(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000003923T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 003 923

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61L 27/34

(21) Magyar ügyszám: E 04 723595 (22) A bejelentés napja: 2004. 03. 26. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040723595 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1608414 A1 2004. 10. 07. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1608414 B1 2008. 07. 09.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 20030007141 2003. 03. 28.

(73) Jogosult: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH, Heidelberg (DE)

EP

(72) Feltalálók: Pohl, Jens, Hambrücken (DE); Bechtold, Rolf, Heidelberg (DE); Kruse, Michael, Mainz (DE)

(54)

(2006.01) A61L 27/56 (2006.01) C07K 14/475 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04084965 PCT/EP 04/003238

(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest Javított oszteoinduktív anyagok

(57) Kivonat

HU 003 923 T2

A találmány tárgyát javított oszteoinduktív anyagok képezik, amelyek mátrixanyagokat és morfogén fehérjéket tartalmaznak, ahol az adott helyzettõl függõen a fehérjék lehetnek dimer és monomer fehérjék. A talál-

mány szerinti oszteoinduktív anyagok javított tulajdonságokkal rendelkeznek. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások a találmány szerinti, javított oszteoinduktív anyagok elõállítására.

A leírás terjedelme 34 oldal (ezen belül 11 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 003 923 T2

A találmány tárgyát javított oszteoinduktív anyagok képezik, amelyek mátrixanyagokat és morfogén fehérjéket tartalmaznak, ahol az adott helyzettõl függõen a fehérjék lehetnek dimer és monomer fehérjék. A találmány szerinti oszteoinduktív anyagok javított tulajdonságokkal rendelkeznek. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások a találmány szerinti, javított oszteoinduktív anyagok elõállítására. A 6,118,043 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás tárgya csonthelyettesítõ anyag, amely egy vagy több olyan polipeptidet tartalmaz, amely fibroblaszt növekedési faktorok biológiai hatásával rendelkezik egy porózus mátrixban. A TGF-b-szupercsaládhoz [Kingsley, Genes and Development 8, 133–146 (1994), valamint a leírásban idézett hivatkozások] tartozó számos növekedési faktor jöhet szóba igen sokféle, olyan orvosi kezelési eljárásokban és alkalmazásokban, amelyekben különös figyelem irányul sejtproliferációra és szövetképzõdésre, ideértve a sebgyógyulást és a szövet-újjáalakítást. Ilyen növekedési faktorok konkrétan a TGF¹b tagjai [transzformáló növekedés faktor, vö. például Roberts és Spom, „Handbook of Experimental Pharmacology”, 95, 419–472. oldal, szerk. Sporn és Roberts (1990)], a DVR-csoport [Hötten és munkatársai, Biochem. Biophys. Res. Comm. 206, 608–613 (1995), és a hivatkozásban idézett további irodalom], beleértve a BMP-ket [csont morfogén fehérje, vö. például Rosen és Thies, „Growth Factors in Perinatal Development”, 39–58. oldal, szerk. Tsang, Lemons és Balistreri (1993)], és GDF¹ek [növekedési differenciálódási faktorok], az inhinbin/aktivin [vö. például Vale és munkatársai, „The Physiology of Reproduction”, második kiadás, 1861–1878. oldal, szerk. Knobil és Neill (1994)] és a GDNF-fehérjecsalád [Rosenthal, Neuron 22, 201–203 (1999); Airaksinen és munkatársai, Mol. Cell. Neurosci. 13, 313–325 (1999)] tagjait tartalmazzák. Bár a TGF-b-szupercsalád tagjai nagymértékû aminosavhomológiát mutatnak a fehérje érett részében, különösen 7 konzervatív cisztein tekintetében, igen változatosak is egzakt funkcióikban. A családhoz tartozó egyegy növekedési faktor sokféle funkciót képes ellátni egyidejûleg, így alkalmazásuk különféle orvosi alkalmazásokban lehet érdekes. Az említett multifunkcionális fehérjék közül néhány túlélést elõsegítõ hatásokat képes kifejteni neuronokra olyan funkciók mellett, mint például különféle sejttípusok proliferációjának és differenciálódásának szabályozása [Roberts és Spora, mint fent; Sakurai és munkatársai, J. Biol. Chem. 269, 14118–14122 (1994)]. Így például TGF-b¹ra in vitro kimutatták, hogy trofikus hatásokat képes kifejteni embrionális motoros és szenzoros neuronokra [Martinou és munkatársai, Dev. Brain Res. 52, 175–181 (1990), és Chalazonitis és munkatársai, Dev. Biol. 152, 121–132 (1992)]. Továbbá kimutattak dopaminerg neuronok túlélését elõsegítõ hatásokat TGF-b-1, –2, –3, aktivin¹A és GDNF esetén, ami a TGF-b-szupercsalád tagjaihoz szerkezetileg hasonló fehérje [Krieglstein és munkatársai, EMBO J. 14, 736–742 (1995)]. A TGF-b-szupercsalád fehérjéinek elõfordulása különbözõ szöveti fázisokban és fejlõdési állapotokban

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

megfelel az egzakt funkcióikban fennálló különbségeknek, valamint a célhelyeknek, életciklusnak, segédfaktorok iránti igényeknek, a szükséges celluláris fiziológiai környezetnek és/vagy lebomlás elleni rezisztenciájuknak. A TGF-b-szupercsalád fehérjéi homodimerként vagy egyetlen diszulfidkötéssel rendelkezõ, heterodimerként fordulnak elõ a természetben. Azonban felismerték, hogy a dimer kialakulásáért felelõs ciszteint nem tartalmazó fehérje is megtartotta a dimer, vad típusú fehérjék jellemzõ tulajdonságait, legalábbis lényegi mértékben. Ilyen formák elõnyösebbek lehetnek a dimer fehérjékkel szemben, különösen akkor, ha könnyû az elõállításuk, azaz reprodukálhatóan, egyszerûen és olcsón termeltethetõk géntechnológiai módszerekkel. Ilyen fehérjéket és elõállításukat, valamint alkalmazásukat leírták a WO 01/11041 számú nemzetközi közzétételi iratban. Elsõsorban csonttal összefüggõ alkalmazásokban, mint például csontdefektusok (hiányok) kijavítása vagy csontregenerálás esetén, betegségek, például trauma vagy operáció okozta csontdefektusok vagy degeneratív csontdefektusok kitöltése esetén stb., de porc, kötõszövet, például ín vagy ínszalag, fogorvosi, neurológiai, angiogén vagy más alkalmazásokban is hasznos kombinálni morfogén fehérjéket mátrixanyagokkal. Ilyen mátrixanyagok, amelyeket morfogén fehérjékkel burkolnak vagy áztatnak, olyan eszközt biztosítanak, amelybõl folyamatosan felszabadul morfogén fehérje, és ezáltal állandó stimulációt biztosít progenitorsejteknek differenciálódáshoz és az elpusztult szövet új sejtjeinek kialakulásához. Továbbá a mátrixanyag kedvezõ környezetet biztosíthat proliferáló sejtek adhéziójához és benövéséhez, és ezáltal felgyorsítja új szövet, különösen csontszövet képzõdését. Morfogén fehérjék mátrixanyagokkal kombinációban történõ ilyen alkalmazásait alaposan körülírták és közölték, például a WO 98/21972 számú nemzetközi közzétételi iratban. Azonban még szükség van olyan anyagokra, amelyek nagy mennyiségû morfogén fehérjét tartalmaznak olyan formában, amely biztosítja a fehérje folyamatos felszabadulását. Mátrixanyagok homogén és maximális mértékû burkolása morfogén fehérjékkel döntõ faktor sikeresen alkalmazható oszteoinduktív anyagokkal szemben, és egy megoldandó cél. A fõ probléma morfogén fehérjék korlátozott oldhatósága. A technika jelenlegi állása szerint elõállított oszteoinduktív anyagok gyakran csak kis mennyiségû aktív morfogén fehérjét tartalmaznak, mert a fehérjék nem stabilak, vagy nem egyenletesen kötõdnek a mátrix felszíneihez. Különösen porózus mátrixanyagok belsõ felületei burkolódnak nem kielégítõen. Tehát a találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tûztük ki javított oszteoinduktív anyagok elõállítását gyógyászati területen történõ alkalmazásra, és különösen eljárások kidolgozását olyan mátrixanyagok elõállítására, amelyek egyenletesen vannak burkolva morfogén fehérjékkel. Ezt a kérdést megoldottuk a találmány szerinti megoldásban, a leírásban és a csatolt szabadalmi igény-

1

HU 003 923 T2

pontokban ismertetett, oszteoinduktív anyagok elõállításával. A félreértések és kétértelmû kifejezések elkerülése céljából a leírásban gyakran használt néhány kifejezést az alábbiakban definiálunk és példákkal szemléltetünk. A „morfogén fehérje” kifejezés a leírásban a TGF-bszupercsaládhoz tartozó fehérjét, vagy biológiailag aktív részét vagy variánsát jelenti. A kifejezésen értünk minden olyan fehérjét, amely a TGF-b-szupercsalád fehérjéire jellemzõ, 7 cisztein régiót tartalmazza, függetlenül attól, hogy ebben a doménben jelen lévõ, a dimer kialakulásáért felelõs cisztein helyettesítve van¹e más aminosavval, vagy nem. A TGF-b-szupercsalád érdekes tagjai vagy biológiailag aktív részei vagy variánsai közé tartozik például a TGF-b-fehérjeszerû TGF-b1, TGF–b2, TGF-b3, TGF-b4, TGF-b5 [5,284,763 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; EP 0376785 számú szabadalmi irat; 4,886,747 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; DNA 7, 1–8 (1988); EMBO J. 7, 3737–3743 (1988); Mol. Endo. 2, 1186–1195 (1988); J. Biol. Chem. 265, 1089–1093 (1990)], OP1¹, OP2- és OP3-fehérjék (5,011,691, 5,652,337 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások; WO 91/05802 számú nemzetközi közzétételi irat), valamint BMP2, BMP3, BMP4 [WO 88/00205 számú nemzetközi közzétételi irat, 5,013,648 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; és WO 89/10409 számú nemzetközi közzétételi irat; Science 242, 1528–1534 (1988)], BMP5, BMP6 és BMP7 (OP1) [Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 9841–9847 (1990), WO 90/11366 számú nemzetközi közzétételi irat], BMP8 (OP2) (WO 91/18098 számú nemzetközi közzétételi irat), BMP9 (WO 93/00432 számú nemzetközi közzétételi irat), BMP10 (WO 94/26893 számú nemzetközi közzétételi irat), BMP11 (WO 94/26892 számú nemzetközi közzétételi irat), BMP12 (WO 95/16035 számú nemzetközi közzétételi irat), BMP13 (WO 95/16035 számú nemzetközi közzétételi irat), BMP15 (WO 96/36710 számú nemzetközi közzétételi irat), BMP16 (WO 98/12322 számú nemzetközi közzétételi irat), BMP3b [Biochem. Biophys. Res. Comm. 219, 656–662 (1996)], GDF1 [WO 92/00382 számú nemzetközi közzétételi irat, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 4250–4254 (1991)], GDF8 (WO 94/21681 számú nemzetközi közzétételi irat), GDF10 (WO 95/10539 számú nemzetközi közzétételi irat), GDF11 (WO 96/01845 számú nemzetközi közzétételi irat), GDF5 (CDMP1, MP52) [WO 95/04819; WO 96/01316; WO 94/15949; WO 96/14335 és WO 93/16099 számú nemzetközi közzétételi iratok, és Nature 368, 639–643 (1994)], GDF6 (CDMP2, BMP13) (WO 95/01801, WO 96/14335 és WO 95/16035 számú nemzetközi közzétételi iratok), GDF7 (CDMP3, BMP12) (WO 95/01802 és WO 95/10635 számú nemzetközi közzétételi irat), GDF14 (WO 97/36926 számú nemzetközi közzétételi irat), GDF15 (WO 99/06445 számú nemzetközi közzétételi irat), GDF16 (WO 99/06556 számú nemzetközi közzétételi irat), 60A [Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 9214–9218 (1991)], DPP [Nature 325, 81–84 (1987)], Vgr¹1 [Proc. Natl. Acad.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

Sci. 86, 4554–4558 (1989)], Vg¹1 [Cell 51, 861–867 (1987)], dorsalin [Cell 73, 687–702 (1993)], MIS [Cell 45, 685–698 (1986)], pCL13 (WO 97/00958 számú nemzetközi közzétételi irat), BIP (WO 94/01557 számú nemzetközi közzétételi irat), inhibin¹a, aktivin-bA és aktivin-bB (EP 0222491 számú szabadalmi irat), aktivinbC (MP121) (WO 96/01316 számú nemzetközi közzétételi irat), aktivin-bE és GDF12 (WO 96/02559 és WO 98/22492 számú nemzetközi közzétételi iratok), aktivin-bD [Biochem. Biophys. Res. Comm. 210, 581–588 (1995)], GDNF [Science 260, 1130–1132 (1993), WO 93/06116 számú nemzetközi közzétételi irat], neurturin [Nature 384, 467–470 (1996)], persephin [Neuron 20, 245–253 (1998); WO 97/33911 számú nemzetközi közzétételi irat], artemin [Neuron 21, 1291–1302 (1998)], Mic¹1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11514–11519 (1997)], univin [Dev. Biol. 166, 149–158 (1994)], ADMP [Development 121, 4293–4301 (1995)], nodal [Nature 361, 543–547 (1993)], Screw [Genes Dev. 8, 2588–2601 (1994)]. A „morfogén fehérjék” kifejezésen értjük továbbá a TGF-b-szupercsaládhoz tartozó, természetesen elõ nem forduló, tehát mesterségesen termeltetett fehérjéket, például a TGF-b-szupercsaládhoz tartozó olyan fehérjéket, amelyekbõl hiányzik a dimer képzõdéséért felelõs cisztein, a WO 01/11041 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint, amely fehérjék elõnyösen monomer formában fordulnak elõ, vagy csak egy további monomerrel létesített, gyenge asszociációk formájában, nem kovalens asszociációk, például hidrogénhíd-kötések kialakulása miatt. A „morfogén fehérjék” kifejezésen értünk más olyan alkalmas fehérjéket is, amelyek biológiailag aktív, bioszintetikus konstrukciók, idetartoznak két vagy több, ismert morfogén fehérje szekvenciájából kiindulva tervezett fehérjék. Bioszintetikus konstrukciókat leírnak például az 5,011,691 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (például COP-1, COP-3, COP-4, COP5, COP¹7 és COP¹16). A TGF-b-szupercsalád tagjainak többsége olyan morfogén fehérje, amely hasznosan alkalmazható olyan kezelésekben, ahol sejtek vagy progenitorsejtek differenciálódásának és proliferációjának szabályozására irányul a figyelem. Ez károsodott és/vagy beteg szövet, például a csontvázat alkotó (csont, porc) szövet, kötõszövet, periodontális (fog körüli) vagy fogszövet, idegszövet, a szenzoros rendszert felépítõ szövet, máj¹, hasnyálmirigy¹, szív¹, ér¹, bõr- és veseszövet, méh- vagy pajzsmirigyszövet stb. pótlását eredményezheti. Morfogén fehérjéket gyakran alkalmaznak fekélyes vagy gyulladásos szövetkárosodás kezelésére és bármilyenfajta seb gyógyítására, például fekélyek, égések, sérülések és bõrátültetések gyógyulásának fokozására. A „biológiailag aktív része vagy variánsa” kifejezés a leírásban olyan fehérjefragmenseket jelent, amelyek megtartották aktivitásukat, prekurzor fehérjéket, amelyeken például hasítás történik az aktivitás helyén az érett forma kialakulásához, vagy önmaguk biológiai aktivitással rendelkeznek, vagy olyan fehérjevariánsokat jelent, amelyek lényegében még megtartották a vad tí-

1

HU 003 923 T2

pusú fehérje biológiai aktivitását. Ilyen variánsok elõnyösen konzervatív aminosavszubsztitúciókat tartalmaznak, de különösen az érett fehérjék N¹terminális részében, és jelentõs számú deléció vagy szubsztitúció sem vezet a biológiai aktivitás számottevõ mértékû elvesztéséhez. Szakember képes meghatározni, hogy vajon bizonyos fehérjék rendelkeznek¹e a szükséges biológiai aktivitással. A vad típusú, érett fehérjékkel legalább 70%, és elõnyösen legalább 80% homológiát mutató fehérjék a találmány tárgykörébe tartoznak. A „homológia” kifejezés a leírásban azt jelenti, hogy az alábbi csoportokon belül az aminosavak homológoknak tekinthetõk: „S, T, P, A, G” és „N, Q, D, E” és „H, R, K” és „M, I, L, V” és „F, Y, W”, ahol a homológiát optimális szekvenciamegfeleltetéshez szekvenciák egymás alá rendezésével határozzuk meg, beleértve a réseket is, ha vannak. A „mátrixanyag” kifejezés egy olyan hordozómátrixot jelent, ami vázként mûködik sejtek toborzásához, letapadásához, infiltrációjához, proliferációjához és differenciálódásához, és/vagy morfogén fehérjék potenciális célba juttató és tárolóeszköze. Minden típusú mátrixanyag alkalmazható a találmány szerinti megoldásban, amíg azok biológiailag kompatibilisek, és a tervezett alkalmazási terület vagy indikáció szerint lettek kiválasztva. A mátrixanyag lehet természetes anyag, módosított természetes anyag, valamint szintetikus anyag. Morfogén fehérjékkel kapcsolatban már ismert, valamennyi mátrix a találmány tárgykörébe tartozik. Természetes anyagok például autológ, heterológ vagy xenológ csontanyagok, kollagén, például I. és III. típusú kollagén, vagy fémek, mint például titán. Az extracelluláris mátrix más komponenseit is lehet alkalmazni. Az extracelluláris mátrix például különbözõ kollagéneket, mint például I., II., V., IX., X., XI. és XIII. típust, továbbá hidroxilapatitot, proteoglikánokat és glükózamino-glükánokat, mint például kondroitin-szulfátot, biglikánt, dekorint és/vagy hialuronsavat, vagy nem kollagénszerû fehérjéket, mint például oszteopontint, laminint, fibronektint, vitronektint, trombospondint, porcmátrixfehérjét és dentin-foszfoproteint tartalmaz. Valamennyi említett természetes anyagot lehet alkalmazni mesterségesen módosított formákban. Módosított természetes anyagok például demineralizált csont, hõkezelt csontból származó ásványi anyag, szinterelt csont vagy kémiailag keresztkötött hialuronsav (hydrogél), vagy fémötvözetek. Szintetikus anyagok például poliglikolsav, polilaktid és polilaktidszármazékok, például politejsav, poli(laktid-koglikolid), politejsav-polietilénglikol vagy glikolid-Llaktid-kopolimerek, továbbá polifoszfátok, polietilénglikol, polioxi-etilén-polioxi-propilén kopolimerek vagy olyan anyagok, amelyek kalcium-foszfátot tartalmaznak, például béta-trikalcium-foszfátot [Ca3(PO4)2], alfatrikalcium-foszfátot és hidroxilapatitot. Más, alkalmas hordozómátrixok továbbá olyanok, amelyek a fentebb említett csoportok egyikéhez tartoznak, például Ca(OH)2, korall, természetes csontból származó ásványi anyag, kitin, nem demineralizált csontszemcsék, kerámia csontszemcsék, kerámiaden-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 4

2

tin, besugárzott likacsos csontszilánkok, gipsz, biológiailag aktív üveg, apatit-wollastonit-tartalmú üvegkerámia. A fentebb említett hordozómátrixok kombinációja is kialakíthatja a mátrixanyagot, például hidroxiapatit és kollagén kombinációja (például Healos, amelyet régebben az Orquest, Inc. cég forgalmazott, CA, USA, jelenleg DePuy Acromed, MA, USA), poliglikolsav és politejsav vagy polilaktidszármazékok kombinációja, vagy korall-kollagén összetételek. Alkalmas hordozómátrixok listáját továbbá lásd Kirker-Head, Advanced Drug Delivery 43, 65–92 (2000), amelyekre nem kívánjuk korlátozni a találmány szerinti megoldást. A leírásban az „oszteoinduktív anyag” kifejezésen egy biológiai eszközt értünk, amely legalább egy mátrixanyagot, és a mátrixanyagban és/vagy a felszínén ideiglenesen immobilizált, morfogén fehérjét tartalmaz. Az eszköz továbbá tartalmazhat adalék anyagokat, amelyek megfelelnek az elõre látható alkalmazáshoz. Ilyen anyagok lehetnek például antibiotikumok, antifibrinolitikus ágensek, vitaminok, stabilizálószerek, pufferek, emulgeátorok, gyulladásgátló anyagok és más adalék anyagok, mint például olyan anyagok, amelyek fokozzák a morfogén fehérje oldhatóságát. Elõfeltétel az ilyen anyagokkal kapcsolatban, hogy nem károsak a páciensre, és nem zavarják a tervezett gyógyászati alkalmazást. Az „oszteoinduktív anyag” kifejezés jelentése a találmány szerinti megoldásban nem korlátozódik csont helyreállításával kapcsolatos alkalmazásokra. Más indikációk, például porc, kötõszövet, ideértve ín vagy ínszalag, periodontális (fog körüli) vagy fogszövet, idegszövet, szenzoros rendszert felépítõ szövet, máj¹, hasnyálmirigy¹, szív¹, ér¹, vese¹, méh- és pajzsmirigyszövet, bõr, nyálkahártyák, endotélium, epitélium helyreállítása vagy növekedése, idegnövekedése, szövet-helyreállítása és regenerálása, angiogenezis, sebek, például fekélyek, égések, sérülések vagy bõrgraftok gyógyulásának elõsegítése vagy indukciója, progenitorsejtek vagy csontvelõsejtek proliferációjának indukciója esetén is hasznos lehet fehérje és mátrixanyag kombinációjának alkalmazása, például kihasználva a lassan, folyamatosan felszabaduló fehérje elõnyét, és/vagy olyan környezetet biztosítva, amely lehetõvé teszi sejtek benövését, így tehát új egészséges szövet kialakulását segíti. Azért az „oszteoinduktív anyag” kifejezést használjuk a leírásban, mert az eddig megjelent közlemények alapján a szakirodalomban mátrixanyagok és morfogén fehérjék kombinációját értik rajta. A találmány szerinti oszteoinduktív anyagok minden olyan esetben hasznosak, ahol morfogén fehérjék kedvezõen alkalmazhatók, és különösen olyan esetekben, ahol morfogén fehérjéket egy mátrixanyaggal együtt alkalmaznak a fehérje lassú és tartós felszabadulásának és/vagy olyan környezet biztosítása céljából, amely továbbá elõsegít sejtproliferációt és szövetregenerálódást. A találmány szerinti oszteoinduktív anyagot például porc, kötõszövet, ideértve ín vagy ínszalag, periodontális (fog körüli) vagy fogszövet, idegszövet, szenzoros rendszert felépítõ szövet, máj¹, hasnyálmirigy¹, szív¹, ér¹, vese¹, méh- és pajzsmirigyszövet, bõr, nyálkahártyák, endotélium vagy epitélium be-

1

HU 003 923 T2

tegségre utaló tüneteinek vagy beteg állapotainak, vagy abnormális állapotainak prevenciójára, enyhítésére vagy kezelésére lehet alkalmazni. Az anyagok alkalmazhatók például idegnövekedés, szövet-helyreállítás és regenerálás, angiogenezis, sebek, például fekélyek, égések, sérülések vagy bõrgraftok gyógyulásának elõsegítésére vagy indukciójára, progenitorsejtek vagy csontvelõsejtek proliferációjának indukciójára, kötõszövet és csont közötti funkcionális kapcsolat regenerálására, porc helyreállítására, oszteoporózis (csontritkulás) vagy oszteoartritisz kezelésére, nem tökéletesen összefort törések, szerzett vagy öröklött koponya¹, csontváz- vagy fogászati abnormalitások kijavítására, nem vázizomszövet pótlására plasztikai vagy rekonstrukciós sebészetben. Továbbá az oszteoinduktív anyaggal kezelendõ betegséget vagy abnormális állapotot okozhatja ischaemiás vagy traumás sérülés, degeneratív betegség, kardiomiopátiák, atherotrombotikus vagy kardioembolitikus szélütések, fekélyesedés, cirrózis, emfizéma, sejt öregedése vagy sejt nyugalmi állapota. Az oszteogén anyagot továbbá gyulladásos válasz modulálására és ezekkel társult szövetkárosító hatások enyhítésére, továbbá károsodott vagy sérült szövet életképességének fokozására lehet alkalmazni. Továbbá fibrózis vagy hegszövetképzõdés csillapítása elkerülhetõ, és az anyagot kedvezõen lehet alkalmazni ischaemiás-reperfúziós károsodások kezelésére, például amelyek szívbénulással, tüdõelzáródással, artériaelzáródással, szívkoszorúér-elzáródással vagy okklúziós szélütéssel társultak, vagy amelyek mûtéttel vagy a vér áramlásába történõ, más, szükséges beavatkozással társultak, vagy amelyek agyi infarktussal, szívinfarktussal, asphyxiával vagy kardiopulmonáris bénulással társultak. Egy további lehetséges indikáció kötõszövet tapadásának gyógyítása és helyreállítása, például a WO 96/39169 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint. A találmány szerinti oszteogén anyagok alkalmazásának lehetséges indikációi csak szemléltetõ példák, amelyekkel nem kívánjuk korlátozni a találmány tárgykörét. A találmány szerinti oszteoinduktív anyagok maximális dózisban tartalmaznak morfogén fehérjéket biológiailag aktív és hatásos formában, és/vagy az elõnyösen porózus mátrixanyag felszínén. Az „egyenletesen burkolt” és „a burkolás egyenletessége” kifejezések a leírásban azt jelentik, hogy az oszteoinduktív anyag minden egyes mm2¹e alapvetõen azonos mennyiségû morfogén fehérjét tartalmaz. A szakirodalomban leírt oszteoinduktív anyagok esetén a biológiailag aktív, morfogén fehérjék hordozón való eloszlása gyakran egyenetlen. Az említett esetek többségében kevesebb fehérje kötõdik a mátrix bizonyos részeihez, vagy a kötõdött fehérje számottevõ arányának biológiai aktivitása lecsökkent. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során azt találtuk, hogy az említett egyenetlenség mértékét fõleg helyi kicsapódások befolyásolják, amelyek a mátrixanyagok burkolása során következnek be, fehérjelebomlási folyamatokkal együtt. Tehát az eszköz oszteoinduktív kapacitása jelentõsen lecsökken. Ilyen egyenetlen elosz-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

lást és fehérjebomlást el lehet kerülni a fehérje stabilitásának és oldhatóságának egyidejû módosításával vagy fokozásával a burkolási folyamat alatt, amely a pH szakszerû kiválasztásával és kontrolljával, valamint alkalmas puffer vagy oldószer-tulajdonságok és speciális adalék anyagok alkalmazásával érhetõ el. A morfogén fehérjék oldhatósága folyadékban sok más, a leírásban ismertetett, fontos faktorokon kívül az oldószer pH¹értékétõl függ. Egy mátrixanyag morfogén fehérjékkel való burkolása akkor a leghatékonyabb, ha a fehérjék stabil módon, teljesen feloldott állapotban vannak a burkolásra alkalmazott oldatban, a burkolási eljárás teljes ideje alatt. Azonban, mivel a legtöbb mátrixanyag hidrogénion-donor vagy akceptor, a mátrixanyagok önmagukban befolyásolják a pH¹t a burkolási eljárás alatt. A legtöbb mátrixanyag felszíne maximalizálva van, és számtalan üreget és pórust tartalmaz, amelyek lokális mikrokörnyezetet biztosítanak néha eltérõ pH¹körülményekkel, ahol a fehérjék hajlamosak kicsapódni. A találmány szerinti eljárások lehetõvé teszik a fehérjeoldat egyenletes eloszlását a hordozóanyag külsõ és belsõ felszínén, és a fehérje homogén és stabil kötõdését ezekhez a felszínekhez annak a kockázata nélkül, hogy a fehérje pH¹indukált kicsapódása bekövetkezzen. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával elérhetõ a burkolás említett egyenletessége és különösen a morfogén fehérjék mátrixanyaghoz való hatékony adszorpciója, ezáltal biztosítható, hogy a fehérjék stabilak és teljesen feloldott állapotban legyenek egy oldatban. A morfogén fehérjékhez alkalmazott oldószernek a burkolási eljárásban általában stabilizálnia kell a fehérjéket, és kompenzálnia kell kritikus pH¹eltolódásokat, amelyeket a hordozó okoz. A találmány szerinti eljárásban a morfogén fehérjék pH¹függõ oldhatóságának pontos ismerete a mátrix tulajdonságainak alapvetõ ismeretével együtt lehetõvé teszi alkalmas oldószer vagy puffer kiválasztását a burkolási eljáráshoz. Például ha a morfogén fehérje oldható 4,5-nél kisebb pH¹értéken, de kicsapódik magasabb pH¹értékeken, és a mátrixanyag maga lúgos tulajdonságú, a burkolási eljárásban alkalmazott oldószernek vagy puffernek alkalmas anyagokat kell tartalmaznia, elõnyösen gyenge savat a hordozó által okozott pH¹eltolódás kompenzálására abból a célból, hogy fenntartsa a morfogén fehérjék hatékonyságát oldatban a teljes burkolási eljárás alatt. Ha a morfogén fehérjék oldhatók 10¹nél magasabb pH¹n, de kicsapódnak alacsonyabb pH¹értékeken, és a mátrixanyag maga savas tulajdonságú, a burkolási eljárásban alkalmazott oldószernek vagy puffernek alkalmas anyagokat kell tartalmaznia, elõnyösen gyenge bázist a hatékony kompenzálásra. A leírásban közölt példákban leírjuk különbözõ mátrixok hatását a pH¹ra, valamint megadjuk néhány morfogén fehérje pH¹függõ oldhatóságát. A találmány más elõnyös megvalósítási módjai szerint, melyeket nem fejtünk ki részletesen a példákban, szakember könnyen meghatározhatja bármilyen más mátrix hatását a pH¹ra, valamint bármilyen más morfogén fehérje pH¹függõ oldhatóságát. A találmány szerinti morfogén fehérjék rendszerint fiziológiás (közel semleges) vagy kissé savas/bázikus

1

HU 003 923 T2

pH¹értékeken kicsapódnak, míg 4,5 alatti és 10,3 fölötti pH¹értékeken oldódnak, ha az oldószerek ionkoncentrációja 100 mmol/l vagy több. Meglepõ módon a morfogén fehérjék ilyen pH¹függõ oldhatóságát továbbá a pufferek vagy oldószerek összetételével vagy koncentrációjával lehet módosítani, ami egyértelmûen tágabb pH¹tartományhoz vezet, amelyben lehetséges a mátrix egyenletes és stabil burkolása. Alacsonyabb, például 10 vagy 20 mmol/l ionkoncentrációjú oldószerekben legalább 75 mg/ml, elõnyösen 100 mg/ml, elõnyösebben 150 mg/ml és a legelõnyösebben több mint 200 mg/ml fehérjeoldhatóság érhetõ el 5,2 alatti és 9,5 feletti pH¹értékeken. Ez a megnövelt pH¹tartomány különösen kedvezõ akkor, ha pH¹érzékeny mátrixokat, például természetes anyagokat tartalmazó mátrixokat burkolunk. A találmány szerinti megoldás említett aspektusa szerint a morfogén fehérjék pH¹függõ oldhatósága és a mátrixanyag stabil burkolása az alkalmazott puffer vagy oldószer ionkoncentrációjától függ, és jelentõsen javítható alacsony ionkoncentrációjú puffer vagy oldószer alkalmazásával. A pufferben vagy oldószerben lévõ ionkoncentráció elõnyösen 150 mmol/l vagy kevesebb, elõnyösen 100 mmol/l vagy kevesebb, 80 mmol/l vagy kevesebb, 40 mmol/l vagy kevesebb, 20 mmol/l vagy kevesebb, 10 mmol/l vagy kevesebb, vagy 5 mmol/l vagy kevesebb. A pufferben vagy oldószerben lévõ koncentráció 20 mmol/l. A pufferben vagy oldószerben lévõ koncentráció a legelõnyösebben 10 mmol/l. Továbbá azt találtuk, hogy az oldószer összetétele is befolyásolja a morfogén fehérje pH¹függõ oldhatóságát és a mátrixanyag stabil burkolását. Míg nátrium-citrátot, 2¹amino-2-metil-1,3-propándiol-HCl¹ot vagy nátrium-glicint tartalmazó pufferekrõl bebizonyosodott, hogy kevésbé alkalmasak oldószerként morfogén fehérjékhez, figyelemre méltóan jó fehérjeoldhatóságot és stabilitást értünk el nátrium-acetátot, nátrium-karbonátot tartalmazó oldatokban, vagy HCl¹ot vagy NaOH¹ot tartalmazó, nem pufferolt oldatokban. Továbbá váratlanul jó fehérjeoldhatóságot találtunk szerves oldószereket, például trifluor-ecetsavat (TCA), TFA/etanol keverékeket, izopropanolt, propanolt, butanolt, izopropanolt, dimetil-szulfoxidot vagy acetont tartalmazó oldatokban. A találmány szerinti megoldás említett aspektusában a morfogén fehérjékhez alkalmazott puffer vagy oldat elõnyösen egy sav, például ecetsav vagy sósav, vagy bázis, például NaOH. Az oldat elõnyösebben nátrium-acetátot vagy nátrium-karbonátot tartalmazó puffer. Az oldat szintén elõnyösen több mint 25%, 30%, 40%, 50%, 75%, vagy akár 100% szerves oldószert tartalmaz. Továbbá teljesen váratlan volt, hogy a morfogén fehérjék nemcsak oldhatóak, hanem megtartották biológiai aktivitásukat is erõsen savas (pH=5,2 alatt), valamint erõsen bázikus pH¹értékeken (pH=9,5 felett), ami ritkán fordul elõ fiziológiás körülmények között. Ezek az eredmények lehetõvé teszik speciális mátrixanyagok és azok burkolására szolgáló eljárások kifejlesztését.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 6

2

Aktív morfogén fehérjék oldatai, amelyekben ilyen extrém pH¹értékek vannak, kedveznek a sterilitásnak. Emiatt ezeket elõnyösen lehet alkalmazni a burkolási eljárásban, mivel nem kívánt, élõ mikroorganizmusokkal történõ szennyezõdések veszélye jelentõsen lecsökkent. Mindezeken felül a burkolás például bázikus pH¹n, 9,5 és 12 között bizonyos esetekben kedvezõ, mivel számos mátrix bomlik savas közegben, és ezért bázikus pH¹körülményekre van szükség a burkolás alatt. Továbbá olyan mátrixanyagok burkolását, amelyek önmagukban semleges vagy bázikus tulajdonságokkal rendelkeznek, magasabb pH¹értékeken lehet végezni, és általában megszûnik a fehérje kicsapódásának kockázata a burkolási eljárás alatt. Például Ca(OH)2 rutinszerûen alkalmazott anyag fogak javítására szolgáló eljárásokban, de vizes oldatában körülbelül 12 pH¹érték van, ami normálisan gátolja fehérjékkel való burkolását. A Ca(OH)2-ról elõzõleg már kimutatták, hogy kisebb mennyiségû szekunder dentin képzõdését stimulálja. Ez a hatás drámaian fokozható, ha a Ca(OH)2¹ot pH=12¹n burkoljuk a találmány szerinti morfogén fehérjékkel. A találmány egy konkrét elõnyös megvalósítási módja szerint a fentebb leírt adatok összesítése alapján lehetõvé válik mátrixanyagok burkolása biológiailag aktív, morfogén fehérjékkel 5,2 alatti pH¹értéken, és különösen magas, 9,5 és 13 közötti pH¹n. A 12 és 13 közötti pH¹értékek elõnyösek. Különösen elõnyösek a 2 és 4,5 közötti, és a 4,5 és 5,2 közötti, és a 9,5 és 10,3 közötti, és a 10,3 és 12 közötti, és a 12 és 13 közötti pH¹értékek. Egy mátrixanyag burkolását továbbá stabilizátorok, emulgeátorok és más olyan segédanyagok és adalék anyagok alkalmazásával lehet jelentõs mértékben tovább javítani, amelyek például gátolják lebomlásukat vagy fokozzák oldhatóságukat. Különösen elõnyösek polietilénglikolok, amelyek drámaian fokozzák a morfogén fehérjék oldhatóságát, ha kovalensen vagy nem kovalensen kötõdnek a fehérjékhez. Más hasznos adalék anyagok vagy segédanyagok lehetnek olyan anyagok, amelyek például kedvezõ hatást képesek kifejteni egy fehérje egyenletes adszorpciójára mátrixanyagon, valamint olyan anyagok, amelyek oldatban stabilizálják a fehérjét. Továbbá bármilyen anyagot hozzáadhatunk, amíg az bármilyen módon pozitív hatást képes kifejteni, vagy legalábbis nem veszélyes a páciensre. Alkalmas anyagok például nemionos detergensek, például Tween80, bázikus aminosavak, hordozófehérjék, például szérumalbumin, zsírsavak alkalikus sói (szappanok) vagy „syndet”¹ek (szappantól különbözõ, szintetikus detergensek), cukrok vagy alkoholok, például szacharóz, mannit (WO 98/33514 számú nemzetközi közzétételi irat), etanol vagy izopropanol. Különösen cukrokról és alkoholokról, valamint szappanokról és syndetekrõl találtuk azt, hogy javítják a burkolás egyenletességét. Ezek az alkoholt tartalmazó oldatok, szappanok és/vagy syndetek nagyon elõnyösek nagyon alacsony felületi feszültségük miatt, amely javítja a burkolás hatékonyságát. Parenterális beadásra alkalmas, injektálható mátrixanyagokban és készítményekben

1

HU 003 923 T2

szappanok és syndetek hasznosak, mert micelláris struktúrákat alakítanak ki. A micellák képesek körülvenni és emulgeálni a hidrofób morfogén fehérjéket, ezáltal segítik a fehérje célba juttatását, és gátolják a kicsapódást. Mivel a szappanok bázikus tulajdonságokkal rendelkeznek 8 fölötti pH¹értékeken, könnyen lehet azokat kombinálni a találmány szerinti morfogén fehérjékkel, amelyekrõl bebizonyosodott, hogy ezeken a bázikus pH¹értékeken megtartják biológiai aktivitásukat. A savas pH¹tartományban 5,2 alatt syndeteket lehet alkalmazni szappanok helyett a morfogén fehérjékkel kombinációban. Kívánt esetben más anyagokat is hozzá lehet adni, például antibiotikumokat, antiszeptikumokat, vitaminokat, antifibrinolitikumokat stb. Részletesen ismertetve, a mátrixanyag burkolását jelentõsen lehet javítani a találmány szerinti megoldás alkalmazásával, adalék anyagként egy vagy több szacharid alkalmazásával. A szacharid elõnyösen szacharóz. Szintén elõnyös, ha a szacharid mannit. Különösen elõnyösek olyan burkolóoldatok, amelyek akár 8%, 10%, 12%, 15% vagy 20% szacharidot tartalmaznak. A mátrixanyag burkolását továbbá adalék anyagként egy vagy több alkohol alkalmazásával lehet javítani. Az alkohol elõnyösen etanol. Szintén elõnyös, ha az alkohol izopropanol. Különösen elõnyösek olyan burkolóoldatok, amelyek akár 50%, 55%, 60% vagy 65% alkoholt tartalmaznak. A mátrixanyag burkolása, valamint a morfogén fehérjéket tartalmazó, injektálható hordozók vagy parenterális készítmények összetételét továbbá adalék anyagként zsírsavak alkalikus sóinak (szappanok) alkalmazásával lehet javítani. A szappan elõnyösen nátrium-sztearát, nátrium-mirisztát, nátrium-oleát vagy nátrium-palmeát. Különösen elõnyösek olyan oldatok, amelyek akár 10%, 20%, 30%, 40%, 50% vagy 75% szappanokat tartalmaznak. A mátrixanyag burkolása, valamint a morfogén fehérjéket tartalmazó, injektálható hordozók vagy parenterális készítmények összetételét továbbá adalék anyagként syndetek alkalikus sóinak alkalmazásával is lehet javítani. A syndet elõnyösen lineáris alkilszulfonát, alkil-szulfát vagy alkil-benzil-szulfonát. A syndet elõnyösebben laurel- vagy laureth-szulfát. A legelõnyösebben a syndet nátrium- vagy ammóniumlauril-szulfát. Különösen elõnyösek olyan oldatok, amelyek akár 10%, 20%, 30%, 40%, 50% vagy 75% syndetet tartalmaznak. A találmány tárgyát képezi egyik vonatkozásában oszteoinduktív anyag, amely egy mátrixanyagot és a mátrixanyag külsõ vagy belsõ felszíneire adszorbeált, egy vagy több morfogén fehérjé(ke)t tartalmaz, ahol az oszteoinduktív anyag úgy állítható elõ, hogy mátrixanyagot és a morfogén fehérjét alkalmas körülmények között érintkeztetjük, ami alkalmas a fehérje oldatban tartására, ezáltal lehetõvé válik, hogy a mátrixanyagot egyenletesen burkolja a morfogén fehérje. Ez a mátrixanyag egy vázként mûködik sejtek toborzásához, letapadásához, proliferációjához és/vagy differenciálódásához, és potenciális célba juttató és tárolóeszközként

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 7

2

szolgál morfogén fehérjékhez. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a mátrixanyag porózus anyag, és lehetõvé teszi a fehérjeoldat bejutását az anyag belsõ felszínéhez. Szintén elõnyös, ha a mátrixanyag természetes anyag, módosított természetes anyag vagy szintetikus anyag. Sõt, elõnyösebben a mátrixanyag egy kalcium-foszfát-típust tartalmaz, különösen béta-trikalcium-foszfátot [Ca3(PO4)2], alfa-trikalcium-foszfátot és hidroxilapatitot. Szintén különösen elõnyösek az alábbi mátrixanyagok: a) kollagén, b) Ca(OH)2, c) polilaktidszármazékok: polilaktid, politejsav, poli(laktid-koglikolid), politejsav-polietilénglikol, d) hialuronsav, e) polioxi-etilén-polioxi-propilén kopolimerek. Szintén különösen elõnyös hidroxiapatit és kollagén kombinációja (például Healos, amelyet régebben az Orquest, Inc. cég forgalmazott, CA, USA, jelenleg DePuy Acromed, MA, USA). Az oszteoinduktív anyag által tartalmazott morfogén fehérjék olyan fehérjék, amelyek a TGF-b-szupercsaládhoz tartoznak, vagy ezek biológiailag aktív részei vagy variánsai, amelyek lehetnek dimerek, vagy hiányzik belõlük a dimer kialakulásáért felelõs cisztein. Valamennyi TGF-b-szupercsaládtag tartalmaz egy speciális domént, amit „7 cisztein régió”-nak hívnak. Ez a speciális, 7 cisztein régió úgy tekinthetõ, ami a fehérje legfontosabb része a biológiai aktivitás szempontjából. Ezért azok a fehérjék, amelyek megtartották ezt a döntõ fontosságú régiót, különösen elõnyösek a találmány szerinti megoldásban. Ebben a régióban a ciszteinek egymáshoz viszonyított helyzete fontos, és csak nagyon kis variáció engedhetõ meg, hogy ne változzon meg a biológiai aktivitás. Ilyen fehérjéknek megfelelõ konszenzusszekvenciák szakember által ismertek, és minden olyan fehérje, amely megfeleltethetõ ilyen konszenzusszekvenciáknak, a találmány tárgykörébe tartozik. A találmány szerinti megoldás ebben a vonatkozásában különösen elõnyösek olyan fehérjék, amelyek legalább a TGF¹b fehérje-szupercsaládra jellemzõ, „7 cisztein régiót” tartalmazzák függetlenül attól, hogy ebben a doménben jelen lévõ, a dimer kialakulásáért felelõs cisztein helyettesítve van¹e más aminosavval, vagy nem. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a morfogén fehérje vagy biológiailag aktív része vagy variánsa egy érett fehérje vagy biológiailag aktív része vagy variánsa. Szintén elõnyös, ha a morfogén fehérje vagy biológiailag aktív része vagy variánsa a TGF-b-szupercsalád alcsoportjainak egy tagja, konkrétan TGF¹b, BMP¹, GDF¹, aktivin- vagy GDNF-családé. Számos BMP-fehérjét leírtak, amelyeket eredetileg úgy fedeztek fel, hogy képesek csontképzõdést indukálni. Idõközben számos további funkciót találtak, ami igaz a GDF¹ek tagjaira is. Ezek a fehérjék nagyon széles körben alkalmazhatók, és különösen csont- és porcnövekedést elõsegítõ aktivitásukon (lásd például WO 88/00205, WO 90/11366, WO 91/05802 számú nemzetközi közzétételi iratok) kívül hasznosak periodontális (fog körüli) betegségben, periodontális és fogszövetveszteség gátlására, fogüregek lezárására, fog

1

HU 003 923 T2

integrálódásának fokozására a fogmederbe (lásd például WO 96/26737, WO 94/06399, WO 95/24210 számú nemzetközi közzétételi iratok); kötõszövetre, például ínra és ínszalagra (lásd például WO 95/16035 számú nemzetközi közzétételi irat), idegsejtek túlélésének javítására, idegsejtek növekedésének indukálására és idegi defektusok helyreállítására, szélütés következtében károsodott központi idegrendszeri szövetekre, trauma vagy degeneratív betegségekre (lásd például WO 97/34626, WO 94/03200, WO 95/05846 számú nemzetközi közzétételi iratok), szenzoros érzékelés fenntartására és helyreállítására (lásd például WO 98/20890, WO 98/20889 számú nemzetközi közzétételi iratokat), veseelégtelenségre (lásd például WO 97/41880, WO 97/41881 számú nemzetközi közzétételi iratok), májregenerálásra (lásd például WO 94/06449 számú nemzetközi közzétételi irat), szívizom regenerálására (lásd például WO 98/27995 számú nemzetközi közzétételi irat), szerv- vagy szövettranszplantációra szánt szövetek vagy sejtek kezelésére vagy védelmére, gasztrointesztinális vonal integritására (lásd például WO 94/06420 számú nemzetközi közzétételi irat), progenitor-sejtpopuláció növelésére, mint például hematopoetikus progenitorsejtek esetén ex vivo stimulációval (lásd például WO 92/15323 számú nemzetközi közzétételi irat) stb. A morfogén fehérje vagy biológiailag aktív része vagy variánsa elõnyösebben a TGF-b¹, BMP¹, GDF¹, aktivin- vagy GDNF-családhoz tartozó, dimer fehérje. Sõt, a dimer morfogén fehérje vagy biológiailag aktív része vagy variánsa elõnyösebben BMP2, BMP7, BMP12 vagy BMP13. A találmány szerinti oszteoinduktív anyag által tartalmazott dimer fehérje a legelõnyösebben MP52 jelû fehérje (GDF5-ként vagy CDMP-1-ként is jelölik), vagy biológiailag aktív része vagy variánsa. Az MP52-szekvenciát bemutatjuk az 1. azonosító számú szekvenciában (DNS- és fehérjeszekvencia) és a 2. azonosító számú szekvenciában (csak fehérjeszekvencia), ahol a 465. helyzetben lévõ Xaa jelentése cisztein. A 2. azonosító számú szekvencia a humán MP52 prepro-fehérje teljes fehérjeszekvenciáját mutatja, melyet a WO 95/04819 számú nemzetközi közzétételi iratban már közöltek. Az érett fehérje kezdete elõnyösen a 352–400. aminosavak körül van, különösen elõnyösen a 381. vagy 382. aminosavnál. Tehát az érett fehérje a 381–501. vagy 382–501. aminosavakat tartalmazza. Az érett fehérje elsõ alaninját el lehet távolítani, és az érett fehérje azután elõnyösen a 382–501. aminosavakat tartalmazza. MP52 alkalmazásai megfelelnek a BMP/GDF család már leírt, néhány alkalmazásának. Az MP52 a csont- és porcképzõdés, valamint a kötõszövet-képzõdés nagyon hatékony elõsegítõjének tekinthetõ [lásd például a WO 95/04819 nemzetközi közzétételi iratban leírtakat; Hötten és munkatársai, Growth Factors 13, 65–74 (1996); Strom és munkatársai, Nature 368, 639–643 (1994); Chang és munkatársai, J. Biol. Chem. 269, 28227–28234 (1994)]. Ebben a vonatkozásban MP52 hasznos olyan alkalmazásokban, amelyek a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 8

2

csontváz elemei közötti ízületekkel kapcsolatosak [lásd például Storm és Kingsley, Development 122, 3969–3979 (1996)]. Kötõszövet például az ín és az ínszalag [Wolfman és munkatársai, J. Clin. Invest. 100, 321–330 (1997); Aspenberg és Forslund, Acta Orthop. Scand. 70, 51–54 (1999); WO 95/16035 számú nemzetközi közzétételi irat]. MP52 szintén hasznos fogászati (fogra és periodontális, azaz fog körüli) alkalmazásokban [lásd például WO 95/04819, WO 93/16099 számú nemzetközi közzétételi iratok; Morotome és munkatársai, Biochem. Biophys. Res. Commun. 244, 85–90 (1998)]. MP52 hasznosan alkalmazható bármilyen típusú sebgyógyításban. Továbbá nagyon hasznos szövetnövekedés elõsegítésére az idegrendszerben, és például dopaminerg neuronok túlélésének elõsegítésére. Ebben a vonatkozásban MP52 hasznosan alkalmazható neurodegeneratív betegségek, például Parkinsonkór és valószínûleg Alzheimer-kór, Huntington-betegség esetén az érintett szövetekben [lásd például a WO 97/03188 számú nemzetközi közzétételi iratot; Krieglstein és munkatársai, J. Neurosci. Res. 42, 724–732 (1995); Sullivan és munkatársai, Neurosci. Lett. 233, 73–76 (1997); Sullivan és munkatársai, Eur. J. Neurosci. 10, 3681–3688 (1998)]. MP52 lehetõvé teszi idegi funkciók fenntartását vagy idegi funkciók helyreállítását már elpusztult szövetekben. Így tehát MP52 általánosan alkalmazható neurotrofikus faktornak tekinthetõ. Szintén hasznosan alkalmazható szembetegségekben, különösen ideghártyán, szaruhártyán és látóidegben [lásd például WO 97/03118 számú nemzetközi közzétételi irat; You és munkatársai, Invest Opthalmol Vis Sci 40, 296–311 (1999)], valamint hajnövesztésre és bõrrel kapcsolatos rendellenességek kezelésére és diagnosztizálására (WO 02/076494 számú nemzetközi közzétételi irat). A kifejezések fentebb leírt definícióiban már említettek szerint MP52 lehet például érett formájában, azonban lehet alkalmazni fragmenseként is, ami legalább a „7 cisztein régiót” tartalmazza, vagy prekurzor formában is. Az érett MP52 N¹terminális részében található eltérések nem befolyásolják jelentõs mértékben aktivitását. Ezért a fehérjék N¹terminális részében, az elsõ 9 aminosavnál kialakított szubsztitúciók és deléciók a találmány oltalmi körébe esnek. Hasznos lehet a fehérje N¹terminális részéhez hozzáadni egy peptidet, például tisztítási okokból. Valószínûleg nem szükséges lehasítani ezt a hozzáadott peptidet a fehérje expressziója és tisztítása után. A fehérje N¹ vagy C¹terminálisához hozzáadott peptidek szolgálhatják a fehérje célba juttatását is konkrét szövetekbe, például idegszövetbe vagy csontszövetbe, vagy segíthetik a vér/agy gáton való átjutást is. A morfogén fehérje vagy biológiailag aktív része vagy variánsa elõnyösebben lehet olyan fehérje is, amely a TGF-b¹, BMP¹, GDF¹, aktivin- vagy GDNF-családhoz tartozik, de hiányzik belõle az a cisztein, amely felelõs a megfelelõ természetesen elõforduló fehérjék dimerképzõdéséért. A fehérje a találmány szerinti megoldás ilyen aspektusában nem képes olyan diszulfidhidat kialakítani, ami jelen van a fehérje vad típusú for-

1

HU 003 923 T2

májában. A WO 01/11041 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint a cisztein szubsztitúciója vagy deléciója, amely normálisan befolyásolja a fehérjék dimerizációját, expresszió esetén olyan monomer fehérje expressziója és konformációjának megfelelõ kialakulását (intramolekuláris diszulfidhidak képzõdését) eredményezi, amely megtartja a dimer forma biológiai aktivitását. Általában a találmány szerinti megoldás említett aspektusa szerinti monomer fehérjék és egy másik peptid vagy csoport által felépített fúziós fehérjék is a találmány által igényelt oltalmi körbe tartoznak, ahol ezek a más peptidek vagy csoportok a fúziós fehérje lokalizációját irányítják, például bizonyos szövettípusok stb. irányában mutatott affinitás alapján. Ilyen fúziós fehérjéket leírnak például a WO 97/23612 számú nemzetközi közzétételi iratban. Ilyen hozzáadott részt tartalmazó fehérje legalább addig megõrzi biológiai aktivitását, amíg az ilyen hozzáadott rész nem befolyásolja hátrányosan a fehérje biológiailag aktív konformációját. Bár monomer és (vad típusú) dimer fehérjék biológiai aktivitásai összehasonlítható mértékûek, dimer fehérjék gyakran mutatnak némileg eltérõ kémiai és biofizikai tulajdonságokat. Mivel dupla molekulatömegük, valamint a két monomer alegység között lévõ tartós kovalens kötés és intermolekuláris erõk miatt a dimerekben számuk több, és eltérõ a környezõ közeg számára hozzáférhetõ aminosavak típusa is, a megfelelõ monomerekhez képest. A dimerek két kovalensen összekapcsolt alegységbõl állnak, amelyek fiziológiás körülmények között közel vannak egymáshoz, ezért többféle típusú, reciprok (oda-vissza ható) kölcsönhatásokat létesítenek egymás között, valamint az oldószerrel. A szakirodalomban leírták, mely aminosav felelõs bizonyos fehérjecsaládokban vagy fehérjékben dimer kialakulásáért [lásd például Schlunegger és Grutter, Nature 358, 430–434 (1992); Daopin és munkatársai, Science 257, 369–373 (1992); és Griffith és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 878–883 (1996)]. Különösen azok az aminosavak, amelyek az alegységek között kialakult, említett kötési ponthoz közel vannak, soha nem kerülnek közvetlen érintkezésbe az oldószerrel. Másrészt a monomereket rendszerint teljes egészében körülveszi folyadék, és nem létesítenek tartós kölcsönhatást más monomer molekulákkal. A monomer és dimer morfogén fehérjék között fennálló, említett különbségek elméletileg várhatóan azt eredményezik, hogy megváltozik a morfogén molekulák pH¹függõ oldhatósága. A megváltozott oldhatóságra ad információt továbbá az izoelektromos pont (pI) kísérleti meghatározása mindkét fehérjére. Az izoelektromos pont pH¹ként definiálható, amelynél (pI-értéküknél) a fehérjék nettó töltése nulla és a fehérjék oldhatósága a pI¹értéknél elér egy minimumot. Az 1. példában és az 1. ábrán bemutatottak szerint meghatároztuk a találmány szerinti monomer fehérjék pI¹jét, és az egyértelmûen különbözött a dimer fehérjék pI¹jétõl. Monomer morfogén fehérjék elméleti és kísérleti alapon egyaránt elõre jelzett, megváltozott oldhatóságát tekintve abszolút váratlan, hogy a monomer morfo-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 9

2

gén fehérjék pH¹függõ oldhatósága mégis megegyezik dimer megfelelõik oldhatóságával. A találmány szerinti megoldás azokra a további meglepõ eredményekre alapul, hogy ezek a monomer fehérjék extrém pH¹értékeken is megtartják biológiai aktivitásukat, és úgy adszorbeálhatók mátrixanyagokra, hogy az nem fejt ki kedvezõtlen hatásokat aktivitásukra és hatékonyságukra. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során felismertük, hogy bizonyos pH¹körülmények biztosításával lehetõvé válik monomer fehérjék oldatban tartása, még mátrixanyagok jelenlétében is. Ilyen körülmények között az oldható fehérje egyenletesen tud adszorbeálódni minden olyan felületen, ami elérhetõ az oldott fehérje számára. Többé-kevésbé porózus anyagok belsõ felszínei a pórusmérettõl függõen hozzáférhetõek. A találmány szerinti megoldás körülményeinek alkalmazásával lehetõvé válik fehérje adszorbeálása minden olyan felületre, ami elérhetõ a szolubilizált fehérje számára molekulamérete alapján. A találmány szerinti megoldásban elkerülhetõ csapadékok képzõdése és a pórusok eltömése, ami gátolná fehérjeoldat további odajutását. Ez az eljárás lehetõvé teszi a mátrixanyag minden rendelkezésre álló felületének optimális burkolását, és a találmány szerinti oszteoinduktív anyagok javított hatékonyságot mutatnak a technika jelenlegi állása szerint alkalmazott anyagokhoz képest. A fentebb említett, WO 01/11041 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint azt találták, hogy ezek közül a monomer fehérjék közül legalább néhány a fehérje tömegéhez viszonyítva összehasonlítható mértékû, sõt, nagyobb aktivitást mutat, mint a megfelelõ dimer formáik. Egy további fontos elõnyt jelent az a tény, hogy a fehérjék nagy mennyiségben expresszálhatók prokarióta gazdaszervezetekben, és a monomerek egyszerûen felveszik natív konformációjukat, ezért nagy tisztaságban és nagyon magas hozamban elõ lehet ezeket állítani anélkül, hogy szükség lenne a dimerizált fehérjék elkülönítésére a nem dimerizált (momoner) fehérjéktõl. Elõnyös, hogy a találmány szerinti megoldás említett aspektusa szerinti fehérjék legalább a TGF¹b fehérjeszupercsaládra jellemzõ, „7 cisztein régiót” tartalmazzák. A szakirodalomban leírták, mely cisztein felelõs bizonyos fehérjecsaládokban vagy fehérjékben dimer kialakulásáért [lásd például Schlunegger és Grutter, Nature 358, 430–434 (1992); Daopin és munkatársai, Science 257, 369–373 (1992); és Griffith és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 878–883 (1996)]. Ezt a ciszteint deletálni vagy szubsztituálni lehet egy másik aminosavval olyan fehérjét kialakítva, amit a találmány szerinti megoldás említett aspektusának keretén belül lehet alkalmazni. A találmány említett aspektusának különösen elõnyös megvalósítási módja szerint ebben a vonatkozásban a dimer kialakulásáért felelõs ciszteint nem tartalmazó fehérje egy konszenzusszekvenciát tartalmaz az alábbi szekvencia szerint: CC(Y)25–29CYYYC(Y)25–35XC(Y)27–34CYC (I. képlet) amelyben C jelentése cisztein, Y jelentése bármilyen aminosav, beleértve ciszteint, és X jelentése bármilyen aminosav, kivéve ciszteint.

1

HU 003 923 T2

A találmány említett aspektusa szerint a dimer kialakulásáért felelõs ciszteint nem tartalmazó fehérje elõnyösebben egy konszenzusszekvenciát tartalmaz az alábbi szekvencia szerint: CC(Y)28CYYYC(Y)30–32XC(Y)31CYC (II. képlet) amelyben C, X és Y jelentése ugyanaz, mint a fentebb definiáltak. Sõt, a találmány említett aspektusa szerint a dimer kialakulásáért felelõs ciszteint nem tartalmazó fehérje a legelõnyösebben egy konszenzusszekvenciát tartalmaz az alábbi szekvencia szerint: C(X)28CXXXC(X)31–33C(X)31CXC (III. képlet) amelyben C és X jelentése ugyanaz, mint a fentebb definiáltak. Ezekben a konszenzusszekvenciákban különösen elõnyös a megfelelõ ciszteinek közötti távolság, ahol a dimerképzõ ciszteinek már helyettesítve vannak más aminosavval. Az említett fehérjeszupercsalád valamennyi fehérjetagjához hasonlóan a ciszteinek helyzete és a közöttük lévõ távolság fontosabb, mint a régióban lévõ más aminosavak típusa. Tehát a konszenzusszekvencia megmutatja a ciszteinek megfelelõ helyzetét, de nem mutatja más aminosavak típusát, mivel ezek az aminosavak nagyon változatosak a TGF¹b fehérjeszupercsalád fehérjéiben. A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módja szerint az oszteoinduktív anyagban lévõ fehérje MP52 monomer formája, és az 1. azonosító számú (DNS- és fehérjeszekvencia), valamint a 2. azonosító számú (csak fehérjeszekvencia) aminosavszekvencia legalább érett részét tartalmazza, amelyben a 465. helyzetben lévõ, Xaa-ként jelölt aminosav deletálva van, vagy bármilyen más, ciszteintõl különbözõ aminosav. A 465. helyzetben elsõsorban más hidrofób aminosav lehet, például glicin, valin, leucin vagy izoleucin. Az érett fehérje kezdete elõnyösen a 352–400. aminosavak körül van, különösen elõnyösen a 381. vagy 382. aminosavnál. Tehát az érett fehérje a 381–501. vagy 382–501. aminosavakat tartalmazza. Az érett fehérje elsõ alaninját el lehet távolítani (deléció), és az érett fehérje azután elõnyösen a 383–501. aminosavakat tartalmazza. A találmány szerinti megoldásban legelõnyösebben alkalmazott fehérje MP52-Ala83, az 1. vagy 2. azonosító számú szekvencia 383. aminosavánál kezdõdõ fehérje, amelyben a 465. helyzetben természetesen elõforduló cisztein helyettesítve van az alanin hidrofób aminosavval. MP52-Ala83 esetén az érett fehérje elõnyösen szintén a 352–400. aminosavak között kezdõdik, különösen elõnyösen a 381. vagy 382. aminosavnál. Az érett fehérje elsõ alaninját el lehet távolítani, és az érett fehérje azután elõnyösen a 383–501. aminosavakat tartalmazza. Elméletileg lehetséges, hogy azok a fehérjék, amik ebben az összefüggésben megfelelnek a monomer fehérjék definíciójának, bizonyosfajta aggregátumokat képeznek oldatban. Azonban ezek az aggregátumok nem dimer vagy multimer fehérjéknek felelnek meg, amiket definiált intermolekuláris hidak és kovalens kötések alakítanak ki. Van de Waals-erõk és gyenge kö-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 10

2

tõerõk más formái viszont elõfordulhatnak, és ilyen aggregátumok a találmány tárgykörébe tartoznak. A találmány tárgyát képezi egy másik vonatkozásában eljárás a találmány szerinti oszteoinduktív anyag elõállítására. Az eljárásban egy mátrixanyagot érintkeztetünk morfogén fehérjé(ke)t tartalmazó oldattal alkalmas körülmények között, amelyben a fehérje megõrzi stabilitását, és oldott állapotban marad pufferolt oldatban, és ezáltal lehetõvé válik, hogy a mátrixanyagot egyenletesen burkolják a morfogén fehérjék, és ezt követõen megszárítjuk a burkolt mátrixanyagot. Az eljárásban biztosítva van a pH kiválasztása és beállítása 5,2 vagy kisebb értékre, vagy 9,5 vagy nagyobb értékre, még akkor is, amikor az érintkeztetés történik a mátrixanyaggal. Az elõnyösen alkalmazott pH¹értékek 12 és 13 között vannak. Különösen elõnyös pH¹értékek 2 és 4,5 között, 4,5 és 5,2 között, 9,5 és 10,3 között és 10,3 és 12 között vannak. Fehérjéket és mátrixanyagokat, amelyek felépíthetik az oszteoinduktív anyagokat, fentebb leírunk a találmány tárgyának más vonatkozásaival kapcsolatban, és minden alkalmas oldószert/puffert, adalék anyagot és segédanyagot is. Az alábbi példákban leírtak, az ábrákkal és a szekvencialistával együtt a találmány szerinti megoldás további szemléltetésére szolgálnak, amellyel nem kívánjuk korlátozni az igényelt oltalmi kört. Az 1. azonosító számú szekvenciaként és a 2. azonosító számú fehérjeszekvenciaként bemutatjuk az MP52 és MP52-Ala83 prepro-peptidek DNS- és fehérjeszekvenciáját, ahol a 465. helyzetben lévõ Xaa jelentése cisztein (MP52 esetén) vagy alanin (MP52Ala83 esetén). Az MP52 és MP52-Ala83 természetesen elõforduló, érett fehérjék a 382–501. aminosavakat tartalmazzák. Az MP52 és MP52-Ala83 elõnyös rekombináns variánsaiban az érett fehérje elsõ alaninját el lehet távolítani, és az érett fehérje a 383–501. aminosavakat tartalmazza. Valamennyi ábrán és példában ezeket az MP52 és MP52-Ala83 rekombináns verziókat alkalmazzuk. Az 1. ábrán bemutatjuk az 1. példában leírt izoelektromos fokuszálás eredményeit. MP52-Ala83 van az 1. sávban, míg MP52 van a 2. sávban. Az MP52 pI¹je körülbelül 7,65, és az MP52-Ala83 pI¹je körülbelül 7,1. A 2. ábrán bemutatjuk MP52 és MP52-Ala83 pH¹függõ oldhatóságának összehasonlítását a 2. és 3. példában leírtak és az alábbi táblázat alapján. A puffereket (0,1 M nátrium-acetát/ecetsav, 429. oldal; és 0,1 M nátrium-karbonát/nátriumhidrogén-karbonát, 439. oldal) Dawson és munkatársai által leírtak szerint („Data for biochemical research”, 3. kiadás, 1986, 429. és 439. oldal, Clarendon Press, Oxford) készítettük. Tehát a pH¹függõ oldhatóság vonatkozásában kijelenthetjük, hogy MP52 és MP52Ala83 közel azonos tulajdonságú.

HU 003 923 T2

Minta

pH

Oldószer

Kihozatal (%)

MP52-Ala83

9,50

Nátrium-karbonát 0,1 M

12,2

48,96

MP52-Ala83

9,87


30,4

121,76

MP52-Ala83

10,08


41,5

166,16

MP52-Ala83

10,29


51,2

204,64

MP52-Ala83

10,49


75,8

303

MP52-Ala83

10,79


77,5

309,84

MP52-Ala83

11,07


85,7

342,96

MP52-Ala83

11,28


90,7

362,6

MP52-Ala83

11,49


97,6

390,48

MP52-Ala83

11,70


99,8

399,04

MP52-Ala83

11,87


101,7

406,96

MP52-Ala83

12,10


95,8

383,36

Minta

pH

Oldószer

Kihozatal (%)

Kihozatal (mg/ml)

MP52

9,50


2,1

8,32

MP52

9,87


27,5

110,16

MP52

10,08


34,7

138,8

MP52

10,29


52,8

211,2

MP52

10,49


54,8

219,12

MP52

10,79


74,6

298,32

MP52

11,07


77,6

310,32

MP52

11,28


82,9

331,4

MP52

11,49


94,6

378,56

MP52

11,70


99,5

398,16

MP52

11,87


91,2

364,8

MP52

12,10


94,1

376,52

Minta

pH

Oldószer

Kihozatal (%)

Kihozatal (mg/ml)

MP52-Ala83

3,72

Nátrium-acetát 0,1 M

98,4

393,48

MP52-Ala83

4,03


94,3

377,2

MP52-Ala83

4,23


92,4

369,56

MP52-Ala83

4,43


101,9

407,48

MP52-Ala83

4,63


0,5

1,88

MP52-Ala83

4,82


0,0

0

MP52-Ala83

5,03


0,0

0

MP52-Ala83

5,63


0,0

0

Minta

pH

Oldószer

Kihozatal (%)

Kihozatal (mg/ml)

MP52

3,72


104,3

417,2

MP52

3,83


94,8

379,2

MP52

4,03


94,8

379,2

MP52

4,23


97,2

390

MP52

4,43


91,2

364,8

MP52

4,63


5,6

22,4

MP52

4,82


0,1

0,4

MP52

5,03


0,0

0

11

Kihozatal (mg/ml)

1

HU 003 923 T2

2

Táblázat (folytatás) Minta

pH

Oldószer

MP52

5,22


0,0

0

MP52

5,43


0,0

0

MP52

5,63


0,0

0

A 3. ábrán bemutatjuk MP52 ionerõsségtõl függõ oldhatóságának összehasonlítását, a 2. és 3. példában leírtak és az alábbi táblázat alapján. A puffereket (nátrium-acetát/ecetsav és nátrium-karbonát/nátrium-hidrogén-karbonát) Dawson és munkatársai által leírtak szerint („Data for biochemical research”, 3. kiadás, 1986, 429. és 439. oldal, Clarendon Press, Oxford) ké-

Kihozatal (%)

Kihozatal (mg/ml)

10 szítettük. Nagy ionerõsségû oldószerekben (0,1 M, lásd a 2. ábrának megfelelõ táblázatot is) a fehérje oldhatóságára elérhetõ 200 mg/ml vagy több, 4,5 pH¹értékek alatt és 10,3 fölött. Alacsonyabb ionerõsségû oldószerekben (0,01 M, lásd lentebb a táblázatot is) a fe15 hérje oldhatóságára elérhetõ 200 mg/ml vagy több, 5,2 pH¹értékek alatt és 9,5 fölött.

Minta

pH

Oldószer

Kihozatal (%)

Kihozatal (mg/ml)

MP52

7,50

0,1 M Nátrium-karbonát

0,0

MP52

8,00


3,5

MP52

8,50


1,6

MP52

9,00


20,7

MP52

9,50


48,7

194,6

MP52

11,00


80,5

322,16

0,08 14 6,32 82,76

Minta

pH

Oldószer

Kihozatal (%)

Kihozatal (mg/ml)

MP52

3,72

0,01 M Nátrium-acetát

98,4

393,48

MP52

4,05


100,9

403,56

MP52

4,20


95,1

380,28

MP52

4,55


94,8

379,92

MP52

4,85


92,0

367,92

MP52

5,15


75,5

302,16

MP52

5,45


6,9

27,56

MP52

5,65


0,1

0,52

A 4. ábrán bemutatjuk MP52 és MP52-Ala83 stabilitását különbözõ pufferekben (10 mM HCl, 10 mM nátrium-acetát pH=4,0 és 10 mM nátrium-citrát pH=4,0), a 3. és 5. példában leírtak szerint, kéthetes, 20 °C¹on való tárolás után, RP¹HPLC-analízis alkalmazásával. Az MP52-nek (vagy MP52-Ala83-nak, sorrendben) megfelelõ, magas fõcsúcsok körülbelül 17–23 percnél (MP52), és körülbelül 11–18 percnél (MP52-Ala83) jelennek meg. További csúcsok (elõcsúcsok) jelennek meg a fõcsúcs elõtt, és a kezeletlen referencia standardektõl való eltérés jelzi a fehérjék lebomlási termékeit. Jelentõs mértékû fehérjelebomlás jelenik meg 10 mM nátrium-citrátban, míg a fehérje stabilitása 10 mM HCl-ban, és különösen 10 mM nátrium-acetátpufferben javul. Az 5. ábrán bemutatjuk MP52 és MP52-Ala83 stabilitását az alkalmazott puffer/oldószer ionerõsségének függvényében, RP¹HPLC-analízissel meghatározva. Bemutatjuk az MP52 lebomlását 10 mM és 20 mM nát-

45

50

55

60

12

rium-acetátban (pH=4,0) kéthetes, 20 °C¹on végzett tárolás után, valamint MP52-Ala83 lebomlását 10 mM és 20 mM nátrium-citrátban (pH=4,0) egyhetes, 20 °C¹on végzett tárolás után, amely példákra nem kívánjuk korlátozni a találmány által igényelt oltalmi kört. Az MP52nek (vagy MP52-Ala83-nak, sorrendben) megfelelõ, magas fõcsúcs körülbelül 15–20 percnél jelenik meg. További csúcsok (elõcsúcsok) jelennek meg a fõcsúcs elõtt, és a kezeletlen referencia standardektõl való eltérés jelzi a fehérje lebomlási termékeit. A fehérje stabilitása jó volt 10 mM nátrium-acetátban, de jelentõsen fokozódott, ha a fehérjét mérsékelt ionerõsségû pufferben tároltuk (20 mM nátrium-acetát), sõt, olyan pufferekben is, amelyek általában nem alkalmasak a morfogén fehérjék tárolására (nátrium-citrát), a fehérje stabilitásának javulása érhetõ el mérsékelt (20 mM) ionerõsségû pufferben. A 6. ábrán bemutatjuk MP52 és MP52-Ala83 stabilitását a 3. és 7. példában leírtak szerint, pH=11¹en,

1

HU 003 923 T2

pH=12¹n és pH=13¹on, 0 és 90 perc után, RP¹HPLCanalízissel meghatározva. Az MP52-nek (vagy MP52Ala83-nak, sorrendben) megfelelõ, magas fõcsúcs körülbelül 15–20 percnél jelenik meg. További csúcsok (elõcsúcsok) jelennek meg a fõcsúcs elõtt, és a kezeletlen referencia standardektõl való eltérés jelzi a fehérje lebomlási termékeit. A fehérjék stabilak magas pH¹értékeken, legalább pH=12¹ig, 90 percet nem meghaladó, rövidebb ideig pH=13¹on is stabilak. A 7. ábrán bemutatunk a 9. példában leírtak szerint, oszteoinduktív anyaggal töltött, koponyadefektusokkal (hiányokkal) rendelkezõ patkányokról készült radiográfiákat. A: kezeletlen defektusok; B: kizárólag kollagénszivaccsal kezelt defektusok; C: kollagénnel+dimer MP52-vel töltött defektusok; D: kollagénnel+monomer MP52-vel (MP52-Ala83) töltött defektusok. Míg nem látható regenerálódás a kezeletlen (7A.) vagy kizárólag

Fázis

2

mátrixanyaggal kezelt (7B.) defektusokban, megfigyelhetõ csontregenerálódás olyan koponyadefektusokban, amelyek kollagénnel és morfogén fehérjével voltak töltve (7C. és 7D.). 5 1. példa Izoelektromos fokuszálás Az izoelektromos fokuszálást nem denaturáló körülmények között végeztük, „CleanGel IEF” gél (Pharma10 cia, kat. sz. 18–1035–32) alkalmazásával. Felhasználás elõtt a szárított gélt rehidratáltuk 8 óra hosszáig, 40 ml vizes oldatban, amely 19,2 g karbamidot, 400 ml NP–40¹et (10% nátrium), 10 ml Ampholine¹t pH=3,5–10,0 (Pharmacia, kat. sz. 80–1125–87) és 15 2,5 ml Ampholine¹t pH=7,0–9,0 (Pharmacia, kat. sz. 80–1125–94) tartalmazott. A futtatási körülmények az alábbiak voltak:

Feszültség (V)

Áramerõsség (mA)

Teljesítmény (W)

Idõ (perc)

Elõfokuszálás

700

12

8

20

Minta belépése

500

8

8

60

Izoelektromos fokuszálás

2000

14

14

150

Sávok élesítése

2500

14

18

10

500 ng fehérjét vittünk fel sávonként. Futtatás után a gélt 2¹szer 15 percig fixálóoldatba (115 g/l triklór-ecetsav és 35 g/l 5¹szulfoszalicilsav-dihidrát) helyeztük, desztillált vízben mostuk, és ezüstfestést alkalmaztunk (lásd 1. ábrát). A pI meghatározása céljából az IEF után egy gélt külön az anódoldalról felvágtunk 1 cm¹es darabokra, amelyeket injekcióban alkalmazott vízben áztattunk extrakcióhoz. Ha az extraktumok pH¹it ábrázoltuk az anódoldaltól való távolság függvényében, megfigyeltük a pH¹gradiens linearitását az anódoldaltól számított 2,5–7,5 cm¹es tartományban. A pI¹értékeket úgy határoztuk meg, hogy megmértük az anód (pH=7) és a fõ csík közötti távolságot, és a pI és az anód/fõ csíkok közötti távolságra lineáris összefüggést alkalmaztunk. Az anódtól mért távolság MP52 dimer csíkra x=5,5 cm volt, és az MP52-Ala83 csíkra a távolság x=3,2 cm volt. Az alkalmazott lineáris egyenlet y=0,217*x+6,416. Tehát kísérletileg meghatározva az MP52-dimer pI¹je körülbelül 7,65, és az MP52-Ala83 pI¹je körülbelül 7,1.

3. példa Fehérjeminták fordított fázisú HPLC-analízise 30 A fehérje bomlásának meghatározására a mintákon általánosan ismert, fordított fázisú HPLC-analízist végeztünk (RP-HPLC). Különbözõ gyártóktól származó RP¹HPLC-berendezéseket alkalmaztunk. Egy alkalmas példa a kívánalmaknak megfelelõ, futtatási körül35 ményekre: oszlop: Vydac C18; 5 mm; 300 angström; 2,1×250 mm; Phase 218TP52; A¹fázis: 0,15% TFA vízben; B¹fázis: 0,15% acetonitril/TFA; áramlási sebesség: 0,3 ml/perc.

2. példa A fehérje oldhatóságának meghatározása MP52¹t és/vagy MP52-Ala83¹at elõzõleg feloldottunk 10 mmol/l HCl-ban, és liofilizáltunk. A liofilizátumokat azonos idõtartam alatt feloldottuk különbözõ oldószerekben (lásd a 2. és 3. ábrát), hogy elõállítsunk 0,4 mg/l fehérje-végkoncentrációt. Ezt követõen a mintákat RP¹HPLC-vel analizáltuk, és a kiszámítottuk a feloldott, visszanyert fehérje arányát/mennyiségét (azaz kihozatalt).

50

40

45

55

60 13

4. példa Különbözõ oldószerek hatása a fehérjék oldhatóságára MP52¹t elõzõleg feloldottunk 10 mmol/l HCl-ban, és liofilizáltunk. A liofilizátumokat azonos idõtartam, 5 perc alatt feloldottuk különbözõ oldószerekben, hogy elõállítsunk 0,4 mg/l fehérje-végkoncentrációt. Az oldhatóságot a pH¹függõ oldhatóság határára esõ, két rögzített pH¹érték (pH=10, illetve pH=4,6) alkalmazásával hasonlítottuk össze. Ezt követõen a mintákat RP¹HPLCvel analizáltuk, és a kiszámítottuk a feloldott, visszanyert fehérje arányát/mennyiségét (kihozatal). Az alábbi táblázat szerint nem oldódott az anyag pH=10¹en, ha AMP¹t [2¹amino-2-metil-1,3-propándiolHCl; lásd Dawson és munkatársai, „Data for biochemical research”, 3 kiadás (1986), 437. old., Clarendon Press, Oxford] vagy nátrium-glicint alkalmaztunk oldószerként. Jó oldhatóságot kaptunk nátrium-karbonátpufferben vagy nem pufferolt NaOH-oldatban (pH=10). pH=4,6¹on a nátrium-acetát jobb oldószernek bizonyult a nátrium-citráthoz viszonyítva.

1

HU 003 923 T2

Minta

pH

Oldószer

MP52

10


MP52

10

AMP 0,1 M

MP52

10

Nátrium-glicin 0,1 M

MP52

10

NaOH

2

Kihozatal (%)

Kihozatal (mg/ml)

34,7

138,3

0,1

0,4

0,0 97

MP52

4,6


5,6

MP52

4,6

Nátrium-citrát 0,1 M

1,1

5. példa Különbözõ oldószerek hatása a fehérje stabilitására MP52¹t és MP52-Ala83¹at feloldottunk három különbözõ oldószerben, egy nem pufferolt oldatban (10 mM HCl) és két pufferolt oldatban (10 mM nátriumacetát, pH=4,0; 10 mM nátrium-citrát, pH=4,0). Valamennyi mintát 20 °C¹on tároltunk. Két hét elteltével a mintákat fordított fázisú HPLC-analízisnek vetettük alá (3. példa), a fehérjék bármilyen mértékû lebomlásának meghatározása céljából. Az eredményeket bemutatjuk a 4. ábrán. Mínusz 80 °C¹on tárolt, MP52 vagy MP52Ala83 referencia standardekhez viszonyítva, a fehérjék jelentõs mértékû lebomlási mintázatot mutattak, ha 10 mM nátrium-citrátban voltak feloldva, míg kisebb mértékû lebomlást lehetett látni 10 mM HCl-ban. A legjobb eredményeket 10 mM nátrium-acetát-pufferben való tárolással kaptuk. 6. példa Különbözõ ionerõsségû pufferek hatása a fehérje stabilitására MP52¹t és MP52-Ala83¹at feloldottunk 10 vagy 20 mM nátrium-acetátban, pH¹ja 4 volt, vagy 10 vagy 20 mM nátrium-citrátban, pH¹ja 4 volt. Valamennyi mintát 20 °C¹on tároltunk. Egy vagy két hét elteltével a mintákat fordított fázisú HPLC-analízisnek vetettük alá (3. példa), a fehérjék bármilyen mértékû lebomlásának meghatározása céljából. Az eredményeket bemutatjuk az 5. ábrán. A fehérje stabilitása jó volt 10 mM nátriumacetátban, de jelentõsen fokozódott, ha a fehérjét mérsékelt ionerõsségû pufferben tároltuk (20 mM nátriumacetát). Sõt, olyan pufferekben, amelyek általában nem alkalmasak a morfogén fehérjék tárolására (nátriumcitrát), a fehérje stabilitásának javulása érhetõ el a magasabb ionerõsségû pufferben. 7. példa MP52 és MP52-Ala83 stabilitása pH=11¹en, pH=12¹n, pH=13-on Morfogén fehérjék bázikus pH¹értékeken való stabilitásának meghatározására MP52¹t és MP52-Ala83¹at feloldottunk Na2HPO4-pufferben. A pH¹t NaOH-dal állítottuk be pH=11¹re, pH=12¹re vagy pH=13¹ra. 0 és 90 perc elteltével a mintákat fordított fázisú HPLC-analízisnek vetettük alá, a fehérjék bármilyen mértékû lebomlásának meghatározása céljából. A 6. ábrán bemutatottak szerint, MP52 vagy MP52-Ala83 referencia standardekhez viszonyítva, nem lehetett látni jelentõ-

0,0 388 22,4 0,62

sebb változást a csúcs profiljában 0 és 90 perc után, pH=11¹en és pH=12¹n, míg lebomlási termékeknek megfelelõ elõcsúcsok jelentõs mértékben növekedtek, 15 amelyek egyértelmûen láthatók voltak 90 perc után, pH=13¹on. Azonban az MP52 fõcsúcs jelentõs része még jelen volt pH=13¹on. Tehát ez a példa igazolta morfogén fehérjék stabilitását magas pH¹értékeken, legalább pH=12¹ig. Továbbá ezek a fehérjék pH=13¹on 20 is stabilak 90 percet nem meghaladó, rövid ideig. 8. példa Mátrixanyagok savas burkolása egyenletes fehérjeeloszlás elõállítása céljából 25 Ez az általános burkolási eljárás elõnyös semleges vagy bázikus tulajdonságú mátrixanyagok burkolására, de lehet alkalmazni savas hordozók burkolására is. MP52-Ala83¹at feloldottunk 10 mM HCl-ban, 10 mM nátrium-acetátban (pH=4) vagy 20 mM nátrium30 acetátban vagy ezek kombinációjában, 1 mg/ml végkoncentrációt elérve. Adott esetben az oldatok egyet vagy többet tartalmaztak az alábbi adalék anyagokból: 8–15% szacharidok, 50–60% alkoholok, 10–75% syndetek. Az oldatokat ezt követõen b¹TCP mátrixanyag35 hoz pipettáztuk. 100 ng MP52-Ala83¹at használtunk fel 100 mg mátrixanyag burkolására. A burkolt b¹TCP¹t levegõn szárítottuk 1 óra hosszáig, 20 °C¹on, és végül levegõn szárítottuk vagy vákuumban szárítottuk bármilyen maradék folyadék eltávolítása céljából. 40 9. példa Kollagénhordozó savas burkolása és oszteoindukció bemutatása in vivo Jó szívóképességû, hemosztatikus kollagénsziva45 csokat („Helistat” típus, Integra Life Sciences, Plainsboro, USA) felvágtunk kis darabokra (0,6 cm×0,6 cm). Ezután a szivacsok durva oldalát burkoltuk, egyrészt kizárólag 60 ml hígítópufferrel (10 mM HCl/20 mM nátrium-acetát, pH=4,0) negatív kontrollként, másrészt 50 monomer MP52-Ala83-mal (500 mg/ml hígítópufferben) vagy dimer MP52-vel (500 mg/ml hígítópufferben). A szivacsmátrixokat levegõn szárítottuk, steril körülmények között. Ezt követõen meghatároztuk, hogy ezek az oszteoinduktív anyagok képesek¹e új csontnöveke55 dést indukálni in vivo, patkányokon végzett koponyadefektus-kísérlet alkalmazásával. Ebben a jól kialakított állatmodellben körkörös csonthiányokat (defektusokat) fúrtunk a patkányok koponyájába, és morfogén fehérjékkel burkolt mátriximplantátumokat helyeztünk a ter60 mészetesen nem gyógyuló lyukakba. Néhány hét után 14

1

HU 003 923 T2

ki lehet számítani az oszteoinduktív anyagok új csont növekedésére kifejtett hatékonyságát úgy, hogy meghatározzuk a defektus méretének csökkenését. A kollagénszivacs-mátrixokat rehidratáltuk beültetés elõtt 30 ml foszfátpufferolt nátrium-kloridban (PBSben), 10 percig. Az implantátumokat végül bilaterális hiányokba (átmérõjük egyenként 6 mm) helyeztük patkányok falcsontjaiba, elõzõleg már leírtak szerint [Mulliken, J. B. és Glowacki, J. Plast. Reconstr. Surg. 65, 533–559 (1980)]. Morfogén fehérje nélküli, tiszta kollagént tartalmazó implantátumok, valamint implantátum nélküli defektusok szolgáltak negatív kontrollként. 8 hét múlva az állatokat elpusztítottuk, és kontaktradiográfiát végeztünk. A patkányok falcsontdefektusainak radiográfiái jelentõs különbségeket tártak fel (7. ábra). Nem lehetett megfigyelni csontregenerálódást kezeletlen defektusokban (7A.), vagy kizárólag kollagénszivacsokkal kezelt defektusokban (7B.). Olyan állatokban, amelyekben a koponyadefektusokat kollagénnel+dimer MP52-vel töltöttük (7C.), erõteljes csontnövekedés történt a hiány határairól kiindulva. Összehasonlítható mértékû oszteoinduktív hatásokat figyeltünk meg azokban a mintákban, amelyeket kollagénnel+monomer MP52-vel (MP52-Ala83) kezeltünk (7D.).

5

10

15

20

25 10. példa Mátrixanyagok bázikus burkolása egyenletes fehérjeeloszlás elõállítása céljából Ez az általános burkolási eljárás elõnyös savas vagy semleges tulajdonságú mátrixanyagok burkolására, de lehet alkalmazni bázikus hordozók burkolására is. A továbbiakban MP52¹t és MP52-Ala83¹at feloldottunk 10 vagy 20 mM nátrium-karbonát/nátrium-hidrogén-karbonát pufferben vagy NaOH-ban (pH=12), 1 mg/ml végkoncentrációt elérve. Adott esetben az oldatok egyet vagy többet tartalmaztak az alábbi adalék anyagokból: 8–15% szacharidok, 50–60% alkoholok, 10–75% syndetek. Az oldatokat ezt követõen b¹TCP mátrixanyaghoz pipettáztuk. Ebben az eljárásban 100 ng MP52Ala83¹at használtunk fel 100 mg mátrixanyag burkolására. A burkolt b¹TCP¹t levegõn szárítottuk 1 óra hosszáig, 20 °C¹on, és végül vákuumban szárítottuk bármilyen maradék folyadék eltávolítása céljából. 11. példa Ca(OH)2-hordozó burkolása pH=12¹n, és a biológiai aktivitás mérése in vivo Hagyományos Ca(OH)2-port, melyet rutinszerûen alkalmaznak fogak javítására szolgáló eljárásokban mátrixanyagként, 1 óra hosszáig, 180 °C¹on sterilizáltunk burkolás elõtt. A Ca(OH)2 erõsen bázikus, pH¹ja 12 vizes oldatban. A burkolási eljárás alatt 71 mg, sterilizált Ca(OH)2-port összekevertünk 1:1 arányban 71 ml, szolubilizált MP52-vel (3,15 mg/ml), vagy kontrollként 71 ml vízzel, és inkubáltuk azt oszteoinduktív anyag elõállítása céljából, 12¹es pH¹értéken. MP52 bázikus pH¹értékeken megfigyelt stabilitásának igazolása céljából a burkolt MP52 biológiai aktivitását teszteltük a burkolási eljárás után. Az oszteoinduktív anyagot 1 M HCl-dal semlegesítettük, és azt követõen

30

35

40

45

50

55

60 15

2

sejttenyésztési tápközeggel hígítottuk a morfogén fehérjék felszabadítása céljából, és 400 ng/ml fehérje-végkoncentráció, és 133,2 ng/ml MP52-koncentráció elõállítása céljából. Az MP52-oldatok biológiai aktivitását alkalikus foszfatáz (ALP) in vitro mennyiségi meghatározásával mértük, megállapodott MCHT-1/26 jelû egéreredetû sejtvonal alkalmazásával. A sejteket 3 napig inkubáltuk 10% FCS¹t, L¹glutamint (20 mM) és penicillint/sztreptomicint tartalmazó alfa-MEM-tápközegben, ameddig a konfluencia 95%-nál kisebb volt. A mosott, tripszinnel kezelt sejteket újra felszuszpendáltuk ugyanebben a tenyésztési tápközegben, és szétosztottuk 96 mérõhelyet tartalmazó, mikrotitertálcákba (4,5×103 sejt/mérõhely). A sejteket 24 óra hosszáig hagytuk letapadni, mostuk (20 mM L¹glutamint tartalmazó alfa-MEM-mel), és a tenyésztési tápközegben hígított, különbözõ koncentrációjú MP52-vel érintkeztettük. Az MP52-minták minden értékét standard MP52-höz viszonyítottuk, amelyekre meghatároztuk az in vivo csontképzõ aktivitást. A sejteket 72 óra hosszáig inkubáltuk, mostuk, és lízisnek vetettük alá inkubálással 0,2% Nonidet P–40 detergensben és 1 mM MgCl2-ban, egy éjszakán át. A felülúszót összekevertük p¹nitro-fenil-foszfáttal, ami az alkalikus foszfatáz szubsztrátja, és a 37 °C¹on mûködõ reakciót 1 óra után leállítottuk. Az abszorbancia változását 405 nm¹en mértük, és a relatív biológiai aktivitás indikátoraként alkalmaztuk. A Ca(OH)2-burkolási eljárásban alkalmazott MP52 OD405-értékek (400 ng/ml: 0,629; 133,2 ng/ml: 0,378) összehasonlíthatók azokkal, amelyeket az MP52-standardre kaptunk (400 ng/ml: 0,684; 133,2 ng/ml: 0,438), míg a kontroll nem mutatott abszorbanciát 405 nm¹en. Tehát ez a kísérlet igazolta azt, hogy mátrixanyagok burkolhatók morfogén fehérjékkel magas pH¹értékeken, a biológiai aktivitás elvesztése nélkül. 12. példa Coomassie-festés a burkolás egyenletességének kimutatására A mátrixanyaghoz kötõdött fehérje mennyiségét Coomassie-festéssel tettük láthatóvá. A Coomassie Brilliant Blue egy szintetikus heterociklusos szerves festék, amely nemspecifikusan, de megközelítõleg sztöchiometrikusan kötõdik lényegében minden fehérjéhez. Savanyított Coomassie Blue festék színe vörösesbarnáról kékre változik, ha fehérjéhez kötõdik. Tehát a mátrixanyagon az egyenetlen fehérjeeloszlásra a foltos kék mintázat utal. Burkolt mátrixanyagokat inkubáltunk Coomassie festékoldattal (0,5% Coomassie Brilliant Blue R–250 40% metanolban, 60% PBS) 20 percig, szobahõmérsékleten. Azonos módon, nem burkolt mátrixanyagokat is megfestettünk, és ezek kontrollként szolgáltak. A feleslegben maradt festéket mosással távolítottuk el, 40% metanolt és 60% PBS¹t tartalmazó oldattal, amíg az a festéktõl teljesen mentes lett. Teljesen egyenletes fehérjeeloszlást láttunk a mátrixanyagokon, kék foltok nélkül, ha a burkolás poliszacharidok, különösen szacharóz jelenlétében történt. Hasonló eredményeket kaptunk alkoholok, különösen etanol, szappanok és syndetek jelenlétében.

HU 003 923 T2

Szekvencialista <110> Biopharm Ges. zur biotechnologischen Entwicklung v <120> Improved Osteoinductive Materials <130> 29725PEPAS <140> 03 007 141.9 <141> 2003–03–28 <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2703 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (640)..(2142) <400> 1

ccatggcctc tttagacagc ttcctgagtt gtgtgtgtgt gggggaaaaa tccctcagcc cggttggctt gtctggatac caagagtctc tttgaaagtc cgctgttctc

gaaagggcag atgacatcag caggtttgta gtgtgtgtgt aaaactggag ttatacaagc tctcctttca gagagcattt agactgagga cactcctttc tttggtgtca

cggtgatttt agagtaatta aaagattttt gtgtgtgtga cacacaggca ctccttcaag agaacgagtt ccactatggg gaaagccttt atggtttttc ttcagcggct

tttcacataa atatatcgca aattggtttg ggttggaatt ctgagcacct gcaggcctgt agtattttca ctggaaagga gcattacgcc attcttcctt ccctcagtca gttgtgcagg attttcagct gctgactgga actggataca aacacacacc ccttctgctg ctactgctgc ctgccaaacc agaggcacct ggccagagg atg aga ctc

cttaaatgag ccgtttccaa gagtgtgtgt ttcaaaacta cttggaaaaa agaaaggggg gacggtgcac cggcagactt tgccgctgct ttgctgctgc ccc aaa

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 654

Met Arg Leu Pro Lys 1 5 ctc ctc act ttc ttg ctt tgg tac ctg gct tgg ctg gac ctg gaa ttc Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp Leu Asp Leu Glu Phe 10 15 20

702

atc tgc act gtg ttg ggt gcc cct gac ttg ggc cag aga ccc cag ggg Ile Cys Thr Val Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly Gln Arg Pro Gln Gly 25 30 35

750

acc agg cca gga ttg gcc aaa gca gag gcc aag gag agg ccc ccc ctg Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys Glu Arg Pro Pro Leu 40 45 50

798

gcc cgg aac gtc ttc agg cca ggg ggt cac agc tat ggt ggg ggg gcc Ala Arg Asn Val Phe Arg Pro Gly Gly His Ser Tyr Gly Gly Gly Ala 55 60 65

846

acc aat gcc aat gcc agg gca aag gga ggc acc ggg cag aca gga ggc Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr Gly Gln Thr Gly Gly 70 75 80 85

894

16

HU 003 923 T2

ctg aca cag ccc aag aag gat gaa ccc aaa aag ctg ccc ccc aga ccg Leu Thr Gln Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys Leu Pro Pro Arg Pro 90 95 100

942

ggc ggc cct gaa ccc aag cca gga cac cct ccc caa aca agg cag gct Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro Gln Thr Arg Gln Ala 105 110 115

990

aca gcc cgg act gtg acc cca aaa gga cag ctt ccc gga ggc aag gca Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala 120 125 130

1038

ccc cca aaa gca gga tct gtc ccc agc tcc ttc ctg ctg aag aag gcc Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe Leu Leu Lys Lys Ala 135 140 145

1086

agg gag ccc ggg ccc cca cga gag ccc aag gag ccg ttt cgc cca ccc Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu Pro Phe Arg Pro Pro 150 155 160 165

1134

ccc atc aca ccc cac gag tac atg ctc tcg ctg tac agg acg ctg tcc Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu Tyr Arg Thr Leu Ser 170 175 180

1182

gat gct gac aga aag gga ggc aac agc agc gtg aag ttg gag gct ggc Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val Lys Leu Glu Ala Gly 185 190 195

1230

ctg gcc aac acc atc acc agc ttt att gac aaa ggg caa gat gac cga Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys Gly Gln Asp Asp Arg 200 205 210

1278

ggt ccc gtg gtc agg aag cag agg tac gtg ttt gac att agt gcc ctg Gly Pro Val Val Arg Lys Gln Arg Tyr Val Phe Asp Ile Ser Ala Leu 215 220 225

1326

gag aag gat ggg ctg ctg ggg gcc gag ctg cgg atc ttg cgg aag aag Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg Ile Leu Arg Lys Lys 230 235 240 245

1374

ccc tcg gac acg gcc aag cca gcg gcc ccc gga ggc ggg cgg gct gcc Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly Gly Gly Arg Ala Ala 250 255 260

1422

cag ctg aag ctg tcc agc tgc ccc agc ggc cgg cag ccg gcc tcc ttg Gln Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg Gln Pro Ala Ser Leu 265 270 275

1470

ctg gat gtg cgc tcc gtg cca ggc ctg gac gga tct ggc tgg gag gtg Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Gly Trp Glu Val 280 285 290

1518

ttc gac atc tgg aag ctc ttc cga aac ttt aag aac tcg gcc cag ctg Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys Asn Ser Ala Gln Leu 295 300 305

1566

tgc ctg gag ctg gag gcc tgg gaa cgg ggc agg gcc gtg gac ctc cgt Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg Ala Val Asp Leu Arg 310 315 320 325

1614

17

HU 003 923 T2

ggc ctg ggc ttc gac cgc gcc gcc cgg cag gtc cac gag aag gcc ctg Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gln Val His Glu Lys Ala Leu 330 335 340

1662

ttc ctg gtg ttt ggc cgc acc aag aaa cgg gac ctg ttc ttt aat gag Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp Leu Phe Phe Asn Glu 345 350 355

1710

att aag gcc cgc tct ggc cag gac gat aag acc gtg tat gag tac ctg Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr Val Tyr Glu Tyr Leu 360 365 370

1758

ttc agc cag cgg cga aaa cgg cgg gcc cca ctg gcc act cgc cag ggc Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly 375 380 385

1806

aag cga ccc agc aag aac ctt aag gct cgc tgc agt cgg aag gca ctg Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu 390 395 400 405

1854

cat gtc aac ttc aag gac atg ggc tgg gac gac tgg atc atc gca ccc His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro 410 415 420

1902

ctt gag tac gag gct ttc cac tgc gag ggg ctg tgc gag ttc cca ttg Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu 425 430 435

1950

cgc tcc cac ctg gag ccc acg aat cat gca gtc atc cag acc ctg atg Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met 440 445 450

1998

aac tcc atg gac ccc gag tcc aca cca ccc acc nnn tgt gtg ccc acg Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr Xaa Cys Val Pro Thr 455 460 465

2046

cgg ctg agt ccc atc agc atc ctc ttc att gac tct gcc aac aac gtg Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val 470 475 480 485

2094

gtg tat aag cag tat gag gac atg gtc gtg gag tcg tgt ggc tgc agg Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 490 495 500

2142

tagcagcact ctggaatcac gggattccaa ccacaagttc aggtccaggg gactcagccc ctctcaggag ctgtccctgg tggatagagt ataaaaagca

2202 2262 2322 2382 2442 2502 2562 2622 2682 2703

ggccctctgt agaggggtca taagcttgct ccctggctga agacagactc accatttctc agccacaggt gacagttgag tgaggagtgt aaactgtgcc

cttcctgggt ggaagctgtg cgctctctga ggattgctgc tgaatgggac ctcacctggg gccactgcct aagctgactg gaggctgtta t

ggcacatccc gcaggagcat gtgtgacttg ccgtctgctg tgagtcccag ccttctcagc cctcaaatca ggcaagagtg gactgttaga

<210> 2 <211> 501 <212> PRT <213> Homo sapiens

18

aagagcccct ctacacagct ggctaaaggc atgtgaccag gaaacagtgc ctctggactc catttgtgcc ggagagaaga tttaaatgta

tcctgcactc tgggtgaaag ccccttttat tggcaggcac tttccgatga tcctaagcac tggtgacttc ggagagggct tattgatgag

HU 003 923 T2

<400> 2

Met Arg Leu Pro Lys Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp 1 5 10 15 Leu Asp Leu Glu Phe Ile Cys Thr Val Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly 20 25 30 Gln Arg Pro Gln Gly Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys 35 40 45 Glu Arg Pro Pro Leu Ala Arg Asn Val Phe Arg Pro Gly Gly His Ser 50 55 60 Tyr Gly Gly Gly Ala Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr 65 70 75 80 Gly Gln Thr Gly Gly Leu Thr Gln Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys 85 90 95 Leu Pro Pro Arg Pro Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro 100 105 110 Gln Thr Arg Gln Ala Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly Gln Leu 115 120 125 Pro Gly Gly Lys Ala Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe 130 135 140 Leu Leu Lys Lys Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu 145 150 155 160 Pro Phe Arg Pro Pro Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu 165 170 175 Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val 180 185 190 Lys Leu Glu Ala Gly Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys 195 200 205 Gly Gln Asp Asp Arg Gly Pro Val Val Arg Lys Gln Arg Tyr Val Phe 210 215 220 Asp Ile Ser Ala Leu Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg 225 230 235 240 Ile Leu Arg Lys Lys Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly 245 250 255 Gly Gly Arg Ala Ala Gln Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg 260 265 270 Gin Pro Ala Ser Leu Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly 275 280 285 Ser Gly Trp Glu Val Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys 290 295 300

19

HU 003 923 T2

Asn Ser Ala Gln Leu Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg 305 310 315 320 Ala Val Asp Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gln Val 325 330 335 His Glu Lys Ala Leu Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp 340 345 350 Leu Phe Phe Asn Glu Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr 355 360 365 Val Tyr Glu Tyr Leu Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu 370 375 380 Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys 385 390 395 400 Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp 405 410 415 Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu 420 425 430 Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val 435 440 445 Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr 450 455 460 Xaa Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile Asp 465 470 475 480 Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu 485 490 495 Ser Cys Gly Cys Arg 500 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mesterséges szekvencia leírása: konszenzusszekvencia <220> <221> REPEAT <222> (3) <223> Xaa=(Y)25–29, ahol Y jelentése bármilyen aminosav, beleértve ciszteint is <220> <221> VARIANT <222> (5)..(7) <223> Xaa=Y, ahol Y jelentése bármilyen aminosav, beleértve ciszteint is <220> <221> REPEAT

20

HU 003 923 T2

<222> (9) <223> Xaa=(Y)25–35, ahol Y jelentése bármilyen aminosav, beleértve ciszteint is <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> Xaa=X, ahol X jelentése bármilyen aminosav, kivéve ciszteint <220> <221> REPEAT <222> (12) <223> Xaa=(Y)27–34, ahol Y jelentése bármilyen aminosav, beleértve ciszteint is <220> <221> VARIANT <222> (14) <223> Xaa=Y, ahol Y jelentése bármilyen aminosav, beleértve ciszteint is <400> 3

Cys Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mesterséges szekvencia leírása: konszenzusszekvencia <220> <221> REPEAT <222> (2) <223> Xaa=(Y)28, ahol Y jelentése bármilyen aminosav, beleértve ciszteint is <220> <221> VARIANT <222> (4)..(6) <223> Xaa=Y, ahol Y jelentése bármilyen aminosav, beleértve ciszteint is <220> <221> REPEAT <222> (8) <223> Xaa=(Y)30–32, ahol Y jelentése bármilyen aminosav, beleértve ciszteint is <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> Xaa=X, ahol X jelentése bármilyen aminosav, kivéve ciszteint <220> <221> REPEAT <222> (11) <223> Xaa=(Y)31, ahol Y jelentése bármilyen aminosav, beleértve ciszteint is <220> <220> <221> VARIANT

21

1

HU 003 923 T2

2

<222> (13) <223> Xaa=Y, ahol Y jelentése bármilyen aminosav, beleértve ciszteint is <400> 4

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mesterséges szekvencia leírása: konszenzusszekvencia <220> <221> REPEAT <222> (2) <223> Xaa=(X)28, ahol X jelentése bármilyen aminosav, kivéve ciszteint <220> <221> VARIANT <222> (4)..(6) <223> Xaa=X, ahol X jelentése bármilyen aminosav, kivéve ciszteint <220> <221> REPEAT <222> (8) <223> Xaa=(X)31–33, ahol X jelentése bármilyen aminosav, kivéve ciszteint <220> <221> REPEAT <222> (10) <223> Xaa=(X)31, ahol X jelentése bármilyen aminosav, kivéve ciszteint <220> <221> VARIANT <222> (12) <223> Xaa=X, ahol X jelentése bármilyen aminosav, kivéve ciszteint <400> 5

Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys 1 5 10 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Oszteoinduktív anyag, amely mátrixanyagot és a mátrixanyag belsõ és/vagy külsõ felszíneire adszorbeált morfogén fehérjé(ke)t tartalmaz, ahol az oszteoinduktív anyag úgy állítható elõ, hogy a mátrixanyagot és a morfogén fehérjé(ke)t olyan alkalmas körülmények között érintkeztetjük, amelyben a fehérje megõrzi stabilitását és oldatban marad, ezáltal lehetõvé válik, hogy a mátrixanyagot egyenletesen burkolja(ák) be a morfogén fehérje(ék), ahol az alkalmas körülményeket az alábbiak közül választjuk:

(a) olyan puffer vagy oldószer alkalmazása, amely képes a pH¹t 4,5 alatt vagy 10,3 fölött tartani a burkolá50 si eljárás alatt, vagy (b) olyan puffer vagy oldószer alkalmazása, amelynek ionkoncentrációja 100 mmol/l vagy kisebb, és képes a pH¹t 5,2 alatt vagy 9,5 fölött tartani a burkolási eljárás alatt. 55 2. Az 1. igénypont szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a morfogén fehérje legalább a TGF-b-szupercsalád fehérjéire jellemzõ, 7 ciszteines régiót tartalmazza. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti oszteoin60 duktív anyag, amelyben a morfogén fehérje érett fe22

1

HU 003 923 T2

hérje vagy annak biológiailag aktív része vagy variánsa. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a morfogén fehérje a TGF¹b, BMP¹, GDF¹, aktivin- vagy GDNF-családhoz tartozik. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a morfogén fehérje dimer fehérje. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a morfogén fehérje BMP2, BMP7, BMP12, BMP13, MP52 (GDF5) vagy annak biológiailag aktív része vagy variánsa. 7. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a morfogén fehérje olyan fehérje, amely nem tartalmazza azt a ciszteint, amely a dimer kialakulásáért felelõs a megfelelõ természetben elõforduló fehérjékben. 8. Az 1–4. és 7. igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a morfogén fehérje egy konszenzusszekvenciát tartalmaz az alábbiak szerint: I. képlet: C(Y)25–29CYYYC(Y)25–35XC(Y)27–34CYC vagy II. képlet: C(Y)28CYYYC(Y)30–32XC(Y)31CYC, amelyben C jelentése cisztein, Y jelentése bármilyen aminosav, és X jelentése bármilyen aminosav cisztein kivételével. 9. Az 1–4., 7. és 8. igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a fehérje MP52 monomer formája. 10. A 9. igénypont szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a fehérje MP52-Ala83 vagy annak biológiailag aktív része vagy variánsa. 11. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a mátrixanyag biológiailag kompatibilis anyag. 12. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a mátrixanyag természetes anyag, módosított természetes anyag vagy szintetikus anyag. 13. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a mátrixanyag porózus anyag. 14. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a mátrixanyag az alábbi anyagok közül legalább egyet tartalmaz: a) kollagén, b) Ca(OH)2, c) polilaktid vagy polilaktidszármazékok, d) hialuronsav, e) polioxi-etilén-polioxi-propilén kopolimerek, f) kalcium-foszfát, g) hidroxiapatit és kollagén kombinációja, h) poliglikolsav és politejsav vagy polilaktidszármazékok kombinációja. 15. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a burkoláshoz használt puffer vagy oldószer ionkoncentrációja 80 mmol/l vagy kisebb, 40 mmol/l vagy kisebb, 20 mmol/l vagy kisebb, 10 mmol/l vagy kisebb, vagy 5 mmol/l. 16. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a burkoláshoz használt puffer vagy oldószer tartalmaz továbbá szacharidokat is. 17. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a burkoláshoz használt

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 23

2

puffer vagy oldószer tartalmaz továbbá alkoholokat vagy más szerves oldószereket is. 18. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a burkoláshoz használt puffer vagy oldószer tartalmaz továbbá szappanokat vagy „syndet”-eket is. 19. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a morfogén fehérje(ék) kovalensen vagy nem kovalensen kapcsolódnak polietilénglikolokhoz. 20. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a savas burkoláshoz használt puffer vagy oldószer HCl¹ot vagy nátrium-acetátot tartalmaz. 21. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag, amelyben a bázikus burkoláshoz használt puffer vagy oldószer NaOH¹ot vagy nátriumkarbonátot/nátrium-hidrogén-karbonátot tartalmaz. 22. Eljárás az 1–20. igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag elõállítására, amely eljárásban mátrixanyagot érintkeztetünk legalább egy morfogén fehérje oldatával, azzal jellemezve, hogy az oldatban lévõ anyagokat úgy választjuk ki, hogy lehetõvé tegyék az oldat pH¹jának beállítását 5,2 alá, még akkor is, amikor érintkeztetjük a mátrixanyaggal. 23. Eljárás az 1–19. és 21. igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag elõállítására, amely eljárásban mátrixanyagot érintkeztetünk morfogén fehérje oldatával, azzal jellemezve, hogy az oldatban lévõ anyagokat úgy választjuk ki, hogy lehetõvé tegyék az oldat pH¹jának beállítását 9,5 fölé, még akkor is, amikor érintkeztetjük a mátrixanyaggal. 24. Az 1–21. igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag alkalmazása porc, csont, kötõszövet, ideértve ín és/vagy ínszalag, periodontális (fog körüli) vagy fogszövet, idegszövet, szenzoros rendszert felépítõ szövet, máj¹, hasnyálmirigy¹, szív¹, ér¹, vese¹, méh- és pajzsmirigyszövet, bõr, nyálkahártyák, endotélium, epitélium helyreállítására vagy növesztésére alkalmas gyógyszer elõállítására. 25. Az 1–21. igénypontok bármelyike szerinti oszteoinduktív anyag alkalmazása idegnövekedés, szövet-helyreállítás és regenerálás, angiogenezis, sebek, például fekélyek, égések, sérülések vagy bõrgraftok gyógyulásának elõsegítésére vagy indukciójára, progenitorsejtek vagy csontvelõsejtek proliferációjának indukciójára, kötõszövet és csont közötti funkcionális kapcsolat regenerálására, porc helyreállítására, oszteoporózis (csontritkulás) vagy oszteoartritisz kezelésére, nem tökéletesen összeforrt törések, szerzett vagy öröklött koponya¹, csontváz- vagy fogászati abnormalitások kijavítására, plasztikai vagy rekonstrukciós sebészetben nem vázizomszövet pótlására alkalmas gyógyszer elõállítására. 26. A 24. vagy 25. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a betegséget vagy rendellenes állapotot ischaemiás vagy traumás sérülés, degeneratív betegség, kardiomiopátiák, atherotrombotikus vagy kardioembolitikus szélütések, fekélyesedés, cirrózis, emfizéma, sejt öregedése vagy sejt nyugalmi állapota okozza.

HU 003 923 T2 Int. Cl.: A61L 27/34

24

HU 003 923 T2 Int. Cl.: A61L 27/34

25

HU 003 923 T2 Int. Cl.: A61L 27/34

26

HU 003 923 T2 Int. Cl.: A61L 27/34

27

HU 003 923 T2 Int. Cl.: A61L 27/34

28

HU 003 923 T2 Int. Cl.: A61L 27/34

29

HU 003 923 T2 Int. Cl.: A61L 27/34

30

HU 003 923 T2 Int. Cl.: A61L 27/34

31

HU 003 923 T2 Int. Cl.: A61L 27/34

32

HU 003 923 T2 Int. Cl.: A61L 27/34

33

HU 003 923 T2 Int. Cl.: A61L 27/34

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest

(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Recommend Documents