(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (54) Bakteriális poliszacharidok alkalmazása biofilmképzõdés gátlására

!HU000008368T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 008 368

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 06291080 2006. 06. 30.

(73) Jogosultak: Institut Pasteur, 75015 Paris (FR); Centre National de la Recherche Scientifique, 75016 Paris (FR)

EP

(72) Feltalálók: GHIGO, Jean-Marc, 92260 Fontenay aux Roses (FR); VALLE, Jaione, Zizur Mayor (ES); DA RE, Sandra, 87100 Limoges (FR) (54)

HU 008 368 T2

A61K 39/102

(21) Magyar ügyszám: E 07 804998 (22) A bejelentés napja: 2007. 06. 25. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20070804998 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 2046378 A2 2008. 01. 10. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 2046378 B1 2010. 03. 10.

(2006.01) A61P 31/04 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 08004128 PCT/IB 07/002875

(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest

Bakteriális poliszacharidok alkalmazása biofilmképzõdés gátlására

A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül 8 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.

1

HU 008 368 T2

A találmány tárgyát képezi biofilmképzõdés gátlása. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezik új komponensek, amelyek képesek megelõzni és/vagy gátolni a bakteriális biofilm képzõdését különbözõ felületeken. Biofilm alatt poliszacharidmátrixba ágyazódott és biológiai vagy nem biotikus felülethez tapadó mikroorganizmusok felhalmozódását értjük. Ezekben a biofilmekben különbözõ mikroorganizmusok lehetnek jelen (baktériumok, gombák, és/vagy protozoonok, a velük asszociált bakteriofágokkal és egyéb vírusokkal). A biofilmek mindenütt megtalálhatók a természetben és szokásosan elõfordulnak a legkülönbözõbb környezetekben, így például háztartási és ipari vízvezetékekben. A biofilmek egyúttal számos kóros állapot etiológiai forrásai emlõsökben. Ilyenek például a száj lágyszövetei, fogak, középfül, gyomor-bél rendszer, húgyivarszervek, légutak/tüdõszövet, hashártya és szem fertõzései. Biofilmek képzõdhetnek továbbá orvosi beavatkozás során beültetett eszközökön, például fogimplantátumokon, húgyúti protézisek, peritoneális dialízis katéterek, hemodialízis és kemoterápiás szerek tartós adagolása céljából beültetett katéterek (Hickman-katéterek), kardiális implantátumok, például pacemakerek, mûbillentyûk, mûszívek („ventricular assist devices”, VAD), szintetikus érprotézisek és sztentek, protézisek, belsõ rögzítõeszközök, perkután varratok, és tracheális és lélegeztetõcsövek. A biofilmképzõdés ipari eszközökben, például vízvezetékekben és mezõgazdasági-élelmiszer-ipari berendezésekben ugyancsak biztonsági problémát vet fel. A kutatások és antibiotikumok kifejlesztése során rendszerint planktonikus baktériumokat (azaz egysejtû, folyékony közegben szuszpendált baktériumokat) alkalmaznak modellként. A biofilmekben található baktériumok azonban sokkal rezisztensebbek antibiotikumokkal szemben, mint planktonikus megfelelõik, és kevésbé hozzáférhetõk az immunrendszer számára. Ezenfelül, biofilmekben nagyobb gyakorisággal történik konjugáció a sejtek között, mint planktonikus sejtek között. A baktériumok közti géntranszfer ezen fokozott lehetõsége azért fontos, mert antimikrobiális szerekre vagy kémiai biocidekre rezisztens baktériumok a rezisztenciagéneket átadhatják szomszédos, érzékeny baktériumoknak. A géntranszfer következtében korábban nem virulens, társorganizmusok magas virulenciájú kórokozókká alakulhatnak. A biofilmképzõdés nem korlátozódik baktériumok felülethez történõ tapadásához. Valójában, a réteg belsejében szaporodva, a baktériumok sokkal inkább egymással lépnek kölcsönhatásba, mint az aktuális fizikai hordozóval, amelyen a biofilm eredetileg kialakult. A biofilmben, a baktériumok kémiai jelzõ mechanizmusokkal kommunikálhatnak egymással úgy, hogy a közösség fenotípusos változásokon megy át, amikor a populáció egy minimális denzitást („quorum”) ér el a biofilmben. Ez a jelenség, amelyet quorum sensing (a baktériumok saját populációsûrûségét észlelõ és arra reagáló) mechanizmusnak neveznek, felelõs lehet a virulenciafaktorok kifejezõdésért.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

E. coli biofilmmel asszociált poliszacharidok, például kolánsavpolimerek, cellulóz és (1–6)-b-N-acetilglükóz-amin mellett, E. coli izolátumok két szerotípusspecifikus felszíni poliszacharidot is termelnek: a lipopoliszacharid (LPS) O¹antigént és tokpoliszacharid (capsular polysaccharide) K¹antigént. Errõl a két, felszínen megjelenített poliszacharid-polimer osztályról kimutatták, hogy indirekt módon szerepet játszanak a biofilmképzõdésben azáltal, hogy eltakarják a bakteriális felszíni adhezineket [Schembri és munkatársai: (2004)]. A biofilmek képzõdésének megakadályozására és/vagy azok roncsolására irányuló, eddig ismertetett stratégiák fõként „quorum sensing” inhibitorokon alapultak [Schachter: (2003)]. A jelen találmány új stratégiát nyújt a biofilmképzõdés gátlására, mivel in vitro kevert speciesekbõl álló bakteriális biofilm alkalmazásával kimutattuk, hogy egyes baktériumok szolubilis, II¹es csoportba tartozó tokpoliszacharidot bocsátanak ki a tenyészet felülúszójába, amelyek Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumok széles körénél megakadályozzák biofilm képzõdését. Amint azt a kísérletes részben az alábbiakban leírjuk, ezek a tokkomponensek a felszín fizikokémiai változását idézik elõ, sejt-felszín és sejt-sejt kontaktusok csökkenéséhez vezetve, amely mind a kezdeti adhéziót, mind a bakteriális biofilm képzõdését korlátozza. Ennek megfelelõen, a találmány elsõ célkitûzése baktériumtörzsbõl származó, szolubilis, II¹es csoport típusú tokpoliszacharid alkalmazása készítmény elõállítására, amely megakadályozza, vagy gátolja mikroorganizmusok adhézióját és/vagy biofilm kialakulását, közelebbrõl, megelõzi vagy gátolja a bakteriális adhéziót és/vagy a bakteriális biofilmképzõdést. Az alábbiakban a „poliszacharid” kifejezés, bár egyes számban használjuk, különbözõ poliszacharidok keverékére is vonatkozhat. A baktériumok által termelt tokpoliszacharidok valójában különbözõ méretûek. Közelebbrõl, az E. coli tokok, amelyek a sejtfelszín legkülsõ védõrétegét alkotják, genetikai és biosztintéziskritériumok alapján négy csoportra oszthatók. A II¹es csoportba tartozó tok az E. coli esetében leírt négy toktípus egyike, amelyet az uropatogén Escherichia coli (UPEC) és egyéb extraintesztinális E. coli-törzsek többsége által termelt, nagy molekulatömegû, és töltéssel rendelkezõ polimerek építenek fel. A II¹es csoportba tartozó tok konzervált moduláris genetikai szervezõdést mutat, amelyet három funkcionális régió jellemez. Az I. (kpsFEDCUS) és 3. régió (kpsMT) valamennyi II¹es csoportba tartozó tokos baktériumban konzervált, és ABC-függõ transzporthoz szükséges proteineket kódol. A 2. régió különbözõ poliszacharid strukturális komponenseket kódol, például a K1, K2 (CFT073), K5 és K96 tok szerotípusokat [Whitfield: (2006); Whitfield és Roberts: (1999)]. Ezenfelül, II¹es csoport típusú tokokat leírtak Haemophilus influenzae és Neisseria meningitidis esetében is [Roberts: (1996)]. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a szolubilis, II¹es csoport típusú tokpoliszacharidot Escherichia coli, Haemophilus influenzae és Neis-

1

HU 008 368 T2

seria meningitidis közül választott baktérium tenyészetének felülúszójában kapjuk. A leírásban, a „szolubilis, II¹es csoport típusú tokpoliszacharid” kifejezés vonatkozhat más baktériumok által elõállított tokpoliszacharidokra is, azzal a kikötéssel, hogy a fent említett törzsek által termelt tokpoliszacharidok esetében megfigyelt, biofilm elleni aktivitásukat megtartják. Például az ECOR gyûjtemény 47¹es törzse által termelt tokpoliszacharidokat [Ochman és Selander: (1984)] „II¹es csoport típusú tokpoliszacharidnak” tekintjük, annak ellenére, hogy ez a törzs valójában hibrid, II¹es/III¹as csoportba tartozó tokot termel. A találmány szerinti megoldásban különbözõ tisztítottsági fokú poliszacharidok alkalmazhatók. Például a találmány szerinti megoldással összhangban, szolubilis, II¹es csoport típusú tokpoliszacharidot tartalmazó készítményként alkalmazható bakteriális tenyészet nyers felülúszója (a baktériumoktól filtersterilizálással vagy centrifugálással elválasztva). A készítmény biofilm elleni aktivitásának, valamint biztonságosságának növelése érdekében azonban a szolubilis, II¹es csoport típusú tokpoliszacharid tisztított frakcióként is elõállítható. A szemléltetés kedvéért, azonban a korlátozás szándéka nélkül, az alábbi kísérletes részben három tisztítási szintet ismertetünk. További lehetõség szerint, a találmány szerinti készítmény közvetlen módon elõállítható a bakteriális tenyészetbõl, például a baktériumok lízisét követõen. A találmány további célkitûzése készítmény elõállítása bakteriális adhézió és/vagy bakteriális biofilmképzõdés gátlására, amely bakteriális törzsbõl származó, szolubilis, II¹es csoport típusú tokpoliszacharidot tartalmaz. Ilyen készítmény különbözõ tisztítottsági szintû poliszacharidokat tartalmazhat. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, az ilyen készítmény E. coli, H. influenzae és N. meningitidis közül választott baktériumtenyészet felülúszójának szolubilis, II¹es csoport típusú tokpoliszacharidokat tartalmazó, tisztított frakcióját tartalmazza. Ezenfelül, a találmány tárgyát képezi továbbá eljárás II¹es csoport típusú tokpoliszacharid biofilm elleni tisztítására bakteriális törzsbõl, amely a következõ lépéseket tartalmazza: (i) II¹es csoport típusú tokot expresszáló baktériumtörzs-tenyészet felülúszójának elválasztását a bakteriális sejtektõl; (ii) a jelen levõ poliszacharidok precipitálását a kapott felülúszóból; és (iii) adott esetben, a precipitátum ismételt szuszpendálását. A fenti eljárást elõnyösen E. coli, H. influenzae és N. meningitidis közül választott baktériumtörzs, elõnyösebben uropatogén E. coli alkalmazásával végezzük. A fenti eljárásban, az (i) lépést végezhetjük a bakteriális tenyészet centrifugálásával és/vagy filtersterilizálásával annak érdekében, hogy a baktériumsejteket eltávolítsuk. Például, ipari eljárásokban tangenciális szûrést alkalmazhatunk, bármely elõzetes centrifugálás nélkül. A tangenciális szûrés folyamatosan is végezhetõ.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

Szakember képes a technika állása szerint ismert bármely precipitációs eljárás alkalmazására, a fenti eljárás második lépésének kivitelezéséhez. Például, a (ii) precipitációs lépés végezhetõ a felülúszó térfogatára vonatkoztatott háromszoros térfogatú etanollal. A találmány szerinti eljárás elõnyös változatában, a (ii) lépésben kapott precipitátumot elõször vízben ismét szuszpendáljuk, ionmentesített vízzel szemben dializáljuk, és a (iii) lépés elõtt liofilizáljuk. A szuszpendálást a (iii) lépésben végezhetjük vízben vagy bármely, a célra alkalmas pufferben. Pufferként alkalmazható például 20 mmol/l Tris-HCl (pH=7,5), 25% 1¹propanollal kiegészítve. A (iii) lépés végén, a biofilm elleni poliszacharidokat félig tisztított termékként kapjuk meg, amelyek a találmány szerint ilyen formában alkalmazhatók, különösen olyan alkalmazásokban, ahol nincs szükség orvosi tisztaságú termékekre. A poliszacharidok további tisztítására, a tisztítási eljárás egy további (iv) kromatográfiás, különösen ioncserélõ kromatográfiás tisztítási lépést is tartalmazhat, például DEAE-Sepharose oszlop alkalmazásával. A találmány ezen megvalósítási módjában, a (iii) és (iv) lépések közé adott esetben egy centrifugálási lépés iktatható be, az oldhatatlan frakció eltávolítására. Szakember képes bármely, a (iv) lépésben alkalmazható megfelelõ puffer kiválasztására. Pufferként alkalmazható például 20 mmol/l Tris-HCl (pH=7,5), 25% 1¹propanollal kiegészítve. Az eljárás egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a precipitátumot a (iii) lépésben 25% 1¹propanolt tartalmazó 20 mmol/l TrisHCl-pufferben újraszuszpendáltuk (pH=7,5), és a (iv) lépésben alkalmazott az oszlopot ugyanezzel a pufferrel ekvilibráltuk. Amennyiben a tisztítási lépést ioncserélõ kromatográfiával végezzük, a II¹es csoport típusú tokpoliszacharidokat sógradienssel, például NaCl-gradienssel eluálhatjuk. Az eljárás egyik hatékony, a kísérletes részben ismertetett megvalósítási módja szerint, a II¹es csoport típusú tokpoliszacharidokat 25% 1¹propanolt tartalmazó 20 mmol/l Tris-HCl-pufferben, 300 mmol/l NaCl-oldattal eluáljuk. Természetesen, a fenti eljárással kapott, szolubilis, II¹es csoport típusú tokpoliszacharidok, a találmány szerinti megoldással összhangban, alkalmazhatók bakteriális adhéziót és/vagy bakteriális biofilmképzõdést megakadályozó és/vagy gátló készítmény elõállítására. Ilyen tisztított poliszacharidokat tartalmazó biofilm elleni készítmény szintén a találmány tárgyát képezi. A találmány egy közelebbi megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti készítményt preventív vagy terápiás adagolásra formulázzuk arra rászoruló egyén számára. A találmány fenti szempontja szerinti készítmények a korlátozás szándéka nélkül lehetnek például szájon át adagolható oldatok, fülbe infundálható oldatok, kollirium (szemvíz), fogpaszta vagy terápiás fogtisztító szer, és hasonlók. Ezek a készítmények alkalmazhatók például a bél, tüdõ, fül, szinusz vagy bármely

1

HU 008 368 T2

más szerv vagy üreg patogén baktériumokkal történõ (újra)kolonizálódásának a gátlására. A találmány egyik további megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti készítmény folyadék vagy paszta, például festék, amely bármely felületen alkalmazható, hogy megakadályozzuk biofilm képzõdését ezeken a felületeken. A jelen találmány egy további szempontja szerint, a találmány tárgyát képezi biofilm elleni bevonat, amely bakteriális törzsbõl származó II¹es csoport típusú tokpoliszacharidot tartalmaz. Ilyen bevonatokban, a II¹es csoport típusú tokpoliszacharid, a fent leírtak szerint, különbözõ tisztítottsági fokú lehet. A találmány szerinti bevonat egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a II¹es csoport típusú tokpoliszacharid E. coli, H. influenzae és N. meningitidis közül választott baktériumtörzsbõl származik. Ez a bevonat elõállítható például a fent ismertetett készítmény alkalmazásával. Az lehet továbbá lemezek formájában, amelyek bármely eszközre felvihetõk, amelyen biofilm képzõdését el kívánjuk kerülni. Ennek megfelelõen, ugyancsak a találmány tárgyát képezi orvosi vagy ipari eszköz, amely bakteriális törzsbõl származó, II¹es csoport típusú tokpoliszacharidot tartalmazó biofilm elleni hatású bevonattal legalább részben be van vonva. Ilyen célkitûzés elérhetõ például úgy, hogy az eszköz egy részét vagy az egész eszközt a fent ismertetett folyékony készítménybe mártjuk. Szakember képes az inkubációs idõtartam megválasztására az adott anyagtól, a készítményben a II¹es csoport típusú tokpoliszacharid koncentrációjától, az alkalmazás céljától, és hasonló faktoroktól függõen. Tipikusan, az inkubáció 10 másodperctõl 30 percig terjedõ idõtartam lehet. Rövid (£1–5 perces) inkubációs idõk rendszerint elegendõek. Amennyiben szükséges, a bevont eszköz ezután különbözõ kezelésekkel sterilizálható, a bevonat károsítása nélkül. Például azt intenzív mosásnak vethetjük alá és/vagy autoklávozhatjuk. A találmány fenti szempontja szerint, például üvegbõl, pirexbõl, PVC-bõl, polikarbonátból, polipropilénbõl és hasonlókból készült, bármilyen eszköz elõnyösen bevonható. A találmány fenti szempontja szerint elõnyösen bevonható orvosi eszközök például, a korlátozás szándéka nélkül, szikék, fúrófejek és más, nem egyszer használatos sebészeti és/vagy fogászati eszközök, beültethetõ eszközök, például fogászati implantátumok, húgyúti protézisek, peritoneális dialízis katéterek, hemodialízis- és kemoterápiás szerek tartós adagolása céljából beültetett katéterek (Hickman-katéterek), kardiális implantátumok, például pacemakerek, mûbillentyûk, mûszívek („ventricular assist devices”, VAD), szintetikus érprotézisek és sztentek, protézisek, belsõ rögzítõeszközök, perkután varratok, valamint tracheális és lélegeztetõcsövek. A találmány fenti szempontja szerint elõnyösen bevonható ipari eszközök például, a korlátozás szándéka nélkül, vízvezeték-komponensek, például csõvezetékek, csövek, szelepek és hasonlók, léghûtéses tornyok, meleg vízrendszerek, nukleáris erõmûvek hûtõkörei, elsõsorban másodlagos vagy harmadlagos kö-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 4

2

rök, az agrár-élelmiszer szektorban használt anyagok, például silók, fermentorok, szûrõk stb., bútorelemek, mint például laboratóriumi asztalok, pult felületek és hasonlók, különösen tiszta helységekben, és hasonlók. A találmányt az alábbi ábrákon és példákon keresztül szemléltetjük. Az ábrák rövid ismertetése 1. ábra: A CFT073 törzs biofilmgátló hatása. A. MG1655F’ biofilmképzése 1 vagy 10 OD600 nm ekvivalens KS272 (szürke) vagy CFT073 (fekete) sejtekkel beoltott mikrofermentorokban. MG1655F’ biofilm önmagában (Ø, fehér) Az eredmények hat párhuzamos vizsgálat adatait képviselik, ±standard eltéréssel (±s. d.). Az MG1655F’ biofilmhez viszonyítva p<0,001. B. Mikrotitrálólemezeken létrejött MG1655F’ biofilm önmagában (Ø) vagy KS272- vagy CFT073-felülúszó (S.KS272, illetve S.CFT073) jelenlétében. C. MG1655F’ biofilm felülúszó nélkül, vagy KS272- vagy S.CFT073-felülúszót tartalmazó közeggel perfundált mikrofermentorokban. D. MG1655F’ növekedési görbék felülúszó nélkül (Ø), vagy S.KS272- vagy S.CFT073-felülúszó jelenlétében. E. MG1655F’-sejtek viabilitása felülúszó nélkül (Ø), vagy S.KS272 vagy S.CFT073 jelenlétében, BacLight festéssel detektálva. F. Különbözõ baktériumok biofilmképzésének kvalitatív analízise mikrotitrálólemezekben, CFT073-felülúszó (S. CFT) jelenlétében. 2. ábra: CFT073-felülúszó hatása Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok biofilmképzésére. A. Különbözõ baktériumok biofilmképzésének kvantitatív meghatározása mikrotitrálólemezeken, felülúszó nélkül (Ø), vagy KS272 (S.KS) vagy CFT073 (S.CFT) jelenlétében. A visszatartott kristályibolya mennyiségét mértük fotometriás eljárással (OD570 nm). B. Néhány patogén baktérium biofilmképzésének kvantitatív meghatározása mikrofermentorokban, kiegészítés nélkül (Ø), vagy S.CFT- vagy S.KS-felülúszóval kiegészített közeg alkalmazásával. A hibazászlók két független kísérlet alapján számolt standard deviációt jelölnek. C. CFT073-felülúszó (S.CFT073) hatása E. coli (MG1655F’) és P. aeruginosa (PAK), K. pneumoniae (KP21), S. epidermidis (O¹47), S. aureus (15981) kevert biofilmekre, valamint S. epidermidis (O–47), és S. aureus (15981) és E. faecalis (54) kevert biofilmekre. II¹es csoportú tokot nem szekretáló E. coli CFT073AkpsD (S. DkpsD) törzs felülúszót alkalmaztunk ne-

1

3. ábra:

4. ábra:

5. ábra:

6. ábra:

HU 008 368 T2

gatív kontrollként. D. S. aureus és P. aeruginosa biofilmkézésének kvalitatív analízise mikrofermentorokban, nem kiegészített, vagy CFT073-felülúszóval kiegészített közeg alkalmazásával. A tokképzés és az CFT073-felülúszó biofilm elleni aktivitása közti korreláció. A CFT073 tok R1, R2 és R3 régióinak genetikai szervezõdése. A transzpozoninszerciókat tartalmazó géneket csillaggal jelöltük. B. A tok mutáns felülúszók jelenlétében tenyésztett MG1655F’ biofilmképzése. C. Hexózszintek a felülúszókban. A kpsF, kpsU, c3692 és c3693 tokképzést hátrányosan nem befolyásoló mutánsok. D. Stacioner fázisú CFT073 vagy CFT073D baktériumsejttokok ferritinnel megfestve, transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálattal (nagyítás: 100 000X; skála=0,2 mm) (bal oldali ábra); 125, illetve 105 sejtet vizsgáltunk meg. A megfestett CFT073-tokot nyíllal jelöltük. A jobb oldali ábrán stacioner fázisú CFT073 vagy CFT073DkpsD (nagyítás: 50 000X; skála=0,5 mm) pásztázó elektronmikroszkópos képe látható. Százhuszonöt (125), illetve 105 sejtet vizsgáltunk meg. A biofilm elleni aktivitás és a II¹es csoportú tok közti korreláció vizsgálata. E. coli MG1655F’ és 1091 jelzésû törzsek, valamint a S. aureus 15981 törzs biofilmképzését vizsgáltuk, amelyeket: (A) biofilm elleni aktivitású E. coli felülúszók (lásd 1. táblázat) (a 47¹es törzs kivételével valamennyi vizsgált törzs II¹es csoport típusú tokot termelt), (B) CFT073¹, U¹9¹, U–15törzsek és megfelelõ kpsD-mutánsaik felülúszójának jelenlétében tenyésztettünk. (C) M63B1glu tápközegben tenyésztett CFT073, U–9, U–15 (fekete) UPEC-törzsek és megfelelõ kpsD-mutánsaik (szürke), valamint a megfelelõ vad típus felülúszójával kiegészített kpsD-mutánsok (fehér) biofilmképzése mikrofermentorban. Biofilmeket 26 óráig hagytunk növekedni, 37 °C¹on. A hibazászlók az átlag standard eltérését jelentik. Az egyszerû számokkal azonosított törzsek az EcoRgyûjtemény törzseinek felelnek meg [Ochman és Selander: (1984)]. Neisseria meningitidis felülúszó biofilm elleni hatásának vizsgálata. MG1655F’ biofilmképzését határoztuk meg kvantitatív módon S. Neisseria jelenlétében. A kristályibolya festék 570 nm¹en mért OD¹értékét O’Toole és Kolter (1988) által leírtak szerint határoztuk meg. CFT073-felülúszó fizikokémiai tulajdonságai. a. CFT073 (CFT), U–9, IHE3034

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

(IHE), EcoR72 (E–72) (fekete) és az elõbbieknek megfelelõ tokmutáns (világosszürke) törzsekbõl származó dializált felülúszókkal inkubált kationos kolloidok z¹potenciálja, b. Vízcsepp peremszöge a CFT, U9, IHE, E–72 törzsekkel (sötétszürke) és a tok mutánsokkal (világosszürke) inkubált felületeken, c. Propidium-jodid adszorpciója CFT, U–9, IHE, E–72, FR2 (CFT073-felülúszó tisztított frakció) (sötétszürke) és megfelelõ tokmutánsaik (világosszürke) jelenlétében inkubált kationos részecskékre. Az adszorpció mértékét fluoreszcens intenzitásban adtuk meg (>670 nm). d. CFT, S.CFT073DR1 (ØR1), FR2 és nem inkubált (Ø) kationos részecskék fluoreszcens mikroszkópiás képe. A hibazászlók az átlag standard eltérését jelentik. 7. ábra: CFT073-felülúszó biofilmgátló hatása bevont felületeken. Néhány baktérium biofilmképzése mikrofermentorokban, az alábbiak alkalmazásával: kezeletlen üveglemezek (felsõ kép), CFT073-felülúszóval kezelt üveglemezek (középsõ kép), CFT073DkpsD ¹felülúszóval kezelt üveglemezek (alsó kép). 8. ábra: S.CFT073-felülúszóval (S.CFT) bevont spatula kezelésének hatása MG1655F’ általi biofilmképzés mikrofermentorokban, kezeletlen üveglemezek és S.CFTvel vagy forralt S.CFT-vel kezelt, majd autoklávozott vagy alapos mosásnak alávetett üveglemezek alkalmazásával. 9. ábra: A CFT073-felülúszó befolyásolja a sejtsejt kölcsönhatást. A. MG1655F’ általi biofilmképzés mikrofermentorokban, CFT073-felülúszóval (S.CFT) a 0., 1. vagy 6. órában kiegészített tápközeggel (24 órás tenyészet), és 24. órában kiegészített tápközeggel (48 órás tenyészet). Ø: S.CFT hozzáadása nélkül. B. GFP-jelölt MG1655F’ átfolyásos kamrába oltva és konfokális mikroszkóppal vizsgálva. CFT073- vagy KS272-felülúszókat három órás tenyésztést követõen egészítettünk ki, és a biofilmeket összesen 12 óráig hagytuk növekedni. C. Autoaggregációs vizsgálat különbözõ mechanizmusok szerint aggregálódó törzsekkel. MG1655F’ (konjugatív F¹pilus expresszió); MG1655ompR234 („curli” fimbria erõs expresszió); MG1655DoxyR (Ag43 autotranszporter adhezin overexpresszió); 1094 (cellulóztermelés). A sejteket OD600 nm¹en mért 2¹es értékig 3 ml M63B1 tápközegben (háromszög), CFT073-felülúszóban (karika) és DkpsD-felülúszóban (négyszög) hígítottuk.

1

HU 008 368 T2

10. ábra: Az FR2-frakció biofilm elleni aktivitása. A CFT073-felülúszó tisztított frakcióját (FR2) MG1655F’ tenyészethez adtuk 0,5–500 mg/ml koncentrációban. Az MG1655F’ biofilmképzését 24 óra múlva láthatóvá tettük. Az 50–100 mg/ml tartományba esõ koncentrációk gátolták az MG1655F’ biofilmképzését. 11. ábra: CFT073 és CFT073DR1 kolonizációja a bélben. a. A skálák 1 gramm székletben található telepképzõ egységek (CFU) log10-ben megadott átlagos számának standard hibáját jelentik; a statisztikai analíziseket Mann–Whitney-teszttel végeztük; a statisztikai szignifikancia szintjét (*) >0,016 p¹értékeknél határoztuk meg. b. A vastagbél (colon) és vakbél (coecum) kolonizációja CFT073- (karika) és CFT073DR1- (háromszög) törzsekkel. DL („detection limit”): kimutatási határ. 12. ábra: A szaporodási fázis és a baktériumok egyedsûrûség-érzékelõ biokémiai mechanizmus („quorum sensing”) hatása a CFT073-felülúszó biofilm elleni tulajdonságára. Vizsgáltuk az MG1655F’ biofilmképzését mikrotitrálólemezeken, exponenciális, stacioner fázisú sejtekbõl és DluxS-mutánsokból tisztított felülúszó jelenlétében. 1010 exponenciális fázisú sejtet (OD600 nm=0,4) és stacioner fázi-

2

sú sejtet (OD 600 =2) centrifugálással ülepítettünk, és a felülúszókat háromszoros térfogatnyi etanollal precipitáltuk. A DluxS-mutánsból felülúszót éjszakán át tenyészetbõl tisztítottunk.

5 Példák

10

15

20

25

30

1. példa Eljárások Baktériumtörzsek, tenyésztési körülmények és mikroszkópos analízis A bakteriális törzseket az alábbi, 1. táblázatban soroltuk fel. Gram-negatív baktériumokat 37 °C¹on, 0,4% glükózzal kiegészített M63B1 minimáltápközegben (M63B1glu) vagy tápanyagokban dús LB tápközegben tenyésztettünk. Gram-pozitív baktériumokat 0,25% glükózzal kiegészített TSB tápközegben (TSBglu) tenyésztettünk, 37 °C¹on. Növekedési görbe felvételével, LB¹lemezeken a telepképzõ egységek számának a meghatározásával és BacLight Live/Dead viabilitás festési eljárással (Molecular Probes) értékeltük a CFT073-felülúszó hatását a bakteriális szaporodásra és a viabilitás arányra. Ferritin festést és pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálatot a korábbiakban leírtak szerint végeztünk [Bahrani-Mougeot és munkatársai: (2002)]. Epifluoreszcens és átesõ fényû mikroszkópiás vizsgálatokat Nikon E400 mikroszkóp alkalmazásával végeztünk. Autoagglutinációs vizsgálatokat a korábban ismertetettek szerint végeztünk [Beloin és munkatársai: (2006)].

1. táblázat A vizsgálatban alkalmazott törzsek Törzsek

Releváns jellemzõ

Hivatkozás

E. coli-törzsek CFT073

UPEC II¹es csoport tok (K2)

(Mobley és munkatársai: 1990)

MG1655F’

MG1655 F’tet-DraD plasmid

(Ghigo, 2001)

KS272

Kommenzális E. coli K–12

(Strauch és Beckwith, 1988)

1091

Kommenzális E. coli

C. Le Bouguenec

1092


C. Le Bouguenec

1094


(Da Re és Ghigo, 2006)

1096


C. Le Bouguenec

1097


C. Le Bouguenec

1102


C. Le Bouguenec

1103


C. Le Bouguenec

1110


C. Le Bouguenec

1125


C. Le Bouguenec

1127


C. Le Bouguenec

U–1

UPEC II¹es csoport tok

C. Forestier

U–2


C. Forestier

U–3

UPEC nem II¹es csoport tok

C. Forestier

U–4


C. Forestier

U–5


C. Forestier

6

HU 008 368 T2

1. táblázat (folytatás) Törzsek

Releváns jellemzõ

Hivatkozás

U–6


C. Forestier

U–7


C. Forestier

U–8


C. Forestier

U–9


C. Forestier

U–10


C. Forestier

U–11


C. Forestier

U–12


C. Forestier

U–13


C. Forestier

U–14


C. Forestier

U–15


C. Forestier

U–16


C. Forestier

U–17


C. Forestier

U–18


C. Forestier

U–19


C. Forestier

U–20


C. Forestier

U–21


C. Forestier

984

Kommenzális E. coli II¹es csoport tok (K1)

M. C. Ploy

988


M. C. Ploy

999


M. C. Ploy

1007


M. C. Ploy

1014


M. C. Ploy

IHE3034

Meningitist okozó E. coli II¹es csoport tok (K1)

(Meier és munkatársai: 1996)

EcoR törzsek

E. coli referencia törzs gyûjtemény (72 törzs)

(Ochman és Selander, 1984)

15981

S. aureus klinikai eredetû törzs

(Valle és munkatársai, 2003)

V329

S. aureus bovin mastitis szubklinikai izolátum

(Cucarella és munkatársai, 2001)

O–47

S. epidermidis klinikai törzs

(Heilmann és munkatársai, 1996)

CH845

S. epidermidis klinikai törzs BM94314

(Galdbart és munkatársai, 2000)

54

E. faecalis klinikai törzs

(Toledo-Arana és munkatársai, 2001)

11279

E. faecalis klinikai törzs

(Toledo-Arana és munkatársai, 2001)

KP21

Klebsiella pneumoniae törzs

C. Forestier

PAK

Pseudomonas aeruginosa

(Vasseur és munkatársai, 2005)

8013

Neisseria meningitidis törzs, C szerocsoport, 1. osztály

(Deghmane és és munkatársai: 2002)

44H3

CFT073 kpsD::TnSC189

jelen vizsgálat

25F11

CFT073 kpsD::TnSC189

jelen vizsgálat

23D5

CFT073 kpsU::TnSC189

jelen vizsgálat

16B9

CFT073 kpsU::TnSC189

jelen vizsgálat

14E12

CFT073kpsC::TnSC189

jelen vizsgálat

76H11

CFT073 kpsS::TnSC189

jelen vizsgálat

30H8

CFT073 kpsM::TnSC189

jelen vizsgálat

DkpsD

CFT073 kpsD::km

jelen vizsgálat

DkpsC

CFT073 kpsC::km

jelen vizsgálat

DkpsU

CFT073 kpsU::km

jelen vizsgálat

Egyéb baktériumok

Mutánsok

7

1

HU 008 368 T2

2

1. táblázat (folytatás) Törzsek

Releváns jellemzõ

Hivatkozás

DkpsS

CFT073 kpsD::km

jelen vizsgálat

DkpsM

CFT073 kpsM::km

jelen vizsgálat

D3692

CFT073 D3692::km

jelen vizsgálat

D3693

CFT073 D3693::km

jelen vizsgálat

D3694

CFT073 D3694::km

jelen vizsgálat

D3695–96

CFT073 D3695D3696::km

jelen vizsgálat

DR1

CFT073 kpsD – kpsS delécióval

jelen vizsgálat

D2

CFT073 c3692 – c3696 delécióval

jelen vizsgálat

DR3

CFT073 kpsT – kpsM delécióval

jelen vizsgálat

U–9 DkpsD

U–9 kpsD::km

jelen vizsgálat

U–15 DkpsD

U–15 kpsD::km

jelen vizsgálat

IHE3034 DkpsD

IHE3034 kpsD::km

jelen vizsgálat

DluxS

CFT073 DluxS

jelen vizsgálat

CFT073gfp

ATTlCFT073gfp

jelen vizsgálat

DR1gfp

ATTlDR1gfp

jelen vizsgálat

DoxyR

MG1655 oxyR::km

(Beloin és munkatársai, 2006)

ompR234

MG1655 omp234malA::km

(Vidal és munkatársai, 1998)

Eljárások a biofilmképzõdés vizsgálatára Vizsgálatok mikrofermentorokban: Biofilmet a korábbiakban ismertetettek szerint állítottunk elõ [Ghigo: (2001)]. Kevert biofilm tenyészetek: a belsõ mikrofermentor üveglemezen képzõdött 8 órás MG1655F’ biofilmet egy éjszakás, 1 OD600 nm ekvivalens CFT073gfp tenyészettel fertõztünk. Miután M63B1glu tápközegben, 24 órás folyamatos tenyésztést végeztünk, az üveglemezeket lefényképeztük. A biofilm biomasszát a belsõ üveglemezen képzõdött biofilmbõl készített szuszpenzió OD600 nm értékének maghatározásával értékeltük [Ghigo: (2001)]. Biofilmgátlási vizsgálatok: a beáramoltatott tápközeget 1:1 arányban szûrt felülúszóval elegyítettük, és a baktériumokkal történõ beoltást követõen különbözõ idõpontokban (0, 1, 6 vagy 24 órával késõbb) a mikrofermentorokhoz adtuk. A biofilmet további 24 órán át tenyésztettük, majd a biomasszát meghatároztuk. A baktériumok és kezelt felületek közti kölcsönhatás értékelése: az üveglemezeket 1 percig szûrt CFT073-felülúszóban inkubáltuk, és a mikrofermentorokban történõ beoltást megelõzõen ionmentesített vízben egyszer mostuk. A biofilmképzõdést a lemezeken 24 múlva határoztuk meg. Vizsgálatok mikrotitrálólemezeken: A statikus biofilmképzõdést 96 lyukú PVC mikrotitrálólemezeken (Falcon) vizsgáltuk, a korábbiakban ismertetettek szerint [O’Toole és Kolter: (1998)]. Biofilm gátlási vizsgálatok: egy éjszakás tenyészeteket OD600=0,04 értékre állítottunk be, majd 100 ml térfogatban 96 lyukú lemezekre oltottuk ki 50 ml felülúszó jelenlétében vagy anélkül. Vizsgálatok áramlási kamrában: Biofilmet állítottunk elõ M63B1glu tápközegben, 37 °C¹on, 3× csatornás áramlási cellákban (1×4×40 mm). Az áramlásos

30

35

rendszert a korábbiakban leírtak szerint állítottuk össze és mûködtettük [Christensen és munkatársai: (199)]. Inokulumot a következõk szerint készítettünk: 16–20 órás éjszakás M63B1glu tápközegben készített tenyészeteket gyûjtöttünk össze, és szuszpendáltunk normalizált hígításokként (OD600=0,005). 300 ml¹t injektáltunk mindegyik áramlási csatornába. A beáramoltatott folyadékot 1:1 arányban szûrt felülúszóval elegyítettük. Az áramoltatást 1 órával a beoltást követõen indítottuk el, állandó, 3 ml/óra sebességgel, Watson–Marlow perisztaltikus pumpa alkalmazásával. Minden vizsgálatot legalább háromszor megismételtünk.

40

45

50

55

60 8

CFT073 vagy más, biofilm elleni aktivitású, II¹es csoportba tartozó tokkal rendelkezõ törzs felülúszójának tisztítása Három tisztítási szintet vizsgáltunk: (i) Az aktív felülúszók szûrése (sterilizálása) (S. CFT, valamennyi, mikrotitrálólemezen vagy mikrofermentorban végzett vizsgálathoz) – 0,4% glükózt tartalmazó M63B1 tápközegben készített, egy éjszakás tenyészeteket 30 percig, 5000 fordulat/perc mellett, 4 °C¹on centrifugáltunk, és a baktériumok eltávolítására 0,25 mm pórusátmérõjû szûrõn átszûrtünk. (ii) Az aktív felülúszókban található poliszacharidok precipitálása – A szûrt felülúszókban található poliszacharidokat háromszoros térfogatú etanollal precipitáltuk, ionmentesített vízben szuszpendáltuk, majd 10 kDa cut-off értékig áteresztõ dialíziskazettákban ionmentesített vízzel szemben dializáltuk (Pierce biochemical).

1

HU 008 368 T2

(iii) A tokpoliszacharidok aktív frakciójának tisztítása (FR2 tok aktív frakció) – A (ii) lépésben kapott, részlegesen tisztított felülúszó aktív frakciót liofileztük, és 80 ml, 25% 1¹propanollal kiegészített 20 mmol/l Tris-HCl (pH=7,5) pufferben újraszuszpendáltuk. – A kapott szuszpenziót 10 percig, 3000 fordulat/perc mellett centrifugáltuk az oldhatatlan részecskék eltávolítására. – A szolubilis felülúszót DEAE-Sepharose oszlopra vittük fel (30 ml, 2,6×6 cm; Amersham), és 25% 1¹propanollal kiegészített 20 mmol/l Tris-HCl (pH=7,5) pufferrel ekvilibráltuk. – Az oszlopot 20 ml/óra átfolyási sebesség mellett 25% 1¹propanollal kiegészített 20 mmol/l Tris-HCl (pH=7,5) pufferrel mostuk. – A mosást követõen, az oszlopot NaCl-gradienssel eluáltuk (0–1 mol/l 400 ml¹ben), és mindegyik eluált frakció (4,5 ml) poliszacharidkoncentrációját Dubois-eljárással határoztuk meg [Dubois és munkatársai: (1956)]: 100 ml, 5%¹os fenol és 500 ml tömény kénsav hozzáadását követõen az elegyet vortexszel összekevertük, majd 492 nm¹en leolvastuk). – A pozitív frakciókat (körülbelül 10, 4,5 ml¹es frakciót) összeöntöttük, és ionmentesített vízzel szemben dializáltuk, majd liofileztük. – A liofilizátum 1 mg¹ját 1 ml ionmentesített vízben szuszpendáltuk. Tenyészetek felülúszójának a kezelése és poliszacharidok vizsgálata M63B1glu tápközegben készített egy éjszakás tenyészeteket centrifugáltunk 30 percig, 5000 fordulat/perc mellett, 4 °C¹on. Miután a felülúszót 0,2 mm pórusátmérõjû szûrõn átszûrtük, a makromolekulákat

2

3 térfogatnyi etanollal precipitáltuk, és 10 kDa értékig áteresztõ kazetták alkalmazásával ionmentesített vízzel szemben dializáltuk (Pierce). A foszfát és neutrális cukrok összmennyiségét ammónium-molibdát/aszkor5 binsav, illetve fenol/kénsav eljárásokkal határoztuk meg. A poliszacharid-összetételt HPLC-eljárással határoztuk meg (ionkizárásos oszlopkromatográfiával) és gáz-folyadék kromatográfiával [d’Enfert és Fontaine: (1997); Fontaine és munkatársai: (2000)]. CFT073 fe10 lülúszó aktív frakciót, FR2¹t, DEAE-Sepharose oszlop (Amersham) alkalmazásával tisztítottunk, és 300 mmol/l NaCl-dal eluáltunk 25% 1¹propanol, 20 mmol/l Tris-HCl (pH=7,5) pufferben. A polimer molekulatömegét gélszûrõ kromatográfiával határoztuk meg 15 Sephadex–200 oszlopon (Amersham), standardként dextránt alkalmazva. Poliszachariddegradációs reakciókat teljes savas hidrolízissel (trifluor-ecetsav, 4 N, 4H, 100 °C) vagy vizes fluorsavval (HF) (48% vizes HF, 2 napig jeges fürdõben) végeztünk. 20 Mutagenezis és molekuláris eljárások E. coli CFT073 mariner transzpozon mutagenezisét a korábban leírtak szerint végeztük [Da Re és Ghigo: (2006)]. Tízezer (10 000) transzpozonmutáns felül25 úszóját 24 órán át, LB tápközegben, 37 °C¹on, 96 lyukú mikrotitrálólemezeken inkubáltuk, a lemezeket 15 percig, 10 000 fordulat/perc mellett centrifugáltuk, majd a felülúszókat leszívtuk, és azok hatását MG1655F’ sejtek biofilmképzésére nézve analizáltuk. A transzpozon 30 inszerciós helyeket a leírtak szerint határoztuk meg [Da Re és Ghigo: (2006)]. Homológiakereséseket végeztünk a Blast 2.0 program alkalmazásával. Deléciós mutánsokat a http://www.pasteur.fr/recherche/unites/Ggb/3SPCRprotocol.html helyen részletesen is35 mertetettek szerint hoztunk létre, a 2. táblázatban megadott primerek alkalmazásával.

2. táblázat A vizsgálatban alkalmazott primerek Célzott gén

Primer neve

Szekvencia

Szekvenciaazonosító szám

Deléciós mutánsok létrehozására alkalmazott primerek kpsD

kpsU

kpsC

KpsD.500–5

gaccagcttgcctttgcagaaacg

1

KpsD.500–3

ctttttcagcattacgcggatagg

2

KpsD.GB.L–5

TGCTCGATGAGTTTTTCTAAGGAGTTGAAatgagcaa

3

KpsD.GB.L–3

gattttgagacacaacgtggctttCATcacAAACTCATTCAGCGACA

4

KpsD.ext–5

ttgcgcttaagtttaaccaaaccg

5

KpsD.ext–3

gctctggcatggactccggtaact

6

KpsU.500–5

atgaacgcagttcagctttatcgcc

7

KpsU.500–3

ccaaatttcggcttgaggattttc

8

KpsU.GB.L–5

TGCTCGATGAGTTTTTCTAAcaggaactggctgaaaacgcatga

9

KpsU.GB.L–3

gatttttgagacacaacgtggctttCATTTCAACTCCttacaaagacaga

10

KpsU.ext–5

tgcagaacggcgataccttaatcg

11

KpsU.ext–3

ctcggcaatcaaacgtactcgttg

12

KpsC.500–5

gaggcagatatcaacattaacc

13

9

HU 008 368 T2

2. táblázat (folytatás) Célzott gén

kpsS

kpsM

Kps

Kps

Kps

Kp95–

C3694

Primer neve

Szekvencia


KpsC.500–3

gttgaaggttttaagttctcaac

14

KpsC.GB.L–5

TGCTCGATGAGTTTTTCTAAACAATTTCATAGTTGACTATTAC

15

KpsC.GB.L–3

gattttgagacacaacgtggcntgagtaaatgccaatcatgcgttttc

16

KpsC.ext–5

cgactcacattacgattatgcg

17

KpsC.ext–3

gaaaatgamgtggtggcggtagc

18

KpsS.500–5

agagcaaccttgagttattacg

19

KpsS.500–3

aaagacaagggatagcmagg

20

KpsS.GB.L–5

TGCTCGATGAGTTTTTCTAATTTATTCTAAATTATCAACG

21

KpsS.GB.L–3

gattttgagacacaacgtggcttCATAAATAATCTGTGTAATAGTCAA

22

KpsS.ext–5

agcgactggttgaaagcaaactg

23

KpsS.ext–3

ttcgatgagtcaagactattgg

24

KpsM.500–5

TTACTACGCATAAAATTCATGG

25

KpsM.500–3

aatgccatgcttaaaccaaagcc

26

KpsM.GB.L–5

TGCTCGATGAGTTTTTCTAAcaatgctgacatcatgattaagattg

27

KpsM.GB.L–3

gattttgagacacaacgtggctttcttgccatTTGGTGATGTGATCCT

28

KpsM.ext–5

TCGCATGCGTTCTGGTTTGAG

29

KpsM.ext–3

cacatcacaaaactctttcaatg

30

KpsD.500–5

gaccagcttgcctttgcagaaacg

31

KpsS.500–3

aaagacaagggatagctttagg

32

KpsD.GB.L–3

gartttgagacacaacgtggcmCATcacAAACTCATTCAGCGACA

33

KpsS.GB.L–3

gattttgagacacaacgtggctttCATAAATAATCTGTGTAATAGTCAA

34

KpsD.ext–5

ttgcgcttaagtttaaccaaaccg

35

KpsS.ext–3

ttcgatgagtcaagactattgg

36

KpsR2.500–5

atataggagtatggagcgaaac

37

KpsR2.500–3

ttgagtaaggaatatggcttag

38

KpsR2.GB-L5

TGCTCGATGAGTTTTTCTAAGAAATCAGACGAGTTTTC

39

KpsR2.GB-L3

gattttgagacacaacgtggctttcataacatACTATGTCCCCATGATTATT

40

KpsR2.ext–5

catgtactcatttcacgtaaag

41

KpsR2.ext–3

tgctaaaattgcattattaggtc

42

KpsM.500–5

TTACTACGCATAAAATTCATGG

43

KpsR3.500–3

AATTAACCATATCTTTTGATTTGAG

44

KpsR3.GB-L5

TGCTCGATGAGTTTTTCTAAatcagacttgtctttatcag

45

KpsM.GB.L–3

gatttgagacacaacgtggcttcttgccatTTGGTGATGTGATCCT

46

KpsM.ext–5

TCGCATGCGTTCTGGTTTGAG

47

KpsR3.ext–3

cctagcaacaaaatatttagcgac

48

Kps95–96.500–5

aaacaatatcatggccagtcgg

49

Kps95–96.500–3

aataacgttcaggtattgaagg

50

Kps95–96.GB–L5

TGCTCGATGAGTTTTTCTAAccttgaGGTCTATATAACTGAA

51

Kps95–96.GB–L3

gatttgagacacaacgtggctttcatcaaatgtaccaaaggtgataac

52

Kps95–96.ext–5

taaatcaacgttactgagaatg

53

Kps95–96.ext–3

gaatatccgagtgcataatacc

54

Kps95–96.500–5

aaacaatatcatggccagtcgg

55

c3694.500–5

aagcattagaattggaaccc

56

10

HU 008 368 T2

2. táblázat (folytatás) Célzott gén

C3693

C3692

luxS

Primer neve

Szekvencia


c3694.500–3

ctttccatgtancctctccaag

57

c3694.GB.L–5

TGCTCGATGAGTTTTTCTAAgtgcaagtamcttgtaaccc

58

c366094.GB.L–3

GATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCATatacgcatcaatagccttagccc

59

c3694.ext–5

gcggagagctattttaagcagg

60

c3694.ext–3

cggaaaacgatatgacaatcctg

61

c3693.500–5

gtttattgttgcaggcatccaag

62

c3693.500–3

atgccgttagatagttttattcc

63

c3693.GB.L–5

TGCTCGATGAGTTTTTCTAAatggatgctcaaaaggaggtacg

64

c3693.GB.L–3

GATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCATcagcattggttggtaatgcatttg

65

c3693.ext–5

acatattaacagtaatataacc

66

c3693.ext–3

ctacaaatttggatactgcaaatc

67

c3692.500–5

ttatacttgcggtgatttgcag

68

c3692.500–3

ATGACTCATAAAAATATATTCC

69

c3692.GB.L–5

TGCTCGATGAGTTTTTCTAAtatttacagaataattattctgg

70

c3692.GB.L–3

GATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCATtaagccaatagtcttgactcatcg

71

c3692.ext–5

aattcatatgattgtagcaatg

72

c3692.ext–3

CAACGTAGAATAAAAGCATTACC

73

LuxS.500–5

AAACTGCGCAGTTCCCGTTACC

74

LuxS.500–3

CCTGATTTTGTTCCCTGGGAGG

75

LuxS.GB–L5

TGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGTGGAACAAAAGAAG

76

LuxS.GB–L3

gattttgagacacaacgtggctttcatTTAGCCACCTCCGGTAATTT

77

LuxS.ext–5

CTGGAACCGGGTGATCCTCGAAG

78

LuxS.ext–3

AGCAACAATGCTGGGGAAAAATGC

79

II¹es csoport tok szûrésre alkalmazott primerek Kps95–F

aacgaaaattgcttgctctggc

80

Kps94–R

cggtgccaagtttgaaataacg

81

Kps94–F

gaaaatagtgtagacggtctcttc

82

Kps92–R

tttggatactgcaaatcaccgc

83

KpsIIf

GCGCATTTGCTGATACTGTTG

84

KpsK2r

AGGTAGTTCAGACTCACACCT

85

Mutációk PCR-eljárással történõ ellenõrzésére alkalmazott primerek: az inszertált rezisztenciagénekre tervezett verifikációs primerek KmGB.verif–5

TGGCTCCCTCACTTTCTGGC

86

KmGB.verif–3

ATATGGCTCATAACACCCCTTG

87

Az önkényesen választott primerek elvén mûködõ PCR-eljárással végzett szekvenciameghatározáshoz alkalmazott primerek ARB1

ggCCACgCgTCgACTAgTAC,’NNNNNNNNNNgATAT

ARB6

ggCCACgCgTCgACTAgTACNNNNNNNNNNACgCC

89

ARB2

ggCCACgCgTCgACTAgTAC

90

IR2

CTgACCgCTTCCTCgTgCTTTACgg

91

IR2–60–5

TTCTGAgcgggactctggggtacg

92

11

88

1

HU 008 368 T2

Az aktív frakciók fizikokémiai tulajdonságainak vizsgálata A zéta-potenciált Caruso és munkatársai által leírtak szerint mértük (1999), miután 10 mm átmérõjû, kationos kolloid latexrészecskéket dializált, precipitált felülúszóval [azaz, a fenti (ii) tisztítási szintû készítménnyel] inkubáltunk. A latexrészecskék állandó nettó pozitív töltéssel rendelkeznek polietilén-imin- (PEI) bevonatuknak köszönhetõen. A PEI-réteg elágazó, 6400 dalton molekulatömegû polimer, amely körülbelül 50% metilált kvaterner funkciót tartalmaz, ami stabil pozitív töltést biztosít a molekulának. Ezt a polimert vizes fázisban a kezdetben karboxilezett részecskékre vittük fel [Decher: (1997)]. A felülúszók hidrofil tulajdonságát 2,5 ml ultratiszta víz egy cseppjének peremszöge meghatározásával vizsgáltuk a felülúszókkal elõzõleg 20 percig inkubált üveglap felületén. A felületi kölcsönhatásokat propidium-jodid-adszorpció monitorozásával analizáltuk a felülúszóval kezelt kationos kolloidokon. A kezelt felületek affinitását fluoreszcens próbához áramlásos citometriával [Leboeuf és Henry: (2006)] és fluoreszcens mikroszkópiával vizsgáltuk. A részecskék felülúszóval történõ inkubálását minden esetben alacsony részecske/térfogat frakció arány (körülbelül 0,2%) mellett végeztük, ami nagy valószínûséggel ahhoz vezet, hogy a felület telítõdik az aktív formával. In vivo egérkísérletek A CFT073 és CFT073AR1 törzsek in vivo kolonizációs vizsgálatát a korábbiakban leírtak szerint végeztük [Maroncle és munkatársai: (2006)]. Az egerek gyomrába (intragasztriálisan) 1010 telepképzõ egységet („colony forming units”; CFU) juttattunk. A székletmintában található baktériumok számát agarlemezeken határoztuk meg. Ahhoz, hogy a baktériumok szaporodását a gazdában vizsgáljuk, az egereket a beoltás után különbözõ idõpontokban leöltük; a vastagbelet és vakbelet fiziológiás oldatban homogenizáltuk, és lemezekre oltottuk le az egy gramm szövetben található baktériumok CFU-értékének meghatározására. 2. példa CFT073-felülúszó biofilm elleni aktivitásának vizsgálata Abból a célból, hogy a UPEC-kölcsönhatásokat a multicelluláris biofilm [Hall-Stoodley és munkatársai: (2004)] bakteriális együttélésekben tanulmányozzuk, in vitro kevert bakteriális biofilmmodellt dolgoztunk ki mikrofermentorokban [Ghigo: (2001)]. Ennek a modellnek az alkalmazásával, a K12 MG1655F’ kommenzális E. coli törzs által képzett biofilmet különbözõ titerekben a CFT073 UPEC törzzsel oltottuk be, és további 24 órán át tenyésztettük. A CFT073 növekvõ titerei mellett, az E. coli K12 MG1655F’ törzs biofilmképzésének nagymértékû csökkenését figyeltük meg, szemben a kommenzális E. coli KS272 törzs alkalmazásával (1A. ábra). Mindez arra utalt, hogy a CFT073, közvetlen kontaktus vagy inhibitormolekula szekretálása révén, képes a MG1655F’ általi biofilmképzést gátolni. Annak eldöntésére, hogy a fenti két lehetõség közül

2

melyik helytálló, a CFT073 stacioner fázisú tenyészetének felülúszóját szûréssel sterilizáltuk, és annak hatását az E. coli biofilmképzésére megvizsgáltuk. A CFT073-felülúszó jelenlétében a MG1655F’ biofilm 5 jelentõsen károsodott (1B. és 1C. ábra). Ezt a biofilmgátló hatást nem baktericid vagy bakteriosztatikus aktivitásra visszavezethetõ szaporodási defektus okozta, mivel a MG1655F’ szaporodási rátáját és sejt-viabilitását a CFT073-felülúszó nem befolyásolta (1D. és 10 1E. ábra). Abból a célból, hogy a CFT073-felülúszó biofilm elleni aktivitásának spektrumát meghatározzuk, annak hatását több adherens baktériumra (E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococ15 cus aureus, S. epidermidis és Enterococcus faecalis) nézve megvizsgáltuk. Ez a vizsgálat azt mutatta, hogy a CFT073-felülúszó baktériumok meglepõen széles körével szemben aktív, még kevert tenyészetekben is (1.F és 2. ábra). 20 3. példa A biofilm elleni aktivitás és II¹es típusú tok közötti korreláció vizsgálata A biofilm elleni aktivitás genetikai hátterének felde25 rítésére, mintegy 10 000 CFT073 random mariner transzpozon-inszerciós mutánst vizsgáltunk meg. Hét jelöltet azonosítottunk, amelyek MG1655F’-biofilmet gátló aktivitása károsodott. Az inszerciót a fenti mutánsok mindegyikében a II¹es csoportba tartozó tokpoli30 szacharid expressziójában, a legkülsõ bakteriális sejtfelszíni struktúra kialakításában szerepet játszó génekben térképeztük [Whitfield és Roberts: (1999)]. A II¹es típusú tok konzervált, moduláris genetikai szervezõdést mutat, amelyet három funkcionális régió jellemez 35 [Roberts: (1996)] (3A. ábra). Az 1. régió (kpsFEDCUS) és a 3. régió (kpsMT) valamennyi II¹es csoportba tartozó tokkal rendelkezõ baktériumban konzervált, és az ABC-függõ poliszacharidexporthoz szükséges proteineket kódol. A 2. régió variábilis, és különbözõ polisza40 charid-szerotípusokat kódol, például a K1, K2 (CFT073), K5 és K96 [Roberts: (1996)] szerotípusokat. Az R1¹, R2¹ vagy R3¹régiókat vagy az egyes kps géneket egyenként deletáltuk, és azt találtuk, hogy a kpsU¹, c3692- és c3693-mutánsok kivételével, valamennyi 45 mutáns E. coli biofilmképzést gátló képessége elveszett, ami korrelációt mutatott a precipitálódott cukrok csökkent mennyiségével a felülúszóban (3.B és 3C. ábra). Bár ferritinfestéssel még mindig kimutatható volt tok a CFT073 sejtek körül (3D. ábra), ezek az ered50 mények arra utaltak, hogy ennek ellenére, a CFT073 tok jelentõs mennyiségben szabadul fel a tápközeg felülúszójába, ami felelõs a megfigyelt biofilm elleni hatásért. Annak megállapítására, hogy a biofilmképzõdés 55 gátlása az E. coli CFT073-felülúszó kizárólagos tulajdonsága¹e, több uropatogén Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Morganella, Citrobacter és Serratia bakteriális izolátumot, valamint 110 különbözõ eredetû E. colitörzset tartalmazó gyûjteményt szûrtünk. Azt találtuk, 60 hogy csak negyven E. coli, ezen belül 17 UPEC törzs 12

1

HU 008 368 T2

szûrt felülúszója gátolta a biofimképzõdést baktériumok széles körében anélkül, hogy a szaporodási rátát befolyásolta volna (4A. ábra). Ezenfelül, a CFT073 E. coli-törzshöz hasonlóan, valamennyi aktív törzs képes volt E. coli mellett egyéb adherens baktériumok biofilmképzésének gátlására (4A. ábra, lásd a 15981 jelzésû S. aureus biofilm adatait). Specifikus PCR-próbák alkalmazásával [Johnson és O’Bryan: (2004)] kimutatták, hogy a 40 aktív E. coli törzsbõl 39 hordozott II¹es csoportba tartozó tok géneket. A negyvenedik baktérium, az EcoR47, úgy tûnik hibrid, és II/III. csoportba tartozó tokot képez. Errõl a törzsrõl kimutatták, hogy II¹es csoportú KPS-géneket hordoz [Boyd és Hartl: (1998)]. Ennek megfelelõen, kpsD mutáció beiktatása az U–9 és U–15 klinikai izolátumokba megszüntette azok felülúszóinak biofilmgátló hatását (4.B ábra). Érdekes módon, bár a CFT073, U–9 és U–15 törzsek a mikrofermentor biofilm modellben igen korlátozott biofilmképzõ képességgel rendelkeztek, azok kpsD-mutánsai fokozott biofilmképzõ fenotípust mutattak. A fenotípus CFT073-felülúszó hozzáadásával visszafordítható volt, arra utalva, hogy ezek a törzsek saját adhéziójukat is gátolni képesek (4C. ábra). Biofilmképzõdés gátlási tesztet végeztünk egy Neisseria meningitidis törzzsel is, melynek tokja biokémiailag igen hasonló az E. coli II¹es csoportba tartozó tokhoz. Érdekes módon, az eredmények azt mutatták, hogy a N. meningitidis felülúszója ugyancsak gátolja az E. coli MG1655F’ biofilmképzését (5. ábra), arra utalva, hogy a biofilm elleni aktivitás nem kizárólag az E. coli II¹es tok sajátsága, hanem ismereteink szerint az utóbbihoz hasonló tokok (azaz, a II¹es csoport típusú tokok) tulajdonsága. 4. példa A CFT073-felülúszó fizikokémiai tulajdonságai Amikor különbözõ, II¹es csoportba tartozó tokkal rendelkezõ E. coli szerotípusok, ezen belül CFT073 (K2), U–9 (non¹K2) és IHE3034 (K1), aktív felülúszójából precipitált poliszacharidfrakciók összetételét analizáltuk, korábbi tanulmányok eredményeivel összhangban [Jann és munkatársai: (1980); Silver és Vimr: (1994)] azt találtuk, hogy ezek a frakciók jelentõsen eltérõ összetételûek (az adatokat nem tüntettük fel). Mindez arra utal, hogy bár biokémiailag eltérõek, az ilyen törzsek által termelt II¹es csoportú tokok a biofilmképzõdés gátlásához vezetõ hasonló hatásmechanizmussal rendelkezhetnek. A mechanizmus további tanulmányozására, melynek révén a II¹es csoportú tok gátolja a bakteriális biofilmképzõdést, ezeket a frakciókat 10 mm átmérõjû, polietilénimin (PEI) bevonatuknak köszönhetõen állandó nettó pozitív töltéssel rendelkezõ latex részecskékbõl álló, kationos kolloidokkal érintkeztettük. A határfelületi z (Zéta) potenciál meghatározása azt mutatta, hogy a vad típusú felülúszók jelentõs töltésinverzióhoz vezetnek a kationos kolloidokban, azok erõs anionos természetére utalva a megfelelõ tokmutánsok felülúszóihoz képest (6A. ábra). Ezenfelül, savas tisztításnak alávetett üveglemezek kezelése aktív felülúszóval csökkentette a víz-üveglemez határ-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 13

2

felületi energiát, ami azok hidrofil tulajdonságára utal (6.B ábra). Annak vizsgálatára, hogy a II¹es csoportba tartozó tok képes¹e elõidézni felszíni változásokat és befolyásolni intermolekuláris erõket a kezelt felületeken, propidium-jodid, egy fluoreszcens amfifil kationos ion adszorpcióját mértük aktív vagy inaktív felülúszókkal bevont kolloidokon. Elõször kimutattuk, hogy a II¹es csoportba nem sorolható tokkal rendelkezõ E. coli EcoR72 anionos, de inaktív felülúszója erõs affinitást mutat a kationos, fluoreszcens próba iránt (6C. ábra). Magas negatív töltésük ellenére, az aktív felülúszók jelentõsen alacsonyabb affinitást mutattak a próbával szemben, mint az inaktív, de kisebb negatív töltésû tokmutánsok felülúszói (6.C és 6D. ábra). Ez a jelenség még kifejezettebb volt a CFT073 törzsbõl anioncserélõ kromatográfiával tisztított, galaktózt, glicerint, foszfátot és acetátot 1:2:1:1 moláris arányban tartalmazó, 500 kDa K2 tok aktív frakció (FR2) esetében [Jann és munkatársai: (1980)] (6.C és 6D. ábra). Ezért, eredményeink azt mutatták, hogy jelentõs elektrosztatikus módosulások mellett, az aktív felülúszók a kolloid felszíni tulajdonságainak alapos átrendezõdését is eredményezik, amelyek valószínûleg a felszín hidratációját és a szterikus taszítást befolyásolják. 5. példa Biofilmképzõdés megakadályozása A II¹es csoportba tartozó tok fizikokémiai tulajdonságai lényegesen befolyásolhatják a baktérium azon tulajdonságát, hogy miként képes kölcsönhatásba lépni felületekkel, ezáltal az adhéziót jelentõsen csökkenteni [Neu: (1996)]. A fenti feltevés helyességének vizsgálatára, MG1655F’ és S. aureus törzseket teszteltük arra nézve, hogy képesek¹e tapadni CFT073-felülúszóval elõkezelt üvegfelületekhez. Egy órán át tartó inkubációt követõen, az E. coli MG1655F’ és S. aureus 15981 kezdeti adhéziós képessége a kezelt felületen harmadára csökkent (az adatokat nem tüntettük fel). Következésképp, a CFT073-felülúszóval kezelt, belsõ mikrofermentor üveglemez drasztikusan csökkentette a biofilmképzõdést E. coli, valamint Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok széles körében (7. ábra). Ugyanezt a hatást figyeltük meg, amikor CFT073-felülúszót a mikrofermentorokba perfundáltunk (2.B. ábra). Semmilyen hatást nem észleltünk, amikor hasonló kezelést végeztünk CFT073DkpsD-felülúszóval (7. ábra). Ezek az eredmények tehát arra engednek következtetni, hogy a CFT073-felülúszóba felszabaduló tok-poliszacharidok által indukált felületi változások, a kezdetben kialakuló baktériumfelszín kölcsönhatások gátlásával akadályozhatják a biofilmképzõdést. Meglepõ módon, a CFT073-felülúszó biofilm elleni hatása az üvegfelület erõteljes kezelését követõen is kimutatható maradt (8. ábra), ami azt jelenti, hogy a II¹es csoportba tartozó tok olyan helyzetekben is alkalmazható lehet, ahol sterilezési lépésre van szükség (például mezõgazdasági-élelmiszer-ipari vagy orvosi célú alkalmazásokban).

1

HU 008 368 T2

A CFT073-felülúszó már kialakult biofilmre kifejtett hatásának vizsgálatára, MG1655F’ törzssel beoltott mikrofermentorokat a biofilmképzõdés különbözõ fázisaiban szûrt CFT073-felülúszóval egészítettünk ki. Ez a vizsgálat azt mutatta, hogy a már kialakult („érett”), 24 órás biofilm kezelése nem vezetett a biofilm széteséséhez, a CFT073-felülúszó hozzáadása az MG1655F’ általi biofimképzés kezdetétõl számított 0., 1. és 6. órában megakadályozta annak további növekedését (9A. ábra). Ezután, CFT073-felülúszó hozzáadását követõen, konfokális lézerpásztázó mikroszkópiával (CLSM) vizsgáltuk GFP-jelölt MG1655F’-biofilm in vitro tulajdonságait. Három órával a kezdeti beoltás után, aktív CFT073 exogén felülúszó hozzáadása a szokásosan fedett felszínhez jelentõsen befolyásolta a MG1655F’ által termelt, érett biofilmstruktúra kialakulását (9.B ábra). Ez a hatás a kontroll KS272-felülúszóval történõ kezelés esetében nem volt megfigyelhetõ. A bakteriális felszíni struktúrák közvetlen hozzájárulását a háromdimenziós E. coli biofilmstruktúra kialakításához már alaposan szemléltették [Beloin és munkatársai: (2005)]. Ezekrõl a struktúrákról ismert, hogy stacioner tenyészetekben ugyancsak szerepet játszanak a bakteriális aggregáció és koaguláció közvetítésében. Abból a célból, hogy a II¹es csoportba tartozó tok biofilm érésében betöltött szerepét jellemezzük, annak hatását vizsgáltuk több különbözõ, felszínen megjelenített, biofilmképzésben is szerepet játszó faktor által közvetített bakteriális aggregációra. Kimutattuk, hogy a CFT073-felülúszó a különbözõ típusú bakteriális felszíni struktúrák által indukált bakteriális aggregációt gátolja (9C. ábra). Az FR2-frakció különbözõ koncentrációinak biofilm elleni hatását mikrotitrálólemezeken teszteltük. Azt találtuk, hogy a tisztított FR2-frakció 50 mg/ml koncentrációtól aktív (10. ábra). Összefoglalva, ezek az eredmények arra utalnak, hogy a II¹es csoportba tartozó tokpoliszacharidok fizikokémiai tulajdonságai a sejtfelszíni kontaktusok (kezdeti adhézió) gyengítésével, de a sejt-sejt kölcsönhatások csökkentésén (biofilm érésen) keresztül is befolyásolják a biofilmképzõdést. Következésképp, kimutattuk, hogy a II¹es csoport típusú tokpoliszacharidok a tenyészet felülúszójába felszabadulnak, és adhéziót gátló hatást fejtenek ki baktériumok széles spektrumára, ezen belül fontos nozokomiális patogénekre. A vizsgálat a II¹es csoportba tartozó tokpoliszacharidok új tulajdonságát tárja fel, amely poliszacharidok gyakran expresszálódnak extraintesztinális E. coli-törzsekben, de egyéb patogénekben, például Neisseria meningitidis törzsekben is [Kaijser: (1973); Sandberg és munkatársai: (1988)], amelyek felülúszója az E. coli biofilmképzõdését is gátolhatja (az adatokat nem tüntettük fel). A II¹es csoportba tartozó tokról kimutatták, hogy szerepet játszik az UPEC-törzsek virulenciájában, azok rezisztenciáját növelve fagocitózissal és humán szérum baktericid hatásával szemben [Cross és munkatársai: (1986); Kaper és munkatársai: (2004); Pluschke és munkatársai: (1983); Russo és munkatársai: (1995)]. Ezenfelül, a tok ugyancsak fontos biológiai

2

szerepet játszhat az UPEC-törzsek, és élõ és inert felületek közti kölcsönhatásokban. Közelebbrõl, a baktériumok közötti versengés mellett, az UPEC önmagával történõ adhéziójának gátlása II¹es csoportba tartozó tok 5 szekréciója által, a baktérium-baktérium közötti kölcsönhatások csökkentésével segítheti a gasztrointesztinális traktus kolonizációját [Schembri és munkatársai: (2004)], elkerülve a baktériumok kiürülését koagulátum („clump”) képzõdésén keresztül [Favre-Bonte és mun10 katársai: (1999)]. Ezzel összhangban, megfigyeltük, hogy a tok nélküli CFT073DRI mutáns nem képes az egér belét kolonizálni (11. ábra). In vitro vizsgálatok az mutatták, hogy a II¹es csoportba tartozó tok felszíni módosulásokat képes elõ15 idézni, például kationos felületek töltésinverzióját, fokozott felszíni nedvesíthetõséget és molekuláris taszítást, amelyek nem specifikus, adhéziót gátló tulajdonságokhoz vezetnek. 20

25

30

35

40

45

50

55

60 14

Irodalmi hivatkozások Bahrani-Mougeot, F. K., Buckles, E. L., Lockatell, C. V., Hebel, J. R., Johnson, D. E., Tang, C. M., and Donnenberg, M. S. (2002). Type 1 fimbriae and extracellular polysaccharides are preeminent uropathogenic Escherichia coli virulence determinants in the murine urinary tract. Mol. Microbiol. 45, 1079–1093. Beloin, C., Da Re, S. & Ghigo, J. M. (2005) in Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, eds. Curtiss III, R., Böck, A., Ingraham, J. L., Kaper, J. B., Neidhardt, F. C., Riley, M. & Squires, C. L. (ASM Press, Washington, D. C.), pp. Chapter 8.3.1.3. Beloin, C., Michaelis, K., Lindner, K., Landini, P., Hacker, J., Ghigo, J. M., and Dobrindt, U. (2006). The Transcriptional Antiterminator RfaH Represses Biofilm Formation in Escherichia coli. J. Bacteriol. 188, 1316–1331. Boyd, E. F., and Hartl, D. L. (1998). Chromosomal regions specific to pathogenic isolates of Escherichia coli have a phylogenetically clustered distribution. J. Bacteriol. 180, 1159–1165. Caruso, F., Lichtenfeld, H., Donath, E., and Möhwald, H. (1999). Investigation of electrostatic interactions in polyelectrolyte multilayer films: binding of anionic fluorescent probes to layers assembled onto colloids. Macromolecules 32, 2317–2328. Christensen, B. B., Sternberg, C., Andersen, J. B., Palmer, R. J., Jr., Nielsen, A. T., Givskov, M., and Molin, S. (1999). Molecular tools for study of biofilm physiology. Methods Enzymol. 310, 20–42. Cross, A. S., Kim, K. S., Wright, D. C., Sadoff, J. C., and Gemski, P. (1986). Role of lipopolysaccharide and capsule in the serum resistance of bacteremic strains of Escherichia coli. J. Infect. Dis. 154, 497–503. Cucarella, C., Solano, C., Valle, J., Amorena, B., Lasa, I. I., and Penades, J. R. (2001). Bap, a Staphylococcus aureus Surface Protein Involved in Biofilm Formation. J. Bacteriol. 183, 2888–2896. Da Re, S., and Ghigo, J. M. (2006). A CsgD-independent pathway for cellulose production and biofilm formation in Escherichia coli. J Bacteriol. 188, in press.

1

HU 008 368 T2

de Gennes, P. G. (1987). Polymers at an interface: a simplified view. Adv. Colloid Interface Sci 27, 189–209. Decher, G. (1997). Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science 277, 1232–1237. Deghmane, A. E., Giorgini, D., Larribe, M., Alonso, J. M., and Taha, M. K. (2002). Down-regulation of pili and capsule of Neisseria meningitidis upon contact with epithelial cells is mediated by CrgA regulatory protein. Mol. Microbiol. 43, 1555–1564. d’Enfert, C., and Fontaine, T. (1997). Molecular characterization of the Aspergillus nidulans treA gene encoding an acid trehalase required for growth on trehalose. Mol. Microbiol. 24, 203–216. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., and Smith, F. (1956). Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28, 350–356. Favre-Bonte, S., Licht, T. R., Forestier, C, and Krogfelt, K. A. (1999). Klebsiella pneumoníae capsule expression is necessary for colonization of large intestines of streptomycin-treated mice. Infect. Immun. 67, 6152–6156. Fontaine, T., Simenel, C, Dubreucq, G., Adam, O., Delepierre, M., Lemoine, J., Vorgias, C. E., Diaquin, M., and Latge, J. P. (2000). Molecular organization of the alkali-insoluble fraction of aspergillus fumigatus cell wall. J. Biol. Chem. 275, 41 528. Galdbart, J. O., Allignet, J., Tung, H. S., Ryden, C., and El Solh, N. (2000). Screening for Staphylococcus epidermidis markers discriminating between skinflora strains and those responsible for infections of joint prostheses. J. Infect. Dis. 182, 351–355. Ghigo, J. M. (2001). Natural conjugative plasmids induce bacterial biofilm development. Nature 412, 442–445. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., and Stoodley, P. (2004). Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2, 95–108. Heilmann, C., Gerke, C., Perdreau-Remington, F., and Gotz, F. (1996). Characterization of Tn917 insertion mutants of Staphylococcus epidermidis affected in biofilm formation. Infect Immun 64, 277–282. Jann, K., Jann, B., Schmidt, M. A., and Vann, W. F. (1980). Structure of the Escherichia coli K2 capsular antigen, a teichoic acid-like polymer. J. Bacteriol. 143, 1108–1115. Johnson. J. R., and O’Bryan, T. T. (2004). Detection of the Escherichia coli group 2 polysaccharide capsule synthesis Gene kpsM by a rapid and specific PCR-based assay. J. Clin. Microbiol. 42, 1773–1776. Kaijser, B. (1973). Immunology of Escherichia coli: K antigen and its relation to urinary-tract infection. J. Infect Dis. 127, 670–677. Kaper, J. B., Nataro, J. P., and Mobley, H. L. (2004). Pathogenic Escherichia coli. Nat. Rev. Microbiol. 2, 123–140.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 15

2

Leboeuf, D., and Henry, N. (2006). Molecular bond formation between surfaces: anchoring and shearing effects. Langmuir 22, 127–133. Maroncle, N., Rich, C., and Forestier, C. (2006). The role of Klebsiella pneumoniae urease in intestinal colonization and resistance to gastrointestinal stress. Res. Microbiol. 157, 184–193. Meier, C., Oelschlaeger, T. A., Merkert, H., Korhonen, T. K., and Hacker, J. (1996). Ability of Escherichia coli isolates that cause meningitis in newborns to invade epithelial and endothelial cells. Infect Immun 64, 2391–2399. Mobley, H. L., Green, D. M., Trifíllis, A. L., Johnson, D. E., Chippendale, G. R., Lockatell, C. V., Jones, B. D., and Warren, J. W. (1990). Pyelonephritogenic Escherichia coli and killing of cultured human renal proximal tubular epithelial cells: role of hemolysin in some strains. Infect Immun 58, 1281–1289. Neu, T. R. (1996). Significance of bacterial surfaceactive compounds in interaction of bacteria with interfaces. Microbiol. Rev. 60, 151–166. Ochman, H., and Selander, R. K. (1984). Standard reference strains of Escherichia coli from natural populations. J. Bacteriol. 157, 690–693. O’Toole, G. A., and Kolter, R. (1998). Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449–461. Pluschke, G., Mayden, J., Achtman, M., and Levine, R. P. (1983). Role of the capsule and the O antigen in resistance of O18:K Escherichia coli to complementmediated killing. Infect Immun 42, 907–913. Roberts, I. S. (1996). The biochemistry and genetics of capsular polysaccharide production in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 50, 285–315. Russo, T. A., Sharma, G., Weiss, J., and Brown, C. (1995). The construction and characterization of colanic acid deficient mutants in an extraintestinal isolate of Escherichia coli (O4/K54/H5). Microb. Pathog. 18, 269–278. Sandberg, T., Kaijser, B., Lidin-Janson, G., Lincoln, K., Orskov, F., Orskov, I., Stokland, E., and Svanborg-Eden, C. (1988). Virulence of Escherichia coli in relation to host factors in women with symptomatic urinary tract infection. J. Clin. Microbiol. 26, 1471–1476. Schachter, B. (2003). Slimy business-the biotechnology of biofilms. Nat. Biotechnol. 21, 361–365. Schembri, M. A., Dalsgaard, D., and Klemm, P. (2004). Capsule shields the function of short bacterial adhesins. J. Bacteriol. 186, 1249–1257. Silver, R. P., and Vimr, E. R. (1984). Polysialic acid capsule of Escherichia coli K1. In Molecular Basis of Bacterial Pathogenesis (Academic Press, Inc., New York), pp. 39–60. Strauch, K. L., and Beckwith, J. (1988). An Escherichia coli mutation preventing degradation of abnormal periplasmic proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 1576–1580.

1

HU 008 368 T2

Toledo-Arana, A., Valle, J., Solano, C., Arrizubieta, M. J., Cucarella, C., Lamata, M., Amorena, B., Leiva, J., Penades, J. R., and Lasa, I. (2001). The Enterococcal Surface Protein, Esp, Is Involved in Emerococcus faecalis Biofilm Formation. Appl. Environ. Microbiol. 67, 4538–4545. Valle, J., Toledo-Arana, A., Berasain, C., Ghigo, J. M., Amorena, B., Penades, J. R., and Lasa, 1. (2003). SarA and not sigmaB is essential for biofilm development by Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 48, 1075–1087. Vasseur, P., Vallet-Gely, I., Soscia, C., Genin, S., and Filloux, A. (2005). The pel genes of the Pseudomonas aeruginosa PAK strain are involved at early and late stages of biofilm formation. Microbiology 151, 985–997. Vidal, O., Longin, R., Prigent-Combaret, C., Dorel, C., Hooreman, M., and Lejeune, P. (1998). Isolation of an Escherichia coli K–12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442–2449. Waters, C. M., and Bassler, B. L. (2005). Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21, 319–346. Whitfield, C. (2006). Hosynthesis and assembly of capsular polysaccharides in Escherichia coli. Annu Rev Biochem. 75, 39–68. Whitfield, C., and Roberts, I. S. (1999). Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 31, 1307–1319.

5

10

15

20

25

30 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Bakteriális törzsbõl származó, szolubilis, II¹es csoport típusú tokpoliszacharid alkalmazása olyan készítmény elõállítására, amely megakadályozza vagy gátolja a bakteriális adhéziót és/vagy bakteriális biofilm kialakulását. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a szolubilis, II¹es csoport típusú tokpoliszacharidot Escherichia coli, Haemophilus influenzae és Neisseria meningitidis közül választott baktérium tenyészetének felülúszójában kapjuk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a szolubilis, II¹es csoport típusú tokpoliszacharidot tisztított frakcióként kapjuk. 4. Készítmény bakteriális adhézió és/vagy bakteriális biofilmképzõdés gátlására, azzal jellemezve, hogy bakteriális törzsbõl származó, szolubilis, II¹es csoport típusú tokpoliszacharidot tartalmaz. 5. A 4. igénypont szerinti készítmény, amely E. coli, H. influenzae és N. meningitidis közül választott baktérium tenyészete felülúszójának tisztított frakcióját tartalmazza. 6. Eljárás biofilm elleni aktivitású, II¹es csoport típusú tokpoliszacharid tisztítására bakteriális törzsbõl, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: (i) II¹es csoport típusú tokot expresszáló bakteriális törzs tenyészetének felülúszóját elválasztjuk a bakteriális sejtektõl;

35

40

45

50

55

60 16

2

(ii) a kapott felülúszóban jelen levõ poliszacharidokat precipitáljuk; és (iii) adott esetben a precipitátumot újraszuszpendáljuk. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, ahol a II¹es csoport típusú tokpoliszacharidot expresszáló bakteriális törzs E. coli, H. influenzae és N. meningitidis közül választott. 8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, ahol a bakteriális törzs uropatogén E. coli. 9. A 6–8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az (i) elválasztási lépést a tenyészet filtersterilizálásával és/vagy centrifugálásával végezzük. 10. A 6–9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (ii) precipitációs lépést egy térfogatnyi felülúszóra számítva háromszoros térfogatnyi etanollal végezzük. 11. A 6–10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az (ii) lépésben kapott precipitátumot vízben újraszuszpendáljuk, ionmentesített vízzel szemben dializáljuk, majd a (iii) lépést megelõzõen liofilizáljuk. 12. A 6–11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amely egy további, (iv) ioncserélõ kromatográfiás tisztítási lépést is tartalmaz. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol a (iv) lépést DEAE-Sepharose oszlop alkalmazásával végezzük. 14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, ahol a (iii) újraszuszpendálási lépést 25% 1¹propanollal kiegészített 20 mmol/l Tris-HCl (pH=7,5) pufferben végeztük, és a (iv) lépésben alkalmazott oszlopot ugyanezzel a pufferrel ekvilibráltuk. 15. A 12–14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (iii) és (iv) lépések közé centrifugálási lépést iktatunk közbe az oldhatatlan frakció eltávolítására. 16. A 12–15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a II¹es csoport típusú tokpoliszacharidot 20 mmol/l Tris-HCl pufferben (pH=7,5) 25% 1¹propanolt tartalmazó, 300 mmol/l NaCl-oldattal eluáljuk. 17. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, vagy a 4. vagy 5. igénypont szerinti készítmény, ahol a szolubilis, II¹es csoport típusú tokpoliszacharidot a 6–16. igénypontok bármelyike szerinti eljárással kapjuk. 18. A 4., 5. és 17. igénypont szerinti készítmény, amely arra rászoruló egyén számára történõ, preventív vagy terápiás adagolásra van formulázva. 19. Biofilm elleni bevonat, azzal jellemezve, hogy bakteriális törzsbõl származó, II¹es csoport típusú tokpoliszacharidot tartalmaz. 20. A 19. igénypont szerinti, biofilm elleni bevonat, azzal jellemezve, hogy a II¹es csoport típusú tokpoliszacharid Escherichia coli, Haemophilus influenzae és Neisseria meningitidis közül választott bakteriális törzsbõl származik. 21. A 19. vagy 20. igénypont szerinti, biofilm elleni bevonat, azzal jellemezve, hogy a 4., 5. és 17. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazásával elõállított. 22. Orvosi vagy ipari eszköz, azzal jellemezve, hogy a 19., 20. és 21. igénypontok bármelyike szerinti biofilm elleni bevonattal legalább részben be van vonva.

HU 008 368 T2 Int. Cl.: A61K 39/102

17

HU 008 368 T2 Int. Cl.: A61K 39/102

18

HU 008 368 T2 Int. Cl.: A61K 39/102

19

HU 008 368 T2 Int. Cl.: A61K 39/102

20

HU 008 368 T2 Int. Cl.: A61K 39/102

21

HU 008 368 T2 Int. Cl.: A61K 39/102

22

HU 008 368 T2 Int. Cl.: A61K 39/102

23

HU 008 368 T2 Int. Cl.: A61K 39/102

Kiadja a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest

(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (54) Bakteriális poliszacharidok alkalmazása biofilmképzõdés gátlására

Recommend Documents