!HU000005609T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 005 609
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C07F 9/117
(21) Magyar ügyszám: E 06 766355 (22) A bejelentés napja: 2006. 06. 23. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20060766355 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1896489 A1 2007. 01. 11. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1896489 B1 2008. 12. 31.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: RM20050344 2005. 06. 30. IT (72) (73) Feltaláló és szabadalmas: De Luca, Maria, 81041 Bellona CE (IT)
(74) Képviselõ: dr. Török Ferenc, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
(54)
(2006.01) C07H 19/16 (2006.01) A61K 31/7076 (2006.01) A61P 1/16 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) A61P 3/04 (2006.01) C07C 229/12 (2006.01) A61P 25/24 (2006.01) A61K 31/6615 (2006.01) A61K 45/06 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 07004244 PCT/IT 06/000484
Metildonorok fitinsavval vagy annak származékaival képzett sói vagy komplexei és eljárás ezek szintézisére
(57) Kivonat
HU 005 609 T2
A találmány metildonor vegyületek, fõként S¹adenozilL-metionin vagy SAMe és betain vagy N,N,N-trimetilglicin fitinsavval vagy foszforilezett inozittal – amely fém kationokkal részben sóvá alakított lehet – képzett sójának vagy komplexének elõállítására vonatkozik stabil, teljesen természetes vegyületek képzõdésével, melyek a kiinduló metildonor vegyületekre jellemzõ biológiai aktivitásával rendelkeznek a fitinsav és az
inozit jellemzõ biológiai aktivitásával kombinálva és javítva azt. A találmány szintén vonatkozik a metildonor vegyület fitinsavval vagy annak származékaival képzett egy vagy több sóját vagy komplexét tartalmazó táplálék-gyógyszerészeti, gyógyszerészeti, diétás, növény-gyógyszerészeti vagy állat-gyógyszerészeti készítményekre és azok szintézisének eljárására.
A leírás terjedelme 10 oldal (ezen belül 2 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 005 609 T2
A találmány részletes ismertetése A jelent találmány metildonorok fitinsavval vagy annak származékaival képzett új sóira vagy komplexeire, és ezek elõállítási eljárásaira vonatkozik. Pontosabban, a jelen találmány metildonorok, például S¹adenozil-L-metionin vagy SAMe és betain vagy trimetil-glicin fitinsavval vagy foszforilezett inozittal képzett sóinak vagy kelátjainak elõállítására vonatkozik teljesen természetes, stabil vegyületek képzõdésével, melyek a kiinduló metildonorok jellemzõ biológiai aktivitásával rendelkeznek a fitinsav és az inozit jellemzõ biológiai aktivitásával kombinálva és javítva azt. Mint az jól ismert, a metildonor kifejezést olyan természetes, szerves metilezett vegyületekre alkalmazzuk, melyek biológiailag labilis metilcsoportot tartalmaznak, melyek átmetilezési reakciókban könnyebben adódnak át más vegyületekre. Ezen reakción keresztül a metildonor molekula metilcsoportot biztosít más vegyületek számára, ezáltal alapvetõen változtatva meg annak kémiai-fizikai tulajdonságait és biológiai funkcióit, lehetõvé téve így a test folyamataiban jól meghatározott fiziológiai szerepet betöltõ molekulák bioszintézisét. A transzferáz, transzmetiláz vagy metiltranszferáz osztályba tartozó enzimek által katalizált metilezési reakciók befolyásolják például a génkifejezõdést, a sejtmembránok mûködését, valamint különbözõ hormonok és neurotranszmitterek mûködését. Valójában vitami-
5
10
15
20
25
SS Ismert, hogy a két diasztereomer közül csak az egyik, az (SS)-(+)-SAMe, rendelkezik a transzmetilezéshez biológiai aktivitással, és hogy spontán racemizálódik, amely az inaktív (RS)-(+)-SAMe diasztereomer képzõdéséhez vezet. Élõlényekben a SAMe a citoplazmában enzimek (S-adenozil-metionin-szintetáz vagy S¹adenozil-transzferáz) hatására képzõdik, az élelmiszerbõl származó metioninból és az élõ sejtben energiatartalékként található ATP-bõl kiindulva. A SAMe alapvetõ feladatokat lát el számos átmetilezési folyamatban, melyek a test létfontosságú biológiai mûködéséhez kötõdnek, melyek között megtalálható a neurotranszmitter szerotonin átalakítása melatoninná, a kreatin szintézise, ami az izomszövetek alapvetõ energiatartaléka, a glutation reintegrációja, ami egy fontos antioxidáns, a kolin és a foszfatidil-kolin bioszintézise, melyek közül a kolin a prekurzor. A neurotranszmitter szintézisben játszott szerepének köszönhetõen a SAMe¹t sikeresen alkalmazták depresszió kezelésére és egyéb gyógyászati területeken, így króni-
2
nok, hormonok, neurotranszmitterek, nukleinsavak, enzimek és antitestek szintézise és mûködésük a testben mind függ a metilcsoport-átadástól. Nevezetesen a metilcsoportok a homociszteint [HS(CH2)2CH(NH2)–COOH], ami toxikus aminosav, metionin kéntartalmú aminosavvá [CH3S(CH2)2CH(NH2)–COOH] alakítják, ami elõnyös aminosav, amely minden fehérjében jelen lévõ metildonor. Valójában a test csak kis mennyiségû homociszteint használ, és annak felhalmozódása szív- és érrendszeri rendellenességeket okozhat. Az elõbb említettekkel szemben a test egyik méregtelenítõ mechanizmusa a metilezés. A metildonor-aktivitással rendelkezõ természetes vegyületek közül – a már említett metionin és kolin aminosav mellett – egy másik fontos, élelmiszerekben széles körben megtalálható tápanyag, melynek molekulája szintén tartalmaz könnyen átadható metilcsoportokat, a [(CH3)3N+(CH2)2OH] – a kiváló SAM vagy SAMe, S¹adenozil-L-metionin (ademetioninként is ismert). Ez természetes vegyület, amely minden élõlényben – baktériumban, gombában, növényekben és állatokban, az embereket is beleértve – megtalálható, és számos biokémiai folyamat kulcseleme. A SAMe¹t tartalmazó termékek két diasztereomer keverékébõl állnak: (RS)-(+)-SAMe és (SS)¹(+)-SAMe, melyek szerkezeti képlete a következõ:
RS
45
50
55
60 2
kus májrendellenességek, lipémia, adipózis (kövérség) és arteriosclerosis kezelésére is alkalmazzák. Egy másik metildonor fontos biológiai feladatokkal a betain vagy trimetil-glicin (TMG), pontosabban az N,N,N-trimetil-glicin, melynek képlete [(CH3)3N+(CH2)COO–]. Ez utóbbi a kinolin oxidált analógját képviseli, és a testben a kolin metabolizmusa során termelõdik. Ez a kvaterner aminosav széles körben található meg növényekben és állatokban, és szintén nagy mennyiségben található cukros melaszban, gyapotmagban és gabonacsírában. Fõ formájában vízmentes, 97% tisztaságú, kristályos termékként jelenik meg. Fogyasztásakor transzmetilezési reakción keresztül gyorsan átalakul dimetil-glicin (DMG) tercier aminosavvá a májban, biztosítva a DMG sejtmetabolizmusra, immunrendszerre és oxigénfelhasználásra gyakorolt összes elõnyét, így elõsegítve a test alkalmazkodását a fizikai és mentális terheléshez. Továbbá a trimetil-glicin más metildonorokhoz hasonlóan aktív a test homociszteinszintjének csökkenté-
1
HU 005 609 T2
sében, és szintén ajánlott lipotrop szer és májvédõ szer májrendellenességek esetén. Összegezve, ezért a betain egy metilcsoportjának átadása hatások egész sorát váltja ki a dimetil-glicin képzõdésnek köszönhetõen, ami a metildonorok hasznos alkalmazási lehetõségeinek felismeréséhez vezetett a szív- és érrendszeri rendellenességek és májbetegségek kezelésében, a sportmedicinában, cukorbetegség, neurológiai elváltozások, hipoglikémia, krónikus kimerültség, autizmus és egyebek kezelésében. Visszatérve a kereskedelemben legelterjedtebb metildonorhoz, az S¹adenozil-L-metioninhoz, ez a molekula elõállítható szintetikusan, enzimatikus szintézissel ATP-bõl és metioninból, vagy fermentációval élesztõbõl, például Torulopsis utilis-bõl, Aspergillus tamarii-bõl, Saccharomyces cerevisiae-bõl kiindulva. Az inaktív komponens a természetes termékben körülbelül 20% mennyiségben marad, míg a szintetikus termék 50%-ban tartalmaz biológiailag inaktív komponenst. A SAMe fõ hátránya az instabilitása, oldatban és kristályos formában egyaránt. A termék még szobahõmérsékleten is racemizálódik, hasadással degradálódik vagy hidrolízisen megy keresztül, 5’¹metiltioadenozinná és homoszerin-laktonná bomlik. A klorid- vagy szulfátsók csak rövid távú reagensként alkalmazhatók, de nem megfelelõek kereskedelmi gyógyszerészeti termékek gyártására. Ennek a hátránynak a leküzdése érdekében a SAMe számos sójának alkalmazását javasolták az idõk folyamán, melyek között szerepel az 1 043 885 számú olasz szabadalmi iratban leírt tri-p-toluolszulfonát (tri-tozilát), a 3,954,726 amerikai szabadalmi iratban ismertetett kénsavval és p¹toluolszulfonsavval képzett kettõs só (diszulfát-ditozilát és diszulfát-tozilát), az 1 054 175 olasz szabadalmi iratban bemutatott szulfonsavsók vagy kénsavval és szulfonsavval képzett kettõs sók. Továbbá, mivel a fentebb említett sók nem alkalmasak parenterális alkalmazásra, mert erõs savasságuk miatt a gyógyszerészeti készítményben alkalmazandó puffersó szükséges koncentrációja nagyon nagy lenne, szintén SAMe és 1,4butándiszulfonát sójának alkalmazását javasolták. Az egyéb javasolt, acil-taurinokkal kapott SAMe-sóknak, melyek elõreláthatóan szintén biztosítják a termék szükséges stabilitását, és mivel kereskedelmi forgalomba hozhatók, az elõírásoknak megfelelõen biztosítaniuk kell a tárolási idõszak alatt a degradációmentességet. Meg kell jegyezni, hogy a SAMe¹só alapú termékekkel kapcsolatos nézet szerint azok jelentõs mennyiségû xenobiotikus vegyületet tartalmaznak: a tozilát-diszulfátban az aktív hatóanyag tömegének majdnem fele szintetikus xenobiotikus vegyületekbõl, kénsavból és p¹toluolszulfonsavból áll (a termék 384 mg¹ja 200 mg SAMe-ionnal egyenértékû), ugyanez érvényes az 1,4-butándiszulfonátra (760 mg egyenértékû 400 mg SAMe-ionnal), melyben a xenobiotikus vegyület, a butándiszulfonát, fõleg petrolkémiai eredetû szerves vegyület.
5
10
15
20
25
30
35
40
2
Mindkét elõbb említett esetben a termék szárítható fagyasztva vagy porlasztva. A termék savassága védelmet nyújt a hasadási reakciókkal szemben, míg a fagyasztva vagy porlasztva szárítással elérhetõ kis víztartalom megvédi terméket a kémiai hidrolízissel szemben. Ugyanakkor a tapasztalatok szerint a SAMe in vivo stabilitását a nagy ionokkal kialakuló kötések és a nagy töltés biztosítja. A fentiek fényében nyilvánvaló, hogy a korábbi tapasztalatok alapján a SAMe stabil só termékek gyártásakor a szárítási költségek magasak, és például a fentebb említett, egészében nem természetes eredetû xenobiotikus ellenion alkalmazása szükséges. Ezért a jelen találmány célja, hogy SAMe-származék metildonort, vagy más metildonorok, például a fentebb említettek származékait biztosítsa, ahol a sóképzés – ami SAMe esetében a termék kémiai stabilitásának biztosítása érdekében szükséges – xenobiotikus ellenionok alkalmazása nélkül történik, egy olcsó, könnyen kivitelezhetõ eljárással. Végül a találmány szerint javasolt a metildonor molekula – ami fõként, de nem kizárólag SAMe – sóképzése olyan ellenionnal, mely úgy választott, hogy még a molekula sóképzésnél bevitt anionos része is természetes eredetû legyen és önmagában is rendelkezzen valamilyen biológiai funkcióval, gyógyászatilag hasznosítható legyen vagy a kapott vegyületnek táplálék-gyógyszer (nutraceutical) aktivitást kölcsönözzön. A jelen találmány szerint azt tapasztaltuk, hogy egy teljesen természetes vegyület, melynek molekulájára a nagy negatív töltéssûrûség jellemzõ, a fitinsav, képes a SAMe sóképzésére, és egy megfelelõ oldószerrel meghatározható annak vízben (jeges fürdõben) való kicsapódása, a stabil só elválasztásához alkalmazott komplex eljárások szükségessége nélkül: a kicsapódott és szûrt sóból a maradék víz egyszerû, szobahõmérsékleten végzett szárítási eljárással eltávolítható, hagyományos szárítószerek, például kalcium-klorid vagy foszfor-pentoxid alkalmazásával. A fitinsav vagy inozit-hexafoszforsav [inozit-hexakisz(dihidrogén-foszfát)], az inozit-hexafoszfor észtere, molekulatömege 660,04, tapasztalati képlete C6H18O24P6 és szerkezeti képlete a következõ:
45
50
Ez a vegyület elterjedten fordul elõ a természetben, fõként növényekben, ahol különösen bõségesen található olajos magvakban, gabonákban és hüvelyesekben. Kereskedelmi forgalomban hozzáférhetõ önmagában vagy nátriumsójának (nátrium-fitát) oldata formájá60 ban, vagy kalcium- és magnéziumsó keverékeként 55
3
1
HU 005 609 T2
[Ca5Mg(C6H6O24P6)]. Ez utóbbi formában fitinnek nevezik, és foszforilezett, szervezetet helyreállító szerként és kalciumforrásként alkalmazzák. A fitinsav oldhatatlan komplexet képez a kettõ- és háromértékû kationokkal, az ásványokkal szemben mutatott kelátképzõ tulajdonságának tulajdoníthatóan a múltban táplálkozáselleni tényezõként kezelték. Jóllehet meg kell jegyezni, hogy ez a természetes antioxidáns védõhatást mutat a karcinómával szemben, pontosan a kelátképzõ tulajdonságának köszönhetõen (Shamsuddin, A. M., Elsayed, A. M. és Ullah, A. (1998) Suppression of large intestinal cancer in f344 rats by inositol hexa-phosphate, Carcinogenesis, 9, 577–580). Továbbá, elfogyasztva a fitinsav gyomorvédelmet eredményez, és lelassítja az amidok emésztését az étkezés utáni glikémiás szintre gyakorolt hatáson keresztül. A fitázok által megemésztve termékként inozitot képez, a megfelelõ hexahidroxilátterméket, ami a természetben szintén elterjedten megtalálható, ahol mikroorganizmusok és magasabb rendû állatok növekedési faktoraként mûködik. In vivo inozittá alakulásának köszönhetõen a fitinsav egy sor biológiailag hasznos hatást mutat, ami miatt jelenléte gyógyászati vagy táplálék-gyógyszer molekulákban nagyra értékelendõ. Az újabb tanulmányokban nemcsak a tumorellenes aktivitására mutattak rá, de antioxidáns, koleszterinszint-csökkentõ és lipidszintcsökkentõ hatására is. Rákellenes hatását tekintve az epidemiológiai tanulmányok azt mutatták, hogy szójatermékek alkalmazása, melyek kitûnõ természetes fitinsavforrások, csökkenti a prosztaták halálozási arányát. Ez fõként annak tulajdonítható, hogy a kalcium¹, magnézium¹, réz- és vasionok mellett a fitinsav képes a cinkionnal is kelátot képezni (Hebert, J. R., Hurley, T. G., Olendzki, B. C., Teas, J., Ma, Y. & Hampl, J. S: (1998), Nutritional and socioeconomic factors in relation to prostate cancer mortality: a crossnational study, J. Natl. Cancer Inst., 90, 1637–1647; Kolonel, L. N., Hankin, J. H., Wittemore, A. S., Wu, A. H., Gallagher, R. P., Wilkens, L. R., et al. (2000) Vegetables, fruit, legumes and prostate cancer: a multiethnic casecontrol study, Cancer Epidemial Biomarker Prev., 9, 975–804). Az inozit fõként a sejtmembránokban és üzenetek küldésében aktív, szignálfunkciót ellátva az idegrendszerben a sejtfunkció-szabályozás során. A kolinhoz hasonlóan az inozit szintén jelen van a lecitinben, és hatékonynak bizonyult a lecitin testben való termelésének stimulálásában. Mivel a zsírok a májból a lecitin segítségével kerülnek a sejtekhez, az inozit pozitívan járul hozzá a zsírok metabolizmusához, és segít a vér koleszterinszintjének csökkentésében. Továbbá inozit alkalmazása kolinnal együtt pozitív hatást gyakorol a perifériás diabetikus neuropátiára, és ugyanez a kombináció ajánlott nõk táplálkozásában és hipoglikémia esetében is. Az inozit napi bevitele élelmiszerekkel állati forrásból, mint például foszfolipidek, vagy növényi forrásból, mint fitinsav, körülbelül 1 gramm, míg a gyógyászatilag hatékony adag az 500–1 000 mg/nap tartományba
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
esik. A diabétesz által okozott perifériás neuropátiában szenvedõ betegek két héten át naponta kétszer 500 mg¹ot kaptak, figyelemre méltó eredménnyel. 3 g mioinozitot is adagoltak orálisan és 1 g¹t intravénásan, bármiféle mellékhatás vagy toxikus hatás megjelenése nélkül. Az inozit, és így a fitinsav, mely annak in vivo prekurzorát adja, egyéb hasznos biológiai hatása között meg kell említeni, hogy az inozit a szedatív szerekhez hasonló hatással rendelkezik, így nemcsak nyugtatószerként mûködik mellékhatások nélkül, de az álmatlansággal szemben is hatásos. Enyhe magas vérnyomásos eseteket tisztáz, általánosságban csökkentve a vérnyomást, és szintén hasznos skizofrénia, hipoglikémia és a vérben magas réz- és alacsony cinkkoncentrációval rendelkezõ betegek kezelésében. Végül az inozitot hasznosnak találták a májduzzadás megelõzésében. Így a jelen találmány metildonor vegyület fitinsavval vagy foszforilezett inozittal képzett sóját vagy komplexét biztosítja, ahol a foszforilezett inozit alatt olyan molekulát értünk, melyben a fitinsav egy vagy több foszforcsoportja fém kationnal sót képzett, ahol a metildonor vegyület a következõket tartalmazó csoportból választott: S¹adenozil-L-metionin és N,N,N-trimetilglicin. Abban az adott esetben, amikor a metildonor SAMe, a találmány szerinti SAMe és fitinsav vagy foszforilezett inozitsók és komplexek képlete a következõ: SAMe.n [(C6H(18¹x)O24P6)·My/a·N(x¹y)/b] ahol a SAMe jelentése S¹adenozil-L-metionin-molekula, n jelentése 1 és 3 közötti egész szám, x jelentése 0 és 12 közötti szám (0£x£12), y jelentése 0 és x közötti szám (0£y£x), M és N jelentése egy- vagy többértékû fém kation, a és b jelentése rendre az M és az N oxidációs állapota. Azonnal kiderül, hogy a fenti általános képlet magában foglalja azokat a bizonyos eseteket, melyekben a SAMe a következõkkel képez sót: fitinsav, fitin (kalcium- vagy magnéziumsó), vagy a fitinsav és fém kationok bármely más egyszerû vagy kevert sója, például nátrium-fitát vagy a fitinsav kalcium- és vassója. Másik esetben, amikor a metildonor vegyület betain vagy N,N,N-trimetil-glicin, a találmány szerinti sók vagy komplexek képlete a következõ: m TMG.n [(C6H(18-x)O24P6)·My/a·N(a¹y)/b] ahol a TMG jelentése N,N,N-trimetil-glicin-molekula, m és n jelentése 1 és 10 közötti egész szám, x jelentése 0 és 12 közötti szám (0£x£12), y jelentése 0 és x közötti szám (0£y£x), M és N jelentése egy- vagy többértékû fém kation, a és b jelentése rendre az M és az N oxidációs állapota. Mindkét elõbb említett elõnyös esetben az M és N kationok, ha jelen vannak, elõnyösen alkálifém vagy alkáliföldfém kationok, fõként kalcium- vagy magnéziumionok. A találmány egy további nézõpontja szerint szerinti, a jelen találmány táplálék-gyógyszerészeti, gyógyszerészeti, diétás, növény-gyógyszerészeti vagy állat-
1
HU 005 609 T2
gyógyszerészeti készítményt biztosít, amely tartalmazza a következõket: az S¹adenozil-L-metionint és az N,N,N-trimetil-glicint tartalmazó csoportból választott metildonor vegyület fitinsavval vagy foszforilezett inozittal, adott esetben fém kationnal sóvá alakítva, képzett egy vagy több sóját vagy komplexét. Szintén ebben az esetben a találmány bizonyos megvalósításai azokból az esetekbõl állnak, ahol a metildonor SAMe, és az említett sót vagy komplexet a fentebb ismertetett képlet mutatja be, illetve abból az esetbõl, ahol a metildonor betain, és a találmány szerint nyert sót vagy komplexet a fenti megfelelõ általános képlet írja le. Ez a két aktív hatóanyag egymással kombinálva is formulázható. A jelen találmány szerinti javasolt készítmények, amellett, hogy tárolási stabilitásuk a SAMe-tól jelenleg elvártnál jobb, rendelkeznek azzal a megkérdõjelezhetetlen elõnnyel, hogy egyetlen molekulában egyesítik két különbözõ aktív hatóanyag biológiai aktivitását, és nem tartalmaznak biológiailag nem hasznos, xenobiotikus összetevõket. SAMe esetében, mely fõ kívánatos aktivitását antidepresszánsként fejti ki, egy metabolizálható komponens, például inozit további jelenléte ugyanabban a molekulában, mely önmagában rendelkezik a hangulatstabilizáló hatással, szinergikus hatékonysággal ruházza fel a kapott készítményt. Továbbá, mint már megállapítottuk, a fitinsavval együtt komplex- vagy sóformában lévõ metildonorok bizonyos típusú rákok tekintetében megnövekedett antioxidáns és védõhatással rendelkeznek. A találmány szerinti készítmények a gyógyszeriparban jól ismert technikák alapján formulázhatók, és például savasító, szárító, stabilizáló vagy antioxidáns vegyületekkel integrálhatók. Gazdagíthatók aromatizáló vegyületekkel, édesítõszerekkel és más összetevõkkel, melyek az adott alkalmazási területen jellemzõek és a tervezett adagolási formához megfelelõek. A készítmény különösen elkészíthetõ mikrokapszulázott formában is. A jelen találmány szintén biztosítja a metildonor vegyület fitinsavval vagy foszforilezett inozittal, mely adott esetben fém kationokkal képzett só formájában van, képzett egy vagy több sójának vagy komplexének alkalmazását táplálék-gyógyszerészeti, gyógyszerészeti, diétás, növény-gyógyszerészeti, kozmetikai vagy állat-gyógyszerészeti készítmények elõállítására. Mint már megjegyeztük, a metildonor vegyület a következõkbõl álló csoportból választható: S¹adenozil-L-metionin, N,N,N-trimetil-glicin, N,N-dimetil-glicin, kolin és metionin, a legelõnyösebb termékek azok, melyekben a metildonor SAMe és azok, melyekben a metildonor trimetil-glicin. Különösen a találmány szerinti sót tartalmazó készítmények antidepresszáns aktivitást mutató készítményként alkalmazhatók, vagy bármely esetben a központi idegrendszerre hatást gyakorló készítményként, a termékek elhízás kezelésére, foszfortartalmú diétás étrend-kiegészítõként, kalciumtartalmú diétás étrendkiegészítõként és magnéziumtartalmú diétás étrend-kiegészítõként, májvédõ készítményként, dermatológiailag aktív készítményként és tumorellenes aktivitású ké-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
szítményként alkalmazhatók nemcsak emberekben, de bármely más meleg vérû állatokban is. Végül, annak további nézõpontja szerint a jelen találmány egy különlegesen egyszerû és olcsó szintéziseljárásra vonatkozik, mellyel a javasolt metildonor sók vagy komplexek elõállíthatók. Általánosságban az eljárás tartalmazza a következõ alapvetõ mûveleteket: a) a metildonor vegyület vagy annak sójának oldhatóvá tétele (szolubilizálása) egy megfelelõ oldószerben; b) az elõre meghatározott mennyiségû fitinsav vagy foszforilezett inozit adagolása; c) olyan oldószer adagolása a reakcióelegyhez, amelyben a kívánt só vagy komplex nem oldódik; d) a keletkezõ csapadék összegyûjtése és szûrése; e) a csapadék szárítása vagy száradásának lehetõvé tétele. Fitinsav és trimetil-glicin sójának vagy komplexének elõállításához az említett a) mûveletet az N,N,Ntrimetil-glicin-alap desztillált vízben való oldhatóvá tételével végezzük, majd a b) mûvelet során kalciumkloridot vagy magnézium-kloridot adunk a reakcióelegyhez; továbbá az említett c) mûvelet során etanolt oldószerként adagolunk, és a teljes rendszert 4 °C hõmérsékleten hagyjuk, míg a csapadékképzõdés teljesen lejátszódik. Végül a d) szûrés után az e) mûveletet szobahõmérsékleten hajtjuk végre, szárítószer jelenlétében. A SAMe-sók vagy ¹komplexek elõállítása az elõbbiekben bemutatott eljárással alternatív eljárásokkal is megvalósítható attól függõen, hogy a SAMe¹t a korábbiakban is alkalmazott anionnal képzett sóformában reagáltatjuk közvetlenül fitinsavval vagy foszforilezett inozittal (fitin), és ez utóbbi esetben, attól függõen, hogy a SAMe-bõl eliminálódó aniont a fitinadagolást megelõzõen extraháltuk vagy nem. A fentiekben bemutatott általános eljárás egy speciális megvalósításában az a) mûveletet a SAMe só desztillált vízben való oldhatóvá tételével végezzük, a b) mûveletet fitinsavval végezzük; az említett b) mûveletet követõen az elegyet jeges fürdõn keverve hagyjuk; a c) mûveletben etanolt vagy más megfelelõ oldószert adunk hozzá, és a teljes elegyet jeges fürdõn hagyjuk mindaddig, míg a kicsapódás teljesen végbemegy. Végül a d) szûrés után az e) mûveletet hajtjuk végre szárítószer jelenlétében. Egy másik speciális megvalósításnak megfelelõen az a) mûveletet a SAMe¹só desztillált vízben való oldhatóvá tételével végezzük, ezen mûvelet után a SAMesóban eredetileg jelen lévõ aniont – fõleg a szulfátiont – a megfelelõ anyag, fõként bárium-klorid adagolásával sóként kicsapjuk; majd a b) mûveletet végezzük el fitin adagolásával, majd néhány csepp koncentrált kénsav adagolása után a reakcióelegyet jeges fürdõn keverve hagyjuk. A c) mûveletben etanolt adunk hozzá, és a teljes elegyet jeges fürdõn hagyjuk mindaddig, míg a kicsapódás teljesen végbe megy. Végül a d) szû-
1
HU 005 609 T2
rés után az e) mûveletet hajtjuk végre szárítószer jelenlétében. Néhány speciális megoldásnak megfelelõen az említett szárítószer kalcium-klorid vagy foszfor-pentoxid. Bár a jelen találmány szerinti eljárás egyik legelõnyösebb jellemzõje, hogy a nagy igényeket támasztó fagyasztva szárítás vagy porlasztva szárítás nélkül is kinyerhetõ a kívánt termék kristályos, száraz formában, lehetõség van az e) mûvelet helyettesítésére porlasztva szárítással vagy fagyasztva szárítással, amely közvetlenül a jelen találmány szerinti eljárás elsõ lépései során nyert só vagy komplex oldatán hajtható végre. A jelen találmány speciális jellemzõi, valamint annak elõnyei és a relatív mûveleti eljárás nyilvánvalóbbak lesznek az alábbi példákban szereplõ részletes leírásra való hivatkozások segítségével, a találmánnyal kapcsolatban elvégzett kísérletek eredményeivel együtt. Néhány kísérleti eredményt a mellékelt ábrákon is bemutatunk, ahol: az 1a. és 1b. ábrák az 50% fitin és 50% SAMe-diszulfát-tozilát fizikai keverékének kromatogrammját mutatják, rendre közvetlenül az elõállítás után és 53 °C hõmérsékleten 5 napig való tárolást követõen; és a 2a. és 2b. ábrák a jelen találmány szerinti SAMefitát komplex kromatogrammját mutatják, rendre az elõállítás után és 53 °C hõmérsékleten 5 napig való tárolást követõen. A jelen találmány szerinti szintézis néhány speciális megvalósítását ismertetjük a következõ példákban. 1. példa SAMe-fitát¹só szintézise A következõ példában a SAMe ionos formáját fermentált élesztõbõl közvetlenül állítottuk elõ. Az elõállítást a jelen találmány szerint, a következõ eljárással végeztük: – SAMe-ion 1 mol; – fitin 1 mol; – 2/3 csepp koncentrált kénsav adagolása; – a három termék keverése hidegen, jeges fürdõn; – etanol adagolása mindaddig, míg a SAMe-fitát kicsapódása befejezõdik; – a csapadék szûrése papírszûrõvel, majd szárítása kalcium-kloridot vagy foszfor-pentoxidot tartalmazó szárítóban. Kitermelés >90%. A teljes száradást követõen a kristályos só kinézetû termék megjelenése lágy fehér por. A kémiai elemzés tanúsítja körülbelül egy mol fitinsav és egy mol SAMeion tényleges sóképzését. A termékrõl bebizonyosodott, hogy 5 napig 53 °C hõmérsékleten nagyon stabil. A fenti reakció elvégezhetõ fitin helyett fitinsav alkalmazásával, kalcium és/vagy magnézium adagolásával a csapadék kinyeréséhez. Végül meg kell jegyezni, hogy a SAMe fitáttal való kelátképzése hasznos a SAMe tenyésztõközegtõl való durva elválasztására.
2
Összehasonlító példa SAMe-diszulfát-tozilát és fitin fizikai keveréke Az elõzõ példáéval azonos összetevõk egyszerû, sóképzésen vagy komplexképzésen át nem esett ke5 verékének stabilitásértékelése érdekében a fitint és a SAMe-diszulfát-tozilátot egyenlõ arányban (50% fitin, 50% SAMe-diszulfát-tozilát) egyszerûen szárazon összekevertük. A degradáció értékelését HPCEC–UV elemzéssel 10 végeztük 0,5 M (pH=4) ammónium-formiát-eluens alkalmazásával, 1,2 ml/perc áramlási sebességgel, és Supelcosil LC–SCX oszlopon (25 cm, 4,6 mm, 5 mikron). A keverékre közvetlenül az elõállítást követõen 15 és 53 °C hõmérsékleten, 5 napig való tárolást követõen kapott kromatogrammokat rendre az 1a. és 1b. ábrákon mutatjuk be, melyek mellett a táblázatban a mért számszerû értékek is megtalálhatók. Mint látható, 53 °C hõmérsékleten 5 napig való tárolást köve20 tõen az aktív hatóanyag-veszteség nagyobb, mint 24%.
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2. példa SAMe-fitát¹só szintézise Kereskedelmi forgalomban kapható SAMe-sóból, SAMe-diszulfát-tozilátból kiindulva a jelen találmány szerinti termék szintézisét a következõ eljárás alapján hajtottuk végre: 1. 400 mg SAMe-diszulfát-tozilátot oldhatóvá teszünk 2,5 ml desztillált vízben; 2. a p¹toluolszulfonsavat (PTSA) választótölcsér alkalmazásával éterben (5 ml) extraháljuk; 3. (a PTSA extrakciója után) a vizes fázisban található szulfátokat 0,254 mg bárium-kloriddal kicsapjuk, és 5 percig 4000 l/perc fordulatszámon (T=4 °C) centrifugáljuk; 4. a víz felszínén úszó fázishoz (mágneses keverés mellett) lassan 2,5 ml vízben szuszpendált 410 mg fitint adagolunk; 5. 2/3 csepp kénsavat adunk az elegyhez; 6. 10 percig jeges fürdõn hagyjuk (az oldat pH¹ja 1,3 értéknek megfelelõ); 7. 20 ml 95% etanolt adunk hozzá, és a kicsapódás teljes befejezõdéséig jeges fürdõn hagyjuk; nagyon fehér csapadék képzõdik; 8. papíron való szûréssel elválasztjuk a csapadékot (szívópalack-szivattyúval); 9. a csapadékot szobahõmérsékleten hagyjuk megszáradni kalcium-klorid vagy foszfor-pentoxid jelenlétében; 24 óra elteltével a termék fehér kristályos porrá alakul. Azt is tapasztaltuk, hogy az eljárás elõbb említett 2. lépése elhagyható. SAMe-ion oldatából kiindulva a SAMe-oldatot és a szulfátokat titráltuk: a szulfátmolok és a báriummolok aránya 1:1. Ugyanez igaz a SAMe és a fitinsav vagy fitin mólarányra a következõ lépésben. A reakció kihozatala körülbelül 600–700 mg SAMefitát. A kiinduló SAMe 0–10%¹át az anyalúgban hagytuk.
1
HU 005 609 T2
2
Az elõbb említett szintézis laboratóriumban készült 3 tételén végzett átlagelemzést foglaltuk össze a következõ táblázatban. 1. táblázat
5
1. tétel % p/p
2. tétel % p/p
3. tétel % p/p
Átlag % p/p
SAMe-ion
25,0
25,3
25,4
25,2
Fitinsav
55,5
56,7
54,9
55,7
Kalcium
5,5
5,2
5,1
5,2
Mg
1,48
1,35
1,52
1,45
Szulfátok
2,1
2,3
2,5
2,3
Nedvesség
1,9
1,8
1,5
1,7
91,48
92,65
90,92
91,55
3. példa SAMe¹só szintézise fitinsavval és a stabilitás értékelése Egy másik kereskedelmi forgalomban kapható SAMe-sóból, SAMe-1,4-butándiszulfonátból kiindulva a jelen találmány szerinti terméket a következõ eljárásnak megfelelõen szintetizáltuk: 1. 760 mg SAMe-1,4-butándiszulfonátot oldhatóvá teszünk 2 ml vízben; 2. közvetlenül az 1. lépés oldatához 4,95 g 40%¹os fitinsavoldatot adunk; 3. keverés mellett egy órán át jeges fürdõn hagyjuk az elegyet; 4. 95% etanolt adunk hozzá a kicsapódás teljes befejezõdéséig (jeges fürdõn); 5. vákuum alatt szûrjük; 6. szárítóban 24–48 órán át szárítjuk kalcium-kloriddal vagy foszfor-pentoxiddal. Az így kapott terméket a fenti Összehasonlító példában alkalmazotthoz hasonló stabilitás teszteknek vetettük alá. A jelen találmány szerinti SAMe-fitát-komplexet és egyidejûleg a fitin és SAMe-diszulfát-tozilát egyenlõ arányú (50% fitin, 50% SAMe-diszulfát-tozilát) száraz keverésével elõállított fizikai keverékét stabilitásvizsgálatoknak vetettük alá, melynek az alábbi táblázatban összefoglalt eredményre vezettek. A degradáció értékelését ebben az esetben is HPCEC–UV elemzéssel végeztük 0,5 M (pH=4) ammónium-formiát-eluens alkalmazásával, 1,2 ml/perc áramlási sebességgel, és Supelcosil LC–SCX oszlopon (25 cm, 4,6 mm, 5 mikron).
1. tétel % p/p
2. tétel % p/p
3. tétel % p/p
Átlag % p/p
25,2
25,1
25,3
25,2
5 nap, 53 °C után SAMe-ion
SAMe-ion
1. tétel % p/p
2. tétel % p/p
3. tétel % p/p
Átlag % p/p
25,0
25,2
25,1
25,1
5 nap, 53 °C után SAMe-ion
10
Változás %
18,8
19,7
19,1
19,2
–24,8
–21,8
–23,9
–23,5
A két csoport átlag % szórásának különbsége, student t elemzéssel meghatározva, nagymértékben szignifikáns volt p<0,01. A jelen példa szerinti eljárás alapján elõállított 15 SAMe-fitát-komplexre közvetlenül az elõállítás után és 53 °C hõmérsékleten 5 napig való tárolást követõen kapott kromatogrammokat rendre a 2a. és 2b. ábrákon mutatjuk be, melyek mellett a táblázatban a mért számszerû értékek is megtalálhatók. 20 4. példa Betain fitinsavval képzett sójának szintézise N,N,N-trimetil-glicin (betain) alapból kiindulva a jelen találmány szerinti fitinsavval képzett komplexet a 25 következõ eljárást követve kaptuk: 1. 1,19 g betainalapot oldhatóvá teszünk 2,5 ml desztillált vízben; 2. 1,65 g 40%¹os fitinsavoldatot adunk hozzá; 3. az oldatot szobahõmérsékleten hagyjuk, és 0,550 g kalcium-kloridot adunk hozzá; 30 4. 25 ml 95% etanolt adunk az oldathoz, és a teljes elegyet 4 °C hõmérsékleten hagyjuk a kicsapódás teljes befejezõdéséig; 5. papíron való szûréssel elválasztjuk a csapadékot (szívópalack-szivattyúval); 35 6. a csapadékot szobahõmérsékleten hagyjuk megszáradni megfelelõ szárítószer jelenlétében; 24 óra elteltével a termék fehér kristályos porrá alakul. Választhatóan, a 3. lépésben kalcium-klorid helyett 40 0,470 g magnézium-klorid adagolható. A jelen találmányt néhány speciális megvalósításra való különös hivatkozással mutattuk be, de tudni kell, hogy a terület szakemberei módosításokat és változtatásokat hajthatnak végre azokon anélkül, hogy a talál45 mány mellékelt szabadalmi igénypontokban meghatározott oltalmi körétõl eltérnének.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 50
2. táblázat
SAMe-ion
3. táblázat
23,2
23,3
23,2
23,2
–7,9
–7,2
–8,3
–7,8
1. Az S¹adenozil-L-metionint és N,N,N-trimetil-glicint tartalmazó csoportból választott metildonor vegyület fitinsavval vagy foszforilezett inozittal képzett sója vagy komplexe, ahol a fitinsav egy vagy több foszforsavcso55 portja fém kationnal képzett só formában van. 2. Az 1. igénypont szerinti só, ahol a metildonor vegyület a következõ képletû S¹adenozil-L-metionin: SAMe.n [(C6H(18¹x)O24P6)·My/a·N(a¹y)/b] ahol a SAMe jelentése S¹adenozil-L-metionin-molekula, 60 n jelentése 1–3 egész szám, 7
1
HU 005 609 T2
0£x£12, 0£y£x, M és N jelentése egy- vagy többértékû fém kation, a és b jelentése rendre az M és az N oxidációs állapota. 3. Az 1. igénypont szerinti só, ahol a metildonor vegyület a következõ képletû N,N,N-trimetil-glicin: m TMG.n [(C6H(18-x)O24P6)·My/a·N(a¹y)/b] ahol a TMG jelentése N,N,N-trimetil-glicin-molekula, m és n jelentése 1–10 egész szám, 0£x£12, 0£y£x, M és N jelentése egy- vagy többértékû fém kation, a és b jelentése rendre az M és az N oxidációs állapota. 4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti só, ahol az M és N kationok alkálifém kationok vagy alkáliföldfém kationok. 5. A 4. igénypont szerinti só, ahol a kationok kalcium- vagy magnéziumionok. 6. Táplálék-gyógyszerészeti, gyógyszerészeti, diétás, növény-gyógyszerészeti vagy állat-gyógyszerészeti készítmény, amely tartalmazza az S¹adenozil-Lmetionint és N,N,N-trimetil-glicint tartalmazó csoportból választott metildonor vegyület fitinsavval vagy foszforilezett inozittal képzett egy vagy több sóját vagy komplexét, ahol a fitinsav egy vagy több foszforsavcsoportja fém kationnal képzett só formában van. 7. A 6. igénypont szerinti készítmény, ahol a metildonor vegyület S¹adenozil-L-metionin és a só vagy komplex a 2. igénypontban meghatározott só vagy komplex. 8. A 6. igénypont szerinti készítmény, ahol a metildonor vegyület N,N,N-trimetil-glicin, és a só vagy komplex a 3. igénypontban meghatározott só vagy komplex. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti készítmény, amely tartalmazza az S¹adenozil-L-metionin sójának vagy komplexének és az N,N,N-trimetil-glicin sójának vagy komplexének kombinációját. 10. A 6–9. igénypontok bármelyike szerinti készítmény mikrokapszulázott formában. 11. Az S¹adenozil-L-metionint és N,N,N-trimetilglicint tartalmazó csoportból választott metildonor vegyület fitinsavval vagy foszforilezett inozittal képzett egy vagy több sójának vagy komplexének, ahol a fitinsav egy vagy több foszforsavcsoportja fém kationnal képzett só formában van, alkalmazása táplálék-gyógyszerészeti, gyógyszerészeti, diétás, növény-gyógyszerészeti, kozmetikai vagy állat-gyógyszerészeti készítmények elõállítására. 12. A 11. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a metildonor vegyület S¹adenozil-L-metionin, és a só vagy komplex a 2. igénypontban meghatározott só vagy komplex. 13. A 11. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a metildonor vegyület N,N,N-trimetil-glicin és a só vagy komplex a 3. igénypontban meghatározott só vagy komplex. 14. A 11–13. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmények a következõket tartalmazó csoportból választottak: antidepresszáns aktivitást mutató készítmények, vagy bármely esetben a közpon-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
ti idegrendszerre hatást gyakorló készítmények, készítmények elhízás kezelésére, foszfortartalmú diétás étrend-kiegészítõk, kalciumtartalmú diétás étrend-kiegészítõk és magnéziumtartalmú diétás étrend-kiegészítõk, májvédõ készítmények, dermatológiailag aktív készítmények és tumorellenes aktivitású készítmények. 15. Eljárás az S¹adenozil-L-metionint és N,N,Ntrimetil-glicint tartalmazó csoportból választott metildonor vegyület fitinsavval vagy foszforilezett inozittal képzett sójának vagy komplexének, ahol a fitinsav egy vagy több foszforsavcsoportja fém kationnal képzett só formában van, elõállítására, amely tartalmazza a következõ mûveleteket: a) a metildonor vegyület vagy annak sójának oldhatóvá tétele egy megfelelõ oldószerben; b) elõre meghatározott mennyiségû fitinsav vagy foszforilezett inozit adagolása; c) olyan oldószer adagolása a reakcióelegyhez, amelyben a kívánt só vagy komplex nem oldódik; d) a keletkezõ csapadék összegyûjtése és szûrése; e) a csapadék szárítása vagy száradásának lehetõvé tétele. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, ahol a metildonor vegyület az N,N,N-trimetil-glicin és az a) mûvelet az N,N,N-trimetil-glicin-alap desztillált vízben való oldhatóvá tétele, majd a b) mûvelet után kalcium-klorid vagy magnézium-klorid adagolása a reakcióelegyhez; továbbá az említett c) mûvelet etanol oldószerként történõ adagolása, és a teljes rendszer 4 °C hõmérsékleten tartása a csapadékképzõdés teljesen lejátszódásáig; végül az e) mûvelet végrehajtása szobahõmérsékleten, szárítószer jelenlétében. 17. A 15. igénypont szerinti eljárás, ahol a metildonor vegyület az S¹adenozil-L-metionin (SAMe) és az a) mûvelet egy SAMe¹só desztillált vízben való oldhatóvá tétele; majd a b) mûvelet után elvégzése fitinsavval; az említett b) mûveletet követi az elegy jeges fürdõn keverve tartása; a c) mûvelet etanol oldószerként történõ adagolása és a teljes elegy jeges fürdõn tartása mindaddig, míg a csapadékképzõdés teljesen végbemegy; végül az e) mûvelet végrehajtása szárítószer jelenlétében. 18. A 15. igénypont szerinti eljárás, ahol a metildonor vegyület S¹adenozil-L-metionin (SAMe) és az a) mûvelet egy SAMe¹só desztillált vízben való oldhatóvá tétele; az a) mûvelet után a SAMe-sóban eredetileg jelen lévõ anion sóként való kicsapása a megfelelõ anyag adagolásával; majd a b) mûvelet elvégzése fitin adagolásával; majd a b) mûveletet követõen koncentrált kénsav adagolása, és a reakcióelegy jeges fürdõn keverve tartása; a c) mûveletben etanol adagolása, és a teljes elegy jeges fürdõn tartása mindaddig, míg a csapadékképzõdés teljesen végbemegy, végül, az e) mûvelet végrehajtása szárítószer jelenlétében. 19. A 15–18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a szárítószer kalcium-klorid vagy foszforsavanhidrid. 20. A 15–18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az e) szárítási mûvelet alternatívája a csapadék porlasztva szárítása vagy fagyasztva szárítása.
HU 005 609 T2 Int. Cl.: C07F 9/117
9
HU 005 609 T2 Int. Cl.: C07F 9/117
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
