!HU000005080T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 005 080
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C12M 1/113
(21) Magyar ügyszám: E 05 790932 (22) A bejelentés napja: 2005. 09. 27. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050790932 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1794280 A1 2006. 04. 06. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1794280 B1 2008. 12. 03.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 20041253 2004. 09. 28.
(73) Jogosult: Verdera Oy, 02270 Espoo (FI)
FI
(72) Feltalálók: VIRTANEN, Veera, 02180 Espoo (FI); JÄÄSKELÄINEN, Seppo, 00350 Helsinki (FI); SEISKARI, Pekka, 02440 LUOMA (FI) (54)
(2006.01) C12M 1/16 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06035104 PCT/FI 05/000408
(74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Reaktor és eljárás szilárd fázisú fermentációra
(57) Kivonat
HU 005 080 T2
A találmány tárgya eljárás mikroorganizmusok tenyésztésére szilárd tenyésztési tápközegen, szilárd fázisú fermentálóreaktorban, a szilárd tenyésztési tápközeg szállítására és egyenletes inokulációjára szolgáló
külsõ rázatás alkalmazása mellett. Az alkalmazott reaktor megvalósítása egy külsõ rázató hozzákapcsolásával és legalább egy inokulátumot bevezetõ bevezetésnek a külsõ falba történõ beépítésével történik.
A leírás terjedelme 8 oldal (ezen belül 2 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 005 080 T2
A találmány tárgya szilárd fázisú fermentációs reaktor és eljárás mikroorganizmusok szilárd növekedési tápközegen történõ tenyésztésére ezen reaktor alkalmazásával. A szilárd fázisú fermentáció (Solid state fermentation, SSF) jól ismert szakember számára, amely eljárás mikrobák tenyésztésre szolgál olyan tápközegen, ahol víz van impregnálva szilárd hordozóra. A szabad víz mennyisége nagyon kicsi a szubmersz (bemerülõ) folyadék fermentációhoz képest. Hagyományosan az SSF¹et olyan alkalmazásokban használták, ahol nem volt szükség szigorú aszeptikus körülményekre. Gyakran alkalmaznak terjedelmes tápközegeket, mint amilyenek a gabonaszemek, komposzt, szemcsés agyag vagy vermikulit. Azonban az új biotechnológiai termékek és mikrobiális inokulátumok elõállítása teljesen aszeptikus körülményeket kíván. Tehát szofisztikáltabb és jobban meghatározott növekedési tápközeget fejlesztettek ki és alkalmaztak, ahogy ezt a WO 9218623 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertették. Mindeddig még az új SSF alkalmazások is hagyományos folyamattechnológián alapultak: a fermentáció tenyésztési tápközegen történik, amely el van oszlatva növesztõtálcákon, amelyek egy zárt kamra polcaira vannak helyezve. Mûanyag tasakokban vagy edényekben történõ tenyésztést is alkalmaznak. Az ilyen gyakorlatok nagy mennyiségû manuális munkát igényelnek és lassúak. Ezen reaktortípusok kapacitásai kicsik a reaktorokban lévõ holttér miatt. A szilárd fázisú fermentációval történõ, szilárd tenyésztési tápközegen végzett mikrobaszaporításokra különbözõ típusú reaktorok lettek kifejlesztve, ahogy ezeket Mitchell és munkatársai bemutatták, Process Biochemistry 35 (2000) 1211–1225. Ezek közé tartozik a töltött ágyú reaktorok, forgódobú reaktorok, gáz-szilárd fluid ágyas reaktorok és az olyan reaktorok, amelyekben különbözõ típusú keverõket alkalmaznak (lásd a US 2002031822 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot). Az aszeptikus szilárd fázisú tenyészetekben, esszenciális az inokulum egyenlõ és aszeptikus elosztása a teljes tápközegben. A tálcareaktorokat gyakran sterilizációt követõen inokulálják inokulációs folyadéknak minden egyes polc felszínén lévõ tápközegre történõ permetezésével, vagy a reaktor teljes tartalmát a kívánt mikrobát tartalmazó szuszpenzióba merítik és leszárítják a felesleges folyadékot. Az összetettebb kevert töltött ágyas reaktorok drágák és bonyolult az aszeptikus mûködtetésük. A nem aszeptikus tenyészetek esetén az inokulációt sokkal könnyebb szabályozni, mivel az alkalmanként elõforduló fertõzõ mikrobák nem okoznak gondokat. Az inokulum bevihetõ szilárd vagy folyékony formában a szaporítási tápközegbe a szaporítótálcákon vagy folytonosan futószalag esetén (gombacsírázás). Néhány alkalmazás során az inokulációt szárított spóraporral végzik, amelyet levegõvel fújnak a tápközegre. A hagyományos szilárd fermentációs folyamattechnológia bonyolult és munkaigényes az alkalmazá-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
sa olyan modern biotechnológiai folyamatokban, ahol szigorú aszepszis szükséges. Tálcás reaktorokban a holttér körülbelül a bioreaktor térfogatának a fele. Ezért a töltött ágyas reaktorok esetében egy adott termékhozamhoz szükséges bioreaktorméret figyelemre méltóan kisebb, mint a tálcás bioreaktorok esetén, ami a tálcás bioreaktortípust kevésbé hatékonnyá teszi. A tálcás bioreaktorok mûködtetése szintén nagyon sok manuális munkát igényel, mivel minden egyes tálcát egyedileg fel kell tölteni, ki kell üríteni és le kell tisztítani. A CN–A–1473924 számú dokumentum aszeptikus szilárd fázisú fermentációs készüléket ismertet, ahol a készüléken belül egy rázatott szitát alkalmaznak a tenyésztési tálcák egyenlõ és szabályozott feltöltésére. Ezzel szemben a töltött ágyas bioreaktort könnyû feltölteni és üríteni a tenyésztési tápközeg be¹ és kiöntésével és a tisztítás is egyszerû. A töltött ágyas bioreaktor tehát költség, munka és térkihasználás szempontjából hatékonyabb, mint a tálcás bioreaktor. A töltött ágyas reaktorok hátránya az inokuláció volt. A modern SSF alkalmazásokra keverõs reaktorokat fejlesztettek ki, de a motorral felszerelt aszeptikus keverõeszköz nagyon drága. A mechanikai horzsolás a keverés során károsíthatja a tenyésztési tápközeg levegõs, laza szerkezetét, amennyiben egyes érzékeny hordozók vannak alkalmazva. A forgódobos reaktorok csak az olyan szilárd tenyésztési tápközeg esetén biztosítanak elégséges keverést, amelyeknek meghatározott fajtájú szabadon gördülõ szerkezetük van. Még az új szilárd fermentációkat is komplex terjedelmes tápközeg alkalmazásával végzik, mint amilyenek a különbözõ lisztekkel kiegészített gabonamagvak. A növekedési körülmények és a termék termelés optimális szabályozása elérhetõ jobban meghatározott tápközegen, amely érzékeny lehet a keverésre vagy a folyadékba történõ teljes bemerülésre. A jelen találmány célja új típusú töltött ágyas szilárd fázisú fermentációs eszköz bevezetése tiszta tenyészetek aszeptikus tenyésztésének elvégzésére. A találmány egy további célja bármilyen szilárd tenyésztési tápközeg aszeptikus és egyenletes inokulációja nagy térfogatok esetén. A találmány további célja egyszerûsített könnyen használható és költséghatékony reaktor és aszeptikus tenyésztésekre szolgáló eljárás biztosítása. Azt találtuk, hogy a reaktorban lévõ steril szilárd tenyésztési tápközeg külsõ rázatásával a tápközeg aszeptikusan és szabályozhatóan átvihetõ vagy áthelyezhetõ a reaktoron belül az inokulációs pontig és azon túl, és ezzel egyidejûleg egyenletesen beoltható tiszta tenyészettel. Az 1. ábra találmány szerinti reaktorelrendezést mutat, amely tartalmazza az (1) rázatót, a (2) inokulumbetápláló bevezetést, a (3) reaktor alsó rekeszt, a (4) reaktor felsõ rekeszt és az (5) szûrõt. A 2. ábra találmány szerinti reaktorelrendezést mutat, amely tartalmazza az (1) rázatót, a (2) inokulumbetápláló bevezetést, a
1
HU 005 080 T2
(6) tápközeg-sterilizáló egységet, a (7) levezetõcsövet és a (8) tenyésztõedényt. A találmány szerinti eljárást a fõigénypontban definiáltuk. A találmány szerinti eljárás szerint szilárd fázisú fermentor (SSF) reaktorban a szilárd tenyésztési tápközeg, amely mikroorganizmusok tenyésztésére szolgál, külsõ rázatás alkalmazásával továbbítódik a kezdeti nyugalmi helyétõl az inokulációs pontig és azon túl. Amennyiben szabályozott szilárd növekedési tápközeg tömegáram halad át az inokulációs ponton, akkor egyenletesen és folytonosan végezhetõ az inokuláció. A szilárd tenyésztési tápközeg tartalmaz különbözõ szerves és szervetlen hordozóanyagokat, amelyek átvihetõek rázatással. A szervetlen hordozóanyagok elõnyösen olyanok, mint a vermikulit, perlit, amorf szilícium-dioxid vagy a szemcsés agyag. Az ilyen típusú anyagokat gyakran alkalmazzák, mert laza, levegõs szerkezetet hoznak létre, amelynek elõnyösen a szemcsemérete 0,5–50 mm és nagy a felülete. A szerves hordozóanyagok elõnyösen olyanok, mint a gabonamagvak, korpa, fûrészpor, tõzeg vagy faforgács. Továbbá a szilárd tenyésztési tápközeg tartalmazhat kiegészítõ tápanyagokat a mikroorganizmusok számára. Jellemzõen ezek közé tartoznak szénforrások, mint amilyenek a szénhidrátok (cukrok, keményítõ), fehérjék vagy zsírok, nitrogénforrások szerves formában (fehérjék, aminosavak) vagy szervetlen nitrogénsók (ammónium- és nitrátsók, karbamid), nyomelemek vagy egyéb növekedési faktorok (vitaminok, pH¹szabályozók). A szilárd tenyésztési tápközeg tartalmazhat segédanyagokat a szerkezeti összetételhez, mint amilyenek a szuperabszorbensek, például a poliakrilamidok. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a szilárd tenyésztési tápközeget a tápközeg sterilezési egységben sterilezzük ex situ. Például rázatott szállítócsiga-edény (amint azt a 2. ábrán mutatjuk) leválasztható a reaktortestrõl, feltölthetõ szilárd tenyésztési tápközeggel és sterilizálható például egy autoklávban, ami után újra visszacsatolható a reaktortesthez a mûködtetés megkezdése elõtt (rázatás és inokuláció). Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint a szilárd tenyésztési tápközeg a tápközeg sterilezõegységben van sterilezve in situ, például gõz segítségével az inokuláció megkezdése elõtt. A tenyészteni kívánt és a szilárd tenyésztési tápközegre inokulált mikroorganizmusok közé tartoznak a gombák, ideértve az élesztõket, például mint amilyen a Phlebiopsis gigantea, Gliocladium fajok, Nectria pityrodes, Chondrostereum purpureum, Pseudozyma flocculosa, Coniothyrium minitans, Trichoderma fajok, Metarrhizium fajok, Verticillium fajok vagy Beauveria bassiana. Elõnyösen a gombák a következõek: Phlebiopsis gigantea, Gliocladium catenulatum, Nectria pityrodes vagy Chondrostereum purpureum. A gombák tartalmazzák továbbá az ehetõ gombákat, mint amilyen az Agaricus bisporus, Lentinus edodes vagy Pleurotus ostreatus. A találmány szerint a mikroorganizmus lehet
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
baktérium, mint amilyen a Streptomyces fajok, Bacillus thuringiensis, egyéb Bacillus fajok vagy Pseudomonas fajok, elõnyösen Streptomyces fajok. Továbbá nematódák is alkalmazhatóak a találmány szerinti tenyésztett mikroorganizmusként. Az inokulumot a találmány szerinti reaktorba folyékony vagy szilárd formában tápláljuk be, elõnyösen folyékony formában. Amennyiben folyékony tápközeget alkalmazunk inokulumként, akkor lehet például szuszpenzió formájában, amelynek nagyon kicsi a szemcsemérete, ami lehetõvé teszi porlasztótechnikák alkalmazását. Elõnyösen a folyékony tápközeget a szilárd tenyésztési tápközeg folytonos áramára permetezzük, amint az elhalad az inokulációs pontnál. Amennyiben az inokulum szilárd alakban van, akkor a szilárd tenyésztési tápközeghez hasonló módon, rázatással juttatható el az inokulációs ponthoz. Elõnyösen a szilárd inokulumot csiga, rázató- vagy szállítószalag alkalmazásával szállítjuk. Ez biztosítja, hogy a mikroorganizmus egyenlõen aszeptikusan szállítható a tenyésztéshez. A külsõ rázatást hagyományos rázatóeszközökkel érjük el a reaktortest külsõ részéhez rázatókészülék hozzákapcsolásával. Elõnyösen a rázatást külsõ elektromos forgóvibrátorok, mágneses, hidraulikus vagy pneumatikus vibrátorok alkalmazásával hozzuk létre. Legelõnyösebben elektromos forgóvibrátort alkalmazunk. A találmány szerinti reaktort a fõigénypontban definiáltuk. Számos különbözõ szerkezet létezhet a találmány szerinti funkció megvalósítására, például a rázatóeszközök) elhelyezése és a reaktor rekeszek vagy egységek. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti reaktortest legalább négy részt tartalmaz, ahogy azt az 1. ábrán mutatjuk. Két fõ rekesz van egy felsõ rekesz (4), és egy alsó rekesz (3), amelyek egymástól egy permeábilis szeparátorral (5) vannak elválasztva, és a reaktortest külsõ falához egy külsõ rázató (1) van hozzákapcsolva. Legalább egy bevezetõ (2) kapcsolódik az alsó rekeszhez az inokulációhoz. Ez a reaktortest adott esetben forgatható és fejre állítható és így tartalmaz eszközt a forgatáshoz. A reaktorrészek mérete és alakja változhat a tenyésztési szükségletektõl és az alkalmazott anyagoktól függõen. Az alakot nem szükséges jól körülhatárolható alakra korlátozni, hanem lehet hajlítható vagy mûanyagszerû is. Elõnyösen az edények alakja hengeres, szögletes vagy kúpos. A találmány szerinti a permeábilis szeparátor elõsegíti a szilárd tenyésztési tápközeg szabályozott és homogén áramlását az inokulációs pont felé a rázató segítségével, miután a reaktorrekesz fel lett töltve és fejre lett állítva. A permeábilis szeparátor alakja változhat a szilárd tenyésztési tápközegnek a reaktoron keresztüli szükséges áramlási sebességétõl függõen. Elõnyösen a permeábilis szeparátor szûrõ vagy perforált lemez. A szeparátor résmérete a szilárd tenyésztési tápközeg
1
HU 005 080 T2
szerkezetétõl és szemcseméretétõl és alakjától függ és elõnyösen 5–50 mm. A permeábilis szeparátor lehet statikus, amely elõre meghatározott helyen rögzítve van, ezzel a reaktorrekeszeket két meghatározott térfogatra osztja egy (4) felsõ rekeszre és egy (3) alsó rekeszre. Ezen adott elõnyös megvalósítási mód esetén a reaktor mûködtetéséhez szükséges, hogy a reaktortestet fejre állítsuk a reaktor feltöltése és a benne lévõ szilárd növekedési tápközeg sterilezését követõen. A megfordítást vagy manuálisan vagy automatikusan egy emelõszerkezet alkalmazásával végezzük. További alternatív lehetõség a mozgó szeparátor, amely esetben a (4) rekesz és a (3) rekesz térfogataránya állítható. A szeparátor mozgatható például kívülrõl forgatható forgócsavarhoz történõ rögzítésével. Egy további elõnyös megvalósítási mód esetén a találmány szerinti reaktortest tartalmaz a (6) leválasztható szilárd tenyésztésitápközeg-sterilizáló egységhez kapcsolt (1) külsõ rázatót, amely a (7) lejövõ csõhöz van kapcsolva. Ezen reaktortest megfelelõ részéhez kapcsolódik legalább egy (2) inokulátumbetápláló bevezetés a szilárd tenyésztési tápközeg egyenlõ és folytonos inokulációjának elérése érdekében. A (7) lejövõ csõ a (8) tenyésztési edényhez kapcsolódik, ahol történik a kultiválás az inokulálást követõen. Elõnyösen a lejövõ csõ hajlékony, hogy alkalmazkodjon a rázató, tápközeget sterilezõ egység mozgásához. Elõnyös a leválasztható (6) szilárd tenyésztésitápközeg-sterilezõ egység, mivel a sterilezés során minimális a holt térfogata. Amennyiben sterilezésre leválasztjuk a reaktorról, akkor ezt követõen aszeptikusan újra hozzákapcsoljuk a reaktorhoz. Elõnyösen a (6) tápközeg-sterilezõ egység rázatott szállítócsiga-edény. A reaktortestegységek alakja változó lehet, de elõnyösen hengeres, szögletes vagy kúpos. Mind a mai napig nem voltak elérhetõek kereskedelmi léptékû aszeptikus töltött ágyas bioreaktorok. A legnagyobb megoldandó feladat a homogén inokuláció biztosítása volt, különösen olyan tápközeg esetén, amely nem jól tolerálja az erõs keverést. A találmány szerinti reaktor és alkalmazási eljárása képes leküzdeni ezeket a problémákat, amelyek a szilárd tenyésztési tápközeg beható mozgatásával járnak. A reaktoron belüli keverõeszköz a keverõ körüli területen a levegõztetõ levegõ csatornázásának a kockázatát váltja ki. Az erõs keverõ a tenyésztési tápközeg mechanikai formaváltozását válthatja ki (például a lazaság elvesztését). A jelen találmány szerinti a szilárd tenyésztési tápközeg aszeptikusan továbbítódik egy szûrõn keresztül az egyik edénybõl egy másikba egy külsõ rázatóval történõ rázatás révén. Ezzel egyidejûleg történik az inokulumnak a szilárd tenyésztési tápközegre juttatása. Ez az eljárás egyszerû és aszeptikus és nem szükséges hozzá a tenyésztési tápközeg keverése. A találmányt a következõ példákban illusztráljuk, anélkül, hogy korlátoznánk az igénypontokban definiált oltalom terjedelmét.
5
10
15
20
25
30
35
40
2
1. példa Phlebiopsis giganteát (Rotstop, Verdera Oy védjegye) tenyésztettünk az 1. ábrán bemutatott reaktor elrendezés alkalmazásával szilícium-dioxid-alapú tenyésztési tápközegen töltött ágyas szilárd fázisú reaktor alkalmazásával. A P. giganteának megfelelõ tápoldatot a következõ módon állítottuk elõ: 9 kg kondenzált desztillálógabonát (Altia Oyj) oldottunk fel 33 kg csapvízben. Az oldatot 15 kg amorf szilícium-dioxid-porra (Degussa) impregnáltuk tésztakeverõben végzett 3 perces keveréssel, hogy szemcsés tenyésztési tápközeget alakítsunk ki. 700 g mészkövet adtunk hozzá a keverés elõtt a pH szabályozásának céljából. A fermentálóreaktort feltöltöttük a tenyésztési tápközeggel a statikus szûrõig, amelynek résmérete 1 cm volt, és a reaktor közepén helyezkedett el. A reaktort lezártuk és steril szûrõket kapcsoltunk a bevezetõnyílásokhoz. A reaktort autoklávban sterileztük egy órát, 121 °C hõmérsékleten. Az autoklávozást követõen a reaktort éjszakán át hagytuk lehûlni. P. gigantea inokulumot tenyésztettünk rázatott edényekben malátakivonat-oldatban 4 napig 28 °C hõmérsékleten. Az inokulumot homogenizáltuk, mielõtt áthelyeztük volna a reaktorba. A szilárd tenyésztési tápközeget manuálisan inokuláltuk a reaktor fejrefordításával és külsõ pneumatikus görgetõ rázatóberendezéssel (Netter Vibrationstechnik GmbH) végzett rázatással. A rázatás hatására a szilárd tápközeg egyenletesen átesett a szûrõn. Egy fúvókán keresztül a lehulló tápközegre permeteztük aszeptikusan az inokulumoldatot. 100 ml inokulumot permeteztünk 4 kg szilárd tápközegre körülbelül 5 ml/s sebességgel üreges kúpfúvóka alkalmazásával. A gombát 10 napig tenyésztettük 28 °C hõmérsékleten és 0,3 l/min/kg tenyésztési tápközeg levegõztetési sebességgel. A tenyésztés befejezésekor a gomba növekedett és sporulált mindenhol a teljes tápközeg. A tápközeget eltávolítottuk a reaktorból és szobahõmérsékleten szárítottuk három napig szárítópolcokon. A szárított tápközeg 1·107 cfu/g (cfu=kolónialétrehozó egység) P. giganteát tartalmazott. A szárított termék életképessége olyan nagy volt, mint a hagyományos SSF eljárásokkal elõállított termékeké.
45 2. példa P. giganteát tenyésztettünk a 2. ábrán bemutatott töltött ágyas szilárd fázisú fermentálóreaktor alkalmazásával. A P. gigantea szilárd tenyésztési tápközegét az 1. 50 példában ismertetett módon állítottuk elõ. Csigás töltõedényt tartalmazó, rázatott tápközegsterilizáló egységet töltöttünk fel 40 kg tenyésztési tápközeggel. Az edényt lezártuk és autoklávban sterilez55 tük 90 percet, 121 °C hõmérsékleten és éjszakán át hagytuk lehûlni. A töltõedényt rázatóalapra (Tärylaite Oy) rögzítettük, amely forgó elektromos rázatókkal volt felszerelve és aszeptikus módon volt rugalmas lejövõ alkalmazásával egy steril hengeres tenyésztõedény60 hez kapcsolva. A töltõedényt rázattuk, aminek a hatá4
1
HU 005 080 T2
sára a belül lévõ tenyésztési tápközeg fokozatosan áramlott felfelé a töltõcsiga mentén. Az inokulumot az 1. példában ismertetett módon tenyésztettük. A szilárd tenyésztési tápközeget a következõ módon inokuláltuk: 2 liter homogenizált inokulumot permeteztünk 300 ml/perc sebességgel egy üreges kúpfúvókával a tápközegre, amely a lejövõ csövön keresztül esett a tenyésztõedénybe. Az inokulumot a lejövõ csõ felsõ végébe permeteztük. Így a teljes tápközeget egyenletesen inokuláltuk. A végtermék tenyésztését, betakarítását és szárítását az 1. példában ismertetett módon végeztük. A szárított tápközeg 1·107 cfu/g P. giganteát tartalmazott.
5
10
15 3. példa Streptomyces fajt (Mycostop, a Verdera Oy védjegye) tenyésztettünk az 1. és 2. példákban ismertetett módon szilárd tenyésztési tápközegként 0,62 kg kukoricalekvár szárazanyagot („corn steep solids”, css), 0,62 kg laktózt, 0,62 kg mészkövet, 12 kg amorf szilícium-dioxidot alkalmazva és 28,8 kg csapvízzel. A baktériumot 7 napig tenyésztettük 28 °C hõmérsékleten. A szárított tápközeg 6·108 cfu/g és 1·109 cfu/g Streptomycest tartalmazott, amely rendre az 1. és 2. példa szerint lett elõállítva. 4. példa Gliocladium catenulatumot (GlioMix, a Verdera Oy védjegye) tenyésztettünk az 1. példában ismertetett módon szilárd tenyésztési tápközegként 0,53 kg kondenzált desztillációs gabonát, 60 g mészkövet, 1,5 kg amorf szilícium-dioxidot alkalmazva és 3,4 kg csapvizet. A gombát 18 napig tenyésztettük 22 °C hõmérsékleten. A szárított tápközeg 3·108 cfu/g G. catenulatumot tartalmazott. 5. példa P. giganteát tenyésztettünk a 2. ábrán bemutatott töltött ágyas szilárd fázisú fermentációs reaktor alkalmazásával, amely reaktor két különbözõ fajta tenyésztõedénnyel és inokulumbetápláló bevezetéssel volt felszerelve. A P. gigantea szilárd tenyésztési tápközegét az 1. példában ismertetett módon állítottuk elõ. Csigás töltõedényt tartalmazó rázatott tápközeget sterilezõ egységet 70 kg tenyésztési tápközeggel töltöttünk fel. Az edényt sterileztük és a 2. példában ismertetett módon hozzákapcsoltuk egy rázatóalaphoz. Két különbözõ típusú tenyésztési edényt aszeptikusan hozzákapcsoltunk a sterilezõegységhez rugalmas lejövõ csõ alkalmazásával; szögletes doboz alakú edények, amelyeknek a magasság:szélesség:mélység arányaik a következõk voltak: 1. 1:1:1 és 2. 10:6:3. A tenyésztõedények az 1. esetben a 2. példában ismertetett módon lettek inokulálva és a 2. esetben széles szögû lapos permetezõfúvóka alkalmazásával, amely a lefolyócsõ alsó végéhez volt helyezve a tenyésztési edény belül, lettek inokulálva.
20
25
2
Az összes ismertetett konfigurációval nagyon egyenletes szilárd tenyésztési tápközeg inokulációt értünk el. A végtermék tenyésztését, betakarítását és szárítását az 1. példában ismertetett módon végeztük. A szárított tápközeg körülbelül 1·107 cfu/g P. giganteát tartalmazott az összes tenyésztési szakasz esetén. Referenciapélda Phlebiopsis giganteát (Rotstop, a Verdera Oy védjegye) tenyésztettünk szilícium-dioxid-alapú szilárd tenyésztési tápközegen, az 1. példában ismertetett módon, hengeres töltött ágyas szilárd fázisú reaktorban, amely spirális alakú szalagkeverõvel volt felszerelve és alulról egy bevezetéssel a reaktortérbe. A reaktor nyomás alatti tartály volt és in situ sterilizáltuk gõzzel 121 °C hõmérsékleten. A sterilezést és a lehûlést követõen a reaktort beoltottuk a tenyésztési tápközegre történõ inokulumöntéssel egy a reaktor tetején elhelyezkedõ bevezetõnyíláson keresztül és a keverõ egyidejû bekapcsolásával. A tenyésztési tápközeg a megfigyelésünk szerint nagyon sérülékeny volt a keverés esetén. 5 perc elteltével elveszett a laza levegõs szerkezete az inokuláció során és a kapott termék tésztaszerû lett. Az így kapott anyag további feldolgozása nem volt lehetséges.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 30
35
40
45
50
55
60 5
1. Eljárás mikroorganizmusok tenyésztésére szilárd tenyésztési tápközegen szilárd fázisú fermentáló(SSF) reaktorban, azzal jellemezve, hogy az eljárás tartalmazza a következõ lépéseket: a) a szilárd tenyésztési tápközeg külsõ rázatás általi átvitele, és b) az átvitel során a szilárd tenyésztési tápközeg inokulációjának egyenletes elvégzése tiszta tenyészettel. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inokuláció aszeptikusan van végezve. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szilárd tenyésztési tápközeg szerves hordozókat és/vagy szervetlen hordozókat tartalmaz. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerves hordozók a gabonamagvak, korpa, fûrészpor, tõzeg és faforgács alkotta csoportból választottak. 5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szervetlen hordozók a vermikulit, perlit, amorf szilícium-dioxid és szemcsés agyag alkotta csoportból választottak. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyészteni kívánt mikroorganizmus gomba, ideértve az élesztõket, baktériumokat vagy nematódákat. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rázatás külsõ elektromos rotációs rázatókkal, mágneses, hidraulikus vagy pneumatikus rázatókkal van létrehozva.
1
HU 005 080 T2
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inokulációhoz alkalmazni kívánt mikroorganizmust a szilárd tenyésztési tápközegre folyékony vagy szilárd formában van rátáplálva. 9. Az 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus folyékony inokulumát szuszpenzióként permetezzük fúvóka alkalmazásával. 10. Az 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus szilárd inokuluma a szilárd tenyésztési tápközegre csiga, rázató vagy szalagos szállítószalag alkalmazásával van rátáplálva. 11. Szilárd fázisú fermentációra (SSF) megfelelõ reaktor, azzal jellemezve, hogy a reaktor tartalmaz a) külsõ rázatót (1), amely a külsõ reaktortesthez van kapcsolva a reaktortest és a benne lévõ tartalom hatásos rázatására az 1. igénypont szerinti tartalmak átvitele során, és b) legalább egy inokulációt betápláló bevezetést (2) a reaktortesthez kapcsolva. 12. A 11. igénypont szerinti reaktor, azzal jellemezve, hogy a fermentáció aszeptikusan van végezve. 13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti reaktor, azzal jellemezve, hogy a reaktortest tartalmaz a) két rekeszt, egy felsõ rekeszt (4) és egy alsó rekeszt (3), b) a két rekeszt elválasztó áteresztõszeparátort (5), és c) a reaktortest külsõ részéhez kapcsolódó külsõ rázatót (1), és
5
10
15
20
25
6
2
d) az alsó rekeszhez kapcsolt legalább egy inokulációt betápláló bevezetést (2), e) adott esetben forgatóeszközt a reaktortest fejreállítására. 14. A 13. igénypont szerinti reaktor, azzal jellemezve, hogy az áteresztõszeparátor szûrõ vagy perforált lemez. 15. A 11. vagy 12. igénypont szerinti reaktor, azzal jellemezve, hogy a reaktortest tartalmaz a) külsõ rázatót (1), b) leválasztható szilárd tenyésztési tápközeget sterilezõ egységet (’6), b) lejövõ csövet (7), c) tenyésztõedényt (8), és d) legalább egy inokulációt betápláló bevezetést (2). 16. A 15. igénypont szerinti reaktor, azzal jellemezve, hogy a legalább egy inokulációt betápláló bevezetés a sterilezõegység (6) és a tenyésztõedény (8) között van a szilárd tenyésztési tápközeg átvitele során történõ inokulumbetáplálásra. 17. A 15. igénypont szerinti reaktor, azzal jellemezve, hogy a leválasztható szilárd tenyésztési tápközeget sterilezõ egység (6) rázatott csigás töltõedény. 18. A 15. igénypont szerinti reaktor, azzal jellemezve, hogy a lejövõ csõ (7) rugalmas a szabad rázatás lehetõvé tételéhez. 19. Külsõ rázatás alkalmazása szilárd tenyésztési tápközeg SSF reaktoron belüli átvitelére és egyenletes inokulációjára tiszta tenyészet tenyésztésére.
HU 005 080 T2 Int. Cl.: C12M 1/113
7
HU 005 080 T2 Int. Cl.: C12M 1/113
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
