!HU000007196T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 196
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 200300183 2003. 02. 10. 200301708 2003. 11. 18.
(73) Jogosult: Santaris Pharma A/S, 2970 Horsholm (DK)
DK DK
(72) Feltalálók: HANSEN, Jens Bo Rode, DK-2900 Hellerup (DK); THRUE, Charlotte, Albaek, DK-1327 Copenhagen K (DK); PETERSEN, Kamille, Dumong, DK-2800 Lyngby (DK); WESTERGAARD, Majken, DK-3460 Birkerod (DK); WISSENBACH, Margit, DK-3480 Fredensborg (DK) (54)
HU 007 196 T2
C12N 15/11
(21) Magyar ügyszám: E 04 709580 (22) A bejelentés napja: 2004. 02. 10. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040709580 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1592793 A1 2004. 08. 19. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1592793 B1 2009. 07. 15.
(2006.01) A61K 31/7088 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04069991 PCT/DK 04/000096
(74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Survivinexpresszió modulálására szolgáló oligomer vegyületek
A leírás terjedelme 62 oldal (ezen belül 10 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 196 T2
A találmány területe A találmány tárgyát képezik survivinexpresszió modulálására szolgáló készítmények és eljárások. Részletezve, a találmány tárgyát képezik oligomer vegyületek, elõnyösen oligonukleotidok, amelyek specifikusan hibridizálhatóak survivint kódoló nukleinsavakkal. Az oligomer vegyületekrõl bemutattuk, hogy modulálják a survivin expresszióját és ismertettük a vegyületek gyógyszerészeti készítményeit és alkalmazásukat rákbetegségek kezelésére. A találmány háttere A rák a világ vezetõ haláloka és betegségek csoportját foglalja magában, amelyeket genetikai instabilitás következtében fellépõ genetikai rendellenességek váltanak ki. Úgy vélik, hogy az összes ráksejt a normális sejtproliferációt és ¹homeosztázist irányító, számos szabályozási útvonalban hordoz hiányosságokat. Ezek a hiányosságok különbözõ, ráksejtekre specifikus, jellegzetes képesség megszerzését eredményezik (Hanahan és Weinberg, 200, Cell 100, 57–70). Ezen rákjellemzõk egyike az apoptózis vagy programozott sejthalál elkerülése, amely egy evolúciósan konzervált sejtöngyilkossági folyamat (Hengartner, 2000, Nature 407, 770–776.). Az apoptózis esszenciális a magzati fejlõdés során, mivel eltávolítja azokat a sejteket, amelyekre már nincs szükség, és felnõtt szövetekben a sejttermelés és sejtpusztulás egyensúlyával biztosítja a homeosztázis fenntartását. Továbbá ezen a módon eltávolítódnak azok a sejtek, amelyeknek rendellenes tulajdonságaik vannak, mint például fertõzõ ágensek vagy vegyületek által indukált mutációk vagy genetikai károsodások. Malignussejtekben hiányzik ez a sejtes ellenõrzési mechanizmus az apoptózis gátoltsága miatt, amely megnövelt sejtéletképességet eredményez, ami sejtes transzformáció, gyorsabb betegség elõrehaladás és terápiára való rezisztensség kockázatát növeli (Evan és Vousden, 2001, Nature 411, 342–348.). Ezért az apoptózis manipulálása megjelent, mint új, rák kezelésére szolgáló stratégia (Nicholson D. W., 2000, Nature 407, 810–816.). Két jelátvivõ útvonal ismert, amelyek apoptózis indukciót váltanak ki, a belsõ vagy mitokondriális útvonal, amelyet környezeti stressz és kemoterapeutikumok indukálnak, és a külsõ vagy halálreceptor útvonal, amelyet az immunrendszer végrehajtó sejtjei indukálnak (Ashkenazi és Dixit, 1998 Science 281, 1305–1308; Green és Reed, 1998, Science 281, 1309–1312). Mindkét útvonal kaszpázok aktiválásában csúcsosodik ki, amelyek egy sejten belüli cisztein proteáz családot alkotnak, amelyek perceken belül szétszedik a sejt szerkezeteit, ezzel gyors sejtpusztulást okoznak (Cohen, 1997, Biochem. J. 326, 1–16). Mind apoptózist elõsegítõ, mind apoptózisgátló fehérjék ismertek. A Bcl–2 fehérjecsalád tartalmaz mind pro¹, mind antiapoptotikus ferhéjéket. Az apoptózis inhibitorai között az evolúciósan nagyon konzervált apoptózis gátló fehérje (inhibitor of apoptpsis protein, IAP) család nyolc fehérjét tartalmaz emberekben. Ezek egyike a survivin, amelyet nemrégiben azonosítottak (Ambrosini és mun-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
katársai: 1997, Nat. Med. 3, 917–921). A survivin a Bcl–2 után gátolja az apoptózist, közvetlenül vagy közvetve gátolva a végrehajtó kaszpáz¹3 és –7 intracelluláris proteázokat, amelyek az apoptózisért felelõsek (Shin és munkatársai: 2001, Biochemistry 40, 1117–1123). A legújabb bizonyítékok azt sugallják, hogy a survivin közvetlenül szabályozza a korábban ható kaszpáz¹9 aktiválását. Egy survivin Thr34-Ala domináns negatív mutáns nem tud apoptózist indukálni egér embrionális fibroblasztokban, amelyekben nincsen Apaf–1 vagy kaszpáz¹9 apoptószóma összetevõ (Blanc-Brude és munkatársai: 2003, Clin. Cancer Res. 9, 2683–2692). A hepatitisz B¹kölcsönható fehérje (HBXIP) a foszforilált survivin kofaktoraként mûködik, lehetõvé teszi, hogy a prokaszpáz-9-hez kötõdjön és elnyomja az aktiválódását (Marusawa és munkatársai: 2003, EMBO J. 22, 2729–2740). Egyéb hatásmechanizmusokat is tárgyaltak már (Beltrami és munkatársai: 2004, J. Biol. Chem. 279, 2077–2084). A survivin nagy figyelmet keltett, mint új terápiás célpont, mivel szelektíven expresszálódik ráksejtekben és szükséges az életképességükhöz. A survivin normálisan expresszálódik az embriogenezis során. A csecsemõmirigyen, CD34+ csontvelõ-eredetû õssejteken, placentán és a bazális vastagbél-epitéliumon kívül a survivin nem detektálható normális felnõtt szövetekben, de alapvetõen nagy mennyiségben van jelen az összes transzformált sejten, attól függetlenül, hogy milyen a mitózisos állapotuk. Az expressziója általánosan sejtciklus függõ módon van szabályozva, a csúcspontja a mitózis során van (U és munkatársai: 1998, Nature 396, 580–584). A G2/M fázis során a survivin az interfázishoz képest több mint 40¹szeres mennyiségben lehet jelen. Továbbá, a CDC2-ciklin¹B1 általi Thr 34 foszforiláció következtében fellépõ megnõtt fehérjestabilitás okozhatja a mitózisnál a megemelkedett survivinszintet. Az interfázisban a fehérjeszint alapértékekre csökken az ubikvitinfüggõ protoeolízis következtében (Zhao és munkatársai: 2000, J. Cell Sci. 113, 4363–71). Azt sugallták, hogy a survivin túltermelése a ráksejtekben az alapvetõ apoptózisindukáció ellen hat, túljut a G2/M ellenõrzési ponton és ezáltal a sejtek mitózison keresztüli áthaladását segíti (Li és munkatársai: 1998, Nature 396, 580–584). Sejttenyészetes rendszerekben a sejtpusztulás gátlása a survivin túltermelése révén jól megalapozott (Ambrosini és munkatársai: 1997, Nat. Med. 3, 917–921; Tamm és munkatársai: 1998, Cancer Res. 58, 5315–5320; Mahotka és munkatársai: 1999, Cancer Res. 59, 6097–6102). A survivinapoptózist gátló szerepét in vivo transzgenikus egerekben demonstrálták, amelyek survivint expresszáltak a bõrükben, amely gátolta az UVB indukálta apoptózist a keratinocitáknál (Grossman at al., 2001, J. Clin. Invest. 108,991–999). A sejtes apoptózisban betöltött szerepe mellett a survivin kritikus szerepet játszik a mitózis különbözõ szakaszaiban. Például a survivin kiütése homozigóta survivin kiütött egerekben 100%¹os letalitást okoz (Uren és munkatársai: 2000, Curr. Biol. 10, 1319–1328; Conway és munkatársai: 2002, Gastroenteroigy 123, 619–631).
1
HU 007 196 T2
A survivinról azt találták, hogy a mitózisos gépezet különbözõ összetevõihez kapcsolódik, mint például a centroszómákhoz, miktrotubulusokhoz és a magorsók maradékához a középtestekhez. A mikrotubulus asszociáció esszenciális a survivin apoptózis elleni hatásához. A survivin kettõs szerepét, mint apoptózisinhibitor és esszenciális faktor a sejtosztódás során, bemutatták a survivin célzott leszabályozásával, Hela-sejtek transzfektálásával EPR–1 cDNS-sel, amely komplementer a survivinhoz. A survivin EPR–1 antiszensz általi leszabályozása megnövelt apoptózist és sejtproliferáció gátlást eredményezett (Ambrosini és munkatársai: 1998, J. Biol. Chem. 273, 11 177–11 182). A survivin eltüntetésének további jelei a mitózisos megállás, poliploiditás, sérült centroszómareplikáció, mikrotubulus-nukleáció és mitózisos orsó összeállítás/stabilitás és sejtosztódás gátlás. Ezen hatások legtöbbje fokozódik egy p53–/– mutáns háttér esetén (Beltrami és munkatársai: 2004, J. Biol. Chem. 279, 2077–2084; Carvalho és munkatársai: 2003, J. Cell. Sci. 116, 2987–2998; Lens és munkatársai: 2003, EMBO J. 22, 2934–2947). A survivinmitózis során betöltött alapvetõ szerepét alátámasztja, hogy asszociál a mitózisos gépezettel, ideértve a metafázisú és anafázisú orsó mikrotubulusait, és a metafázisú kromoszómák kinterokórjait (Beltrami és munkatársai: 2004, J. Biol. Chem. 279, 2077–2084). A survivin együtt helyezkedik el egyéb kromoszomális utazó fehérjékkel, mint amilyen az INCENP és az Aurora B (Carvalho és munkatársai: 2003, J. Cell. Sd. 116, 2987–2998; Lens és munkatársai: 2003, EMBO J. 22, 2934–2947). Az Aurora B kináz aktivitása függ a survivinnal mutatott kölcsönhatástól (Chen és munkatársai: 2003, J. Biol. Chem. 278, 486490). Azt sugallták, hogy az Aurora B kináz aktivitása esszenciális a citokinézishez, ezáltal egy mechanisztikus kapcsolatot ad a survivin és a sejtosztódás között (Chen és munkatársai: 2003, J. Biol. Chem. 278, 486–490). Két beszámoló azt igazolta, hogy a survivin szükséges a fenntartott ellenõrzési pontnál történõ leálláshoz, a leánykromatidák kinetokórjain a feszültség hiánya esetén. Úgy tûnik, hogy a survivin esszenciális a BubR1 ellenõrzési pont fehérjének a kinetokóroknál történõ tartásához és a mitózisos megálláshoz, olyan állapotokban, amikor nincs feszültség a kinetokóroknál. A taxol, amely egy mikrotubulus stabilizálószer, lehetõvé teszi, hogy a mikrotubulusok a kinetokórokhoz kapcsolódjanak, de meggátolja a feszültség létrehozását. Normálisan a taxollal kezelt sejtek mitózisban állnak meg egy kinetokór asszociált fehérje, a BubR1 közvetített ellenõrzési pont aktiválásának következtében. A taxollal kezelt survivinhiányos sejtek azonban be tudják fejezni a mitózist egy késést követõen, amelynek során a BubR1 eltûnik a kinetokórról. A Nokodazol szintén meggátolja, hogy feszültség jöjjön létre a kinetokórokon, de a mikrotubulusok hozzákapcsolódásának gátlása révén. Azonban a survivin eltüntetése nincs hatással a Nokodazol indukált mitózisos blokk és az ellenõrzési pont aktiválás esetén. A survivin láthatóan nem érintett a kinetokór és mikrotubulus kapcsolat figyelésében, hanem ehelyett a kine-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
tokóron kifejtett magorsó feszesség ellenõrzési pontjához szükséges (Carvalho és munkatársai: 2003, J. Cell. Sd. 116, 2987–2998; Lens és munkatársai: 2003, EMBO J. 22, 2934–2947). Továbbá azt sugallták, hogy a survivin egy kritikus p53 függõ mitózisos ellenõrzési pont fehérjeként szolgál, amely a genomikus integritás és a sejtvédelem érdekében szükséges (Beltrami és munkatársai: 2004, J. Biol. Chem. 279, 2077–2084). A survivin tehát egy fontos kapcsolat lehet a sejthalál és a sejtosztódás szabályozása között. A survivin kettõs szerepe következtében, azaz hogy az apoptózis inhibitora és a mitózis elõsegítõje, a survivin egy fontos faktor a rák megjelenésében és progessziójában, valamint a kemoterápiás ágensekre mutatott rezisztenciájában. A rákban betöltött klinikai szerepét hangsúlyozták, hogy nagy survivinszintet találtak majdnem minden típusú tumorban. A tumorokban a megnövelt survivinexpresszió gyenge prognózishoz, megnövekedett rák újramegjelenéshez és terápiára mutatott ellenálláshoz társul (Kawasaki és munkatársai: 1998, Cancer Res. 58, 5071–5074; Adida és munkatársai: 1998, Lancet 351, 882–883). Érdekes módon a tüdõ- és emlõtumorok expresszálják a legnagyobb survivinszintet. Ezek a tumorok általánosan nem elõnyös prognózisához társul a korai metasztatizálóképesség és a számos mechanisztikusan nem rokon kemoterápiás ágensre megjelenõ rezisztencia következtében. A survivin szintjének csökkentésérõl kimutatták, hogy érzékennyé teszi a tumorsejteket az olyan DNS-károsító ágensekre, mint az etopozid (Li és munkatársai: 1999, Nature Cell Biology l, 461–466; Olie és munkatársai: 2000, Cancer Res. 60, 2805–2809; Jiang és munkatársai: 2001, J. Cell. Biochem. 83, 342–354), cisplatin (Pennati és munkatársai: 2004, Oncogén 23, 386–394;), doxorubicin (Zhou és munkatársai: 2002, J. Farmacol. Exp. Ter. 303, 124–131) és radioterápia (Pennati és munkatársai: 2003, J. Invest. Dermatol. 120, 648–654; Asanuma és munkatársai: 2002, Jpn. J. Cancer Res. 93, 1057–1062). Azok a sejtek, amelyekbõl a survivin el lett távolítva, különösen érzékenyek a texolra, ami szintén igaz a taxolra is (Zaffaroni és munkatársai: 2002, Cell. Mol. Life Sci. 59, 1406–1412; Ling és munkatársai: 2004, J. Biol. Chem. elektronikus közzététel a nyomdai elõtt). A taxolra és a radioterápiára mutatott rezisztenciáról kimutatták, hogy korrelál a survivinexpressziós szintjével (Zaffaroni és munkatársai: 2002, Cell. Mol. Life Sci. 59, 1406–1412; Rodel és munkatársai: 2003, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Fys. 55, 1341–1347) és a taxol éppen nem letális koncentrációi esetén kimutatták, hogy fokozza a survivinexpressziót jelentõs mértékben MCF–7 emlõráksejtek esetén (Ling és munkatársai: 2004, J. Biol. Chem. elektronikus közzététel a nyomdai elõtt). A survivin úgy tûnik, hogy szükséges a magorsó ellenõrzési pont mûködéséhez a taxol kezelésre adott válaszban (Carvalho és munkatársai: 2003, J. Cell. Sci. 116, 2987–2998; Lens és munkatársai: 2003, EMBO J. 22, 2934–2947). Survivin hiányában tehát a sejtek meg vannak fosztva az egyik természetes ellenállási mechanizmusoktól, amely lehe-
1
HU 007 196 T2
tõvé teszi a taxol hátrányos hatásainak kijavítását a mitózisban. Érdekes módon a survivin az angiogenezis során is kritikus szerepet játszik. Azt találták, hogy az angiogenetikailag stimulált endotéliumsejtekben a survivin szintje megemelkedett in vitro és in vivo (O’Connor és munkatársai: 2000, Am. J. Patol. 156, 393–398; Tran és munkatársai: 1999, Biochem. Biofys. Res. Commun. 264, 781–788). A survivin antiszensz célbavétele endoteliális apoptózist okozott és a kapillárisszerû véredények gyors begyûrõdését in vitro (Mesri és munkatársai: 2001a, Am. J. Patol. 158, 1757–1765). Emberi emlõrák xenograftokba történõ injekciója egy olyan adenovírusnak, amely a survivin domináns negatív változatát expresszálta, gátolta a kialakult tumorok növekedését. Ehhez apoptózis társult, mind a tumorsejtek, mind az endotél sejtek esetén és jelentõsen csökkent a tumoreredetû véredények mennyisége (Blanc-Brude és munkatársai: 2003, Clin. Cancer Res. 9; 2683–2692). A kemoterápia és a radioterápia mind a tumorsejteket, mind a proliferáló endotélsejteket célbaveszi a tumorvaszkulaturában. A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (vascular endothelial growth factor, VEGF) jelentõsen csökkenti a kemoterápia proapoptotikus hatását a vaszkuláris endotél sejtekre. A gyógyszertoxicitás esetén ez a sejtvédelem kapcsolatba lett hozva a VEGF közvetített survivinexpresszió fokozással. A survivin aktivitásának elnyomása eltünteti a VEGF sejtvédõ hatását azon gyógyszerek esetében, amelyek a mikrotubulus dinamikával lépnek kölcsönhatásba (taxol) és a DNS-károsítókkal, valamint az a tumornekrózis-faktor elleni védelemmel (Tran és munkatársai: 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 4349–4354; Mesri és munkatársai: 2001a, Am. J. Patol. 158, 1757–1765). Továbbá domináns negatív survivin (T34A) expressziója endoteliális sejtekben (HUVECC és DMVEC) masszív apoptózis indukciót eredményezett (Blanc-Brude és munkatársai: 2003, Clin. Cancer Res. 9, 2683–2692). A survivin célbavételét egyre fokozottabban említik, mint aminek kettõs rákellenes hatása van a tumorsejt apoptózis kiváltásával és a tumorhoz kapcsolódó angionegezis gátlásával (Altieri DC, 2003, Oncogene 22, 8581–8591). Számos survivint alkalmazó terápiás megközelítést kezdeményeztek már. A legígéretesebbek a következõk: oltási stratégiák, mutáns survivin alkalmazása, mint domináns negatív antagonista és survivin specifikus antiszensz oligonukleotidok alkalmazása. Domináns negatív mutáns survivin fehérjét (Thr34-Ala) expresszáló replikációképtelen adenovírus alkalmazása gátolt tumornövekedést váltott ki három különbözõ mellrák xenograft modellben egérben. Ez az adenovírus mellrák xenograft modellekben in vivo hatásosnak bizonyult és survivin (T34A) expressziót indukált melanoma sejtekben, gátolta a tumornövekedést melanoma xenograft modellben (Blanc-Brude és munkatársai: 2003, Clin. Cancer Res. 9, 2683–2692; Grossman és munkatársai: 2001 Proc. Natl. Sci. USA 98; 635–640). Sejttenyészetekben növekedett az apoptózis, ha mu-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
táns survivin CDC2-ciklin¹B1 komplexhez volt kötve és ezáltal meg volt akadályozva a vad típusú survivin foszforilációja (Mesri és munkatársai: 2001b, J. Clin. Invest 108, 981–990). Egyes CDC2 antagonisták, mint amilyen a purvalanol A és a flavopiridol, meggátolják a survivin foszforilációt, és ezeket jelenleg klinikai vizsgálatokban tesztelik taxollal kombinációban (Schwartz és munkatársai: 2002, J. Clin. Oncol. 20, 2157–2170). Számos antiszensz oligonukleotidot alkalmazó megközelítés azt mutatta, hogy az antisurvivin antiszensz oligonukleotidok leszabályozzák a survivint sejttenyészetekben, apoptózist indukálnak és tüdõrák sejteket és HeLa-sejteket érzékennyé tesznek az etopozid nevû kemoterápiás ágensre (Li és munkatársai: 1999, Nature Cell Biology 1, 461–466; Olie és munkatársai: 2000, Cancer Res. 60, 2805–2809; Jiang és munkatársai: 2001, J. Cell. Biochem. 83, 342–354). Az ISIS 28599 antiszensz oligoval, amely egy kevert vázú 2’¹O-MOE szárnymer (wingmer), végzett gátlás multinukleált sejteket és apoptózisindukció gátlást eredményezett (Chen at al., 2000, Neoplasia 2, 235–241). Egy egér májregenerációs modellben az ISIS 114926 antiszensz oligonukleotid 90%-kal lecsökkentette a survivin mRNS¹t (Proceedings of the American Association for Cancer Research, vol. 42, 2001, 2468 számú kivonat). Az ISIS 23722 antiszensz oligonukleotid intratumorális injekciója korlátozott hatást mutatott agresszív nem-Hodgkin-limfóma xenograft tumorok növekedésére egérben (Ansell és munkatársai: 2004, Leukemia – elektronikus közzététel a nyomdai elõtt). Jelenleg nincs olyan terápiás ágens, amely hatásosan gátolná a survivin szintézisét. Tehát létezik egy hosszú ideje fennálló szükség olyan ágensekre, amelyek gátolják a tumorsejtnövekedést a survivin expressziójának csökkentése révén. A WO9822589 számú nezetközi közzétételi iratban eljárásokat ismertettek apoptózis modulálására olyan ágensekkel, amelyek modulálják a survivin mennyiségét vagy aktivitását és eljárásokat ismertettek survivin által közvetített patológiás állapotok súlyosságának csökkentésére. Ilyen ágens például az EPR–1¹et kódoló szálat kódoló konstrukció, amely a survivin komplementere, de nem ismertettek specifikus antiszensz oligokat. A WO0164741 számú nemzetközi közzétételi irat ismertet egy „tet-off” promoter rendszert, amely szabályozza survivin antiszensz mRNS transzkripcióját. Azonban ez az alkalmazás nem ismertet antiszensz oligonukleotidokat. A jelenleg klinikai próbák alatt lévõ oligonukleotidok legnagyobb része a foszfortioátkémián alapul, 1988ból, amely az elsõ alkalmas antiszensz kémia volt, amelyet kifejlesztettek. Azonban az elmúlt években egyértelmûvé vált, hogy ennek a kémiának súlyos hátrányai vannak, amelyek korlátozzák a klinikai alkalmazását. Ezek közé tartozik a cél mRNS¹re mutatott alacsony affinitás, amely negatívan befolyásolja a hatásosságot és korlátozásokat jelent arra nézve, hogy milyen kicsi aktív oligonukleotidok lehetségesek, ezáltal bonyolulttá teszi az elõállítást és növeli a kezelési költségeket. Továbbá, az alacsony affinitásuk a cél mRNShez alacsony hozzáférést eredményez, amely nehéz-
1
HU 007 196 T2
kessé teszi az aktív vegyületek azonosítását. Végül a foszfortioát-oligonukleotidok mellékhatások sokaságától szenvednek, amelyek leszûkítik a terápiás ablakokat. Annak érdekében, hogy ezeket és egyéb problémákat megoldjanak, sok erõfeszítést tettek új analógok kifejlesztésére, amelyeknek jobbak a tulajdonságaik. Amint azt az alábbi 1. ábrán bemutattuk, ezek közé tartozik az olyan teljesen mesterséges analóg, mint a PNA és morfolino és több hagyományos DNS-analóg, mint például a boránfoszfonátok, N3’-P5’-foszforamidátok és számos 2’¹módosított analóg, mint például a 2’¹F, 2’¹O¹Me, 2’¹O-metoxi-etil (MOE) és 2’¹O-(3¹amino-propil) (AP). Nemrégiben vezették be a hexitol-nukleinsavat (HNA), 2’¹F-arabino-nukleinsavat (2’-F-ANA) és D¹ciklohexenil-nukleozidot (CeNS). Ezen analógok közül több jobban kötõdik komplementer nukleinsavakhoz, jobb a biostabilitása vagy megmarad az a képességük, hogy egy sejtbeli enzimet toborozzanak, az RNáz-H¹t, amely számos antiszensz vegyület hatásmechanizmusában érintett. Azonban ezek közül egyik sem kombinálja ezen elõnyök mindegyikét s számos esetében az egyéb tulajdonságbeli javulás egy vagy több tulajdonságbeli romlással jár. Továbbá számos esetben új komplikációkat jegyeztek fel, amelyek komolyan korlátozzák az analógok némelyikének kereskedelmi értékét. Ezek közé tartozik az alacsony oldhatóság, komplex oligomerizációs kémia, nagyon alacsony sejtek általi felvétel, egyéb kémiával mutatott inkompatibilitás stb. Betegségek kezelésére szolgáló survivinexpressziót moduláló antiszensz oligonukleotidokat ismertettek a WO0018781 és WO0157059 számú nemzetközi közzétételi iratokban. Ezen oligonukleotidok mindegyike 18–20 bp hosszúságú és a foszfortioát vagy a MOE kémia alkalmazásával lettek tervezve. A WO014655 számú nemzetközi közzétételi irat egyetlen antiszensz oligonukleotidot ismertet, amelynek célpontja a survivin és ez egy teljesen módosított foszfortioát, ahol néhány MOE-nukleozid is van. A MOE-kémiának számos korlátja van. Ennek csupán enyhe affinitása van, amely csak akkor jelenik meg, ha számos MOE van inszertálva egy tömbben az oligoba. A MOE a 2’¹módosítások családjába tartozik, és jól ismert, hogy a vegyületeknek ezen csoportja esetén az antiszensz aktivitás közvetlenül korrelál az ENS-kötõ affinitással in vitro. A c¹raf¹ot célzó MOE 20 bp hosszúságú gapmer (5MOE/PO-10PS-5MOE/PO) IC50-értéke a beszámoló szerint körülbelül 20 nm T24 sejtekben és a PKC-célzó MOE gapmer IC50-értéke 25 nm a beszámolók szerint A549 sejtekben. Ezzel szemben az antiszensz kísérletekben alkalmazott foszfortioát vegyületeknek az IC50-értéke jellemzõen a 150 nm tartományban van (Stein, Kreig, Applied Antisense Oligonucleotide Technology, Wiley-Liss, 1988, p 87–90). A jelen találmánnyal egyidejûleg benyújtott WO03027244 számú nemzetközi közzétételi irat egy 20¹mer foszfortioát antiszensz oligonukleotidot ismertet, amelynek a célja a survivin, és a survivin mennyiségének csökkenését váltja ki nagyon nagy koncentrá-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
ciók esetén (például a 903 vegyület 55%¹os fehérjecsökkentést váltott ki 200 nmol esetén). Az US 2002/137708 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés survivint célzó antiszensz oligonukleotidokat ismertet. Az ismertetett oligonukleotidok között vannak foszfortioát oligodezoxinukleotidok és kiméra foszfortioát oligonukleotidok, amelyeknek van 2’MOE szárnya és dezoxiprés, valamint ismertetve lettek konjugátumok, amelyek tartalmazzák az oligonukleotidokat és a rák elleni terápiás alkalmazások. A jelen találmány fõ célja új oligomer vegyületek létrehozása a survivin mRNS ellen. A találmány szerinti vegyületekrõl azt találtuk, hogy csökkent IC50-értékeket mutatnak (tehát nagyobb az aktivitásuk), ezáltal könnyebbé teszik számos rákbetegség hatásos kezelését, amelyben a survivin expressziója okozati vagy kapcsolt ágensként van meghatározva. Amint azt a következõkben megmagyarázzuk, ezt a célt legjobban egy szupernagy affinitású kémia alkalmazásával értük el, amelyet LNA (Locked Nucleic Acid, azaz zárt nukleinsav) névvel láttak el. A találmány tárgyát képezik oligomer vegyületek, különösen LNA antiszensz oligonukleotidok, amelyek survivint kódoló nukleinsavra vannak célozva, és amelyek a survivin expresszióját módosítják. Részletezve ez a moduláció különösen hatásos volt survivin mRNS gátlásra, valamint apoptózisos válasz kiváltására. Az LNA¹t tartalmazó oligomer vegyületek lehetnek olyan kicsik, mint például 8¹merek és ugyanolyan aktívak, mint egy 16¹mer, amely meglehetõsen rövidebb, mint a survivint célzó antiszensz vegyületek, amelyekrõl eddig beszámoltak. Ezek a 16¹mer oligomer vegyületek alsó nanomoláris tartománybeli IC50-értékkel bírnak. A találmány lehetõvé teszi antiszensz oligomerek általános hosszának jelentõs csökkentését (20–25 merrõl, például 8–16 merre) anélkül, hogy sérülne a farmakológiai aktivitáshoz szükséges affinitás. Mivel egy oligo belsõ specifikussága fordítva arányos a hosszával, ezért egy ilyen rövidítés jelentõsen növeli az antiszensz vegyület specifikusságát az RNS célja irányába. Továbbá, várhatóan a rövidebb oligomer vegyületeknek nagyobb a biostabilitása és a sejtekbe való bejutása, mint a hosszabb oligomer vegyületeknek. Ezen okokból kifolyólag a jelen találmány egy jelentõs hozzájárulás a szakterülethez.
A találmány összefoglalása A survivin esszenciális a sejtproliferációhoz és a 50 mitózis több fázisában érintett. Számos ellenõrzési pontban érintett, amely a mitózist a sejtosztódással és az apoptózissal kapcsolja össze. A survivin az apoptózisgátló (inhibitor of apoptosis, IAP) géncsalád tagja, amelyek szuppresszálják a programozott sejthalált 55 (apoptózis) (lásd 6. ábra). A leggyakoribb humán neopláziák esetén megfigyelhetõ a megemelkedett survivinexpresszió, ezen neopláziák közé tartoznak a következõk: vastagbélrák, hólyagrák, tüdõkarcinóma, emlõrák, malignus glioma és hematológiás rákok. A survivin 60 expressziója korrelál az elõrehaladottság fokával és az 5
1
HU 007 196 T2
invázió fokával számos rák esetén. A normális differenciálódott szövetekben a survivin nem detektálható vagy nagyon alacsony szinten van jelen, amely a survivint egy elõnyös célponttá teszi számos humán rák esetén. A találmány egy központi szempontja szerint a találmány tárgya 12–25 nukleotidból álló vegyület, ahol a vegyület legalább 8 nukleotid hosszúságú alszekvenciát tartalmaz, ahol az említett szekvencia a SEQ ID NO: 130 szekvencián belül helyezkedik el, ahol az említett vegyület legalább egy nukleotidanalógot tartalmaz. Mivel a humán genom szekvenciája elérhetõ és a gének azonosítása gyorsan növekszik, a találmány egy megvalósítási módja a lehetõ legrövidebb egyedi szekvenciák azonosítása, amelyek mRNS¹et céloznak. A találmány szerinti LNA-tartalmú oligomer vegyületek össze lettek hasonlítva LNA¹t és/vagy foszfortioátokat tartalmazó 18 merekkel, amelyek izoszekvenciálisak az ISIS 23722 antiszensz oligomerrel. Összehasonlítást is végeztünk az ISIS 23722-vel (amely egy 18¹mer 4 MOE 10 foszfortioát, amelyet 4 MOE követ). Megadtunk továbbá a találmány szerinti oligomer vegyületeket tartalmazó gyógyszerészeti és egyéb készítményeket is. A találmány tárgya továbbá eljárás survivin expressziójának modulálására sejtekben vagy szövetekben, amely eljárás tartalmazza az említett sejtek vagy szövetek érintkeztetését a találmány szerinti oligomer vegyületek közül eggyel vagy többel. Ismertetünk továbbá eljárásokat állat vagy ember kezelésére, akik gyanítható, hogy olyan betegségre vagy állapotra hajlamosak, amely kapcsolatba hozható a survivin expressziójával, melynek során terápiásan vagy profilaktikusan hatásos mennyiségben van beadva a találmány szerinti oligomer vegyületek közül egy vagy több. Továbbá survivin expressziójának gátlására és survivinaktivitáshoz kapcsolódó betegségek kezelésére szolgáló oligomer vegyületeket alkalmazó eljárásokat is megadunk. Az ilyen betegségek példái: rák különbözõ típusai, mint például tüdõ¹, emlõ¹, vastagbél¹, prosztata¹, hasnyálmirigy¹, tüdõ¹, máj¹, pajzsmirigy¹, vese¹, agy¹, here¹, gyomor¹, bél¹, vékonybél¹, gerincvelõ¹, szinusz¹, hólyag¹, vizeletrendszeri vagy petefészekrák. Az ábrák rövid ismertetése 1. ábra: A találmány szerinti különbözõ megoldások bemutatása: különbözõ összetételû gapmerek, fej- és farokmerek (head and tailmers) és keverékmerek (mixmer). A keverékmerek esetén a számok az alternatív folytonos DNS-szakaszokat jelölik, b¹D-oxi-LNA vagy a¹L-LNA. Az ábrán a vonal a DNS, a szürke satírozás az a¹L-LNA-nak felel meg és a négyzet b¹Doxi-LNA. 2. ábra: Survivin mRNS gátlása LNA antiszensz oligomer vegyülettel. Northern-blot az összes RNS¹re 15PC3-ból, amely 0,2, 1, 5, 25 nM 2A, 6A, 9A, 15A vegyülettel volt kezelve rendre. Az összes vegyület hatásos inhibitor volt alacsony koncentrációk esetén.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
3A. ábra: Survivin mRNS gátlása LNA antiszensz oligomer vegyület által. Összes RNS Northern-blotja, SW480 (felsõ panel) és A549 (alsó panel) sejtekbõl, amelyek 0,2, 1, 5, 25 nM 2A és 15A vegyülettel voltak kezelve. A sejtek az oligonukleotiddal voltak transzfektálva és 24 órát tenyésztve. 4. ábra: A tio-LNA szintézisének általános vázlata. 5. ábra: Humán survivin mRNS-szekvencia, SEQ ID No 1, GenBank regisztrációs szám: NM_001168. 6. ábra: A survivin vázlatos mûködése az apoptózisútvonalban. 7. ábra: Survivin mRNS-gátlása LNA antiszensz oligonukleotidokkal. A sejtek oligonukleotidokkal voltak transzfektálva és 24 órát tenyésztve. Az összes RNS¹t extraháltuk és detektáltuk a survivin mRNS¹t 15 PC3 és MCF–7 sejtekben valós idejû PCR alkalmazásával. A bemutatott survivinexpresszió normalizálva van a GAPDH-transzkripció állandósult állapotához. 8. ábra: LNA-tartalmú antiszensz oligonukleotidok általi apoptózis indukció. Az oligokkal transzfektált 15PC3 sejtek és a koncentrációk vannak jelölve egy 96 lyukú lemezen. A transzfekciót követõen kaszpáz-3/7¹Glo reagenst adtunk, ahogy azt már ismertettük, lumineszcencia indukciójára (luficeráz aktivitás), amelyet Luminoskan Ascent készüléken rögzítettünk, amelynek szállítója a Thermo Labsystem volt. A luciferáz aktivitás másodpercenkénti relatív fényegységben mértük (Relatíve Light Units, RLU/s). 9. ábra: Az ábra azt mutatja, hogy az LNA-tartalmú vegyületek (145A és 145C) javítják az apoptózisindukciót az azonos szekvenciájú MOE-vegyülethez képest ISIS 27322 (itt 145F) és az azonos szekvenciájú foszfortioátvegyülethez képest (145D). Az LNA-vegyület (146C) és a MOE-vegyület (146F), valamint a 15B LNA-vegyület hibás párosodású kontrolljai szintén a vizsgálat részét képezték. Az LNA antiszensz oligomer vegyület által végzett célzott survivin mRNS-gátlás nem eredményez növekedett apoptózist 15PC3 sejtekben. Az apoptózis aktiválását citometrikus gyöngy eljárással mértük. Az indukció többszörözõdését a kontrollal kezelt sejtekhez képest mutatjuk be. 10. ábra: Aktív kaszpáz-3¹at detektáltunk imunhisztokémiás detektálási eljárás alkalmazásával 15A LNA-antiszensz oligonukleotidokkal kezelt 15PC3 sejtekben, amely oligonukleotid a survivint célozza.
1
HU 007 196 T2
11. ábra: Survivin LNA antiszensz gátlása proliferáló ráksejtekben. Példái a 6A vegyület különösen potens volt. 12. ábra: 15A vegyülettel transzfektált 15 PC3 sejtekben a survivin gátlásának elemzése Western-blottolással 100 nM koncentrációnál. A találmány ismertetése A találmány oligomer vegyületeket alkalmaz, különösen antiszensz oligonukleotidokat, survivint kódoló nukleinsavmolekulák mûködésének modulálásában történõ alkalmazásra. A modulálás végsõ soron a termelt survivin mennyiségének változtatása. Egy megvalósítási mód szerint ezt úgy érjük el, hogy olyan antiszensz vegyületeket biztosítunk, amelyek specifikusan hidrolizálnak survivint kódoló nukleinsavakkal. A modulálás elõnyösen a survivin expressziójának gátlása, amely a termelt mûködõképes fehérjék mennyiségének csökkenéséhez vezet. A találmány szerinti antiszensz és egyéb oligomer vegyületek, amely a cél expresszióját modulálják, kísérletezéssel vagy a cél szekvenciájának információján alapuló ésszerû tervezéssel és egy kívánt cél elleni oligomer vegyület tervezésének legjobb ismeretanyagával azonosíthatóak. Ezen vegyületek szekvenciái a találmány elõnyös megvalósítási módjai. Hasonló módon a célmolekulában lévõ azon szekvenciamotívumok, amelyekhez ezen elõnyös oligomer vegyületek komplementerek (a továbbiakban „forró pontok” néven jelölve) az elõnyös helyek a célzásra. A találmány tárgya 12–25 nukleotidot és/vagy nukleotidanalógot tartalmazó vegyület, ahol az említett vegyület legalább 8 nukleotid vagy nukleotidanalóg hosszúságú alszekvenciát tartalmaz, ahol az említett alszekvencia a 130. azonosító számú szekvencián belül található (SEQ ID NO: 130), ahol az említett vegyület legalább egy nukleotidanalógot tartalmaz. A nukleotidanalógok jellemzõ módon a 130. azonosító számú szekvencia nukleotidjainak analógjai. Tehát a találmány szerinti vegyület alszekvenciája jellemzõ módon a 130. azonosító számú szekvencián belül helyezkedik el, vagy a 130. azonosító számú szekvencián belüli nukleotidok analógját tartalmazza. Egy elõnyös találmány szerinti nukleotidanalóg az LNA. Összesen 12–25 nukleotid vagy nukleotidanalóg jelentése szándékunk szerint 12–25 nukleotid vagy 12–25 nukleotidanalóg vagy ezek kombinációja, amely nem több mint összesen 25 nukleozidegység. A jelen szövegkörnyezetben a „nukleozid” kifejezést a normális jelentése szerint alkalmazzuk, azaz 2¹dezoxiribóz-egységet vagy ribózegységet tartalmaz, amely az egyes számú szénatomján keresztül van kötve egy nitrogénbázishoz, amely az adenin (A), citozin (C), timin (T), uracil (U) vagy guanin (G). Hasonló módon a „nukleotid” kifejezés jelentése 2¹dezoxiribóz-egység vagy RNS-egység, amely az egyes számú szénatomján keresztül van a nitrogénbázisok egyikéhez kötve, adenin (A), citorzin (C), ti-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
min (T) vagy guanin (G), uracil (U) és amely az ötös számú szénatomján keresztül egy nukleozidok közötti foszfátcsoporthoz van követve vagy egy terminális csoport. A leírás szerinti értelemben a „nukleotidanalóg” jelentése nem természetesen elõforduló nukleotid, ahol vagy a ribózegység különbözik a 2¹dezoxiribóztól vagy RNS-tõl és/vagy a nitrogénbázis különbözik az A¹tól, C¹tõl, T¹tõl és G¹tól és/vagy a nukleozidok közötti foszfát kapcsolócsoport különbözõ. Nukleozidanalógok specifikus példáit ismertetik például a következõk Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429–4443 és Uhlmann; Curr. Opinion In Drug Development, 2000, 3(2), 293–213. A megfelelõ „nukleozidanalóg” és „megfelelõ nukleozid” kifejezések jelentése szándékunk szerint az, hogy a nukleozidanalógban lévõ nukleobázis és a nukleozid azonos. Például, ha a nukleotid 2¹dezoxiribózegysége adeninhez van kötve, akkor a „megfelelõ nukleozidanalóg” pentózegységet (2¹dezoxiribóztól különbözõt) tartalmaz adeninhez kötve. A „nukleinsav” kiefejezés definíciója egy olyan molekula, amely kettõ vagy több nukleotid kovalens kötésével van kialakítva. A „nukleinsav” és „polinukleotid” kifejezéseket felcserélhetõ módon alkalmazzuk. A „nukleinsavanalóg” kifejezés jelentése nem természetes nukleinsavkötõ vegyület. Nukleinsav analógokat és nukleotidanalógokat ismertet például Freier & Altmann (Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429–4443) és Uhlmann (Curr. Opinion in Drug & Development [2000, 3(2): 293–213]. Az 1. ábra nukleinsavak elõállítására megfelelõ nukleotidanalógok kiválasztott példáit mutatja be. Az „LNA” kifejezés jelentése bicikluoss nukleozidanalógot tartalmazó nukleotid, amelyre hivatkozunk úgy is, mint LNA-monomer, vagy egy vagy több nukleozidanalógot tartalmazó oligonukleotid. LNA-monomereket ismertetnek a WO 9914226 számú nemzetközi közzétételi iratban és a következõ bejelentésekben: WO0056746, WO0056748, WO0066604, WO00125248, WO0228875, WO2002094250 és WO03/006475. Egy timidin LNA-monomer egy különös példája az (1S,3R,4R,7S)-7-hidroxi-1-hidroxi-metil-5metil-3-(timin-1¹il)-2,5-dioxa-biciklo[2:2:1]heptán. Az „oligonukleotid” kifejezés jelentése a jelen bejelentés szövegkörnyezetében egy oligomer (úgy is nevezzük, mint oligo) vagy nukleinsavpolimer [például ribonukleinsav (RNS) vagy dezoxiribonukleinsav (DNS)] vagy a szakterületen jártasak számára ismert nukleinsavanalóg, elõnyösen zárt nukleinsav (locked nucleid acid, LNA) vagy ezek keveréke. Ez a kifejezés tartalmazza a természetben elõforduló nukleobázis oligonukleotidokat, cukrokat és internukleozid (váz) kapcsolatokat, valamint olyan oligonukleotidokat, amelyeknek természetben nem elõforduló részei vannak, amelyek hasonlóan vagy javított módokon mûködnek. Egy teljesen vagy részlegesen módosított vagy szubsztituált oligonukleotid gyakran elõnyösebb a natív formákhoz képest, mivel számos kívánatos tulajdonsággal bírhatnak az ilyen oligonukleotidok, mint amilyen például a sejt-
1
HU 007 196 T2
membránon való átjutás, jó ellenálló képesség a sejten kívüli és sejten belüli nukleázokra, a cél nukleinsavra
foszfortioát
2’AP
morfolino
mutatott nagy affinitás. A fenti tulajdonságokat mutató LNA-analóg különösen elõnyös.
2¹MOE
2’¹O-metil
HNS
2’¹F-ANS
2
CeNS
2’¹fluor
PNS
3’¹foszforamidát 2’¹(3¹hidroxi)-propil
boranofoszfát 1. vázlat Az „egység” kifejezés jelentése monomer. A „legalább egy” kifejezés tartalmazza az 1¹et vagy az 1¹nél nagyobb egész számokat, mint például 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 és így tovább. A „tio-LNA” kifejezés zárt nukleitidot tartamaz, amelyben a 2. ábra szerinti X vagy Y legalább egyikének jelentése S vagy –CH2–S–. A tio-LNA lehet (b¹Dés a¹L-konfigurációban is. Az „amino-LNA” kifejezés tartalmaz olyan zárt nukleotidot, amelyben a 2. ábra szerinti X vagy Y közül legalább egy –N(H)–, N(R)–, CH2–N(H)–, –CH2–N(R)– ahol R hidrogénatom és C1–4-alkil közül választott. Az amino-LNA lehet beta¹D és alfa-L-konfigurációjú is. Az „oxi-LNA” kifejezés zárt nukleotidot tartalmaz, amelyben a 2. ábra szerinti X vagy Y közül legalább egy jelentése –O– vagy –CH2–O–. Az oxi-LNA lehet beta¹D- és alfa-L-konfigurációjú is. Az „ena-LNA” kifejezés jelentése zárt nukleotid, amely tartalmaz a 2. ábra szerinti Y¹on –CH2–O– csoportot.
40
45
50
55
60 8
Az „alfa-L-LNA” kifejezés zárt nukleotidot tartalmaz, amelyet a 3. ábrán mutattunk be (szerkezet a jobb oldalon). Az „LNA-származékok” kifejezés tartalmazza a 2. ábra szerinti zárt nukleotidokat, kivéve a beta-D-metilén LNA¹t, lehet például tio-LNA, amino-LNA, alfa-Loxi-LNA és ena-LNA. A „kapcsolócsoport” kifejezés jelentése olyan csoport, amely képes két nukleozidot, két nukleozidanalógot, egy nukleozidot és egy nukleozidanalógot stb. kovalensen összekapcsolni. Az egyedi és elõnyös példák közé tartoznak a foszfátcsoportok és a foszfonotioátcsoportok. A jelen szövegkörnyezetben a „konjugátum” kifejezés jelentése szándékunk szerint egy olyan heterogén molekula, amely itt ismertetett vegyület (azaz nukleozidok vagy nukleozidanalógok szekvenciáját tartalmazó vegyület) és egy vagy több nem nukleotid vagy nem polinukleotid rész kovalens összekapcsolásával lett elõállítva. A nem nukleotid vagy nem polinukleotid részek példái közé tartoznak olyan makromolekuláris ágensek, mint például fehérjék, zsírsavláncok, cukrok,
1
HU 007 196 T2
glikolproteinek, polimerek vagy ezek kombinációi. A jellemzõ fehérjék lehetnek a célfehérje antitestei. Jellemzõ polimer lehet a polietilénglikol. A „karcinóma” kifejezés jelentése szándékunk szerint epitéliás eredetû malignus tumor. Az epiteliás szövet beborítja vagy szegélyezi a testen belüli és kívüli sejtfelszíneket. Az epitéliás szövetek példái a bõr és a nyálkahártya és a savós hártya, amely testüregeket és belsõ szerveket borít be, mint amilyenek a belek, húgyhólyag, méh stb. Az epitél szövet kiterjedhet mélyebb szöveti rétegekre, csomók kialakítására, mint amilyenek például a nyálkakiválasztó csomók. A „szarkóma” kifejezés jelentése szándékunk szerint olyan malignus tumor, amely kötõszövetbõl növekszik, mint például porc, zsír, izom, ín és csont. A „glioma” kifejezés, ha itt alkalmazzuk, akkor szándékunk szerint gliasejt-eredetû malignus tumort takar. Az „egy” ha egy nukleoziddal, nukleozidanalóggal, szekvenciaazonosító számmal stb. kapcsolatban alkalmazzuk, akkor egyet vagy többet jelent. Különösen az „egy összetevõ (mint például nukleozid, nukleozidanalóg, azonosító számú szekvencia vagy a hasonlóak) a következõk alkotta csoportból választva…” kifejezés szándékunk szerint azt jelenti, hogy egy vagy több említett összetevõ választható ki. Tehát az olyan kifejezések, mint „egy összetevõ az A, B és C alkotta csoportból kiválasztva” szándékunk szerint tartalmazza az A, B és C összes kombinációját, azaz A, B, C, A+B, A+C, B+C és A+B+C kombinációkat. A jelen szövegkörnyezetben a „C1–4-alkil” kifejezés jelentése szándékunk szerint lineáris vagy elágazó, telített szénhidrogénlánc, ahol a láncnak 1–4 szénatomja van, mint például metil¹, etil¹, n¹propil¹, izopropil¹, n¹butil¹, izobutil¹, szek-butil- és terc-butil-csoport. A leírás szerinti értelemben a „cél nukleinsav” kifejezés survivint kódoló DNS¹t, RNS¹t (ideértve premRNS¹t és mRNS¹t) jelöl, amely az ilyen DNS-bõl lehet átvive és az ilyen RNS-bõl eredõ cél DNS¹t is magában foglalja. Amint azt itt alkalmazzuk, a „gén” kifejezés jelentése exonokat, intronokat, nem kódoló 5’¹ és 3’¹szakaszokat és regulátorelemeket és ezek összes jelenleg ismert variációját és bármilyen további még felderítendõ variációját tartalmazó gén. Amint azt itt alkalmazzuk, az „oligomer vegyület” jelentése egy oligonukleotid, amely kívánt terápiás hatást tud indukálni emberekben, például hidrogénkötõdés révén egy célgénhez „Chimeraplast” és „TFO”, a célgén „antiszensz inhibitorai” „siRNS”, „ribozimek” és „oligozimek” RNS átirataihoz történõ kötõdés révén vagy a célgén „aptamer”, „spiegelmer” vagy csali („decoy”) által kódolt fehérjékhez kötõdés révén. Az „mRNS” kifejezés jelentése a leírás szerinti értelemben a célgén jelenleg ismert mRNS átiratai, és bármilyen még azonosítandó további átirat. A leírás szerinti értelemben a „modulálás” kifejezés jelenthet vagy növelést (stimulálást) vagy csökkentést (gátlást) a gén expressziójában. A jelen találmányban a gátlás a modulálás elõnyös formája, amely egy elõnyös cél mRNSének és génexpressziójának a modulálása.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
A leírás szerinti értelemben a „célzás” kifejezés egy antiszensz vegyület esetén, egy olyan különös cél nukleinsav eszköz, amely antiszensz oligonukleotidot ad a sejtnek, állatnak vagy embernek oly módon, hogy az antiszensz vegyület képes a céljának a funkcióját modulálni vagy a célhoz kötni. A leírás szerinti értelemben a „hibridizáció” jelentése hidrogénkötés kialakítása, amely lehet Watson–Crick, Holstein, fordított Holstein, hidrogénkötés stb. a komplementer nukleozid vagy nukleotidbázisok között. Watson és Crick körülbelül 50 évvel ezelõtt bemutatta, hogy a dezoxiribonukleinsav (DNS) két szálból áll, amelyeket hidrogénkötések tartanak össze egy hélixszerû konfigurációban, amely kötések egymással szembelévõ komplementer nukleobázisok között alakulnak ki a két szál között. A négy, DNS-ben gyakran megtalálható nukleobázis a guanin (G), adenin (A), timin (T) és a citozin (C), amelyek közül a G nukleobázis a C¹vel párosodik és az A nukleobázis a T¹vel párosodik. Az RNS-ben a timin nukleobázist az uracil (U) helyettesíti, amely a T nukleobázissal hasonló módon az A¹val párosodik. A standard kettõs szál kialakításában részt vevõ kémiai kötések a nukleobázisokban adják a Watson–Crick-nézetet. Néhány évvel késõbb Hoogsteen bemutatta, hogy a purin nukleobázisok (G és A) a Watson–Crick-arculatukon kívül bírnak Hoggsteen-nézettel, amely a páron kívülrõl ismerhetõ fel, és pirimidin oligonukleotidokat szokott kötni hidrogénkötés révén, ezáltal háromszoros Helix-szerkezetet kialakítva. A jelen bejelentés szövegkörnyezetében a „komplementer” kifejezés két nukleotid vagy nukleozidszekvencia közötti pontos párosodás képességére utal. Például, ha egy oligonukleotid egy adott pozíciójában lévõ nukleotidnak képes hidrogénkötés kialakítására egy DNS- vagy RNS-molekula megfelelõ pozíciójában lévõ nukleotidjával, akkor az oligonukleotid és a DNS vagy RNS egymással komplementernek tekinthetõ az adott pozícióban. A DNS vagy RNS és az oligonukleotid egymással komplementernek tekinthetõ, ha az oligonukleotidban lévõ nukleotidgyök elégséges szálon hidrogénkötést tud kialakítani a cél DNS- vagy RNS-molekulában lévõ megfelelõ nukleotidokkal, hogy ezáltal stabil komplex alakuljon ki. Az in vitro vagy in vivo stabilitáshoz az antiszensz vegyület szekvenciájának nem szükséges 100%-ban komplementernek lennie a cél nukleinsavval. A „komplementer” és „specifikusan hidrolizálható” kifejezések tehát azt jelzik, hogy az antiszensz vegyület elég erõsen és speficikusan kötõdik a célmolekulához, ahhoz, hogy kívánt interferenciát váltson ki a cél normál mûködésével, miközben a nem cél molekulák mûködése nem változik. A találmány szerinti oligomer vegyületek a célmolekula hatásos modulátorai. Például a célmolekula in vitro gátlását mutatjuk be az 1. táblázatban, amelyet valós idejû PCR alkalmazásával mértünk. A 2. ábra a találmány szerinti oligomer vegyületek in vitro hatásosságát mutatja Northern-blot alkalmazásával mérve. Az oligomer vegyületek nagyon alacsony IC50-értékeit a 3. táblázatban mutatjuk be. Az összes fent említett kísérleti megfigyelés azt mutatja, hogy a találmány szerinti
1
HU 007 196 T2
vegyületek gyógyszerészeti készítmény hatóanyagát alkothatják. A találmány szerinti vegyület alszekvenciája jellemzõ módon a SEQ ID NO: 130 szekvencián belül helyezkedik el. A nukleotidok analógjai megfelelõ módon ezen szekvencián belüli nukleotidok. A találmány szerinti vegyület 12–25 nukleotidot, legmegfelelõbb módon 12–20 nukleotidot, mint például 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 vagy 20 nukleotidot tartalmaz. A találmány egy nagyon elõnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti vegyület 14–18 nukleotidot, mint például 14, 15, 16, 17 vagy 18 nukleotidot, elõnyösen 15–17 nukleotidot, mint például 15, 16 vagy 17 nukleotidot, jellemzõbben 15 nukleotidot, vagy 16 nukleotidot, vagy 17 nukleotidot tartalmaz. A találmány egy megfelelõ megvalósítási módja szerint a SEQ ID NO: 130 szekvencián belüli alszekvencia jellemzõ módon legalább 8 nukleotid vagy nukleotidanalóg hosszúságú, mint például legalább 9 nukleotid a szekvenciából vagy nukleotidanalógja a nukleotidnak az említett szekvenciából. Jellegzetesebben az alszekvencia legalább 12 nukleotidot vagy nukleotidanalógot tartalmaz az említett szekvenciából, min például 14 nukleotidot vagy nukleotidanalógot, így például 10, 11, 12, 13, 14, 15 vagy 16 nukleotidot vagy nukleotidanalógot. A nukleotidok jellemzõ módon egymáshoz egy kapcsolócsoporttal vannak kötve, amely foszfátcsoport, foszfortioátcsoport és borán-foszfát-csoport alkotta csoportból választott. Megfelelõ módon a nukleotidok közül néhány vagy mindegyik foszfátcsoporttal van egymáshoz kötve. Megfelelõ módon az összes nukleotid foszfátcsoporttal van egymáshoz kötve. Hasonló módon a találmány szerinti nukleotidok jellemzõ módon foszfátcsoport, foszfortioátcsoport és borán-foszfát-csoport alkotta csoportból választott kapcsolócsoporttal vannak egymáshoz kötve. A találmány szerinti elõnyös oligonukleotidvegyület a SEQ ID NO: 130 szerinti vegyület. A találmány egy további megvalósítási módja szerint az említett nukleotidok foszfortioátcsoporttal vannak egymáshoz kötve, mint például foszfortioátcsoporttal egymáshoz kötött nukleotidok. A találmánynak egy érdekes megvalósítási módja szerint a SEQ ID NO: 130 szerinti vegyületeken belül minden egyes kapcsolócsoport foszfortioátcsoport. Az ilyen módosításokat S alsóindexszel jelöltük. Alternatívan kifejezve a találmány egy szempontjának a tárgya a SEQ NO: 130A vegyület. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgya a SEQ NO: 130B vegyület. A találmány megvalósítási módjainak egy elõnyös csoportja a 130B képlet szerinti szekvenciát tartalmazó vegyület. A találmány tárgya egy további szempont szerint a SEQ NO 130C. A találmány tárgya egy további szempont szerint a SEQ NO 130D. A találmány tárgya egy további szempont szerint a SEQ NO 130E.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2
Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti vegyület 12–25 nukleotidot tartalmaz, ahol az említett vegyület legalább 8 nukleotid hosszúságú alszekvenciát tartalmaz, az említett alszekvencia a SEQ ID NO: 130 szekvencián belül helyezkedik el, ahol legalább egy nukleotid a megfelelõ nukleotidra van cserélve. Jellemzõ módon a találmány szerinti vegyület 1–25 nukleotidanalógot tartalmaz, mint például 2–25 nukleotidanalógot, 3–25 nukleotidanalógot, megfelelõ módon 4–25 nukleotidanalógot, 5–25 nukleotidanalógot, 6–25 nukleotidanalógot, jellemzõen 6–25 nukleotidanalógot, jellemzõbben 6–14 nukleotidanalógot, mint például 6–12 nukleotidanalógot, mint például 6, 7, 8, 9, 10, 11 vagy 12 nukleotidanalógot. A feltalálók azt találták, hogy a 6–16 nukleotidanalógot tartalmazó találmány szerinti vegyületek különbözõ ribóz egységekkel megfelelnek arra, hogy jobb affinitásuk legyen az egyéb nukleotidokhoz képest. Tehát a találmány tárgya egy érdekes szempont szerint egy 6–10, mint például 6, 7, 8, 9 vagy 10 nukleotidanalógot tartalmazó találmány szerinti vegyület, amelyeknek különbözõ ribóz egysége van, elõnyösen 7, 8 vagy 9 különbözõ ribózegységû nukleotidanalóg, legjellemzõbben 8 különbözõ ribózegységû nukleotidanalóg. Elõnyösen a különbözõ ribózegységû nukleotidanalóg az LNA. Jelen feltalálók azt találták továbbá, hogy a különbözõ ribózegységû nukleotidanalógok, és továbbá a módosított nukleozidok közötti kapcsolat tovább javította az antiszensz módosításokat a célokra. Tehát a 6–16 nukleotidanalógban lehetnek módosított ribóz egységek, különbözõ kapcsolócsoport vagy mindkettõ. Megfelelõ módon az összes nukleotid a megfelelõ nukleotidanalógra van cserélve. Egy elõnyös nukleotidanalóg a találmány szerint az LNA. A találmány szerinti további elõnyös nukleotidanalóg, ha az internukleozid foszfát kapcsolat foszfortioát. Egy még további elõnyös nukleotidanalóg, ahol a nukleotid LNA, és ahol a nukleozid közötti kapcsolat foszfortioát. Egy érdekes megvalósítási mód szerint a találmány szerinti vegyület 12–25 nukleotidot tartalmaz, ahol az említett vegyület legalább 8 nukleotid hosszúságú alszekvenciát tartalmaz, ahol az alszekvencia a SEQ ID NO: 130 szekvencián belül helyezkedik el, ahol legalább egy nukleotid a megfelelõ nukleotidanalógra van cserélve és ahol a 3’¹vég nukleotidot tartalmaz és nem nukleotidanalógot. Egy különösen érdekes megvalósítási mód szerint a vegyület legalább egy nukleotidanalógot tartalmaz, ahol az említett nukleotidanalóg zárt nukleinsav (locked nucleic acid, LNA), amely a következõ képlet szerinti:
55
ahol Z és Z* egymástól függetlenül hiányzik, internuk60 leozid kapcsolat, terminális csoport vagy védõcsoport 10
1
HU 007 196 T2
közül választott csoport; ahol X és Y jelentése egymástól függetlenül O, S, NR, CH2, CH, (ha kettõs kötés része), CH2–O, CH2–S, CH2–NR, CH2CH2, CH2–CH (ha kettõs kötés része) és CH=CH, ahol R jelentése hidrogénaton vagy C1–4-alkil-csoport alkotta csoportból választott csoport. A kötések kapcsolócsoport általi kapcsolatot képviselnek. Jellemzõ módon X jelentése O és Y jelentése O, S és NR, ahol R jelentése hidrogénatom vagy C1–4-alkil-csoport alkotta csoporttól függetlenül választott csoport. Jellemzõbb módon X jelentése O és Y jelentése O, S és NH alkotta csoportból választott csoport. Legjellemzõbben X jelentése O és Y jelentése O. Azokban a megvalósítási módokban, ahol az LNA nukleotidok közül legalább az egyik a 3’¹végen van, akkor az említett pozícióban Z jelentése terminális csoport és Z* jelentése nukleozidok közötti kapcsolat. Azokban a megvalósítási módokban, ahol az LNA nukleotidok közül legalább az egyik az 5’¹végen van, akkor az említett pozícióban Z nincs jelen és Z* jelentése terminális csoport. A nukleotidszekvencián belül Z hiányzik és Z* jelentése nukleozidok közötti kapcsolat. A találmány egy megfelelõ megvalósítási módja szerint, a találmány LNA¹t tartalmaz nukleotidanalógként, ahol az említett LNA a béta¹D vagy alfa¹L formában van, elõnyösen a béta¹D formában. A találmány nukleotidanalógként legalább egy LNA¹t tartalmazó megvalósítási módjaiban, mint például 1–25 LNA nukleotidanalógot, mint például 2–25 LNA nukleotidanalógot, mint például 3–25 LNA nukleotidanalógot, mint például 4–25 LNA nukleotidanalógot, mint például 5–25 LNA nukleotidanalógot, mint például 6–25 LNA nukleotidanalógot, jellemzõen 6–20 LNA nukleotidanalógot, jellemzõbben 6–14 LNA nukleotidanalógot, mint például 6–12 LNA nukleotidanalógot, így például 6, 7, 8, 9, 10, 11 vagy 12 LNA nukleotidanalógot, az említett nukleotidok és/vagy nukleotidanalógok egymáshoz a következõk közül választott kapcsolócsoporttal vannak kötve: foszfátcsoport, foszfortioátcsoport és borát-foszfát-csoport. A találmány LNA nukleotidanalógot tartalmazó megfelelõ megvalósítási módja szerint az említett nukleotidok és/vagy nukleotidanalógok foszfátcsoporttal vannak egymáshoz kötve. Az LNA nukleotidanalógokat tartalmazó találmány elõnyös megvalósítási módja szerint az említett nukleotidok és/vagy nukleotidanalógok egymáshoz foszfortioátcsoport alkalmazásával vannak kapcsolva. Egy érdekes megvalósítási mód kombinációja szerint az LNA nukleotidanalógot tartalmazó találmány szerinti megvalósítási módban az említett nukleotid és/vagy nukleotidanalógok foszfortioátcsoporton keresztül vannak egymáshoz kötve, ahol X jelentés O és Y jelentése O, és az említett LNA béta¹D alakban van. A találmány szerinti vegyület megvalósítási módjaiban, amely vegyület 12–25 nukleotidot tartalmaz, ahol az említett vegyület legalább 8 nukleotid hosszúságú alszekvenciát tartalmaz, ahol az alszekvencia a SEQ ID NO: 130 szekvencián belül helyezkedik el és az említett nukleotidok LNA nukleotidanalógokat tartalmaznak, az alszekvencia jellemzõ módon 2–6 LNA hosszúságú szakaszt tartalmazhat, az itt definiáltak szerint,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 11
2
amelyek 4–12 nukleotid hosszúságú szakasz követ, amelyet 2–6 LNA hosszúságú szakasz követ az itt definiáltak szerint. LNA-szakaszt tartalmazó alszekvenciák, amelyeket nukleotidok követnek, amelyeket LNA-szakasz követ, úgy is ismertek, mint gapmerek. Megfelelõ módon az említett alszekvenciák 4 LNA hosszúságú szakaszt tartalmaznak, az itt definiáltak szerint, amelyet 8 nukleotid hosszúságú szakasz követ, amelyet 4 itt definiáltak szerinti LNA-szakasz követ. A találmány szerinti 12–25 nukleotidot tartalmazó vegyület megvalósítási módjaiban, ahol az említett vegyület legalább 8 nukleotid hosszúságú alszekvenciát tartalmaz, ahol az említett alszekvenciák a SEQ ID NO: 130 szekvencián belül helyezkednek el, és az említett 12–25 nukleotid hosszúságú LNA nukleotidanalógot tartalmazó szekvencia, ahol az említett szekvencia tartalmazhat 2–6 itt definiált LNA hosszúságú szakaszt, amelyet 4–12 nukleotid hosszúságú szakasz követ, amelyet 2–5 itt definiált LNA hosszúságú szakasz követ, amelyet 1–4 nukleotid hosszúságú szakasz követ, mint például 1 vagy 2 nukleotid, jellemzõbb módon egyetlen nukleozid. Az 1–4 nukleotid, 1 vagy 2 nukleotid vagy egyetlen nukleotid jellemzõ módon a szekvencia 3’¹végén helyezkedik el, és jellemzõbb módon az oligomer 3’¹végén. A 12–25 nukleotidot tartalmazó találmány szerinti vegyület megvalósítási módjaiban, ahol az említett vegyület legalább 8 nukleotid hosszúságú alszekvenciát tartalmaz, ahol az említett alszekvencia a SEQ ID NO: 130 szekvencián belül helyezkedik el és az említett nukleotidok LNA nukleotidanalógokat tartalmaznak, az említett szekvencia jellemzõen tartalmazhat 4 itt definiált LNA hosszúságú szakaszt, amelyet 8 nukleotid hosszúságú szakasz követ, amelyet 3 itt definiált LNA hosszúságú szakasz követ, amelyet egyetlen természetes nukleotid követ. Az egyetlen nukleotid jellemzõ módon az alszekvencia 3’¹végén helyezkedik el és jellemzõbb módon az oligomer 3’¹végén. A 12–25 nukleotidot tartalmazó találmány szerinti vegyület megvalósítási módjaiban, ahol a vegyület legalább 8 nukleotid hosszúságú alszekvenciát tartalmaz, ahol az említett alszekvencia a SEQ ID NO: 130 szekvencián belül helyezkedik el, és az említett nukleotidok tartalmaznak LNA nukleotidanalógokat, az említett alszekvencia LNA-szakaszt tartalmaz, amelyet nukleotid szakasz követ, amelyet LNA-szakasz követ, amelyet itt úgy definiálunk, mint gapmerek, az említett nukleotidok és/vagy LNA¹k foszfátcsoport, foszfortioátcsoport és borán-foszfát-csoport alkotta csoportból választott kapcsolócsoporttal vannak egymáshoz kapcsolva. Megfelelõ módon az említett nukleotidok és/vagy említett LNA¹k foszfátcsoportokkal vannak egymáshoz kötve. Jellemzõ módon az említett nukleotid és/vagy említett LNA–foszfortioátcsoportokkal vannak egymáshoz kötve. Összesen 12–25 nukleotidot és/vagy nukleotidanalógot tartalmazó találmány szerinti vegyületek megvalósítási módjaiban az említett vegyület legalább 8 nuk-
1
HU 007 196 T2
leotid hosszúságú alszekvenciát tartalmaz, ahol az említett alszekvencia a SEQ ID NO: 130 szekvencián belül helyezkedik el és ahol az említett szekvencia 4 itt definiált LNA hosszúságú szakszból, 8 nukleotid hosszúságú szakaszból és 4 itt definiált LNA hosszúságú szakaszból áll, hogy összesen az említett alszekvenciában 16 nukleotid és nukleotidanalóg legyen, ahol az említett nukleotidok és LNA¹k foszfortioátcsoporttal vannak egymáshoz kötve. Egy megfelelõ megvalósítási mód szerint az alszekvencia a SEQ ID NO: 130a. Egy további megfelelõ megvalósítási mód szerint a találmány szerinti vegyület szekvenciája a SEQ ID NO: 130 szekvencia, és ahol a szekvencia 4 itt definiált LNA hosszúságú szakaszból, 8 nukleotid hosszúságú szakaszból és 4 itt definiált LNA hosszúságú szakaszból áll, hogy ezáltal az említett vegyület összesen 16 nukleotid vagy nukleotidanalóg hosszúságú legyen, az említett nukleotidok és említett LNA¹k foszforitoátcsoportokkal vannak egymáshoz kapcsolva. Egy megfelelõ megvalósítási mód szerint a vegyület a SEQ ID NO: 130a szekvenciából áll. A közvetlenül ezelõtt említett egyedi megfelelõ megvalósítási módban, ahol a vegyület a SEQ ID NO: 130a, ott a 3’ LNAvegyület megfelelõ módon le lehet cserélve a megfelelõ nukleotidra. Egy további szempont szerint a találmány tárgya az itt definiált vegyületet tartalmazó konjugátum, amely legalább egy nem nukleotid vagy nem polinukleotid részt tartalmaz az említett vegyülethez kovalensen kapcsolva. A találmány egy rokon szempontja szerint a találmány szerinti vegyület ligandokhoz van kapcsolva, hogy ezáltal az említett ligandumok konjugátumai alakuljanak ki, amelyeknek célja a konjugátumsejtek általi felvételének növelése az antiszensz oligonukleotidokhoz képest. Ez a konjugátum az 5’/3’¹OH terminális pozícióknál történik, de a ligandok lehetnek a cukrokon és/vagy a bázisokon is. Részletezve, a növekedési faktor, amelyekhez az antiszensz oligonukleotidok konjugálhatóak, tartalmazhat transzferrint vagy folátot. Transzferrin-polilizin-oligonukleotid komplexek vagy folát-polilizin-oligonukleotid komplexek elõállíthatóak a sejtek általi felvétel céljából nagy mennyiségû transzferrin vagy folátreceptor expresszálásával. A konjugátumok/ligandok további példái a koleszterinrészek, kettõs interkelátor vegyületek, mint például az akridin, poli-L-lizin, „végsapkázó” vegyületek egy vagy több nukleáz rezisztens kapcsolócsoporttal, mint például foszfor-monotioát és a hasonlók. A transzferrinkomplexek, mint oligonukleotidsejtekbe történõ felvételének hordozói, elõállítását ismertették Wagner és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410–3414, (1390). A folátreceptor endocitózis révén történõ folát-makromolekula konjugátumok sejtekbe juttatását, ideértve az antiszensz oligonukleotidok bejuttatását Low és munkatársai ismertették: U.S. Pátnt 5 108 921. Lásd még: Leamon és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5572 (1991). A találmány szerinti vegyületek konjugátumokkal lehetnek konjugálva vagy tovább konjugálva gyógy-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 12
2
szer-hatóanyagokhoz, például aszpirin, ibuprofen, szulfadrog, antidiabetikum, antibakteriális ágens, kemoterápiás ágens vagy antibiotikum. A találmánynak, egy különösen érdekes szempont szerint, a tárgya gyógyászati készítmény, amely az itt definiált vegyületet vagy az itt definiált konjugátumot és gyógyászatilag elfogadható diluenst, hordozót vagy adjuvánst tartalmaz. Meg kell érteni azt, hogy a jelen találmány különösen releváns gyógyászati készítmények esetén is, amelyek legalább egy antiszensz oligonukleotidot tartalmaznak a találmány szerint hatóanyagként. Meg kell érteni azt, hogy a találmány szerinti gyógyászati készítmények adott esetben tartalmaznak gyógyszerészeti hordozót, és hogy a gyógyászati készítmény adott esetben tartalmaz további antiszensz vegyületeket, kemoterápiás ágenseket, gyulladáscsökkentõ vegyületeket, antivirális vegyületeket és/vagy immunmoduláló vegyületeket. Amint kifejtettük, a találmány szerinti gyógyászati készítmény tartalmazhat továbbá legalább egy kemoterápiás ágenst is. A kemoterápiás ágens jellemzõ módon a következõk által alkotott csoportból választott: adrenokortikoszteroidok, mint például prednizon, dexametazon vagy dekadron; altretamin [hexalen, hexametil-melamin (HMM)]; amifostin (etiol); aminoglutetimid (citadren); amsacrin (M¹AMSA); anastrozol (arimidex); androgének, mint például tesztoszteron; aszparagináz (elspar); bacillus calmette-gurin; bicalutamid (casodex); bleomicin (blenoxán); buszulfan (mileran); karboplatin (paraplatin); carmustin (BCNU, BICNU); klorambucil (leukeran); klór-deoxiadenozin (2¹CDA, cladribin, leustatin); ciszplatin (platinol); citozin-arabinozid (citarabin); decarbazin (DTIC); dactinomicin (actinomicin¹D, cosmegen); daunorubicin (cerubidin); docetaxel (taxoter); doxorubicin (adriomicin); epirubicin; estramustin (emcyt); ösztrogének, mint például dietilstilbestrol (DES); etopozid (VP–16, VePesid, etopophos); fiudarabin (fludara); flutamid (eulexin); 5¹FUDR (floxuridin); 5¹fluor-uracil (5¹FU); gemcitabin (gemzar); goserelin (zodalex); herceptin (trastuzumab); hidroxi-karbamid (hidrea); idarubicin (idamicin); ifoszfamid; IL–2 (prolukin, aldesleukin); alfa interferon (A intron, A roferon); irinotecan (camptosar); leuprolid (lupron); levamizol (ergamizol); lomustin (CCNU); mekloratamin (mustargen, nitrogénmustár); melphalan (alkeran); merkapto-purin (purintol, 6¹MP); metotrexát (mexát); mitomicin¹C (mutamucin); mitoxantron (novantron); oktreotid (sandostatin); pentostatin (2¹deoxikoformicin, nipent); plicamicin (mitramicin, mitracin); prorokarbazin (matulán); streptozocin; tamoxifin (nolvadex); taxol (paclitaxel); tenipozid (vumon, VM–26); tiotepa; topotecan (hicamtin); tretinoin (vesanoid, teljesen transz retinoidsav); vinblasztin (valban); vinkrisztin (oncovin) és vinorelbin (navelbin). A találmányban lévõ oligomer vegyület vagy konjugátum alkalmazható számos gyógyászatilag elfogadható só alapban. A leírás szerinti értelemben a kifejezés olyan sókra utal, amelyek megtartják az itt azonosított vegyületek kívánt biológiai aktivitását és minimális nemkívánatos toxikológiai hatást mutatnak. Az ilyen sók nem korlátozó példái elõállíthatók szerves amino-
1
HU 007 196 T2
sav- és bázisaddíciós sókkal, amelyek fémkationokkal lettek kialakítva, mint például cink, kalcium, bizmut, bárium, magnézium, alumínum, réz, kobalt, nikkel, kadmium, nátrium, kálium és a hasonlóak, vagy kationnal, amely ammóniából, N,N-dibenzil-etilén-diaminból, D¹glkózaminból, tetraetil-ammóniumból vagy etiléndiaminból lett kialakítva; vagy (c), (a) és (b) kombinációi; például cink-tannát¹só és a hasonlóak. A találmány egy megvalósítási módja szerint az oligomer vegyület vagy konjugátum lehet prodrog alakban. Az oligonukleotidok negatívan töltött ionok. A sejtmembránok lipofil természete következtében az oligonukleotidok sejtek általi felvétele le van csökkenve semleges vagy lipofil ekvivalensekre. Ez a polaritási „hátrány” elkerülhetõ a prodrog megközelítés alkalmazásával [lásd például Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research és Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103–140]. Ezen megközelítés szerint az oligonukleotidok védett formában vannak elõállítva, hogy ezáltal az oligo semleges legyen a beadáskor. Ezek a védõcsoportok úgy vannak megtervezve, hogy eltávolíthatóak akkor, amikor a sejtek az oligot felveszik. Az ilyen védõcsoportok példái az S¹acetil-tioetil (SATE) vagy S¹pivaloil-tioetil (t¹butil-SATE) csoportok. Ezek a védõcsoportok nukleáz rezisztensek és szelektíven vannk eltávolítva a sejten belül. A találmány tartalmazza az itt ismertetett egy vagy több oligonukleotid vegyület vagy konjugátum kiszerelését is. Gyógyászatilag elfogadható kötõanyagok és adjuvánsok alkothatják a kiszerelt gyógyszer részét. A kapszulák, tabletták és pirulák stb. tartalmazhatják például a következõ vegyületeket: mikrokristályos cellulóz, gumi vagy zselatin, mint kötõanyag; keményítõ vagy laktóz, mint excipiens; sztearátok, mint lubrikánsok; különbözõ édesítõ- vagy ízesítõszerek. A kapszulák esetén az adagolási egység tartalmazhat folyékony hordozót, mint például zsírsavakat. Hasonló módon cukor vagy enterikus ágensek lehetnek részei az adagolási egységnek, mint bevonatok. Az oligonukleotid kiszerelések lehetnek emulziói a gyógyászati hatóanyagoknak és micellás emulziót kialakító lipid is. Egy találmány szerinti oligonukleotid elkeverhetõ bármilyen anyaggal, amely nem károsítja a kívánt hatást, vagy olyan anyaggal, amely kívánt hatást visz a kiszerelésbe. Ezek közé tartozhatnak egyéb nukleotidvegyületeket tartalmazó gyógyszerek. A parenterális, szubkután, intradermális vagy topikális beadásra a készítmény tartalmazhat steril diluenst, puffereket, tonikusságot és antibakterialitást szabályozóanyagokat. Az aktív vegyület elõállítható hordozókkal, amelyek lebomlás ellen védenek vagy a testbõl történõ azonnali eltávolítás ellen, ideértve az implantált mikrokapszulákat, amelyeknek szabályozott kibocsátású tulajdonságaik vannak. Az intravénás beadásra az elõnyös hordozók a fiziológiai sóoldat vagy a foszfáttal pufferezett sóoldat. Elõnyösen egy oligomer vegyület egy egység kiszerelésben van, mint például gyógyszerészetileg elfogadható hordozóban vagy diluensben olyan mennyiségben, amely elégséges a páciens számára terápiásan hatásos mennyiség bejutta-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 13
2
tására anélkül, hogy a kezelt páciensben súlyos mellékhatásokat váltana ki. A találmány szerinti gyógyászati készítmények számos módon adhatók be, attól függõen, hogy lokális vagy szisztémás kezelés az elõnyös és a kezelni kívánt területtõl függõen. A beadás lehet (a) orális, (b) pulmonáris, például porok vagy aeroszolok inhalációja vagy belégzése, ideértve a nebulizátor általi bevitelt; intratracheális, intranazális, (c) topikális, ideértve az epidermálist, transzdermálist, optalmikus és nyálkahártyákra történõ, ideértve a vaginális és rektális bejuttatást; vagy (d) parenterális, ideértve az intravénás, intraarteriális, szubkután, intraperitoneális vagy intramuszkuláris injekciót vagy infúziót; vagy intrakraniális, például intratekális vagy intraventrikuláris beadást. Egy megvalósítási mód szerint az aktív oligo IV módon, IP módon, orálisan, topikálisan vagy bolusinjekcióként van beadva, vagy közvetlenül a cél szervbe van beadva. A topikális beadásra szolgáló gyógyászati készítmények és kiszerelések tartalmazhatják a következõket: transzdermális tapaszok, kenõcsök, lotionok, krémek, zselék, cseppek, sprayk, kúpok, folyadékok és porok. Hagyományos gyógyszerészeti hordozók, vizes, por vagy olajos bázisok, sûrítõanyagok és hasonlóak lehetnek szükségesek vagy kívánatosak. Bevont kondomok, kesztyûk és a hasonlóak szintén hasznosak lehetnek. Az elõnyös topikális kiszerelések közé tartoznak azok, amelyekben a találmány szerinti oligonukleotidok elkeverve vannak topikálisan bejuttató ágenssel, mint például lipidek, liposzómák, zsírsavak, zsírsav-észterek, szteroidok, kelátképzõ vegyületek és felületaktív anyagok. Az orális beadásra szolgáló készítmények és kiszerelések nem korlátozó módon tartalmazzák a porokat vagy granulátumokat, mikrorészecskéket, nanorészecskéket, vízbeni vagy nemvizes közegbeni szuszpenziókat vagy oldatokat, kapszulákat, gél kapszulákat, tasakokat, tablettákat vagy minitablettákat. A parenterális, intratekális vagy intraventrikuláris beadásra szolgáló készítmények és kiszerelések tartalmazhatnak steril vizes oldatokat, amelyek tartalmazhatnak puffereket, diluenseket és egyéb megfelelõ adalék anyagokat, de nem korlátozó módon bejuttató, elõsegítõ anyagokat, hordozóvegyületeket és egyéb gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot vagy excipienst is tartalmazhatnak. A találmány szerinti gyógyászati készítmények nem korlátozó módon tartalmazhatnak oldatokat, emulziókat és liposzómatartalmú kiszereléseket. Ezek a vegyületek elõállíthatóak számos vegyületbõl, amelyek közé nem korlátozó módon tartoznak az elõre kialakított folyadékok, az önmagukban emulgeáló szilárd anyagok és a tárolás során emulgeáló félig szilárd anyagok. A gyógyszer bejuttatása a tumorszövetbe javítható hordozó közvetített bejuttatással, ideértve nem korlátozó módon a kationos liposzómákat, ciklodextrineket; porfirin származékokat, elágazó láncú dendrimereket, polietilén-imin-polimereket, nanorészecskéket és mikrogömböket [Dass C. R., J. Farm., Farmacol., 2002; 54(1):3–27]. A találmány szerinti gyógyszerészeti kiszerelések, amelyek hagyományosan lehetnek egységdózis alak-
1
HU 007 196 T2
ban, elõállíthatóak hagyományos technikák szerint, amelyek jól ismertek a gyógyszeriparban. Az ilyen technikák tartalmazzák a hatóanyag és a gyógyszerészeti hordozó(k) vagy excipiens(ek) kapcsolatba hozását. Általánosan a kiszerelések oly módon vannak elõállítva, hogy a hatóanyagokat egyenletesen és bensõségesen kapcsolatba hozzuk folyadék hordozókkal vagy finoman eloszlatott szilárd hordozókkal vagy mindkettõvel és ezután szükség szerint a terméket alakkal látjuk el. A találmány szerinti készítmények számos lehetséges dózisalak bármelyikében kiszerelhetõek, mint például nem korlátozó módon tablettákká, kapszulákká, gélkapszulákká, folyékony szirupokká, lágy gélekké és kúpokká. A találmány szerinti készítmények kiszerelhetõek vizes, nemvizes vagy kevert közegû szuszpenzióknak is. A vizes szuszpenziók tartalmazhatnak továbbá olyan anyagokat, amelyek a szuszpenzió viszkozitását növelik, ideértve például a nátrium-karboxi-metilcellulózt, szorbitot és/vagy dextránt. A szuszpenzió tartalmazhat stabilizátorokat is. Az LNA-tartalmú oligomer vegyületek számos terápiás alkalmazásban alkalmazhatóak, ahogy azt fent jeleztük. Általánosan a találmány szerinti terápiás eljárások tartalmazzák egy LNA-módosított oligonukleotid terápiásan hatásos mennyiségének beadását emlõsnek, különösen embernek. Bizonyos megvalósítási módokban a találmány tárgya gyógyászati készítmény, amely tartalmaz (a) egy vagy több antiszensz vegyületet és (b) egy vagy több kemoterápiás ágenst, amelyek nem antiszensz módon mûködnek. Ha a találmány szerinti vegyületekkel van alkalmazva, akkor az ilyen kemoterápiás ágensek alkalmazhatóak egyedileg (például nitromicin és oligonukleotid), szekvenciálisan (például nitromicin és oligonukleotid egy adott ideig, amelyet további ágens és oligonukleotid követ), vagy egy vagy több ilyen kemoterápiás ágenssel kombinációban, vagy sugárterápiával kombinációban. A szakember számára ismert összes kemoterápiás ágens a kitanítás részét képezi, mint kombinációs kezelés a találmány szerinti vegyülettel. Gyulladásgátló gyógyszerek, ideértve nem korlátozó módon a nem szteroid gyulladásgátló gyógyszereket és kortikoszteroidokat, antivirális gyógyszereket és immunmoduláló gyógyszereket, szintén kombinálhatóak a találmány szerinti készítményekben. Két vagy több kombinált vegyület alkalmazható együtt vagy szekvenciálisan is. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak egy vagy több antiszensz vegyületet, különösen oligonukleotidot, amely egy elsõ nukleinsavat céloz és egy vagy több további antiszensz vegyületet, amely egy második nukleinsavat céloz. Kettõ vagy több kombinált vegyület alkalmazható együttesen vagy szekvenciálisan. Az adagolás a kezelni kívánt betegség súlyosságától és kezelésre adott válaszától függ, és a kezelés tarthat néhány naptól akár néhány hónapig is, vagy amíg gyógyulás nem történik, vagy a beteg állapot lecsökkenését nem érjük el. Az optimális adagolási meneterendek kiszámolhatóak a páciens testében történõ gyógyszer akkumulálás méréseibõl.
5
10
15
20
25
2
Az optimális dózisok függhetnek az egyedi oligonukleotidok relatív hatásosságától. Általánosan megbecsülhetõ az in vitro és in vivo állatmodellekben hatásosnak talált EC50-értékeken alapulva. Általánosan a dózis 0,01 mg–1 g testtömegkilogrammonként, és adható naponta, hetente, havonta vagy évente egyszer vagy többször, vagy akár minden 2–10 évben egyszer vagy folytonos infúzióval néhány órától több hónapig terjedõ idõszakban. Az adagolás ismétlési sebességei megbecsülhetõk a mért tartózkodási idõbõl és a gyógyszer testfolyadékbeli vagy szövetekbeli koncentrációiból. A sikeres kezelést követõen elõnyös lehet, ha a páciens fenntartó terápián megy át, annak érdekében, hogy a beteg állapotba történõ visszaesést meggátoljuk. Amint azt kifejtettük, a találmány egy érdekes megvalósítási módja, ha az oligomer vegyületek legalább egy egység LNA (zárt nukleinsav, Locked Nucleic Acid) névvel ellátott kémiát tartalmaznak. Az LNA-monomer jellemzõen biciklusos nukleotidanalógot jelöl, ahol a nukleozidrész egy olyan analóg, mint amilyen a WO 99/14226 nemzetközi szabadalmi bejelentésben és az ezt követõ, WO0056746, WO0056748, WO0066604, WO00125248, WO0228875, WO2002094250 és WO3006475 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésekben lett ismertetve. Az elõnyös LNA nukleotid struktúrák a találmány szerinti vegyület kialakítására a következõ 2. vázlattal jellemezhetõek:
30
2. vázlat 35
40
45
50
55
60 14
ahol X és Y jelentése egymástól függetlenül –O–, –S–, –N(H)–, N(R)–, –CH2– vagy –CH– (ha kettõs kötés része), –CH2–O–, –CH2–S–, –CH2–N(H)–, –CH2¹N(R)–, –CH2–CH2– vagy –CH2–CH– (ha kettõs kötés része), –CH=CH– ahol R jelentése hidrogénatom és C1–4-alkil közül választott csoport; ahol Z és Z* egymástól függetlenül hiányzik, nukleozidok közötti kötés, terminális csoport vagy védõcsoport közül választott csoport. Azokban a megvalósítási módokban, ahol legalább egy LNA nukleotid van a 3’¹végen, ott az említett pozícióban Z egy terminális csoport és Z* jelentése nukleozidok közötti kapcsolat. Azokban a megvalósítási módokban, ahol legalább egy LNA nukleotid az 5’¹végen van, az említett pozícióban Z nincs jelen és Z* jelentése terminális csoport. A nukleotidszekvencián belül Z hiányzik és Z* jelentése nukleozidok közötti kapcsolat. Az aszimmetrikus csoportok megtalálhatóak bármelyik irányultságban. A 2. vázlaton bemutattuk a 4 kiralitáscentrumot rögzített konfigurációban. Azonban a 2. vázlat konfigurációi nem szükség szerint rögzítettek. A találmány részét képezik továbbá a 2. vázlat szerinti vegyületek, amelyekben a kiralitáscentrumok különbözõ konfigurációjúak, mint például azok, amelyeket a 3. vagy 4. vázlaton mutattunk be. Tehát a 2. vázlat célja az illusztráció és nem a kiralitási centrum konfiguráció-
1
HU 007 196 T2
jának korlátozása. A 2. vázlat minden egyes kiralitáscentruma létezhet R¹ vagy S¹konfigurációban. Az R (rectus) és S (sinister) definíciói az 1974¹es IUPAC ajánlásokban voltak ismertetve [Pure Appl. Chem. 45, 13–30, (1976) és „Nomenclature of organic Chemistry” pergamon, New York, 1979]. A Z és Z* nukleozidok közötti kapcsolat kialakítását szolgálják, terminális csoportok vagy védõcsoportok, az LNA-molekulán belüli pozíciójától függõen, nevezetesen az alszekvencián vagy a vegyület szekvenciájának 3’¹végén. A nukleozidok közötti kapcsolat lehet –O–P(O)2–O–, –O–P(O,S)–O–, –O–P(S)2–O–, –S–P(O)2–O–, –S–P(O,S)–O–, –S–P(S)2–O–, –O–P(O)2–S–, –O–P(O,S)–S–, –S–P(O)2–S–, –O–PO(RH)–O–, O–PO(OCH3)–O–, –O–PO(NRH)–O–, –O–PO(OCH2CH2S–RH)–O–, –O–PO(BH3)–O–, –O–PO(NHRH)–O–; –O–P(O)2–NRH–, –NRH–P(O)2–O–, –NRH–CO–O–, –NRH–CO–NRH¹, –O–CO–O–, –O–CO–NRH–, –NRH–CO–CH2–, –O–CH2–CO–NRH–, –O–CH2–CH2–NRH–, –CO–NRH–CH2–, –CH2–NRH–CO–, –O–CH2–CH2–S–, –S–CH2–CH2–O–, –S–CH2–CH2–S–, –CH2–SO2–CH2–, –CH2–CO–NRH–, –O–CH2–CH2–NRH–CO–, –CH2–NCH3–O–CH2–, ahol RH hidrogénatom és C1–4-alkil-csoport közül választott. A terminális csoportok egymástól függetlenül a következõk közül választottak: hidrogénatom, azido, halogén, ciano, nitro, hidroxi, Prot¹O–, Act¹O–, merkapto, Prot¹S–, Act¹S–, C1–6-alkil-tio, amino, Prot-N(RH)–, ActN(RH)–, mono- vagy di(C1–6-alkil)-amino, adott esetben szubsztituált C1–6-alkoxi, adott esetben szubsztituált C1–6-alkil, adott esetben szubsztituált C2–6-alkenil, adott esetben szubsztituált C2–6-alkenil-oxi, adott esetben szubsztituált C2–6-alkinil, adott esetben szubsztituált C2–6-alkinil-oxi, monofoszfát, monotiofoszfát, difoszfát, ditiofoszfát, trifoszfát, tritiofoszfát, DNS-interkelátor, fotokémiailag aktív csoport, termokémiailag aktív csoport, kelátképzõ csoport, riportercsoport, ligandok, karboxi¹, szulfon¹, hidroxi-metil¹, Prot-O–CH2–, Act-O–CH2–, amino-metil¹, Prot-N(R H )–CH 2 –, Act-N(R H )–CH 2 –, karboxi-metil¹, szulfono-metil-csoportok, ahol Prot jelentése védõcsoport az –OH, –SH, és –NH(RH) csoportra, rendre, Act jelentése aktiváló csoport az –OH, –SH, és –NH(RH) csoportra, rendre, és RH hidrogénatom és C1–6-alkil-csoport közül választott. A hidroxiszubsztituensek védõcsoportjai közé tartoznak a következõk: szubsztituált tritil, mint például 4,4’-dimetoxi-tritil-oxi (DMT), 4¹monometoxi-tritil-oxi (MMT), és tritil-oxi, adott esetben szubsztituált 9¹(9¹fenil)-xanténepoxi (pixil), adott esetben szubsztituált metoxi-tetrahidropiranil-oxi (mtp), szilil-oxi mint például trimetil-szilil-oxi (TMS), triizopropil-szilil-oxi (TIPS), terc-butil-dimetil-szilil-oxi (TBDMS), trietil-szilil-oxi, és fenil-dimetil-szilil-oxi, terc-butil-éterek, acetálok (beleértve két hidroxicsoportot), acil-oxi, mint például acetilvagy halogénszubsztituált acetilek, például klór-acetiloxi vagy fluor-acetil-oxi, izobutiril-oxi, pivaloil-oxi, ben-
5
10
15
20
25
30
35
40
2
zoil-oxi és szubsztituált benzoilok, metoxi-metil-oxi (MOM), benzil-éterek vagy szubsztituált benzil-éterek, mint például 2,6-diklór-benzil-oxi (2,6-Cl2Bzl). Alternatív esetben, a Z vagy Z* jelentése hidroxilcsoport, akkor védve lehetnek szilárd hordozóhoz történõ kapcsolással, adott esetben egy kapcsolómolekulán keresztül. Ha Z vagy Z* jelentése aminocsoport, akkor az aminocsoportot védõ csoportok jellemzõ példái: fluorenilmetoxi-karbonil (Fmoc), terc-butil-oxi-karbonil-amino (BOC), trifluor-acetil-amino, allil-oxi-karbonil-amino (alloc, AOC), Z benzil-oxi-karbonil-amino (Cbz), szubsztituált benzil-oxi-karbonil-amino, mint például 2¹klór-benzil-oxi-karbonil-amino (2¹C1Z), monometoxi-tritil-amino (MMT), dimetoxi-tritil-amino (DMT), ftaloil-amino, és 9¹(9¹fenil)-xantenil-amino (pixil). A fenti megvalósítási módban az Act aktiválócsoportot jelöl az –OH, –SH és –NH(RH) csoportokra, rendre. Az ilyen aktiválócsoportok például a következõk közül választottak: adott esetben szubsztituált O¹foszforamidit, adott esetben szubsztituált O¹foszfortriészter, adott esetben szubsztituált O¹foszfor-diészter, adott esetben szubsztituált H¹foszfonát, és adott esetben szubsztituált O¹foszfonát. A jelen szövegkörnyezetben a „foszforamidit” kifejezés jelentése –P(OR*)–N(Ry)2 képlet szerinti csoport, ahol Rx adott esetben szubsztituált alkilcsoportot, például metil¹, 2¹ciano-etil- vagy benzilcsoportot jelöl; és az R y mindegyike adott esetben szubsztituált alkilcsoportot, például etil vagy izopropilcsoportot jelöl, vagy az –N(Ry)2 csoport [–N(CH2CH2)2O] morfolincsoportot alkot. Rx elõnyösen 2¹ciano-etilt jelöl és a két Ry elõnyösen azonos és izopropilcsoportot jelölnek. Tehát egy különösen releváns foszforamidit az N,N-diizopropil-O¹(2¹ciano-etil)-foszforamidit. A B semleges vagy nem semleges nukleobázist jelöl és a következõk közül választott: adenin, citozin, 5¹metil-citozin, izocitozin, pszeudoizocitozin, guanin, timin, uracil, 5¹bróm-uracil, 5¹propinil-uracil, 5¹propinil-6-fluorol-uracil, 5¹metil-tiazol-uracil, 6¹amino-purin, 2¹aminopurin, inozin, 2,6-diamino-purin, 7¹propin-7-deaza-adenin, 7¹propin-7-deaza-guanin, 2¹klór-6-amino-purin. Különösen elõnyös biciklusos szerkezeteket mutatunk be az alábbi 3. vázlaton:
45
3. vázlat 50 ahol Y jelentése –O–, –S–, –NH–, vagy N(RH), Z és Z* egymástól függetlenül nincs jelen, egymástól függetlenül nukleozidok közötti kapcsolat, terminális csoport vagy védõcsoport közül választott csoport. 55 Azokban a megvalósítási módokban, ahol az LNA nukleotidok közül legalább egy a 3’¹végen van, ott az említett Z pozíció jelentése terminális csoport és Z* jelentése nukleozidok közötti kapcsolat. Azokban a megvalósítási módokban, ahol az LNA 60 nukleotidok közül legalább egy az 5’¹végen van, ott az 15
1
HU 007 196 T2
említett Z pozíció nincs jelen és Z* jelentése terminális csoport. A nukleotidszekvencián belül Z nincs jelen és Z* jelentése nukleozidok közötti kapcsolat. A nukleotidok közötti kapcsolat lehet: –O–P(O)2–O–, –O–P(O,S)–O–, –O–P(S)2–O–, –S–O(O)2–O–, –S–P(O,S)–O–, –S–P(S)2–O–, –O–P(O)–S–, –O–P(O,S)–S–, –S–P(O)2–S–, –O–PO(RH)–O–, O–PO(OCH3)–O–, –O–PO(NRH)–O–, –O–PO(OCH2CH2S–R)–O–, –O–PO(BH3)–O–, –O–PO(NHRH)–O–, –O–P(O)2–NRH–, –NRH–P(O)2–O–, ¹NRH–CO–O–, ahol RH hidrogénatom és C1–4-alkil-csoport közül választott. A terminális csoportok egymástól függetlenül hidrogén, azido, halogén, ciano, nitro, hidroxi, Prot¹O–, Act¹O–, merkapto, Prot¹S–, Act¹S–, C1–6-alkil-tio, amino, Prot-N(RH)–, Act-N(RH)–, mono- vagy di(C1–6-alkil)-amino, adott esetben szubsztituált C1–6-alkoxi, adott esetben szubsztituált C1–6-alkil, adott esetben szubsztituált monofoszfát, monotiofoszfát, difoszfát, ditiofoszfát, trifoszfát, tritiofoszfát, ahol Prot jelentése védõcsoport rendre az –OH, –SH, és –NH(RH) csoportokra, Act jelentése egy aktiválócsoport rendre az –OH, –SH és –NH(RH) csoportokra, és RH jelentése hidrogénatom és C1–6-alkil-csoport közül választott csoport, közül van kiválasztva. A hidroxiszubsztituensek védõcsoportjai közé tartoznak a következõk: szubsztituált tritil, mint például 4,4’-dimetoxi-tritil-oxi (DMT), 4¹monometoxi-tritil-oxi (MMT), adott esetben szubsztituált 9¹(9¹fenil)-xanteniloxi (pixil), adott esetben szubsztituált metoxi-tetrahidropiranil-oxi (mtp), szilil-oxi mint például trimetil-szililoxi (TMS), triizopropil-szilil-oxi (TIPS), terc-butil-dimetilszilil-oxi (TBDMS), trietil-szilil-oxi, és fenil-dimetil-szililoxi, terc-butil-éterek, acetálok (beleértve két hidroxicsoportot), acil-oxi, mint például acetilcsoport. Alternatív esetben, ha Z vagy Z* jelentése hidroxilcsoport, akkor védve lehetnek szilárd hordozóhoz történõ kapcsolással, adott esetben egy kapcsolómolekulán keresztül. A specifikusan elõnyös LNA-egységeket a 4. vázlaton mutatjuk be.
5
10
15
20
25
30
35
40
45 Béta-D-oxi-LNA
Alfa-L-oxi-LNA
50
Béta-D-tio-LNA
Béta-D-ENA-LNA 55
Béta-D-amino-LNA 4. vázlat
60 16
2
Ha Z vagy Z* jelentése aminocsoport, akkor az aminocsoportot védõ csoportok jellemzõ példái a következõk: fluorenil-metoxi-karbonil-amino (Fmoc), terc-butiloxi-karbonil-amino (BOC), trifluor-acetil-amino, allil-oxikarbonil-amino (alloc, AOC), monometoxi-tritil-amino (MMT), dimetoxi-tritil-amino (DMT), ftaloil-amino-csoport. A fenti megvalósítási módokban az Act jelentése –OH, –SH és –NH(RH) aktiválócsoportja, rendre. Ilyen aktiválócsoportok például a következõk közül választottak: adott esetben szubsztituált O¹foszforamidit, adott esetben szubsztituált O¹foszfor-triészter, adott esetben szubsztituált O¹foszfor-diészter, adott esetben szubsztituált H¹foszfonát és adott esetben szubsztituált O¹foszfonát. A jelen szövegkörnyezetben a „foszforamidit” kifejezés jelentése –P(ORx)–N(Ry)2 képlet szerinti csoport, ahol R x jelentése adott esetben szubsztituált alkilcsoport, például metilcsoport, 2¹ciano-etil-csoport, és az R y mindegyike adott esetben szubsztituált alkilcsoportot jelent, Rx elõnyösen 2¹ciano-etil-csoportot jelöl és a két Ry elõnyösen azonosak és izopropilcsoportot jelölnek. Tehát egy különösen releváns foszforamidit az N,N-diizopropil-O¹(2¹ciano-etil)-foszforamidit. B jelentése a 3. és 4. vázlaton egy természetes vagy természetben nem elõforduló nukleobázis és a következõk közül választott: adenin, citozin, 5¹metilcitozin, izocitozin, pszeudoizocitozin, guanin, timin, uracil, 5¹bróm-uracil, 5¹propinil-uracil, 6¹amino-purin, 2¹amino-purin, inozin, diamino-purin, 2¹klór-6-aminopurin. Szakember értékeli azt, hogy az LNA-tartalmú oligomer vegyületek alkalmazhatóak survivinhoz kapcsolt betegségek leküzdésére számos különbözõ elv mentén, amelyek a jelen találmány szellemének részét képezik. Például LNA oligomer vegyületek lehetnek olyan antiszensz inhibitorok, amelyek egyszálú nukleinsavak, amelyek meggátolják betegséget okozó fehérje termelését, az mRNS szinten történõ beavatkozás révén. Továbbá, lehetnek ribozimek vagy oligzimek, amelyek olyan antiszensz oligonukleotidok, amelyek amellett, hogy célba veszik a kötõdomén(eke)t, tartalmaznak katalitikus aktivitást, amely lebontja a cél mRNS¹t (ribozimek) vagy tartalmaznak egy külsõ irányítószekvenciát (external guide sequence, EGS), amely endogén enzimet (RNáz P) toboroz, amely lebontja a cél mRNS¹t (oligozimek). Az LNA oligomer vegyületek hasonlóan jól tervezhetõk, mint siRNS-vegyület, amelyek kis kettõs szálú RNS-molekulák, amelyeket a sejtek arra használnak, hogy specifikus endogén vagy exogén géneket csendesítsenek el egy egyelõre gyengén megértett „antiszensz-szerû” mechanizmus révén. Az LNA oligomer vegyületek megtervezhetõek, mint aptamerek (és ezeknek változataként, amelyeket spiegelmereknek nevezünk), amelyek olyan nukleinsavak, amelyek molekulák között hidrogénkötések révén háromdimenziós szerkezeteket vesznek fel, amelyek lehetõvé teszik számukra, hogy a biológiai célpontjukat
1
HU 007 196 T2
megkössék és gátolják, nagy affinitással és specifikussággal. Továbbá, az LNA oligomer vegyületek megtervezhetõek, mint csalik, amelyek kicsiny kettõs szálú nukleinsavak, amelyek meggátolják a sejten belüli transzkripciós faktorokat, hogy a DNS kötõhelyük szelektív blokkolása révén transzaktiválják a célgénjeiket. Továbbá az LNA oligomer vegyületek megtervezhetõek, mint kiméraplasztok, amelyek kicsi, egyszálú nukleinsavak, amelyek képesek specifikusan párosodni és módosítani egy célgénszekvenciát. Az LNA-tartalmú oligomer vegyületek, amelyek ezt az elvet használják ki, tehát különösen alkalmasak lehetnek survivinhoz kapcsolódó betegségek kezelésére, amelyeket a survivin génben történt mutáció okoz. Egyrészt az oligonukleotidok szándékolt mûködési módjának terápiás elvei alapján a találmány szerinti LNA oligomer vegyületek elõnyösen körülbelül 8–körülbelül 60 nukleobázist tartalmaznak, azaz körülbelül 8–körülbelül 60 összekapcsolt nukleotidot. Különösen elõnyös vegyületek az olyan antiszensz oligonukleotidok, amelyek körülbelül 12–körülbelül 30 nukleobázist tartalmaznak és legelõnyösebbek az olyan antiszensz vegyületek, amelyek körülbelül 12–körülbelül 20 nukleobázist tartalmaznak. Az 1. és 2. táblázatban bemutatott vegyületek mindegyike 16¹mer. A fenti elvekre hivatkozva, melyek szerint egy LNA oligomer vegyület a találmány szerinti célmolekulán terápiás hatást vált ki, lehet a survivin gén, az mRNS vagy a fehérje. A legelõnyösebb megvalósítási mód szerint az LNA oligomer vegyület úgy van megtervezve, hogy antiszensz inhibitor legyen, amely a survivin pre-mRNS vagy survivin mRNS ellen irányuljon. Az oligonukleotidok hibridizálhatnak bármely helyhez a survivin pre-mRNS¹en belül vagy mRNS¹en belül, mint amilyen helyek például az 5’¹transzlációban részt nem vevõ vezetõ szekvencia, exonok, intronok és 3’¹transzlációban részt nem vevõ farokszekvencia. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint az oligonukleotid a humán survivin pre-mRNS vagy mRNS egy olyan részéhez hibridizál, amely tartalmazza a transzlációs iniciátor helyet. Elõnyösebben a survivin oligonukleotid tartalmaz CAT szekvenciát, amely komplementer az AUG iniciációs szekvenciával a survivin premRNS¹en vagy mRNS¹en. Egy további megvalósítási mód szerint a survivin oligonukleotid a hasítási donorhely egy részéhez hibridizál a humán survivin premRNS¹en. Egy még további megvalósítási mód szerint a survivin oligonukleotid a hasítási akceptorhely egy részéhez hibridizál a humán survivin pre-mRNS¹en. További megvalósítási mód szerint a survivin oligonukleotid hibridizál a humán survivin pre-mRNS vagy mRNS részeivel, amelyek a poliadeninezésben, transzportban vagy lebomlásban érintettek. Szakember értékeli, hogy az elõnyös oligonukleotid azok, amelyek a survivin premRNS vagy mRNS olyan részével hibridizálnak, amelyek szekvenciája nem fordul elõ gyakran a nem rokon gének átirataiban, hogy fennmaradjon a kezelés specifikussága. A találmány szerinti oligomer vegyület úgy van megtervezve, hogy elégséges mértékben komplemen-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 17
2
ter legyen a célhelyhez, hogy kívánt klinikai választ adjon, azaz az oligomer vegyületnek elégséges erõvel és specifikussággal kell kötõdnie a célpontjához, hogy a kívánt hatást váltsa ki. Egy megvalósítási mód szerint az említett survivint moduláló vegyület úgy van megtervezve, hogy egyéb specifikus nukleinsavakat moduláljon, amlyek nem survivint kódolnak. Elõnyös, ha a találmány szerinti oligomer vegyület oly módon van megtervezve, hogy a molekulán belüli és molekulák közötti oligonukleotid hibridizáció el van kerülve. Számos esetben azon LNA oligomer vegyületek azonosítása, amelyek hatásosak a survivin aktivitás módosítására in vivo vagy klinikailag, a célgén szekvenciainformációján alapulnak. Azonban átlagos tudású szakember értékeli azt, hogy az ilyen oligomer vegyületek azonosíthatóak kísérletes vizsgálatokkal. Mivel az ilyen survivin oligomer vegyületek, amelyeknek például kisebb szekvenciahomológiája van, több vagy kevesebb módosított nukleotidokat tartalmaz, vagy hosszabb vagy rövidebb láncú, az elõnyös megvalósítási módokkal összehasonlítva, de amelyek ettõl függetlenül válaszokat mutatnak klinikai kezelésekben, szintén a találmány oltalmi körébe esnek. A találmány egy megvalósítási módja szerint az oligomer vegyületek megfelelõ antiszensz gyógyszerek. Egy hatásos és biztonságos antiszensz gyógyszer tervezése megköveteli különbözõ paraméterek finomhangolását, mint amilyen az aktivitás/specifikusság, biológiai folyadékokban tapasztalható stabilitás, sejtek általi felvétel, hatásmechanizmus, farmakokinetikai tulajdonságok és toxikusság. Affinitás és specifikusság: Oxi-metilén 2’¹O, 4’¹C kapcsolati LNA (b-D-oxi-LNA) korábban nem létezõ kötési tulajdonságokat mutat DNS és RNS célszekvenciák irányába. Hasonló módon az LNA-származékok, mint például amino¹, tio- és a¹L-oxi-LNA korábban elõ nem forduló affinitásokat mutatnak komplementer RNS és DNS irányában és a tio-LNA esetében az RNS irányában mutatott affinitás még jobb, mint a b¹D-oxi-LNA esetében. Ezen figyelemre méltó hibridizációs tulajdonságok mellett, az LNA-monomerek keverhetõek és kooperatív módon hatnak DNS- és RNS-monomerkkel, és további nukleinsavanalógokkal, mint például 2’¹O-alkilmódosított RNS-monomerekkel. A találmány szerinti oligonukleotidok önmagukban állhatnak teljesen b¹Doxi-LNA-monomerekbõl vagy b¹D-oxi-LNA és DNS, RNS vagy kiegészítõ nukleinsavanalógok bármilyen kombinációjából, amely tartalmazza az olyan LNAszármazékokat, mint például az amino¹, tio- és a¹L-oxiLNA. A korábban nem tapasztalt kötési affinitás az LNA esetében a DNS vagy RNS célszekvenciák irányában és az a képessége, hogy szabadon keverhetõ DNS-sel, RNS-sel és számos kiegészítõ nukleinsavanalóggal, számos fontos következményekkel jár a találmány szerinti, hatásos és biztonságos antiszensz vegyületek kifejlesztése tekintetében. Elõször is, a találmány egy megvalósítási módjában lehetõvé teszi egy antiszensz oligo általános
1
HU 007 196 T2
hosszának a figyelemre méltó rövidítését (20–25-merekrõl például 12–16-merekre), anélkül, hogy kompromittálná a farmakológiai aktivitáshoz szükséges affinitást. Mivel egy oligo belsõ specifikussága fordítottan arányos a hosszával, ezért egy ilyen rövidítés szignifikánsan növeli az antiszensz vegyület specifikusságát az RNS célmolekulája irányában. Mivel a humán genom szekvenciájának elérhetõsége és az annotált génjeinek száma gyorsan növekszik, ezért a találmány egy megvalósítási módja a legrövidebb lehetséges egyedi szekvenciák azonosítása a cél mRNS-ben. Egy további megvalósítási mód szerint az LNA alkalmazása az oligok méretének csökkentésére, jelentõsen könnyíti az eljárást és a gyártás költségét, tehát a kereskedelmileg versenyképes antiszensz terápia alapját adja számos betegség esetén. Egy további megvalósítási mód szerint az LNA korábban nem tapsztalt affinitása alkalmazható egy antiszensz oligo cél mRNS-éhez történõ hibridizációnak lényeges javítására in vivo, ezáltal jelentõsen lecsökken egy hatóanyag azonosításához szükséges idõ és erõfeszítés mennyisége az egyéb vegyületek helyzetéhez képest. Egy további megvalósítási mód szerint az LNA korábban nem tapasztalt affinitását antiszensz oligonukleotidok hatásosságának javítására alkalmazzuk, ez lehetõvé teszi olyan vegyületek kifejlesztését, amelyeknek elõnyösebb terápiás ablakul van, mint azoknak, amelyek jelenleg a klinikai próbákban vannak. Ha antiszensz inhibitornak vannak tervezve, akkor a találmány szerinti oligonukleotidok a cél nukleinsavhoz kötõdnek és modulálják az ezekhez tartozó ferhéje expresszióját. Elõnyösen az ilyen modulálás legalább 10% vagy 20% expressziós gátlást vált ki a normális expressziós szinthez képest, elõnyösebben legalább 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% vagy 90% gátlást vált ki a normális expressziós szinthez képest. Jellemzõen a találmány szerinti LNA oligonukleotidok tartalmaznak a b¹D-oxi-LNA¹n kívüli vegyületeket, mint például natív DNS-monomerek, RNS-monomerek, N3’–P5’ foszforamidátok, 2’¹F, 2’¹O–Me, 2’¹O-metoxietil (MOE), 2’¹O-(3¹amino-propil) (AP), hexitol-nukleinsav (HNA), 2’¹F-arabino-nukleinsav (2’-F-ANA) és D¹ciklohexenil nukleozid (CeNA). Továbbá a b¹D-oxiLNA-módosított oligonukleotid tartalmazhat egyéb LNA-egységeket is egy oxi-LNA-csoport helyett vagy ezenkívül. Egy különösen elõnyös további LNA-egység tartalmazza a tio-LNA vagy amino-LNA-monomereket, akár D¹b¹, akár L¹a-konfigurációkban vagy ezek kombinációit vagy ena-LNA¹t. Általánosan egy LNA módosított oligonukleotid legalább körülbelül 5, 10, 15 vagy 20 LNA-egységet tartalmaz, az oligonukleotidban lévõ összes nukleotidon alapulva, jellemzõbben legalább körülbelül 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 vagy 90% LNAegyésget tartalmaz, az oligonukleotidban lévõ összes bázis mennyiségén alapulva. Stabilitás biológiai folyadékokban: A találmány egy megvalósítási módja tartalmazza LNA-monomerek beépítését standard DNS vagy RNS oligonukleotidba, hogy az eredményül kapott oligomer vegyület stabilitá-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 18
2
sa növekedjen biológiai folyadékokban, például a nukleázokkal (endonukleázok és exonukleázok) szemben mutatott ellenállás növelése révén. A stabilitás mértéke az alkalmazott LNA-monomerek számától, az oligonukleotidon belüli pozíciójától és az alkalmazott LNA-monomer típusától függ. A DNS-hez és foszfortioátokhoz képest a következõ nukleolitikus lebontás elleni oligonukleotid-stabilizáló képességi sorrend állapítható meg: DNS << foszfortioátok ~ oxi-LNA < a¹L-LNA < amino-LNA < tio-LNA. Abból a ténybõl kiindulva, hogy az LNA kompatibilis standard DNS-szintézisekkel és szabadon keveredik számos kiegészítõ nukleinsavanalógokkal, ezért az LNA-oligomer-vegyületek nukleáz rezisztenciája tovább javítható a találmány szerint vagy további olyan analógok beépítésével, amelyek javított nukleáz stabilitást mutatnak, vagy nukleázrezisztens nukleozidok közötti kapcsolatok kihasználásával, azaz foszformonotioát, foszforditioát és metil-foszfonát kapcsolatokkal stb. Hatásmechanizmus: A találmány szerinti antiszensz vegyületek kifejthetik a terápiás hatásokat számos mechanizmus révén és képesek lehetnek arra, hogy számos ilyen vegyületet ugyanabba a vegyületbe kombináljunk. Egy forgatókönyv szerint az oligonukleotid kötõdése a céljához (pre-mRNS vagy mRNS) úgy mûködik, hogy megelõzi egyéb tényezõk kötõdését (fehérjék, további nukleinsavak stb.), amelyek a cél megfelelõ mûködéséhez szükségesek, azaz térbeli gátlás révén mûködnek. Például az antiszensz oligonukleotid kötõdhet a szekvenciamotívumhoz a pre-mRNS¹en vagy mRNS¹en, amelyek fontosak transzkripciós faktorok felismerésére és megkötésére, amelyek az érésben, poliadeninezésben, sejt általi transzportban, transzkripciót követõ módosításokban érintett a nukleozidokban az RNS-ben, az 5’¹vég lezárása, transzlációja stb. A pre-mRNS érés esetében a kölcsönhatás eredménye az oligonukleotid és a célja között lehet egy nem kívánt fehérje expressziójának szuppressziója, kívánt fehérjét kódoló mRNS alternatívan hasított formájának elõállítása vagy mindkettõ. Egy további megvalósítási mód szerint az oligonukleotid kötõdése a céljához nem teszi lehetõvé a transzlációs folyamatot egy fizikai blokk létrehozásával a riboszomális gépezetnek, azaz transzlációs blokk. Egy még további megvalósítási mód szerint az oligonukleotid kötõdése a céljához interferál az RNS¹ek azon képességével, hogy másodlagos vagy felsõbb rendû szerkezeteket vegyen fel, amelyek fontosak a megfelelõ mûködéséhez, azaz strukturális interferencia. Például az oligonukleotid interferálhat törzs-hurok szerkezetek kialakulásával, amelyek kritikus szerepet játszanak különbözõ funkciókban, így például addicionális stabilitás biztosítása az RNS-nek vagy esszenciális felismerõ motívumok adaptálása különbözõ fehérjékre. Egy még további megvalósítási mód szerint az oligonukleotid kötõdése a célmolekulák inaktiválja a további celluláris metabolikus folyamatok tekintetében, olyan sejten belüli enzimek toborzására, amelyek le-
1
HU 007 196 T2
bontják az mRNS¹t. Például az oligonukleotid tartalmazhat olyan nukleozidok részét, amelynek ribonukleáz H (RNázH) toborzó képessége van, amely lebontja az RNS részét egy DNS/RNS duplexnek. Hasonló módon az oligonukleotid tartalmazhat egy szegmenst, amely kettõs szálú RNáz-okat toboroz, mint például RNáz III vagy tartalmazhat externális irányítószekvenciát (EGS), amely endogén enzimet (RNáz P) toboroz, amely lebontja a cél mRNS¹t. Továbbá az oligonukleotid tartalmazhat egy olyan szekvenciamotívumot, amely RNáz katalitikus aktivitást mutat vagy olyan részek kapcsolhatóak az oligonukleotidhoz, amelyek ha a cél közelében vannak hozva a hibridizációs esemény révén, mûködésképtelenné teszi a célmolekulát további metabolikus aktivitásokra. Bemutattuk, hogy a b¹D-oxi-LNA nem támogat RNázH-aktivitást. Azonban ez megváltoztatható a találmány szerint kiméra oligonukleotidok létrehozásával, amelyek b¹D-oxi-LNA-ból és DNS-bõl állnak, amelyeket gapmereknek nevezünk. Egy gapmer egy központi 4–12 nukleotidos DNS-szakaszon alapul vagy RnaseH által felismerhetõ és hasítható módosított monomerekbõl (a gap) jellemzõen ezt 1–6 b¹Doxi-LNA rész (a határoló) határolja. A határolórészek elõállíthatóak LNAszármazékokkal. Vannak további találmány szerinti kimérakonstrukciók, amelyek képesek RNázH-közvetített mechanizmus révén hatni. Egy fejmert b¹D-oxi-LNA vagy LNA-származékok folytonos szakasza definiál az 5’¹végen, amelyet DNS vagy módosított monomerek folytonos szakasza követ, amelyek RNázH által felismerhetõek és hasíthatóak, a 3’¹vég irányában, és egy farokmert folytonos DNS vagy RNázH által felismerhetõ és hasítható módosított monomerek folytonos szakasza definiálja az 5’¹végen, amelyet folytonos b¹D-oxiLNA vagy LNA-származék szakasz követ a 3’¹vég irányában. További találmány szerinti kimérák, amelyeket mixmereknek nevezünk DNS alternatív összetételébõl vagy RNázH által felismerhetõ és hasítható módosított monomerekbõl állnak és b¹D-oxi-LNA és/vagy az LNAszármazékok képesek lehetnek RNázH-kötõdés és hasítás közvetítésére. Mivel az a¹L-LNA RNázH-aktivitást toboroz egy adott mértékig, ezért kisebb DNS vagy módosított monomer rés ismerhetõ fel és hasítható az RNázH által, mivel a gapmer szerkezet szükséges lehet, és talán bevihetõ több rugalmasság a mixmer konstrukciójába. Az 1. ábra különbözõ, találmány szerinti tervek körvonalait mutatja. Antiszensz oligonukleotid klinikai hatásossága jelentõs mértékben függ a farmakokinetikai tulajdonságaitól, azaz abszorpció, eloszlás, sejt általi felvétel, metabolizmus és kiválasztás. Ezzel szemben ezeket a paramétereket az oligonukleotid alapvetõ kémiája és a mérete, és a háromdimenziós szerkezete jelentõsen befolyásolja. Amint azt korábban említettük a találmány szerinti LNA nem egyetlen, hanem számos rokon kémiából áll, amelyek habár molekulárisan különböznek, de mindegyik megdöbbentõ affinitást mutat a komplementer DNS és RNS irányában. Tehát a kémiák LNA családja különösen és egyedi módon megfelelõ a találmány
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 19
2
szerinti oligo kifejlesztésére, amelyeknek elõre meghatározott farmakokinetikai tulajdonságai vannak, az LNA nagy affinitásának a kihasználása révén, a hatóanyagok méretének modulálásával vagy különbözõ LNA-kémiák kihasználásával a pontos molekuláris összetétel modulálására az aktív vegyületek esetén. Az utóbbi esetben például amino-LNA alkalmazása, inkább, mint az oxi-LNA alkalmazása megváltoztatja az oligo teljes töltését és befolyásolja a felvételi és disztribúciós viselkedést. Hasonló módon a tio-LNA alkalmazása az oxiLNA helyett növeli az oligonukleotid lipofilikusságát és ezáltal befolyásolja azon képességét, hogy lipofil gátakon, mint például sejtmembránon keresztül jusson. Egy találmány szerinti LNA oligonukleotid farmakokinetikai tulajdonságainak módosítása elérhetõ továbbá számos különbözõ rész hozzákapcsolásával. Például az oligonukleotidok azon képessége, hogy átjussanak a sejtmembránon, javítható például lipidrészek hozzákapcsolásával, mint amilyen egy koleszterinrész, egy tioéter, egy alifás lánc, egy foszfolipid- vagy egy poliaminrész hozzákapcsolása az oligonukleotidhoz. Hasonló módon az LNA oligonukleotidok sejtekbe történõ felvétele javítható részek hozzákapcsolásával az oligonukleotidhoz, amelyek kölcsönhatnak membránon lévõ molekulákkal, amelyek elõsegítik a citoplazmába történõ transzportot. A találmány szerint a farmakodinamikai tulajdonságok javíthatók olyan csoportokkal, amelyek javítják az oligomer felvételt, javítják a biostabilitást, mint például javítják az oligomer rezisztanciáját a lebomlásra, és/vagy növelik az oligonukleotidok specifitását és affinitását a célszekvenciával szemben mutatott hibridizációs jellemzõkben, amely célszekvencia például egy mRNS-szekvencia. Alapvetõen két típusú toxikusság társul az antiszensz oligókhoz: szekvenciafüggõ toxikusság, amely az alapszekvenciát érinti, és szekvenciától nem függõ toxikusság, amely az osztályhoz kapcsolódik. A natív CpG szekvenciamotívumok általi immunstimuláláshoz kapcsolódó problémák kivételével, az antiszensz oligonukleotidok kifejlesztése során a legegyértelmûbb toxikusságok a szekvenciától függetlenek, azaz az oligonukleotidok kémiájához és dózisához, beadási módjához, beadási gyakoriságához és beadási idejéhez kapcsolódik. Az oligonukleotidok foszfortioát osztálya különösen jól lett jellemezve, és azt találták, hogy számos hátrányos hatást váltanak ki, mint például komplent aktiválás, kinyújtott PTT (részleges tromboplasztin idõ), trombocitopénia, hepatotoxikusság (májenzimek szintjének növekedése), kardiotoxikusság, lépmegnagyobbodás és retikuloendoteliális sejtek hiperpláziája. Amint azt korábban említettük, a kémiák LNA-családja korábban nem ismert affinitást biztosít, nagyon nagy a biostabilitása és azon képessége, hogy az oligonukleotid pontos molekuláris összetételét modulálja. A találmány egy megvalósítási módja szerint az LNAtartalmú vegyület lehetõvé teszi olyan oligonukleotidok kifejlesztését, amelyek a nagy hatásosságot a kevés vagy egyáltalán nem létezõ foszfortioátkapcsolatokkal kombinálják, és amelyek ezáltal valószínûleg jobb ha-
1
HU 007 196 T2
tásosságot és biztonságot mutatnak, mint az egyéb antiszensz vegyületek. A találmány szerinti oligo- és polinukleotidok elõállíthatók a szerves kémia területén átlagos jártassággal bíró szakember által jól ismert nukleinsav kémiai polimerizációs technikák alkalmazásával. Általánosan a foszforamidit megközelítés standard polimerizációs ciklusai vannak alkalmazva (S. L. Beaucage és R. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. Beaucage és R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223), de például H¹foszfonát-kémia, foszfor-triészter-kémia szintén alkalmazható. A találmány egyes monomerjei esetében hosszabb kapcsolási idõt, és/vagy friss reagensekkel végzett ismételt kapcsolásokat, és/vagy töményebb kapcsolóreagensek alkalmazását alkalmaztuk. Az alkalmazott foszforamiditek kielégítõ > 95% lépésenkénti kapcsolási hozamokat értek el. A foszfát tiolezését a foszfor-diészter-oligomerek szintézisére alkalmazott normális oxidálószerek, például jód/piridin/H2O lecserélésével végeztük, ami után Beaucage-reagenst (kereskedelemben kapható) alkalmazó oxidálást végeztünk és egyéb szulfurilezõreagensek szintén részét képezik az eljárásnak. Az LNA-foszfortioát oligomereket hatásosan szintetizáltuk lépésenkénti kapcsolási hozamokkal, amelyek > 98% voltak. A b¹D-amino-LNA, b¹D-tio-LNA oligonukleotidok, a¹L-LNA és b¹D-metil-amino-LNA oligonukleotidok szintén hatásosan voltak elõállítva > 98% lépésenkénti kapcsolási hozamokkal a foszforamiditeljárások alkalmazásával. Az LNA oligomer vegyületek tisztítását eldobható, fordított fázisú tisztítási patronokkal és/vagy fordított fázisú HPLC alkalmazásával, és/vagy etanolból történõ kicsapással vagy butanolból történõ kicsapással végeztük. Kapilláris gélelektroforézist, fordított fázisú HPLC¹t, MALDI-tömegspektrometriát és ESI-tömegspektrometriát alkalmaztunk a szintetizált oligonukleotid tisztaságának igazolására. Továbbá különösen érdekesek az olyan szilárd hordozóanyagok, amelyekhez egy adott esetben nukleobázissal védett és adott esetben 5’¹OH védett LNA van kötve, mint olyan anyag, amely alkalmas LNA-tartalmú oligomer vegyületek szintézisére, ahol az LNA-monomer a 3’¹végen van. Ez esetben a szilárd hordozóanyag elõnyösen CBG, azaz egy egyszerûen (kereskedelemben) hozzáférhetõ CPG anyag vagy polisztirol, amelyre egy 3’¹funkciós csoporttal ellátott, adott esetben nukleobázis védett és adott esetben 5’¹OH védett LNA van kapcsolva, olyan körülmények alkalmazásával, amelyet az adott anyag szállítója meghatározott. Amint ez mostanra egyértelmûvé vált, egy érdekes szempont szerint a találmány tárgya egy vegyület vagy találmány szerinti konjugátum alkalmazása gyógyszerként. Szintén kétségtelennek kell lennie mostanra, hogy a találmány szerinti vegyület vagy a találmány szerinti konjugátum alkalmazása rák kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására, egy különösen érdekes szempontja a találmánynak. A találmány szerinti gyógyászati készítmény számos különbözõ betegség kezelésére alkalmazható.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 20
2
Például a survivinról azt találták, hogy nagy mennyiségben expresszálódik a következõk humán tumorjaiban: tüdõ (Monzo és munkatársai: 1999, J. Clin. Oncol 17, 2100–2104), emlõ (Tanaka és munkatársai: 2000, Clin. Cancer Res. 6, 127–134; Nasu és munkatársai: 2002, Anticancer Res. 22, 1839–1844), vastagbél/végbél (Kawasaki és munkatársai: 1998, Cancer Res. 58, 5071–5074; Rödel és munkatársai: 2002, Strahlenter. Onkol. 8, 426–434), gyomor (Lu és munkatársai: 1998, Cancer Res. 58, 1808–1812; Tsuburaya és munkatársai: 2002, Hepatogastroenterology 49, 1150–1152), nyelõcsõ (Kato és munkatársai: 2001, Int. J. Cancer 95, 92–95; Ikeguchi és Kaibara, 2002, Br. J. Cancer 87, 883–887), hasnyálmirigy (Satoh és munkatársai: 2001, Cancer 92, 271–278; Sarela és munkatársai: 2002, Br. J. Cancer 86, 886–892), máj (Ikeguchi és munkatársai: 2002, Clin. Cancer Res. 8, 3131–3136), méh (Saitoh és munkatársai: 1999, Int. J. Oncol. 15, 137–141; Takai és munkatársai: 2002, Cancer Lett. 184, 105–116), petefészkek (Yoshoda és munkatársai: 2001, Int. J. Oncol. 19, 537–542; Takai és munkatársai: 2002, Int. J. Mol. Med. 10, 211–216), Hodgkin-betegség (Garcia és munkatársai: 2003, Blood 101, 681–689), non-Hodgkin-limfóma (Adida és munkatársai: 2000, Blood 96, 1921–1925.; Kuttler és munkatársai: 2002, Leukemia 16, 726–735), leukámiák (Adida és munkatársai: 2000, Br. J. Haematol. 111, 196–203.; Kamihira és munkatársai: 2001, Br. J. Haematol. 114, 63–69; Mori és munkatársai: 2001, Int. J. Haematol. 75, 161–165), neuroblasztóma (Islam és munkatársai: 2000, Oncogén 19, 617–623; Adida és munkatársai: 1998, Lancet 351, 882–883), faeochromocytoma (Koch és munkatársai: 2002, Eur. J. Endocrinol. 146, 381–388), lágyszöveti szarkómák (Würl és munkatársai: 2002, Lancet 359, 943–945), gliómák (Chakravarti és munkatársai: 2002, J. Clin. Oncol. 20, 1063–1068), melanoma (Grossman és munkatársai: 1999, J. Invest. Dermatol. 113, 1076–1081), hólyag (Swana és munkatársai: 1999, New Engl. J. Med. 341, 452–453; Smit és munkatársai: 2001, JAMA 285, 324–328), méhnyak (Kim és munkatársai: 2002, Anticancer Res. 22, 805–808; Yoshida és munkatársai: 2003, Oncol. Rep. 10, 45–49), prosztata (Ambrosini és munkatársai: 1997, Nat. Med. 3, 917–921). A ráksejtekhez hasonlóan a proliferáló vaszkuláris endotél sejtek érzékenyek a survivin expressziójának csökkenésére. A találmány szerinti gyógyászati készítmény, ezért alkalmazható azon betegségek kezelésére, amelyekre abnormális betegséget okozó angiogenezis jellemzõ. Az ilyen betegségek példái általánosan a rákok és az arteroszklerózis, pszoriázis, diabetikus retinopátia, reumatoid artritisz, asztma, szemölcs, allergiás dermatitisz és Kaposi szarkóma. Továbbá a survivin aktívan érintett lehet a sejtéletképesség szabályozásában HIV–1-fertõzés során (Zhu és munkatársai: 2003, Apoptosis 8, 71–79). A survivin esszenciális a mitózis megfelelõ végrehajtása és a sejtosztódás befejezése során. A survivin gátlása, ezért releváns kell legyen minden olyan betegségben, amelyre nem szabályozott vagy abnormális sejtnövekedés a jellemzõ.
1
HU 007 196 T2
Általánosan megfogalmazva a találmány szerinti vegyület egy szempontja, hogy rendellenes angiogenezis által okozott betegségre érzékeny vagy ebben szenvedõ emlõs kezelésére szolgáló eljárásban alkalmazzuk, amelynek során az emlõsnek terápiásan hatásos mennyiségét adjuk be a survivint célzó oligonukleotidnak, amely egy vagy több LNA-egységet tartalmaz. Egy érdekes szempont szerint a találmány tárgya az itt definiált vegyület alkalmazása vagy az itt definiált konjugátum alkalmazása alteroszklerózis, pszoriázis, diabetikus retinopátia, pneumatoid artritisz, asztma, szemölcsök és allergiás dermatitisz kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. A találmány szerinti vegyületek elõnyösen rák által kiváltott betegségek kezelésére vagy megelõzésére vannak alkalmazva, különösen az olyan rákok kezelésére, amelyek az olyan szövetekben fordulnak elõ, mint például tüdõ¹, emlõ¹, vastagbél¹, prosztata¹, hasnyálmirigy¹, máj¹, agy¹, herék, gyomor¹, zsigerek, bél¹, gerincvelõ¹, szinuszok, vizeletrendszer- vagy petefészekrák. Továbbá az itt ismertetett találmány szerinti vegyületek alkalmazhatóak rák kezelésére vagy megelõzésére szolgáló eljárásban, amely tartalmazza survivinmoduláló oligomer vegyület terápiásan hatásos mennyiségének beadását, nem korlátozó módon ideértve az oligomer nagy dózisait, ilyen terápiára szükséget mutató embernek. A találmány szerinti vegyületek továbbá alkalmazhatóak survivinmoduláló oligomer vegyületek rövid ideig történõ beadása során. A normális nem rákos sejtek az adott sejttípusra jellemzõ frekvenciával osztódnak. Amikor a sejt rákos állapotba transzformálódott, akkor szabályozatlan sejtproliferáció és lecsökkent sejtpusztulás jön létre, és emiatt korai sejtosztódás vagy sejtnövekedés jelenik meg, mint a rákos sejttípus jellegzetessége. A ráktípusok nem korlátozó példái közé tartoznak a következõk: non-Hodgkin-limfóma, Hodgkinlimfóma, leukémia (például akut leukémia, mint például akut limfocitikus leukémia, akut mielocitikus leukémia, krónikus mieloid leukémia, krónikus limfocitikus leukémia, többszörös mielóma), vastagbél-karcinóma, végbélkarcinóma, hasnyálmirigyrák, emlõrák, petefészekrák, prosztatarák, vesesejt-karcinóma, hepatóma, epevezeték-karcinóma, choriokarcinóma, méhnyakrák, hererák, tüdõkarcinóma, hólyagkarcinóma, melanoma, fej és nyak rákja, agydanagat, ismeretlen elsõdleges helyû rákok, neopláziák, a periferiális idegrendszer rákjai, a központi idegrendszer rákjai, tumorok (például fibroszarkóma, mixoszarkóma, liposzarkóma, chondrosarcoma, oszteogenikus szarkóma, chordoma, angioszarkóma, endotelioszarkóma, limfangioszarkóma, limfangioendotelioszarkóma, synovioma, mezotelioma, Ewing-tumor, leiomioszarkóma, rhabdomyioszarkóma, sarlósejtes karcinóma, alapi sejtes karcinóma, adenokarcinóma, édesmirigy-karcinóma, faggyúmirigy-karcinóma, szemölcsös karcinóma, szemölcsös adenokarcinómák, cisztadenokarcinóma, velõkarcinóma, bronchogenikus karcinóma, szeminóma, embrionális karcinóma, Wilm-tumor, kissejtes tüdõkarcinóma, epiteliális
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 21
2
karcinóma, glióma, asztrocitóma, medulloblasztoma, craniopharyngioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblasztóma, akusztikus neuróma, oligodendroglioma, meningioma, neuroblasztoma, és retinoblasztoma), nehéz láncú betegség, metasztázisok vagy bármilyen betegség vagy rendellenesség, amelyre szabályozatlan vagy rendellenes sejtnövekedés jellemzõ. A találmány szerinti vegyület vagy a találmány szerinti konjugátum rák kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására szolgáló eljárásban történõ alkalmazása során az említett rák megfelelõen lehet szolid tumor alakú. Továbbá az említett rák megfelelõ módon karcinóma. A karcinóma jellemzõen a következõk alkotta csoportból választott formában van: malignus melanoma, alapi sejti karcinóma, méhkarcinóma, emlõkarcinóma, nem kissejtes tüdõrák, vesesejt-karcinóma, hólyagkarcinóma, visszatérõ felszíni hólyagrák, gyomorkarcinóma, prosztatakarcinóma, hasnyálmirigy-karcinóma, tüdõkarcinóma, méhnyakkarcinóma, méhnyakdiszplázia, gégepapillomatózis, vastagbél-karcinóma, végbélkarcinóma és karcinoid tumorok. Jellemzõbb módon az említett karcinóma a következõk alkotta csoportból választott: malignus melanoma, nem kissejtes tüdõrák, emlõkarcinóma, vastagbél-karcinóma és vesesejt-karcinóma. A malignus melanoma jellemzõ módon a következõk alkotta csoportból választott: felszíni terjedõ melanoma, csomós melanoma, lentigo malignus melanoma, akrális melagnóma, amelanotikus melanoma és dezmopláziás melanoma. Alternatív esetben a rák lehet megfelelõ szarkóma. A szarkóma jellemzõen a következõk alkotta csoportból választott: oszteoszarkóma, Ewing-szarkóma, kondroszarkóma, malignus rostos hisztiocitóma, fibroszarkóma és Kaposi-szarkóma. Alternatív esetben a rák megfelelõen lehet glióma. Meg kell érteni, hogy a találmány tárgyát képezi olyan gyógyászati készítmény is, amely legalább egy találmány szerinti antiszensz oligonukleotid-konstrukciót tartalmaz hatóanyagként. Meg kell érteni, hogy a találmány szerinti gyógyászati készítmény adott esetben gyógyszerészeti hordozót tartalmaz és, hogy a gyógyászati készítmény adott esetben további antiszensz vegyületeket, kemoterápiás vegyületeket, gyulladásgátló vegyületeket, antivirális vegyületeket és/vagy immunmoduláló vegyületeket tartalmaz. A találmány tárgyát képezõ oligomer vegyület alkalmazható különbözõ gyógyászatilag elfogadható sókban. A leírás szerinti értelemben a kifejezés olyan sókra utal, amelyek megtartják az itt ismertetett vegyületek biológiai aktivitását és minimális nemkívánatos toxikológiai hatásokat mutatnak. Az ilyen sók nem korlátozó példái kialakíthatóak szerves aminosav- és bázisaddíciós sókkal, amelyek fémkationokkal lettek kialakítva, mint például cink, kalcium, bizmut, bárium, magnézium, alumínium, rész, kobalt, nikkel, kadmium, nátrium, kálium és a hasonlóak vagy ammóniával, N,N-dibenzil-etilén-diaminnal, D¹glükózaminnal, tetraetil-ammóniummal vagy etilén-diaminnal kialakított kationnal; vagy (c), (a) és (b) kombinációi, például cink-tannát¹só vagy a hasonlóak.
1
HU 007 196 T2
A találmány egy megvalósítási módja szerint az oligomer vegyület lehet prodrog alakban. Az oligonukleotidok a természetükbõl adódóan negatívan töltött ionok. A sejtmembránok lipofil természetébõl adódóan az oligonukleotidok sejtek általi felvétele le van csökkenve a semleges vagy lipofil ekvivalensekhez képest. Ez a polaritási „hátrány” elkerülhetõ a prodrog megközelítés alkalmazásával [lásd például Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research és Application. Springer-Verlag, Berlin, Németország, 131 kötet, 103–140. oldal]. Ebben a megközelítésben az oligonukleotidok védett módon vannak elõállítva, hogy az oligo semleges legyen a beadáskor. Ezek a védõcsoportok olyan módon lettek megtervezve, hogy el lehessen õket távolítani, ha az oligót felvették a sejtek. Az ilyen védõcsoportok példái a következõk: S¹acetil-tioetil (SATE) vagy S¹pivaloil-tio-etil (t¹butil-SATE). Ezek a védõcsoportok nukleáz rezisztensek és szelektíven eltávolítódnak a sejten belül. A találmány egy megvalósítási módja szerint az oligomer vegyület ligandokhoz/konjugátumokhoz van kapcsolva. Ezen a módon növelhetõ az antiszensz oligonukleotidok sejtek általi felvétele. Ez a konjugáció történhet az 5’/3’¹OH terminális pozícióknál, de a ligandok elhelyezkedhetnek a cukrokon és/vagy a bázisokon. A konjugátumok/ligandumok egyéb példái a koleszterinrészek, duplex interkelátor vegyületek, mint például akridin, poli-L-lizin, „végzáró” egy vagy több nukleáz rezisztens kapcsolócsoporttal. A találmány magában foglalja az itt ismertetett oligonukleotidvegyületek közül egynek vagy többnek a kiszerelését is. Gyógyszerészetileg elfogadható kötõanyagok és adjuvánsok képezhetik részét a kiszerelt gyógyszernek, kapszulák, tabletták és pirulák tartalmazhatják például a következõ vegyületeket: mikrokristályos cellulóz, gumi vagy zselatin, mint kötõanyagok, keményítõ vagy laktóz, mint excipiensek; sztearátok, mint lubrikánsok; különbözõ édesítõ- vagy ízesítõanyagok. A kapszulák esetében a dózisegység tartalmazhat folyékony hordozót, mint például zsírolajokat. Hasonló módon cukor vagy enterikus szer bevonatok részét képezhetik a dózisegységnek. Az oligonukleotid kiszerelések lehetnek a hatóanyag-összetevõ és egy lipid emulziói, amely micelláris emulziót alakít ki. A találmány szerinti oligonukleotid összekeverhetõ bármilyen olyan anyaggal, amelyek nem sértik a kívánt hatást, vagy olyan anyaggal, amely kiegészíti a kívánt hatást. Ezek közé tartozhatnak egyéb gyógyszerek, egyéb nukleotid vegyületeket is. A parenterális, szubkután, intradermális vagy topikális beadás esetén a kiszerelés tartalmazhat steril diluenst, puffereket, tonicitásszabályozókat és antibakteriális szereket. A hatóanyag elõállítható hordozókkal, amelyek a lebontástól védenek vagy a test általi azonnali eliminációtól, ideértve az implantátumokat vagy mikrokapszulákat, amelyeknek szabályozott kibocsátású tulajdonságaik vannak. Az intravénás beadás esetén az elõnyös hordozók a fiziológiai sóoldat vagy a foszfáttal pufferezett sóoldat. Elõnyösen az oligomer vegyület egy egységkiszerelésben van, mint például egy gyógyászatilag elfogadható hor-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 22
2
dozóban vagy diluensben, olyan mennyiségben, amely elégséges ahhoz, hogy a páciensbe terápiásan hatásos mennyiség jusson be anélkül, hogy a kezelt páciensben súlyos mellékhatásokat okozna. A találmány szerinti gyógyászati készítmények számos módon beadhatóak attól függõen, hogy lokális vagy szisztémás keverést akarunk elérni és a kezelni kívánt területtõl függõen. A beadás lehet (a) orális, (b) pulmonális, például porok vagy aeroszolok belégzésével vagy befújásával, ideértve a nebulizátoros bejuttatást; intratacheális, intranazális; (c) topikális, ideértve az epidermális, transzdermális, optalmikus és nyálkahártyára történõ, ideértve a vaginális és rektális bejuttatást; vagy (d) parenterális, ideértve intravénás, intraarteriális, szubkután, intraperitoneális vagy intramuszkuláris injekciót vagy infúziót; vagy intrakraniális, például intratekális vagy intraventrikuláris beadás. Egy megvalósítási mód szerint az aktív oligo IV, IP, orálisan, topikálisan van beadva vagy bolusinjekcióként vagy közvetlenül a célszervbe van beadva. A topikális beadásra szolgáló gyógyászati készítmények és kiszerelések közé tartozhatnak: transzdermális tapaszok, kenõcsök, lotionok, krémek, gélek, cseppek, spray¹k, kúpok, folyadékok és porok. Hagyományos gyógyszerészeti hordozók, vizes, por vagy olajos alapok, sûrítõanyagok és a hasonlóak szükségesek vagy kívánatosak lehetnek. Bevont kondomok, kesztyûk és a hasonlóak, szintén alkalmasak lehetnek. Az elõnyös topikális kiszerelések közé tartoznak azok, amelyekben a találmány szerinti oligonukleotidok el vannak keverve topikális bejuttatóágenssel, mint például lipidekkel, liposzómákkal, zsírsavakkal, zsírsav-észterekkel, szteroidokkal, keláló vegyületekkel és felületaktív anyagokkal. Az orális beadásra szolgáló készítmények és kiszerelések közé tartoznak nem korlátozó módon a porok vagy granulátumok, mikrorészecskék, nanorészecskék, szuszpenziók vagy oldatok, vízben vagy nemvizes közegben, kapszulák, gélkapszulák, tasakok, tabletták vagy minitabletták. A parenterális, intratekális vagy intraventrikuláris beadásra szolgáló készítmények és kiszerelések tartalmazhatnak steril vizes oldatokat, amelyek tartalmazhatnak puffereket, diluenseket és egyéb megfelelõ adalék anyagokat is, így például nem korlátozó módon bejutást segítõ anyagokat, hordozóvegyületeket és egyéb gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokat vagy excipienseket is. A találmány szerinti gyógyászati készítmények közé tartoznak nem korlátozó módon oldatok, emulziók és liposzómát tartalmazó kiszerelések. Ezek a készítmények elõállíthatók számos összetevõbõl, amelyek közé tartoznak nem korlátozó módon a következõk: elõre kialakított folyadékok, önmagukat emulgeáló szilárd anyagok és tárolás alatt emulgeálódó félig szilárd anyagok. A tumorszövetbe történõ drogbejuttatás javítható hordozó közvetített bejuttatással, ideértve nem korlátozó módon a kationos liposzómákat, ciklodextrineket, porfirinszármazékokat, elágazó láncú dendrimereket, polietilén-imin-polimereket, nanorészecskéket és mikrogömböket [Dass CR. J. Farm. Farmacol. 2002; 54(1):3–27]. A találmány szerinti gyógyászati kiszerelé-
1
HU 007 196 T2
sek, amelyek kényelmesen egységdózis alakban lehetnek, elõállíthatók hagyományos technikák alkalmazásával, amelyek jól ismertek a gyógyszeriparban. Az ilyen technikák tartalmazzák a hatóanyag és a gyógyszerészeti hordozó(k) vagy excipiens(ek) kapcsolatba hozását. Általánosan a kiszerelések oly módon vannk elõállítva, hogy egységesen és jól kapcsolatba hozzuk a hatóanyagot folyékony hordozókkal vagy finoman eloszlatott szilárd hordozókkal vagy mindkettõvel és ezt követõen, szükség szerint történik a termék formázása. A találmány szerinti készítmények számos lehetséges dózisalak bármelyikébe formulázhatóak, mint amilyen nem korlátozó módon például a következõk: tabletták, kapszulák, gélkapszulák, folyékony szirupok, lágy gélek és kúpok. A találmány szerinti készítmények kiszerelhetõek vizes, nem vizes vagy kevert közegû szuszpenziókként is. A vizes szuszpenziók tartalmazhatnak továbbá olyan anyagokat, amelyek növelik a szuszpenzió viszkozitását, ideértve például a nátrium-karboximetil-cellulózt, szorbitot és/vagy dextránt. A szuszpenzió tartalmazhat továbbá stabilizálószereket is. A találmány szerinti oligomer vegyületek konjugálhatóak gyógyszerhatóanyagokhoz, például aszpirinhez, ibuprofenhez, szulfagyógyszerhez, antidiabetikumhoz, antibakteriális vagy antibiotikus szerhez. Az LNA-tartalmú oligomer vegyület számos terápiás alkalmazásban alkalmazható, amint azt fent jelöltük. Általánosan a találmány szerinti terápiás eljárások tartalmazzák egy LNA-módosított oligonukleotid terápiásan hatásos mennyiségének beadását emlõsnek, különösen embernek. Egyes megvalósítási módokban a találmány tárgyát képezik gyógyászati készítmények, amelyek tartalmaznak (a) egy vagy több antiszensz vegyületet és (b) egy vagy több további kemoterápiás ágenst, amelyek nem antiszensz mechanizmussal mûködnek. Ha a találmány szerinti vegyületekkel vannak alkalmazva, akkor ilyen kemoterápiás szerek egyedileg is alkalmazhatóak (például mitramicin és oligonukleotid), szekvenciálisan is alkalmazhatóak (például mitramicin és oligonukleotid egy adott ideig, amelyet egyéb szer vagy oligonukleotid követ), vagy egy vagy több további ilyen kemoterapeutikummal kombinálva vagy radioterápiával kombinálva. A szakember számára ismert összes kemoterápiás ágens részét képezik a kombinációs kezelésnek a találmány szerinti vegyülettel. A gyulladásgátló szerek nem korlátozó módon ideértve a nem szteroid gyulladásgátló szereket és a kortikoszteroidokat, antivirális szereket, és immunmoduláló szereket, szintén kombinálhatóak a találmány szerinti készítményekben. Kettõ vagy több kombinált vegyület alkalmazható egyidejûleg vagy szekvenciálisan. Egy további szempont szerint, tehát a találmány tárgya az itt definiált vegyület vagy az itt definiált konjugátum alkalmazása rák kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására, ahol az említett gyógyszer tartalmaz továbbá a következõk alkotta csoportból választott kemoterápiás szert: adrenokortikoszteroidok, mint például prednizon, dexametazon vagy dekadron; altretamin [hexalén, hexametil-melamin (HMM)]; amifostine (etiol); aminoglutetimide (cytadren); amsacrin
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 23
2
(M¹AMSA); anastrozol (arimidex); androgének, mint például tesztoszteron; asparaginase (elspar); bacillus calmette-gurin; bicalutamid (casodex); bleomicin (blenoxán); buszulfan (mileran); karboplatin (paraplatin); carmustin (BCNU, BiCNU); chlorambucil (leukeran); klór-deoxi-adenosin (2¹CDA, cladribin, leustatin); cisplatin (platinol); citozin arabinoside (cytarabin); dacarbazin (DTIC); dactinomicin (actinomicin¹D, cosmegen); daunorubicin (cerubidin); docetaxel (taxotere); doxorubicin (adriomicin); epirubicin; estramustin (emcyt); ösztrogének, mint például dietil-stilbestrol (DES); etopside (VP¹16, VePesid, etopofos); fludarabin (fludara); flutamid (eulexin); 5¹FUDR (floxuridin); 5¹fluor-uracil (5¹FU); gemcitabin (gemzar); goserelin (zodalex); herceptin (trastuzumab); hidroxiurea (hydrea); idarubicin (idamicin); ifoszfamid; IL–2 (prolukin, aldesleukin); interferon alfa (intron A, roferon A); irinotecan (camptosar); leuprolide (lupron); levamizol (ergamizol); lomustin (CCNU); mechloratamin (mustargen, nitrogen mustard); melfalan (alkeran); merkapto-purin (purintol, 6¹MP); metotrexát (mexát); mitomicin¹C (mutamucin); mitoxantrone (novantrone); octreotide (sandostatin); pentostatin (2¹deoxicoformicin, nipent); plicamicin (mitramicin, mitracin); prorocarbazin (matulán); streptozocin; tamoxifin (nolvadex); taxol (paclitaxel); teniposide (vumon, VM–26); tiotepa; topotecan (hycamtin); tretinoin (vesanoid, all-trans retinoic acid); vinblastin (valban); vincristin (oncovin) és vinorelbin (navelbin). Megfelelõ módon a további kemoterápiás szer a taxánok közül választott, mint például Taxol, Paclitaxel vagy Docetaxel. Hasonló módon a találmány tárgya továbbá az itt definiált vegyület vagy az itt definiált konjugátum alkalmazása rák kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására, ahol az említett kezelés tartalmazza továbbá további kemoterápiás szerek beadását, amely kemoterápiás szer a következõk alkotta csoportból választott: altretamin [hexalen, hexametil-melamin (HMM)]; amifostin (etyol); amino-glutetimide (cytadren); amsacrin (M¹AMSA); anastrozol (arimidex); androgének, mint például tesztoszteron; asparaginase (elspar); bacillus calmette-gurin; bicalutamid (casodex); bleomicin (blenoxán); buszulfan (mileran); karboplatin (paraplatin); carmustin (BCNU, BiCNU); chlorambucil (leukeran); klór-deoxiadenosin (2¹CDA, cladribin, leustatin); cisplatin (platinol); citozin arabinoside (cytarabin); dacarbazin (DTIC); dactinomicin (actinomicin¹D, cosmegen); daunorubicin (cerubidin); docetaxel (taxotere); doxorubicin (adriomicin); epirubicin; estramustin (emcyt); estrogens, mint például dietil-stilbestrol (DES); etopside (VP–16, VePesid, etopofos); fludarabin (fludara); flutamid (eulexin); 5¹FUDR (floxuridin); 5¹fluoro-uracil (5¹FU); gemcitabin (gemzar); goserelin (zodalex); herceptin (trastuzumab); hidroxi-urea (hydrea); idarubicin (idamicin); ifoszfamid; IL–2 (prolukin, aldesleukin); interferon alfa (intron A, roferon A); irinotecan (camptosar); leuprolide (lupron); levamizol (ergamizol); lomustin (CCNU); mechloratamin (mustargen, nitrogen mustard); melfalan (alkeran); merkapto-purin (purintol, 6¹MP); metotrexát (mexát); mitomicin¹C (mutamucin);
1
HU 007 196 T2
mitoxantrone (novantrone); octreotide (sandostatin); pentostatin (2¹deoxicoformicin, nipent); plicamicin (mitramicin, mitracin); prorocarbazin (matulán); streptozocin; tamoxifin (nolvadex); taxol (paclitaxel); teniposide (vumon, VM–26); tiotepa; topotecan (hycamtin); tretinoin (vesanoid, all-trans retinoic acid); vinblastin (valban); vincristin (oncovin) és vinorelbin (navelbin). Megfelelõ módon a kezelés tartalmazza továbbá egy további kemoterápiás szer beadását, amely a taxánok közül választott, mint például Taxol, Paclitaxel vagy Docetaxel. Alternatívan megfogalmazva a találmány szerinti vegyület alkalmazható rák kezelésére szolgáló eljárásban, ahol az említett eljárás tartalmazza egy itt definiált vegyület vagy egy itt definiált konjugátum vagy egy itt definiált gyógyászati készítmény beadását erre szükséget mutató páciensnek és alkalmazza továbbá egy további kemoterápiás szer beadását is. Az említett további beadás lehet olyan, hogy a további kemoterápiás szer a találmány szerinti vegyülethez van konjugálva, a gyógyászati készítményben van jelen, vagy egy különálló kiszerelésben van beadva. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak egy vagy több antiszensz vegyületet, különösen oligonukleotidokat, amelyek egy elsõ nukleinsavat céloznak és egy vagy több további antiszensz vegyületet, amelyek egy második nukleinsavat céloznak. Kettõ vagy több kombinált vegyület alkalmazható együttesen vagy szekvenciálisan. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány tárgya gyógyászati készítmény, amely tartalmaz (a) egy vagy több antiszensz vegyületet és (b) egy vagy több további kemoterápiás szert, amelyek mikrotubulusokat stabilizálnak vagy csillapítják a mikrotubulus dinamikát és ezáltal meggátolják, hogy a leánykromatidák kinetokórjain feszültség alakuljon ki. Az ilyen kemoterápiás szerek közé tartoznak a taxánok, különösen a Taxol, Paclitaxel és Docetaxel. Ha a találmány szerinti vegyületekkel vannak alkalmazva, akkor az ilyen kemoterápiás ágenseket szekvenciálisan kell alkalmazni, az oligonukleotidkezelés kezdésével, annyi ideig, amely a célsejteket érzékennyé teszi az ezt követõ kemoterápiás szerrel végzett együttes kezelésre a tumorsejtekben és a tumor vaszkulatura proliferáló endotél sejtejiben lévõ survivinfehérje szintjének csökkentésével. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgya gyógyászati készítmény, amely tartalmaz (a) egy vagy több antiszensz vegyületet és (b) sugárterápiát. Ha a találmány szerinti vegyületekkel van alkalmazva, akkor a sugárterápia szekvenciálisan alkalmazandó az iniciáló oligonukleotidkezelést követõen, amely annyi ideig tart, amely érzékennyé teszi a célsejteket az ezt követõ sugárterápiára a tumorsejtekben és a tumor vaszkulatura proliferáló endotél sejtejiben lévõ survivinfehérje szintjeinek csökkentésével. Az adagolás függ a kezelni kívánt beteg állapot súlyosságától és válaszadásától, és a kezelés idõtartama
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 24
2
néhány naptól néhány hónapig terjedhet vagy amíg gyógyulás nem történik vagy a beteg állapot meg nem szûnik. Az optimális adagolási menetrendek kiszámolhatóak a páciens testében történõ gyógyszer-akkumuláció méréseibõl. Az optimális dózisok változhatnak az egyedi oligonukleotidok relatív hatásosságától függõen. Általánosan in vitro és in vivo állatmodellekben hatásosnak bizonyult EC50-értékeken alapulva határozhatunk meg. Általánosan a dózis 0,01 mg–1 g 1 kg¹testtömegre és adható naponta, hetente, havonta vagy évente egyszer vagy többször, vagy akár minden 2–10 évben vagy óráktól hetekig terjedõ idõtartamig történõ folytonos infúzióval. Az adagolások ismétlési aránya becsülhetõ a gyógyszer-koncentrációk testfolyadékokban vagy szövetekben mért tartózkodási idején alapulva. A sikeres kezelést követõen kívánatos lehet, hogy a páciens fenntartó terápián essen át a betegség kiújulásának meggátlására. A találmány szerinti LNA-tartalmú oligomer vegyületek alkalmazhatóak kísérleti reagensekként is diagnosztikai, terápiás és profilaxiás célból. A kutatásban az antiszensz oligonukleotidok alkalmazhatóak survivin gének szintézisének specifikus gátlására sejtekben és kísérleti állatokban, ezáltal könnyítve a cél funkcionális elemzését vagy a terápiás beavatkozás célpontjaként történõ alkalmasságának elismerését. A diagnosztikában az antiszensz oligonukleotidok alkalmazhatóak survivinexpresszió detektálására és mennyiségi meghatározására sejtben és szövetekben Northern-blottolással, in situ hibridizációval vagy hasonló technikákkal. Terápiás célból vélhetõen survivinexpresszió modulálásával kezelhetõ betegségben vagy rendellenességben szenvedõ állatot vagy embert kezelünk a találmánynak megfelelõ antiszensz vegyületek beadásával. Továbbá megadtunk eljárásokat állat, különösen egér és patkány kezelésére és ember kezelésére, aki vélhetõen olyan betegségben vagy állapotban szenved vagy erre fogékony, amely survivinexpresszióhoz kapcsolódik, ahol a terápia során terápiásan vagy profilaktikusan hatásos mennyisége van beadva a találmány szerinti antiszensz vegyületek vagy készítmények közül egynek vagy többnek. Egy további szempont szerint a találmány tárgya eljárás apoptózis megelõzésére vagy korlátozására, amely tartalmazza az itt ismertetett vegyület beadását, egy itt ismertetett konjugátum vagy egy itt ismertetett gyógyászati készítmény beadását. Az apoptózis megelõzése lehet in vitro. A megelõzés elvégezhetõ sejtes vizsgálati eljárásban vagy egy szöveti mintán. A találmány tárgya egy kapcsolódó szempont szerint eljárás sejtes proliferáció megelõzésére, amely tartalmazza egy itt definiált vegyület, egy itt definiált konjugátum vagy egy itt definiált gyógyászati készítmény beadását. A proliferáció megelõzése lehet in vitro. A megelõzés elvégezhetõ egy sejtes vizsgálati eljárásban vagy egy szöveti mintában. A találmányt tovább jellemezzük nem korlátozó módon a következõ példákkal.
1
HU 007 196 T2
Példák 1. példa: Monomer szintézis Az LNA-monomer építõköveket és származékaikat közölt eljárások és az ezekben történt hivatkozásokat követve állítottuk elõ. Lásd: – WO 03/095467 A1 – D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA phosphoramidits, Syntesis 6, 802–808. – M. D. Sorensen, L. Kværnø, T. Brild, A. E. Håkansson, B. Verbeure, G. Gaubert, P. Herdewijn, J. Wengel (2002) a¹L-ribo-configured Locked Nukleinsav (a-I-LNA): Syntesis és Properties, J. Am. Chem. Soc, 124,2164–2176. – S. K. Singh, R. Kumar, J. Wengel (1998) Syntesis of Novel Biciklo[2,2.1] Ribonukleozids: 2’¹Aminoés 2’¹Tio-LNA Monomeric Nucleosides, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078–6079. – C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sørensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Syntesis of 2’¹amino-LNA: a new strategy, Org. Biomol. Chem. 1, 655–663. A 2’¹tio-LNA ribotimidin-foszforamidit szintézise. Reagensek és körülmények: i) Pd/C, H2, aceton, MeOH; ii) BzCl, piridin, DMF; iii) 0,25 M H2SO4 (aq), DMF, 80 °C (79% 4; 3 lépés); iv) Tf2O, DMAP, CH2Cl2, 0 °C; v) Na2S, DMF (72%, 7; 2 lépés); vi) NaOBz, DMF, 100 °C (81%); vii) NH3, MeOH (76%); viii) DMT¹Cl, piridin (88%); ix) P(OCH2CH2CN)(N(iPr)2)2, 4,5-diciano-imidazol, CH2Cl2 (99%). DMT=4,4’-dimetoxi-tritil, PN2=2-ciano-etoxi-(diizopropil-amino)-foszfinoil. (7) 1¹(3¹O-Benzoil-5-O-metánszulfonil-4-Cmetánszulfonil-oxi-metil-b-D-treo-pentofuranozil)timin (4. ábra) 4 anhidronukleozidot [C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sørensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Syntesis of 2’¹amino-LNA: a new strategy, Org. Biomol. Chem. 1, 655–663] (30,0 g, 58,1 mmol) melegítettünk 70 °C hõmérsékletre metanol (1000 cm3) és aceton (1000 cm3) keverékében, amíg tiszta oldatot nem kaptunk és az oldatot hagytuk szobahõmérsékletre hûlni. A reakcióedényt argonnal öblítettük és Pd/C¹t (10 wt.% palládium szénen, 6,2 g, 5,8 mmol) adtunk hozzá. A keveréket erõsen kevertük hidrogéngáz- (ballon) atmoszféra alatt. 23 óra elteltével az iszapot celitlapon keresztül szûrtük. Kinyertük a celitrõl a katalizátort és DMF-ben (1000 cm3) refluxáltuk 1 órán át. A forró DMF iszapot celit lapon keresztül szûrtük és a szerves réteget összeöntöttük és vákuumban bepároltuk, hogy az 5 nukleozidot kapjuk meg sárga porként. A maradék oldószert nagyvákuum-pumpával távolítottuk el éjszakán át. Az 5 nyers nukleozidot (23 g) 70 °C¹ra melegítettük DMF-ben (300 cm3), hogy tiszta sárga oldatot kapjunk, amelyet hagytunk szobahõmérsékletre hûlni. Benzoilkloridot (81,7 g, 581 mmol, 67,4 cm3) adtunk hozzá, ezt követõen piridint (70 cm3). 18 óra elteltével a reakciót
5
10
15
20
25
30
35
40
2
metanollal (200 cm3) kvencseltük és a metanolfelesleget in vacuo eltávolítottuk. A 6 nukleozid sötétbarna oldatához vizes H2SO4¹ot (0,25 M, 400 cm3) adtunk. Az oldatot 80 °C¹ra melegítettük olajfürdõn. (Körülbelül 50 °C hõmérsékleten csapadékkiválás történik. Az oldat újra tisztává válik 80 °C¹on). 80 °C hõmérsékleten történõ 22 órás tartást követõen az oldatot hagytuk szobahõmérsékletre hûlni. A reakciókeveréket egy elválasztótölcsérbe helyeztük, etil-acetáttal (1000 cm3). A szerves réteget telített vizes NaHCO3-tal mostuk (2×1000 cm3). A kombinált vizes rétegeket etil-acetáttal extraháltuk (1000+500 cm3). A szerves rétegeket kombináltuk és telített vizes NaHCO3-tal mostuk (1000 cm3), szárítottuk (Na2SO4), szûrtük és in vacuo bepároltuk, hogy sárga folyadékot kapjunk. A maradék oldószert nagyvákuumú pumpával távolítottuk el éjszakán át, melynek eredményeként sárga szirupot kaptunk. A terméket száraz oszlopos vákuumkromatográfiával tisztítottuk [id 10 cm; 100 cm3 frakciók; 50–100% EtOAc n¹heptánban (térfogat/térfogat)– 10% növekedések; 2–24% MeOH EtOAc-ben (térfogat/térfogat) – 2%¹os növekedések]. A terméket tartalmazó frakciókat kombináltuk és in vacuo bepároltuk, melynek eredményeként a 7 nukleozidot (25,1 g, 79%) kaptuk fehér hab formájában. Rf=0,54 (5% MeOH EtOAc-ben, térfogat/térfogat); ESI¹MS m/z kapott: 549,0 ([MH]+, számított: 549,1); 1 H–NMR (DMSO-d ) d 11,39 (széles s, 1H, NH), 6 8,10–8,08 (m, 2H, F), 7,74–7,70 (m, 1H, F), 7,60–7,56 (m, 2H, F), 7,51 (d, J=1,1 Hz, 1H, H6), 6,35 (d, J=4,9 Hz, 1H, H1’), 6,32 (d, J=5,3 Hz, 1H, 2’¹OH), 5,61 (d, J=4,0 Hz, 1H, H3’), 4,69 (d, J=10,8 Hz, 1H), 4,59 (m, 1H, H2’), 4,55 (d, J=10,8 Hz, 1H), 4,52 (d, J=10,8 Hz, 1H), 4,46 (d, J=10,6 Hz, 1H) (H5’ és H1’’), 3,28 (s, 3H, Ms), 3,23 (s, 3H, Ms), 1,81 (s, 3H, CH3); 13C–NMR (DMSO-d ) d 164,5, 163,6 [C4, FC(O)], 6 150,3 (C2), 137,7 (C6), 133,8, 129,6, 128,7, 128,6 (F), 108,1 (C5), 84,8 (C1’), 81,1 (C4’), 78,0 (C3’), 73,2 (C2’), 68,0, 67,1 (C5’, Cl’’), 36,7, 36,6 (2×Ms), 11,9 (CH3). Elemanalízis: C20H24N2O12S2·0,33 H2O képletre számított: (%): C, 44,34; H, 4,65; N, 4,85. talált: C, 44,32; H, 4,58; N, 4,77.
45 (9) (1R,3R,4R,7R)-7-Benzoil-oxi-1-metánszulfoniloxi-metil-3-(timin-1¹il)-2-oxa-5tiabiciklo[2:2:1]heptán (7) 1¹(3¹O¹Benzoil-5-O¹metánszulfonil-4-C¹metán50 szulfonil-oxi-metil-b-D-treopentofuranozil)-timint (10,00 g, 18,23 mmol) oldottunk fel diklór-metánban (500 cm3) és 0 °C¹ra hûtöttük. Piridint (15 cm3) és DMAP¹ot (8,91 g, 72,9 mmol) adtunk hozzá, ezt követõen trifluoro-metánszulfonanhidridet (10,30 g, 55 36,5 mmol, 6,0 cm3) adtunk hozzá cseppenként. 1 óra elteltével a reakciót telített vizes NaHCO3 (500 cm3) alkalmazásával kvencseltük és egy elválasztótölcsérre vittük át. A szerves réteget 1,0 M vizes HCl-dal (500 cm3), telített vizes NaHCO3 (500 cm3) alkalmazá60 sával és sóoldattal (500 cm3) mostuk. A szerves réte25
1
HU 007 196 T2
2
get in vacuo bepároltuk toluollal (100 cm3), melynek eredményeként sárga porként kaptuk a (8) 1¹(3¹O¹benzoil-5-O¹metánszulfonil-4-C¹metánszulfonil-oxi-metil-2O¹trifluor-metánszulfonil-b-D-treo-pentofuranozil)-timint. A nyers 8 nukleozidot feloldottuk DMF-ben (250 cm3) és Na2S (1,57 g, 20,1 mmol) vegyületet adtunk hozzá, hogy sötétzöld iszapot kapjunk. 3 óra elteltével a reakciót félig telített vizes NaHCO3 (500 cm3) alkalmazásával kvencseltük és diklór-metánnal extraháltuk (500+2×250 cm3). A kombinált szerves rétegeket sóoldattal mostuk (500 cm3), szárítottuk (Na2SO4), szûrtük és in vacuo betöményítettük, hogy sárga folyadékot kapjunk. A visszamaradó oldószert éjszakán át távolítottuk el nagyvákuumú pumpával, melynek eredményeként sárga gumit kaptunk, amelyet száraz oszlopos vákuumkromatográfiával tisztítottuk [id 6 cm: 50 cm3 frakciók; 50–100% EtOAc n¹heptán (térfogat/térfogat) – 10% növekedések; 2–20% MeOH EtOAc-ben (térfogat/térfogat) – 2% növekedések], így 9 nukleozidot kaptunk (6,15 g, 72%) sárga hab formájában. ESI¹MS m/z kapott: 469,0 ([MH]+, számított: 469,1); 1H–NMR (CDCl ) d 8,70 (széles s, 1H, NH), 8,01–7,99 3 (m, 2H, F), 7,67 (d, J=1,1 Hz, 1H, H6), 7,65–7,61 (m, 1H, F), 7,50–7,46 (m, 2H, F), 5,98 (s, 1H, H1’), 5,34 (d, J=2,4 Hz, 1H, H3’), 4,66 (d, J=11,7 Hz, 1H, H5’a), 4,53 (d, J=11,5 Hz, 1H, H5’b), 4,12 (m, átfed maradék EtOAc-vel), 1H, H2’), 3,15–3,13 (m, 4H, H1’’a és Ms), 3,06 (d, J=10,6 Hz, 1H, H1’’b), 1,98 (d, J=1,1 Hz, 3H, CH3); 13C–NMR (CDCl ) d 165,2, 163,5 [C4, FC(O)], 149,9 3 (C2), 134,1, 133,9, 129,8, 128,7, 128,3 (C6, F), 110,7 (C5), 91,1 (C1’), 86,8 (C4’), 72,6 (C3’), 65,8 (C5’), 50,5 (C2’), 37,9 (Ms), 35,1 (C1’’), 12,5 (CH3). Elemanalízis: C19H20N2O8S2·0,33 EtOAc képletre számítva (%): C, 49,21; H, 4,72; N, 5,47. Talált: C, 49,25; H, 4,64; N, 5,48.
(CDCl3) d 9,02 (széles s, 1H, NH), 8,07–7,99 (m, 4H, F), 7,62–7,58 (m, 2H, F), 7,47–7,42 (m, 5H, F és H6), 5,95 (s, 1H, H1’), 5,46 (d, J= 2,2 Hz, 1H, H3’), 4,93 (d, J=12,8 Hz, 1H, H5’a), 4,60 (d, J= 12,8 Hz, 1H, H5’b), 4,17 (d, J= 2,2 Hz, 1H, H2’), 5 3,27 (d, J=10,6 Hz, 1H, H1’’a), 3,16 (d, J= 10,6 Hz, 1H, H1’’b), 1,55 (d, J=1,1 Hz, 3H,CH3); 13C–NMR (CDCl ) d 165,8, 165,1, 163,7 [C4, 2 x 3 FC(O)], 150,0 (C2), 133,9, 133,7, 133,6, 129,8, 129,6, 129,0, 128,8, 128,6, 128,5 (C6, 2 x F), 110,3 10 (C5), 91,3 (C1’), 87,5 (C4’), 72,9 (C3’), 61,3 (C5’), 50,6 (C2’), 35,6 (C1’’), 12,3 (CH3). Elemanalízis: C25H22N2O7S képletre számítva (%): C, 60,72; H, 4,48; N, 5,66. Talált: C, 60,34; H, 4,49; N, 5,35. 15
(1R,3R,4R,7R)-7-Benzoil-oxi-1-benzoil-oxi-metil-3(timin-1¹il)-2-oxa-5-tiabiciklo[2:2:1]heptán (10) 9 Nukleozidot (1,92 g, 4,1 mmol) oldottunk fel DMFben (110 cm3). Nátrium-benzoátot (1,2 g, 8,2 mmol) adtunk hozzá és a keveréket 100 °C¹ra melegítettük 24 órán át. A reakciókeveréket elválasztótölcsérre vittük félig telített sóoldattal (200 cm3) és etil-acetáttal extraháltuk (3×100 cm3). A kombinált szerves rétegeket szárítottuk (Na2SO4), szûrtük és in vacuo bepároltuk, hogy barna folyadékot kapjunk. A terméket nagyvákuumú pumpára helyeztük, hogy eltávolítsuk a maradék oldószert. Az eredményül kapott barna gumit száraz oszlop vákuumkromatográfia alkalmazásával tisztítottuk [id 4 cm; 50 cm3 frakciók; 0–100% EtOAc n¹heptánban (térfogat/térfogat) – 10% növekedések; 2–10% MeOH EtOAc-ben (térfogat/térfogat) – 2% növekedések], amelynek eredményeként enyhén sárga habként kaptuk a 10 nukleozidot (1,64 g, 81%). Rf=0,57 (20% n¹heptán EtOAc-ben, térfogat/térfogat); ESI¹MS m/z kapott: 495,1 ([MH]+, számított: 495,1);
40
1H–NMR
20
25
30
35
(11) (1R,3R,4R,7R)-7-Hidroxi-1-hidroxi-metil-3(timin-1¹il)-2-oxa-5-tiabiciklo[2:2:1]heptán 10 nukleozidot (1,50 g, 3,0 mmol) oldottunk fel ammóniával telített metanolban (50 cm3). A reakcióedényt lezártuk és kevertük közömbös hõmérsékleten 20 órán át. A reakciókeveréket in vacuo betöményítettük, hogy sárga gumit kapjunk, amelyet száraz oszlop vákuumkromatográfia alkalmazásával tisztítottunk [id 4 cm; 50 cm3 frakciók; 0–16% MeOH EtOAc-ben (térfogat/térfogat) – 1% növekedések], amelynek eredményeként tiszta tûk formájában kaptuk a 11 nukleozidot (0,65 g, 76%). Rf=0,31 (10% MeOH EtOAc-ben, térfogat/térfogat); ESI¹MS m/z kapott: 287,1 ([MH]+, számított: 287,1); 1H–NMR (DMSO-d ) d 11,32 (széles s, 1H, NH), 7,96 6 (d, J= 1,1 Hz, 1H, H6), 5,95 (s, 1H, H6), 5,70 (d, J= 4,2 Hz, 1H, 3’¹OH), 5,62 (s, 1H, H1’), 4,49 (t, J=5,3 Hz, 1H, 5’¹OH), 4,20 (dd, J=4,1 és 2,1 Hz, 1H, H3’), 3,77–3,67 (m, 2H, H5’), 3,42 (d, J=2,0 Hz, 1H, H2’), 2,83 (d, J= 10,1 Hz, 1H, H1’’a), 2,64 (d, J= 10,1 Hz, 1H, H1’’b), 1,75 (d, J= 1,1 Hz, 3H, CH3); 13C–NMR (DMSO-d ) d 163,8 (C4), 150,0 (C2), 135,3 6 (C6), 107,5 (C5), 90,2, 89,6 (C1’ és C4’), 69,4 (C3’), 58,0 (C5’), 52,1 (C2’), 34,6 (C1’’), 12,4 (CH3). Elemanalízis: C11H14N2O5S képletre számítva (%): C, 46,15; H, 4,93; N, 9,78. Talált: C, 46,35; H, 4,91; N, 9,54.
(12) (1R,3R,4R,7R)-1¹(4,4’-Dimetoxi-tritil-oxi-metil)7-hidroxi-5-metil-3-(timin-1¹il)-2-oxa-5tiabiciklo[2:2:1]heptán 11 nukleozidot (0,60 g, 2,1 mmol) oldottunk fel piridinben (10 cm3). 4,4’-Dimetoxi-tritil-kloridot (0,88 g, 50 2,6 mmol) adtunk hozzá és az elegyet közömbös hõmérsékleten kevertük 3 órán át. A reakciókeveréket elválasztótölcsérre vittük vízzel (100 cm3) és etil-acetáttal extraháltuk (100+2×50 cm3). A kombinált szerves rétegeket telített vizes NaHCO3 (100 cm3), sóoldattal 55 (100 cm3) mostuk és száradásig bepároltuk in vacuo, hogy viszkózus sárga folyadékot kapjunk. A terméket újraoldottuk toluolban (50 cm3) és in vacuo betöményítettük, hogy sárga habot kapjunk. A habot nagyvákuumú pumpán szárítottuk éjszakán át és száraz oszlop 60 vákuumkromatográfia alkalmazásával tisztítottuk [id 45
26
1
HU 007 196 T2
4 cm: 50 cm3 frakciók; 10–100% EtOAc n¹heptánban (térfogat/térfogat) – 10% növekedések], melynek eredményeként fehér habként kaptuk a 12 nukleozidot (1,08 g, 88%). Rf=0,24 (20% n¹heptán EtOAc-ben, térfogat/térfogat); ESI¹MS m/z kapott: 587,1 ([M¹H]+, számított: 587,2); 1H–NMR (CDCl ) d 8,96 (széles s, 1H, NH), 7,74 (d, 3 J=1,1 Hz, 1H, H6), 7,46–7,44 (m, 2H, F), 7,35–7,22 (m; 9H, F), 7,19–7,15 (m, 2H, F), 6,86–6,80 (m, 2H, F), 5,82 (s, 1H, H1’), 4,55 (dd, J=9,3 és 2,1 Hz, 1H, H3’), 3,79 (s, 6H, OCH3), 3,71 (d, J= 2,0 Hz, 1H, H2’), 3,50 (s, 2H, H5’), 2,81 (d, J=10,8 Hz, 1H, H1’’a), 2,77 (d, J=10,8 Hz, 1H, H1’’b), 2,69 (d, J=9,2 Hz, 1H, 3’¹OH), 1,42 (s, 3H, CH3); 13C–NMR (CDCl ) d 158,7 (C4), 150,1 (C2), 144,1, 3 135,2, 135,1, 130,1, 129,1, 128,1, 128,0, 127,1, 127,0, 113,3 (C6, 3×F), 110,0 (C5), 90,2 [C(F)3], 89,6 (C1’), 87,0 (C4’), 71,7 (C3’), 60,9 (C5’), 55,2 (C2’), 34,7 (C1’’), 12,2 (CH3). Elemanalízis: C32H32N2O7S·0,5 H2O képletre számítva (%): C, 64,31; H, 5,57; N, 4,69. Talált: C, 64,22; H, 5,67; N, 4,47. (13) (1R,3R,7R)-7-(2¹Ciano-etoxi-(diizopropilamino)-foszfinoxi)-1¹(4,4’-dimetoxi-tritil-oxi-metil)-3(timin-1¹il)-2-oxa-5-tiabiciklo[2,2.1]heptán A közölt eljárás szerint [D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidits, Syntesis, 6, 802–808] a 12 nukleozidot (0,78 g, 1,33 mmol) feloldottuk diklór-metánban (5 cm3) és 1,0 M 4,5-diciano-imidazol acetonitrilben lévõ oldatát (0,93 cm3, 0,93 mmol) adtuk hozzá, ezt követõen cseppenként 2¹ciano-etil-N,N,N’,N’-tetraizopropil-foszforodiamiditet (0,44 cm3, 1,33 mmol) adtunk hozzá. 2 óra eltelte után az elegyet elválasztótölcsérre vittük diklórmetánnal (40 cm3) és telített vizes NaHCO3 (2×25 cm3) és sóoldat (25 cm3) alkalmazásával mostuk. A szerves réteget szárítottuk (Na2SO4), szûrtük és in vacuo bepároltuk, hogy fehér habként kapjuk a 13 nukleozidot (1,04 g, 99%). Rf=0,29 és 0,37 – két diasztereoizomer (20% n¹heptán EtOAc-ben, térfogat/térfogat); ESI¹MS m/z kapott: 789,3 ([MH]+, számított: 789,3); 31P–NMR (DMSO-d6) d150,39, 150,26. 2. példa: Oligonukleotid szintézise Az oligonukleotidokat a foszforamidit megközelítés alkalmazásával szintetizáltuk egy Expedite 8900/MOSS szintetizálókészüléken (Multiple Oligonucleotide Syntesis System=több oligonukleotidszintézis rendszer) 1 vagy 15 mmol mennyiséggel. A szintézis végén (DMT bekapcsolva) az oligonukleotidokat lehasítottuk a szilárd hordozóról vizes ammónia alkalmazásával, 1 órán át szobahõmérsékleten, és továbbá védõcsoportot távolítottunk el 3 órán át 65 °C hõmérsékleten. Az oligonukleotidokat fordított fázisú HPLC (RP-HPLC) alkalmazásával tisztítottuk. A DMT-csoport eltávolítását követõen az oligonukleotidokat IE¹HPLC vagy RPHPLC alkalmazásával jellemeztük. Az oligonukleotidok azonosságát ESI¹MS alkalmazásával igazoltuk. Lásd alább a további részleteket.
2
LNA-szukcinil-hemiészter elõállítása 5’-O-Dmt-3’-hidroxi-LNA-monomert (500 mg), borostyánkõsavanhidridet (1,2 ekvivalens) és DMAP¹ot (1,2 ekvivalens) oldottunk fel DCM (35 mL) oldószer5 ben. A reakciót szobahõmérsékleten kevertettük éjszakán át. Az NaH2PO4 0,1 M pH=5,5 (2×) és sóoldat (1×) extrakciókat követõen a szerves réteget tovább szárítottuk vízmentes Na2SO4-tal, szûrtük és bepároltuk. A hemiészterszármazékot 95%¹os hozammal kaptuk 10 és további tisztítás nélkül alkallmaztuk. Az LNA-hordozó elõállítása A fent elõállított hemiészter származékot (90 mmol) feloldottuk minimális mennyiségû DMF-ben, DIEA és 15 pyBOP (90 mmol) volt hozzáadva és összekeverve 1 percig. Ezt az elõaktivált keveréket kombináltuk LCAA-CPG-vel (500 Å, 80–120 mesh szitaméret, 300 mg) egy manuális szintetizátorban és kevertük. Szobahõmérsékleten 1,5 órát követõen a hordozót le20 szûrtük és DMF, DCM és MeOH alkalmazásával mostuk. A szárítást követõen a töltetet ellenõriztük, amely 57 mmol/g volt (lásd Tom Brown, Dorcas J. S. Brown, „Modern machine-aided metods of oligodeoxiribonucleotide syntesis”, F. Eckstein, szerkesztõ. Oligonucleo25 tides and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13–14). Az oligonukleotid elongációja A foszforamiditek [A(bz), G(ibu), 5¹metil-C(bz) vagy 30 T¹b-ciano-etil-foszforamidit] összekapcsolását az 5’¹ODMT-védett amidit acetonitrilben lévõ 0,1 M¹es oldatának alkalmazásával végeztük, és acetonitrilben (0,25 M) lévõ DCI¹t (4,5-diciano-imidazol) adtunk hozzá aktivátorként. A tiolálást xantán-klorid (0,01 M ace35 tonitril:piridin 10% oldószerben) alkalmazásával végeztük. A többi reagens az olyan, amelyet tipikusan alkalmaznak oligonukleotid szintézisre. Tisztítás RP¹HPLC alkalmazásával XTerra, RP18, 5 mm, 7,8×50 mm oszlop. 40 Oszlop: Eluent: A eluens: 0,1 M NH4OAc, pH: 10. B eluens: acetonitril Áramlás: 5 ml/perc. 45
Gradiens Idõ (perc)
50
55
A eluens
0,05 perc
95%
5%
5,perc
95%
5%
12,perc
65%
35%
16,perc
0%
100%
19,perc
0%
100%
21,perc
100%
0%
Analízis IE¹HPLC alkalmazásával Oszlop: Dionex, DNSPac PA–100, 2×250 mm oszlop. 60 27
B eluens
1
Eluens:
Áramlás:
HU 007 196 T2
A eluens: 20 mM Tris-HCl, f7,6; 1 mM EDTA; 10 mM NaClO4. B eluens: 20 mM Tris-HCl, f 7,6; 1 mM EDTA; 1M NaClO4. 0,25 ml/perc.
5
Gradiens Idõ (perc)
A eluens
B eluens
1 perc
95%
5%
10 perc
65%
35%
11 perc
0%
100%
15 perc
0%
100%
16 perc
95%
5%
21 perc
95%
5%
Rövidítések DMT: dimetoxi-tritil DCI: 4,5-diciano-imidazol DMAP: 4-dimetil-amino-piridin DCM: diklór-metán DMF: dimetil-formamid TF: tetrahidrofurán DIEA: N,N-diizopropil-etil-amin PyBOP: benzo-triazol-1-il-oxi-trisz-pirrolidinfoszfónium-hexafluor-foszfát Bz: benzoil Ibu: izobutil 3. példa: Az oligomer vegyületek tervezésének vizsgálata Az érdekünkben állt különbözõ tervû oligonukleotidok antiszensz aktivitásának értékelése annak érdekében, hogy a survivint célzó oligonukleotid legjobb terve kiválasztásának fontosságát igazoljuk. Ebbõl a célból egy in vitro vizsgálati eljárást állítottunk be, amely lehetõvé tette számunkra számos különbözõ oligonukleotid terv szûrését, az antiszensz oligonukleotidok gátlását követõen szentjánosbogár (Photinus pyralis) luciferáz aktivitásának mérésével. Az 1. ábra a szövegben említett legtöbb terv illusztrációját tartalmazza. Egy elsõ szûrés során b¹D-oxi-LNA-tartalmú terveket, amelyek mindegyike az mRNS¹en belül ugyanazt a motívumot célozta, értékeltünk. Különbözõ résméretû gapmerekbõl álló terveket, különbözõ foszfortioát nukleozidok közötti kapcsolat töltetet és különbözõ LNA-töltetet vizsgáltunk. Különbözõ b¹D-oxi-LNA, foszfortioát nukleozidok közötti kapcsolatot, különbözõ töltettel bíró fejmereket és farokmereket és különbözõ DNS-tölteteket állítottunk elõ. Különbözõ készítmények keverékmereit (mixmer), amely azt jelenti, hogy b¹D-oxi-LNA, a¹L-LNA és DNS különbözõ számú egységeit hordozzák, szintén vizsgáltuk az in vitro vizsgálatban. Továbbá az LNA-származékok különbözõ tervekben vettek részt, és meghatároztuk az antiszensz aktivitásukat. A jó tervezés fontosságát azok az adatok tükrözik, amelyek megszerezhetõek a luciferáz vizsgálatban. A luciferáz expressziós szinteket %¹ban határoztuk meg, és a b¹D-oxi-LNA és LNA-
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
2
származékokat tartalmazó különbözõ tervek antiszensz aktivitásának indikációját adtuk. Könnyen beláthatjuk, hogy néhány terv potens antiszensz oligonukleotid, miközben a többiek mérsékelt vagy alacsony gátlási szinteket adnak. Tehát egyértelmûen egy szoros korelláció van a jó antiszensz aktivitás és az optimális oligonukleotid terv között. Különbözõ tervekkel értékeltük a gátlás jó szintjeit. A 7–10 nukleotid résekkel bíró gapmer DNS, amely tiolezve volt a vázon mindenhol, vagy kizárólag a rés és PO részben a széleken, jó eredményeket mutatott. Ezek a tervek tartalmaznak b¹D-oxi-LNA vagy LNA-származékokat. A 6 nukleotidos fejmerek és a 8 nukleotid hosszúságú b¹D-oxi-LNA szintén jó mértékû gátlást mutatott, ha a foszfortioát internukleozid kapcsolatok mind a vázon voltak vagy csupán a DNS-szegmensben. Különbözõ keverékeknek jó antiszensz aktivitásuk volt a luciferáz vizsgálati eljárásban. Az egységek alternatív száma minden egyes a¹L-oxi-LNA, b¹D-oxiLNA vagy DNS-készítményben definiálja a keveréket, lásd 1. ábra. A 3–9–3–1 mixmer, amelynek dezoxinukleozid része van a 3’¹végen, szignifikáns szintû gátlást mutatott. A 4–1–1–5–1–1–3 mixmerbe kettõ a¹L-oxiLNA részt helyeztünk a rés megzavarására, miáltal a b¹D-oxi-LNA került a szélekre. Továbbá kettõ a¹L-oxiLNA alkalmazásával megszakítottuk a rést és mindkét határoló részt szubsztituáltuk a¹L-oxi-LNA alkalmazásával. Mindkét terv jelentõs szintû gátlást mutatott. Az a¹Loxi-LNA jelenléte flexibilis átmenetet vihet be a Northrögzült szélek (oxi-LNA) és az a¹L-oxi-LNA anyag közé, a dezoxinukleotidok közötti beékelõdéssel. Érdekes vizsgálni továbbá a 4–3–1–3–5 tervet, ahol egy a¹L-oxiLNA zavarja meg a DNS-szakaszt. Az a¹L-oxi-LNA mellett a résben két oxi-LNA¹t is szubsztituáltunk a szélek peremén kettõ a¹L-oxi-LNA-vegyülettel. Egyetlen b¹Doxi-LNA jelenléte (4–3–1–3–5 terv), amely a résben megszakítja a DNS-szakaszt, a gátlás drámai elvesztéséhez vezet. a¹L-oxi-LNA alkalmazásával a terv jelentõs gátlást mutat 50 nM oligonukleotid koncentráció esetén. Az a¹L-oxi-LNA-nak a keresztezõdésekbe történõ helyezése és egy a¹L-oxi-LNA-nak a rés közepébe történõ helyezése szintén gátlást mutatott. Az a¹L-oxiLNA úgy tûnik, hogy hatásos eszköz különbözõ mixmerek konstrukciójának lehetõvé tételére, amelyek képesek nagy szintû antiszensz aktivitás biztosítására. További mixmerek, mint például 4–1–5–1–5 és 3–3–3–3–3–1 szintén elõállíthatóak. Könnyen beláthatjuk, hogy egyes tervek hatásos antiszensz oligonukleotidokat eredményeznek, míg a többiek mérsékelt vagy gyenge gátló szinteket adnak. Tehát ismételve, egy oligonukleotidra nagyon egyértelmûen közeli korreláció van a jó antiszensz aktivitás és az optimális terv között. További elõnyös terv az (1–3–8–3–1), ahol a DNS a széleken található 3 b¹D-oxi-LNA-monomerrel a rés mindkét oldalán. Egy további elõnyös terv a (4–9–3–1), ahol a D¹oxi-LNA határol és egy 9¹es rés van egy DNSsel a 3’¹végen.
Vizsgálati eljárás X1/5 Hela-sejtvonalat (ECACC Ref. No: 95051229), 60 stabilan transzfektáltunk egy „tet-off” luciferáz rend28
1
HU 007 196 T2
szerrel. Tetraciklin hiányában a luciferáz gén konstitutív módon expresszálódik. Az expresszálódás fényként mérhetõ egy luminométerben, ha a luciferáz szubsztrát, a luciferin van hozzáadva. Az X1/5 Hela-sejtvonalakat minimális esszenciális Eagle-tápközegben növesztettük (Sigma M2279), amelyet 1×nem esszenciális aminosavval egészítettünk ki (Sigma M7145), 1×Glutamax I¹vel (Invitrogen 35050–038), 10% FBS borjúszérummal, 25 mg/ml Gentamicinnel (Sigma G1397), 500 mg/ml G418 (Invitrogen 10131–027) és 300 mg/ml Hygromicin B¹vel (Invitrogen 10687–010). Az X1/5 Hela-sejteket lyukanként 8000 sejt sûrûségben oltottuk egy 96 lyukú lemezre (Nunc 136101) a transzfekció elõtti napon. A transzfekciót megelõzõen a sejteket egyszer mostuk optiMEM-mel (Invitrogen), amelyet 40 ml OptiMEM és 2 m/ml Lipofectamin2000 (Invitrogen) hozzáadása követett. A sejteket 7 percig inkubáltuk az oligonukleotidok hozzáadása elõtt. 10 ml oligonukleotidoldatot adtunk hozzá, és a sejteket 4 órán át inkubáltuk 37 °C¹on és 5% CO2 mellett. A 4 órás inkubálást követõen a sejteket egyszer mostuk OptiMEM alkalmazásával és hozzáadtuk a növekedési tápközeget (100 ml). A luciferáz expressziót a következõ napon mértük. A luciferáz expressziót a Steady-Glo luciferáz vizsgálati rendszerrel mértünk meg, amelynek szállítója a Promega volt. 100 ml Steady-Glo reagenst adtunk minden egyes lyukhoz, és a lemezt rázattuk 30 másodpercig 700 rpm mellett. A lemezt a TermoLabsystemstõl származó Luminoskan Ascent készülékkel olvastuk le 8 perces inkubálást követõen a sejtek teljes lízisének befejezésére. A luciferáz expressziót relatív fény egységekben („Relative Light Units”=RLU) RLU/s értékekként mértük. Az adatokat az Ascent szoftver (v2.6) alkalmazásával dolgoztuk fel és az adatokat SigmaPlot2001¹en rajzoltuk meg. 4. példa: In vitro modell: sejttenyészet Antiszensz vegyületek cél nukleinsav expresszióra mutatott hatása vizsgálható sejttípusok bármilyen változatában, feltéve, hogy a cél nukleinsav mérhetõ szinteken van jelen. A cél lehet endogén módon expresszált vagy tranziens vagy stabilis transzfekciója az említett nukleinsavat kódoló nukleinsavnak. A cél nukleinsav expressziója rutinszerûen meghatározható például Northern-blot-elemzés, valós idejû PCR és ribonukleáz védõ vizsgálatok alkalmazásával. A következõ sejttípusokat illusztratív célokból adtuk, de további sejttípusok vannak rendszeresen alkalmazva; feltéve, hogy a cél expresszálva van a sejttípusban, amelyet kiválasztottunk. Sejteket tenyésztettünk az alább ismertetett megfelelõ tápközegben és 37 °C hõmérsékleten és 95–98% páratartalom és 5% CO2 mellett tartottuk fenn õket. A sejteket rutinszerûen passzáltuk hetente 2¹3 alkalommal. 15PC3: A 15PC3 humán prosztata rák sejtvonal Dr. F. Baas, Neurozintuigen Laboratory, AMC, Hollandia kedves adománya volt és DMEM (Sigma)+10% borjúszérum (FBS)+Glutamax I+gentamicin tenyésztési közegben tenyésztettük.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 29
2
A549: Az A549 humán nem kissejtes tüdõrák sejtvonalat az ATCC, Manassas nevû törzsgyûjteménybõl vásároltuk, és a következõben tenyésztettük: DMEM (Sigma)+10% FBS+Glutamax I+gentamicin. MCF7: Az MCF7 humán emlõrák sejtvonalat az ATCC-tõl vásároltuk és a következõben tenyésztettük: Eagle MEM (Sigma)+10% FBS+Glutamax I+gentamicin. SW480: Az SW480 humán vastagbél rák sejtvonalat az ATCC-tõl vásároltuk és a következõben tenyésztettük: L–15 Leibovitz (Sigma)+10% FBS+Glutamax I+gentamicin. SW620: Az SW620 humán vastagbél rák sejtvonalat az ATCC-tõl vásároltuk és a következõben tenyésztettük: L–15 Leibovitz (Sigma)+10% FBS+Glutamax I+gentamicin. HT29: A HT29 humán prosztatarák sejtvonal az ATCC-tõl vásároltuk és a következõben tenyésztettük: McCoy’s 5a MM (Sigma)+10% FBS+Glutamax I+gentamicin. NCI H23: Humán nem kis sejtes tüdõrák sejtvonalat az ATCC-tõl vásároltuk és a következõben tenyésztettük: RPMI 1640 wit Glutamax I (Gibco)+10% FBS+HEPES+gentamicin. HCT–116: A HCT–116 humán vastagbél rák sejtvonalat az ATCC-tõl vásároltuk és a következõben tenyésztettük: McCoy’s 5a MM+10% FBS+Glutamax I+gentamicin. MDA-MB–231: Az MDA-MB–231 humán emlõrák sejtvonalat az ATCC-tõl vásároltuk és a következõben tenyésztettük: L–15 Leibovitz+10% FBS+Glutamax I+gentamicin. MDA-MB–435s: Az MDA-MB–435s humán emlõrák sejtvonalat az ATCC-tõl vásároltuk és a következõben tenyésztettük: L–15 Leibovitz+10% FBS+Glutamax I+gentamicin. DMS273: A DMS273 humán kis sejtes tüdõrák sejtvonalat az ATCC-tõl vásároltuk és a következõben tenyésztettük:+10% FBS+Glutamax +gentamicin. PC3: A PC3 humán prosztata rák sejtvonalat az ATCC-tõl vásároltuk és a következõben tenyésztettük: F12 Coon’s glutaminnal (Gibco)+10% FBS+gentamicin. U373: Az U373 humán glioblasztóma sztrocitóma rák sejtvonalat az ECACC-tõl vásároltuk és a következõben tenyésztettük: EMEM+10% FBS+Glutamax+NEAA+nátriumpiruvát+gentamicin. HeLa Sur-GFP: Wheately, S. P. és munkatársai: Curr. Biol. 11 446–490, 2001. HUVEC–C Humán köldökzsinór-véna endotél sejteket vásároltunk az ATCC-tõl és a gyártói elõírások szerint szaporítottuk õket. HMVEC-d (DMVEC’s-dermális humán mikrovaszkuláris endotél sejteket) vásároltunk a Cloneticstõl és a gyártói elõírások szerint tenyésztettük õket. HMVEC Humán mikrovaszkuláris endoteliális sejteket vásároltunk a Cloneticstõl és a gyártói elõírások szerint tenyésztettük õket. Human embrionális tüdõfibroblasztokat vásároltunk az ATCC-tõl és a gyártói elõírások szerint tenyésztettük õket.
1
HU 007 196 T2
HMEC–1 Humán emlõ epitéliás sejteket vásároltunk a Cloneticstõl és a gyártói elõírások szerint tenyésztettük õket. 5. példa: In vitro modell: Kezelés az antiszensz oligonukleotiddal A sejteket kezeltük az oligonukleotiddal a kation liposzóma kiszerelés alkalmazásával, mint transzfekciós eszköz, LipofectAMIN 2000 (Gibco). A sejteket 12 lyukú sejttenyésztõ lemezekre (NUNC) oltottuk és kezeltük, ha 80–90%-ban konfluens lett. Az alkalmazott oligo koncentrációk a 125 nM–0,2 nM tartományba szóródtak a végkoncentrációra. Az oligolipid komplexek kiszerelését lényegében a Dean és munkatársai (Journal of Biological Chemistry 1994, 269, 16 416–16 424) által ismertetett eljárás szerint hajtottuk végre, szérum-mentes OptiMEM (Gibco) és 10 mg/ml LipofectAMIN 2000 végsõ lipidkoncentrációt alkalmaztunk 500 ml teljes térfogatban. A sejteket 37 °C hõmérsékleten inkubáltuk 4 órán át és leállítottuk a kezelést az oligotartalmú tenyésztési tápközeg eltávolításával. A sejteket mostuk és szérumot tartalmazó tápközeget adtunk hozzá. Az oligo kezelést követõen a sejteket 18 órán át hagytuk pihenni, mielõtt betakarítottuk volna õket RNS vagy fehérje analízis alkalmából. 6. példa: In vitro modell: RNS- és cDNS-szintézis extrakciója Össz-RNS izolálás Az összes RNS¹t vagy az RNeasy mini készlet (Qiagen katalógusszám: 74104) alkalmazásával vagy a Trizol reagens alkalmazásával (Life technologies katalógusszám: 15596) izoláltuk. A sejtekbõl történõ RNS izolálásra az RNeasy az elõnyös eljárás és a szöveti minták esetén a Trizol az elõnyös eljárás. Az összes RNS¹t a sejtvonalból a Qiagen RNA OPF Robot-BIO Robot 3000 alkalmazásával izoláltuk a gyártó által biztosított protokoll szerint. A szöveti mintákat homogenizáltuk Ultra Turrax T8 homogenizáló készülékkel (IKA Analysen technik) és az összes izolált RNS¹t a Trizol reagens protokoll alkalmazásával izoláltuk, amelyet a gyártó adott meg. Elsõ szál szintézis Az elsõ szál szintézist OmniScript Reverse Transcriptase készlet (katalógusszám: 205113, Qiagen alkalmazásával végeztük el a gyártói instrukciók szerint. Minden egyes minta esetén 0,5 mg össz-RNS¹t egyenként 12 ml¹re állítottunk RNáz-mentes vízzel és elkevertük 2 ml poli (dT)12–18 vegyülettel (2,5 mg/ml) (Life Technologies, GibcoBRL, Roskilde, DK) és a következõkkel: 2 ml dNTP keverék (minden egyes dNTP-bõl 5 mM), 2 ml 10×RT puffer, 1 ml RNSguard™Rnase INHIBITOR (33,3 U/ml), (katalógusszám: 27–0816–01, Amersham Farmacia Biotech, Horsholm, DK) és 1 ml OmniScript Reverse Transcriptase (4 U/ml), amelyet 37 °C hõmérsékleten 60 percig végzett inkubálás követett és az enzimek hõ általi inaktiválása 93 °C¹on 5 percig.
2
7. példa: In vitro modell: Survivin expresszió oligonukleotid gátlásának elemzése valós idejû PCR alkalmazásával A survivinexpresszió antiszensz modulálása vizs5 gálható számos módon, amely ismert a szakterületen. Például a survivin mRNS-szintek meghatározhatóak pl. Northern-blot-analízissel, összehasonlító polimerázláncreakcióval (PCR), vagy valós idejû PCR alkalmazásával. A valós idejû kvantitatív PCR jelenleg az elõ10 nyös. Az RNS vizsgálat elvégezhetõ az összes sejtes RNS¹en vagy mRNS¹en. Az RNS-izolálás és RNS-elemzés eljárásai, mint például a Northern-blot-elemzés rutin a szakterületen és kitanítás található róla például a következõ szak15 könyben: Current Protocols in Molcular Biology, John Wiley és Sons. A valós idejû kvantitatív (PCR) elõnyösen végrehajtható kereskedelmi iQ többszínû, valós idejû PCR detektálási rendszer alkalmazásával, amely elérhetõ a 20 BioRAD-tól.
25
30
35
40
Valós idejû kvantitatív PCR elemzése a Survivin mRNS-szinteknek Az mRNS-szintek mennyiségi meghatározását valós idejû kvantitatív PCR alkalmazásával végeztük az iQ több színû, valós idejû PCR detektálási rendszer (BioRAD) alkalmazásával, a gyártó elõírásainak megfelelõen. A valós idejû kvantitatív PCR egy a szakterületen jól ismert technika és kitanítást találunk róla például a következõben: Heid és munkatársai: Valós idejû kvantitatív PCR, Genome Research (1996), 6: 986–994. Platinum Kvantitatív PCR SuperMix UDG 2×PCR mesterkeveréket szereztünk be az Invitrogentõl (katalógusszám: 11730). A primereket és a TaqMan® próbákat az MWG-Biotech AG cégtõl, Ebersberg, Németország, szereztük be. A humán survivin próbái és primerei úgy voltak megtervezve, hogy hibridizáljanak a humán survivinszekvenciával, a közölt szekvenciainformáció alapján (GenBank regisztrációs szám NM 001168, amelyet SEQ ID NO: 1 azonosító számon a leírás részévé tettük). A humán survivin esetén a PCR-primerek a következõk voltak:
45 1. vizsgálat elõremenõ primer: 5’ caggtccccgctttctttg 3’ (a vizsgálatban a végsõ koncentráció; 0,6 mM); hátramenõ primer: 5’ ggaggagggcgaatcaaa 3’ (a vizs50 gálatban a végsõ koncentráció; 0,6 mM) és a PCR próba: 5’ FAM-ccatcatcttacgccagacttcagcc-TAMRA 3’ (a vizsgálatban a végsõ koncentráció; 0,1 mM) 1. vizsgálat 55 elõremenõ primer: 5’ aaggaccaccgcatctctaca 3’ (a vizsgálatban a végsõ koncentráció; 0,9 mM); hátramenõ primer: 5’ ccaagtctggctcgttctcagt 3’ (a vizsgálatban a végsõ koncentráció; 0,6 mM) és a PCR-próba: 5’ FAM-cgaggctggcttcatccactgcc¹TAMRA 3’ (a vizs60 gálatban a végsõ koncentráció; 0,1 mM). 30
1
HU 007 196 T2
Glicerinaldhied-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) mRNS mennyiségét alkalmaztuk endogén kontrollként a minta elõkészítése során elõforduló bármilyen változás normalizálására. A mintának a humán GAPDH mRNS-tartalmát a humán GAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent alkalmazásával határoztuk meg (Applied Biosystems katalógusszám: 4310884E) a gyártói instrukciók szerint. Egér GAPDH mRNS mennyiségi meghatározására a következõ primereket és próbákat terveztük: szensz primer 5’aggctgtgggcaaggtcatc 3’ (0,3 mM végsõ koncentráció), antiszensz primer 5’ gtcagatccacgacggacacatt (0,6 mM végsõ koncentráció), TaqMan próba 5’ FAM-gaagctcactggcatggcatggccttccgtgttc-TAMRA 3’ (0,2 mM végsõ koncentráció). Valós idejû PCR A 6. példában ismertetettek szerint elvégzett elsõ szál szintézisbõl származó cDNS¹t 2–20-szorosára hígítottuk, és valós idejû kvantitatív PCR alkalmazásával elemeztük. A primereket és próbát 2×Platinum Kvantitatív PCR SuperMix UDG (katalógusszám: 11730, Invitrogen) reagenssel kevertük és 3,3 ml cDNS-hez adtuk 25 ml végtérfogatig. Minden egyes mintát háromszorosan elemeztünk. A vizsgálatok standard görbéit a vizsgált RNS¹t expresszáló sejtvonalból tisztított anyagból elõállított cDNS kétszeres hígításainak vizsgálatával hoztuk létre. Steril vizet alkalmaztunk a cDNS helyett a templát nélküli kontrollokban. PCR-program: 50 °C 2 percen át, 95 °C 10 percen át, ezt követõen 40 cikluson át 95 °C, 15 másodperc, 60 °C, 1 perc. A cél mRNS-szekvencia relatív mennyiségeit a számolt küszöb ciklusból határoztuk meg az iCycler iQ Real Time Detection System szoftver alkalmazásával.
5
10
15
20
25
30
35
Lásd a 7. ábrát és az 1., 2., 3., 4. és 5. táblázatot 8. példa: In vitro elemzés: Northern-blot-elemzés survivin mRNS-szintekre Northern-blot-elemzést végeztünk a szakterületen jól ismert eljárásokkal, lényegében úgy, ahogy ezt ismertetve lett a következõ helyen: Current Protocols in Molcular Biology, John Wiley & Sons. A hibridizációs próbát reverz transzkripciós PCR-rel elõállított 1 ml cDNS 373 bázispáros fragmensének PCR-amplifikációjával állítottuk elõ. A reakciót a következõ primerek alkalmazásával végeztük: 5’ agcacaaagccattctaagtcattg 3’ (elõremenõ) és 5’ tccatcatcttacgccagacttc 3’ (hátramenõ) egyenként 0,5 mM végsõ koncentráció, egyenként 200 nM dNTP, 1,5 mM MgCl2 és Platinum Taq DNS-polimeráz (Invitrogen katalógusszám: 10966–018). A DNS¹t 40 cikluson át amplifikáltuk Perkin Elmer 9700 termocycler készülék alkalmazásával a következõ program szerint: 94 °C 2 percig, ezután 40 ciklus 94 °C 30 másodpercig és 72 °C 30 másodpercig, ciklusonként 0,5 °C hõmérséklet-csökkenéssel, amelyet 72 °C követett 7 percig.
40
45
50
55
60 31
2
Az amplifikált PCR-terméket S¹400 MicroSpin oszlopok (Amersham Farmacia Biotech katalógusszám: 27–5140–01) alkalmazásával tisztítottuk a gyártói instrukciók szerint és spektrofotometriásan határoztuk meg a mennyiségét. A hibridizációs próbát Redivue™ [a- 32 P]dATP 3000 Ci/mmol (Amersham Farmacia Biotech katalógusszám: AA 0005) és Prime¹It RmT jelölõ készlet (Stratagene, katalógusszám: 300392) alkalmazásával jelöltük meg a gyártói instrukciók szerint és a radioaktívan jelölt próbát S–300 MicroSpin oszlopok (Amersham Pharmacia Biotech katalógusszám: 27–5130–01) alkalmazásával tisztítottuk. Az alkalmazást megelõzõen a próbát denaturáltuk 96 °C hõmérsékleten és azonnal jégre tettük. 2 mg összes RNS-mintát tisztítottuk a 6. példában ismertetettek szerint, ezután denaturáltuk õket és méret szerint elválasztottuk õket 2,2 M formaldehid/MOPS agarózgélen. Az RNS a pozitívan töltött nejlon membránra ment lefelé menõ kapilláris transzferrel a TurboBlotter (Schleicher & Schuell) alkalmazásával és az RNS¹t a membránhoz immobilizáltuk UV keresztkötéssel Stratagene keresztkötõ alkalmazásával. A membránt elõhibridizáltuk ExpressHyb hibridizációs oldatban (Clontech katalógusszám: 8015–1) 60 °C hõmérsékleten, és a próbát ezt követõen adtuk hozzá hibridizálására. A hibridizálást 60 °C hõmérsékleten végeztük és a blotot kevésbé szigorú mosópufferrel mostuk (2×SSC, 0,1% SDS) szobahõmérsékleten és nagyon szigorú mosópufferrel (0,1×SSC, 0,1% SDS) 50 °C hõmérsékleten. A blotot Kodak tároló foszforlemezekre helyeztük és beolvastuk BioRAD FX molekuláris ábrázolóval. A survivin mRNS-szinteket Quantity One szoftver (BioRAD) alkalmazásával határoztuk meg. Az RNS-minta töltésegyenlõségét a blot 0,5% vízben lévõ SDS-sel történõ lemosásával 85 °C hõmérsékleten határoztuk meg és ezt követõen új próbát végeztünk jelölt GAPDH (gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz) próbával, amelyet lényegében a fent ismertetett módon állítottunk elõ a következõ primerek alkalmazásával: 5’ aacggatttggtcgtatt 3’ (elõremenõ) és 5’ taagcagttggtggtgca 3’ (hátramenõ). Lásd a 2. és 3. ábrát. Az intenzitást Biorad foszfo ábrázoló készülékkel követtük, FX¹scanner alkalmazásával (lásd alább). A vizsgált oligomer vegyületeket a 10. példában mutatjuk be. Survivin northern-blotolásból becsült százalékos mRNS-gátlás (GAPDH¹ra normalizált adatok) Vegyület/Seq ID
0,2 nM
1 nM
5 nM
25 nM
2A
31%
34%
55%
77%
6A
22%
48%
71%
91%
9A
21%
44%
67%
64%
15A
45%
79%
93%
95%
1
HU 007 196 T2
2
9. példa: In vitro vizsgálat: Western-blot-elemzés survivinfehérje-szintekre A survivinfehérje szintjeinek a mennyiségi meghatározása különbözõ módokon, amelyek jól ismertek a szakterületen, lehetséges, mint például immunoprecipitáció, Western-blot-elemzés (immunblottolás), ELISA, RIA (Radio Immuno Assay) vagy fluoreszcens-akvitált sejtválogatás (FACS). A survivin elleni antitestek azonosíthatóak és különbözõ forrásból beszerezhetõek, mint például Upstate Biotechnologies (Lake Piacid, USA), Novus Biologicals (Littleton, Colorado), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California) vagy elõállíthatóak hagyományos antitest elõállító eljárásokkal.
blokkoló pufferben történt (Invitrogen) a membránt két órán át inkubáltuk nyúl-survivin elleni antitestekkel (AF886 az R&D vagy Novus 500–201 az Abcam cégektõl). Ezt 1 órás inkubálás követte másodlagos anti5 testekben. Egy kromogén immundetektáló készletet (Invitrogen) alkalmaztunk a survivin megjelenítésére. Alternatív esetben a membránt HRP-konjugált nyúl-immunoglobulinokkal (DAKO) inkubáltuk, amelyet ECL+ Plus reagenssel (Amersham) történõ inkubáció köve10 tett és VersaDoc kemilumineszcens detektáló rendszer alkalmazásával ábrázoltuk. (Lásd 13. ábra, a vizsgált oligomer vegyületeket a 10. példában mutattuk be.)
Western-blotolás A survivinoligok in vitro hatását a survivinfehérjeszintre transzfektált sejtekben határoztuk meg Western-blottolás alkalmazásával. Sejteket transzfektáltunk, ahogy azt az 5. példában ismertettük. A transzfekciót követõen körülbelül 24 órával a sejteket betakarítottuk, 2,5% SDS, 5 mM DTT és 6 M karbamid alkalmazásával, amely proteázgátló koktél tablettával (Roche) volt kiegészítve, lizáltuk. Az összes fehérjekoncentrációt egy Bradford-reagenssel mértük meg. 150 mg összfehérjét töltöttünk egy 12%¹os bis-tris gélre, MOPS-pufferrel futtattuk és PCDFmembránra blotoltuk a gyártói elõírások szerint (Invitrogen). Éjszakán át történõ inkubációt követõen, amely
15
10. példa: In vitro analízis: Humán survivinexpresszió antiszensz gátlása oligomer vegyülettel A találmánynak megfelelõen oligonukleotidok sorozatát terveztük meg, hogy a humán survivin RNS különbözõ szakaszait célozzák, a közölt szekvenciák al20 kalmazásával (GenBank regisztrációs szám: NM_001168, amelyet a leírás részévé tettünk SEQ ID NO: 1 számon). A 16 nukleotid hosszúságú oligonukleotidokat az 1. és 2. táblázatban mutatjuk be. A „célhely” azt az elsõ nukleotidszámot jelöli az adott cél25 szekvenciában, amelyhez az oligonukleotid kötõdik. Az elõnyös vegyületek az LNA-tartalmú vegyületek. A 3. táblázat alacsony IC50-értéket mutat négy vegyületre.
1. táblázat A találmány szerinti oligomer vegyületek Oligomer vegyületeket értékeltünk Survivin mRNS gátló képességükre 15PC3 sejtekben. Az adatokat a kontrollal transzfektált sejtekhez viszonyított százalékos gátlásként adtuk meg. Az átiratok állandósult állapotát valós idejû PCR alkalmazásával követtük és a GAPDH átirat állandósult állapotára normalizáltuk. Megjegyezzük, hogy az összes LNA C¹metil-citozin. Célhely
SEQ ID
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
172
2
GCAGTGGATGAAGCCA
198
206
214
3
4
5
GCCAAGTCTGGCTCGT
AACACTGGGCCAAGTC
GCAGAAGAAACACTGG
Seq ID+Terv
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=-O-P(O)2¹OKisbetûk: DNS cukor
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
44
2A
GSCSASGStSgSgSaStSgSaSaSGSCSCSA
85
2B
GSCSASGStSgSgSaStSgSaSaSGSCSCSa
91
2C
GOCOAOGOtSgSgSaStSgSaSaSGOCOCOA
2D
gScSaSgStSgSgSaStSgSaSaSgScScSa
3A
GSCSCSASaSgStScStSgSgScSTSCSGST
3B
GSCSCSASaSgStScStSgSgScSTSCSGSt
3C
GOCOCOAOaSgStScStSgSgScSTOCOGOT
3D
gScScSaSaSgStScStSgSgScStScSgSt
4A
ASASCSAScStSgSgSgScScSaSASGSTSC
74
4B
ASASCSAScStSgSgSgScScSaSASGSTSc
91
4C
AOAOCOAOcStSgSgSgScScSaSAOGOTOC
4D
aSaScSaScStSgSgSgScScSaSaSgStSc
5A
GSCSASGSaSaSgSaSaSaScSaSCSTSGSG
5B
GSCSASGSaSaSgSaSaSaScSaSCSTSGSg
5C
GOCOAOGOaSaSgSaSaSaScSaSCOTOGOG
32
49
67
HU 007 196 T2
1. táblázat (folytatás) Célhely
SEQ ID
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
Seq ID+Terv
5D 216
238
403
491
505
521
531
566
579
608
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
AAGCAGAAGAAACACT
CTCCCAGCCTTCCAGC
TTCTTTCTTCTTATTG
TGGGACCAGGCAGCTC
TGGTGCAGCCACTCTG
GAATAAACCCTGGAAG
TGGCACCAGGGAATAA
CTAAGACATTGCTAAG
TTGATCTCCTTTCCTA
GCACAGTTGAAACATC
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=-O-P(O)2¹OKisbetûk: DNS cukor
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
63
gScSaSgSaSaSgSaSaSaScSaScStSgSg
6A
ASASGSCSaSgSaSaSgSaSaSaSCSASCST
88
6B
ASASGSCSaSgSaSaSgSaSaSaSCSASCSt
79
6C
AOAOGOCOaSgSaSaSgSaSaSaSCOAOCOT
6D
aSaSgScSaSgSaSaSgSaSaSaScSaScSt
7A
CSTSCSCScSaSgScScStStScSCSASGSC
7B
CSTSCSCScSaSgScScStStScSCSASGSc
7C
COTOCOCOcSaSgScScStStScSCOAOGOC
7D
cStScScScSaSgScScStStScScSaSgSc
8A
TSTSCSTStStScStStScStStSASTSTSG
8B
TSTSCSTStStScStStScStStSASTSTSg
8C
TOTOCOTOtStScStStScStStSAOTOTOG
8D
tStScStStStScStStScStStSaStStSg
9A
TSGSGSGSaScScSaSgSgScSaSGSCSTSC
9B
TSGSGSGSaScScSaSgSgScSaSGSCSTSc
9C
TOGOGOGOaScScSaSgSgScSaSGOCOTOC
9D
tSgSgSgSaScScSaSgSgScSaSgScStSc
10A
TSGSGSTSgScSaSgScScSaScSTSCSTSG
10B
TSGSGSTSgScSaSgScScSaScSTSCSTSg
10C
TOGOGOTOgScSaSgScScSaScSTOCOTOG
10D
tSgSgStSgScSaSgScScSaScStScStSg
11A
GSASASTSaSaSaScScScStSgSGSASASG
11B
GSASASTSaSaSaScScScStSgSGSASASg
11C
GOAOAOTOaSaSaScScScStSgSGOAOAOG
11D
gSaSaStSaSaSaScScScStSgSgSaSaSg
12A
TSGSGSCSaScScSaSgSgSgSaSASTSASA
12B
TSGSGSCSaScScSaSgSgSgSaSASTSASa
12C
TOGOGOCOaScScSaSgSgSgSaSAOTOAOA
12D
tSgSgScSaScScSaSgSgSgSaSaStSaSa
13A
CSTSASASgSaScSaStStSgScSTSASASG
13B
CSTSASASgSaScSaStStSgScSTSASASg
13C
COTOAOAOgSaScSaStStSgScSTOAOAOG
13D
cStSaSaSgSaScSaStStSgScStSaSaSg
14A
TSTSGSAStScStScScStStStSCSCSTSA
14B
TSTSGSAStScStScScStStStSCSCSTSa
14C
TOTOGOAOtScStScScStStStSCOCOTOA
14D
tStSgSaStScStScScStStStScScStSaS
26
62
78
50
56
58
44
78
73
15A
GSCSASCSaSgStStSgSaSaSaSCSASTSC
96
93
15B
GSCSASCSaSgStStSgSaSaSaSCSASTSc
89
79
15C
GOCOAOCOaSgStStSgSaSaSaSCOAOTOC 83
78
15D
gScSaScSaSgStStSgSaSaSaScSaStSc
15E
GSCSAScSaSgStStSgSaSaSaSCSASTSc
33
HU 007 196 T2
1. táblázat (folytatás) Célhely
SEQ ID
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
Seq ID+Terv
1
16
GATTCAAATCTGGCGG
16A
GSASTSTScSaSaSaStScStSgSGSCSGSG
17
33
49
65
81
97
113
129
145
161
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
TGCCAACGGGTCCCGC
CCGCCGCCGCCACCTC
CGTCGGGGCACCCATG
GCCAGGCAGGGGGCAA
TCCTTGAGAAAGGGCT
TGTAGAGATGCGGTGG
AGGGCCAGTTCTTGAA
GCGCAGCCCTCCAAGA
CCGCTCCGGGGTGCAG
AGCCAGCCTCGGCCAT
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=-O-P(O)2¹OKisbetûk: DNS cukor
16B
GSASTSTScSaSaSaStScStSgSGSCSGSg
16C
GOAOTOTOcSaSaSaStScStSgSGOCOGOG
16D
gSaStStScSaSaSaStScStSgSgScSgSg
17A
TSGSCSCSaSaScSgSgSgStScSCSCSGSC
17B
TSGSCSCSaSaScSgSgSgStScSCSCSGSc
17C
TOGOCOCOaSaScSgSgSgStScSCOCOGOC
17D
tSgScScSaSaScSgSgSgStScScScSgSc
18A
CSCSGSCScSgScScSgScScSaSCSCSTSC
18B
CSCSGSCScSgScScSgScScSaSCSCSTSc
18C
COCOGOCOcSgScScSgScScSaSCOCOTOC
18D
cScSgScScSgScScSgScScSaScScStSc
19A
CSGSTSCSgSgSgSgScSaScScSCSASTSG
19B
CSGSTSCSgSgSgSgScSaScScSCSASTSg
19C
COGOTOCOgSgSgSgScSaScScSCOAOTOG
19D
cSgStScSgSgSgSgScSaScScScSaStSg
20A
GSCSCSASgSgScSaSgSgSgSgSGSCSASA
20B
GSCSCSASgSgScSaSgSgSgSgSGSCSASa
20C
GOCOCOAOgSgScSaSgSgSgSgSGOCOAOA
20D
gScScSaSgSgScSaSgSgSgSgSgScSaSa
21A
TSCSCSTStSgSaSgSaSaSaSgSGSGSCST
21B
TSCSCSTStSgSaSgSaSaSaSgSGSGSCSt
21C
TOCOCOTOtSgSaSgSaSaSaSgSGOGOCOT
21D
tScScStStSgSaSgSaSaSaSgSgSgScSt
22A
TSGSTSASgSaSgSaStSgScSgSGSTSGSG
22B
TSGSTSASgSaSgSaStSgScSgSGSTSGSg
22C
TOGOTOAOgSaSgSaStSgScSgSGOTOGOG
22D
tSgStSaSgSaSgSaStSgScSgSgStSgSg
23A
ASGSGSGScScSaSgStStScStSTSGSASA
23B
ASGSGSGScScSaSgStStScStSTSGSASa
23C
AOGOGOGOcScSaSgStStScStSTOGOAOA
23D
aSgSgSgScScSaSgStStScStStSgSaSa
24A
GSCSGSCSaSgScScScStScScSASASGSA
24B
GSCSGSCSaSgScScScStScScSASASGSa
24C
GOCOGOCOaSgScScScStScScSAOAOGOA
24D
gcSgScSaSgScScScStScScSaSaSgSa
25A
CSCSGSCStScScSgSgSgSgStSGSCSASG
25B
CSCSGSCStScScSgSgSgSgStSGSCSASg
25C
COCOGOCOtScScSgSgSgSgStSGOCOAOG
25D
cScSgScStScScSgSgSgSgStSgScSaSg
26A
ASGSCSCSaSgScScStScSgSgSCSCSAST
26B
ASGSCSCSaSgScScStScSgSgSCSCSASt
34
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
HU 007 196 T2
1. táblázat (folytatás) Célhely
177
193
209
225
241
257
273
289
305
321
SEQ ID
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
GTGGGGCAGTGGATGA
GTCTGGCTCGTTCTCA
AGAAACACTGGGCCAA
AGCTCCTTGAAGCAGA
TGGCTCCCAGCCTTCC
CTATGGGGTCGTCATC
TGCTTTTTATGTTCCT
AGCGCAACCGGACGAA
TCTTGACAGAAAGGAA
AATTCTTCAAACTGCT
Seq ID+Terv
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=-O-P(O)2¹OKisbetûk: DNS cukor
26C
AOGOCOCOaSgScScStScSgSgSCOCOAOT
26D
aSgScScSaSgScScStScSgSgScScSaSt
27A
GSTSGSGSgSgScSaSgStSgSgSASTSGSA
27B
GSTSGSGSgSgScSaSgStSgSgSASTSGSa
27C
GOTOGOGOgSgScSaSgStSgSgSAOTOGOA
27D
gStSgSgSgSgScSaSgStSgSgSaStSgSa
28A
GSTSCSTSgSgScStScSgStStSCSTSCSA
28B
GSTSCSTSgSgScStScSgStStSCSTSCSa
28C
GOTOCOTOgSgScStScSgStStSCOTOCOA
28D
gStScStSgSgScStScSgStStScStScSa
29A
ASGSASASaScSaScStSgSgSgSCSCSASA
29B
ASGSASASaScSaScStSgSgSgSCSCSASa
29C
AOGOAOAOaScSaScStSgSgSgSCOCOAOA
29D
aSgSaSaSaScSaScStSgSgSgScScSaSa
30A
ASGSCSTScScStStSgSaSaSgSCSASGSA
30B
ASGSCSTScScStStSgSaSaSgSCSASGSa
30C
AOGOCOTOcScStStSgSaSaSgSCOAOGOA
30D
aSgScStScScStStSgSaSaSgScSaSgSa
31A
TSGSGSCStScScScSaSgScScSTSTSCSC
31B
TSGSGSCStScScScSaSgScScSTSTSCSc
31C
TOGOGOCOtScScScSaSgScScSTOTOCOC
31D
tSgSgScStScScScSaSgScScStStScSc
32A
CSTSASTSgSgSgSgStScSgStSCSASTSC
32B
CSTSASTSgSgSgSgStScSgStSCSASTSc
32C
COTOAOTOgSgSgSgStScSgStSCOAOTOC
32D
cStSaStSgSgSgSgStScSgStScSaStSc
33A
TSGSCSTStStStStSaStSgStSTSCSCST
33B
TSGSCSTStStStStSaStSgStSTSCSCSt
33C
TOGOCOTOtStStStSaStSgStSTOCOCOT
33D
tSgScStStStStStSaStSgStStScScSt
34A
ASGSCSGScSaSaScScSgSgSaSCSGSASA
34B
ASGSCSGScSaSaScScSgSgSaSCSGSASa
34C
AOGOCOGOcSaSaScScSgSgSaSCOGOAOA
34D
aSgScSgScSaSaScScSgSgSaScSgSaSa
35A
TSCSTSTSgSaScSaSgSaSaSaSGSGSASA
35B
TSCSTSTSgSaScSaSgSaSaSaSGSGSASa
35C
TOCOTOTOgSaScSaSgSaSaSaSGOGOAOA
35D
tScStStSgSaScSaSgSaSaSaSgSgSaSa
36A
ASASTSTScStStScSaSaSaScSTSGSCST
36B
ASASTSTScStStScSaSaSaScSTSGSCSt
36C
AOAOTOTOcStStScSaSaSaScSTOGOCOT
36D
aSaStStScStStScSaSaSaScStSgScSt
35
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
HU 007 196 T2
1. táblázat (folytatás) Célhely
SEQ ID
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
Seq ID+Terv
337
37
AAATTCACCAAGGGTT
37A
ASASASTStScSaScScSaSaSGSGSGSTST
353
369
385
401
417
433
449
465
481
497
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
CTCTGTCCAGTTTCAA
TTGTTCTTGGCTCTTT
GGTTTCCTTTGCAATT
CTTTCTTCTTATTGTT
GCAGTTTCCTCAAATT
ACGGCGCACTTTCTTC
CCAGCTGCTCGATGGC
CCTCAATCCATGGCAG
CAGCTCCGGCCAGAGG
CCACTCTGGGACCAGG
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=-O-P(O)2¹OKisbetûk: DNS cukor
37B
ASASASTStScSaScScSaSaSGSGSGSTSt
37C
AOAOAOTOtScSaScScSaSaSGOGOGOTOT
37D
aSaSaStStScSaScScSaSaSgSgSgStSt
38A
CSTSCSTSgStScScSaSgStStSTSCSASA
38B
CSTSCSTSgStScScSaSgStStSTSCSASa
38C
COTOCOTOgStScScSaSgStStSTOCOAOA
38D
cStScStSgStScScSaSgStStStScSaSa
39A
TSTSGSTStScStStSgSgScStSCSTSTST
39B
TSTSGSTStScStStSgSgScStSCSTSTSt
39C
TOTOGOTOtScStStSgSgScStSCOTOTOT
39D
tStSgStStScStStSgSgScStScStStSt
40A
GSGSTSTStScScStStStSgScSASASTST
40B
GSGSTSTStScScStStStSgScSASASTSt
40C
GOGOTOTOtScScStStStSgScSAOAOTOT
40D
gSgStStStScScStStStSgScSaSaStSt
41A
CSTSTSTScStStScStStSaStSTSGSTST
41B
CSTSTSTScStStScStStSaStSTSGSTSt
41C
COTOTOTOcStStScStStSaStSTOGOTOT
41D
cStStStScStStScStStSaStStSgStSt
42A
GSCSASGStStStScScStScSaSASASTST
42B
GSCSASGStStStScScStScSaSASASTSt
42C
GOCOAOGOtStStScScStScSaSAOAOTOT
42D
gScSaSgStStStScScStScSaSaSaStSt
43A
ASCSGSGScSgScSaScStStStSCSTSTSC
43B
ASCSGSGScSgScSaScStStStSCSTSTSt
43C
AOCOGOGOcSgScSaScStStStSCOTOTOC
43D
aScSgSgScSgScSaScStStStScStStSc
44A
CSCSASGScStSgScStScSgSaSTSGSGSC
44B
CSCSASGScStSgScStScSgSaSTSGSGSt
44C
COCOAOGOcStSgScStScSgSaSTOGOGOC
44D
cScSaSgScStSgScStScSgSaStSgSgSc
45A
CSCSTSCSaSaStScScSaStSgSGSCSASG
45B
CSCSTSCSaSaStScScSaStSgSGSCSASg
45C
COCOTOCOaSaStScScSaStSgSGOCOAOG
45D
cScStScSaSaStScScSaStSgSgScSaSg
46A
CSASGSCStScScSgSgScScSaSGSASGSG
46B
CSASGSCStScScSgSgScScSaSGSASGSg
46C
COAOGOCOtScScSgSgScScSaSGOAOGOG
46D
cSaSgScStScScSgSgScScSaSgSaSgSg
47A
CSCSASCStScStSgSgSgSaScSCSASGSG
47B
CSCSASCStScStSgSgSgSaScSCSASGSg
36
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
HU 007 196 T2
1. táblázat (folytatás) Célhely
SEQ ID
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
Seq ID+Terv
47C 513
529
545
561
577
593
609
625
641
657
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
CCTGGAAGTGGTGCAG
GCACCAGGGAATAAAC
CACAGGAAGGCTGGTG
ACATTGCTAAGGGGCC
GATCTCCTTTCCTAAG
CTAATTTGAAAATGTT
AGCACAGTTGAAACAT
TTCAAGACAAAACAGG
CACCTCTGGTGCCACT
GCTGCACAGGCAGAAG
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=-O-P(O)2¹OKisbetûk: DNS cukor
COCOAOCOtScStSgSgSgSaScSCOAOGOG
47D
cScSaScStScStSgSgSgSaScScSaSgSg
48A
CSCSTSGSgSaSaSgStSgSgStSGSCSASG
48B
CSCSTSGSgSaSaSgStSgSgStSGSCSASg
48C
COCOTOGOgSaSaSgStSgSgStSGOCOAOG
48D
cScStSgSgSaSaSgStSgSgStSgScSaSg
49A
GSCSASCScSaSgSgSgSaSaStSASASASC
49B
GSCSASCScSaSgSgSgSaSaStSASASASc
49C
GOCOAOCOcSaSgSgSgSaSaStSAOAOAOC
49D
gScSaScScSaSgSgSgSaSaStSaSaSaSc
50A
CSASCSASgSgSaSaSgSgScStSGSGSTSG
50B
CSASCSASgSgSaSaSgSgScStSGSGSTSg
50C
COAOCOAOgSgSaSaSgSgScStSGOGOTOG
50D
cSaScSaSgSgSaSaSgSgScStSgSgStSg
51A
ASCSASTStSgScStSaSaSgSgSGSGSCSC
51B
ASCSASTStSgScStSaSaSgSgSGSGSCSc
51C
AOCOAOTOtSgScStSaSaSgSgSGOGOCOC
51D
aScSaStStSgScStSaSaSgSgSgSgScSc
52A
GSASTSCStScScStStStScScSTSASASG
52B
GSASTSCStScScStStStScScSTSASASg
52C
GOAOTOCOtScScStStStScScSTOAOAOG
52D
gSaStScStScScStStStScScStSaSaSg
53A
CSTSASAStStStSgSaSaSaSaSTSGSTST
53B
CSTSASAStStStSgSaSaSaSaSTSGSTSt
53C
COTOAOAOtStStSgSaSaSaSaSTOGOTOT
53D
cStSaSAaStStStSgSaSaSaSaStSgStSt
54A
ASGSCSAScSaSgStStSgSaSaSASCSAST
54B
ASGSCSAScSaSgStStSgSaSaSASCSASt
54C
AOGOCOAOcSaSgStStSgSaSaSAOCOAOT
54D
aSgScSaScSaSgStStSgSaSaSaScSaSt
55A
TSTSCSASaSgSaScSaSaSaSaSCSASGSG
55B
TSTSCSASaSgSaScSaSaSaSaSCSASGSg
55C
TOTOCOAOaSgSaScSaSaSaSaSCOAOGOG
55D
tStScSaSaSgSaScSaSaSaSaScSaSgSg
56A
CSASCSCStScStSgSgStSgScSCSASCST
56B
CSASCSCStScStSgSgStSgScSCSASCSt
56C
COAOCOCOtScStSgSgStSgScSCOAOCOT
56D
cSaScScStScStSgSgStSgScScSaScSt
57A
GSCSTSGScSaScSaSgSgScSaSGSASASG
57B
GSCSTSGScSaScSaSgSgScSaSGSASASg
57C
GOCOTOGOcSaScSaSgSgScSaSGOAOAOG
57D
gScStSgScSaScSaSgSgScSaSgSaSaSg
37
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
HU 007 196 T2
1. táblázat (folytatás) Célhely
SEQ ID
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
Seq ID+Terv
673
58
GTTACCAGCAGCACCC
58A
689
705
721
737
753
769
785
801
817
833
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
GAGAGAAGCAGCCACT
AAAAAAGAGAGAGAGA
GCAAAAATGAGCCCCC
CCCGGGAATCAAAACA
CTTCTCACCTGGTAAG
CCTTCTTCCTCCCTCA
AGCAAAAGGGACACTG
CAAAGCTGTCAGCTCT
GCTCTGCCCACGCGAA
ACATTCACTGTGGAAG
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=-O-P(O)2¹OKisbetûk: DNS cukor
GSTSTSAScScSaSgScSaSgScSASCSCSC
58B
GSTSTSAScScSaSgScSaSgScSASCSCSc
58C
GOTOTOAOcScSaSgScSaSgScSAOCOCOC
58D
gStStSaScScSaSgScSaSgScSaScScSc
59A
GSASGSASgSaSaSgScSaSgScSCSASCST
59B
GSASGSASgSaSaSgScSaSgScSCSASCSt
59C
GOAOGOAOgSaSaSgScSaSgScSCOAOCOT
59D
gSaSgSaSgSaSaSgScSaSgScScSaScSt
60A
ASASASASaSaSgSaSgSaSgSaSGSASGSA
60B
ASASASASaSaSgSaSgSaSgSaSGSASGSa
60C
AOAOAOAOaSaSgSaSgSaSgSaSGOAOGOA
60D
aSaSaSaSaSaSgSaSgSaSgSaSgSaSgSa
61A
GSCSASASaSaSaStSgSaSgScSCSCSCSC
61B
GSCSASASaSaSaStSgSaSgScSCSCSCSc
61C
GOCOAOAOaSaSaStSgSaSgScSCOCOCOC
61D
gScSaSAaSaSaSaStSgSaSgScScScScSc
62A
CSCSCSGSgSgSaSaStScSaSaSASASCSA
62B
CSCSCSGSgSgSaSaStScSaSaSASASCSa
62C
COCOCOGOgSgSaSaStScSaSaSAOAOCOA
62D
cScScSgSgSgSaSaStScSaSaSaSaScSa
63A
CSTSTSCStScSaScScStSgSgSTSASASG
63B
CSTSTSCStScSaScScStSgSgSTSASASg
63C
COTOTOCOtScSaScScStSgSgSTOAOAOG
63D
cStStScStScSaScScStSgSgStSaSaSg
64A
CSCSTSTScStStScScStScScSCSTSCSA
64B
CSCSTSTScStStScScStScScSCSTSCSa
64C
COCOTOTOcStStScScStScScSCOTOCOA
64D
cScStStScStStScScStScScScStScSa
65A
ASGSCSASaSaSaSgSgSgSaScSASCSTSG
65B
ASGSCSASaSaSaSgSgSgSaScSASCSTSg
65C
AOGOCOAOaSaSaSgSgSgSaScSAOCOTOG
65D
aSgScSaSaSaSaSgSgSgSaScSaScStSg
66A
CSASASASgScStSgStScSaSgSCSTSCST
66B
CSASASASgScStSgStScSaSgSCSTSCSt
66C
COAOAOAOgScStSgStScSaSgSCOTOCOT
66D
cSaSaSaSgScStSgStScSaSgScStScSt
67A
GSCSTSCStSgScScScSaScSgSCSGSASA
67B
GSCSTSCStSgScScScSaScSgSCSGSASa
67C
GOCOTOCOtSgScScScSaScSgSCOGOAOA
67D
gScStScStSgScScScSaScSgScSgSaSa
68A
ASCSASTStScSaScStSgStSgSGSASASG
68B
ASCSASTStScSaScStSgStSgSGSASASg
38
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
HU 007 196 T2
1. táblázat (folytatás) Célhely
SEQ ID
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
Seq ID+Terv
68C 849
865
881
897
913
929
945
961
977
993
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
AACATGAGGTCCAGAC
CTGTGACAGCCTCAAC
AAGTCCACACTCAGGA
TCAACAGGCACCTGCC
AACCTGCAGCTCAGAT
GGTGTGACAGATAAGG
CCTCTGAGGAGGCACA
ACAACAAAAAAACTGT
AAAACAAAAAAACACA
CATCTACCAAAAAAAA
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=-O-P(O)2¹OKisbetûk: DNS cukor
AOCOAOTOtScSaScStSgStSgSGOAOAOG
68D
aScSaStStScSaScStSgStSgSgSaSaSg
69A
ASASCSAStSgSaSgSgStScScSASGSASC
69B
ASASCSAStSgSaSgSgStScScSASGSASc
69C
AOAOCOAOtSgSaSgSgStScScSAOGOAOC
69D
aSaScSaStSgSaSgSgStScScSaSgSaSc
70A
CSTSGSTSgSaScSaSgScScStSCSASASC
70B
CSTSGSTSgSaScSaSgScScStSCSASASc
70C
COTOGOTOgSaScSaSgScScStSCOAOAOC
70D
cStSgStSgSaScSaSgScScStScSaSaSc
71A
ASASGSTScScSaScSaScStScSASGSGSA
71B
ASASGSTScScSaScSaScStScSASGSGSa
71C
AOAOGOTOcScSaScSaScStScSAOGOGOA
71D
aSaSgStScScSaScSaScStScSaSgSgSa
72A
TSCSASAScSaSgSgScSaScScSTSGSCSC
72B
TSCSASAScSaSgSgScSaScScSTSGSCSc
72C
TOCOAOAOcSaSgSgScSaScScSTOGOCOC
72D
tScSaSaScSaSgSgScSaScScStSgScSc
73A
ASASCSCStSgScSaSgScStScSASGSAST
73B
ASASCSCStSgScSaSgScStScSASGSASt
73C
AOAOCOCOtSgScSaSgScStScSAOGOAOT
73D
aSaScScStSgScSaSgScStScSaSgSaSt
74A
GSGSTSGStSgSaScSaSgSaStSASASGSG
74B
GSGSTSGStSgSaScSaSgSaStSASASGSg
74C
GOGOTOGOtSgSaScSaSgSaStSAOAOGOG
74D
gSgStSgStSgSaScSaSgSaStSaSaSgSg
75A
CSCSTSCStSgSaSgSgSaSgSgSCSASCSA
75B
CSCSTSCStSgSaSgSgSaSgSgSCSASCSa
75C
COCOTOCOtSgSaSgSgSaSgSgSCOAOCOA
75D
cScStScStSgSaSgSgSaSgSgScSaScSa
76A
ASCSASAScSaSaSaSaSaSaSaSCSTSGST
76B
ASCSASAScSaSaSaSaSaSaSaSCSTSGSt
76C
AOCOAOAOcSaSaSaSaSaSaSaSCOTOGOT
76D
aScSaSaScSaSaSaSaSaSaSaScStSgSt
77A
ASASASAScSaSaSaSaSaSaSaSCSASCSA
77B
ASASASAScSaSaSaSaSaSaSaSCSASCSa
77C
AOAOAOAOcSaSaSaSaSaSaSaSCOAOCOA
77D
aSaSaSaScSaSaSaSaSaSaSaScSaScSa
78A
CSASTSCStSaScScSaSaSaSaSASASASA
78B
CSASTSCStSaScScSaSaSaSaSASASASa
78C
COAOTOCOtSaScScSaSaSaSaSAOAOAOA
78D
cSaStScStSaScScSaSaSaSaSaSaSaSa
39
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
HU 007 196 T2
1. táblázat (folytatás) Célhely
SEQ ID
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
Seq ID+Terv
1009
79
TCACACACAAGTCATG
79A
TSCSASCSaScSaScSaSaSgStSCSASTSG
1025
1041
1057
1073
1089
1105
1121
1137
1153
1169
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
TGTCTCCATTCTCTCA
GAGGAGCCAGGGACTC
ATGTTGTTAAACAGTA
ACAAAATAAGAAAGCC
TGAATTAACAATTCAA
AGTTTGTGCTATTCTG
GCTTAGTTTTAATTGT
CTTAGAATGGCTTTGT
CCCGTTTCCCCAATGA
TCCACCTGAAGTTCAC
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=-O-P(O)2¹OKisbetûk: DNS cukor
79B
TSCSASCSaScSaScSaSaSgStSCSASTSg
79C
TOCOAOCOaScSaScSaSaSgStSCOAOTOG
79D
tScSaScSaScSaScSaSaSgStScSaStSg
80A
TSGSTSCStScScSaStStScStSCSTSCSA
80B
TSGSTSCStScScSaStStScStSCSTSCSa
80C
TOGOTOCOtScScSaStStScStSCOTOCOA
80D
tSgStScStScScSaStStScStScStScSa
81A
GSASGSGSaSgScScSaSgSgSgSASCSTSC
81B
GSASGSGSaSgScScSaSgSgSgSASCSTSc
81C
GOAOGOGOaSgScScSaSgSgSgSAOCOTOC
81D
gSaSgSgSaSgScScSaSgSgSgSaScStSc
82A
ASTSGSTStSgStStSaSaSaScSASGSTSA
82B
ASTSGSTStSgStStSaSaSaScSASGSTSa
82C
AOTOGOTOtSgStStSaSaSaScSAOGOTOA
82D
aStSgStStSgStStSaSaSaScSaSgStSa
83A
ASCSASASaSaStSaSaSgSaSaSASGSCSC
83B
ASCSASASaSaStSaSaSgSaSaSASGSCSc
83C
AOCOAOAOaSaStSaSaSgSaSaSAOGOCOC
83D
aScSaSaSaSaStSaSaSgSaSaSaSgScSc
84A
TSGSASAStStSaSaScSaSaStSTSCSASA
84B
TSGSASAStStSaSaScSaSaStSTSCSASa
84C
TOGOAOAOtStSaSaScSaSaStSTOCOAOA
84D
tSgSaSaStStSaSaScSaSaStStScSaSa
85A
ASGSTSTStSgStSgScStSaStSTSCSTSG
85B
ASGSTSTStSgStSgScStSaStSTSCSTSg
85C
AOGOTOTOtSgStSgScStSaStSTOCOTOG
85D
aSgStStStSgStSgScStSaStStScStSg
86A
GSCSTSTSaSgStStStStSaSaSTSTSGST
86B
GSCSTSTSaSgStStStStSaSaSTSTSGSt
86C
GOCOTOTOaSgStStStStSaSaSTOTOGOT
86D
gScStStSaSgStStStStSaSaStStSgSt
87A
CSTSTSASgSaSaStSgSgScStSTSTSGST
87B
CSTSTSASgSaSaStSgSgScStSTSTSGSt
87C
COTOTOAOgSaSaStSgSgScStSTOTOGOT
87D
cStStSaSgSaSaStSgSgScStStStSgSt
88A
CSCSCSGStStStScScScScSaSASTSGSA
88B
CSCSCSGStStStScScScScSaSASTSGSa
88C
COCOCOGOtStStScScScScSaSAOTOGOA
88D
cScScSgStStStScScScScSaSaStSgSa
89A
TSCSCSAScScStSgSaSaSgStSTSCSASC
89B
TSCSCSAScScStSgSaSaSgStSTSCSASc
40
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
HU 007 196 T2
1. táblázat (folytatás) Célhely
SEQ ID
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
Seq ID+Terv
89C 1185
1201
1217
1233
1249
1265
1281
1297
1313
1329
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
CTATTCTGTCTCCTCA
GACGCTTCCTATCACT
AAAGGAGTATCTGCCA
TCACACAGCAGTGGCA
CACTGGGCCTGTCTAA
CATGTGCCCCGCGGCT
AGGGAGGAGCGGCCAG
CCACTGCCTTTTTCTG
TTAAAAAGGATTTAGG
CATCGAGCCAAGTCAT
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=-O-P(O)2¹OKisbetûk: DNS cukor
TOCOCOAOcScStSgSaSaSgStSTOCOAOC
89D
tScScSaScScStSgSaSaSgStStScSaSc
90A
CSTSASTStScStSgStScStScSCSTSCSA
90B
CSTSASTStScStSgStScStScSCSTSCSa
90C
COTOAOTOtScStSgStScStScSCOTOCOA
90D
cStSaStStScStSgStScStScScStScSa
91A
GSASCSGScStStScScStSaStSCSASCST
91B
GSASCSGScStStScScStSaStSCSASCSt
91C
GOAOCOGOcStStScScStSaStSCOAOCOT
91D
gSaScSgScStStScScStSaStScSaScSt
92A
ASASASGSgSaSgStSaStScStSGSCSCSA
92B
ASASASGSgSaSgStSaStScStSGSCSCSa
92C
AOAOAOGOgSaSgStSaStScStSGOCOCOA
92D
aSaSaSgSgSaSgStSaStScStSgScScSa
93A
TSCSASCSaScSaSgScSaSgStSGSGSCSA
93B
TSCSASCSaScSaSgScSaSgStSGSGSCSa
93C
TOCOAOCOaScSaSgScSaSgStSGOGOCOA
93D
tScSaScSaScSaSgScSaSgStSgSgScSa
94A
CSASCSTSgSgSgScScStSgStSCSTSASA
94B
CSASCSTSgSgSgScScStSgStSCSTSASa
94C
COAOCOTOgSgSgScScStSgStSCOTOAOA
94D
cSaScStSgSgSgScScStSgStScStSaSa
95A
CSASTSGStSgScScScScSgScSGSGSCST
95B
CSASTSGStSgScScScScSgScSGSGSCSt
95C
COAOTOGOtSgScScScScSgScSGOGOCOT
950
cSaStSgStSgScScScScSgScSgSgScSt
96A
ASGSGSGSaSgSgSaSgScSgSgSCSCSASG
96B
ASGSGSGSaSgSgSaSgScSgSgSCSCSASg
96C
AOGOGOGOaSgSgSaSgScSgSgSCOCOAOG
96D
aSgSgSgSaSgSgSaSgScSgSgScScSaSg
97A
CSCSASCStSgScScStStStStSTSCSTSG
97B
CSCSASCStSgScScStStStStSTSCSTSg
97C
COCOAOCOtSgScScStStStStSTOCOTOG
97D
cScSaScStSgScScStStStStStScStSg
98A
TSTSASASaSaSaSgSgSaStStSTSASGSG
98B
TSTSASASaSaSaSgSgSaStStSTSASGSg
98C
TOTOAOAOaSaSaSgSgSaStStSTOAOGOG
98D
tStSaSaSaSaSaSgSgSaStStStSaSgSg
99A
CSASTSCSgSaSgScScSaSaSgSTSCSAST
99B
CSASTSCSgSaSgScScSaSaSgSTSCSASt
99C
COAOTOCOgSaSgScScSaSaSgSTOCOAOT
99D
cSaStScSgSaSgScScSaSaSgStScSaSt
41
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
HU 007 196 T2
1. táblázat (folytatás) Célhely
SEQ ID
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
Seq ID+Terv
1345
100
AGCCAGTCCCCCACAG
100A
ASGSCSCSaSgStScScScScScSASCSASG
1361
1377
1393
1409
1425
1441
1457
1473
1489
1505
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
CGGCCTGCAGCAGCCC
TGGGCTGACAGACACA
TGACAGATGTGAAGGT
CCCCGTGTGGAGAACG
GCGGACTGCGTCTCTC
GAAAGCGGGGACCTGG
AGCTGCTGCCTCCAAA
ACTTCAGCCCTGCGGG
CATCATCTTACGCCAG
GAGGGCGAATCAAATC
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=-O-P(O)2¹OKisbetûk: DNS cukor
100B
ASGSCSCSaSgStScScScScScSASCSASg
100C
AOGOCOCOaSgStScScScScScSAOCOAOG
100D
aSgScScSaSgStScScScScScSaScSaSg
101A
CSGSGSCScStSgScSaSgScSaSGSCSCSC
101B
CSGSGSCScStSgScSaSgScSaSGSCSCSc
101C
COGOGOCOcStSgScSaSgScSaSGOCOCOC
101D
cSgSgScScStSgScSaSgScSaSgScScSc
102A
TSGSGSGScStSgSaScSaSgSaSCSASCSA
102B
TSGSGSGScStSgSaScSaSgSaSCSASCSa
102C
TOGOGOGOcStSgSaScSaSgSaSCOAOCOA
102D
tSgSgSgScStSgSaScSaSgSaScSaScSa
103A
TSGSASCSaSgSaStSgStSgSaSASGSGST
103B
TSGSASCSaSgSaStSgStSgSaSASGSGSt
103C
TOGOAOCOaSgSaStSgStSgSaSAOGOGOT
103D
tSgSaScSaSgSaStSgStSgSaSaSgSgSt
104A
CSCSCSCSgStSgStSgSgSaSgSASASCSG
104B
CSCSCSCSgStSgStSgSgSaSgSASASCSg
104C
COCOCOCOgStSgStSgSgSaSgSAOAOCOG
104D
cScScScSgStSgStSgSgSaSgSaSaScSg
105A
GSCSGSGSaScStSgScSgStScSTSCSTSC
105B
GSCSGSGSaScStSgScSgStScSTSCSTSc
105C
GOCOGOGOaScStSgScSgStScSTOCOTOC
105D
gScSgSgSaScStSgScSgStScStScStSc
106A
GSASASASgScSgSgSgSgSaScSCSTSGSG
106B
GSASASASgScSgSgSgSgSaScSCSTSGSg
106C
GOAOAOAOgScSgSgSgSgSaScSCOTOGOG
106D
gSaSaSaSgScSgSgSgSgSaScScStSgSg
107A
ASGSCSTSgScStSgScScStScSCSASASA
107B
ASGSCSTSgScStSgScScStScSCSASASa
107C
AOGOCOTOgScStSgScScStScSCOAOAOA
107D
aSgScStSgScStSgScScStScScSaSaSa
108A
ASCSTSTScSaSgScScScStSgSCSGSGSG
108B
ASCSTSTScSaSgScScScStSgSCSGSGSg
108C
AOCOTOTOcSaSgScScScStSgSCOGOGOG
108D
aScStStScSaSgScScScStSgScSgSgSg
109A
CSASTSCSaStScStStSaScSgSCSCSASG
109B
CSASTSCSaStScStStSaScSgSCSCSASg
109C
COAOTOCOaStScStStSaScSgSCOCOAOG
109D
cSaStScSaStScStStSaScSgScScSaSg
110A
GSASGSGSgScSgSaSaStScSaSASASTSC
110B
GSASGSGSgScSgSaSaStScSaSASASTSc
42
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
HU 007 196 T2
1. táblázat (folytatás) Célhely
1521
1537
1553
1569
1585
1601
SEQ ID
111
112
113
114
115
116
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
GCTCTATGACAGGGAG
AACAATCCACCCTGCA
TTTCCAGCGAAGCTGT
AGATGACCTCCAGAGG
TTCTCAGGAACAGCCG
ATGACAGGCTTTTTAT
Seq ID+Terv
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=-O-P(O)2¹OKisbetûk: DNS cukor
110C
GOAOGOGOgScSgSaSaStScSaSAOAOTOC
110D
gSaSgSgSgScSgSaSaStScSaSaSaStSc
111A
GSCSTSCStSaStSgSaScSaSgSGSGSASG
111B
GSCSTSCStSaStSgSaScSaSgSGSGSASg
111C
GOCOTOCOtSaStSgSaScSaSgSGOGOAOG
111D
gScStScStSaStSgSaScSaSgSgSgSaSg
112A
ASASCSASaStScScSaScScScSTSGSCSA
112B
ASASCSASaStScScSaScScScSTSGSCSa
112C
AOAOCOAOaStScScSaScScScSTOGOCOA
112D
aSaScSaSaStScScSaScScScStSgScSa
113A
TSTSTSCScSaSgScSgSaSaSgSCSTSGST
113B
TSTSTSCScSaSgScSgSaSaSgSCSTSGSt
113C
TOTOTOCOcSaSgScSgSaSaSgSCOTOGOT
113D
tStStScScSaSgScSgSaSaSgScStSgSt
114A
ASGSASTSgSaScScStScScSaSGSASGSG
114B
ASGSASTSgSaScScStScScSaSGSASGSg
114C
AOGOAOTOgSaScScStScScSaSGOAOGOG
114D
aSgSaStSgSaScScStScScSaSgSaSgSg
115A
TSTSCSTScSaSgSgSaSaScSaSGSCSCSG
115B
TSTSCSTScSaSgSgSaSaScSaSGSCSCSg
115C
TOTOCOTOcSaSgSgSaSaScSaSGOCOCOG
115D
tStScStScSaSgSgSaSaScSaSgScScSg
116A
ASTSGSAScSaSgSgScStStStSTSTSAST
116B
ASTSGSAScSaSgSgScStStStSTSTSASt
116C
AOTOGOAOcSaSgSgScStStStSTOTOAOT
116D
aStSgSaScSaSgSgScStStStStStSaSt
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
2. táblázat A találmány szerinti oligomer vegyületek Oligomer vegyületeket értékeltünk survivin mRNS-gátló képességükre 15PC3 sejtekben. Az adatokat a kontrollal transzfektált sejtekhez viszonyított százalékos gátlásként adtuk meg. Az átiratok állandósult állapotát valós idejû PCR alkalmazásával követtük és a GAPDH átirat állandósult állapotára normalizáltuk. Megjegyezzük, hogy az összes LNA C¹metil-citozin. Célhely
SEQ ID
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
Seq ID+Terv
62(c)
117
AGGCAGGGGGCAACGT
117A
A s G s G s C s a s g s g s gs gs gs c s as A s C s G s T
119(c)
118
CCAAGAAGGGCCAGTT
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=–O–P(O)2–O– Kisbetûk: DNS-cukor
117B
A s G s G s C s a s g s g s gs gs gs c s as A s C s G s t
117C
AOGOGOCOasgsgsgsgsgscsasAOCOGOT
117D
asgsgscsasgsgsgsgsgscsasascsgst
118A
CsCsAsAsgsasasgsgsgscscsAsGsTsT
118B
C s C s A s A s gs as as gs gs gs c s c s A s G s T s t
43
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
<20
<20
87
33
HU 007 196 T2
2. táblázat (folytatás) Célhely
SEQ ID
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
Seq ID+Terv
118C 190(c)
193(c)
194(e)
168(c)
215(c)
261(c)
286(c)
267(c)
325(c)
353(c)
375(c)
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
TGGCTCGTTCTCAGTG
GTCTGGCTCGTTCTCA
AGTCTGGCTCGTTCTC
TGGATGAAGCCAGCCT
AGCAGAAGAAACACTG
TCCTCTATGGGGTCGT
GCAACCGGACGAATGC
TTATGTTCCTCTATGG
GGTTAATTCTTCAAAC
CTCTGTCCAGTTTCAA
GCAATTTTGTTCTTGG
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=–O–P(O)2–O– Kisbetûk: DNS-cukor
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
79
27
84
47
75
49
67
41
85
26
23
<20
64
<20
53
<20
17
<20
60
COCOAOAOgsasasgsgsgscscsAOGOTOT
118D
cscsasasgsasasgsgsgscscsasgstst
119A
TsGsGsCstscsgststscstscsAsGsTsG
119B
TsGsGsCstscsgststscstscsAsGsTsg
119C
TOGOGOCOtscsgststscstscsAOGOTOG
119D
tsgsgscstscsgststscstscsasgstsg
120A
GsTsCsTsgsgscstscsgststsCsTsCsA
120B
GsTsCsTsgsgscstscsgststsCsTsCsa
120C
GOTOCOTOgsgscstscsgststsCOTOCOA
112D
gstscstsgsgscstscsgststscstscsa
121A
AsGsTsCstsgsgscstscsgstsTsCsTsC
121B
AsGsTsCstsgsgscstscsgstsTsCsTsc
121C
AOGOTOCOtsgsgscstscsgstsTOCOTOC
121D
asgstscstsgsgscstscsgststscstsc
122A
TsGsGsAstsgsasasgscscsasGsCsCsT
122B
TsGsGsAstsgsasasgscscsasGsCsCst
122C
TOGOGOAOtsgsasasgscscsasGOCOCOT
122D
tsgsgsastsgsasasgscscsasgscscst
123A
AsGsCsAsgsasasgsasasascsAsCsTsG
123B
AsGsCsAsgsasasgsasasascsAsCsTsg
123C
AOGOCOAOgsasasgsasasascsAOCOTOG
123D
asgscsasgsasasgsasasascsascstsg
124A
TsCsCsTscstsastsgsgsgsgsTsCsGsT
124B
TsCsCsTscstsastsgsgsgsgsTsCsGst
124C
TOCOCOTOcstsastsgsgsgsgsTOCOGOT
124D
tscscstscstsastsgsgsgsgstscsgst
125A
GsCsAsAscscsgsgsascsgsasAsTsGsC
125B
GsCsAsAscscsgsgsascsgsasAsTsGsc
125C
GOCOAOAOcscsgsgsascsgsasAOTOGOC
125D
gscsasascscsgsgsascsgsasastsgsc
126A
TsTsAsTsgststscscstscstsAsTsGsG
126B
TsTsAsTsgststscscstscstsAsTsGsg
126C
TOTOAOTOgststscscstscstsAOTOGOG
126D
tstsastsgststscscstscstsastsgsg
127A
GsGsTsTsasaststscststscsAsAsAsC
127B
GsGsTsTsasaststscststscsAsAsAsc
127C
GOGOTOTOasaststscststscsAOAOAOC
127D
gsgststsasaststscststscsasasasc
128A
CsTsCsTsgstscscsasgststsTsCsAsA
76
128B
CsTsCsTsgstscscsasgststsTsCsAsa
77
128C
COTOCOTOgstscscsasgststsTOCOAOA
128D
cstscstsgstscscsasgstststscsasa
129A
GsCsAsAststststsgststscsTsTsGsG
44
73
49
HU 007 196 T2
2. táblázat (folytatás) Célhely
SEQ ID
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
Seq ID+Terv
129B
464(c)
159(c)
350(c)
351(c)
47(c)
456(c)
470(c)
55(c)
66(c)
130
131
132
133
134
135
136
137
138
CTCAATCCATGGCAGC
CCAGCCTCGGCCATCC
TGTCCAGTTTCAAAAA
CTGTCCAGTTTCAAAA
TCGGGGCACCCATGCC
ATGGCAGCCAGCTGCT
AGAGGCCTCAATCCAT
GGGCAACGTCGGGGCA
TGCCAGGCAGGGGGCA
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=–O–P(O)2–O– Kisbetûk: DNS-cukor
129C
GOCOAOAOtstststsgststscsTOTOGOG
129D
gscsasaststststsgststscststsgsg
130A
CsTsCsAsastscscsastsgsgsCsAsGsC
130B
CsTsCsAsastscscsastsgsgsCsAsGsc
CCGGGGTGCAGGCGCA
77
40
29
130C
COTOCOAOastscscsastsgsgsCOAOGOC
130D
cstscsasastscscsastsgsgscsasgsc
131A
CsCsAsGscscstscsgsgscscsAsTsCsC
80
131B
CsCsAsGscscstscsgsgscscsAsTsCsc
94
131C
COCOAOGOcscstscsgsgscscsAOTOCOC
131D
cscsasgscscstscsgsgscscsastscsc
132A
TsGsTsCscsasgstststscsasAsAsAsA
132B
TsGsTsCscsasgstststscsasAsAsAsa
132C
TOGOTOCOcsasgstststscsasAOAOAOA
132D
tsgstscscsasgstststscsasasasasa
133A
CsTsGsTscscsasgstststscsAsAsAsA
133B
CsTsGsTscscsasgstststscsAsAsAsa
133C
COTOGOTOcscsasgstststscsAOAOAOA
133D
cstsgstscscsasgstststscsasasasa
134A
TSCSGSGSgSgScSaScScScSaSTSGSCSC
134B
TSCSGSGSgSgScSaScScScSaSTSGSCSc
134C
TOCOGOGOgSgScSaScScScSaSTOGOCOC
134D
tScSgSgSgSgScSaScScScSaStSgScSc
135A
ASTSGSGScSaSgScScSaSgScSTSGSCST
135B
ASTSGSGScSaSgScScSaSgScSTSGSCSt
135C
AOTOGOGOcSaSgScScSaSgScSTOGOCOT
135D
aStSgSgScSaSgScScSaSgScStSgScSt
136A
ASGSASGSgScScStScSaSaStSCSCSAST
136B
ASGSASGSgScScStScSaSaStSCSCSASt
136C
AOGOAOGOgScScStScSaSaStSCOCOAOT
136D
aSgSaSgSgScScStScSaSaStScScSaSt
137A
GSGSGSCSaSaScSgStScSgSgSGSGSCSA
137B
GSGSGSCSaSaScSgStScSgSgSGSGSCSa
137C
GOGOGOCOaSaScSgStScSgSgSGOGOCOA
137D
gSgSgScSaSaScSgStScSgSgSgSgScSa
138A
TSGSCSCSaSgSgScSaSgSgSgSGSGSCSA
138C 139
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
GsCsAsAststststsgststscsTsTsGsg
138B
140(c)
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
TSGSCSCSaSgSgScSaSgSgSgSGSGSCSA
138D
tSgScScSaSgSgScSaSgSgSgSgSgScSa
139A
CSCSGSGSgSgStSgScSaSgSgSCSGSCSA
139B
CSCSGSGSgSgStSgScSaSgSgSCSGSCSa
139C
COCOGOGOgSgStSgScSaSgSgSCOGOCOA
139D
cScSgSgSgSgStSgScSaSgSgScSgScSa
45
<20
<20
<20
<20
1
HU 007 196 T2
2
2. táblázat (folytatás) Célhely
SEQ ID
Oligomer vegyületek szekvenciája 5’¹3’
Seq ID+Terv
148(c)
140
CATCCGCTCCGGGGTG
140A
CSASTSCScSgScStScScSgSgSGSGSTSG
177(c)
141
260(c)
142
274(c)
143
384(c)
144
ISIS 23722
145
GTGGGGCAGTGGATGA
CCTCTATGGGGTCGTC
ATGCTTTTTATGTTCC
GTTTCCTTTGCAATTT
TGTGCTATTCTGTGAATT (18-mer)
146
Oligomer vegyület egyedi kialakítása Nagybetûk: b¹D-oxi-LNA S=foszfortioát O=–O–P(O)2–O– Kisbetûk: DNS-cukor
140B
CSASTSCScSgScStScScSgSgSGSGSTSg
140C
COAOTOCOcSgScStScScSgSgSGOGOTOG
140D
cSaStScScSgScStScScSgSgSgSgStSg
141A
GSTSGSGSgSgScSaSgStSgSgSASTSGSA
141B
GSTSGSGSgSgScSaSgStSgSgSASTSGSa
141C
GOTOGOGOgSgScSaSgStSgSgSAOTOGOA
141D
gStSgSgSgSgScSaSgStSgSgSaStSgSa
142A
CSCSTSCStSaStSgSgSgSgStSCSGSTSC
142B
CSCSTSCStSaStSgSgSgSgStSCSGSTSt
142C
COCOTOCOtSaStSgSgSgSgStSCOGOTOC
142D
cScStScStSaStSgSgSgSgStScSgStSc
143A
ASTSGSCStStStStStSaStSgSTSTSCSC
143B
ASTSGSCStStStStStSaStSgSTSTSCSt
143C
AOTOGOCOtStStStStSaStSgSTOTOCOC
143D
aStSgScStStStStStSaStSgStStScSc
144A
GSTSTSTScScStStStSgScSaSASTSTST
144B
GSTSTSTScScStStStSgScSaSASTSTSt
144C
GOTOTOTOcScStStStSgScSaSAOTOTOT
144D
gStStStScScStStStSgScSaSaStStSt
145A
TsGsTsGscstsaststscstsgstsgsAsAsTsT
145C
TOGOTOGscstsaststscstsgstsgsAOAOTOT
145D
tsgstsgscstsaststscstsgstsgsasastst
145F
TsGsTsGscstsaststscstsgstsgsAsAsTsT
146A
TsAsAsGscstsgststscstsastsgsTsGsTsT*
146C
TOAOAOGscstsgststscstsastsgsTOGOTOT*
146F
TsAsAsGscstsgststscstsastsgsTsGsTsT*
%¹os gátlás 25 nM oligo esetén
%¹os gátlás 5 nM oligo esetén
* jelentése, hogy az aláhúzott vegyület hibás párosodást mutat a fenti vegyülettel. A 145F és 146F vegyület a MOE-kémiát tartalmazza dõlt nagybetûkkel, amely az ISIS23722 vegyület.
3. táblázat LNA- (b-D-oxi-LNA) tartalmú oligomerek IC50 (nM) értékei két különbözõ eredetû sejtvonalban
Seq ID/terv
4B
Oligomer vegyületeket értékeltünk survivin mRNS-gátló képességükre 15PC3 és MCF7 sejtekben. Az átira- 50 tok állandósult állapotát valós idejû PCR alkalmazásával követtük és a GAPDH átirat állandósult állapotára normalizáltuk. Seq ID/terv
MCF7
2A
28
15PC3
MCF7
55
6A
15PC3
5 8
6B
3 <5
9A-
11
3
15A
1
<1
15B
<1
15E
1
5
118A
<5
2B
<5
120A
<25
4A
<5
123A
<5
60 46
1
HU 007 196 T2
3. táblázat (folytatás) Seq ID/terv
MCF7
15PC3
128A
<5
128B
<25
129A
<25
131A
<25
131B
<5
Amint azt az 1. és 2. táblázatban bemutattuk, a SEQ ID NO 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 125, 126, 128, 129, 130 és 131 legalább 30%¹os survivinexpresszió gátlást mutatott 25 nM koncentrációban ezekben a kísérletekben és ezért elõnyösek. Különösen érdekesek a következõ vegyületek: 2A, 2B, 4A, 4B, 6A, 6B, 15A, 15B, 15E, 119A, 119B, 121A, 121B, 128A, 128B, BOA, 130B, 131A és 131B.
5
10
15
2
11. példa: A survivinexpresszió javított in vitro gátlása LNA antiszensz oligomer vegyületek alkalmazásával a foszfortioátokhoz és a MOE-hez képest 15PC3 sejtekben végeztünk összehasonlítást az mRNS-gátlásra foszfortioátok és MOE (Calbiochem) és LNA-tartalmú antiszensz oligomer vegyületek között. Az ISIS23722 LNA változatát hasonlítottuk a MOE-tartalmú vegyülethez, amely egy 18¹mer 4MOE/PS+10PS+4MOE/PS és összehasonlítottuk egy azonos szekvenciájú foszfortioáttal. A 15PC3 sejteken a transzfekciót oligonukleotidokkal vagy tápközeggel (kontroll) végeztük. (Lásd 5. példa). A survivin mRNS szinteket valós idejû PCR alkalmazásával követük, és a GAPDH¹ra normalizáltuk. A bemutatott survivin mRNS a kontrollexpresszióhoz viszonyított relatív mennyiség (lásd 4. táblázat).
4. táblázat Százalékos mRNS-gátlás 0,2 nM
1 nM
5 nM
25 nM
100 nM
ISIS23722 (4LNA/PS+10PS+4LNA/PS): 145A LNA változata
<20%
48%
79%
84%
76%
ISIS23722 (4MOE/PS+10PS+4MOE/PS): 145F MOE-vegyület
<20%
<20%
<20%
<20%
46%
ISIS23722 (18PS) 145D Foszfortioát változata
22%
<20%
<20%
<20%
<20%
ISIS23722 LNA változata 6 hibás párosodással: 146C
–
–
–
<20%
<20%
ISIS23722 MOE-vegyület 6 hibás párosodással: 146F
–
–
–
<20%
<20%
Egy további kísérletben minden egyes tenyészetbõl a felülúszókat az elemzésbe tettük annak érdekében, 40 hogy lehetõvé tegyük a késõi apoptópikus sejtek elemzését. A 18¹mer LNA, PS és MOE-vegyületeket a fentiek szerint összehasonlítottuk a találmány szerinti 16¹mer LNA-val. 15PC3 sejteket transzfektáltunk a jelölt oligok-
kal a megadott koncentrációkkal (lásd 5. példa). 24 óra elteltével extraháltuk az össz RNS¹t. A tápközeg felülúszójában lévõ sejteket tettük be az elemzésbe. A survivin mRNS¹t valós idejû PCR alkalmazásával követtük és GAPDH¹ra normalizáltuk. A bemutatott survivin mRNS a kontrollexpresszióhoz viszonyított relatív mennyiség.
5. táblázat mRNS-gátlás (a kontroll százaléka) Leírás: Seq ID
100 nM
25 nM
5 nM
ISIS23722 (4LNA/PS+10PS+4LNA/PS): 145A LNA változata
91%
94%
89%
ISIS23722 (4LNA/PO+10PS+4LNA/PO): 145C LNA változata
89%
88%
79%
ISIS23722 MOE-vegyület (4MOE/PS+10PS+4MOE/PS):145F
68%
36%
<20%
ISIS23722 (18PS): 145D foszfortioát változata
35%
<20%
<20%
2A vegyület LNA (16-mer)
99%
90%
66%
6A vegyület LNA (16-mer)
–
98%
90%
15B vegyület LNA (16-mer)
97%
97%
99%
47
1
HU 007 196 T2
12. példa: LNA antiszensz oligomer vegyületek általi apoptózisindukció Sejteket ojtottunk lyukanként 12 000 sejt sûrûségre fehér 96 lyukú lemezre (Nunc 136101) DMEM¹be a transzfekciót megelõzõ napon. A következõ napon a sejteket egyszer mostuk elõmelegített OptiMEM-mel, ezt követte 72 ml OptiMEM, amely 5 mg/ml Lipofectamin 2000¹et (Invitrogen) tartalmazott. A sejteket 7 percig inkubáltuk 18 ml OptiMEM-ben hígított oligonukleotid hozzáadása elõtt. A végsõ oligonukleotidkoncentráció 5 nM–25 nM tartományban volt. 4 órás kezelést követõen a sejteket OptiMEM-ben mostuk és 100 ml DMEM¹et tartalmazó szérumot adtunk hozzá. Az oligokezelést követõen a sejteket hagytuk regenerálódni a jelölt ideig, mielõtt eltávolítottuk õket a CO2-inkubátorból és 15 percig szobahõmérsékletre ekvilibráltuk õket. A nagyon érzékeny kaszpáz-3/7¹Glo™ reagenst (Promega) közvetlenül adtuk a sejtekhez 96 lyukú lemezen és a lemezeket 20 percig inkubáltuk a lumineszcencia rögzítése elõtt (luciferáz aktivitás), amelyet Luminoskan Ascent készülékkel végeztünk, Termo Labsystems, további 1 perces lag idõszakot követõen. A luciferáz aktivitást relatív fény egység/másodperc (RLU/s) értékekként mértük meg. Az adatokat az Ascent szoftver 2.4.2. változatában dolgoztuk fel és az ábrákat excelben rajzoltuk (lásd 8. ábra). 13. példa: Javított apoptózisindukció in vitro az LNA antiszensz oligomer vegyületekkel a foszfortioát- és MOE-vegyületekhez képest Apoptózis mérése BD™ citometrikus gyöngy vizsgálat (CBA) (katalógusszám: 557816) alkalmazásával. A sejteket lipofectamin 2000 alkalmazásával transzfektáltuk, amint azt ismertettük (lásd 5. példa). A transzfekciót követõen 24 órával a sejteket a felülúszóról lepörgettük és a tapadósejteket tripszineztük és lepörgettük. A sejtpelletet újraszuszpendáltuk/mostuk PBSben és megszámoltuk, hogy a koncentrációt 2×106 sejt/ml lízispuffer, amely proteázinhibitorokat tartalmazott, értékre állítsuk be. Az eljárást a gyártó elõírásai szerint végeztük a következõ módosításokkal: amikor a sejteket lizáltuk, akkor 40 percig lizáltuk õket és kevertük 10 perces idõközönként. 1×105 sejtet inkubáltunk kaszpáz-3, Bcl–2 és PARP gyöngyökkel, röviden összekevertük õket és 1 órán át inkubáltuk szobahõmérsékleten. A kaszpáz¹3 aktivitást, Bcl–2 expressziót és PARP indukciót elemeztük oligokezelt sejtekben a BD TM CBA szoftver alkalmazásával. Az adatokat excelbe vittük és görbéket rajzoltunk. Az összes adatot a kontrollhoz viszonyítottuk (amelyet 1¹re állítottunk). A 9. ábra azt mutatja, hogy az LNA-tartalmú vegyületek (145A és 145C) javítják az apoptózis indukciót az azonos szekvenciájú MOE-vegyülethez ISIS27322 (itt 145F) és az azonos szekvenciájú foszfortioát vegyülethez (145D) képest. Az LNA-vegyület (146C) és a MOE-vegyület (146F), valamint a 15A LNA-vegyület hibás párosodású kontrolljai szintén részét képezték a vizsgálatnak. Továbbá a 15A vegyület kaszpáz¹3 aktiválását detektáltuk LNA oligomer vegyülettel kezelt sejtek immunhisztokémiás elemzésével (10. ábra).
2
14. példa: Survivin antiszensz oligonukleotidos gátlása proliferáló ráksejtekben Sejteket ojtottunk lyukanként 12 000 sejt sûrûséggel fehér, 96 lyukú lemezre (Nunc 136101) DMEM¹be a 5 transzfekciót megelõzõ napon. A következõ napon a sejteket egyszer mostuk elõmelegített OptiMEM alkalmazásával, amelyet 5 mg/ml Lipofectamin 2000 (Invitrogen) tartalmú 72 ml OptiMEM hozzáadása követett. A sejteket 7 percig inkubáltuk, mielõtt OptiMEM-ben hí10 gított 18 ml oligonukleotidot adtunk hozzájuk. A végsõ oligonukleotidkoncentráció 5 nM–100 nM tartományban volt. 4 órás kezelést követõen a sejteket OptiMEMben mostuk és 100 ml szérumot tartalmazó DMEM¹et adtunk hozzájuk. Az oligo kezelést követõen a sejteket 15 hagytuk regenerálódni a jelölt ideig, az élõ sejteket 20 ml tetrazóniumvegyület [3¹(4,5-dimetil-2¹il)-5-(3¹karboxi-metoxi-fenil)-2-(4¹szulfo-fenil)-2H-tetrazólium, belsõ só; MTS] hozzáadásával mértük, és egy elektronkapcsoló reagens (fenazin-etoszulfát; PES) (CellTiter 20 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega) hozzáadásával. Az élõ sejteket 490 nm¹en mértük egy Powerwave (Biotek Instruments) készülékben. A növekedési sebességet (AOD/óra) az oligokoncentráció függvényében ábrázoltuk (lásd 11. ábra). 25 15. példa: Ploiditás (sejtciklus) és DNS-lebomlás (apoptózis) mérése survivint célzó oligomer vegyületekkel történõ kezelést követõen sejtekben Az apoptópikus kaszkád késõi szakasza nagyszá30 mú rövid DNS-fragmenst eredményez, amelyek propidium-jodid-festéssel elemezhetõk a sejtekben, továbbá a propidium-jodid-festés alkalmazható a kezelt sejtek ploiditásának meghatározására. A survivin ellen irányuló oligomer vegyületekkel kezelt sejtek ploiditásá35 nak/apoptózisának meghatározásához a sejteket PBAban mostuk és 1 órára rögzítettük 70%¹os EtOH-ban 4 °C hõmérsékleten. 50 mg/ml RNáz (Sigma) 20 perces kezelését követõen szobahõmérsékleten a sejtek PBSsel mostuk és 40 mg/ml propidium-jodiddal inkubáltuk 40 30 percig (Sigma vagy BD). Az összes mintát fluoreszcenciaaktivált sejtválogató készülék (FACSCalibur, Becton Dickinson) és Cell Quest szoftver alkalmazásával elemeztük. A DNS-hisztogramban a hipoploid- vagy a GI¹csúcs alatti sejtek képviselték az apoptózisos sej45 teket. 16. példa: Survivint célzó oligomer vegyületekkel végzett kezelést követõen a mitokondriális membránpotenciál változásának mérése sejtekben A mitokondriális membránpotenciál változásainak 50 méréséhez a MitoSensor™ reagens eljárást (Becton Dickinson, Katalógusszám: K2017–1) alkalmaztuk. A MitoSensor™ reagenst az egészséges sejtek felveszik, amelyekben ez aggregátumokat alakít ki, amelyek 55 piros fluoreszcenciát bocsátanak ki. Az apoptózis során a mitokondriális membránpotenciál megváltozik, és nem engedi a reagenst a mitokondriumba aggregálódni és ezáltal a citoplazmában marad monomer formában, ahol zöld fluoreszcenciát bocsát ki. A survivin el60 len célzott oligomer vegyületekkel kezelt sejteket mos48
1
HU 007 196 T2
tuk és inkubáltuk mitoszenzor reagenssel, amely inkubációs pufferrel volt hígítva a gyártói leírás szerint. Az oligokezelést követõ membránpotenciál-változásokat fluoreszcenciaaktivált sejtválogató készülékkel (FACSCalibur, Becton Dickinson) és Cell Quest szoftver alkalmazásával detektáltuk. 17. példa: Endotél sejtek kapilláris kialakításának gátlása antiszensz oligo kezelést követõen Endotél egysejtréteg sejteket (például HUVEC) inkubáltunk survivin ellen irányult antiszensz oligokkal. Elemeztük a csõ kialakulást a két következõ eljárás egyikével. Az elsõ eljárás a BD BioCoat angiogenezis csõ kialakítási rendszer volt. A sejteket transzfektáltuk oligokkal, ahogy azt ismertettük (5. példa). A transzfektált sejteket 2×104 sejt /96 lyuk koncentrációban ojtottuk matrigel polimerizált BD Biocoat angiogenezis lemezekre. A lemezeket a jelölt óráig/napig inkubáltuk PMA (5–50 nM), VEGF (20–200 ng/ml), Suramin vagy hordozó jelenlétében vagy hiányában. A lemezeket Cacein AM alkalmazásával festettük meg, ahogy azt a gyártó elõírta és képeket készítettünk. Az összes csõhosszt MetaMorf alkalmazásával mértük. Alternatív módon a sejteket patkányfarok I. típusú kollagénben ojtottuk (3 mg/ml, Becton Dickinson) tízszeres DMEM 0,1 térfogatába, semlegesítettük steril 1 M NaOH-val és jégen tartottuk vagy matrigélben. A sejteket 1×106 sejt/ml kollagén végkoncentrációban adtuk a kollagén szuszpenzióhoz. A sejt kollagén keveréket 6 lyukba helyeztük vagy 35 mm¹es lemezekre és nedvesített inkubátorba helyeztük 37 °C hõmérsékletre. Ezután 3 ml gélesített tenyésztési tápközeget, plussz további 10% FBS¹t adtunk, és a sejteket engedtük, hogy kapillárisszerû vaszkuláris csöveket alakítsanak ki a jelölt idõszak alatt PMA (16 nM), VEGF (50 ng/ml) jelenlétében vagy hiányában. A csõképzõdést kriosztat szekcionálással határoztuk meg a géleken és a metszetek vizsgálatával fáziskontraszt-mikroszkópiával. 18. példa: In vitro citotoxikusság mérése survivint célzó oligomer vegyületekkel végzett kezelést követõen Sejteket ojtottunk (0,3–1,2×104) és kezeltük õket a leírtak szerinti módon antiszensz oligokkal (például az MTS-vizsgálatot lásd a 12. példánál). A jelölt idõpontokban 20–50 ml tápközeget az antiszensszel kezelt sejtekbõl áthelyeztünk 96 lyukú lemezekre annak érdekében, hogy a tápközegbe történõ LDH-kibocsátást mérjük. Azonos térfogatú LDH-szubsztrátot adtunk hozzá, ahogy azt a gyártó ismertette. A kibocsátott LDH¹t 30 perces kapcsolt enzimes vizsgálati eljárással mértük, amely egy tetrazólium só (INT) piros formazan termékké történõ konverzióját eredményezi. A kialakult szín mennyisége arányos a lizált sejtek számával. A látható hullámhosszú abszorbanciaadatokat (490 nm¹en mérve) standard 96 lyukú lemezolvasóval gyûjtöttük be (Powerwave, Bio-Tek Instruments). Pozitív kontrollként a sejteket körülbelül 45 percig kezeltük 0,9% Triton X–100 (=100% lízis) alkalmazásával. A citotoxikusságot a kontroll és Triton X–100-kezelt sejtek-
2
hez viszonyítva ábrázoltuk (100% lízis=100% citotoxikusság).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 49
19. példa: In vivo modell: In vivo növesztett humán tumorsejtek növekedésének gátlása szisztémás antiszensz oligonukleotid kezeléssel Nõstény NMRI csecsemõmirigy nélküli 6 hetes csupasz egeret vásároltunk az M&B, Dánia cégtõl és hagytuk õket aklimatizálódni legalább 1 hétig a kísérletek megkezdése elõtt. Humán ráksejteket, jellemzõen 106 sejtet, amely 300 ml matrigélben volt szuszpenzálva (BD Bioscience), injektáltunk szubkután módon 7¹8 hetes NMRI csecsemõmirigy nélküli, nõstény, csupasz egerek végtagjaiba. Amikor a tumornövekedés elindult, jellemzõen 7–12 nappal a tumorsejt-injekciót követõen; különbözõ antiszensz oligonukleotidokat adtunk 5 mg/kg/nap mennyiségben 28 napig ALZET ozmotikus pumpák alkalmazásával, amelyek szubkután módon voltak implantálva. A dorzális implantációt megelõzõen a pumpákat éjszakán át szobahõmérsékleten inkubálruk steril PBS-ben, a pumpák beindításához. A kontrollállatok csupán sóoldatot kaptak ugyanennyi ideig. Minden egyes kísérleti csoport legalább 5 egérbõl állt. A rákellenes aktivitásokat a tumortérfogat gátlásából becsültük. A tumornövekedést két merõleges átmérõ rendszeres mérésével követtük. A tumortérfogatot a képlet szerint határoztuk meg (p×L×D2/6), ahol L jelenti a legnagyobb átmérõt és D jelenti az L¹re merõleges tumorátmérõt. A kezelés végén az állatokat elpusztítottuk és megmértük a tumortömegeket. Az átlagos tumortérfogatot és tömeget az egyes csoportokban összehasonlítottuk Mann–Whitney-teszt alkalmazásával. Az összes elemzést az SPSS 11.0 verziójában Windows alatt végeztük. Optimális esetben Western-blot-analízis is elvégezhetõ annak mérésére, hogy az antiszensz oligonukleotidnak gátló hatása van¹e a fehérje szintekre. A kezelési idõszak végén az egereket ezért elaltattuk és a tumorokat kivágtuk és azonnal lefagyasztottuk folyékony nitrogénnel. A tumorokat lizálópufferben homogenizáltuk {azaz 20 mM Tris¹Cl [pH=7,5]; 2% Triton X–100; 1/100 térfogat Protease Inhibitor Cocktail Set III (Calbiochem); 1/100 térfogat Protease Inhibitor Cocktail Set II (Calbiochem)} 4 °C hõmérsékleten motorral hajtott homogenizátor alkalmazásával. 500 ml lízispuffert alkalmaztunk 100 mg tumorszövetre. Minden egyes egércsoportból származó tumorlizátumot összegyûjtöttünk és 13 000 g alkalmazásával centrifugáltuk 5 percig 4 °C hõmérsékleten a szöveti törmelék eltávolítására. A tumorextraktumok fehérjekoncentrációit a BCA Protein Assay Reagent készlet (Pierce, Rockford) alkalmazásával határoztuk meg. A fehérjeextraktumokat (50–100 mg) gradiens SDS-PAGE gélen frakcionáltuk, amely 4–20%¹ig terjedt és azután PVDFmembránokra vittük át és aminoblack festékkel tettük láthatóvá. A survivin expresszióját humán survivin elleni antitesttel detektáltuk, amelyet torma peroxidázkonjugált kecske elleni IgG (DAKO) követett. Az immunreaktivitást az ECL Plus (Amersham biotech) alkalmazásával detektáltuk és egy Versadoc 5000 lite
1
HU 007 196 T2
rendszer (Bio-Rad) alkalmazásával határoztuk meg a mennyiségét. 20. példa: In vivo modell: Csupasz egerekbe transzplantált humán tumorfragmensek tumornövekedés gátlása LNA antiszensz oligokkal végzett intraperitoneális kezelést követõen LNA antiszensz oligonukleotidok tumornövekedést gátló aktivitását vizsgáltuk xenotranszplantált csecsemõmirigy nélküli csupasz egerekben, NMRI nu/nu, Oncotest tenyésztési kolóniából (Freiburg, Németország). Emlõ (MDA MB 231), prosztata (PC3) vagy tüdõ (LXFE 397, Oncotest) tumor eredetû humán tumorfragmenseket vetünk xenograftokból sorozatos passzálással csupasz egerekben. A donoregérbõl történõ tumoreltávolítást követõen, a tumorokat fragmensekre vágtuk (1–2 mm átmérõ) és RPMI 1640 tenyésztési tápközegbe helyeztük, a szubkután implantációig. A fogadó egereket izofluráninhalációval altattuk el. Egy kis vágatot készítettünk a hát bõrén. A tumorfragmenseket (egerenként 2 fragmens) csipeszek alkalmazásával transzplantáltuk. MDA MB 231 és LXFE 397 tumorokat transzplantáltunk nõstény egerekbe, a PC3 tumorokat hím egerekbe transzplantáltuk. Ha 4–6 mm¹es tumorátmérõt értünk el, akkor az állatokat véletlenszerûen kiválasztottuk és oligonukleotidokkal kezeltük 20 mg/kg mennyiségben naponta egyszer, intraperitoneálisan három hétig, a hétvégéket kihagyva. Egy hordozót (sóoldat) és egy pozitív kontrollcsoportot (Taxol, 20 mg/kg/nap) vettünk be az összes kísérletbe. Minden egyes csoport 6 egérbõl állt. A tumortérfogatot két dimenziós mérésekkel határoztuk meg egy mérõkörzõvel a véletlenszerû kiválasztás napján (0. nap) és ezt követõen hetente kétszer. A tumortérfogatot a következõ képlet szerint számoltuk ki: (a×b2)×0,5 ahol „a” jelenti a legnagyobb és „b” jelenti az erre merõleges tumorátmérõt. Az egereket naponta vizsgáltuk 28 napig a véletlenszerû kiválasztást követõen, addig, míg a tumortérfogat meg nem kétszerezõdött. Az egereket elpusztítottuk, ha a tumorátmérõ meghaladta az 1,6 cm¹t. A tumorgátlás statisztikai szignifikanciájának értékelésére Mann–Whitney–Wilcoxon-tesztet hajtottunk végre. Hagyományosan a <0,05 p¹értékek a tumorgátlás szignifikanciáját jelölik.
Jellemzõen 106 humán ráksejtet szuszpendáltunk 300 ml matrigélben (BD Bioscience), amelyeket szubkután injektáltunk 7¹8 hetes NMRI csecsemõmirigy nélküli nõstény csupasz egerek végtagjaiba. Amikor a tu5 mornövekedés nyilvánvaló volt, akkor trícium jelölt oligonukleotidokat adtunk 5 mg/kg/nap mennyiségben 14 napig ALZET ozmotikus pumpák alkalmazásával, amelyek szubkután voltak implantálva. Az oligonukleotidok tríciumjelöltek voltak, ahogy azt Graham M. J. és 10 munkatársai ismertették [J. Farmacol. Exp. Ter. 1998; 286(1): 447–458]. Az oligonukleotidok mennyiségét az összes fõ szervbõl (máj, vese, lép, szív, gyomor, tüdõ, vékonybél, vastagbél, nyirokcsomók, bõr, izom, zsír, csont, csontvelõ) származó és szubkután transzplan15 tált humán tumorszövetben extraktumban határoztuk meg szcintillációs számlálással.
20
25
30
35
40
45 21. példa: Oligonukleotidok biológiai eloszlása egerekben Nõstény NMRI csecsemõmirigy nélküli csupasz egereket, amelyek 6 hetesek voltak, vásároltunk az M&B, Dánia cégtõl és legalább egy hétig hagytuk õket akklimatizálódni, mielõtt a kísérleteket kezdtük velük.
2
50
22. példa: LNA oligomer vegyületek felvétele humán tumorxenograftokban A 13. példa szerinti 15PC3 humán xenograft tumorokat homogenizáltuk 10 térfogatnyi 0,5% Igepal CA–630, 25 mM Tris pH=8,0, 25 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mg/ml Proteinase KI¹oldatában és éjszakán át inkubáltuk 36 °C hõmérsékleten, amelyet fenol-kloroform extrakció követett. A 2650 antiszensz oligonukleotidkoncentrációja a kombinált folyadékfázisban egy szekvenciaspecifikus ELISA vizsgálati eljárás alkalmazásával volt meghatározva. Két próbát, egy biotinnal jelöltet és egy digoxigeninnel jelöltet (DIG), amelyek komplementerek voltak az antiszensz oligonukleotidszekvenciájához, hibridizáltunk az antiszensz oligohoz. A komplexet immobilizált streptavidin alkalmazásával rögzítettük és torma peroxidáz-konjugált digoxigenin elleni antitest alkalmazásával standard ELISA eljárásokkal határoztuk meg a mennyiségét és. Röviden 10 nM DNS-rögzítõ próbát 5’¹aactgtgc-Biotin¹3’) és 10 nM LNA-detektáló próbát (5’-DIG-GATGTTTCgatgtttc¹3’) kevertünk mintával vagy standardokkal 1%¹os blokkolóreagensben (Roche katalógusszám: 1 096 176) PBS-ben. A próbákat az oligohoz tapasztottuk a keveréket 70 °C¹ra melegítve és ezt követõen fokozatosan 20 °C¹ra hûtve. A keveréket streptavidinnel bevont lyukakra vittük át. A rögzített DIGpróba mennyiségét egy HRP-konjugált DIG elleni antitest fragmens (Roche) alkalmazásával határoztuk meg és standard ELISA eljárásokkal. A 15A oligomer vegyület esetén legalább 1,3 mg/g tumorszövetet detektáltunk (az adatokat nem állítottuk a kinyeréshez). A jelen találmányt egyes elõnyös megvalósítási módjainak megfelelõen ismertettük. Tehát a példák csak illusztrációs célt szolgálnak a találmány jellemzésére és nem céljuk a találmány korlátozása.
A szekvencialistában található szabad szövegek (<223> kód) magyar fordítása <210> 2–145 <223> Szintetikus oligonukleotid <210> 147–149, 151–153, 155–157, 159–161, 163–165, 167–169, 171–173, 175–177, 179–181, 183–185, 187–189, 191–193, 195–197, 199–201, 203–206, 208–210, 212–214, 216–218, 220–222, 224–226, 228–230, 232–234, 236–238, 240–242, 244–246, 248–250, 252–254, 256–258, 260–262, 264–266, 268–270, 272–274, 276–278, 50
1
280–282, 284–286, 288–290, 292–294, 324–326, 328–330, 332–334, 336–338, 368–370, 372–374, 376–378, 380–382, 412–414, 416–418, 420–422, 424–426, 456–458, 460–462, 464–466, 468–470, 500–502, 504–506, 508–510, 512–514, 544–546, 548–550, 552–554, 556–558, 588–590, 592–594, 596–598, 600–602, 632–634, 636–638, 640–642, 644–646, 676–678, 680–682, 684–686, 686–690, 720–721, 723–726 <223> Szintetikus oligonukleotid <223> béta-D-oxi-LNA módosított bázis <223> béta-D-oxi-LNA módosított bázis <223> foszfortioát kapcsolat
HU 007 196 T2
296–298, 340–342, 384–386, 428–430, 472–474, 516–518, 560–562, 604–606, 648–650, 692, 694,
300–302, 344–346, 388–390, 432–434, 476–478, 520–522, 564–566, 608–610, 652–654, 696–698,
304–306, 348–350, 392–394, 436–438, 480–482, 524–526, 568–570, 612–614, 656–658, 700–702,
2
308–310, 352–354, 396–398, 440–442, 484–486, 528–530, 572–574, 616–618, 660–662, 704–706,
312–314, 356–358, 400–402, 444–446, 488–490, 532–534, 576–578, 620–622, 664–666, 708–710,
316–318, 360–362, 404–406, 448–450, 492–494, 536–538, 580–582, 624–626, 668–670, 712–714,
320–322, 364–366, 408–410, 452–454, 496–498, 540–542, 584–586, 628–630, 672–674, 716–718,
<210> 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190,194, 198, 202, 207, 211, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 257, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, 287, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 415, 419, 423, 427, 431, 435, 439, 443, 447, 451, 455, 459, 463, 467, 471, 475, 479, 483, 487, 791, 495, 499, 503, 507, 511, 515, 519, 523, 527, 531, 535, 539, 543, 547, 551, 555, 559, 563, 567, 571, 575, 579, 583, 587, 591, 595, 599, 603, 607, 611, 615, 619, 623, 627, 631, 635, 639, 643, 647, 651, 655, 659, 663, 667, 671, 675, 679, 683, 687, 691, 695, 699, 703, 707, 711, 715, 719, 722 <223> Szintetikus oligonukleotid <223> foszfortioát kapcsolat <210> 729, 732, 735, 738 <223> Próba <210> 727–728, 730–731, 733–734, 736–737, 739–740 <223> Primer <210> 741 <223> poli-T-oligonukleotid <223> ez a szekvencia 12–18 nukleotidot foglalhat magában a benyújtott bejelentéseben meghatározottak szerint
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 40 1. Survivinexpressziót modulálni képes vegyület, amely összesen 12–25 nukleotidból és/vagy nukleotidanalógból áll, ahol a vegyület legalább 8 nukleotid vagy nukleotidanalóg alszekvenciát tartalmaz, ahol az alszekvencia a CTCAATCCATGGCAGC (SEQ ID NO: 130) szekvencián belül helyezkedik el, ahol a vegyület legalább egy nukleotidanalógot tartalmaz. 2. Az 1. igénypont szerinti vegyület, ahol a legalább egy nukleotidanalóg 2¹dezoxiribóztól vagy RNS-tõl különbözõ ribózegységet tartalmaz. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyület, ahol a legalább egy nukleotidanalóg A¹tól, C¹tõl, T¹tõl és G¹tõl különbözõ nitrogénbázist tartalmaz. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, ahol a legalább egy nukleotidanalóg foszfáttól különbözõ kapcsolócsoportot tartalmaz. 5. A 4. igénypont szerinti vegyület, ahol a kapcsolócsoport foszfortioát vagy borán-foszfát. 6. Bármely elõzõ igénypont szerinti vegyület, ahol az összes kapcsolócsoport foszfortioát.
45
50
55
60 51
7. Bármely elõzõ igénypont szerinti vegyület, ahol a vegyület 4–25 nukleotidanalógot tartalmaz, amelyek 2¹dezoxiribóztól vagy RNS-tõl különbözõ ribózegységet tartalmaznak, vagy amelyek A¹tól, C¹tõl, T¹tõl és G¹tõl különbözõ nitrogénbázist tartalmaznak. 8. A 7. igénypont szerinti vegyület, ahol a vegyület 6–20 nukleotidanalógot tartalmaz, amelyek 2¹dezoxiribóztól vagy RNS-tõl különbözõ ribózegységet tartalmaznak, vagy amelyek A¹tól, C¹tõl, T¹tõl és G¹tõl különbözõ nitrogénbázist tartalmaznak. 9. A 8. igénypont szerinti vegyület, ahol a vegyület 6–12 nukleotidanalógot tartalmaz, amelyek 2¹dezoxiribóztól vagy RNS-tõl különbözõ ribózegységet tartalmaznak, vagy amelyek A¹tól, C¹tõl, T¹tõl és G¹tõl különbözõ nitrogénbázist tartalmaznak. 10. Bármely elõzõ igénypont szerinti vegyület, ahol a vegyület legalább 12 nukleotid vagy nukleotidanalóg hosszúságú alszekvenciát tartalmaz. 11. Bármely elõzõ igénypont szerinti vegyület, ahol a vegyület 6, 7, 8, 9, 10, 11 vagy 12 nukleotidanalógot tartalmaz.
1
HU 007 196 T2
12. Bármely elõzõ igénypont szerinti vegyület, amely összesen 12–20 nukleotidból és/vagy nukleotidanalógból áll. 13. Bármely elõzõ igénypont szerinti vegyület, amely 15, 16 vagy 17 nukleotidból és/vagy nukleotidanalógból áll. 14. Bármely elõzõ igénypont szerinti vegyület, ahol a vegyület nukleozidot tartalmaz a 3’¹végén. 15. Bármely elõzõ igénypont szerinti vegyület, ahol a legalább egy nukleotidanalóg a 2’¹O-metil-ribóz, 2’¹fluor-2’-dezoxiribóz, 2’¹O-metoxi-etil-ribóz, 2’¹O(3¹hidroxi)-propil-ribóz, 2’¹O¹(3¹amino)-propil-ribóz és zárt nukleinsav („locked nucleic acid”, LNA) alkotta csoportból választott. 16. Bármely elõzõ igénypont szerinti vegyület, ahol a legalább egy nukleotidanalóg zárt nukleinsav („locked nucleic acid”, LNA). 17. A 15. vagy 16. igénypont szerinti vegyület, ahol az LNA béta¹D alakban van. 18. A 15. vagy 16. igénypont szerinti vegyület, ahol az LNA alfa¹L alakban van. 19. Az 1–18. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, ahol a legalább egy nukleotidanalóg a következõ képletû zárt nukleinsav („locked nucleic acid”, LNA):
5
10
15
20
25
ahol Z és Z* jelentése egymástól függetlenül nukleozidok közötti kapcsolat, terminális csoport vagy védõcsoport; és X és Y jelentése egymástól függetlenül a következõk alkotta csoportból választott csoport: O, S, NR, CH2, CH (ha kettõs kötés része), CH2–O, CH2–S, CH2–NR, CH2–CH2, CH2–CH (ha kettõs kötés része) és CH=CH, ahol R jelentése hidrogénatom vagy C1–4alkil-csoport. 20. A 19. igénypont szerinti vegyület, ahol X jelentése O és Y jelentése a következõk alkotta csoportból választott csoport: O, S és NR, ahol R jelentése hidrogénatom vagy C1–4-alkil-csoport. 21. A 20. igénypont szerinti vegyület, ahol X jelentése O és Y jelentése a következõk alkotta csoportból választott csoport: O, S és NH. 22. A 20. igénypont szerinti vegyület, ahol X jelentése O és Y jelentése O. 23. Bármely elõzõ igénypont szerinti vegyület, ahol a szekvencia 2–6 hosszúságú LNA-szakaszt tartalmaz, amelyet 4–12 hosszúságú nukleotidszakasz követ, amelyet 2–6 hosszúságú LNA-szakasz követ, ahol az LNA¹k 17–22. igénypontok bármelyike szerint definiáltak. 24. Az 1. igénypont szerinti vegyület, ahol a vegyület CTCAATCCATGGCAGC (SEQ ID NO: 130) alszekvenciát tartalmaz, ahol a vegyület legalább egy nukleotidanalógot tartalmaz. 25. A 24. igénypont szerinti vegyület, ahol a vegyület a CTCAATCCATGGCAGC (SEQ ID NO: 130) szek-
30
35
40
45
50
55
52
2
venciából áll, ahol a vegyület legalább egy nukleotidanalógot tartalmaz. 26. Az 1. igénypont szerinti vegyület, ahol a vegyület C s T s C s A s a s t s c 3 c 3 a s t s g s g s C s A s G s C (SEQ ID NO: 130A), CsTsCsAsastscscsastsgsCsAsGsc (SEQ ID NO: 130B), C O T O C O A O a s t s c s c s a s t s g s C O A O G O C (SEQ ID NO: 130C) és cstscsasastscscsastsgsgscsasgsc (SEQ ID NO: 130D) alkotta csoportból választott alszekvenciát tartalmaz, ahol a nagybetûk jelentése béta-D-oxi-LNA, a kisbetûk jelentése DNS, az O alsóindex jelentése foszfát kapcsolat, és az S alsóindex jelentése foszfortioát kapcsolat. 27. A 26. igénypont szerinti vegyület, ahol a vegyület CsTsCsAsastscsastsgsgsCsAsGsC (SEQ ID NO: 130A), CsTsCsAsastscscsasgsgsCsAsGsc (SEQ ID NO: 130B), COTOCOAOastscscsastsgsgsCOAOGOC (SEQ ID NO: 130C) és cstscsasastscscsastsgsgscsasgsc (SEQ ID NO: 130D) alkotta csoportból választott alszekvenciából áll, ahol a nagybetûk jelentése béta-D-oxi-LNA, a kisbetûk jelentése DNS, az O alsóindex jelentése foszfátkapcsolat, és az S alsóindex jelentése foszfortioátkapcsolat. 28. A 27. igénypont szerinti vegyület, amely a CsTsCsAsastscscsastsgsgsCsAsGsc (SEQ ID NO: 130B) vegyület. 29. Konjugátum, amely bármely elõzõ igénypont szerinti vegyületet és legalább egy nem nukleotid vagy nem polinukleotid részt tartalmaz a vegyülethez kovalens módon kötve. 30. Gyógyszerészeti készítmény, amely 1–27. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet vagy 29. igénypont szerinti konjugátumot és gyógyszerészetileg elfogadható diluenst, hordozót vagy adjuvánst tartalmaz. 31. A 30. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, amely továbbá legalább egy kemoterápiás ágenst is tartalmaz. 32. A 30. vagy 31. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, ahol a hordozó sóoldat. 33. A 32. igénypont szerinti gyógyszerészeti készítmény, ahol a hordozó foszfáttal pufferezett sóoldat. 34. Az 1–28. igénypontok bármelyike szerinti vegyület vagy 29. igénypont szerinti konjugátum gyógyászati alkalmazásra. 35. Az 1–28. igénypontok bármelyike szerinti vegyület vagy 29. igénypont szerinti konjugátum alkalmazása rák gyógyítására szolgáló gyógyszer elõállítására. 36. Az 1–28. igénypontok bármelyike szerinti vegyület vagy 29. igénypont szerinti konjugátum és kemoterápiás ágens kombinációjának alkalmazása rák gyógyítására szolgáló gyógyszer elõállítására.
HU 007 196 T2 Int. Cl.: C12N 15/11
53
HU 007 196 T2 Int. Cl.: C12N 15/11
54
HU 007 196 T2 Int. Cl.: C12N 15/11
55
HU 007 196 T2 Int. Cl.: C12N 15/11
56
HU 007 196 T2 Int. Cl.: C12N 15/11
57
HU 007 196 T2 Int. Cl.: C12N 15/11
58
HU 007 196 T2 Int. Cl.: C12N 15/11
59
HU 007 196 T2 Int. Cl.: C12N 15/11
60
HU 007 196 T2 Int. Cl.: C12N 15/11
61
HU 007 196 T2 Int. Cl.: C12N 15/11
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
