (1996)] szakirodalmi publikációban írtak le. Kiszámítjuk a nyál átlagos tömegét a hordozóközeggel kezelt állatokban minden egyes elõkezelési idõpontban, és felhasználjuk a nyálképzõdés %¹os gátlásának megadásához a megfelelõ elõkezelési idõpontokban minden egyes dózisra. A gátlásra vonatkozó dózis-válasz adatokat egy négyparaméteres logisztikus egyenlettel illesztjük a GraphPad Prism, Windows rendszerre fejlesztett 3.00 verziójának (GraphPad Software, San Diego, California) alkalmazásával, hogy megbecsüljük a nyálképzésgátló ID50-értéket (ami az a dózis, amely ahhoz szükséges, hogy 50%-kal gátoljuk a pilokarpin elõidézte nyálképzõdést). A következõ egyenletet alkalmazzuk: Y=Min+(Max–Min)/(1+10 ((log lD50–X)*Meredekség)) ahol X a dózis logaritmusát, Y a választ (a nyálképzõdés %¹os gátlását) jelenti. Az Y a Min-nél indul és aszimptotikusan közelít a Max-hoz ’S’ alakban. A nyálképzésgátló ID 50 -érték bronchoprotektív lD50-értékhez viszonyított arányát alkalmazzuk, hogy kiszámítsuk a tesztvegyület látszólagos tüdõ szelektivitási indexét. Általában a körülbelül 5¹nél nagyobb látszólagos tüdõ szelektivitási indexszel rendelkezõ vegyületek elõnyösek. Az I képlet szerinti vegyület várhatóan körülbelül 5¹nél nagyobb látszólagos tüdõ szelektivitási indexszel rendelkezik, amikor ebben vagy hasonló vizsgálatban teszteljük.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 26
2
5. vizsgálat Metakolin indukálta depresszor válaszok éber tengerimalacokban 200 g és 300 g közötti tömegû egészséges, felnõtt, hím Sprague–Dawley tengerimalacokat (Harlan, Indianapolis, 1 N) használunk ezekben a vizsgálatokban. (A véghezvitel céljából) izoflurán alatti érzéstelenítésben az állatokat közönséges, nyaki verõérbe és juguláris vénába vezetett katéterekkel látjuk el (PE¹50 csõvezetékek). A katétereket kivezetjük egy bõr alatti alagút használatával a lapocka alatti területre. Az összes mûtéti bemetszést összevarrjuk 4–0 Ethicon selyemmel, és a katétereket (1000 egység/ml) heparinnal lezárjuk. Minden állatnak (3 ml, SC) sóoldatot adunk be a mûtét végén, valamint (0,05 mg/kg, 11VI) buprenorfint. Az állatokat hagyjuk magukhoz térni egy melegítõpárnán, mielõtt visszakerülnek a tartóhelyeikre. Megközelítõleg a mûtétet követõ 18–20. órában az állatok tömegét megmérjük, és a nyaki verõérbe vezetett katétert minden egyes állaton jelátalakítóhoz csatlakoztatjuk az artériás nyomás rögzítése céljából. Az artériás nyomást és a pulzusszámot Biopac MP¹100 adatgyûjtõ rendszer alkalmazásával rögzítjük. Az állatokat hagyjuk akklimatizálódni és stabilizálódni 20 perces idõtartamon keresztül. Minden egyes állatot (0,3 mg/kg, IV) MCh-val kezelünk, amelyet a juguláris vénás vezetéken keresztül adunk be, és folyamatosan ellenõrizzük a kardiovaszkuláris választ 10 percen keresztül. Az állatokat azután a teljes test adagolókamrába helyezzük, amelyet egy, a tesztvegyület- vagy hordozóközeg-oldatot tartalmazó porlasztóhoz csatlakoztatunk. Az oldatot 10 percig porlasztjuk lélegezhetõ levegõ és 5% szén-dioxid gázkeverékét alkalmazva 3 l/perc térfogatárammal. Az állatokat azután eltávolítjuk a teljes test kamrából, és visszahelyezzük a saját kalitkájukba. Az adagolás utáni 1,5. és 24. órában az állatokat ismét (0,3 mg/kg, IV) MChval kezeljük, és meghatározzuk a hemodinamikai választ. Ezután az állatokon eutanáziát alkalmazunk (150 mg/kg, IV) nátrium-pentobarbitallal. Az MCh az átlagos artériás nyomásban (MAP-ban) csökkenést, és a pulzusszámban is csökkenést (bradikardiát) idéz elõ. A MAP-ban jelentkezõ csökkenés csúcsértékét a kiindulási értéktõl számítva (depresszor válasz) minden egyes MCh-provokációra megmérjük (IH adagolás elõtt és után). A kezelés MCh-válaszokon mutatkozó hatásait a kontroll depresszor válaszok %¹os gátlásaként (átlag +/– középhiba) fejezzük ki. Kétutas ANOVA¹t a megfelelõ posthoc teszttel alkalmaztunk a kezelés és az elõkezelési idõ hatásainak vizsgálatához. Az MCh¹ra adott depresszor válaszok várhatóan viszonylag változatlanok a hordozóközeggel történõ inhalációs adagolás utáni 1,5. és 24. órákban. A depresszor választ gátló ID50-érték bronchoprotektív ID50-értékhez viszonyított arányát alkalmazzuk, hogy kiszámítsuk a tesztvegyület látszólagos tüdõszelektivitását. Általában az 5¹nél nagyobb látszólagos tüdõ szelektivitási indexszel rendelkezõ vegyületek elõnyösek. Az I képlet szerinti vegyület várhatóan 5¹nél
1
HU 007 494 T2
nagyobb látszólagos tüdõ szelektivitási indexszel rendelkezik, amikor ebben vagy hasonló vizsgálatban teszteljük. 5 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin4-il-észter kristályos, gyógyszerészetileg elfogadható sója vagy szabad bázisa, amely az I képlettel rendelkezik:
10
15
I vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható szolvátja. 2. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amelyben az I képlet szerinti kristályos só vagy szabad bázis olyan difoszfátsó, amelyet az alábbiak legalább egyike jellemez: (i) por-röntgendiffrakciós kép, amely kettõ vagy több diffrakciós csúccsal rendelkezik a következõk közül választott 2q értékeknél: 6,4±0,2, 7,6±0,2, 8,6±0,2, 13,7±0,2, 15,0±0,2, 19,4±0,2, 21,6±0,2, 22,1±0,2, 22,9±0,2 és 23,7±0,2; és (ii) differenciális pásztázó kalorimetriás görbe, amely maximális endotermikus hõáramot mutat körülbelül 154,5 °C¹nál. 3. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amelyben az I képlet szerinti kristályos só vagy szabad bázis olyan monoszulfátsó, amelyet az alábbiak legalább egyike jellemez: (i) por-röntgendiffrakciós kép, amely kettõ vagy több diffrakciós csúccsal rendelkezik a következõk közül választott 2q értékeknél: 7,7±0,2, 8,4±0,2, 8,8±0,2, 12,6±0,2, 13,7±0,2, 14,1±0,2, 15,3±0,2, 16,0±0,2, 19,7±0,2, 20,6±0,2, 23,0±0,2 és 24,4±0,2; és (ii) differenciális pásztázó kalorimetriás görbe, amely maximális endotermikus hõáramot mutat körülbelül 76,5 °C¹nál. 4. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amelyben az I képlet szerinti kristályos só vagy szabad bázis olyan dioxalátsó, amelyet az alábbiak legalább egyike jellemez: (i) por-röntgendiffrakciós kép, amely kettõ vagy több diffrakciós csúccsal rendelkezik a következõk közül választott 2q értékeknél: 7,7±0,2, 8,7±0,2, 13,5±0,2, 14,0±0,2, 14,8±0,2, 15,4±0,2, 15,8±0,2, 19,4±0,2, 22,9±0,2, 23,3±0,2 és 24,6±0,2; és (ii) differenciális pásztázó kalorimetriás görbe, amely maximális endotermikus hõáramot mutat körülbelül 73,7 °C¹nál. 5. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amelyben az I képlet szerinti kristályos só vagy szabad bázis olyan szabad bázis, amelyet az alábbiak legalább egyike jellemez: (i) por-röntgendiffrakciós kép, amely kettõ vagy több diffrakciós csúccsal rendelkezik a következõk közül választott 2q értékeknél: 4,7±0,2, 9,6±0,2, 12,7±0,2, 13,7±0,2, 16,7±0,2, 17,4±0,2, 18,5±0,2,
20
25
30
35
40
45
50
55
60 27
2
19,4±0,2, 20,8±0,2, 21,4±0,2, 24,2±0,2 és 25,6±0,2; és (ii) differenciális pásztázó kalorimetriás görbe, amely maximális endotermikus hõáramot mutat körülbelül 102,7 °C¹nál. 6. Az 1. igénypont szerinti vegyület, amelyben az I képlet szerinti kristályos só vagy szabad bázis olyan szabad bázis, amelyet az alábbiak legalább egyike jellemez: (i) por-röntgendiffrakciós kép, amely kettõ vagy több diffrakciós csúccsal rendelkezik a következõk közül választott 2q értékeknél: 4,6±0,2, 9,3±0,2, 12,9±0,2, 13,6±0,2, 14,0±0,2, 14,6±0,2, 16,5±0,2, 18,64±0,2, 19,1±0,2, 20,9±0,2, 22,1±0,2, 22,7±0,2 és 25,7±0,2; és (ii) differenciális pásztázó kalorimetriás görbe, amely maximális endotermikus hõáramot mutat körülbelül 98,6 °C¹nál. 7. Gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot és az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet tartalmazó gyógyszerkészítmény. 8. A 7. igénypont szerinti készítmény, amely továbbá az alábbiak közül választott hatóanyag gyógyászatilag hatásos mennyiségét tartalmazza: b2-adrenerg receptor agonisták, szteroid gyulladásellenes hatóanyagok, foszfodiészteráz¹4 inhibitorok és ezek kombinációi; amely készítményben a vegyület és a hatóanyag együtt vagy külön formulázott. 9. A 8. igénypont szerinti készítmény, amely b2-adrenerg receptor agonista és szteroid gyulladásellenes hatóanyag gyógyászatilag hatásos mennyiségét tartalmazza. 10. A 8. igénypont szerinti készítmény, amelyben a b2-adrenerg receptor agonista az N¹{2¹[4¹((R)-2-hidroxi-2-fenil-etil-amino)-fenil]-etil}-(R)-2-hidroxi-2-(3¹formamido-4-hidroxi-fenil)-etil-amin monohidrokloridsója. 11. A 8. igénypont szerinti készítmény, amelyben a szteroid gyulladásellenes hatóanyag a 6a,9a-difluor17a-[(2¹furanil-karbonil)-oxi]-11b-hidroxi-16a-metil-3oxo-androszta-1,4-dién-17b-tiokarbonsav-S’-fluor-metil-észter. 12. A 7. igénypont szerinti készítmény, amelyben a készítmény inhalálás útján történõ beadáshoz formulázott. 13. A 7. igénypont szerinti készítmény, amelyben a hordozóanyag egy körülbelül pH=4-tõl körülbelül pH=6¹ig terjedõ tartományba esõ pH¹értékkel rendelkezõ vizes izotóniás sóoldat. 14. A 13. igénypont szerinti készítmény, amely citrátpuffert tartalmaz. 15. A 7. igénypont szerinti készítményt tartalmazó szárazpor-inhalátort magában foglaló gyógyszerhordozó eszköz. 16. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti vegyület kristályos formája mikronizált alakban. 17. Gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot és a 16. igénypont szerinti vegyületet tartalmazó gyógyszerkészítmény. 18. A 17. igénypont szerinti készítmény, amelyben a hordozóanyag laktóz. 19. Eljárás a 2. igénypont szerinti vegyület elõállítására, azzal jellemezve, hogy difenil-2-il-karbaminsav-1(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-
1
HU 007 494 T2
amino}-etil)-piperidin-4-il-észtert érintkezésbe hozunk foszforsavval. 20. Eljárás a 3. igénypont szerinti vegyület elõállítására, azzal jellemezve, hogy difenil-2-il-karbaminsav-1(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]-metilamino}-etil)-piperidin-4-il-észtert érintkezésbe hozunk kénsavval. 21. Eljárás a 4. igénypont szerinti vegyület elõállítására, azzal jellemezve, hogy létrehozzuk difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)piperidin-4-il-észter kristályos dioxalátsójának magkristályát difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin4-il-észter oxálsavval történõ érintkezésbe hozásával; létrehozzuk difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)piperidin-4-il-észter dioxalátsóját difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter oxálsavval történõ érintkezésbe hozásával, és a sót közömbös oldószerben feloldjuk, hogy oldatot képezzünk, és hozzáadjuk az oldathoz a magkristályt. 22. Eljárás az 5. vagy 6. igénypont szerinti vegyület elõállítására, azzal jellemezve, hogy létrehozzuk kristályos szabad bázis magkristályát difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter közömbös oldószerrel történõ érintkezésbe hozásával; kristályos szabad bázist hozunk létre difenil-2-ilkarbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-
5
10
15
20
25
30
28
2
benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter közömbös oldószerrel történõ érintkezésbe hozásával, és a kapott kristályos észtert feloldjuk, hogy oldatot képezzünk, és hozzáadjuk az oldathoz a magkristályt. 23. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti vegyület alkalmazása difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)piperidin-4-il-észter tisztítására szolgáló eljárásban, amely szerint létrehozzuk difenil-2-il-karbaminsav-1(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-il-metil)-benzoil]-metilamino}-etil)-piperidin-4-il-észter kristályos sóját vagy kristályos szabad bázisát. 24. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti vegyület gyógykezelési eljárásban vagy gyógyszerként történõ alkalmazásra. 25. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti vegyület alkalmazása gyógyszer elõállítására. 26. A 25. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a gyógyszer tüdõ-rendellenesség kezelésére szolgál. 27. A 25. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a gyógyszer hörgõtágulás elõidézésére szolgál. 28. A 25. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a gyógyszer krónikus obstruktív tüdõbetegség vagy asztma kezelésére szolgál. 29. Difenil-2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoilpiperidin-1-il-metil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin4-il-észter-difoszfát¹, ¹monoszulfát- vagy ¹dioxalátsó. 30. A 29. igénypont szerinti vegyület, amely difenil2-il-karbaminsav-1-(2¹{[4¹(4¹karbamoil-piperidin-1-ilmetil)-benzoil]-metil-amino}-etil)-piperidin-4-il-észter-difoszfátsó.
HU 007 494 T2 Int. Cl.: C07D 211/46
29
HU 007 494 T2 Int. Cl.: C07D 211/46
30
HU 007 494 T2 Int. Cl.: C07D 211/46
31
HU 007 494 T2 Int. Cl.: C07D 211/46
32
HU 007 494 T2 Int. Cl.: C07D 211/46
33
HU 007 494 T2 Int. Cl.: C07D 211/46
34
HU 007 494 T2 Int. Cl.: C07D 211/46
35
HU 007 494 T2 Int. Cl.: C07D 211/46
36
HU 007 494 T2 Int. Cl.: C07D 211/46
37
HU 007 494 T2 Int. Cl.: C07D 211/46
38
HU 007 494 T2 Int. Cl.: C07D 211/46
39
HU 007 494 T2 Int. Cl.: C07D 211/46
40
HU 007 494 T2 Int. Cl.: C07D 211/46
41
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
