(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000007625T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 007 625

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 05 796859 (22) A bejelentés napja: 2005. 09. 16. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050796859 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1794306 A2 2006. 03. 30. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1794306 B1 2009. 12. 16.

(51) Int. Cl.: C12N 15/82 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06032469 PCT/EP 05/010168

(30) Elsõbbségi adatok: 04077624 2004. 09. 24. 628826 P 2004. 11. 17.

(73) Jogosult: Bayer BioScience N. V., 9052 Gent (BE)

EP US

(72) Feltalálók: DE BLOCK, Marc, B-9820 Merelbeke (BE); METZLAFF, Michael, B-3080 Tervuren (BE); GOSSELE, Véronique, B-9000 Gent (BE)

HU 007 625 T2

(54)

(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest

Stresszrezisztens növények

A leírás terjedelme 28 oldal (ezen belül 11 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 007 625 T2

A találmány tárgyát képezik eljárások növények és növényi sejtek stresszrezisztenciájának növelésére, amelyek során növényekben a NAD-mentõszintézis-útvonalban és/vagy a de novo NAD-szintézis útvonalban részt vevõ enzimeket expresszáltatunk. Gabonák esetében a kedvezõtlen növekedési feltételekkel, ezen belül a vízhiánnyal, erõs fénnyel, magas hõmérséklettel, tápanyagkorlátokkal, sós növekedési körülményekkel és hasonlókkal szembeni tûrõképesség igen kívánatos tulajdonság, tekintettel arra, hogy soha véget nem érõ az erõfeszítés az ilyen növények tényleges hozamának további növelésére. Sokféle módot leírtak annak a célnak az elérésére, amivel javíthatjuk azt a tulajdonságot, amit stresszrezisztenciának vagy stressztûrõ képességnek neveznek. Mivel a különféle abiotikus stresszkörülmények eredményeként gyakran keletkeznek káros reaktív oxigénszármazékok („reactive oxigen species” – „ROS”), így például szuperoxidok vagy hidrogén-peroxidok, a növények stresszrezisztenciájának javítására tett korai próbálkozások a ROS-képzõdés megelõzésére vagy a ROS¹ok eltávolítására helyezték a hangsúlyt. Ilyen megközelítés például a ROS-befogó enzimek, így például katalázok, peroxidázok, szuperoxid-diszmutázok stb. túlexpresszáltatása, vagy akár a ROS-befogó molekulák, így például aszkorbinsav, glutation stb. mennyiségének növelése. E megközelítésekrõl és stressztûrõ növények konstruálását célzó más próbálkozásokról összefoglaló található például Wang és munkatársai [Planta 218, 1–14 (2003)] cikkében. Növényi sejtekben és növényekben úgy is kialakítható stressztûrés, hogy csökkentjük az endogén poliADP-ribóz polimerázok (ParP) vagy poli-(ADP-ribóz) glikohidrolázok (ParG) aktivitását vagy koncentrációját, ahogy azt a WO00/04173 és a WO2004/090140 számú iratok ismertetik. Feltételezik, hogy ilyen módon a stresszel terhelt növényi sejtekben elkerülhetõ vagy kellõképpen késleltethetõ a NAD és az ATP traumatikus sejthalálhoz vezetõ kiürülése ahhoz, hogy a stressz alatt álló sejtek túléljenek és akklimatizálódjanak a stresszkörülményekhez. Uchimiya és munkatársai (2002) az YK1 megjelölésû rizsgén izolálását ismertetik, valamint kiméra YK1 gén alkalmazását ilyen gént hordozó transzgén rizsnövények tûrõképességének növelésére rizskárokkal és sokféle abiotikus stresszel, így például NaCl-dal, UV¹C-vel, víz alá kerüléssel és hidrogén-peroxiddal szemben. [Uchimiya és munkatársai, Molecular Breeding 9, 25–31 (2002)]. Uchimiya és munkatársai emellett egy poszterabsztraktot is közzétettek, amely szerint a NAD-függõ reduktáz génje (YK1) a NAD-szintetáz aktivitásának fokozó szabályozása révén rizssejtekben a NAD(P)(H) szintjét is növelte, és arra a következtetésre jutottak, hogy ez a módosítás a ROS-stresszel szembeni rezisztenciához szükséges redoxanyagokat generált [Uchimiya és munkatársai, Keystone symposium on plant biology: Functions and control of cell death („Növénybiológiai Keystone-szimpózium: A sejthalál funkciói és szabályozása”), Snowbird Utah, 2003. április 10–15.].

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

Az élesztõbõl származó NAD-szintetáz jól jellemzett enzim, amely a de novo NAD-szintézis útvonalban és a NAD-mentõszintézis-útvonalban is az utolsó enzim (lásd 1. ábra). A de novo útvonalon a NAD-szintézis prekurzora a kinolát, amely a tripofán bomlástermékeként keletkezik. A mentõútvonalon a nikotinamid (amely a NAD bomlásterméke, és különféle enzimek, így például a PARP, a NAD-függõ deacetilázok és más NAD-glikohidrolázok aktivitása révén keletkezik) a prekurzormolekula. Elsõ lépésben a nikotinamidot a nikozinamidáz nikotinsavvá dezaminálja. A nikotinsavat a nikotinát-foszforobozil-transzferáz 5¹foszforibozil-1-pirofoszfátra viszi át, aminek eredményeként nikotinsavmononukleotid keletkezik. Ezen a vegyületen a de novo útvonalon és a mentõútvonal is osztozik. A vegyület NAD+-pirofoszforiláz és NAD-szintetáz általi további átalakítása ezért ugyanúgy történik, mint a de novo útvonalon. Élesztõben a (nikotinamidázt kódoló) PNC1 túlexpresszióját összefüggésbe hozták az élettartam kalóriakorlátozás és kis intenzitású stressz általi meghosszabbításával [Anderson és munkatársai, Nature 423, 181–185. oldal (2003); Gallo és munkatársai, Molecular and Cellular Biology 24, 1301–1312 (2004)]. Keveset tudunk az egyes NAD bioszintézis útvonalaknak megfelelõ enzimekrõl növényekben. Hunt és munkatársai [New Phytologist 163(1), 3144 (2004)] Arabidopsis-ból rendelkezésre álló genominformációk enzimek növényi homológjainak azonosítására történõ alkalmazását ismertetik. A beazonosított DNS-szekvenciák hozzáférési számai a következõk: nikotinamidáz: At5g23220, At5g23230 és At3g16190; nikotinátfoszforibozil-transzferáz: At4g36940 és At2g23420; nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz: At5g55810, NAD-szintetáz: At1g55090. Még mindig szükség van alternatív eljárásokra a növények stressztûrõ képességének növelésére és az igénypontokat is ideértve a találmány továbbiakban ismertetett megvalósítási módjai ilyen eljárásokat és eszközöket ismertetnek. A találmány összefoglalása A találmány egyik megvalósítási módjában a találmány tárgyát képezi eljárás fokozott stresszrezisztenciájú növények elõállítására, amelynek során egy növény sejtjeibe bejuttatunk egy kiméragént, amely kiméragén az alábbi, mûködõképesen összekapcsolt DNSfragmenseket tartalmazza: i. növényekben expresszáltatható promoter; ii. a nikotinamid-adenin-dinukleotid mentõszintézis-útvonal egyik növényekben funkcióképes enzimét kódoló, élesztõbõl vagy gombákból származó DNSrégió, amely enzim az alábbiak közül kerül kiválasztásra: nikotinaminidáz, nikotinát-foszforiboziltranszferáz, nikotinsav-mononukleotid-adeniltranszferáz vagy nikotinamid-adenin-dinukleotidszintetáz; iii. a transzkripció terminálásában és a poliadenilezésben részt vevõ 3’¹végi régió, majd transzgenikus növénypopuláció elõállítása céljából regeneráljuk a

1

HU 007 625 T2

transzgenikus sejteket; és kiválasztunk a transzgenikus növénypopulációból egy olyan növényt, amely fokozott stresszrezisztenciát mutat vagy kiválasztunk egy olyan növényt, amelyben hasonló, de nem transzgenikus növényekkel összehasonlítva alacsonyabb a reaktív oxigénszármazékok szintje vagy magas marad a NADH-szint stresszkörülmények között. Az DNS-régió olyan enzimet kódolhat, amely SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.:6, SEQ ID No.:8 vagy SEQ ID No.:10 szerinti aminosavszekvenciának megfelelõ aminosavszekvenciát tartalmaz. A találmány egy másik megvalósítási módjában a találmány tárgyát képezik a leírásban ismertetett kiméragének, az ilyen kiméragéneket tartalmazó növényi sejtek, és lényegében ilyen kiméragéneket tartalmazó növényi sejtekbõl álló növények, valamint ilyen növények magjai. Az ilyen növények és növényi sejtek azzal jellemezhetõk, hogy stresszkörülmények között alacsonyabb bennük a reaktív oxigénszármazékok szintje, mint a kiméragént nem tartalmazó hasonló növényben. A találmány egy másik megvalósítási módjában a találmány tárgyát képezi az ismertetett kiméragének alkalmazása növények stresszrezisztenciájának növelésére vagy stresszkörülmények között lévõ növényben vagy növényi sejtben a reaktív oxigénszármazékok szintjének csökkentésére. A találmány tárgyát képezi továbbá a nikotinamidáz, nikotinát-foszforibozil-transzferáz, nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz vagy nikotinamid-adenin-dinukleotid-szintetáz – így például a SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.:6, SEQ ID No.:8 és SEQ ID No.:10 szerinti aminosavszekvenciák közül választott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérjét kódoló DNSszekvenciák – közül kiválasztott, a nikotinamid-adenindinukleotid mentõszintézis-útvonal növényben mûködõképes enzimét kódoló DNS-szekvencia alkalmazása növények stresszrezisztenciájának növelésére vagy stresszkörülmények között lévõ növényekben vagy növényi sejtekben a reaktív oxigénszármazékok szintjének csökkentésére vagy a NADH szintjének fenntartására. Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra a sütõélesztõbõl (Saccharomyces cerevisiae) ismert NAD-mentõútvonal és de novo NAD-szintézis útvonal vázlatos bemutatása. A 2–11. ábrák a NAD-mentõútvonalból vagy a de novo NAD-szintézis útvonalból származó különféle enzimeket kódoló DNS-régiókat tartalmazó, és növényekben expresszáltatható szabályozóelemek szabályozása alatt álló T¹DNS vektorok vázlatos bemutatásai. Az alkalmazott rövidítések a következõk: RB: jobb oldali T¹DNS határolószekvencia; 3’35S: transzkripcióterminációs és poliadenilezési szignál a CaMV 35S átiratából; Cab22L: a Cab22L átirat nem transzlálódó vezetõszekvenciája; P35S2: CaMV 35S

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

promoter; 3’g7: transzkripcióterminációs és poliadenilezési szignál Agrobacterium tumefaciens 7. T¹DNS génjébõl; „vonalkód”, foszfinotricin-acetil-transzferázt kódoló régió; az Arabidopsis Rubisco-kisalegység átiratának pSSUAra promotere; LB: bal oldali t¹DNS határolószekvencia; Sm/Sp: szpektinomicin- és sztreptomicinrezisztencia-gén; pVS1ori: Agrobacterium-ban replikációra alkalmazható VS1 origó, ColE1: replikációs origó; NLS: nukleáris lokalizációs szignál; PNC1: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinamidázt kódoló DNS-régió; npt1: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinát-foszforibozil-transzferáz; nma1: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 1. típusú nikotinsav-mononukleotidadenil-transzferáz; nma2: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 2. típusú nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz; qns1: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó NAD-szintetáz (QNS1). A találmány részletes ismertetése A találmány azon a felismerésen alapul, hogy az élesztõbõl származó NAD-mentõútvonal növényekben funkcióképes enzimeit kódoló DNS-szekvenciák felhasználhatók olyan transzgenikus növények elõállítására, amelyek stresszre, különösen abiotikus stresszre rezisztensebbek, mint az ilyen DNS-szekvenciákat nem tartalmazó növények. A kontrollnövényekkel összehasonlítva a transzgenikus növényekben emellett szignifikánsan csökkent a reaktív oxigénfajták („ROS”¹ok) szintje és magas maradt a NADH szintje, amikor stresszkörülmények közé helyezték õket. A találmány egyik megvalósítási módjában tehát a találmány tárgyát képezi eljárás fokozott stresszrezisztenciájú növény elõállítására, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: – a leírásban ismertetett egyik stresszrezisztens kiméragént egy növény sejtjeibe juttatjuk, hogy ezáltal a stresszrezisztens kiméragént tartalmazó sejteket állítsunk elõ; – regeneráljuk a stresszrezisztens kiméragént tartalmazó sejteket, hogy ezáltal a stresszrezisztens kiméragént tartalmazó növénypopulációt állítsunk elõ; – kiválasztunk a növénypopulációból egy olyan növényt, amely fokozott stresszrezisztenciát mutat és/vagy amelyben hasonló, de nem transzgenikus növényekkel összehasonlítva alacsonyabb a ROS¹ok szintje stresszkörülmények között és/vagy magas marad a NADH-szint. A stresszrezisztens kiméragén ezáltal tartalmaz egy növényekben expresszáltatható promotert, amelyhez mûködõképesen hozzá van kapcsolva a nikotinamid-adenin-dinukleotid mentõszintézis-útvonal egyik növényekben funkcióképes enzimét kódoló DNS-régió, amely enzim az alábbiak közül kerül kiválasztásra: nikotin-aminidáz, nikotinát-foszforibozil-transzferáz, niko-

1

HU 007 625 T2

tinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz vagy nikotinamid-adenin-dinukleotid-szintetáz, valamint egy transzkripcióterminálásban és poliadenilezésben részt vevõ 3’¹vég. A leírás szerinti értelemben „a nikotinamid-adenindinukleotid mentõszintézis-útvonal egyik növényekben funkcióképes enzime” olyan enzim, amely, ha mûködõképesen megfelelõ szabályozóelemekhez, például növényekben expresszáltatható promoterhez és termináló régióhoz van kapcsolva, akkor növényekbe juttatva átírható és transzlálható, amelynek eredményeként a NAD-mentõszintézis-útvonal egy növényekben funkcióképes enzimét kapjuk. A találmány tárgyát képezik a NAD-mentõszintézisbõl származó enzimek (és az õket kódoló gének), amelyeket növényi forrásból nyerünk, de a találmány tárgyát képezik az élesztõbõl (Saccharomyces cerevisiae), más élesztõfélékbõl vagy gombákból nyert enzimek is. Ez utóbbi fehérjék feltehetõleg még jobban alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásokhoz, mivel kevésbé valószínû, hogy olyan enzimatikus visszacsatolásos szabályozás stb. alatt állnak, amely alatt hasonló növényi eredetû enzimek állhatnak. A NAD-mentõszintézisben részt vevõ enzimek között vannak az alábbiak: – nikotinamidáz (EC 3.5.1.19), amely a nikotinamid amidcsoportjának hidrolízisét katalizálja, ami által nikotinát és NH3 keletkezik. Az enzim nikotinamid-dezamináz, nikotinamid-amidáz, YNDáz vagy nikotinamid-amidohidroláz néven is ismert, – nikotinát-foszforibozil-transzferáz (EC 2.4.2.11), más néven niacin-ribonukleotidáz, nikotinsavmononukleotid-glikohidroláz; nikotinsav-mononukleotid-pirofoszforiláz; nikotinsav-foszforibozil-transzferáz, amely az alábbi reakciót katalizálja: nikotinát-D-ribonukleotid+difoszfát= nikotinát+5+foszfo-a-D-ribóz-1-difoszfát – nikotinát-nukleotid-adenil-transzferáz (EC 2.7.7.18), más néven dezamido-NAD+-pirofoszforiláz; nikotinát-mononukleotid-adenil-transzferáz; dezaminonikotinamid-adenin-dinukleotid-pirofoszforiláz; NaMT-ATáz; nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz, amely az alábbi reakciót katalizálja: ATP+nikotinát-ribonukleotid= difoszfát+dezamido-NAD+ – NAD-szintáz (EC 6.3.1.5), más néven NAD-szintetáz; NAD+-szintáz; nikotinamid-adenin-dinukleotid-szintetáz; difoszfopiridin-nukleotid-szintetáz, amely az alábbi reakciót katalizálja Dezamido-NAD++ATP+NH3=AMP+difoszfát+NAD+ A találmány egyik megvalósítási módjában a NADmentõútvonal különféle enzimeit kódoló régiók olyan nukleotidszekvenciát tartalmaznak, amely SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.:6, SEQ ID No.:8 vagy SEQ ID No.:10 szerinti aminosavszekvenciájú fehérjéket kódolnak, így például ID No.:1, SEQ ID No.:3, SEQ ID No.:5, SEQ ID No.:7 vagy SEQ ID No.:9 szerinti nukleotidszekvenciát.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 4

2

Nyilvánvaló azonban, hogy e nukleotidszekvenciák változatai, ezen belül inszerciókat, deléciókat és szubsztitúciókat tartalmazó változatai is alkalmazhatók ugyanerre a célra. Ugyanígy alkalmazhatók az említett nukleotidszekvenciák Saccharomyces cerevisiae-tõl eltérõ fajokból származó homológjai is. Az ismertetett nukleotidszekvenciák változatai szekvenciaazonosságot mutatnak, amely elõnyösen legalább körülbelül 80%¹os, vagy 90%¹os vagy 95%¹os azokkal az azonosított nukleotidszekvenciákkal, amelyek a NAD-mentõútvonalból származó enzimeket kódolnak, így például a szekvencialistában azonosítottakkal. A változatok elõnyösen a NAD-mentõútvonalból származó enzimekkel azonos aktivitású, funkcióképes fehérjéket kódolnak. A leírás szerinti értelemben két rokon nukleotid- vagy aminosavszekvencia százalékban kifejezett „szekvenciaazonossága” azoknak a pozícióknak a számát jelenti két optimálisan illesztett szekvenciában, amelyekben azonos nukleotid vagy aminosav van (×100), osztva az összehasonlított pozíciók számával. A réseket, azaz az illesztés olyan pozícióit, ahol az egyik szekvenciában jelen van egy aminosav vagy nukleotid, a másikban viszont nincs, nem azonos aminosavaknak vagy nukleotidoknak tekintjük. A két szekvencia illesztését Needleman és Wunsch algoritmusa (Needleman és Wunsch, 1970) szerint végeztük. A fenti számítógéppel segített szekvenciaillesztés kényelmesen elvégezhetõ standard szoftverek, például a Wisconsin Package Version 10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok) részét képezõ GAP programmal, az alapbeállítás szerinti pontszámozó mátrix, 50¹es résképzési büntetõpont („gap creation penalty”) és 3¹as réstágítási büntetõpont („gap extension penalty”) alkalmazásával. A NAD-mentõútvonal élesztõbõl származó egyik enzimét vagy egy, az élesztõtõl eltérõ szervezetbõl származó homológ enzimet kódoló nukleotidszekvenciákkal homológ nukleotidszekvenciák a genomadatok in silico elemzésével beazonosíthatók, ahogyan azt Hunt és munkatársai (lásd fent) ismertetik. Homológ nukleotidszekvenciák úgy is azonosíthatók és izolálhatók, hogy sztringens körülmények között hibridizáltatást végzünk próbaként a NAD-mentõútvonalból származó enzimeket kódoló, azonosított nukleotidszekvenciákat, így például a szekvencialistában azonosítottakat alkalmazva. A leírás szerinti értelemben a „sztringens hibridizációs körülmények” azt jelenti, hogy a hibridizáció általában akkor történik meg, ha a próba és a célszekvencia között legalább 95%, elõnyösen legalább 97% a szekvenciaazonosság. A sztringens hibridizációs körülményekre példa a következõ: 50% formamidot, 5×SSC¹t (150 mM NaCl, 15 mM trinátrium-citrát), 50 mM nátrium-foszfátot (pH=7,6), 5×Denhardt-féle oldatot, 10% dextrán-szulfátot és 20 mg/ml denaturált, nyírással kezelt vivõ DNS¹t, így például lazacspermából nyert DNS¹t tartalmazó oldatban éjszakán át történõ inkubálás, majd a hibridizáltató hordozó mosása körülbelül 65 °C¹on, 0,1×SSC-ben, elõnyösen kétszer körülbelül 10 percig. Az egyéb hibridizációs és mosási körülmé-

1

HU 007 625 T2

nyek jól ismertek, példák az alábbi publikációban és különösen annak 11. fejezetében találhatók: Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor, New York (1989). Ilyen szekvenciaváltozatok DNS-amplifikálással is elõállíthatók, láncindítóként olyan oligonukleotidokat alkalmazva, amelyek a NAD-mentõútvonalból származó enzimeket kódoló génekre specifikusak, így például többek között a SEQ ID No.:1, a SEQ ID No.:3, a SEQ ID No.:5, a SEQ ID No.:7, a SEQ ID No.:9, a SEQ ID No.:11, a SEQ ID No.:13, a SEQ ID No.:15, a SEQ ID No.:17, a SEQ ID No.:19, a SEQ ID No.:21, a SEQ ID No.:23 szerinti nukleotidszekvenciák vagy komplementereik közül választott, körülbelül 20–50 egymást követõ nukleotidot tartalmazó oligonukleotidokat alkalmazva. A találmány szerinti eljárások felhasználhatók különféle stresszindukáló körülményeket, különösen abiotikus stresszkörülményeket, ezen belül víz alá kerülést, erõs fényt, erõs UV sugárzási szinteket, megemelkedett hidrogén-peroxid szinteket, vízhiányt, magas vagy alacsony hõmérsékletet vagy megemelkedett sótartalmat tûrõ növények elõállítására. A találmány szerinti eljárások felhasználhatók emellett kedvezõtlen körülmények, különösen abiotikus stresszkörülmények között, ezen belül víz alatt, erõs fényben, erõs UV sugárzási szintek mellett, megemelkedett hidrogén-peroxid-szintek mellett, vízhiány mellett, magas vagy alacsony hõmérsékleten, megemelkedett sótartalom mellett stb. növõ növények sejtjeiben a ROS¹ok szintjének csökkentésére is. A ROS¹ok szintje vagy a NADH-szint technikában ismert eljárások, ezen belül a 3. példában ismertetettek segítségével határozható meg. A leírásban ismertetett eljárások alkalmazásával olyan növények állíthatók elõ, amelyekben a ROS¹ok szintje egyenlõ a stresszel nem terhelt körülmények között – így például többek között gyenge fényen – lévõ kontrollnövényekével vagy alacsonyabb azokénál. Ezekben a növényekben, stresszel nem terhelt körülmények között a ROS¹ok szintje a gyenge fényen lévõ kontrollnövények szintjének 50–100%¹a lehet, közelebbrõl körülbelül 60–85%¹a. Ezekben a növényekben a ROS¹ok szintje stresszkörülmények között körülbelül 50–80%¹a a stresszkörülmények között lévõ kontrollnövényekének, ami a stresszel nem terhelt körülmények között lévõ kontrollnövényekben mért ROS-szint körülbelül 60–80%-ának felel meg. A NADH szintje ezekben a növényekben hasonló módon egyenlõ a stresszel nem terhelt körülmények között – így például többek között gyenge fényen – lévõ kontrollnövényekével, vagy magasabb azokénál. Ezekben a növényekben stresszel nem terhelt körülmények között a NADH szintje a gyenge fényen lévõ kontrollnövények NADHszintjének 100–160%¹a lehet, közelebbrõl körülbelül 120–140%¹a. Ezekben a növényekben a NADH szintje stresszkörülmények között körülbelül 200–300%¹a a stresszkörülmények között lévõ kontrollnövények NADH-szintjének, ami a stresszel nem terhelt körülmények között lévõ kontrollnövényekben mért ROS-szint körülbelül 100–160%-ának felel meg.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

A transzgenikus növények elõállítására szolgáló eljárásokat nem tekintjük kritikusnak a találmány szempontjából és bármilyen transzformálási eljárás és adott növényhez megfelelõ regenerálás alkalmazható. Az ilyen eljárások a technikában jól ismertek, és a következõk lehetnek: Agrobacterium-közvetített transzformálás, részecskeágyús bejuttatás, mikroinjekciózás, ép sejtek elektroporézise, polietilénglikolközvetített protoplaszttranszformálás, protoplasztok elektroporézise, liposzómaközvetített transzformálás, szilíciumérintkezõk által közvetített transzformálás stb. Az így elõállított transzformált sejteket ezután érett, termõképes növényekké lehet regenerálni. A kapott transzformált növényeket felhasználhatjuk hagyományos nemesítési sémában, hogy azonos tulajdonságokkal rendelkezõ további transzformált növényeket állítsunk elõ, vagy hogy a találmány szerint a kiméragént azonos faj eltérõ fajtáiba vagy rokon növényfajokba, vagy hibridnövényekbe juttassuk be. A transzformált növények magjai stabilan a genomba inszertálódott formában tartalmazzák a találmány szerinti kiméragént, és ugyancsak a találmány tárgyát képezik. Nyilvánvaló, hogy a leírásban ismertetett különféle stresszrezisztens kiméragének, amelyek a NAD-mentõútvonalból származó különféle enzimeket kódoló DNS-régiókat tartalmaznak, össze is kombinálhatók egy növényben vagy növényi sejtben, hogy ezáltal még tovább növeljük a kiméragéneket tartalmazó növények stressztûrõ képességét. A találmány egyik megvalósítási módjában tehát a találmány tárgyát képezik olyan növényi sejtek és növények, amelyek legalább két, eltérõ kódolórégiókat tartalmazó, stresszrezisztens kiméragént tartalmaznak. A találmány szerinti transzgenikus növényi sejtek és növényvonalak tartalmazhatnak emellett olyan kiméragéneket is, amelyek csökkentik a WO00/04173 és a WO2004/090140 számú iratokban ismertetett az endogén PARP és/vagy PARG gén expresszióját. E további kiméragének bejuttathatók például úgy, hogy a találmány szerinti transzgenikus növényvonalakat a PARP és/vagy PARG gén expresszióját csökkentõ kiméragént tartalmazó transzgenikus növényekkel keresztezzük. Transzgenikus növények vagy növényvonalak úgy is elõállíthatók, hogy a találmány szerinti kiméragéneket olyan transzgenikus növényi sejtekbe juttatjuk be vagy transzformáljuk, amelyek tartalmazzák a PARP és/vagy a PARG gén expresszióját csökkentõ kiméragéneket, és vice versa. A leírás szerinti értelemben a promoter növényben expresszálható promotert jelent. A leírás szerinti értelemben a „növényben expresszálható promoter” olyan DNS¹t jelent, amely képes egy növényi sejtben a transzkripciót irányítani (elindítani). Ide tartozik minden olyan növényi eredetû promoter, de minden olyan nem növényi eredetû promoter is, amely képes növényi sejtekben a transzkripciót irányítani, azaz egyes vírusos vagy bakteriális eredetû promoterek, így például a CaMV35S [Harpster és munkatársai, Mol. Gen. Genet. 212, 182–190 (1988)], a föld alatti lóherevírus („subterranean clover virus”) 4. vagy 7. számú promotere

1

HU 007 625 T2

(WO9606932), vagy a T¹DNS gén promoterek, de emellett a szövetspecifikus vagy szervspecifikus promoterek is, ezen belül többek között a magspecifikus promoterek (például WO89/03887), a szervkezdeményekre specifikus promoterek [An és munkatársai, The Plant Cell 8, 15–30 (1996)], szárspecifikus promoterek (Keller és munkatársai, EMBO J. 7, 3625–3633 (1988)], levélspecifikus promoterek [Hudspeth és munkatársai, Plant Mol Biol 12, 579–589 (1989)], mezofilspecifikus promoterek (így például a fényindukálható Rubisco-promoterek), gyökérspecifikus promoterek [Keller és munkatársai, Genes Devel. 3, 1639–1646 (1989)], gumóspecifikus promoterek [Keil és munkatársai, EMBO J. 8, 1323–1330 (1989)], edényszövetre specifikus promoterek [Peleman és munkatársai, Gene 84, 359–369 (1989)], porzószálra szelektív promoterek (WO 89/10396, WO 92/13956), felhasadási zónára specifikus promoterek (WO 97/13865) és hasonlók. A találmány szerinti kiméragének elláthatók egy növényekben funkcióképes nukleáris lokalizációs szignállal („NLS”) – például az SV40 NLS-sel – is, amely mûködõképesen van hozzákapcsolva a NAD-mentõútvonal egy enzimét kódoló DNS-régióhoz. A leírás elolvasása után technikában jártas szakember számára azonnal nyilvánvalóvá válik, hogy a fokozott stresszrezisztencia vonatkozásában hasonló hatások érhetõk el minden alkalommal, ha a növény olyan természetes változatait állítjuk elõ, amelyekben a NAD-mentõútvonal enzimeit kódoló endogén gének aktívabbak vagy nagyobb mennyiségben expresszálódnak. Az ilyen növényváltozatok úgy állíthatók elõ, hogy egy növénypopulációt mutagenezisnek vetünk alá, így például többek között EMS-mutagenezisnek, majd ezt követõen a NAD-mentõútvonal bármely enzimének vagy ezek bármely kombinációjának fokozott aktivitására szûrjük. Az is azonnal nyilvánvalóvá válik, hogy az eltérõ fajták vagy változatok egy populációja szûrhetõ általánosságban a fent említett stresszkörülményekkel, vagy konkrétan abiotikus stresszekkel szembeni fokozott tûrõképességre, majd a stresszkörülményekkel szembeni fokozott tûrõképesség korreláltatható a NAD-mentõútvonal egyik enzimét kódoló bármely endogén gének egy adott alléljének jelenlétével. Ezt követõen keresztezéssel bejuttathatjuk ezeket az alléleket egy érdeklõdésre számot tartó növénybe, feltéve, hogy a fajok szexuálisan kompatibilisek vagy a leírásban is ismertetett hagyományos módszerekkel (ezen belül hibridizáltatással vagy PCR-amplifikálással is) beazonosíthatók és rekombináns DNS-technológiák alkalmazásával bejuttathatók. A különösen kívánatos allélek nemesítési módszerek alkalmazásával történõ bejuttatása is követhetõ az érdeklõdésre számot tartó allélekre specifikus molekuláris markerek alkalmazásával. A leírásban ismertetett eljárások és eszközök vélhetõleg minden növényi sejtben és növényben alkalmazhatók, kétszikû és egyszikû növényi sejtekben és növényekben egyaránt, ezen belül többek között gyapotban, káposztafélékben, olajrepcében, búzában, kukoricában vagy kukoricában, árpában, napraforgóban,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 6

2

rizsben, zabban, cukornádban, szójababban, zöldségekben (ezen belül cikóriában, salátában, paradicsomban), dohányban, burgonyában, cukorrépában, papayában, ananászban, mangóban vagy Arabidopsis thaliana-ban, de emellett a kertészeti, virágtermesztési vagy erdészeti növényekben is. A leírás szerinti értelemben a „tartalmaz” úgy értendõ, hogy az adott jellemzõk, egész számok, lépések vagy komponensek jelen vannak, de nem zárja ki egy vagy több egyéb jellemzõ, egész szám, lépés vagy komponens vagy ezek csoportjainak jelenlétét vagy hozzáadását. A nukleotid- vagy aminosavszekvenciákat tartalmazó nukleinsavak vagy fehérjék tehát tartalmazhatnak például a ténylegesen idézetteknél több nukleotidot vagy aminosavat is, azaz egy nagyobb nukleinsavba vagy fehérjébe lehetnek beágyazva. Valamely funkcionálisan vagy szerkezetileg definiált DNS-régiót tartalmazó kiméragén további DNS-régiókat stb. is tartalmazhat. Az oltalmi kört nem korlátozó alábbi példák növényi sejtek és növények stresszrezisztenciájának növelésre alkalmas kiméragének összeszerelését, valamint a gének alkalmazását ismertetik. Egyirányú jelzés hiányában a példákban az összes rekombináns DNS-módszert standard protokollok szerint végezzük, ahogy azt például az alábbiak ismertetik: Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) és Ausubel és munkatársai, Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, Egyesült Államok (1994). A növényi molekuláris munka standard anyagait és eljárásait R. D. D. Croy ismerteti „Plant Molecular Biology Labfax” (1993) címû munkájában, amely a BIOS Scientific Publications Ltd (Egyesült Királyság) és a Blackwell Scientific Publications (Egyesült Királyság) közös kiadásában jelent meg. A standard molekuláris biológiai módszerekhez további hivatkozások a következõk: Sambrook és Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001); Brown, Molecular Biology LabFax, 2. kiadás, Academic Press, Egyesült Királyság (1998) I. és II. kötete. A polimeráz-láncreakcióhoz standard anyagok és eljárások a következõ publikációkban találhatók: Dieffenbach és Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995), és McPherson és munkatársai, PCR – Basics: From Background to Bench, 1. kiadás, Springer Verlag, Németország (2000). A leírásban és a példákban az alábbi szekvenciákra hivatkozunk: SEQ ID No. 1: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinamidáz (PNC1) nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 2: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinamidáz (PNC1) aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 3: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinát-foszforibozil-transzferáz (NPT1) nukleotidszekvenciája (komplementer). SEQ ID No. 4: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinát-foszforibozil-transzferáz (NPT1) aminosavszekvenciája.

1

HU 007 625 T2

SEQ ID No. 5: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 1. típusú nikotinsav-mononukleotid-adeniltranszferáz (NMA1) nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 6: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 1. típusú nikotinsav-mononukleotid-adeniltranszferáz (NMA1) aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 7: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 2. típusú nikotinsav-mononukleotid-adeniltranszferáz (NMA2) nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 8: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 2. típusú nikotinsav-mononukleotid-adeniltranszferáz (NMA2) aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 9: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó NAD-szintetáz (QNS1) nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 10: Saccharomyces cerevisiae-bõl származó NAD-szintetáz (QNS1) aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 11: Arabidopsis thaliana-ból (1. izoforma) származó nikotinamidáz nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 12: Arabidopsis thaliana-ból (1. izoforma) származó nikotinamidáz aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 13: Arabidopsis thaliana-ból (2. izoforma) származó nikotinamidáz nukleotidszekvenciája SEQ ID No. 14: Arabidopsis thaliana-ból (2. izoforma) származó nikotinamidáz aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 15: Arabidopsis thaliana-ból (3. izoforma) származó nikotinamidáz nukleotidszekvenciája SEQ ID No. 16: Arabidopsis thaliana-ból (3. izoforma) származó nikotinamidáz aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 17: Arabidopsis thaliana-ból (1. izoforma) származó nikotinát-foszforibozil-transzferáz nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 18: Arabidopsis thaliana-ból (1. izoforma) származó nikotinát-foszforibozil-transzferáz aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 19: Arabidopsis thaliana-ból (2. izoforma) származó nikotinát-foszforibozil-transzferáz nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 20: Arabidopsis thaliana-ból (2. izoforma) származó nikotinát-foszforibozil-transzferáz aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 21: Arabidopsis thaliana-ból származó nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 22: Arabidopsis thaliana-ból származó nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 23: Arabidopsis thaliana-ból származó NAD-szintetáz nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 24: Arabidopsis thaliana-ból származó NAD-szintetáz aminosavszekvenciája. SEQ ID No. 25: a pTVE 467 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 26: a pTVE 468 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 27: a pTVE 469 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 28: a pTVE 470 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 29: a pTVE 496 számú T¹DNS vektor nukleotidszekvenciája.

2

SEQ ID No. 30: a pTVE nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 31: a pTVE nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 32: a pTVE 5 nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 33: a pTVE nukleotidszekvenciája. SEQ ID No. 34: a pTVE 10 nukleotidszekvenciája.

497 számú T¹DNS vektor 500 számú T¹DNS vektor 501 számú T¹DNS vektor 502 számú T¹DNS vektor 503 számú T¹DNS vektor

Példák

15

20

25

30

35

1. példa: Stresszrezisztens kiméragének összeszerelése és növényi sejtekbe juttatása, pTVE467 A növények stresszrezisztenciájának növelése érdekében hagyományos módszerek alkalmazásával kiméragéneket állítottunk össze, amelyek sorrendben a következõ DNS-fragmenseket tartalmazták: – promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 35S); – körülbelül 60 bp hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; – Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinamidázt kódoló DNS-fragmens (SEQ ID No.: 1); – fragmens a CaMV 35S átiratának nem transzlálódó 3’¹végébõl (3’ 35S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a pTVE467¹et (SEQ ID No.:25). A pTVE467 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 2. ábrán mutatjuk be. A pTVE467 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti.

40 Kezdõpont (nt)

Végpont (nt)

198

222

RB: jobb oldali T¹DNS határolószekvencia

521

300,(C)

3’35S: transzkripcióterminációs szignál

1181

534,(C)

PNC1-kódolórégió

1250

1191,(C)

cab22 vezetõszekvencia

1781

1251,(C)

P35S2 promoter

2293

2082,(C)

3’g7 transzkripcióterminációs szignál

2866

2315,(C)

„vonalkód”-régió

4592

2867,(C)

PSSuAra promoter

4760

4784

bal oldali T¹DNS határolószekvencia

45

50

55

60 7

1

HU 007 625 T2

2

Táblázat (folytatás) Kezdõpont (nt) Kezdõpont (nt)

6352

Végpont (nt)

5352,(C)

Sm/Sp rezisztenciagén

6875

10645

pVS1 replikációs origó

10646

11709

ColE1 replikációs origó

pTVE468 Összeállítottunk egy, a pTVE467-ben lévõhöz hasonló kiméragént, amelyben a nikotinamidázt egy konvencionális nukleáris lokalizációs szignállal láttuk el. A kiméragén tehát az alábbi, mûködõképesen összekapcsolt DNS-fragmenseket tartalmazza: – promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 35S); – körülbelül 60 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; – körülbelül 20 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely egy nukleáris lokalizációs szignált (NLS) tartalmazó peptidet kódol; – Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinamidázt kódoló DNS-fragmens (SEQ ID No.:1); amelyben az NLS-szignál fúziója a leolvasási keret megtartásával történt; – fragmens a CaMV 35S átiratának nem transzlálódó 3’¹végébõl (3’ 35S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a pTVE468¹at (SEQ ID No.:26). A pTVE468 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 3. ábrán mutatjuk be. A pTVE468 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. Kezdõpont (nt)

5

Végpont (nt)

4610

2885,(C)

PSSuAra promoter

4778

4802


6370

5370,(C)


6893

10663


10664

11727


10

15

20

25

30

35

40

pTVE469 A növények stresszrezisztenciájának növelése érdekében hagyományos módszerek alkalmazásával kiméragéneket állítottunk össze, amelyek sorrendben a következõ DNS-fragmenseket tartalmazták: – promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 35S); – körülbelül 60 bp hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; – Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinát-foszforibozil-transzferázt kódoló DNS-fragmens (NPT1; SEQ ID No.:3); – fragmens a CaMV 35S átiratának nem transzlálódó 3’¹végébõl (3’ 35S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a pTVE469¹et (SEQ ID No.:27). A pTVE469 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 4. ábrán mutatjuk be. A pTVE469 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. Kezdõpont (nt)

Végpont (nt)

198

222


521

300,(C)


1765

534,(C)

NPT1-kódolórégió

1832

1773,(C)


Végpont (nt)

198

222


521

300,(C)


1169

534,(C)

PNC1-kódolórégió

2363

1833,(C)

P35S2 promoter

1187

1167,(C)

nukleáris lokalizációs szignál

2875

2664,(C)


1268

1209,(C)


3448

2897,(C)


5175

3449,(C)

PSSuAra promoter

1799

1269,(C)

P35S2 promoter

5342

5366

2311

2100,(C)



6934

5934,(C)

2884

2333,(C)



45

50

55

60 8

1

HU 007 625 T2

2


7457 11228

Végpont (nt)

11227 12291

pVS1 replikációs origó ColE1 replikációs origó

pTVE470 Összeállítottunk egy, a pTVE469-ben lévõhöz hasonló kiméragént, amelyben a Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinát-foszforibozil-transzferázt egy konvencionális nukleáris lokalizációs szignállal láttuk el. A kiméragén tehát az alábbi, mûködõképesen összekapcsolt DNS-fragmenseket tartalmazza: – promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 35S); – körülbelül 60 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; – körülbelül 20 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely egy nukleáris lokalizációs szignált (NLS) tartalmazó peptidet kódol; – Saccharomyces cerevisiae-bõl származó nikotinát-foszforibozil-transzferázt kódoló DNS-fragmens (NPT1; SEQ ID No.:3); amelyben az NLSszignál fúziója a leolvasási keret megtartásával történt; – fragmens a CaMV 35S átiratának nem transzlálódó 3’¹végébõl (3’ 35S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a pTVE470¹et (SEQ ID No.:28). A pTVE470 jelû T¹DNS vektort vázlatosan az 5. ábrán mutatjuk be. A pTVE470 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. Kezdõpont (nt)

198

5

10

15

20

25

30

35

40

Végpont (nt)

222


521

300,(C)


1787

534,(C)

NPT1-kódolórégió

1775

1755,(C)

SV40 nukleáris lokalizációs szignál

1853

1794,(C)


2384

1854,(C)

P35S2 promoter

2896

2685,(C)


3469

2918,(C)


5195

3470,(C)

PSSuAra promoter

45

50

55

60 9

Végpont (nt)

5363

5387

Bal oldali T¹DNS határolószekvencia

6955

5955,(C)


7478

11248


11249

12312


pTVE496 A növények stresszrezisztenciájának növelése érdekében hagyományos módszerek alkalmazásával kiméragéneket állítottunk össze, amelyek sorrendben a következõ DNS-fragmenseket tartalmazták: – promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 35S); – körülbelül 60 bp hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; – Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 1. típusú nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferázt kódoló DNS-fragmens (NMA1; SEQ ID No.:5); – fragmens a CaMV 35S átiratának nem transzlálódó 3’¹végébõl (3’ 35S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a pTVE496¹ot (SEQ ID No.:29). A pTVE496 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 6. ábrán mutatjuk be. A pTVE496 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. Kezdõpont (nt)

Végpont (nt)

198

222


521

300,(C)


1739

534,(C)

NMA1-kódolórégió

1805

1746,(C)


2336

1806,(C)

P35S2 promoter

2848

2637,(C)


3421

2870,(C)


5147

3422,(C)

PSSuAra promoter

5315

5339


6907

5907,(C)


1

HU 007 625 T2

Táblázat (folytatás) Kezdõpont (nt)

11200


11201

12264


pTVE497 Összeállítottunk egy, a pTVE496-ban lévõhöz hasonló kiméragént, amelyben a Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 1. típusú nikotinsav-mononukleotidadenil-transzferázt egy konvencionális nukleáris lokalizációs szignállal láttuk el. A kiméragén tehát az alábbi, mûködõképesen összekapcsolt DNS-fragmenseket tartalmazza: – promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 35S); – körülbelül 60 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; – körülbelül 20 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely egy nukleáris lokalizációs szignált (NLS) tartalmazó peptidet kódol; – Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 1. típusú nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferázt kódoló DNS-fragmens (NMA1; SEQ ID No.:5); amelyben az NLS-szignál fúziója a leolvasási keret megtartásával történt; – fragmens a CaMV 35S átiratának nem transzlálódó 3’¹végébõl (3’ 35S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a pTVE497¹et (SEQ ID No.:30). A pTVE497 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 7. ábrán mutatjuk be. A pTVE497 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. Kezdõpont (nt)

198

Kezdõpont (nt)

Végpont (nt)

7430

2

5

Végpont (nt)

5165

3440,(C)

PSSuAra promoter

5333

5357


6925

5925,(C)


7448

11218


11219

12282


10

15

20

25

30

35

40

pTVE500 A növények stresszrezisztenciájának növelése érdekében konvencionális módszerek alkalmazásával kiméragéneket állítottunk össze, amelyek sorrendben a következõ DNS-fragmenseket tartalmazták: – promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 35S); – körülbelül 60 bp hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; – Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 2. típusú nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferázt kódoló DNS-fragmens (NMA2; SEQ ID No.:7); – fragmens a CaMV 35S átiratának nem transzlálódó 3’¹végébõl (3’ 35S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a pTVE500¹at (SEQ ID No.:31). A pTVE500 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 8. ábrán mutatjuk be. A pTVE500 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. Kezdõpont (nt)

Végpont (nt)

198

222


521

300,(C)


1721

534,(C)


1787

1728,(C)


2318

1788,(C)

P35S2 promoter

Végpont (nt)

222


45

521

300,(C)


1757

534,(C)


1748

1731,(C)


2830

2619,(C)


1823

1764,(C)


3403

2852,(C)


5129

3404,(C)

PSSuAra promoter

2354

1824,(C)

P35S2 promoter

5297

5321

2866

2655,(C)



6889

5889,(C)

3439

2888,(C)



50

55

60 10

1

HU 007 625 T2

Táblázat (folytatás) Kezdõpont (nt)

11182


11183

12246


pTVE501 Összeállítottunk egy, a pTVE500-ban lévõhöz hasonló kiméragént, amelyben a Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 2. típusú nikotinsav-mononukleotidadenil-transzferázt egy konvencionális nukleáris lokalizációs szignállal láttuk el. A kiméragén tehát az alábbi, mûködõképesen összekapcsolt DNS-fragmenseket tartalmazza: – promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 35S); – körülbelül 60 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; – körülbelül 20 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely egy nukleáris lokalizációs szignált (NLS) tartalmazó peptidet kódol; – Saccharomyces cerevisiae-bõl származó 2. típusú nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferázt kódoló DNS-fragmens (NMA2; SEQ ID No.:7); amelyben az NLS-szignál fúziója a leolvasási keret megtartásával történt; – fragmens a CaMV 35S átiratának nem transzlálódó 3’¹végébõl (3’ 35S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a pTVE502¹t (SEQ ID No.:32). A pTVE501 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 9. ábrán mutatjuk be. A pTVE501 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. Kezdõpont (nt)

198

Kezdõpont (nt)

Végpont (nt)

7412

2

5

Végpont (nt)

5165

3440,(C)

PSSuAra promoter

5315

5339


6907

5907,(C)


7430

11200


11201

12264


10

15

20

25

30

35

40

pTVE502 A növények stresszrezisztenciájának növelése érdekében konvencionális módszerek alkalmazásával kiméragéneket állítottunk össze, amelyek sorrendben a következõ DNS-fragmenseket tartalmazták: – promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 35S); – körülbelül 60 bp hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; – Saccharomyces cerevisiae-bõl származó NADszintázt kódoló DNS-fragmens (QNS1; SEQ ID No.:9); – fragmens a CaMV 35S átiratának nem transzlálódó 3’¹végébõl (3’ 35S). Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a pTVE502¹t (SEQ ID No.:33). A pTVE502 jelû T¹DNS vektort vázlatosan a 10. ábrán mutatjuk be. A pTVE502 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. Kezdõpont (nt)

Végpont (nt)

198

222


521

300,(C)


2678

534,(C)

QNS1-kódolórégió

2744

2685,(C)


3275

2745,(C)

P35S2 promoter

Végpont (nt)

222


45

521

300,(C)


1739

534,(C)


1733

1713,(C)


3787

3576,(C)


1805

1746,(C)


4360

3809,(C)


6086

4361,(C)

PSSuAra promoter

2336

1806,(C)

P35S2 promoter

6254

6278

2848

2637,(C)



7846

6846,(C)

3421

2870,(C)



50

55

60 11

1

HU 007 625 T2

2


Végpont (nt)

8369

12139


12140

13203


pTVE503 Összeállítottunk egy, a pTVE502-ben lévõhöz hasonló kiméragént, amelyben a Saccharomyces cerevisiae-bõl származó NAD-szintázt egy konvencionális nukleáris lokalizációs szignállal láttuk el. A kiméragén tehát az alábbi, mûködõképesen összekapcsolt DNSfragmenseket tartalmazza: – promoterrégió a karfiol-mozaikvírusból (CaMV 35S); – körülbelül 60 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely a Cab22L nem transzlálódó vezetõszekvenciának felel meg; – körülbelül 20 nt hosszúságú DNS-fragmens, amely egy nukleáris lokalizációs szignált (NLS) tartalmazó peptidet kódol; – Saccharomyces cerevisiae-bõl származó NADszintázt kódoló DNS-fragmens (QNS1; SEQ ID No.:9); amelyben az NLS-szignál fúziója a leolvasási keret megtartásával történt; – fragmens a CaMV 35S átiratának nem transzlálódó 3’¹végébõl (3’ 35S). A pTVE503 jelû T¹DNS vektor mint jellemzõket, az alábbi molekularészeket tartalmazza: A (C) a komplementerszálat jelenti. Kezdõpont (nt)

198

222


521

300,(C)


2699

534,(C)

QNS1-kódolórégió

2690

2670,(C)


2765

2706,(C)


3296

2766,(C)

P35S2 promoter

3808

3597,(C)


4381

3830,(C)


6107

4382,(C)

PSSuAra promoter

6275

6299


7867

6867,(C)


8390

12610


12161

13224


5

A T¹DNS vektorokat hagyományos eljárások alkal10 mazásával segítõ Ti¹plazmidot tartalmazó Agrobacterium-törzsekbe juttattuk be. A kiméragéneket a technikában ismert Agrobacterium-közvetített transzformációval Arabidopsis-növényekbe juttattuk be. Ezt a kiméragént bejuttattuk egy T¹DNS vektorba, a 15 T¹DNS bal oldali és jobb oldali határolószekvenciája közé, valamint ezzel együtt egy szelektálható markergént is, amely rezisztenciát biztosít a foszfinotricin nevû gyomirtóval szemben, és így kaptuk a pTVE503¹at (SEQ ID No.:34). A pTVE503 jelû T¹DNS 20 vektort vázlatosan a 11. ábrán mutatjuk be.

25

30

35

Végpont (nt)

Végpont (nt)

40

45

50

55

60 12

2. példa. Az 1. példában ismertetett kiméragéneket tartalmazó transzgenikus Arabidopsis-vonalak elemzése A NAD-mentõútvonal élesztõbõl származó génjét expresszáló, az 1. példában ismertetettek szerint elõállított transzgenikus Arabidopsis-vonalak (T1 generáció) magjait 15 mg/l foszfinotricint (PPT) tartalmazó táptalajon csíráztattuk és neveltük. Kontrollként Arabidopsis thaliana cv Col-0¹t alkalmaztunk. Minden növényt erõs fénystressznek tettünk ki. 30 mEinstein m–2 s–1 fényen két hétig nevelt növényeket 6 órára 250 mEinstein m–2 s–1 fényre (erõs fény) tettünk, majd 8 órára sötétbe és azután újra 8 órára erõs fényre. A kezelést követõen minden vonalban meghatároztuk a NADH-tartalmat és szuperoxidgyök-tartalmat, és összehasonlítottuk a gyenge fényen nevelt transzgenikus és kontrollvonalakban mért értékekkel. Az eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze. A transzgenikus növények erõs fény mellett nagyobb NADH-tartalmat mutattak, mint a kontrollnövények és kevesebb reaktív oxigénszármazékot termeltek erõs fény mellett, mint a kontrollnövények. Nem figyeltünk meg különbséget a konstrukciók között aszerint, hogy a NAD-mentõútvonal kódolt enzime el volt látva nukleáris lokalizációs szignállal vagy sem. A transzgenikus növényvonalak fenotípusát is pontoztuk az erõs fénystresszel szembeni tûrõképesség szerint. E célra a növényeket két hétig in vitro gyenge fényen (30 mEinstein m–2 s–1) neveltük, majd 3 napra erõs fényre (250 mEinstein m–2 s–1; 16 óra világos, 8 óra sötét) tettük õket. Az erõs fénnyel történõ kezelést követõen a növényeket visszatettük gyenge fényre, és a fenotípus pontozása elõtt további három napig neveltük. A kontrollnövények kicsik voltak és virágozni kezdtek (stresszindukált virágzás), az 1. példában ismertetett kiméragéneket tartalmazó transzgenikus vonalakhoz tartozó növények nagyobbak voltak, mint a kontrollnövények és csak felmagozni kezdtek.

1

HU 007 625 T2

2

1. táblázat Az 1. példában ismertetett kiméra élesztõgéneket túlexpresszáló transzgenikus Arabidopsis-vonalak erõs fénnyel szembeni tûrõképessége Kiméragének

Szegregáció a PPT-tûrõképességre

A NADH %¹os mennyisége a gyenge fényen tartott kontrollal összehasonlítva

A szuperoxidok %¹os mennyisége a gyenge fényen tartott kontrollal összehasonlítva

gyenge fény

erõs fény

gyenge fény

erõs fény

–

100

68

100

145

1. PNC1 (NLS) vonal

3:1

108

128

80

73

2. PNC1 (NLS) vonal

3:1

139

128

82

76

1. NPT1-vonal

6:1

128

147

66

70

2. NPT1-vonal

6:1

122

135

82

76

NPT1 (NLS)

12:1

106

150

61

80

Kontroll

Négyzetes középhiba <10%

3. példa: Protokollok a NDH-tartalom- és szuperoxidtartalom-mérésekhez Intracelluláris NAD(P)H kvantitatív meghatározása vízben oldható tetrazóliumsó 25 alkalmazásával Hivatkozás Jun Nakamura, Shoji Asakura, Susan D. Hester, Gilbert de Murcia, Keith W. Caldecott and James A. Swenberg: Quantitation of intracellular NAD(P)H can monitor an imbalance of DNA single strand break re- 30 pair in base excision repair deficient cells in real time. („Az intracelluláris NAD(P)H kvantitatív meghatározásával valós idõben nyomon követhetõ az egy szálát érintõ DNS-törések javításában bekövetkezõ egyensúlyvesztés báziskivágás-javításra deficiens sejtek- 35 ben.”) Nucleic Acids Research 31(17), e104 (2003). Növényi anyagok A legtöbb növényi anyag alkalmazható: – In vitro nevelt, 14–18 napos, NEM virágzó Arabi- 40 dopsis-hajtások – Olajrepce hipokotilexplantátumok Cell Counting Kit¹8 (CCK¹8) sejtszámláló készlet Sopachem n. v./Belgium 72A, Avenue du Laarbeeklaan –1090 Brussels Belgium Tartalma: 5 mmol/l WST-8¹at (tetrazóliumsó). 0,2 mmol/l 1¹metoxi-PMS¹t és 150 mmol/l NaCl¹ot tartalmazó 5 ml¹es flaskák Reakcióelegy: – 10 ml 25 mM kálium-foszfát-puffer, pH=7,4 – 0,5 ml CCK¹8 – 0,1 mM 1¹metoxi-5-metolfenazinium-metil-szulfát (=1-metoxifenazin-metoszulfát): 1 ml/ml 100 mM¹os törzsoldat (molekulatömeg=336,4; 100 mg 2,973 ml vízben) – 1 csepp Tween-20/25 ml

45

50

55

60 13

Eljárás – Learatjuk a növényi anyagot és 25 mM káliumfoszfát-pufferbe (pH=7,4) tesszük például: 150 olajrepce hipokotilexplantátum 1 gramm Arabidopsis-hajtás (gyökerek nélkül) – A puffert a reakcióelegyre cseréljük 1 gramm Arabidopsis-hajtáshoz 15 ml 150 olajrepce hipokotilexplantátumhoz 15 ml – Sötétben, körülbelül fél óráig (a reakciót követve) 26 °C¹on inkubáljuk – 450 nm¹en megmérjük a reakcióelegy abszorbanciáját Szuperoxid-termelés mérése az XTT redukciójának kvantitatív meghatározásával Hiv.: De Block, M., De Brouwer, D., A simple and robust in vitro assay to quantify the vigour of oilseed rape lines and hybrids. („Egyszerû és robusztus vizsgálati in vitro eljárás olajrepcevonalak és hibridek termõképességének kvantitatív meghatározásához.”) Plant Physiol. Biochem. 40, 845–852 (2002). A. BRASSICA NAPUS Táptalajok és reakciópufferek Vetéshez használt táptalaj (201¹es táptalaj): Félig koncentrált Murashige- és Skoog-féle sók 2% szacharóz pH=5,8 0,6%¹os agar (Difco Bacto Agar) 250 mg/l triacillin A2S3 kalluszindukáló táptalaj: MS táptalaj, 0,5 g/l Mes (pH=5,8), 3% szacharóz, 40 mg/l adenin-SO4, 0,5% agaróz, 1 mg/l 2,4¹D, 0,25 mg/l NAA, 1 mg/l BAP, 250 mg/l triacillin Reakciópuffer: 25 mM kálium-foszfát-puffer, pH=8 1 mM nátrium, 3’¹{1¹[fenil-amino-karbonil]-3,4-tetrazólium}-bisz(4¹metoxi-6-nitro)=XTT (BioVectra, Kanada) (MW 674.53)

1

HU 007 625 T2

Az oldat óvatos hevítésével (+37 °C) feloldjuk az XTT¹t (felhasználás elõtt szobahõmérsékletre hûtjük). 1 csepp Tween¹20 25 ml pufferhez A magok sterilizálása – a magok elõcsíráztatása – a csíranövények nevelése A magokat 2 percre 70%¹os etanolba áztatjuk, majd 15 percig 0,1% Tween-20¹at tartalmazó nátriumhipoklorit-oldatban sterilizáljuk a felületüket, végül 1 liter steril csapvízzel leöblítjük õket. A magokat legalább egy óráig steril csapvízzel inkubáljuk (hogy kidiffundálhassanak belõlük az olyan komponensek, amelyek gátolhatják a csíráztatást). A magokat 50 ml steril csapvizet (+250 mg/l triacillint) tartalmazó 250 ml¹es Erlenmeyer-lombikokba tesszük. Körülbelül 20 óráig rázatjuk. Körülbelül 125 ml, vetéshez használt táptalajt tartalmazó, Duchefa gyártmányú Vitro Vent edényekbe tesszük azokat a magokat, amelyekbõl kidudorodott a gyököcske (10 magot edényenként, nem túl sokat, hogy csökkentsük a szennyezés miatti magveszteséget). A magokat ±24 °C¹on és 10–30 mEinstein s–1 m–2 mellett csíráztatjuk, 16 órás naphosszúságot alkalmazva. U. i.: Az elvetendõ magok mennyiségének kiszámításához: 5 hipokotilszegmens/csíranövény A hipokotilexplantátumok elõkultúrázása és stresszindukció – Az elvetés után 12–14 nappal a hipokotilokat körülbelül 7–10 mm¹es szegmensekre vágjuk. – A hipokotilexplantátumokat (25 hipokotil/Optilux Petri-csésze, Falcon S1005, Dánia) 5 napig, 25 °C¹on, A2S3 táptalajon (10–30 mEinstein s–1 m–2 mellett) kultúrázzuk. U. i.: Minden körülményhez 150 hipokotilexplantátumot alkalmazunk. – Stresszindukció: A hipokotilexplantátumokat 0,25 vagy 50 mg/l acetil-szalicilsavat tartalmazó A2S3 táptalajra ültetjük át. A magokat 25 °C¹on és 10–30 mEinstein s–1 m–2 mellett 24 óráig inkubáljuk, 16 órás naphosszat alkalmazva. XTT vizsgálati eljárás – Egy 50 ml¹es Falcon-csõbe 150 hipokotilexplantátumot teszünk. – Mossuk (XTT¹t nem tartalmazó) reakciópufferrel. – Hozzáadunk 20 ml, XTT¹t tartalmazó reakciópuffert. (az explantátumokat alá kell meríteni, de nem szabad vákuum segítségével átitatni) – Sötétben, 26 °C¹on inkubáljuk. – A reakciót a reakcióközeg abszorbanciájának 470 nm¹nél történõ mérésével követjük. B. ARABIDOPSIS THALIANA Táptalajok és reakciópufferek

2

A növények táptalaja: Félig koncentrált Murashige- és Skoog-féle sók B5-vitaminok 1‚5% szacharóz pH=5,8 5 0,7%¹os Difco-agar Inkubálóközeg: Félig koncentrált MS¹sók 1% szacharóz 0,5 g/l MES, pH=5,8 1 csepp Tween¹20 25 ml közeghez 10 Reakciópuffer: 25 mM kálium-foszfát-puffer, pH=8 1 mM nátrium,3’-{1¹[fenil-amino-karbonil]-3,4-tetrazólium}-bisz(4¹metoxi-6-nitro)=XTT (BioVectra, Kana15 da) (MW 674.53) Az oldat óvatos hevítésével (+37 °C) feloldjuk az XTT¹t (felhasználás elõtt szobahõmérsékletre hûtjük) 1 csepp Tween¹20 25 ml pufferhez 20

25

30

35

40

45

Arabidopsis-növények – Arabidopsis-vonalak: vizsgálandó kontrollvonalak (az az anyavonal, amelybõl a vizsgált vonalak származnak) – Az Arabidopsis-magok sterilizálása: 2 percig 70%¹os etanol 10 percig fehérítõ (6% aktív klór)+20 ml¹enként 1 csepp Tween¹20 az oldathoz, 5 mosás steril csapvízzel U. i.: a sterilizálást 2 ml¹es Eppendorf-csövekben végezzük, az Arabidopsis-növények a csõ aljára süllyednek, amivel lehetõvé teszik a folyadék 1 ml¹es automata pipettával történõ eltávolítását – A magok elõcsíráztatása: 12 ml steril csapvizet tartalmazó 9 cm¹es Optilux Petri-csészében (Falcon). Gyenge fény egy éjszakától 24 óráig terjedõ ideig – Az Arabidopsis-növények nevelése: A magokat 125 ml növényi táptalajt tartalmazó Intergrid szövettenyésztõ lemezeken (Falcon; nr. 3025) vetjük el, rácsonként 1 mag sûrûségben. A növényeket 24 °C¹on, 30 mEinstein s–1 m–2 mellett, 16 óráig fényen, 8 óráig sötétben tartva neveljük körülbelül 18 napig (a felmagzás elõtt). U. i.: A vizsgálati eljárás elvégzéséhez körülményenként és vonalanként 1¹1 g növényi anyagra (gyökér nélküli hajtásra) van szükség. 1 g hajtás 40–60 növénynek felel meg. Stresszindukció Paraquat

50 – Learatjuk az Arabidopsis-hajtásokat (gyökerek nélkül) – 1 g hajtást 0,5 vagy 10 mM paraquatot tartalmazó inkubálóközegbe teszünk (a hajtásokat alá kell meríteni, de nem szabad vákuum segítségével 55 átitatni) Inkubálóközeg: 150 ml Intergrid szövettenyésztõ lemezeken (Falcon; nr. 3025) – 24 °C¹on, sötétben, 24 óráig inkubáljuk, 16 órás naphosszat alkalmazva. 60 14

1

HU 007 625 T2

2. táblázat Az élesztõbõl származó nikotinamidáz (Pnc1) génjét túlexpresszáló Arabidopsis thaliana növények fokozott ózontûrõ képessége

Erõs fény – A lemezek felét erõs fényre tesszük (250 mEinstein s–1 m–2) és 4–20 óráig inkubáljuk XTT vizsgálati eljárás – Az agarlemezekrõl (erõs fény miatti stressz) vagy a folyékony inkubálóközegbõl (paraquatstressz) learatjuk a hajtásokat (gyökerek nélkül) és (XTT nélküli) reakciópuffert tartalmazó 50 ml¹es Falcon-csövekbe tesszük. – A reakciópuffert (ml-enként 15 gramm) XTT¹t tartalmazó reakciópufferre cseréljük. – A hajtásokat alá kell meríteni, de nem szabad vákuum segítségével átitatni – Sötétben, 26 °C¹on inkubáljuk – A reakciót a reakcióközeg abszorbanciájának 470 nm¹nél történõ mérésével követjük (körülbelül egy óráig). 4. példa: Az élesztõbõl származó nikotinamidáz (Pnc1) génjét túlexpresszáló Arabidopsis thaliana növények fokozott ózontûrõ képessége Az A. thaliana Columbia ökotípusának transzformálásához a pTVE467 kiméravektort (1. példa) alkalmaztuk. A primer transzformánsokat Southern DNS-blot és Northern RNS-blot elemzés segítségével vizsgáltuk. Egy olyan transzgenikus vonalat azonosítottunk, amely egyetlen példányban hordozta a Pnc1-transzgén konstrukciót és állandóan magas volt benne a teljes hosszúságú transzgenikus Pnc1-mRNS szintje (20 pg/5 mg teljes RNS). A csírázás után 6 héttel az egykópiás transzgenikus vonal 100 növényegyedét és kontrollként a vad típusú Columbia 100 növényegyedét gõzölõkamrákban ózonnal kezeltük. Két egymást követõ napon a növényeket napi 5 órán át 250, 350 vagy 500 ppb koncentrációjú ózonnal kezeltük. A kezelés után az összes növényt vizuálisan szûrtük a nekrotikus léziók formájában manifesztálódó ózonkárosodásra. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze. 500 ppb koncentrációjú ózon alkalmazása esetén minden növény nekrotikus léziókat mutatott, a 2 alacsonyabb ózonkoncentrációnál azonban a transzgenikus növények szignifikánsan kisebb százaléka károsodott. Emellett a transzgenikus vonal és a vad típusú vonal minden növényében meghatároztuk a vitalitási teljesítményindex (PI) alakulását növekvõ ózonkoncentráció mellett. A Pl az alábbi képlet segítségével számolható: PI=(ABS/CS)×(TR/CS)×(ET/CS). (ABS=az antennapigmentek által elnyelt fotonáram Chi*; CS=keresztmetszet; TR=a reakciócentrum által becsapdázott és redoxienergiává átalakított energia; ET=a reakcióúton késõbbi elektronáram, amely CO2-fixációhoz vezet). A transzgenikus vonalban az ózonkoncentráció növekedésével szignifikánsan nõtt a vitalitási teljesítményindex (Pl), míg a növekvõ koncentrációjú ózonnal kezelt vad típusú növényekben konstans marad az index. Ez úgy magyarázható, hogy az ózon okozta károsodás ellenhatásaként a transzgenikus vonalban egy fiziológiás kompenzációs válasz jelentkezett.

2

5 250 ppb O3

350 ppb O3

500 ppb O3

Vad típusú

45%*

50%

100%

Pnc1

20%

25%

100%

10 * nekrotikus léziókat mutató növények százalékos aránya

15

20

25

30

35

40

45

Ezenkívül kontrollnövényeket, kiméra Pnc1-gént tartalmazó homozigóta transzgenikus növénypopulációkat, valamint egy heterozigóta transzgenikus populációt is kezeltünk ózongõzöléssel és a nem kezelt növényekkel összehasonlítva pontszámoztuk a károsodásokat és a különféle fiziológiás válaszokat. A vizsgálat során mértük a nem modulált fluoreszcenciát, a modulált fluoreszcenciát, a klorofilltartalmat és a friss tömeget. A látható károsodások és fiziológiás válaszok alapján minden populációra felállítottunk egy olyan rangsort, amely jelzi az ózonbehatás mértékét. Minél negatívabb az értékelés, annál érzékenyebb a populáció válasza az ózonra. Míg a nem transzgenikus kontrollpopuláció és a heterozigóta transzgenikus populáció összesített pontszáma –13 volt, a két homozigóta transzgenikus populáció pontszáma –6 és –2 volt. Egyértelmû tehát, hogy a homozigóta transzgenikus populáció statisztikailag szignifikánsan jobban teljesített, mint a kontrollnövények. A szekvencialistában található 223¹as kódok: <223> pTVE467 <223> pTVE468 <223> pTVE469 <223> pTVE470 <223> pTVE496 <223> pTVE497 <223> pTVE500 <223> pTVE501 <223> pTVE502 <223> pTVE503

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás fokozott stressztûrõ képességû növény elõállítására, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: a) transzgenikus sejtek elõállítása céljából növényi sejtekbe kiméragént juttatunk, amely kiméragén az 50 alábbi, mûködõképesen összekapcsolt DNS-fragmenseket tartalmazza: i. növényekben expresszáltatható promoter; ii. a nikotinamid-adenin-dinukleotid mentõszintézis-útvonal egyik enzimét kódoló, élesztõbõl 55 vagy gombákból származó DNS-régió, amely enzim a következõk közül választott: nikotinamidáz, nikotinát-foszforibozil-transzferáz, nikotinsav-mononukleotid-adenil-transzferáz vagy nikotinamid-adenin-dinukleotid-szintetáz; 60 15

1

HU 007 625 T2

iii. a transzkripció terminálásában és a poliadenilezésben részt vevõ 3’¹végi régió; b) transzgenikus növénypopuláció elõállítása céljából regeneráljuk a transzgenikus sejteket; és c) kiválasztunk a transzgenikus növénypopulációból egy olyan növényt, amely fokozott stresszrezisztenciát mutat vagy kiválasztunk egy olyan növényt, amelyben hasonló, de nem transzgenikus növényekkel összehasonlítva, stresszkörülmények között, alacsonyabb a reaktív oxigénszármazékok szintje vagy magas marad a NADH-szint. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, amelyben a DNS-régió a következõk közül választott aminosavszekvenciát tartalmazó enzimet kódol: SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.:6, SEQ ID No.:8 vagy SEQ ID No.:10 szerinti aminosavszekvencia. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, amelyben a DNS-régió SEQ ID No.:1, SEQ ID No.:5, SEQ ID No.:7, SEQ ID No.:9 vagy SEQ ID No.:3 szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben további lépésként a növényt egy másik növénnyel keresztezzük. 5. Az 1–3. igénypontok bármelyikében ismertetett kiméragén.

5

10

15

20

25

16

2

6. Növényi sejt, amely 5. igénypont szerinti kiméragént tartalmaz. 7. Növény, amely 5. igénypont szerinti kiméragént tartalmaz. 8. A 7. igénypont szerinti növény, amely az alábbiak közül kerül kiválasztásra: gyapot, Brassica növényfajok, olajrepce, búza, gabona vagy kukorica, árpa, napraforgó, rizs, zab, cukornád, szójabab, zöldségek, cikória, saláta, paradicsom, dohány, burgonya, cukorrépa, papaya, ananász, mangó vagy Arabidopsis thaliana. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti növény, amely továbbá azzal jellemezhetõ, hogy stresszkörülmények között alacsonyabb benne a reaktív oxigénszármazékok szintje, mint ilyen kiméragént nem tartalmazó, hasonló növényben. 10. A 7. vagy 8. igénypont szerinti növény magja, amely az 5. igénypont szerinti kiméragént tartalmaz. 11. Az 5. igénypont szerinti kiméragén alkalmazása növények stresszrezisztenciájának növelésére. 12. Az 5. igénypont szerinti növény alkalmazása stresszkörülmények között lévõ növényben vagy növényi sejtben a reaktív oxigénszármazékok szintjének csökkentésére, vagy stresszkörülmények között lévõ növényben vagy növényi sejtben a NAD-szint fenntartására.

HU 007 625 T2 Int. Cl.: C12N 15/82

17

HU 007 625 T2 Int. Cl.: C12N 15/82

18

HU 007 625 T2 Int. Cl.: C12N 15/82

19

HU 007 625 T2 Int. Cl.: C12N 15/82

20

HU 007 625 T2 Int. Cl.: C12N 15/82

21

HU 007 625 T2 Int. Cl.: C12N 15/82

22

HU 007 625 T2 Int. Cl.: C12N 15/82

23

HU 007 625 T2 Int. Cl.: C12N 15/82

24

HU 007 625 T2 Int. Cl.: C12N 15/82

25

HU 007 625 T2 Int. Cl.: C12N 15/82

26

HU 007 625 T2 Int. Cl.: C12N 15/82

27

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest

(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Recommend Documents