!HU000004220T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 004 220
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C12N 15/90
(21) Magyar ügyszám: E 03 732512 (22) A bejelentés napja: 2003. 05. 30. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030732512 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1507865 A2 2003. 12. 04. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1507865 B1 2008. 07. 16.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 10224242 2002. 05. 29.
(73) Jogosultak: MAX-DELBRÜCK-CENTRUM FÜR MOLEKULARE MEDIZIN, 13125 Berlin (DE); Netherland Cancer Institute, 1066 CX Amsterdam (NL)
DE
(72) Feltalálók: MISKEY, Csaba, 13125 Berlin (DE); IZSVAK, Zsuzsanna, 13125 Berlin (DE); IVICS, Zoltan, 13125 Berlin (DE); PLASTERK, Ronald, NL-3584 CT Utrecht (NL)
(54)
(2006.01) A61K 38/00 (2006.01) C12N 5/06 (2006.01) C12N 9/22 (2006.01) C12N 15/85 (2006.01) A01K 67/027 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 03100070 PCT/EP 03/005707
(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest
Gerincesekben géntranszfer céljára alkalmas transzpozon vektor, a „Frog prince”.
HU 004 220 T2
(57) Kivonat A találmány tárgyát képezi transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, amely az alábbiakat tartalmazza: (a) funkcionális transzpozázt kódoló polinukleotidtól mentes transzpozont, amely tartalmazza a hasznos polinukleotidot, ahol a transzpozon olyan fordított ismétlõdéseket tartalmaz, amelyek legalább 90%¹os azonosságot mutatnak a 2. azonosító számú szekvencián belüli ismétlõdésekkel, valamint annak fordított ismétlõdésével; és (b) transzpozázt, amely N¹terminális végén olyan DNS-kötõ domént hordoz, amely tartalmazza a 3. és 4. azonosító számú szekvenciákat; vagy (c) a (b) pont szerinti transzpozázt kódoló polinukleotidot. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás hasznos polinukleotid gerinces állat sejtjeibe történõ bejuttatására, amely eljárás tartalmazza a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer fenti sejtekbe történõ bevitelének a lépését.
Ezen túlmenõen, a találmány tárgyát képezi eljárás RNSi elõállítására, amely eljárás tartalmazza (a) olyan expressziós kazettát tartalmazó transzpozon sejtbe történõ stabil bevitelét, amely a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer részeként rövid interferáló RNS¹t és szelektálható markergént expresszál; (b) a szelektálható markert expresszáló sejtek szelektálását; és (c) annak értékelését, hogy a kívánt gén transzkripcióját/transzlációját befolyásolja¹e az RNSi. A találmány tárgyát képezi továbbá gének géncsapdázására alkalmas eljárás, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: (a) a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer sejtbe történõ bevitelét; és (b) szelektálható marker expressziójának az értékelését, ahol a szelektálható marker expresszálódása a transzpozonnak a sejt átírt génjébe történõ integrálódását jelzi.
A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül 5 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 004 220 T2
A találmány tárgyát képezi transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, amely az alábbiakat tartalmazza: (a) funkcionális transzpozázt kódoló polinukleotidtól mentes transzpozont, amely tartalmazza a hasznos polinukleotidot, ahol a transzpozon olyan fordított ismétlõdéseket tartalmaz, amelyek legalább 90%¹os azonosságot mutatnak a 2. azonosító számú szekvencián belüli ismétlõdésekkel, valamint annak fordított ismétlõdését; és (b) transzpozázt, amely N¹terminális végén olyan DNS-kötõ domént hordoz, amely a 3. és 4. azonosító számú szekvenciákat tartalmazza; vagy (c) a (b) szerinti transzpozázt kódoló polinukleotidot. A találmány tárgyát képezi továbbá transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer alkalmazása gyógyhatású készítmény elõállítására, amely készítmény alkalmas adott polinukleotidnak gerinces állat sejtjeibe történõ átvitelére azáltal, hogy a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszert a fenti sejtekbe juttatja. Ezen túlmenõen, a találmány tárgyát képezi in vitro eljárás RNS-interferencia (RNSi) elõállítására, amely az alábbiakat tartalmazza: (a) a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer részeként rövid interferáló RNS¹t és szelektálható markergént expresszáló expressziós kazettát tartalmazó transzpozon sejtbe történõ stabil bejuttatását; (b) szelektálást a szelektálható markert expresszáló sejtekre; és (c) annak megállapítását, hogy az RNSi befolyásolja¹e a kívánt gén transzkripcióját/transzlációját. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi in vitro géncsapdázó eljárás, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: (a) a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer bejuttatását sejtbe; és (b) a szelektálható marker expressziójának meghatározását, ahol a szelektálható marker expressziója a transzpozonnak a sejt átíródott génjébe történõ integrálódását jelzi. Jelentõs energiákat fektettek in vivo génátviteli stratégiák kifejlesztésébe, amelyek alkalmasak örökletes és szerzett rendellenességek kezelésére emberekben (szomatikus géntranszfer), valamint bizonyos, mezõgazdasági és orvosi biotechnológiai hasznosítású gerinces fajok transzgenezisére (csírasejtes géntranszfer). A hatékony génterápiához elengedhetetlen, hogy (1) a terápiás gének nagy hatékonysággal jussanak be specifikusan a releváns sejtekbe, 2) a gén hosszú idõn át expresszálódjon; 3) bizonyosság legyen arra nézve, hogy a terápiás gén bejuttatása nem ártalmas. Több eljárást és vektort is alkalmaznak humán génterápiás célból gének átvitelére [Verma és Somia, (1997)]. Ezek az eljárások nagyjából vírus- és nem vírusalapú módszerekként csoportosíthatók, és mindegyiknek vannak elõnyei és korlátai; egyik sem nyújt tökéletes megoldást. Általánosságban, a transzgén integrálására képes vektorok tartós expressziót is képesek biztosítani. Másrészt, aggodalomra ad okot a véletlenszerû integráció a kromoszómákba, mivel számolnunk kell az inszerciós helyen és annak közelében található endogén génmûködések potenciális megszakadására. Széles körben elterjedt megközelítési mód vírusok adaptálása géntranszferre, a vektor genetikai tervezé-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
sét korlátozza azonban az adott vírus mérete, struktúrája, és abban az expresszió szabályozása. A retrovírus vektorok (Miller; 1987) hatékonyan integrálnak idegen DNS¹t a transzdukált sejtek kromoszómájába, és nagy lehetõségeket rejtenek, ami az élethosszig tartó génexpresszió biztosítását illeti. Az elõállításukhoz szükséges idõ- és költségbefektetés miatt azonban nemigen alkalmasak ipari méretû elõállításra. Ezenfelül, több egyéb faktor is megfontolást érdemel, például a biztonságosság, véletlenszerû kromoszomális integráció, és az a tény, hogy az integráció feltétele a sejtosztódás. A humán immundeficiencia víruson (HIV) alapuló lentivírus rendszerek a retrovírusok közé tartoznak, de képesek mind osztódó, mind nem osztódó sejteket megfertõzni. Az adenovírus-vektorok képesnek bizonyultak arra, hogy in vivo transzgéneket juttassanak osztódó és nem osztódó sejtek széles skálájába, valamint arra, hogy magas szintû, azonban rövid ideig tartó transzgénexpressziót közvetítsenek. Az adenovírusokból hiányzik az a képesség, hogy a bejuttatott gént kromoszomális DNS¹be integrálják, és jelenlétük a sejtekben rövid életû. Ezáltal, rekombináns adenovírus-vektorokat ismételten be kell adni, azzal a következménnyel, hogy a vektor immunogenitása miatt nem kívánt immunválaszt váltanak ki emberekben. Az adeno társult vírus (AAV) vektorok több kiaknázható potenciális elõnnyel bírnak, ezen belül azzal a tulajdonsággal, hogy képesek a transzgén célzott integrációjára. Az AAV-hordozóeszközök egyik nyilvánvaló hátránya az alacsony maximális inszertméret (3,5–4,0 kb). Újabban, kombinált (hibrid) vektorokat fejlesztettek ki (retrovírus/adenovírus, retrovírus/AAV stb.), amelyek képesek áthidalni az egyes vírusvektor-rendszerekkel kapcsolatos bizonyos problémákat. A nem virális módszerek, ezen belül DNS-kondenzáló szerek, liposzómák, mikroinjekció és „génpuska” eljárás alkalmazása egyszerûbb és biztonságosabb lehet, mint a vírusoké. A csupasz DNS bejuttatásának és felvételének hatékonysága azonban alacsony, amely növelhetõ liposzómák alkalmazásával. Általánosságban, a napjainkban alkalmazott, nem virális rendszerek nincsenek úgy felszerelve, hogy támogassák az integrációt a kromoszómába. Következésképp, a nem virális rendszerek alkalmazásával elérhetõ stabil géntranszfer gyakorisága igen alacsony volt. Ezen túlmenõen, a nem virális rendszerek többsége gyakran konkatamerizációhoz és a bejuttatott DNS véletlenszerû töréseihez vezet, ami géncsendesítést eredményezhet. Röviden, transzpozícióra képes (áthelyezõdõ) elemek vagy transzpozonok mobilis DNS-szegmensek, amelyek egyik helyrõl a másikra áthelyezõdhetnek a genomban [Plasterk és mtsai.: (1999)]. Ezek az elemek konzervatív „kivágás és beillesztés” („cut-and-paste”) mechanizmus révén mozognak: a transzpozáz katalizálja a transzpozon kivágását annak eredeti helyérõl, és elõsegíti reintegrációját máshova a genomban. Transzpozázdeficiens elemek mobilizálhatók, ha a transzpozázok in-trans biztosítva vannak más transzpozáz gén által. Ily módon, a transzpozonok hasznosíthatók hordozókként, hogy transzgenezis révén új feno-
1
HU 004 220 T2
típusos tulajdonságokat vigyenek át genomokba. Nem fertõzõek, és a gazdájukhoz történõ adaptáció szükségessége miatt a vírusoknál vélhetõleg kevésbé ártalmasak a gazdára. DNS-transzpozonokat rutinszerûen alkalmaznak inszerciós mutagenezisre, géntérképezésre és géntranszferre jól megalapozott, nem gerinces modellrendszerekben, például Drosophila melanogaster vagy Caenorhabditis elegans rendszerekben és növényekben. Transzponálható elemeket nem alkalmaztak azonban gerinces genomok tanulmányozására, két okból. Elõször, mindeddig nem álltak rendelkezésre jól meghatározott, DNS-alapú, mobilis elemek ezekben a fajokban. Másodszor, állatokban, aktív transzpozonrendszerek egyik fajból a másikba történõ átvitelének fõ akadálya a transzpozíció fajspecifitása volt, mivel az a természetes gazda által termelt faktorokat igényelt. A „csipkerózsika” („Sleeping Beauty”; SB) aktív Telszerû transzpozon, amely csontos halak genomjában található inaktív elemek darabjaiból lett összeállítva [Ivics és mtsai.: (1977)]. Az SB hatékony és pontos kivágás és beillesztést („cut-and-paste”) közvetít halban, békában és számos emlõs fajban, például egér- és emberi sejtekben [Ivics és mtsai: (1997); Luo és mtsai.: (1998); Izsvak és mtsai.: (2000); Yant és mtsai: (2000)]. Az SB által közvetített transzpozíció hatékonysága különbözõ fajokból származó sejtvonalakban azonban változó. Például, az SB¹transzpozíció hatékonysága zebradánió sejtjeiben igen alacsony [Izsvak és mtsai.: (2000)], ami korlátozza az SB alkalmazhatóságát ebben fontos gerinces modell organizmusban. A jelenség nem teljesen világos, és több faktor együttes következménye lehet. Mivel az SB haleredetû elem, egy lehetséges magyarázat szerint, interferál a zebradánió genomjának endogén elemeivel. Ezért megoldaná a problémát, ha különbözõ gerinces eredetû transzpozon-készlet állna rendelkezésre. A jelen találmány hátterében álló módszertani probléma tehát az volt, hogy alternatív transzpozonalapú génszállítórendszereket biztosítsunk, hogy szélesebb körben tegyük lehetõvé gerincesekben a transzpozonok genomi eszközökként történõ alkalmazását. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezi transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, amely a következõket tartalmazza: (a) funkcionális transzpozázt kódoló polinukleotidtól mentes transzpozont, amely tartalmazza a hasznos (az adott esetben jelentõséggel bíró) polinukleotidot, ahol a transzpozon olyan fordított ismétlõdéseket tartalmaz, amelyek legalább 90%¹os azonosságot mutatnak a 2. azonosító számú szekvencián belüli ismétlõdésekkel vagy azok fordított ismétlõdéseivel; és (b) transzpozázt, amely N¹terminális végén a 3. és 4. azonosító számú szekvenciákat vagy a 3. és/vagy 4. azonosító számú szekvenciával legalább 90%ban azonos szekvenciákat tartalmazó DNS-kötõ domént tartalmaz; vagy (c) a (b) szerinti transzpozázt kódoló polinukleotidot.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
Elõnyösen, a DNS-kötõ domén a 6. azonosító számú szekvenciát tartalmazza, vagy abból áll. A találmány ezen és valamennyi következõ elõnyös megvalósítási módjai szerint, a transzpozon fordított ismétlõdéseket (fordított irányú ismétlõdéseket, „inverted repeat”) tartalmaz, ahol az 5’¹ismétlõdés az 5’¹végen a 2. ábra 1. pozíciójában kezdõdik és 214. pozíciójában végzõdik, és a 3’ ismétlõdés az 5’¹végen a 2. ábra 1408. pozíciójában kezdõdik és 1621. pozíciójában végzõdik. Szintén elõnyösen, a fordított ismétlõdés és/vagy a transzpozáz N¹terminális vége legalább 95%¹os, például legalább 98%¹os, elõnyösebben 99%¹os és legelõnyösebben 100%¹os azonosságot mutat a 2. azonosító számú szekvenciával, illetve a fordított ismétlõdésekkel, a 2. azonosító számú szekvencia rövidebb fragmensével és annak fenti fordított ismétlõdésével, és a 3. és/vagy 4. vagy 6. azonosító számú szekvenciákkal. Nukleinsavszekvenciák (valamint aminosavszekvenciák) azonossága meghatározható szokásos eljárásokkal vagy számítógépes programokkal, ezen belül a BLAST programmal [Altschul S. F., Gish W, Millers E. W. & Lipman D. J.: J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990)] vagy azok változataival [Altschul S. F. és Gish W: Methods Enzymol. 266, 460–480 (1996)], FASTA [Pearson W. R. és Lipman D. J.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444–2448 (1998)] vagy a Smith–Waterman algoritmus alkalmazásával [Smith T. F., Waterman M. S.: J. Mol. Biol. 147, 195–7 (1981)]. A „fordított ismétlõdés” fogalmát a technika állása szerint ismert értelemben használjuk. A „transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer” kifejezést, amely magában foglalja a „géntranszfer rendszer” jelentést, olyan rendszerre vonatkoztatva használjuk, amely DNS¹be, például kromoszomális DNS¹be történõ integráció közvetítéséhez szükséges komponenseket biztosít. Ezek a komponensek a találmány szerint a Frog Prince transzpozonból származnak, amelynek azonosítását a csatolt példákban ismertetjük, és további tulajdonságait a találmány fõ megvalósítási módjának fenti (a), (b) és (c) pontjában definiáljuk. Az elért integráció a találmány szerint tipikus II. osztályba tartozó transzpozíciós esemény. A találmány szerint elért integráció általában véletlenszerû esemény, de célzott módon is megvalósítható, ha a transzpozon például DNS-célzó doménhoz kapcsolt, vagy specifikus módon kölcsönhatásba lép valamely proteinnel (például linkeren keresztül kapcsolt protein interakciós doménnal), amely bizonyos DNS-szekvenciákat felismerõ DNS-célzó domént tartalmaz; lásd az EP 03 00 2637.1, EP 03 2637.6 és EP 03 00 2638.9 számú európai szabadalmi leírásokat. Ezen szabadalmi leírások tartalma teljes egészükben a leíráshoz tartozó kitanítás részét képezi. A találmány szerinti transzpozáz sejtmag-lokalizációs szignált („nuclear localisation signal”, NLS), a 3. és 4. azonosító számú szekvenciák szerinti hélix–hurok–hélix motívumokon felül további DNS-kötõ domént, valamint katalitikus domént is tartalmaz. Az (a) és (b) és/vagy (c) komponensek elõnyösen külön komponensekként vannak jelen a rendszerben. Egyes esetekben elõnyös továbbá, hogy legalább a
1
HU 004 220 T2
transzpozon külön komponensként megtartott. A „külön komponensek” kifejezés arra a tényre utal, hogy a komponensek, azaz a transzpozon, a találmány szerinti rendszerben felsorolt polinukleotidok és/vagy transzpozáz fizikailag elkülönült molekuláris entitások. Lehetséges például, az (a) pont szerinti transzpozon és a (c) pontban felsorolt polinukleotid nem alkot egyetlen polinukleotidot, hanem két külön, adott esetben egymástól függetlenül sokszorozódó polinukleotidként vannak jelen a találmány szerinti DNS-integrációs rendszerben. „Funkcionális transzpozázt kódoló polinukleotidtól mentes transzpozon” kifejezés alatt olyan transzpozonalapú DNS-molekulát értünk, amely többé nem tartalmazza a funkcionális, elõnyösen természetben elõforduló transzpozázt kódoló teljes szekvenciát. Elõnyösen, a funkcionális, elõnyösen természetben elõforduló transzpozázt kódoló teljes szekvencia vagy annak része deletálva van a traszpozonból. Más megoldás szerint, a transzpozázt kódoló gén olyan mutációt hordoz, hogy abban természetben elõforduló transzpozáz vagy annak transzpozázfunkciót betöltõ fragmentuma vagy származéka, azaz, amely a transzpozon inszercióját a DNS célhelyre közvetíti, már nincs jelen. További megoldás szerint, az aktivitás jelentõsen csökkent, legalább 50%-kal, elõnyösebben 80%-kal, 90%-kal, 95%kal vagy 99%-kal. A fenti mutációk lehetnek szubsztitúciók, duplikációk, inverziók stb., melyek leírása megtalálható standard molekuláris biológiai szakkönyvekben, például a következõben: „Molecular Biology of the Gene”, szerk.: Watson és mtsai., 4. kiadás, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA (1987). A transzpozonnak meg kell tartania azokat a szekvenciákat, amelyek in-trans biztosított transzpozáz általi mobilizálásához szükségesek.[2] Ezek a transzpozáz számára kötõhelyeket tartalmazó terminális fordított ismétlõdések. A leírásban „polinukleotid” kifejezés alatt bármely típusú polinukleotidot értünk, például RNS¹t, DNS¹t vagy PNS¹t vagy azok módosulatait. A találmány szerint a kifejezés elõnyösen DNS¹t jelent. Az „azonossági fokot mutat a 2. azonosító számú szekvencián belüli ismétlõdésekkel és annak fordított ismétlõdésével” kifejezés arra a tényre utal, hogy a 2. azonosító számú szekvencia a transzpozon 5’¹végén levõ ismétlõdõ szekvenciát jelöli, vagy azt tartalmazza. Az azonosság foka a transzpozon 5’¹ és 3’¹végeinél található fordított szekvenciák összességére vonatkozik (azaz az 1–124. és 1408–1620. pozíciókra, 2. ábra). A reverz komplementer szekvencia (a fordított ismétlõdés) a transzpozon 3’¹végén található. A találmány szerint, az 5’ ismétlõdés és a 3’ ismétlõdés a hasznos polinukleotidot tartalmazó transzpozonon belül megmarad. További szemléltetés céljából a 2. ábrára utalunk, ahol az ismétlõdéseket kiemeltük. A találmány szerinti, transzpozonalapú DNS-integrációs rendszerben foglalt fordított ismétlõdések tehát, ami az 5’ ismétlõdést illeti, legalább 90%¹os azonossági fokot mutatnak a 2. azonosító számú szekvenciában található ismétlõdésekkel (vagy a 2. ábra szerinti 1. pozícióban kezdõdõ és a 214. pozícióban végzõdõ szekvenciával),
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
ami a 3’ ismétlõdést illeti, legalább 90%¹os azonossági fokot mutatnak a 2. azonosító számú szekvencia szerinti reverz komplementer szekvenciában található ismétlõdésekkel (vagy a 2. ábra szerinti 1408. pozícióban kezdõdõ és az 1621. pozícióban végzõdõ szekvenciával), amelyet a 2. ábra 3’¹régiójában szintén kiemeltünk. A „transzpozáz, amely N¹terminális végén olyan DNS-kötõ domént hordoz, amely domén a 3. és/vagy 4. azonosító számú szekvenciát tartalmazza, vagy a 3. és/vagy 4. azonosító számú szekvenciával legalább 90%¹os azonossági fokot mutató szekvenciát tartalmazza” kifejezés alatt olyan (poli)peptidet értünk, amely szubsztrátspecificitása és DNS-kötõ/integráló kapacitása tekintetében megfelel az 1. azonosító számú szekvencia szerinti Frog Prince transzpozáznak. A 3. és 4. azonosító számú szekvenciák a DNS-kötõ régióban található, két hélix–hurok–hélix motívumnak felelnek meg. Megfelelnek továbbá a természetesen elõforduló transzpozázból származtatott fragmenseknek, amelyekbõl hiányoznak aminosavak, elõnyösen a természetben elõforduló transzpozázon belül, és amelyek mégis közvetítik a szubsztrát-DNS inszertálását. Más megoldás szerint, a kifejezés utal olyan, természetesen elõforduló transzpozázokra, például a természetben elõforduló transzpozázokat tartalmazó fúziós proteinekre, amelyekben egy vagy több aminosavat kicseréltek, deletáltak, hozzáadtak, vagy kevésbé elõnyösen, amelyekben inverziók vagy duplikálódások történtek. Az ilyen módosításokat elõnyösen rekombináns DNS-technológiával végzik. További módosítások végezhetõk a transzpozáz protein kémiai megváltoztatásával. A protein (valamint fragmensei és származékai) elõállítható rekombináns eljárásokkal, és mégis megtarthatja a természetben elõforduló protein azonos, vagy lényegében azonos tulajdonságait. A „(poli)peptid” kifejezés alatt egyaránt értünk peptideket és polipeptideket. A peptidek hagyományosan 30 aminosavat tartalmazó aminosavszekvenciát tartalmaznak, míg a polipeptidek (más elnevezéssel „proteinek”) legalább 31 aminosavból álló láncot képeznek. A találmány szerint transzponálható elemek új rendszerét fejlesztettük ki Rana pipiens kétéltû faj genomjában található, inaktív elemekbõl. Ez az új rendszer, amelynek a Frog Prince (FP; „békakirály”) nevet adtuk, elõnyösen alkalmazható vektorként genetikai anyag gerincesek kromoszómáiba történõ inszertálására. Egy kívánt transzpozonvektor néhány fõbb jellemzõje: könnyû alkalmazhatóság, gazdaszervezetek viszonylag széles köre, hatékony kromoszomális integrálódás és a hû transzgén-expresszálódás stabil fenntartása transzgén sejtek és organizmusok több generációján át. Közelebbrõl, a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer elõnyei, elsõsorban gerincesekbe történõ géntranszfer céljára, a technika korábbi állásához képest az alábbiak szerint ismertethetõ: A gerincesekbõl származó sejtek széles körét képes transzformálni; továbbá, mivel DNS-alapú transz-
1
HU 004 220 T2
pozon, nincs szükség a hasznos polinukleotid és elõnyösen a transzgén reverz transzkripciójára, ami mutációkat visz be retrovírus eredetû vektor törzsekbe. Mivel a transzpozonok nem fertõzõek, a transzpozonalapú vektorok nem képesek replikálódni, ezért nem terjednek át más sejtpopulációkra. Ráadásul, a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer a mobilizáláshoz mindössze körülbelül 230 bázispár (bp) transzpozon fordított ismétlõdõ DNS¹t igényel, amely a hasznos polinukleotidot, például transzgént két oldalról határolja; a transzpozíció indukálható, ahhoz csak a transzpozáz protein szükséges, így az „ugrás” helye és idõpontja a transzpozáz expresszálódásának a szabályozásával egyszerûen irányítható. Ezen túlmenõen, a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer gének stabil, egy-kópiás integrációját közvetíti a kromoszómákba, amely hosszú távú expresszálódás alapját teremti meg transzgén sejtek és organizmusok több generációján keresztül. Miután integrálódtak, az elemek várhatóan stabil, domináns genetikai determinánsként viselkednek a transzformált sejtek genomjában, mert 1) a transzpozáz jelenléte a sejtekben átmeneti, és arra az idõpontra korlátozódik, amikor a transzpozíció katalizálódik, és 2) gerincesekben nincs bizonyíték olyan transzpozázforrásra, amely képes volna az integrált elemeket aktiválni és mobilizálni; néhány békafaj kivételével, a gerincesek genomjában nem léteznek olyan, a találmány szerinti, transzpozonalapú DNS-integrációs rendszerrel homológiát mutató endogén szekvenciák, amelyek lehetõvé tennék transzpozicionálisan kompetens (autonóm) elemek rekombinációját és felszabadulását. A találmány szerinti rendszer a technika korábbi állása szerinti számos transzpozonnal szemben további elõnnyel rendelkezik, nevezetesen, hogy kevésbé érzékeny a fokozott expresszálódás gátlásának nevezett jelenséggel szemben. Nevezetesen, még ha a találmány szerinti rendszerben a transzpozáz koncentrációját egy bizonyos határ fölé emeljük is, a transzpozáz akkor sem gátolja a transzpozíciós reakciót. A technika állása szerinti korábbi transzpozonok ilyen tulajdonsága, amely korlátozza a transzpozíciós reakciók bizonyos körét, néhány alkalmazásra, például génterápia bizonyos alkalmazásaira elõnytelen lehet. A találmány szerinti rendszer két nagyságrenddel nagyobb mennyiségû transzpozázzal terhelhetõ túl anélkül, hogy a fokozott expresszálódás jelenségét észlelnénk. Az SB és Frog Prince transzpozázok aminosavszekvenciájának az összehasonlítása céljából utalunk a 7. ábrára. A találmány szerinti transzpozonalapú integrációs rendszer további fontos elõnye az, hogy a transzpozáz elsõdlegesen csak a szubsztráttal lép specifikusan kölcsönhatásba, azaz a találmány fõ megvalósítási módjának (a) pontjában ismertetett fordított ismétlõdésekkel. Ennek az a jelentõsége, hogy a transzpozáz nem képes kölcsönhatásba kerülni olyan transzponálható elemekkel és azokat mobilizálni, amelyek eltérnek a Frog Prince transzpozonoktól és genomokban endogének (pél-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
dául humán vagy zebradánió genomokban). Ugyanígy, fordítva, a Frog Prince transzpozáztól eltérõ, endogén transzpozázok nem képesek Frog Prince transzpozonokat mobilizálni. A transzpozon-transzpozáz kölcsönhatás specificitása biztosítja az integrált transzgén stabilitását és az endogén gének stabilitását. A találmány szerinti, transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a transzpozáz egy két részbõl álló nukleáris lokalizációs szignált tartalmaz, amelyet az 5. azonosító számú szekvencia képvisel, és/vagy a 6. azonosító számú szekvencia DNS-kötõ doménja és/vagy a 7. azonosító számú szekvencia által képviselt katalitikus domén, DD(34)E azonosítóval („signature”). Más megoldás szerint, a nukleáris lokalizációs szignál, a katalitikus domén és/vagy a DNS-kötõ domén legalább 90%¹os, elõnyösen legalább 95%¹os és még elõnyösebben legalább 99%¹os régióazonosságot mutatnak az 5., 6. és/vagy 7. azonosító számú szekvenciákkal. Ami a találmány fõ megvalósítási módját illeti, a vad típusú szekvencia molekuláris módosításai elvégezhetõk a megvalósítási mód szempontjából mindaddig, amíg a fent ismertetett aktivitás megmarad. A találmánynak megfelelõen különösen elõnyös, ha a transzpozonalapú DNS-integrációs rendszerben a fenti transzpozáz aminosavszekvenciája legalább 90%¹os, elõnyösen 95%¹os, elõnyösebben legalább 98%¹os és legelõnyösebben legalább 99%¹os fokú azonosságot mutat az 1. azonosító számú szekvenciával. Egy további, legelõnyösebb megvalósítási mód szerint, a transzpozáz aminosavszekvenciája azonos az 1. azonosító számú szekvencia szekvenciájával. A találmány megvalósítási módja során a 100%¹os azonosság a vad típusú Frog Prince transzpozázra vonatkozik, amint azt a csatolt példákban ismertetjük. A találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer egyik további megvalósítási módja szerint a hasznos polipeptid egy gén. A „gén” fogalma a technika állása szerint jól ismert, és az vonatkozik átíródott részre, valamint 5’ és 3’ határoló régiókra egyaránt, ezen belül promoterre [lásd például: Biotechnology, 2. kiadás, szerk: H.¹J. Rehm és G. Reed, VCH, Weinheim, 666. oldaltól (1993)]. A leírásban használt értelemben a gén fogalma magában foglal mesterséges géneket is, ahol például az átíródott szekvencia heterológ promoter szabályozása alatt áll, és adott esetben, további heterológ szabályozóelemekkel, például heterológ enhanszerrel kapcsolt. Az adott gén kódolhat markereket, például a zöld fluoreszcens proteint in vivo monitorozás céljára, és riportereket, például luciferáz- vagy antibiotikumrezisztencia-géneket. A hasznos polinukleotid és elõnyösen gén lehet bármely, a természetben elõforduló vagy mesterséges polinukleotid vagy gén, például baktériumokból, vírusokból, bakteriofágokból vagy állatokból származó gén. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a gén emlõsbõl, halból, kétéltûbõl, például békából, hüllõbõl vagy madárból származik. Különösen elõnyösen, az említett emlõs ember.
1
HU 004 220 T2
A hasznos polinukleotid különbözõ természetû lehet. Például, lehet nem kódoló természetû, ezáltal alkalmas lehet egy adott gén célzott megszakítására, amelynek fokozott expressziója szerepet játszhat valamely betegség etiológiájában. Egy további példa szerint, a transzpozon tartalmazhat promoterszekvenciákat, amelyek génexpressziót aktiválnak, amennyiben a transzpozon az endogén génhez megfelelõ közelségben inszertálódik. Elõfordulhat továbbá, hogy a transzpozon a transzpozícióhoz szükséges szekvenciákon felül nem tartalmaz egyéb szekvenciákat, amennyiben megfelelõ (például sejtek megváltozott fenotípusán alapuló) szelekciós eljárás rendelkezésre áll inszertek adott célban történõ azonosítására. Egy további lehetõség szerint, a hasznos polinukleotid szolgál szekvenciatoldalékként, amelyet aztán a transzpozon inszert azonosítására lehet alkalmazni. A találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer egy további megvalósítási módja szerint, a fenti hasznos polinukleotid terápiásan aktív (poli)peptidet kódol. E megvalósítási mód szerint, terápiás értékû (poli)peptidek célzottan bevihetõk ilyen (poli)peptidre rászoruló sejtekbe. Amennyiben szövetspecifikus expresszióra van szükség, szövetspecifikus promoterek irányíthatják a fenti (poli)peptidek expresszióját. Terápiásan aktív (poli)peptid lehet bármely peptid vagy protein, amely adott betegség támadását vagy progresszióját elhárítja. A terápiásan aktív (poli)peptid közvetlenül vagy közvetve befolyásolhatja a fenti támadást vagy progressziót. Terápiásan aktív (poli)peptidek közé tartoznak a növekedési faktorok és differenciálódási faktorok családja, például GCSF, GM¹CSF, valamint interleukinok és interferonok, vagy olyan módosított ellenanyag-származékok, például scFvs, amelyek a szervezeten belül káros vegyületekhez kötõdnek. A transzpozonalapú rendszerek vektorként alkalmazhatók olyan monogénes betegségek génterápiájára, mint például a hemofília. A transzponálható vektor elembe VIII¹as vagy IX¹es véralvadási faktorokat kódoló, megfelelõ transzkripciós szabályozószekvenciával ellátott cDNS¹ek juttathatók be. A transzpozáz a terápiás gének kromoszómákba történõ stabil integrációját közvetíti, ezáltal biztosítja a hosszú távú génexpressziót és a transzgén termékek szintjének emelkedését a szérumban. A találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer egy további elõnyös megvalósítási módja szerint szükség van arra, hogy a fenti hasznos polinukleotid siRNS¹sé íródjon át és szelektálható markert kódoljon. A polinukleotid hajtûkanyar-RNS-molekulákká („hairpin”) írható át, amelyek a kívánt cél expresszióját tekintve RNSi¹t mediálnak; további információért lásd például Elbashir és mtsai.: Nature 411, 494–498 (2001); Bernstein és mtsai.: RNA 7, 1509–1521 (2001); Boutla és mtsai.: Curr. Biol. 11, 1776–1780 (2001). A találmány szerinti transzpozonalapú rendszer alkalmazható RNSi expressziós kazetták kromoszómákba történõ stabil inszertálására, gének stabil génkiütésére gerincesek sejtjeiben. A megvalósításhoz szükséges,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
hogy a transzpozon szelektálható markert, például egy antibiotikum markergént, valamint RNSi expressziós kazettát tartalmazzon. A transzformáns sejtek például antibiotikumrezisztencia alapján szelektálhatók, és ezek a sejtek nagy valószínûséggel hatékonyan expresszálják az RNSi kazettát. Ez az eljárás leegyszerûsíti stabil RNSi klónok transzpozícióval történõ elõállítását és szûrését. A találmány egyik további megvalósítási módja szerint, a transzpozonalapú integrációs rendszerben a fenti hasznos polinukleotid tartalmaz egy intron illesztési akceptorhelyet („intron splice acceptor site”), valamint egy szelektálható markergént, amely génbõl hiányzik a metionin startkódon és tartalmaz egy poliA hozzáadott szignált az mRNS stabilizálására. Ez a megvalósítási mód transzpozon vektoron belüli „géncsapda” expressziós kazettaként alkalmazható, transzpozíciós események expresszált génekben történõ kiváltására és szelektálására. Például, a „géncsapda” transzpozon hordozhatja az egéreredetû recézett 2 („engrailed 2”) intront, amely egy illesztési akceptorhelyet és egy szelektálható markert, például neomicinrezisztencia markergént tartalmaz, amelybõl hiányzik a kezdõ metionon kodon. Ennek megfelelõen, a szelektálható markergén expresszálódása csak úgy érhetõ el, ha egy endogén génnel fúziós protein jön létre. A „géncsapda” transzpozonkonstrukció transzpozázforrással együtt sejtekbe, például humán HeLa sejtekbe transzfektálható. A „géncsapda” transzpozonok egy része gének intronjaiba és nem transzlálódó régióiba inszertálódik, amelyek egy töredéke megfelelõ orientációba kerül ahhoz, hogy az endogén gén és a (példa szerinti) neo markergén között fúziós transzkripció jöjjön létre. Számos transzpozon inszerciót klónoztunk G418-rezisztens sejtklónokból. Az inszerciók mindegyike génekben történt. A „géncsapda” vektor aktívan átírt génekbe történõ integrációja lókusz-specifikus markerként szolgálhat élõ állatokban és címkéket („tag”) biztosítanak szétdarabolt gének azonosítására. A találmány egyik további megvalósítási módja szerint, a transzpozonalapú DNS-integrációs rendszerrel szemben igény, hogy a fenti transzpozáz fokozott transzpozázaktivitást mutasson. Proteinek pontmutációs változatai, amelyek kódolószekvenciájukban enyhe módosítást hordoznak, gyakran mutatnak magasabb aktivitást, mint az eredeti változatuk. Ez okból, számos proteint módosítottak abból a célból, hogy „hiperaktív” változatokat kapjanak. Jól ismert példa a GFP („Green Fluorescence Protein”) versus eGFP protein (e jelentése fokozott, „enhanced”), amelyet a természetben megtalálható proteinhez képest módosítottak, és laboratóriumi alkalmazásra jobb tulajdonságokat mutat. Hiperaktív transzpozázok jól ismertek továbbá baktériumokban (Tn5) és rovarokban (Himar1). Beszámoltak róla, hogy ezek a transzpozázok 1¹2 nagyságrenddel magasabb szinten támogatják a DNS-transzpozíciót, mint az eredeti protein. Tekintettel a gerinces eredetû transzpozonok teljesítménye iránti magas elvárásra, elvégeztük a Frog Prince hiperaktív szûrését („hyperactive screen” vizsgálatát). Ettõl a kísérlettõl azt
1
HU 004 220 T2
vártuk, hogy az eredetihez viszonyítva 10–100-szor jobb teljesítményt nyújtó rendszert kapunk. A leíráshoz csatolt példák azt mutatják, hogy „hiperaktív transzpozon rendszer” elõállítására irányuló próbálkozásunk sikeres megközelítés volt. A találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer egyik további megvalósítási módja szerint, az (a) szerinti transzpozont és/vagy a (c) szerinti polinukleotidot legalább egy vektor tartalmazza, azaz egy vagy több vektor tartalmazza (más megoldás szerint, a transzpozon elõállítható vektorszekvenciák nélkül, például körkörös formában). A találmány szerint, a fent ismertetett bármelyik polinukleotid esetében alkalmazott vektor lehet expressziós, géntranszfer vagy géncélzó („gene targeting”) vektor. Expressziós vektorok szakember számára jól ismertek és széles körben hozzáférhetõk; lásd Ausubel és mtsai., loc cit. A találmány szerinti vektor ezen elõnyös megvalósítási módja szerint, a polinukleotid operatívan kapcsolódik olyan szabályozó szekvenciákhoz, amelyek lehetõvé teszik prokarióta vagy eukarióta sejtekben, vagy azok izolált frakcióikban való expressziót. A fenti polinukleotid(ok) expressziója tartalmazza a polinukleotid(ok) transzkripcióját, elõnyösen transzlálható mRNS¹sé. Ennek megfelelõen, a transzpozon forrás lehet mRNS. Más megoldás szerint, transzpozáz mRNS¹t viszünk be az adott, hasznos sejtbe. Szabályozóelemek, amelyek biztosítják eukarióta sejtekben, elõnyösen emlõseredetû sejtekben való expressziót, szakember számára jól ismertek. Szokásosan a transzkripció kezdetét biztosító szabályozószekvenciákat és kívánt esetben a transzkripció befejezését és a transzkript stabilizálását biztosító poli¹A szignálokat tartalmaznak. További szabályozóelemek közé tartoznak transzkripciós, valamint transzlációs enhanszerek. Prokarióta gazdasejtekben történõ expressziót lehetõvé tevõ, lehetséges szabályozóelemek közé tartoznak például a lac, trp vagy tac promoterek az E coli-ban, és eukarióta gazdasejtekben történõ expressziót lehetõvé tevõ szabályozóelemekre példák az AOX1 vagy GAL1 promoterek élesztõben, vagy a CMC¹, SV40¹, RSV-promoterek („Rous sarcoma virus promoter”), CMV-enhanszer, SV–40 enhanszer vagy globin intron emlõs- vagy más állati eredetû sejtekben. A transzkripció elindításáért felelõs elemeken kívül, az ilyen szabályozóelemek tartalmazhatnak továbbá transzkripciót leállító szignált, amilyenek például az SV40poli¹A vagy tk¹poli¹A helyek, a polinukleotidtól 3’¹irányban. Ebben az összefüggésben, szakember számára jól ismertek olyan expressziós vektorok, mint például a pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene) és pSPORT1 (GIBCO BRL) Okayama-Berg cDNS expressziós vektorok. A génterápia, amely terápiás géneknek sejtekbe ex vivo vagy in vivo eljárásokkal történõ bevitelén alapulnak, a géntranszfer legfontosabb alkalmazása. In vitro vagy in vivo génterápiára alkalmas vektorokat, eljárásokat vagy génbeviteli rendszereket ismertet a szakirodalom, és azok szakember számára jól ismertek; lásd például Giordano: Nature Medicine 2, 534–539 (1996);
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
Schaper. Circ. Res. 79, 911.919 (1996); Anderson: Science 256, 808–813 (1992); Isner: Lancet 348, 370–374 (1996); Muhlhauser: Circ. Res. 77, 1077–1086 (1995); Onodua: Blood 91, 30–36 (1998); Verzeletti: Hum. Gene Ther. 9, 2243–2251 (1998); Verma: Nature 389, 239242 (1997); Anderson: Nature 391, 25–30 (Suppl. 1998); Wang: Gene Therapy 4, 393–400 (1997); Wang: Nature Medicine 2, 714–716 (1996); a WO 94/29469 és WO 97/00957 számú nemzetközi közzétételi iratokat; az US 5 580 859, US 5 589 466 és US 4 394 448 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat, vagy Schaper: Current Opinion in Biotechnology 7, 635–640 (1996) és a bennük idézett szakirodalmi helyeket. Ezeket a vektorokat és/vagy génátviteli rendszereket ismertetik továbbá génterápiás megközelítésben, például neurológiai szövetben/sejtekben [többek között lásd például Blömer: J. Virology 71, 6641–6649 (1997)] vagy a hipotalamuszban [többek között lásd például Geddes: Front Neuroendocrinol. 20, 296–316 (1999) vagy Geddes: Nat. Med. 3, 1402–1404 (1997)]. Neurológiai szövetekben/sejtekben alkalmazható, további megfelelõ génterápiás konstrukciók ismertek szakember számára, lásd például Meier: J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58, 1099–1110 (1999). A találmány szerint alkalmazott vektorok tervezhetõk közvetlen bevitelre, vagy bevihetõk sejtekbe liposzómák, vírusvektorok (például adenovírus- vagy retrovírus-vektorok), elektroporáció, ballisztika (például génpuska) vagy más beviteli rendszer alkalmazásával. Ezen túlmenõen, a találmány szerinti nukleinsavmolekulák számára eukarióta expressziós rendszerként bakulovírus rendszer alkalmazható. A bevitel és a génterápiás megközelítés funkcionális molekula, elõnyösen terápiásan aktív molekula expressziójához kell vezessen, amely expresszált molekula elõnyösen alkalmas bármely olyan betegség kezelésére, javítására és/vagy megelõzésére, amely betegség génterápiás megközelítéssel kezelhetõ, javítható és/vagy megelõzhetõ. Egy kiemelten elõnyös megvalósítási mód szerint, a fenti vektorok közül legalább egy plazmid. A plazmidok szakember számára jól ismertek, és rekombináns célokra ismertetik például Sambrook és mtsai.: [„Molecular Cloning, A laboratory manual”, 2. kiadás, CSH Press, Cold Spring Harbor, (1989); Ausubel és mtsai.: „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, N. Y. (2001)]. A plazmidok kis, extrakromoszomális, általában körkörös alakú, kettõs szálú DNS-molekulák, amelyek autonóm replikációra képesek. A természetben elõfordulnak prokariótákban és eukariótákban egyaránt, és általában legalább egy replikációs origót (kezdõhelyet) és kisszámú gént tartalmaznak. A plazmidalapú vektor forma különösen elõnyös, mivel elõállításuk egyszerû és költségkímélõ, valamint nagy mennyiségben végezhetõ. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszerrel transzfektált vagy transzformált gazdasejt. A találmány szerinti gazdasejt lehet prokarióta sejt, azonban a gazdasejt elõnyösen eukarióta sejt, például Spodoptera
1
HU 004 220 T2
frugiperda sejt, élesztõsejt, például Saccharomyces cerevisiae vagy Pichia pastoris sejt, gombasejt, például Aspergillus sejt, vagy gerincesbõl származó sejt. Az utóbbi tekintetében, a gazdasejt elõnyösen emlõseredetû sejt, például humáneredetû sejt. A gazdasejt lehet sejtvonal része. A találmány tárgyát képezi továbbá nem humán transzgenikus állat, amely tartalmazza a leírás (a) pontja szerinti transzpozont vagy a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszert, amely állat genomjában stabilan integrálva hordozza az összetevõk legalább egyikét vektor, vagy körkörös formában. A transzgenikus állat lehet bármely, manipulálásra alkalmas állat, és ahol a manipulálás eredménye transzgenikus állat. Az állat elõnyösen emlõsállat, például patkány vagy egér. Más megoldás szerint lehet hal, például zebradánió vagy kétéltû, például béka. A fentiekkel összhangban, a találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer alkalmazása olyan gyógyszer elõállítására, amely alkalmas a hasznos polinukleotid átvitelére gerinces állat sejtjeibe azáltal, hogy a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszert beviszi a fenti sejtekbe. Elõnyösen az átvitelt in vitro végezzük. A találmány további elõnyös megvalósítási módja szerint a fenti átvitelt in vivo végezzük. A találmány még elõnyösebb megvalósítási módja szerint (a) olyan sejteket szelektálunk, amelyekben a polinukleotid stabilan integrálódott a sejtek kromoszómáiba, és ahol (b) a fenti sejteket vagy azokból származtatott sejteket ugyanazon gerinces fajba visszük be vagy visszük vissza. Az olyan sejtek szelektálása, amelyekben a polinukleotid stabilan integrálódott a kromoszómákba, végezhetõ fizikálisan, a transzpozon és a kromoszomális DNS közötti kovalens kapcsolat kimutatásával (például PCR alkalmazásával, a transzpozonszekvenciát egyedi szekvenciatoldalékként alkalmazva). A technika állása szerint, különbözõ eljárások ismertek ilyen transzfer létrehozására. Következésképp, számos különbözõ eljárás ismert a transzpozon rendszer komponenseinek sejtekbe történõ bejuttatására. Mivel a csupasz plazmid-DNS sejtekbe történõ bevitele rendszerint nem elég hatékony, azt elõnyösen más, a sejtmembrán penetrációjára képes molekulákkal társítják vagy kapcsolják. A génpuskák DNS-sel bevont kicsiny részecskéket alkalmaznak, amelyeket a sejtekbe lõnek, ezáltal juttatják oda rakományukat, vagy nagy sebességû oldószerrel juttatnak (DNS-oldatot) élõ sejtekbe. A közös elv DNS fizikai úton történõ bejuttatása sejtekbe, a sejtmembránokon keresztül történõ nagy sebességû penetrációval. Liposzómákat DNS kisméretû, mesterséges membránrészecskékbe történõ becsomagolására használnak, amelyeket a sejtmembránnal fuzionáltatnak, vagy endocitózis révén vétetnek fel a sejtekkel, így juttatva be a DNS-rakományt. Az elektro-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
poráció nagyfeszültségû elektrosokkot alkalmaz DNS sejtmembránokon keresztül történõ bejuttatására. Az adenovírus-polilizin komplexek alkalmazása az adenovírusok azon természetes képességén alapul, hogy képesek sejteket megfertõzni. Ezeknek a módszereknek a leírása megtalálható a következõ szakirodalmi helyen: Current Protocols in Human Genetics (1997). A jelen találmány szerint elõnyösek azok az eljárások, ahol a transzfert génpuska alkalmazásával érik el, vagy liposzómák polietilénimin, adenovírus-polilizin-DNSkomplexek, lipfokeció, elektroporáció, transzfekció vagy infekció/transzdukció által közvetített vagy támogatott géntranszferrel érik el. Amennyiben az infekció lehetõségét választjuk, elõnyös, ha az infekció vagy transzdukció rekombináns retrovírus, rekombináns adenovírus, rekombináns herpeszvírus vagy rekombináns adenoasszociált vírus által közvetített vagy támogatott. A találmány szerinti alkalmazás egy elõnyös megvalósítási módjai szerint, az említett sejtek szomatikus sejtek. Szomatikus sejtek manipulációjával kapcsolatosan különösen elõnyös, ha a gerinces emlõs, hal, kétéltû, hüllõ vagy madár. Legelõnyösebben, az emlõs ember. A jelen találmány szerinti alkalmazás egy további elõnyös megvalósítási módja szerint, az említett sejtek nem humán csírasejtek. Csírasejtek manipulációjával kapcsolatosan különösen elõnyös, ha a gerinces nem humán emlõs, hal, kétéltû, hüllõ vagy madár. Nem humán csírasejtek vonatkozásában elõnyös, ha az említett sejtek pluripotens vagy multipotens sejtek. Az említett különbözõ elõnyös megvalósítási módokban történõ megfelelõ alkalmazás magában foglalja továbbá az említett nem humán csírasejtek vagy említett nem humán csírasejtekbõl származó sejt ugyanolyan fajú gerincesbe történõ visszajuttatását követõen a transzgenikus gerinces állat felnevelését, ahol az említett gerinces vagy transzgenikus gerinces nem humán. Transzgenikus állatok létrehozására a fentiekben röviden utaltunk, és az a technika állása szerint jól ismert módszer. Transzgenikus nem humán állat, például transzgenikus egerek létrehozására alkalmas eljárás, a fentiekben említettek szerint polinukleotid- vagy célzóvektor alkalmazásán alapul, amelyet nem humán csírasejtbe, embrionális sejtbe, õssejtbe vagy petesejtbe, vagy azokból származó sejtbe juttatnak. A nem humán állat a leírásban ismertetett szûrõ eljárás szerint alkalmazható. Transzgenikus embriók létrehozása és azok szûrése végezhetõ például a következõ szakirodalmi helyeken ismertetettek szerint: A. L. Joyner szerk., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press. Az embriók embrionális membránjának DNS¹e analizálható például Southern-blotokkal, megfelelõ próba alkalmazásával. Transzgenikus, nem humán állatok létrehozására alkalmas általános eljárás a technika állása szerint jól ismert, lásd például a WO 94 24 274 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetetteket. Transzgenikus, nem humán organizmusok (ezen belül célzott homológ rekombinációval elõállított nem humán állatok) elõállítására embrionális
1
HU 004 220 T2
csírasejtek (ES-sejtek) elõnyösek. Homológ géncélzás („gén-targeting”) céljára alkalmazhatók egér ES¹sejtek, például mitotikusan inaktív SNL76/7 tápláló sejtrétegen tenyésztett AB–1-vonal [McMahon és Bradley: Cell 62, 1073–1085 (1990)], lényegében a következõ szakirodalmi helyen leírtak szerint: Robertson, E. J.: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson, szerk., (Oxford: IRL Press), 71–112 (1987). További alkalmas ES¹vonalak például, anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk, az E14vonal [Hooper és mtsai.: Nature 326, 292–295 (1987)], a D3¹vonal [Doetschman és mtsai.: J. Embryol. Exp. Morph. 87, 27–45 (1985)], a CCE-vonal [Robertson és mtsai.: Nature 323, 445–448 (1986)], és az AK–7-vonal [Zhuang és mtsai.: Cell 77, 875–884 (1994)]. ES-sejtekbõl specifikus, célzott mutációt hordozó egér vonal létrehozásának sikere az ES¹sejtek pluripotenciájának függvénye (azaz, azon képességük függvénye, hogy gazdába injektálva embrióvá fejlõdjenek, például blasztocitává vagy morulává, hogy részt vegyenek az embriogenezisben, és hozzájáruljanak a létrejövõ állat csírasejtéihez). Az injektált ES¹sejteket tartalmazó blasztocitákat álvemhes, nem humán nõstények méhében hagyják fejlõdni, és például kiméra egerekként hozzák világra. A kapott transzgenikus egér a rekombinázt vagy riporter lokuszokat tartalmazó sejtekre nézve kiméra, és azt visszakeresztezik, és az utódok farokbiopsziájából nyert DNS¹en, PCR vagy Southernblot-analízissel a helyesen célzott transzgén(ek)re szûrik, hogy rekombinázra vagy riporter lokuszra/lokuszokra transzgenikus egereket azonosítsanak. Transzgenikus muslicák, például Drosophila melanogaster elõállítására szolgáló eljárások leírása a technika állása szerint szintén megtalálható, lásd például a következõket: 4 670 388 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Brand és Perrimon, Development 118, 401–415 (1993); valamint Phelps és Brand: Methods 14, 367–379 (April 1998). Transzgenikus férgek, például C. elegans elõállíthatók például az alábbi eljárások szerint: Mello és mtsai.: Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. Embo J. 10, 3959–70 (1991), Plasterk: Reverse genetics: from gene sequence to mutant worm. Methods Cell. Biol. 48, 59–80 (1995). Valamennyi, transzgenikus állat vonatkozásában eddig ismertetett bejelentés két, három vagy több transzgént hordozó állatokra is vonatkozik. Kívánt lehet az is, hogy valamely protein expresszióját vagy funkcióját a transzgenikus állat fejlõdésének és/vagy életének bizonyos szakaszában inaktiváljuk. Ez elérhetõ például szövetspecifikus, fejlõdés- és/vagy sejtszabályozás alatt álló és/vagy indukálható promoterek alkalmazásával, amelyek például a kódoló RNS¹t kódoló RNS-transzkript elleni antiszensz vagy ribozim expresszióját irányítják. Alkalmas indukálható rendszer például a tetraciklin-szabályozott génexpresszió, amint azt például a következõ szakirodalmi helyeken leírták: Gossen és Bujard: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547–5551 (1992), valamint Gossen és mtsai.: Trends
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
Biotech. 12, 58–62 (1994). Hasonlóképpen, ilyen szabályozóelemek irányíthatják a mutáns protein expresszióját. Ezen túlmenõen, az így elõállított transzgenikus állatban, amelynek sejtjei (elõnyösen genomjukban stabilan integrálva) tartalmazzák a nukleinsav-molekulának vagy annak részének a transzkripcióját vagy expresszióját[.5], a kívánt protein szintézise redukálható. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint, a redukció végezhetõ antiszensz, szensz, ribozim, ko¹szuppresszió és/vagy domináns mutáns hatással. „Antiszensz” és „antiszensz nukleotid” kifejezés alatt olyan DNS- vagy RNS-konstrukciókat értünk, amelyek a természetben elõforduló géntermék elõállítását blokkolják. Ennek elérésére alkalmazott eljárások szakember számára jól ismertek. Ide tartoznak például antiszensz-RNS, ribozimek és siRNS expressziója, valamint olyan molekuláké, amelyek egyesítenek antiszensz és ribozim funkciókat és/vagy olyan molekulák, amelyek ko¹szuppressziós hatást fejtenek ki; lásd fentebb. Amennyiben antiszensz megközelítést alkalmazunk, hogy sejtekben a kívánt proteinek mennyiségét redukáljuk, az antiszensz-RNS¹t kódoló nukleinsav elõnyösen homológ eredetû a transzformáláshoz alkalmazott állatfajjal. Lehetséges azonban olyan nukleinsavmolekulák alkalmazása is, amelyek nagyfokú homológiát mutatnak a kívánt proteint kódoló, endogén elõforduló nukleinsavmolekulákkal. Ez esetben a homológia foka elõnyösen 80%-osnál nagyobb, elõnyösebben 90%-osnál nagyobb, még elõnyösebben 95%-osnál nagyobb. Transzgenikus eukarióta sejtekben a kívánt protein szintézisének a redukciója változást idézhet elõ például a kalcium-szignálozásban. Ilyen sejteket tartalmazó transzgenikus állatokban ez különbözõ élettani, fejlõdési és/vagy morfológiai elváltozásokhoz vezethet. Amennyiben nem humán csírasejteket vagy nem humán csírasejtvonalakból származtatott csírasejteket, például blasztociszta stádiumban levõ sejteket manipulálunk, elõnyös, ha a fenti bevitelt vagy visszavitelt spermával[.6], mikroinjektálással vagy génpuskával mediáljuk vagy váltjuk ki. Ezen túlmenõen, a találmány tárgyát képezi RNSi elõállítására alkalmas in vitro eljárás, amely az alábbiakat tartalmazza: (a) a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer részét képezõ transzpozon sejtbe történõ stabil bevitelét, ahol a fenti hasznos polinukleotid siRNS¹sé íródik át és szelektálható markert kódol; (b) a szelektálható markert expresszáló sejtek szelektálását, és (c) annak megállapítását, hogy a kívánt gén transzkripciójára/transzlációjára hatással van¹e az RNSi. A találmány szerinti ezen eljárás alkalmazását a találmány szerinti, fenti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer megfelelõ megvalósítási módjával összefüggésben ismertetjük. Ezek az alkalmazások, valamint a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszerrel kapcsolatban ismertetett elõnyös
1
HU 004 220 T2
megvalósítási módok mutatis mutandis vonatkoznak a találmány szerinti eljárásra. A transzpozon integrációját a leírásban ismertetett transzpozáz közvetíti, amelyet a sejtbe vagy a sejt progenitorjába (õsébe, elõdjébe?9/33) elõnyösen protein vagy a proteint kódoló nukleinsav formájában viszünk be. A találmány tárgyát képezi továbbá in vitro géncsapdázási eljárás, amely az alábbiakat tartalmazza: (a) a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer bevitelét sejtbe, amely integrációs rendszerben a hasznos polinukleotid intron tartalmaz egy intron illesztési akceptorhelyet („intron splice acceptor site”), és egy szelektálható markergént, amelybõl hiányzik a metionin startkódon, és tartalmaz egy hozzáadott poliA szignált; és (b) a szelektálható marker expresszálódására történõ szûrést, ahol a szelektálható marker expresszálódása a transzpozonnak a sejt egyik átírt génjébe történt integrálódásának a jele. Akárcsak a fentebb ismertetett megvalósítási mód esetében, a találmány szerinti ezen eljárás alkalmazását a találmány szerinti, fenti transzpozonalapú DNSintegrációs rendszer megfelelõ megvalósítási módjával összefüggésben ismertetjük. Ezek az alkalmazások, valamint a találmány szerinti transzpozonalapú DNSintegrációs rendszerrel kapcsolatban ismertetett elõnyös megvalósítási módok mutatis mutandis vonatkoznak a találmány szerinti eljárásra. Ezek az alkalmazások szintén mutatis mutandis vonatkoznak a találmány szerinti eljárásra. Az illesztési akceptorhelyen („splice acceptor site”) kívül, a hasznos polinukleotid tartalmazhatja az intron részeit vagy a teljes intront. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, az in vitro eljárás tartalmazza továbbá: (c) a megszakított gén azonosítását, az integrált transzpozon toldalékként való alkalmazásával. Mint azt fentebb ismertettük, a „géncsapda” vektor aktívan átíródott génekbe történt integrációja élõ állatokban lókuszspecifikus markerként képes mûködni, és toldalékokként szolgál a megszakított gén azonosításához. A találmány tárgyát képezi továbbá transzpozon, amely olyan fordított ismétlõdéseket tartalmaz, vagy olyan fordított ismétlõdésekbõl áll, amelyek legalább 90%¹os azonosságot mutatnak a 2. azonosító számú szekvencián belüli ismétlõdésekkel, valamint a 2. azonosító számú szekvencia fordított ismétlõdéseivel; továbbá transzpozáz, amely N¹terminálisan olyan DNSkötõ domént hordoz, amely tartalmazza a 3. és 4. azonosító számú szekvenciákat, vagy még elõnyösebben, a 6. azonosító számú szekvencia szerinti kötõ domént. Még elõnyösebb egy olyan transzpozon, ahol a transzpozáz az 1. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciát mutatja és a határoló szekvenciák (ismétlõdések) a 2. azonosító számú szekvenciából állnak, vagy azt tartalmazzák. További megvalósítási módok szerint, olyan nukleinsav- vagy aminosavszekvenciákat alkalmazunk, amelyek legalább 90%¹os, elõnyösen legalább 95%¹os, még elõnyösebben legalább 98%¹os és legelõnyösebben 99%¹os azonosságot mutatnak az 1.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 10
2
(vagy 3. és/vagy 4. vagy 6.) és 2. azonosító számú szekvenciákkal. Végül, a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszert tartalmazó készítmény. A készítmény lehet például diagnosztikai készítmény vagy készlet, vagy farmakológiai készítmény. A készítmény különbözõ összetevõi lehetnek egy vagy több tárolóba, például egy vagy több ampullába kiszerelve. Az összetevõk mellett, az ampullák tartalmazhatnak tartósítószereket vagy puffereket a tároláshoz. Elõnyösen, a készítmény gyógyhatású készítmény. A gyógyhatású készítmény lehet szilárd, folyadékvagy gáz-halmazállapotú és többek között lehet por, tabletta, oldat vagy aeroszol formájú. A készítmény a leírás szerinti különbözõ összetevõk legalább kettõ, elõnyösen három, elõnyösebben négy, még elõnyösebben öt készletét tartalmazhatja. Elõnyösen, kívánt esetben a fenti gyógyhatású készítmény gyógyászatilag elfogadható hordozót, vivõanyagot és/vagy hígítószert tartalmaz. A találmány szerinti gyógyhatású készítmény elõnyösen alkalmazható bármely olyan betegség kezelésére, amely génterápia eszközével megelõzhetõ, enyhíthetõ vagy gyógyítható. Ilyen rendellenességek közé tartoznak, anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk, a hemofília, alfaantitripszin-deficiencia, öröklõdõ hiperkoleszterinémia, izomdisztrófia, cisztikus fibrózis, rák, súlyos kombinált immundeficiencia és cukorbetegség. Gyógyászatilag elfogadható hordozók, vivõanyagok és/vagy hígítószerek szakember számára jól ismertek, és ide tartoznak foszfáttal pufferolt sóoldatok, víz, emulziók, például olaj/víz emulziók, nedvesítõágensek különbözõ típusai, steril oldatok és mások. Az ilyen hordozókat tartalmazó készítmények jól ismert, szokásos eljárásokkal állíthatók elõ. Ezeket a gyógyhatású készítmények megfelelõ adagban beadhatók arra rászoruló személynek. A megfelelõ készítmény beadása több úton lehetséges, például intravénás, intraperitoneális, szubkután, intramuszkuláris, topikális, intradermális, intranazális vagy intrabronchiális beadással. Kiemelten elõnyös, ha a beadást izomban, májban, tüdõben, hasnyálmirigyben vagy tumorokban levõ helyekre injektálják és/vagy viszik be. A találmány szerinti készítmények beadhatók továbbá közvetlenül a célhelyre, például biolisztikus bevitellel egy adott célhelyre, például agyba. A beadási rend dózisát a kezelõorvos és a klinikai tényezõk határozzák meg. Amint az orvostudományban jól ismert, adott személy adagja számos tényezõtõl függ, például a személy tömegétõl, testfelületétõl, korától, nemétõl, a beadás idejétõl és útjától, általános állapotától, a beadandó készítménytõl és az egyidejûleg adott más drogoktól. Proteinszerû, gyógyászatilag aktív ágens dózisonként I ng és 10 mg közötti mennyiségben lehet jelen, a testtömeg 1 kg¹jára vonatkoztatva; a példaként ismertetett tartományon felüli és alatti adagok is alkalmazhatók azonban, különös tekintettel a fenti tényezõkre. Ha a beadási rend folyamatos infúzió, azt szintén 1 ng és 10 mg (1 kg testtömegre és 1 percre vonatkoztatva) tartományban kell
1
HU 004 220 T2
adagolni. DNS beadásának elõnyös adagja a DNS-molekula 106–1012 kópiája. Az elõrehaladás idõszakos értékeléssel monitorozható. A találmány szerinti készítmények beadhatók lokálisan vagy szisztémásan. A parenterálisan beadható készítmények lehetnek steril, vizes vagy nemvizes oldatok, szuszpenziók és emulziók. Nemvizes oldószerekre példák a propilénglikol, plietilénglikol, növényi olajok, például olívaolaj, és injektálható szerves észterek, például etil-oleát. Vizes oldatok közé tartoznak a víz, alkoholos/vizes oldatok, emulziók vagy szuszpenziók, beleértve fiziológiás konyhasóoldatot és pufferolt közegeket. Parenterális vivõanyagok közé tartoznak a nátrium-klorid-oldat, Ringer-dextróz, dextróz és nátrium-klorid, laktátos Ringer-oldat vagy fixált olajok. Intravénás vivõanyagokhoz tartoznak a folyadék- és tápanyagpótlók, elektrolitpótlók (például a Ringer-dextróz alapúak), és hasonlók. Jelen lehetnek tartósítok és más adalékok, például mikrobák elleni ágensek, antioxidánsok, kelálóágensek, inert gázok és hasonlók. Ezen túlmenõen, a találmány szerinti gyógyhatású készítmény tartalmazhat további ágenseket, a készítmény alkalmazási céljától függõen. Kiemelten elõnyös, ha a találmány szerinti gyógyhatású készítmény olyan további ágenseket tartalmaz, mint például immunsegítõket (enhanszereket) és hasonlókat. Az ábrák az alábbiakat mutatják: 1. ábra. Stratégia transzpozáz ORF¹ek csapdázására Rana pipiens genomból. Transzpozáz géneket amplifikáltunk genomi DNSbõl, olyan primerek (nyilakkal jelölve) alkalmazásával, amelyek az elõre látható génszekvenciákat határolták. Transzpozáz-kódoló régiók gyûjteményét (üres kockák jelölik) amplifikáltuk. Ezen gének nagy többsége pontmutáció ( ), leolvasási keret eltolódás ( ) és éretlen transzlációs stopkódonok (·) miatt hibás volt. Meg nem szakított ORF-eket szelektáltunk úgy, hogy a PCR-termékeket CMV-promoterrel irányított LacZ-génnel fuzionáltatva klónoztuk, E. coli¹ba transzformáltuk, majd X¹gal lemezekre szélesztettük. 2. ábra. A Frog Prince transzponálható elem teljes hosszúságú kikövetkeztetett konszenzus szekvenciája. Az IR¹eket sötét háttérrel jelöltük. A 21 bp hosszú DR¹eket fehér keretben ábrázoltuk. A transzpozáz kódolt aminosavszekvenciáját a DNS-szekvencia alatt tüntettük fel. Az újonnan azonosított szekvenciákat, amelyek hiányoznak a Xenopus Txr konszenzus szekvenciából, aláhúztuk. A csillagok olyan bázispár pozíciókat jelölnek, ahol a Rana és Xenopus elemek szekvenciája a transzpozáz kötõhelyen belül eltérõek, és ahol helyettesítést vittünk be a transzpozáz génbe, hogy a konszenzus szekvenciához jussunk. 3. ábra. FP transzpozíciója és szubsztrát-felismerése humán HeLa sejtekben. A táblázat-
5
10
15
4. ábra.
20
25
30 5. ábra.
35
40
45
6. ábra. 50
55
7. ábra. 60 11
2
ban feltüntetett donor és segítõ („helper”) plazmidok különbözõ kombinációját ko¹transzfektáltuk HeLa-sejtekbe. Kontrollként pCMV-bgal donor plazmiddal történõ transzfekció szolgált. A transzgénintegráció hatékonyságát antibiotikumrezisztens klónok számolásával állapítottuk meg, miután a sejteket G418 szelekció alatt kiszélesztettük. A bal oldalon a számok a kolóniák átlagos számát jelentik 105 szélesztett sejtre vonatkoztatva. Az eredmények legalább három transzfekciós kísérlet átlagát jelentik. A hibaantennák a SEM-értéket mutatják FP-közvetítette kivágás és beillesztés („cut-and-paste”) típusú transzpozíció humáneredetû kromoszómákba. Felül, az FP-neo elem sematikus ábrázolását mutatjuk. Az IR¹eket fekete nyilak jelzik, az SV40 promotert és a neomicinrezisztencia markergént a nyíl fehér mezõjében tüntettük fel. A szomszédos pUC19 vektor-váz szekvenciákat, amelyek az elemet a donor konstrukcióban határolják, dõlt betûk jelzik. Humán genomi szekvenciák három régióját, amelyek a transzpozáz célhelyeként szolgáltak, alul tüntettük fel. Pontos kivágás és beillesztés transzpozíció a genomi TA céldinukleotidok duplikációjához vezetett, amelyeket vastagon szedtünk. FP aktivitása különbözõ gerinces fajokban. FP és SB donor és segítõ plazmidjait HeLa (humán), CHO¹K1 (hörcsög), A6 (Xenopus laevis), FHM („fathead minnow”, Pimephales promelas) és PAC2 (zebradánió) sejtvonalakba ko¹transzfektáltuk. A transzpozíció hatékonyságát úgy számoltuk ki, hogy arányba állítottuk a kapott G418-rezisztens klónok számát transzpozázok jelenlétében versus azok hiányában. Az FP aktivitását (sötét oszlopok) az SB aktivitásával (üres oszlopok) hasonlítottuk össze. A relatív hatékonyságot az y tengelyen jelöltük, az SB aktivitását az adott sejtvonal esetében egy önkényes skálán 1¹nek vettük. A hibaantennák a SEM értéket mutatják. A Frog Prince transzpozonon alapuló géncsapda-konstrukció és a géncsapda-eljárással kapott eredmények. Az ábra a Frog Prince transzpozonon alapuló géncsapdavektor sarkalatos összetevõit mutatja. További részletekért lásd a csatolt 6. példát. Mutatja továbbá a találmány szerinti eljárással csapdába ejtett géneket és exonokat, valamint a kromoszómákat, amelyeken a gének elhelyezkednek. A Sleeping Beauty és Frog Prince transzpozázok aminosavszekvenciáinak egymás mellé illesztése. Az azonos aminosa-
1
HU 004 220 T2
vakat sötét háttérben, míg a konzervált aminosavakat szürke háttérben ábrázoltuk. A két transzpozáz aminosavszekvenciájának az azonossági foka körülbelül 50%¹os. A példák a találmány illusztrálását szolgálják. 1. példa: Transzpozáz gének izolálása ORFcsapdával Rana pipiensbõl A napjainkig gerinces fajokból izolált minden, természetben elõforduló Tc1/mariner elem inaktív (nem autonóm) kópia, amely transzpozáz génjében számos mutációt tartalmaz. Ezen elemek viszonylag magas kópiaszáma a genomban gyakorlatilag lehetetlenné teszi funkcionális transzpozáz gének nem szelektív eljárásokkal történõ izolálását. Gerincesekben potenciálisan aktív transzpozáz géneket keresve, kigondoltunk egy nyitott leolvasási keret („open reading frame”, ORF) csapdázó eljárást. Az eljárás genomi DNS-bõl származtatott PCRtermékek elõállításán alapul, olyan primerek alkalmazásával, amelyek határolják a transzpozáz-gén szekvenciákat (1. ábra). Az 5’¹primer tartalmazza a várható transzlációs kezdõ szignált, a 3’¹primerbõl hiányzik a stopkódon. Ezt követõen, a PCR-terméket expressziós vektorba klónoztuk, hogy a lacZ-génnel fúziós gént hozzunk létre. A rekombináns plazmidokat E. coli¹ba transzformáltuk, majd X¹gal lemezekre szélesztettük. Kék kolóniák csak akkor jöhetnek létre, ha a klónozott szekvenciák a lacZ-génnel azonos keretben vannak. Az eljárás alkalmas meg nem szakított ORF¹ek szelektálására, azonban nem szûr ki megváltozott értelmû „missense” mutációkat vagy kereten belüli inszerciókat vagy deléciókat. ORF-csapdát alkalmaztunk Rana pipiensbõl származó, genomi DNS-mintákon, olyan PCR-primerek alkalmazásával, amelyeket a Xenopus laevis Txr-elemeinek ismertetett konszenzus szekvenciáira terveztek (Lam és mtsai., 1996). Miután a könyvtárat baktériumokba transzformáltuk, négy kék telep (az összesen mintegy 100 telepbõl) utalt transzpozázt kódoló szekvenciák jelenlétére, amelyek nem tartalmaztak érés elõtti stopkódont. Mind a négy klónozott szekvencia hosszabb volt, mint a várható konszenzus Txr transzpozáz gén. A Rana szekvenciák az 5’¹terminális fordított ismétlõdés részét, ezt követõen a Txr-kópiákban hiányzó szekvenciákat magukban foglaló régiót tartalmazták. Nyilvánvaló, hogy a Txr-elemek a transzpozáz gén N¹terminális részét átfedõ, 180 bázispárnyi konzervatív deléciót tartalmaztak, amely alapján Lam és mtsai. tévesen következtettek a transzpozáz-szekvenciára (1996). Hasonlóképpen, konzervatív deléciót írtak le zebradánió Tdrl-elemeinek esetében [Izsvak és mtsai.: (1995)]. A Rana szekvenciák és Txr kódoló régiók fennmaradó része körülbelül 90% hasonlóságot mutatott (az adatokat nem tüntettük fel). Az ORF-csapdázás hatékonyságának ellenõrzésére a Rana transzpozon genomi kópiaszámát „dot blot” eljárással becsültük meg. Feltételezve, hogy az R. pipiens haploid genom mérete 6,6×109 bázispár, úgy becsültük, hogy a transzpozáz gén 8000-szer képviselteti magát a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
haploid genomban, azaz a R. pipiens genom mintegy 0,1%¹át képviseli. Ez a szám más fajokban elõforduló egyéb Tel-szerû elemek esetében talált 0,02–0,6% tartományon belül van. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az általunk kidolgozott új ORF csapdázó eljárás nyilvánvalóan hozzájárult viszonylag jó állapotban lévõ transzpozáz gének azonosításához olyan genomból, amelyben ezt a transzpozon család bõven képviseltette magát. 2. példa: A Frog Prince transzpozon-rendszer két komponensének azonosítása A konszenzus Rana gén (2. ábra) két elõre látható hélix–hurok–hélix motívumból (Plasterk és mtsai., 1999) álló, feltételezett N¹terminális DNS-kötõ domént tartalmazó, jellegzetes Tel-szerû transzpozázt, egy kettõs nukleáris lokalizációs szignált (Ivics és mtsai., 1996), és a DD(34)E azonosítót (Plasterk és mtsai., 1999) mutató katalitikus domént kódol (2. ábra). A három általunk izolált, különbözõ transzpozázból az egyik, csak két nukleotidban tért el a konszenzustól, amely nyitott leolvasási keretében két aminosavszubsztitúciót eredményezett. Az egyik egy Thr®Ser (152) csere volt a transzpozáz katalitikus doménjében. A másik megváltozott értelmû mutáció egy CpG hely 5mC csoportjának a dezaminálása miatt jött létre, amely egy Arg®Cys (315) helyettesítéshez vezetett, közel a protein C¹terminális végéhez. Helyspecifikus PCR mutagenezist alkalmaztunk a konszenzus Rana transzpozáz gén szekvenciájának a deriválására (2. ábra). Az FP transzpozáz kódolt aminosavszekvenciáját az 1. azonosító számú szekvencia mutatja. Abból a célból, hogy a Rana-típusú transzpozáz kötõhelyeit deriváljuk, genomi DNS¹en „splinkerette”[.7] PCR eljárást alkalmaztunk, hogy amplifikáljuk a teljes fordított ismétlõdéseket a genomi határoló szekvenciákkal együtt. Öt különbözõ klón sorba rendezése 214 bp hosszúságú, tökéletes fordított ismétlõdést mutatott ki, amelyek a transzpozáz géneket határolták (2. ábra). Az fordított ismétlõdések DNS-szekvenciáit mutatja továbbá a 2. azonosító számú szekvencia. A Rana transzpozonok jellegzetes IR/DR-típusú elemek, azaz az IR¹ek négy transzpozázkötõ helyet tartalmaznak, amelyek közvetlenül ismételt szekvenciákként (DR¹ek) jelennek meg az IR¹ek végeinél (Ivics és mtsai., 1997). A DR¹ek 21 nukleotid hosszúak, és a külsõ és belsõ helyek között egy nukleotidban térnek el. Az IR szekvenciák a konszenzus transzpozáz génnel együtt egy új, transzpozálható elem rendszert képez, amelyet Frog Prince-nek neveztünk (2. ábra).
50 3. példa: FP transzpozíciója A „Sleeping beauty” magas transzpozíciós aktivitást mutat humáneredetû sejtekben (Ivics és mtsai., 1997). Ennek megfelelõen, a Frog Prince elem transzpozíciós 55 aktivitásának kezdeti vizsgálatát tenyésztett HeLa sejteken végeztük, SB számára kidolgozott (Ivics és mtsa., 1997) transzpozíciós vizsgálattal. A vizsgálat egy transzpozázt expresszáló segítõ plazmid, valamint a terminális IR¹ek és a transzpozon között neomicinre60 zisztens (neo) gént tartalmazó donor konstrukcióval tör12
1
HU 004 220 T2
ténõ ko¹transzfektáláson alapul. A transzpozáz által katalizált transzgén-integráció hatékonyságát a G418-rezisztens telepek számával határoztuk meg, amely szám a kromoszomális integráció és a szelektálható markergén expressziójának a függvénye (Ivics és mtsai., 1997). A rekonstruált konszenzus Rana transzpozáz ORF¹et (a pVF-FrogPrince-ben), és a két aminosav változást (a pFv-mFrogPrince-ben) tartalmazó elõdgént együtt transzfektáltuk vagy a Txr-típusú (pTxrneo), vagy a FrogPrince-típusú (pFrogPrince-neo) szubsztrátkonstrukcióval. (3. ábra). Amikor a pFVFrogPrince konstrukciót saját szubsztrátjával (pFrogPrince-neo) ko¹transzfektáltuk, a telepszám 17¹szeres emelkedését tapasztaltuk. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a Rana pipiens genomból sikeresen deriváltunk és állítottunk elõ egy aktív transzpozon rendszert. Az mFrogPrince transzpozáz teljesen inaktív volt, ami a T(152) és R(315) aminosavak egyikének vagy mindkettõnek a fontosságára utalt. Érdekes módon, amikor a pFV-FrogPrince és a pTxr-neo konstrukciókat együtt kotranszfektáltuk, a G418-rezisztens telepek száma ötszörösére emelkedett (3. ábra). Ennek megfelelõen, a Rana transzpozáz képes kereszt-mobilizálni a Xenopus transzpozonokat, ami arra utal, hogy ezekben a fajokban a két transzpozoncsalád a közelmúltban divergált. Ezzel szemben, nem észleltünk keresztmobilizálást az FP és a Sleeping Beauty között. Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy a Frog Prince transzpozon rendszer jelentõsen képes fokozni a transzgénintegráció hatékonyságát plazmidokból a humán genomba. 4. példa: Frog Prince kivágás és illesztés („cut-andpaste”) transzpozíciója humán genomba A Tcl/mariner elemek kivágás és illesztés („cut-andpaste”) mechanizmus révén transzponálódnak TA dinukleotidokba. A TA cél-dinukleotidok megkettõzõdnek és mindkét végén határolják az integrálódott transzpozont, amely a Tcl/mariner transzpozíció biztos jele (Plasterk és mtsai., 1999). Abból a célból, hogy megvizsgáljuk az integrálódott Prince transzpozonokat határoló szekvenciákat, egyedi G418-rezisztens HeLaklónokból genomi DNS¹t izoláltunk, és splinkerettePCR vizsgálatnak vetettük alá. Három különbözõ transzpozon inszert jobb és bal oldali határoló csatlakozását klónoztuk és szekvenáltuk meg, ebbõl kettõ intronból, egy pedig nem génes szekvenciából származott (az adatokat nem mutattuk). Mindhárom esetben a Prince inszertet a várt TA dinukleotidok határolták a transzpozonok mindkét oldalán, amelyet egymástól és a transzpozondonor plazmidétól eltérõ szekvenciák követtek (4. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk négy további határoló szekvencia esetében, amelyek a transzpozon akár bal, akár jobb IR¹jét szegélyezték (az adatokat nem mutattuk). A célhelyek vizsgálata azt mutatta, hogy különbözõ humán kromoszómákban mindegyik inszerció a TA dinukleotidoknál történt (4. ábra). Összegezve, az adatok azt mutatják, hogy az FP a humán genom különbözõ lokációiba történõ transzpozícióhoz pontos kivágás és illesztés („cut-and-paste”) mechanizmust követ.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 13
2
5. példa: Az FP különbözõ gerinceseredetû sejtvonalakban aktív Az SB különbözõ gerinceseredetû sejtvonalakban eltérõ transzpozíciós aktivitást mutat (Izsvak és mtsai., 2000). Az SB azonban egy haleredetû szintetikus elem, míg a Frog Prince¹t egy kétéltû genomjából rekonstruáltuk, így ugyanaz a sejtvonalkészlet eltérõ megengedõ környezetet képes nyújtani a két transzpozon-rendszer számára. Ennek megfelelõen, standard transzpozíciós vizsgálat alkalmazásával összehasonlítottuk a két rendszer aktivitását két emlõseredetû, egy kétéltû-eredetû és két haleredetû tenyésztett sejtvonalon. A kotranszfektáláshoz alkalmazott plazmidok SB esetében pFV-SB és pT/neo (Ivics és mtsai., 1997), míg az FP rendszer esetében pFV-FrogPrince és pFrogPrince-neo voltak. A két rendszer konstrukciójában a vektorvázak, a promoterek, a poliA szignálok és a transzpozon markergének azonosak voltak. Az FP minden vizsgált sejtvonalban aktívabbnak tûnt, mint az SB (5. ábra). A két transzpozon-rendszer transzpozíciós hatékonysága közötti különbség azonban mérsékelt volt, és csak a PAC2 zebradánió-sejtvonalban bizonyult statisztikailag szignifikánsnak. Az adatok azt mutatják, hogy az FP transzpozíciója nem korlátozódik filogenetikailag közeli fajokra, és hogy gerinces fajokban a napjainkig ismertetett legaktívabb transzponálható elem. 6. példa: Géncsapdázás Frog Prince konstrukcióval humán HeLa-sejtekben A Frog Prince transzpozon-vektoron belül elhelyezett „géncsapda” expressziós kazettát alkalmaztunk transzpozíciós eseményeknek expresszált génekben történõ kiváltására és szelektálására. A „géncsapda” transzpozon az egéreredetû „recézett 2” („engrailed 2”) intront hordozza, amely illesztési akceptorhelyet („splice acceptor”, SA), és olyan neomicinrezisztencia markergént (neo) tartalmaz, amelybõl hiányzik egy metionin kezdõkodon. Ezért neoexpresszió csak akkor fordulhat elõ, ha endogén génnel fúziós protein jött létre. A transzpozon tartalmaz továbbá egy zeoexpressziós kazettát, hogy szelektálni lehessen inszerciós eseményekre bárhol a genomban. A géncsapda-transzpozon konstrukciót egy transzpozáz forrással (FP Tpase) együtt HeLa sejtekbe transzfektáltuk. A géncsapdatranszpozonok egy része intronokba és gének nem transzlálódó régióiba inszertálódnak, amelyek töredéke helyes orientációba kerül ahhoz, hogy a neo markergén és az endogén gén között fúziós transzkript (átirat) jöjjön létre. A transzfektált sejteket zeocin és G418 szelekciónak vetettük alá. Az antibiotikumrezisztens klónokból számos transzpozon inszerciót klónoztunk meg, és azokat BLAST algoritmussal térképeztük fel a humán kromoszómán. Ezen inszerciók mindegyike génben történt. A géncspda vektornak aktívan átírt génekbe történõ integrációja lókuszspecifikus markerként szolgálhat élõ állatokban, és megszakított gének azonosítására alkalmas toldalékokat jelentenek. A kísérlet során alkalmazott konstrukciókat és a kapott eredményeket 6. ábra mutatja.
1
HU 004 220 T2
7. példa: Fokozott transzpozíciós aktivitású transzpozázok elõállítása Pontmutációk beiktatása GENE MORPH (Stratagene) készlet alkalmazásával a Frog Prince transzpozáz génbe PCR mutagenezis megközelítési módon alapult. A körülményeket úgy állítottuk be, hogy átlagosan egy pontmutáció jöjjön létre génenként. Körülbelül 10 000 mutáns transzpozáz gént tartalmazó könyvtárat állítottunk elõ. A PCR-termékeket nagy hatékonysággal (a klónok 80–90%¹a tartalmazott transzpozáz gént) eukariota expressziós vektorba klónoztuk. Plazmid-DNS¹t tisztítottunk a klónokból, pipettázórobottal (Tecan), 96 lyukú formátumban. A tisztított plazmid-DNS-sel végzett, nagy hatékonyságú transzpozíciós vizsgálatban tenyésztett, humáneredetû sejteket transzfektáltunk. A mutáns transzpozázokat neomicinrezisztencia gént tartalmazó transzpozonDNS-sel együtt ko¹transzfektáltuk. A rezisztens kolóniák emelkedett száma hiperaktivitást jelez a szûrõvizsgálatban. Eddig három klónt azonosítottunk, amely hiperaktivitást mutat. Az AD8, BG8 és BG12 klónok becsült aktivitása legalább háromszorosa az FP aktivitásának. Minden okunk megvan a feltételezni, hogy a projekt 10–100-szoros aktivitású, hiperaktív transzpozázokat eredményez a vad típusú proteinhez képest. Hivatkozások Ivics, Z., Izsvák, Z., Minter, A. & Hackett, P. B. (1996). Identification of functional domains and evolution of Tcl-like transposable elements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5008–13.
5
10
15
20
25
30
2
Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H. & Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tcl-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell 91, 501–510 (1997). Izsvák, Zs., Ivics, Z. and Hackett, P. B. (1995). Characterization of a Tcl-like transposable element in zebrafish (Danio rerio). Mol. Gen. Genet. 247:312–322. Izsvák, Z., Ivics, Z., and Plasterk, R. H. (2000) Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J. Mol. Biol. 302, 93–102. Lam, W. L., Seo, P., Robison, K., Virk, S. & Gilbert, W. (1996). Discovery of amphibian Tcl-like transposon families. J. Mol. Biol. 257, 359–66. Luo, G., Ivics, Z., Izsvak, Z. & Bradley, A. (1998). Chromosomal transposition of a Tcl/mariner-like element in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 10 769–10 773. Miller, A. D. (1997). Development and applications of retroviral vectors. in Retroviruses (eds. Coffin, J. M., Hughes, S. H. & Varmus, H. E.) 843 pp. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Plasterk, R. H., Izsvák, Z. & Ivics, Z. (1999). Resident aliens: the Tcl/mariner superfamily of transposable elements. Trend Genet. 15, 326–32. Verma, I. M. and Somia, N. (1997). Gene therapy – promises, problems and prospects. Nature 389, 239–242. Yant, S. R., Meuse, L., Chiu, W., Ivics, Z., Izsvak, Z., and Kay, M. A. (2000) Somatic integration and long-term transgene expression in normal and haemophilic mice using a DNA transposon system. Nat. Genet. 25, 35–41.
SZEKVENCIALISTA <110> Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Netherland Cancer Institute <120> The Frog Prince, a Transposon Vector for Gene Transfer in Vertebrates <130> H1869 PCT <150> 102 24 242.9 <151> 2002–05–29 <160> 7 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 340 <212> PRT <213> Rana pipiens <400> 1
Met Pro Arg Pro Lys Glu Ile Gln Glu Gln Leu Arg Lys Lys Val Ile 1 5 10 15 Glu Ile Tyr Gln Ser Gly Lys Gly Tyr Lys Ala Ile Ser Lys Ala Leu 20 25 30
14
HU 004 220 T2
Gly Ile Gln Arg Thr Thr Val Arg Ala Ile Ile His Lys Trp Arg Arg 35 40 45 His Gly Thr Val Val Asn Leu Pro Arg Ser Gly Arg Pro Pro Lys Ile 50 55 60 Thr Pro Arg Ala Gln Arg Arg Leu Ile Gln Glu Val Thr Lys Asp Pro 65 70 75 80 Thr Thr Thr Ser Lys Glu Leu Gln Ala Ser Leu Ala Ser Val Lys Val 85 90 95 Ser Val His Ala Ser Thr Ile Arg Lys Arg Leu Gly Lys Asn Gly Leu 100 105 110 His Gly Arg Val Pro Arg Arg Lys Pro Leu Leu Ser Lys Lys Asn Ile 115 120 125 Lys Ala Arg Leu Asn Phe Ser Thr Thr His Leu Asp Asp Pro Gln Asp 130 135 140 Phe Trp Asp Asn Ile Leu Trp Thr Asp Glu Thr Lys Val Glu Leu Phe 145 150 155 160 Gly Arg Cys Val Ser Lys Tyr Ile Trp Arg Arg Arg Asn Thr Ala Phe 165 170 175 His Lys Lys Asn Ile Ile Pro Thr Val Lys Tyr Gly Gly Gly Ser Val 180 185 190 Met Val Trp Gly Cys Phe Ala Ala Ser Gly Pro Gly Arg Leu Ala Val 195 200 205 Ile Lys Gly Thr Met Asn Ser Ala Val Tyr Gln Glu Ile Leu Lys Glu 210 215 220 Asn Val Arg Pro Ser Val Arg Val Leu Lys Leu Lys Arg Thr Trp Val 225 230 235 240 Leu Gln Gln Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Ser Thr Thr Glu 245 250 255 Trp Leu Lys Lys Asn Lys Met Lys Thr Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser 260 265 270 Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Met Leu Trp Tyr Asp Leu Lys Lys Ala 275 280 285 Val His Ala Arg Lys Pro Ser Asn Val Thr Glu Leu Gly Gln Phe Cys 290 295 300 Lys Asp Glu Trp Ala Lys Ile Pro Pro Gly Arg Cys Lys Ser Leu Ile 305 310 315 320 Ala Arg Tyr Arg Lys Arg Leu Val Ala Val Val Ala Ala Lys Gly Gly 325 330 335 Pro Thr Ser Tyr 340
15
HU 004 220 T2
<210> 2 <211> 250 <212> DNA <213> Rana pipiens <400> 2
cagtggtgtg cacttaagtg acacaaaatg catcatggcc ttgtccacac
aaaaagtgtt tttcggaaca caatttgtaa ctgtgtgaaa
tgcccccttc tcaaaccaat atgaaggtgt aagtgattgc
ctcatttcct ttaaacaata ttattattaa cccccttgtt
gttcctttgc gtcaaggaca aggtgaaaaa aaaacatact
atgtttgtca acacaagtaa aaatccaaac ataactgtgg
<210> 3 <211> 40 <212> PRT <213> Rana pipiens <400> 3
Lys Glu Ile Gln Glu Gln Leu Arg Lys Lys Val Ile Glu Ile Tyr Gln 1 5 10 15 Ser Gly Lys Gly Tyr Lys Ala Ile Ser Lys Ala Leu Gly Ile Gln Arg 20 25 30 Thr Thr Val Arg Ala Ile Ile His 35 40 <210> 4 <211> 42 <212> PRT <213> Rana pipiens <400> 4
Gln Arg Arg Leu Ile Gln Glu Val Thr Lys Asp Pro Thr Thr Thr Ser 1 5 10 15 Lys Glu Leu Gln Ala Ser Leu Ala Ser Val Lys Val Ser Val His Ala 20 25 30 Ser Thr Ile Arg Lys Arg Leu Gly Lys Asn 35 40 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Rana pipiens <400> 5
Arg Lys Arg Leu Gly Lys Asn Gly Leu His Gly Arg Val Pro Arg Arg 1 5 10 15 Lys Pro <210> 6 <211> 123
16
60 120 180 240 250
HU 004 220 T2
<212> PRT <213> Rana pipiens <400> 6
Met Pro Arg Pro Lys Glu Ile Gln Glu Gln Leu Arg Lys Lys Val Ile 1 5 10 15 Glu Ile Tyr Gln Ser Gly Lys Gly Tyr Lys Ala Ile Ser Lys Ala Leu 20 25 30 Gly Ile Gln Arg Thr Thr Val Arg Ala Ile Ile His Lys Trp Arg Arg 35 40 45 His Gly Thr Val Val Asn Leu Pro Arg Ser Gly Arg Pro Pro Lys Ile 50 55 60 Thr Pro Arg Ala Gln Arg Arg Leu Ile Gln Glu Val Thr Lys Asp Pro 65 70 75 80 Thr Thr Thr Ser Lys Glu Leu Gln Ala Ser Leu Ala Ser Val Lys Val 85 90 95 Ser Val His Ala Ser Thr Ile Arg Lys Arg Leu Gly Lys Asn Gly Leu 100 105 110 His Gly Arg Val Pro Arg Arg Lys Pro Leu Leu 115 120 <210> 7 <211> 127 <212> PRT <213> Rana pipiens <400> 7
Asp Glu Thr Lys Val Glu Leu Phe Gly Arg Cys Val Ser Lys Tyr Ile 1 5 10 15 Trp Arg Arg Arg Asn Thr Ala Phe His Lys Lys Asn Ile Ile Pro Thr 20 25 30 Val Lys Tyr Gly Gly Gly Ser Val Met Val Trp Gly Cys Phe Ala Ala 35 40 45 Ser Gly Pro Gly Arg Leu Ala Val Ile Lys Gly Thr Met Asn Ser Ala 50 55 60 Val Tyr Gln Glu Ile Leu Lys Glu Asn Val Arg Pro Ser Val Arg Val 65 70 75 80 Leu Lys Leu Lys Arg Thr Trp Val Leu Gln Gln Asp Asn Asp Pro Lys 85 90 95 His Thr Ser Lys Ser Thr Thr Glu Trp Leu Lys Lys Asn Lys Met Lys 100 105 110 Thr Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu 115 120 125
17
1
HU 004 220 T2
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. A találmány tárgyát képezi transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, amely tartalmazza az alábbiakat: (a) funkcionális transzpozázt kódoló polinukleotidtól mentes transzpozont, amely tartalmaz egy hasznos polinukleotidot, ahol a transzpozon olyan fordított ismétlõdéseket tartalmaz, amelyek legalább 90%¹os azonossági fokot mutatnak egyrészt a 2. azonosító számú szekvencián belüli ismétlõdésekkel, másrészt annak fordított ismétlõdéseivel; és (b) transzpozázt, amely N¹terminális végén olyan DNS-kötõ domént hordoz, amely tartalmazza a 3. és 4. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciát, vagy a 3. és/vagy 4. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciával legalább 90%¹os azonossági fokot mutat; vagy (c) a (b) szerinti transzpozázt kódoló polinukleotidot. 2. Az 1. igénypont szerinti transzpozonalapú DNSintegrációs rendszer, ahol a transzpozáz az 5. azonosító számú szekvencia szerinti kétrészes nukleáris lokalizációs szignált, és/vagy a 7. azonosító számú szekvencia szerinti DD(34)E azonosítót hordozó katalitikus domént, és/vagy a 6. azonosító számú szekvencia szerinti DNS-kötõ domént tartalmaz. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, ahol a transzpozáz azonossági foka az 1. azonosító számú szekvencia szerinti aminosavszekvenciával legalább 90%¹os. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, ahol a hasznos polinukleotid gén. 5. A 4. igénypont szerinti transzpozonalapú DNSintegrációs rendszer, ahol a gén emlõsbõl, halból, kétéltûbõl, hüllõbõl vagy madárból származik. 6. Az 5. igénypont szerinti transzpozonalapú DNSintegrációs rendszer, ahol az emlõs ember. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, ahol a hasznos polinukleotid terápiásan aktív (poli)peptidet kódol. 8. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, ahol a hasznos polinukleotid siRNS¹sé íródik át, és szelektálható markert kódol. 9. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, ahol a hasznos polinukleotid intronillesztési akceptorhelyet és szelektálható markergént tartalmaz, ahol a génbõl hiányzik a metionin startkódon és hozzáadott poliA-szignált tartalmaz. 10. Az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, ahol a transzpozáz fokozott transzpozázaktivitást mutat. 11. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, ahol az (a) szerinti transzpozont és/vagy a (c) szerinti polinukleotidot legalább egy vektor tartalmazza. 12. A 11. igénypont szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer, ahol a vektor plazmid.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 18
2
13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszerrel transzformált vagy transzfektált gazdasejt. 14. Nem humán transzgenikus állat, amely genomjában stabilan integrálva az (a) pont szerinti transzpozont, vagy a 11. vagy 12. igénypont szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszert tartalmazza. 15. Az 1–12. igénypontok bármelyike szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer alkalmazása gyógyszer elõállítására, ahol a hasznos polinukleotidot gerinces állat sejtjeibe visszük át úgy, hogy a sejtekbe a transzpozonalapú DNS-integrációs rendszert bejuttatjuk. 16. A 15. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a transzfert in vitro végezzük. 17. A 15. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a transzfert in vivo végezzük. 18. A 16. igénypont szerinti alkalmazás, ahol továbbá (a) szelektáljuk azokat a sejteket, amely sejtekben fenti polinukleotid stabilan integrálódott a kromoszómákba; és (b) a sejteket vagy a sejtekbõl származó sejteket azonos fajba tartozó gerinces állatba juttatjuk be vagy juttatjuk vissza. 19. A 16. vagy 18. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gerinces állat, amelybe a fenti sejteket visszajuttatjuk, azonos azzal a gerinces állattal, amelybõl a sejteket a transzfer elõtt levettük. 20. A 15–19. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a transzfer génpuskával, liposzómákkal közvetített vagy segített géntranszferrel, polietiléniminnel, adenovírus-polilizin-DNS komplexekkel, lipofekcióval, elektroporációval, transzfekcióval/transzdukcióval vagy fertõzés alkalmazásával kiváltott transzfer. 21. A 20. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a fertõzést vagy transzdukciót rekombináns retrovírus, rekombináns adenovírus, rekombináns herpeszvírus vagy rekombináns, adenoval társult vírus közvetíti vagy segíti. 22. A 15–21. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a sejtek szomatikus sejtek. 23. A 22. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gerinces állat emlõs, hal, kétéltû, hüllõ vagy madár. 24. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az emlõs ember. 25. A 15–21. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a sejtek emberitõl különbözõ eredetû csíravonalsejtek. 26. A 25. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gerinces állat embertõl különbözõ emlõs, hal, kétéltû, hüllõ vagy madár. 27. A 25. vagy 26. igénypont szerinti alkalmazás, ahol, miután visszajuttattuk az emberitõl különbözõ eredetû csírasejteket, vagy a csírasejtvonalból származó sejtet ugyanabba a fajba tartozó gerinces állatba, transzgenikus gerinces állatot nevelünk, amely gerinces állat vagy transzgenikus állat nem ember. 28. A 15., 17. és 25–27. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a bejuttatást vagy visszajutta-
1
HU 004 220 T2
tást sperma, mikroinjektálás vagy génpuska közvetíti vagy váltja ki. 29. In vitro eljárás RNSi elõállítására, amely az alábbiakat tartalmazza: (a) a 8. igénypont szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer részét képezõ transzpozon stabil bejuttatását sejtbe; (b) a szelektálható markert expresszáló sejtek szelektálását; és (c) annak megállapítását, hogy az RNSi hatással van¹e a kívánt gén transzkripciójára/transzlációjára. 30. Gének géncsapdázására alkalmas in vitro eljárás, amely az alábbiakat tartalmazza: (a) a 9. igénypont szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs rendszer sejtbe történõ bejuttatását; és (b) szelektálható marker expressziójának a vizsgálatát, ahol a szelektálható marker expressziója arra utal, hogy a transzpozon integrálódott a sejt egy átírt génjébe.
2
31. A 30. igénypont szerinti in vitro eljárás, amely tartalmazza továbbá: (c) a megszakított gén azonosítását az integrált transzpozon – mint címke – révén. 32. Transzpozon, azzal jellemezve, hogy olyan for5 dított ismétlõdéseket tartalmaz, vagy olyan fordított ismétlõdésekbõl áll, amelyek legalább 90%¹os azonosságot mutatnak a 2. azonosító számú szekvencián belüli ismétlõdésekkel, valamint annak fordított ismétlõdé10 sével; továbbá transzpozázt, amely N¹terminálisan olyan DNS-kötõ domént hordoz, amely tartalmazza a 3. és 4. azonosító számú szekvenciákat. 33. Készítmény, amely az 1–12. igénypontok bármelyike szerinti transzpozonalapú DNS-integrációs 15 rendszert tartalmaz. 34. A 33. igénypont szerinti készítmény, amely gyógyászati készítmény. 35. A 33. igénypont szerinti készítmény, amely diagnosztikai készítmény vagy készlet.
19
HU 004 220 T2 Int. Cl.: C12N 15/90
20
HU 004 220 T2 Int. Cl.: C12N 15/90
21
HU 004 220 T2 Int. Cl.: C12N 15/90
22
HU 004 220 T2 Int. Cl.: C12N 15/90
23
HU 004 220 T2 Int. Cl.: C12N 15/90
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
