!HU000007711T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 711
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 730260 (22) A bejelentés napja: 2004. 04. 29. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040730260 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1618380 A2 2004. 11. 11. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1618380 B1 2009. 12. 30.
(51) Int. Cl.: G01N 33/534 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04097406 PCT/EP 04/004683
(30) Elsõbbségi adatok: 03076252 2003. 04. 29.
(73) Jogosult: Universität Zürich, 8006 Zürich (CH)
EP
(72) Feltalálók: ALBERTO, Roger, CH-8400 Winterthur (CH); PAK, Jaw, Kyoung, CH-6340 Baar-Inwil (CH)
HU 007 711 T2
(54)
(74) Képviselõ: dr. Török Ferenc, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Biomolekulához való kapcsolásra alkalmas N epszilon és/vagy N alfa származékoltatott, fémmel és szerves csoporttal védett L-hisztidin, amely nagyon hatékony, trikarbonil [M(OH2)3(CO)3]+ csoporttal való címkézést tesz lehetõvé fac típusú koordinációval
A leírás terjedelme 16 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 711 T2
A jelen találmány olyan hisztidinszármazékokra vonatkozik, amelyek biomolekulákhoz, mint aminosavakhoz, peptidekhez stb. kapcsolhatók radioaktív fémet tartalmazó fac-koordinációjú trikarbonillal [M(OH2)3(CO)3]+ való címkézéshez (labeling). A biológiai aktív molekuláknak 99mTc-vel való címkézése radiogyógyszerészeti célokra intenzív kutatás tárgyát képezi. A radioaktivitáson alapuló leképezések során alkalmazható kereskedelemben forgalmazott perfúziós szerek olyan címkézett vektorokkal vannak kiegészítve, amelyek lehetõvé teszik az olyan különféle receptorok még pontosabb megcélzását, amelyek nagy mennyiségben expresszálódnak például rákos sejtekben. Azonban csak néhány vegyület jutott preklinikai fázisba, és jelenleg egyiket sem találjuk meg kereskedelmi forgalomban. Számos kémiai és biológiai nehézséget kell leküzdeni. Kémiai szempontból a célba juttató vektornak a következõ tulajdonságokkal kell rendelkeznie: i) olyan megfelelõ kelátor- (kelátképzõ) részt kell tartalmaznia, amely 99mTc vagy más radionuklid számára megfelel, ii) nagy specifikus aktivitással kell végeznie a címkézést (alacsony vektorkoncentrációval), és végül meg kell tartania a fizikai-kémiai tulajdonságait és a receptor iránti affinitását. Rutinszerû alkalmazás esetén a címkézési eljárásnak elõnyösen egyetlenegy lépésbõl kell állnia. A szakirodalomban számos eljárás ismert, és peptidek esetén különösen a „hynic”-megközelítés tûnik a legígéretesebbnek (HYNIC=6-hidrazino-piridin-3-karbonsav), bár itt is még hiányzik az a tisztán definiált vegyület, amely a klinikai engedélyezéshez szükséges. A jelen feltalálók a közelmúltban kidolgozták az organofém akvaion [99mTc(OH2)3(CO)3]+ szintézisutat (Alberto és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 3135), amely komplex fragmentum sokoldalúan alkalmazható különféle biológiai molekulák és peptidek címkézésére. Egyik fõ elõnye a karbonilos megközelítésnek, hogy elérhetõvé tesz egy olyan jól meghatározott komplexet, amelynek nagyon erõs a specifikus aktivitása, amely csupán a ligandum típusától függ. Természetben elõforduló bidentát ligandumok, mint például a peptidláncokban lévõ N¹terminális hisztidinek hatékonyan címkézhetõk a [99mTc(OH2)3(CO)3]+-mal. A specifikus aktivitás irányába tett fontos lépés volt egy termális hisztidin beépítése az a¹amino-csoporton keresztül, ami lehetõvé tette, hogy kis ligandumkoncentráció mellett történjék meg a címkézés. Azonban az ilyen jellegû kétfunkciós kelátor meglehetõsen erõsen lipofil, és elõállítása nehézkes. Jain és Cohen (Tetrahedron 1996, 52, 5363) írja le Ne-alkil-hisztidin- és ¹hisztamin-származékok elõállítását. Ezekrõl a származékokról nem írják le, hogy ligandumok lehetnek fémkelátképzésben. Schibli és Schubiger (Eur. J. Nucl. Med. 2002, 29, 1529) tekinti át ionmolekuláknak fémorganikus komplexekkel való címkézését radiogyógyszerészeti célokra. Ennélfogva a jelen találmány tárgya olyan különféleképpen származékoltatott hisztidinek elõállítása,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
amelyek lehetõvé teszik ezeknek peptidekre vagy peptidekhez való kapcsolását minimális szintetikus munkával, egyben maximális címkézési hatékonyságot biztosítva. A feltalálók feltételezték, hogy mivel a [99mTc(his)(CO)3] komplex hidrofil, megfelelõen alkalmazható a hisztidin származékoltatására az imidazolgyûrû e¹nitrogénjén. Ez a funkcionalizálás nem érinti a nagy hatékonyságú háromfogású (tripodális) koordinációs helyet, de lehetõvé teszi a biomolekulákban található amin- vagy karbonsavcsoporthoz való kapcsolódást. Végül, mivel a [99mTc(his)(CO)3] szintézise végrehajtható a [99mTcO4]– ionból egy lépésben, a hisztidin szintén megfelel az egy edényben végrehajtható címkézési eljárási követelménynek anélkül, hogy a ligandumot ez érintené. A jelen találmány ennélfogva hisztidinszármazékokra vonatkozik, amelyek az Ne atomon származékoltatott –(CH2)n–R-csoportot tartalmaznak, ahol n=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10; R jelentése –NH2, –COOR1, –OH, –X és –X’-biomolekula közül választott; R1 jelentése H, t¹butil vagy pentafluor-fenil; X jelentése a halogenidek, azidok, pszeudohalogenidek, foszfát¹, tiol- és szililcsoport közül választott; X’ jelentése egy kapcsolóblokk, amely egy kötéssel kapcsolódik a biomolekulához, amely COOH és NH2, NH2 és COOH, OH és Ph¹OH vagy X és a biomolekulában lévõ elektrofil funkciós csoport közötti reakcióból származik, ahol Ph jelentése a biomolekula egy foszforsavcsoportja; és a biomolekula a polipeptidek, peptidek, aminosavak, cukrok és vitaminok közül választott, ahol a hisztidinszármazék Na, Nd atomja és karboxilcsoportja fém-trikarbonillal védett. Az N e atom és adott esetben az N a atom –(CH2)n–R-csoporttal származékoltatott, ahol n=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10, elõnyösen 1, 2, 3, 4 vagy 5, és R jelentése –NH2, –COOR1, –OH, –X vagy –X’biomolekula közül választott, ahol X’ jelentése egy kapcsolóblokk, amely egy kötéssel kapcsolódik a biomolekulához, amely COOH és NH2, NH2 és COOH, OH és Ph¹OH reakciójából származik, ahol Ph jelentése a biomolekula egy foszforsavcsoportja, mint foszforilezett peptid vagy glikozil-foszfátok, vagy X és a biomolekula egy elektrofil funkciós csoportjának reakciójából származik, amely lehet különösen S, OH vagy amin, és R1 jelentése H, t¹butil vagy pentafluor-fenil. X és Y jelentése halogenidek, azidok, pszeudohalogenidek, foszfát¹, tiol¹, szililcsoportok közül választott. Az Ne és Na atomok közül egy vagy mindkettõ lehet biomolekulával származékoltatott. A biomolekula választható a polipeptidek, mint antitestek, peptidek, aminosavak, cukrok és vitaminok közül. A biomolekulák megfelelõ példái a következõk: bombezin, (alfa)-mshpeptidek, mint melanokortin, oktreotát, szomatosztatin, interleukin–8 (IL8), CCK, (béta)-„hajtûkanyar” (hairpin loop) peptidek, neurotenzin, biotin, monoklonális antitestek, mint prosztata membrán specifikus antigén (pmsa) elleni monoklonális antitestek. Az Na, Nd és a karboxilcsoport fém-trikarbonil-csoporttal védettek.
1
HU 007 711 T2
2
Ez a fajta védelem különösen hasznos, amennyidását, amennyiben az Ne atomon lévõ –(CH2)n–R-csoben –(CH2)n–R-csoporttal végzünk származékoltatást. port a –(CH2)n–COO-pentafluor-fenil-észter. Ez a szárAmikor az összes származékoltatásvégzést végremazékoltatás az Ne atomon lévõ COOH aktiválásához vezet, ami lehetõvé teszi a direkt konjugációt a biomohajtottuk, a hisztidinszármazékot védõelem-mentesíthetjük, majd ezt koordinációs kapcsolatba hozhatjuk 5 lekulákkal anélkül, hogy maga a biomolekula módosulna, amennyiben a biomolekula maga is rendelkezik radioaktívan jelzett fém-trikarbonillal, és így kapjuk a egy szabad karbonsavcsoporttal, amely versenyezhet címkézett biomolekulát. a kapcsolódás során. A fenti esetben az Na atom és a A radioaktívan címkézett fém-trikarbonil megfelelõen 99m + 188 + választható a [ Tc(OH2)3(CO)3] , [ Re(OH2)3(CO)3] karbonsavrész védett. A jelen találmány különösen vonatkozik, illetve alés [97Ru(OH2)3(CO)3]2+ közül. 10 kalmaz olyan hisztidinszármazékokat, amely megfelel A jelen találmány további aspektusánál azt találtuk, az alábbi szerkezeti képletek közül az egyiknek: hogy nagymértékben elõsegíti a biomolekula kapcsoló-
I R2=H, metil
II R=NH2, COOR, OH, X X’-biomolekula R1=H, t¹butil R2=H, metil
IV R=H, COOR1 R1=H, t¹butil R2=H, metil
VII R=H, COOR1 R1=H, t¹butil R2=H, metil P=H, Fmoc
V R=H, COOR1 R1=H, t¹butil R2=H, metil P=H, Fmoc
VIII R=H, COOR1 R1=H, t¹butil P=H, Fmoc
III R=NH2, COOR1, OH, X, X’¹biomolekula R1=H t¹butil, Pfp R2=H, metil P=H, Fmoc, Cbz, BOC, Teoc metoxi-karbonil, etoxi-karbonil
VI R=H, COOR1, OH, X R1=H, t¹butil R2=H, metil
IX M=Re 99T, Ru R=NH2, COOH, OH, X
XI R2=H, metil P=H, Fmoc, Cbz, Teoc
X M=Re 99T, Ru BM=biomolekula
3
1
HU 007 711 T2
XII M=Re, 99Tc
2
XIII R2=H, metil BM=biomolekula
XVI R2=H, metil P=H, Fmoc BM=biomolekula
XV M=Re, 99Tc BM=biomolekula
XVII R2=H, metil P=H, Fmoc BM=biomolekula Egy további aspektus szerint a kinyilvánítás vonatkozik a találmány szerinti hisztidinszármazékokhoz kapcsolt biomolekulákra. A hisztidin lehet a biomolekula végén vagy a biomolekulán belül. Alternatív módon mind az Ne és Na atom lehet biomolekulával származékoltatva, ami dimer vagy bifunkcionális molekulákhoz vezet. A bifunkcionális molekulák példái azok, amelyekben a biomolekula egyik oldala rendelkezik a célba vivõ funkcióval, mint például egy antitesttel vagy egy receptorhoz kötõdõ ligandummal, és a biomolekula másik oldala fejti ki a toxicitást. Egyéb kombinációkat szintén ismertetünk. Az ilyen bifunkcionális molekulákat alkalmazhatjuk például tumorok célzott kezelésére. A tumorra irányuló célzással a toxikus biomolekulát és a radioaktív fémet a kezelendõ tumor környezetébe juttatjuk. A megfelelõ biomolekulák a következõk: bombezin, (alfa)-MSH-peptidek, mint melanokortin, oktreotát, szomatosztatin, interleukin–8 (IL8), CCK, (béta)-„hajtûkanyar” peptidek, neurotenzin, biotin, monoklonális antitestek, mint a prosztata membrán specifikus antigén (pmsa) elleni monoklonális antitestek. A találmányhoz vezetõ kutatás során két különbözõ utat találtunk az acetilcsoportnak az Ne helyre történõ bevitelére egy Na, Nd és –COO védett hisztidinben, és
XIV R2=H, metil BM=biomolekula
XVIII R2=H, metil P=H, Fmoc
40
45
50
55
60 4
így jutottunk el a 9 Ne-(CH2COOH)-hisztidin-származék modellvegyülethez. A találmány szerinti vegyületek, mint a 9 hisztidinszármazék, bioaktív molekulákban, mint peptidekben található aminocsoportokhoz kapcsolhatók. Az ilyen biokonjugátum teljes védésmentesítését követõen a hisztidin három koordinációs hellyel rendelkezik, amely hatékonyan koordinálódik [ 99m Tc(OH 2 ) 3 (CO) 3 ] + vagy [Re(OH 2 ) 3 (CO) 3 ] + vagy [97Ru(OH2)3(CO)3]2+ ionokhoz faciális geometriában. A jelen találmány szolgáltat továbbá egy eljárást a találmány szerinti hisztidinszármazékok elõállítására, amelynek során a) védjük legalább az Na atomot és adott esetben a karboxilcsoportot és az Nd atomot; b) származékoltatjuk az Ne atomot; c) eltávolítjuk a védõcsoportokat; és d) címkézzük a védésmentesített vegyületet, és így egy címkézett vegyületet kapunk, ahol a címkézés a hisztidinmolekulának radioaktívan címkézett fémtrikarbonillal való címkézését jelenti. A módszerben az Na és Nd atomot védhetjük karbonilcsoporttal, és így egy hattagú karbamidgyûrût alakítunk ki, vagy a karboxilcsoport, Na és Nd atomok koordinálódhatnak egy fémhez, különösen fém-trikarbonilhoz.
1
HU 007 711 T2
2
Az Ne és/vagy Na atomok származékoltatását végrehajthatjuk –(CH2)n–R-csoporttal, ahol n=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10, elõnyösen 1, 2, 3, 4 vagy 5, és R jelentése –NH2, –COOR1, –OH, –X vagy –X’-biomolekula közül választott, ahol X’ jelentése egy kapcsoló- 5 blokk, amely egy kötéssel kapcsolódik a biomolekulához, amely COOH és NH2, NH2 és COOH, OH és Ph¹OH reakciójából származik, ahol Ph jelentése a biomolekula egy foszforsavcsoportja, mint foszforilezett peptid vagy glikozil-foszfátok, vagy X és a biomolekula 10 egy elektrofil funkciós csoportjának reakciójából származik, ami utóbbi lehet különösen S, OH vagy amin, és R1 jelentése H, t¹butil vagy pentafluor-fenil. Amikor a védelem karbamidgyûrû kialakításával és az Ne atomon –(CH2)n–R-csoporttal végzett származé- 15 koltatással van végrehajtva, a gyûrût kinyithatjuk a biomolekula beépítése elõtt. Ilyen esetben a karboxilcsoport észteresítéssel védett, és az Na atom egy amino-védõcsoporttal, mint például Fmoc, Cbz, BOC, Teoc, metil20 oxi-karbonil- vagy etil-oxi-karbonil-csoporttal védett. A származékoltatás megkönnyítése céljából az N e atomon lévõ –(CH 2 ) n –R-csoportot elõször –(CH2)n–COO-pentafluor-fenil-észter formára hozzuk.
Amennyiben az eljárás magában foglalja a származék címkézését is, ezt megfelelõen végrehajthatjuk egy radioaktívan címkézett fém-trikarbonillal, különösen radioaktívan címkézett olyan fém-trikarbonillal, amelyet a [ 99m Tc(OH 2 ) 3 (CO) 3 ] + , [ 188 Re(OH 2 ) 3 (CO) 3 ] + és [97Ru(OH2)3(CO)3]2+ közül választunk. Az Ne pozícióban végrehajtott szelektív származékoltatást kényelmesen végrehajthatjuk az Na és Nd karbonilcsoporttal végrehajtott olyan párhuzamos védelmével, amelyben egy hattagú karbamid végzõdik. A gyûrûs karbamidot felnyithatjuk Fm¹OH-val, fenil-alanint kapcsolva a 9 vegyülethez annak primer aminján keresztül, majd az összes védõcsoport eltávolításával egy lépésben kapjuk a fenil-alanin hisztidinszármazékát, amit 10–5 M koncentrációban címkézhetünk 99mTcvel igen nagy kitermeléssel, és körülbelül 50%-nál nagyobb kitermeléssel 10–6 M koncentrációnál. Azon [Re(CO)3]+ csoporttal képzett komplex röntgen-szerkezetvizsgálata, amelyben anilin kapcsolt a 9 vegyülethez, a hisztidin faciális elrendezõdését igazolja. Egy másik út szerint közvetlenül alkalmazzuk a [Re(CO)3]+ csoportot védõcsoportként, amint azt az alábbi reakcióvázlat bemutatja:
Ez egyike azon ritka példáknak, ahol fémfragmenst alkalmazunk szerves funkcionalitások védelmére. A hisztidinhez való koordináció egy lépésben védi az Na, Nd és –COO helyeket, majd az Ne atomon BrCH2COOH(R)-rel végzett alkilálással, fenil-alaninhoz való kapcsolással és a [Re(CO)3]+ csoportnak [ReO4]– csoporthoz vezetõ oxidatív védésmentesítésével kapjuk a megfelelõ biokonjugátumot, ahol a hisztidint fenilalaninhoz kapcsoltuk egy Ne helyen lévõ acetil-amidon keresztül. Mindkét módszer megfelelõ utat biztosít arra, hogy beépítsünk hisztidint egy biomolekulába úgy, hogy a hármas koordinációs helye megmaradjon. Ez az eljárás bármilyen biomolekulára adaptálható, amely függõ amincsoportot tartalmaz, és lehetõvé teszi új radiogyógyszerek vagy inverz peptidek kifejlesztését. Így biomolekulák [99mTc(OH2)3(CO)3]+ csoporttal történõ címkézése magas kitermeléssel lehetséges mM¹os koncentrációknál, amikor a hisztidin az imidazolgyûrû Ne atomján keresztül kapcsolt a célmolekulához. Két olyan megfelelõ stratégiát dolgoztunk ki, amelyek ilyen származékokhoz vezetnek, az egyikben [Re(CO)3]+ magot alkalmazunk a három funkcionalitással bíró hisztidinben fémorganikus védõcsoportként. A kulcsvegyületet a biomolekulában található bármelyik aminocsoporthoz kapcsolhatjuk, és egy lépésben címkézhetjük [99mTcO4]– csoporttal vízben, amely lehetõvé teszi új radiogyógyszerek kifejlesztését.
A származékoltatási módszer kiválasztása függ a kapcsolandó biomolekulától. A karbamidgyûrû kinyitása savas pH¹t és redukciós körülményeket igényel, és általában a biomolekula kapcsolása elõtt végrehajtandó. Ez a módszer olyan biomolekuláknál alkalmazható, amelyek ellenállóak az ilyen körülményekkel szemben, mint például a vitaminok esetében. Alternatív módon a polipeptideket olyan hisztidinhez kapcsolhatjuk, amely fém-karbonillal védett. Az alábbi példák számos olyan hisztidinszármazékot adnak meg, amelyek igen hatékonyak és biológiailag stabilak a biomolekulák címkézése során. Az Na és Nd atomot egy lépésben védhetjük, szabadon hagyva az Ne atomot további származékoltatásra. Az Na atomon végzett származékoltatás szintén lehetséges.
35
40
45
50
55 R2=H, metil
60 5
R=NH2, COOR1, OH, X R1=H, t¹butil R2=H, metil (1 molekula)
1
HU 007 711 T2
A bal molekula egy olyan hisztidint mutat, ahol az Na és Nd védett, míg az Ne származékoltatásra alkalmas, amint az a jobb oldali molekulán látható. Az Ne atomon végzett származékoltatás (mint alkilálás) számos származékhoz vezet, amely biomolekulákhoz kapcsolható a függõ funkcionalitáson át, ami lehet amin, karboxilát, halogenid és egyebek. Ez a fajta szintézis alapvetõen ismert az irodalomból (R. Jain, és munkatársai, J. Chem. Soc., Dalton Trans, 1994, 2815). A védésmentesítést követõen a hisztidinszármazék megtartja tripodális (háromkarú) koordinációját az Na¹n keresztül az [M(CO)3]+ részhez:
2
A találmány szerinti hisztidinszármazékokkal fordított szekvenciát lehet elõállítani, és így két N¹terminálissal rendelkezõ bidentát ligandumhoz jutunk: 5
Alternatív módon fordított szekvenciájú, két C¹ter10 minálissal rendelkezõ bidentát ligandumot kaphatunk:
15 A hisztidinszármazékokat beépíthetjük a peptidláncba a szekvencia megfordítása nélkül, mint például a következõ normál szekvenciában, amely bidentát 20 hisztidin ligandummal rendelkezik a szekvenciában: R=NH2, COOr1, OH, X R1=H, pentafluor-fenol A védésmentesítés elõtt az 1 molekulát bármilyen fajtájú biomolekulához kapcsolhatjuk. R így szintén lehet egy biomolekula. Az ezt követõ védésmentesítés szintén egy biomolekulához vezet, amely tripodális hisztidin ligandummal rendelkezik. Ez a ligandum a legmagasabb fokú hatékonyságot mutatja a 99mTc vagy 188Re-vel végzett címkézés során, és lehetõvé teszi a biomolekulák címkézését hordozó nélküli (n.c.a.=no carrier added) szinten. Az alábbi egy példa arra, amikor tripodális hisztidin egy modellpeptid szekvenciához kapcsolt:
25
Ezen a módon lehetséges egy bidentát természetes ligandumot beépíteni egy normál peptidszekvenciába. 30 A peptidláncba történõ ilyen típusú beszúrás egy újfajta címkézést eredményez, amit eddig még nem ismertek. A szerkezetben az Na helyen végzett módosítás egy félig természetes hisztidinhez vezet. Akár az Na, akár az Ne helyen szelektív származékoltatás lehetsé35 ges az alábbiak szerint:
40 tripodális hisztidin A szintetikus technikák és a biomolekula címkézési módszer kombinációja új, és nem várt módon magas kitermelést eredményez. Továbbá a találmány szerint a nagyon hatékony karbonil ligandumot lehet könnyen kapcsolni egy biomolekulához. A fent említett típusú származékok alapvetõen bármilyen biomolekulához kapcsolhatók úgy, hogy azok megtartják fizikai-kémiai tulajdonságaikat. A találmány szerinti úton kapcsolt hisztidin természetes ligandum. Továbbá a találmány szerinti hisztidinszármazékok felhasználhatók a peptidlánc irányának megfordítására. Egy normál peptidszekvencia például a következõ szerkezettel rendelkezik:
R=NH2, COOR1, OH, X R1=H, t¹butil R2=H, metil módosítás védésmentesítés 45 Lehetséges egyszerre származékoltatni mind az Na, mind az Ne helyen, beépítve különféle funkcionalitásokat (ideértve a biomolekulákat is) (balra), így kapva trifunkciós hisztidint a védés megszüntetése után, ami 50 után megkapjuk a trifunkciós tripodális hisztidin ligandumot (jobbra):
55
60 6
R=NH2, COOH, OH, X R1=NH2, COOH, OH, X R2=H, metil
1
HU 007 711 T2
Alternatív módon az R vagy R1 helyre kapcsolt peptidszekvenciával lehetõség nyílik arra, hogy egy tridentát hisztidint szúrjunk be a peptidszekvenciába, ami lehet normál (alul) vagy fordított (felül):
1. táblázat
5
10
tripodális hisztidin
15 tripodális hisztidin Mindkét stratégia kis molekulák címkézését teszi lehetõvé az igen hatékony és erõs hisztidin ligandummal. Ez alkalmazható például aminosavak és egyéb kis molekulák, mint hypoxialeképezõ szerek címkézésére. A [Tc(his¹R)(CO)3] komplex ennélfogva erõsen hidrofil, ami általában elõnyös a biológiai molekuláknál. Megjegyezzük, hogy a bejelentésben az (I)–(XVIII) szerkezeti képletû vegyületek általánosított szerkezetek. A következõ 1. táblázatban foglaljuk össze a tulajdonságok kombinációját az egyes általános képletek esetében.
2
20
25
30
A
B
C
D
1.
II/XIII
IX/X
III/XI XVIII/XI
III, XI
2
IV/–
np/np
V/XVI
V, XVI
3
VI/–
np/np
VII/XVII
VII, XVII
4
I/XIV
XII/XV
–
hisztidin
1=Ne
atomon származékoltatott 2=Na atomon származékoltatott 3=Na és Na atomon származékoltatott 4=nem származékoltatott A=hattagú gyûrû segítségével védett B=fém-trikarbonil segítségével védett C=COOH¹n képzett észter és Na atomon végrehajtott aminvédéssel védett D=címkézésre szolgáló C oszlopból származó képlet, amelyben a COOH és Na védésmentesített vastag írás=képlet biomolekula nélkül dõlt írás=biomolekulával np=nem lehetséges (not possible)
Az alábbiakban be szándékozunk mutatni az n¹nel jelölt alkillánchosszúság és az Na és/vagy Ne helyen lévõ különbözõ R szubsztituensek összes lehetséges kombinációját. A következõ 2. táblázatban megadjuk az összes lehetséges kombinációját az n értékeknek és R jelentéseinek. Néhány vegyületben a kombinációk közül bármelyik kettõ lehetséges.
2. táblázat
NH2 COOH
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0/NH2
1/NH2
2/NH2
3/NH2
4/NH2
5/NH2
6/NH2
7/NH2
8/NH2
9/NH2
10/NH2
0/COOH 1/COOH 2/COOH 3/COOH 4/COOH 5/COOH 6/COOH 7/COOH 8/COOH 9/COOH 10/COOH
OH
0/OH
1/OH
2/OH
3/OH
4/OH
5/OH
6/OH
7/OH
8/OH
9/OH
10/OH
X
0/X
1/X
2/X
3/X
4/X
5/X
6/X
7/X
8/X
9/X
10/X
6
7
8
9
Amennyiben a biomolekula kapcsolódik a hisztidinhez, a következõ kombinációk lehetségesek n¹re és R¹re nézve.
45
3. táblázat 0
1
2
3
4
5
10
NH2
0/NH-BM 1/NH-BM 2/NH-BM 3/NH-BM 4/NH-BM 5/NH-BM 6/NH-BM 7/NH-BM 8/NH-BM 9/NH-BM 10/NHBM
COOH
0/CO-BM 1/CO-BM 2/CO-BM 3/CO-BM 4/CO-BM 5/CO-BM 6/CO-BM 7/CO-BM 8/CO-BM 9/CO-BM 10/COBM
OH
0/O¹BM
1/O¹BM
2/0¹BM
3/O¹BM
4/O¹BM
5/O¹BM
6/O¹BM
7/O¹BM
8/O¹BM
9/O¹BM 10/O¹BM
X
0/X’-BM
1/X’-BM
2/X’-BM
3/X’-BM
4/X’-BM
5/X’-BM
6/X’-BM
7/X’-BM
8/X’-BM
9/X’-BM 10/X’-BM
Az NH¹BM azt jelenti, hogy a hisztidinszármazékon az Ne és/vagy Na helyen lévõ NH2 a biomolekula 60 7
COOH-csoportjához kapcsolt. A CO¹BM esetében a hisztidinszármazék Ne és/vagy Na helyen lévõ COOH-
1
HU 007 711 T2
csoportja a biomolekula NH2-csoportjához kapcsolt. O¹BM esetében a hisztidinszármazékon az N e és/vagy Na helyen lévõ OH a biomolekulákon lévõ Ph¹OH-hoz vagy halogenidhez kapcsolt, így kialakítva egy foszfát-észtert vagy egy éterkapcsoló csoportot a biomolekulán. Végezetül az X’¹BM jelentése az, hogy a hisztidinszármazék Ne és/vagy Na helyén lévõ halogenid, azid, pszeudohalogenid, foszfát¹, tiol- vagy szililcsoport a biomolekula S¹, OH¹ vagy amincsoportjához kapcsolt. A találmányt közelebbrõl a következõ példákkal mutatjuk be, amelyekkel semmiféle módon nem szándékozunk korlátozni a találmányt. A példák leírják a biomolekulák címkézésére használható modellrendszert. Megjegyezzük, hogy ugyanilyen módon egyéb biomolekulák, mint aminosavak és peptidek, szintén címkézhetõk. A példákban a következõ ábrákra van utalás: 1. ábra: A 3 vegyület Ortep plotja, ahol az ellipszoidokat az 50%¹os valószínûségnél rajzoltuk meg. 2. ábra: A 6 vegyület Ortep plotja, ahol az ellipszoidokat az 50%¹os valószínûségnél rajzoltuk meg, bemutatva az aszimmetrikus egységben lévõ két molekula közül az egyiket. 3. ábra: A 13 vegyület Ortep plotja, ahol az ellipszoidokat az 50%¹os valószínûségnél rajzoltuk meg, ahol az aszimmetrikus egységben lévõ két molekula közül az egyiket mutattuk be.
5
10
15
20
25
30
Példák 1. példa Na¹ és Nd-védett karbamid-hisztidin elõállítása (1. reakcióvázlat) 5-Oxo-5,6,7,8-tetrahidroimidazo[1,5¹c]pirimidin-7karbonsav-metil-észter (3 vegyület) A vegyületet az irodalmi módszer kismértékû módosításával állítottuk elõ (R. Jain és munkatársai Tetrahedron, 1996, 52, 5363). L¹Hisztidin-metil-észter (2,73 g, 11,28 mmol) dimetil-formamidban (80 ml) készült oldatához Im 2 CO¹t adagoltunk (1,88 g, 11,61 mmol) szobahõmérsékleten. A reakciókeveréket 70 °C¹on 6 órán át melegítettük, szobahõmérsékletre hûtöttük, és óvatosan NaHCO3 1 M vizes oldatára öntöttük (250 ml). Kevés szilárd anyag vált ki a vizes rétegbõl, amit CH2Cl2-vel extraháltunk. Az extrakció során a csapadék teljes mértékben feloldódik a CH2Cl2ben. Az egyesített szerves extraktumokat Na2SO4 fölött szárítottuk, csökkentett nyomáson töményítettük és flash-oszlopkromatográfiásan tisztítottuk, és így kaptuk a 3¹as vegyületet fehér szilárd anyagként (1,35 g, 61%). Rf=0,2 (EtOAc 100%); 1H–NMR (500 MHz, CD3CN, 25 °C): d=8,01 (s, 1H; CHim), 6,77 (s, 1H; CHim), 6,61 (széles s, 1H; NH), 4,37–4,34 (m, 1H; CHCO), 3,67 (s, 3H; OCH 3 ), 3,25–3,23 (m, 2H; CH 2 CH); 13 C–NMR (500 MHz, CD 3 CN, 25 °C):
35
40
45
50
55
60 8
2
d=172,1, 149,2, 135,4, 126,9, 125,9, 53,6, 53,5, 23,7; MS (ESI): m/z (%): 195,73 (100) [M+], 167,8 (35), 135,8 (24); elemanalízis a C8H9N3O3 képlet alapján: számított (%): (195,18): C 49,23, H 4,62, N 21,54; talált: C 49,32, H 4,77, N 21,24. A röntgen-szerkezetanalízisre megfelelõ kristályokat EtOAc-ból végzett lassú bepárlással kaptunk. 2. példa Karboxilát funkcionalitás beépítése az Ne helyre (1. reakcióvázlat) 2-(2¹terc-Butoxi-2-oxo-etil)-7metoxi-karbonil-5-oxo-5,6,7,8tetrahidroimidazo[1,5¹c]pirimidin-2-ium-bromid (4 vegyület) Bróm-ecetsav-terc-butil-észtert (0,57 ml, 3,86 mmol) adagoltunk a 3 vegyület (250 mg, 1,28 mmol) CH3CN-ben (25 ml) készült oldatához. A reakciókeveréket 24 órán át refluxáltattuk, szobahõmérsékletre hûtöttük és vákuumban töményítettük. A maradékot Et2O-val (2×10 ml) és THF-fel (2×5 ml) mostuk és vákuumban szárítottuk, és így kaptuk a 4 vegyületet fehér ragadós szilárd anyagként, amit további tisztítás nélkül alkalmaztunk a következõ lépésben. 1H–NMR (300 MHz, D2O, 20 °C): d=9,39 (s, 1H; CHim), 7,40 (s, 1H: CHim), 5,05 (s, 2H; CH2Nim), 4,78–4,61 (m, 1H; CHCO), 3,63 (s, 3H; OCH 3 ), 3,42–3,39 (m, 2H; CH2CH), 1,39 (s, 9H; tBu); MS (ESI): m/z (%): 309,40 (13) [M+–HBr], 253,80 (100) [M+–HBr–(CH2=C(CH3)2)]. 3. példa Ne-védett hisztidin elõállítása (1. reakcióvázlat) Metil-N-[(benzil-oxi)-karbonil]-1-(2¹terc-butoxi-2oxo-etil)-hisztidinát (6 vegyület) A nyers 4 vegyület (390 mg) THF-ben (50 ml) készült oldatához DIPEA¹t (0,52 ml, 3,01 mmol) és BnOH¹t (2,1 ml, 20,08 mmol) adagoltunk. 16 órás refluxáltatást követõen a reakcióelegyet szobahõmérsékletre hûtöttük, csökkentett nyomáson töményítettük és flash-oszlopkromatográfiásan tisztítottuk, és így kaptuk a 6 vegyületet fehér szilárd anyagként (260 mg, 62% a 3 vegyületre számítva). Rf=0,15 (CH2Cl2/MeOH 45:1); 1 H–NMR (500 MHz, CD 3 CN, 25 °C): d=7,39–7,32 (m, 6H; 5×CHph, CHim), 6,78 (s, 1H; CHim), 6,66 (széles d, J=7,8 Hz, 1H; NH), 5,06 (s, 2H; CH2¹Bn), 4,58 (s, 2H; CH2Nim), 4,42 (q, J=2,6 Hz, 1H; CHCO), 3,62 (s, 3H; OCH3), 2,96 (t, J=5,26 Hz, 2H; CH 2 CH); 13 C–NMR (500 MHz, CD 3 CN, 25 °C): d=173,2, 168,3, 157,0, 139,1, 138,2, 137,8, 129,5, 129,0, 128,9, 119,2, 83,2, 67,2, 66,9, 55,2, 52,7, 49,3, 30,2, 28,2; MS (ESI): m/z (%): 417,53 (100) [M+]; elemanalízis a C21H27N3O6 képlet alapján: számított (%) (417,48): C 60,43, H 6,47, N 10,07; talált: C 60,43, H 6,57, N 9,97. A röntgen-szerkezetanalízisre megfelelõ kristályokat 1¹hexénbõl EtOAc¹ba történõ gõzdiffúzióval kaptuk.
1
HU 007 711 T2
4. példa Védésmentesített funkcionalitásokkal rendelkezõ hisztidinvegyület elõállítása és biomolekulához kapcsolása (2. reakcióvázlat) Metil-N-[(benzil-oxi)-karbonil]-1-{2¹[(1¹etoxikarbonil-2-fenil-etil)-amino]-2-oxo-etil}-hisztidinát (10a vegyület) A 6 vegyület (140 mg, 0,34 mmol) CH2Cl2/TFA keverékben (2:2 ml) készült oldatát 2,5 órán át szobahõmérsékleten kevertük. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítottuk és vákuumban szárítottuk tovább. A maradékot, a nyers 8 vegyületet CH2Cl2-ben (10 ml) oldottuk és Et3N csepegtetéses adagolásával semlegesítettük. BOP¹t (148 mg, 0,34 mmol) és Et3N¹t (46 ml, 0,34 mmol) adagoltunk a reakciókeverékhez. 45 perc elteltével fenil-alanin-etil-észter (84,6 mg, 0,37 mmol) és Et3N (51 ml, 0,37 mmol) CH2Cl2-ben (10 ml) készült oldatát adagoltuk lassan egy fecskendõvel. A reakciókeveréket további 2,5 napon át kevertük szobahõmérsékleten. Az oldatot CH2Cl2-vel (30 ml) hígítottuk és 1 N HCl-oldattal (20 ml), 1 N NaHCO3-oldattal (20 ml)
2
és sóoldattal (20 ml) extraháltuk. A szerves réteget Na2SO4 fölött szárítottuk és csökkentett nyomáson töményítettük és flash-oszlopkromatográfiásan tisztítottuk, és így kaptuk a 10a vegyületet színtelen olajként 5 (162 mg, 90%). Rf=0,2 (CH2Cl2/MeOH 40:1); 1H–NMR (500 MHz, CD 3 CN, 25 °C): d=7,37–7,28 (m, 9H; 2×4H–CHph, CHim), 7,16 (d, J=8,23 Hz, 2H; 2×CHph), 6,77 (széles d, J=7,65 Hz, 1H; NH), 6,69–6,66 (m, 2H; CHim, NH), 5,05 (s, 2H; CH2¹Bn), 4,61 (dt, J=7,86 Hz, 10 1H; CH¹Phe), 4,52 (s, 2H; CH2Nim), 4,43–4,41 (m, 1H; CHCO), 4,11 (q, J=7,15 Hz, 2H; CH2CH3), 3,62 (s, 3H; OCH3), 3,10 (dd, J=8,19 Hz, 1H; CH2-Phe), 2,99–2,93 (m, 3H; CH2-Phe, CH2CH), 2,57 (s, N¹CH3), 1,18 (t, J=7,13 Hz, 3H; CH3); 13C–NMR (500 MHz, CD3CN, 15 25 °C): d=173,3, 172,0, 167,8, 157,0, 139,1, 138,3, 138,2, 137,8, 130,4, 129,5, 129,4, 129,0, 128,9, 127,9, 118,9, 67,2, 62,2, 55,2, 54,8, 52,8, 49,9, 38,0, 30,3, 14,5; MS (ESI): m/z (%): 537,53 (100) [M++H]; elemanalízis a C28H32N4O7+0,5[N(CH3)2]3P=O+0,5H2O 20 (634,5) képlet alapján: számított (%): C 58,63, H 6,62, N 12,14; talált: C 58,98, H 6,89, N 12,48.
2. reakcióvázlat
17
11 1. reakcióvázlat
3
5
4 9
1
HU 007 711 T2
2
15
5. példa Funkciós csoport beépítése az Ne helyre [Re(CO)3]+ csoporttal védett hisztidinbe (3. reakcióvázlat) Re-komplex (16a) A 14 komplex (25 mg, 0,059 mmol) és Cs2CO3 (20,4 mg, 0,065 mmol) acetonitrilben (25 ml) készült oldatához etil-bróm-acetát (29,5 mg, 0,176 mmol) acetonitrilben (5 ml) készült oldatát adagoltuk. A reakciókeveréket 35 °C¹on 1,5 órán át melegítettük. Jégecetet adagoltunk a keverékhez semlegesítés céljából. Szokásos feldolgozást követõen a nyers anyagot szilícium-dioxid-gélen kromatográfiásan tiszítottuk, és így kaptuk a 16a komplexet (30 mg, 90%). Rf=0,15 (EtOAc/EtOH 5:1); 1 H–NMR (300 MHz, CD 3 CN, 20 °C): d=7,95 (s, 1H; CHim), 6,92 (s, 1H; CHim), 4,78 (s, 2H; CH2Nim), 4,23–4,16 (q, J=7,1 Hz, 2H; CH2CH3), 3,91–3,87 (m, 1H; CHCO), 3,21–2,98 (q, 2H; CH2CH), 1,28–1,23 (t, J=7,5 Hz, 3H; CH3); 13C–NMR (300 MHz, CD3CN, 20 °C): d=199,5, 197,8, 197,8, 181,8, 168,8, 143,4, 135,7, 120,9, 63,0, 52,6, 49,4, 28,7, 14,4; MS (ESI): m/z (%): 511,8 (100) [M++H], 1020,7 (55) [2M+]; elemanalízis a C15H18N3O7Re (510,5) képlet alapján: számított (%): C 30,59, H 2,76, N 8,23; talált: C 30,84, H 3,0, N 8,06. Re-komplex (16b) Az elõállítás hasonló a 16a elõállításához. A 14 vegyület (25 mg, 0,059 mmol) és Cs2CO3 (20,4 mg, 0,065 mmol) acetonitrilben (25 ml) készült oldatához terc-butil-bróm-acetátot (34,5 mg, 0,176 mmol) adagoltunk. A reakciókeveréket 35 °C¹on 1,5 órán át kevertük. A reakciókeveréket szûrtük, csökkentett nyomáson szárítottuk és szilícium-dioxid gélen tisztítottuk (EtOAc/EtOH 5:1), és így kaptuk a 16b komplexet (29 mg, 90%). 1H–NMR (300 MHz, CD3CN, 20 °C) d=7,93 (s, 1H; CHim), 6,90 (s, CHim), 4,65 (s, 2H; CH2Nim), 3,94–3,25 (m, 1H; CHCO), 3,27–3,23 (q, 2H; CH 2 CH), 1,45 (s, 9H; tBu); 13 C–NMR (CD 3 CN) d=181,3, 167,3, 143,1, 135,2, 120,6, 83,8, 52,3, 49,7, 28,5, 28,0, 27,8; MS (ESI): m/z (%): 539,9 (100) [M+], 1076,8 (50); elemanalízis a C15H18N3O7Re (538,5)
20
25
30
35
40
45
50
55
60 10
képlet alapján: számított (%): C 33,43, H 3,34, N 7,80; talált: C 33,30, H 3,85, N 7,68. Re-komplex (15) Az észtercsoportok hidrolizálására a 16a vegyület (30 mg, 0,057 mmol) metanolban (5 ml) és LiOH-oldatban (0,5 M, 2 ml) készült oldatát egész éjen át szobahõmérsékleten kevertük, és a 16b vegyületet (15 mg, 0,028 mmol) metilén-kloridban (2 ml) és trifluorecetsavban (2 ml) készült oldatként kevertük 2 órán át szobahõmérsékleten. A két nyersterméket oszlopkromatográfiásan tisztítottuk (EtOH/THF/AcOH 10:1:0,1), és így kaptuk a 15 komplexet (95%, illetve 90%¹os kitermelés). 6. példa Biomolekula kapcsolása a [Re(CO)3]+-védett hisztidin karboxilátcsoportjához és a [Re(CO)3]+ védõcsoport eltávolítása (4. reakcióvázlat) Re-komplex (17) A 15 komplex (8 mg, 0,02 mmol) CH2Cl2/DMF keverékében (3:0,2 ml) készült kevert oldatához BOP¹t (7,4 mg, 0,02 mmol) és Et3N¹t (2 ml, 0,02 mmol) adagoltunk szobahõmérsékleten. 30 perc múlva fenil-alanin-etil-észter (4 mg, 0,02 mmol) és Et 3 N (2 ml, 0,02 mmol) CH2Cl2-ben (2 ml) készült oldatát adagoltuk csepegtetve a komplex oldatához fecskendõ segítségével. A reakciókeveréket egész éjen át kevertük. A reakcióoldatot vákuumban töményítettük. A maradékot dietil-éterrel (2×5 ml) kezeltük. A fehér szilárd anyagot THF-ben oldottuk (10 ml), és az oldhatatlan szilárd anyagot kiszûrtük. A szûrletet vákuumban töményítve kaptuk az etil-észterét a 17 komplexnek (75%). 1H–NMR (500 MHz, CD CN, 25 °C): d=7,8 (s, 1H; 3 CHim), 7,34–7,21 (m, 5H; CHph), 6,8 (s, 1H; CHim), 4,63–4,59 (m, 1H; CHCO), 4,53 (d, 2H; CH2Nim), 4,08 (q, 2H; CH 2 CH 3 ), 3,92–3,88 (m, 1H; CH–His), 3,18–3,10 (2×dd, 2H; CH2¹His, CH2-Phe), 3,05–2,96 (2×dd, 2H; CH2¹His, CH2-Phe), 1,17 (t, 3H; CH3); 13C–NMR (500 MHz, CD CN, 25 °C): d=198,1, 196,6, 3 196,5, 180,4, 170,8, 165,5, 142,0, 136,7, 134,3, 129,4, 128,4, 126,8, 124,9, 120,3, 119,6, 61,2, 54,1, 51,4,
1
HU 007 711 T2
49,2, 37,2, 27,7, 13,4; IR (KBr): n=2020, 1886, 1733, 1636 cm–1; MS (ESI): m/z (%): 659 (100) [M++H]; elemanalízis a C22H29N4O8Re (658,6) képlet alapján: számított (%): C 40,12, H 3,67, N 8,51; talált: C 39,31, H 3,83, N 8,25. A komplex etil-észter-csoportját úgy hidrolizáltuk, hogy a komplexet 0,5 M LiOH és MeOH (1:2) keverékében készült oldatában kevertük egész éjen át szobahõmérsékleten a fentiek szerint, és így kaptuk a 17 komplexet kvantitatív kitermeléssel. Általános eljárás a rénium oxidálással való eltávolítására a 17 és 15 komplexekbõl A 17 vagy 15 vegyület oldatát (5 mM H2O-ban, 500 ml) és egy sav [HCl, trifluor-ecetsav (TFA) vagy ecetsav] oldatát (1,0, 0,1 vagy 0,01 M vízben, 70 ml)
2
egy fiolába adagoltuk, amit lezártunk és nitrogénnel gázmentesítettünk (10 perc). H2O2¹t (0,43, 0,86 vagy 1,29 M vízben, 60 ml) adagoltunk a gázmentesített fiolába, majd a mintát 50 °C¹on melegítettük. A reakcióke5 veréket HPLC módszerrel monitoroztuk 250 nm¹en, amikor is a reakciókeveréket (10 ml) a 4., 8., 24. és 48. órában injektáltuk a HPLC¹be, illetve addig, amíg a réniumkomplex el nem tûnt a spektrumból. A reakciókörülmény hatásosságát úgy számítottuk ki, hogy megha10 tároztuk a csúcs alatti területek arányát a réniumkomplexre és a kialakult perrenátra nézve. Amikor már a réniumkomplex nem volt megfigyelhetõ, a reakciókeveréket mangán-dioxiddal kezeltük a maradék H2O2 eltávolítására a reakciókeverékbõl, majd 0,2 mm¹es Watt15 man-szûrõn szûrtük, és így kaptuk a koordinálatlan ligandum oldatát, amit 99mTc címkézésre használtunk.
3. reakcióvázlat
14
15 4. reakcióvázlat
15
17
17
11
15 5 11
1
HU 007 711 T2
7. példa Hisztidin elõállítása, amely az Ne helyen függõ –NH2 csoportot tartalmaz (5. reakcióvázlat) 3-{1¹[3¹(9H-FIuorén-9-il-metoxi-karbonil-amino)propil]-1H-imidazol-4¹il}-2-(3¹trimetil-szilanil-propionilamino)-propionsav-metil-észter (18 vegyület) A 3 vegyület (196 mg; 1,0 mmol) és N¹Fmoc-3-jódpropil-amin (1,22 g; 3,0 mmol) MeCN-ben (40 ml) készült keverékét refluxáltatás mellett 4,5 napon át melegítjük. Amikor a 3 vegyület, azaz a karbamidszármazék már nem volt detektálható VKR-módszerrel (vékonyréteg-kromatográfiás módszer), a reakciókeveréket vákuumban töményítettük, és így egy fehér szilárd anyagot kaptunk. A szilárd anyagot újra oldottuk MeCN-ben (40 ml), és 2¹trimetil-szilil-etanolt (355 mg; 3,0 mmol) és DIPEA¹t (259 mg; 2,0 mmol) adagoltunk. A kapott keveréket szobahõmérsékleten, N 2 alatt kevertük 16 órán át. Az oldószert vákuumban eltávolítottuk, majd oszlopkromatográfiásan tisztítottuk (szilícium-dioxid, EtOAc). Kitermelés 316 mg (53% a két lépésre számítva); habos színtelen szilárd anyagot kaptunk. Elemanalízis a C31H40N4O6Si képlet alapján: számított (%) C, 62,8; H, 6,8; N 9,5; talált: C, 62,1; H, 6,2; N, 9,5 nmax. (KBr)/cm–1 3329br NH, 1730s, 1698vs C=O; dH (300,8 MHz; CD3CN) 7,82 (2H, pszeudo¹d, 2×ArH), 7,64 (2H, pszeudo¹d, 2×ArH), 7,38 (3H, m, 2×ArH+N2CHHis), 7,32 (2H, pszeudo¹t, 2×ArH), 6,79 (1H, s, CHHis), 6,55 (1H, d, J=7,5, NH), 5,68 (1H, széles s, NH), 4,35 (3H, átfedõ m, OCH 2 -Fmoc+C a H), 4,22 (1H, t, J=6,6, OCH2CH¹Fmoc), 4,07 (2H, m, CH2), 3,87 (2H, m, CH2), 3,60 (3H, s, OCH3), 2,99 (2H, m, CH2), 2,90 (2H, m, CbH2), 1,85 (2H, m, CH2), 0,93 (2H, m, CH2), 0,01 (s, 9H, Si¹(CH3)3); dc (CD3CN; 75,47 MHz) 173,7 (C=Oester), 157,7, 157,6 (2×C=Oamide), 145,5, 142,2 (2×ArCq), 138,4 (CHis), 128,9, 128,3 (2×ArCH), 126,4 (CHis), 121,2, 118,6 (2×ArCH), 118,1 (CHis), 66,9, 63,7, 55,3, 52,7, 98,3, 44,9, 38,6, 32,1, 30,1, 18,3, 1,4 (Si-(CH3)3); m/z (ESI-poz., MeOH) 393, 371, 533, 593 [M+H]+. 3-[1¹(3¹Amino-propil)-1H-imidazol-4¹il]-2-(3¹trimetilszilanil-propionil-amino)-propionsav-metil-észter (19 vegyület) A 18 vegyületet (255 mg; 0,43 mmol) 1/1 arányú DMF/NEt2 keverékben (8 ml) oldottuk. Miután a keveréket 1 órán át szobahõmérsékleten kevertük, az oldószert vákuumban eltávolítottuk. Preparatív HPLC-vel végzett tisztítással (C¹18ec oszlop; trifluor-ecetsavpuffer) kaptuk a 19 vegyületet színtelen habos szilárd anyagként annak trifluor-acetát-sója formájában. Kitermelés: 190 mg (91%). dH (300,08 MHz; CD3CN) 8,59 (1H, s, N2CHHis), 7,95 (3H, széles, NH3+), 7,26 (1H, s, CHHis), 6,56 (1H, d, J=8,4 Hz, NH), 4,43 (1H, m, CaH), 4,24 (2H, t, J=6,9 Hz, CH2), 4,05 (2H, m, CH2), 3,68 (3H, s, OCH3), 3,22 (1H, m, CbH), 3,06 (1H, m, CbH), 2,95 (2H, t, J=6,9, CH2), 2,21 (2H, m, CH2), 0,89 (2H, m, CH2), 0,00 (9H, s, Si¹(CH3)3); dc (75,47 MHz; CD3CN): 172,7 (C=Oester), 162,2 (q, Jc, F 34,6, CF3), 157,7 (C=Oamide), 135,9, 132,4, 120,7 (3×CHis), 64,0, 54,6, 53,2, 47,0, 37,3, 28,6, 27,6, 18,2 (OCH3, Ca, Cb+5×CH2), 1,5 (Si-(CH3)3); m/z
2
(ESI-pos.; MeOH): 343,1, 370,8 ([M+H]+, C16H30N4O4Si képlet alapján 371,2) 762 [2M+Na]+.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 12
8. példa Biomolekulák kapcsolása a hisztidinszármazék aminocsoportjához (5. reakcióvázlat) a) Biotin: D¹(+)-Biotint (35 mg; 0,14 mmol) oldottunk 4/1 arányú (v/v) DMF/NEt3 keverékben (2,5 ml). Ehhez a keverékhez a 19 vegyület (91 mg; 0,19 mmol) dimetil-formamidban (2 ml) készült oldatát, majd TBTU¹t (46 mg; 0,14 mmol) adagoltunk. Miután a keveréket 45 percen át szobahõmérsékleten kevertük, vákuumban szárazra pároltuk. A maradékot felvettük 2 M NaHCO3-oldatban (20 ml), és CH2Cl2-ben extraháltuk (3×20 ml). Az egyesített szerves rétegeket 0,5 M HCloldattal (20 ml), vízzel (20 ml) és sóoldattal (2×20 ml) mostuk. Az oldószer eltávolítását követõen kaptuk a 20 vegyületet színtelen habos szilárd anyagként. Kitermelés: 67 mg (78% a biotinra számítva). dH (300,08 MHz; CD3OD) 7,60 (1H, s, N2CHHis), 6,95 (1H, s, CHHis), 4,48 (1H, m), 4,41 (1H, m), 4,29 (1H, m), 4,09 (2H, m), 3,98 (2H, m), 3,69 (3H, s, OCH3), 3,16 (3H, átfedõ m, CH2+H), 2,95–2,78 (5H, átfedõ m, 2×CH2+H), 2,70 (1H, m), 2,19 (2H, m, CH2), 1,93 (2H, m, CH2), 1,63 (4H, m, 2×CH2), 1,43 (2H, m, CH2), 0,94 (2H, m, CH2), 0,01 (9H, s, Si¹(CH3)3; dc (75,47 MHz; CD3OD): 176,4, 174,3 (C=Oester+N2C=O), 166,3, 158,9 (C=Oamide), 138,5, 138,3, 118,7 (ArCHis), 64,2, 64,4, 61,7, 57,1, 55,7, 52,8, 45,7, 41,1, 37,4, 36,8, 31,9, 31,1, 29,8, 29,5, 26,8, 18,6 (10×CH2, Ca, Cb, OCH3, 3×CH), 1,5 (Si-(CH 3 ) 3 ; m/z (FAB + ; NBA) 597,2898 (M + , C26H45N6O6SiS képlet alapján 597,2891). b) Enkefalin: A tisztított 19 vegyület (39 mg; 0,08 mmol) és védett enkefalin (85 mg; 0,08 mmol) dimetil-formamidban (1,5 ml) és NEt3-ban (0,5 ml) készült oldatához TBTU¹t (25 mg; 0,08 mmol) adagoltunk. A keveréket 45 percen át szobahõmérsékleten kevertük és vákuumban szárazra töményítettük. A vegyületet HPLC-módszerrel tisztítottuk (1. futtatás: C8¹oszlop; 50 mM TRIS-puffer; 2. futtatás: C8¹oszlop; trifluor-ecetsav-puffer). Kitermelés: 42 mg (49%) 21 vegyület, amit üveges szilárd anyagként kaptunk. dH (500,25 MHz; CD3OD) 8,77 (1H, s, N2CHHis), 7,43 (1H, s, CHHis), 7,28 (4H, m, 4×ArH), 7,20 (1H, m, ArH), 7,12 (2H, pszeudo¹d, 2×ArH), 6,90 (2H, pszeudo¹d, 2×ArH), 4,52 (1H, m, CaH), 4,49 (1H, m, CaH), 4,22–4,09 (7H, átfedõ m, 2×CaH+2×CH2), 3,85 (2H, m, CH2-Gly), 3,78 (2H, m, CH2-Gly), 3,73 (3H, s, OCH3), 3,25–3,02 (9H, átfedõ m, 2×CH2+3×CbH), 2,84 (1H, m, CbH), 2,04 (1H, m, CH2¹CH2¹CH2), 1,71 (1H, m, CgHLeu), 1,56 (2H, m, CbH2), 1,36 (9H, s, OC(CH3)3), 1,28 (9H, s, OC(CH3)3), 0,94 (3H, d, J=6,3, Leu-CH3), 0,89 (3H, d, J=6,3, Leu-CH3); dc (90,5 MHz; CD3OD) 175,5, 175,1, 174,2 172,9, 172,6, 158,7, 158,2 (C=O), 155,4, 138,3, 136,4, 133,6, 130,9, 130,2, 129,6, 128,0, 125,2, 121,2 (összes ArC), 81,0, 79,6 (Cq), 64,5, 58,0, 57,5, 54,4, 53,2, 47,6, 44,1, 41,0, 38,1, 38,0, 36,3, 30,8, 29,2, 28,7, 28,2, 25,9, 23,5, 21,7, 18,6, –1,5 (CH, CH2 és CH 3 ;); m/z (FAB + ; NBA) 1064,5789 ([M + H] + , C53H82N9O12Si képlet alapján: 1064,5852).
1
HU 007 711 T2
2
5. reakcióvázlat
19 18
19
20
19
21
9. példa Kétfunkciós csoport kapcsolása az Ne és Na helyekre (6. reakcióvázlat) 2,6-bisz-terc-Butoxi-karbonil-metil-7-metoxikarbonil-5-oxo-5,6,7,8tetrahidroimidazo[1,5¹c]pirimidin-2-ium-bromid (22 vegyület) NaH¹t 13 mg (0,307 mmol) szuszpendáltunk szárított DMF-ben (2 ml) 0 °C¹on. A 3 vegyület 60 mg (0,307 mmol) dimetil-formamidban (1 ml) készült oldatát adagoltuk óvatosan csepegtetve. A reakciókeveréket 0 °C¹on 30 percen át, majd szobahõmérsékleten további 1 órán át kevertük, amíg a gázképzõdés megszûnt. A reakcióelegyet ismét 0 °C¹ra hûtöttük. Bróm-ecetsavterc-butil-észtert (0,07 ml, 0,461 mmol) adagoltunk nagyon lassan, hideg körülmények között egy fecskendõvel. Az oldatot 0 °C¹on 30 percen át, majd szobahõmérsékleten további 2 órán át kevertük. Amikor a 3 vegyület nem volt detektálható VKR-módszerrel (vékonyrétegkromatográfiásan), még egyszer bróm-ecetsav-terc-butil-észtert (0,14 ml, 0,921 mmol) adagoltunk csepegtetve. A reakciókeveréket egész éjen át 70 °C¹on melegítettük. A reakciót VKR-módszerrel vizsgáltuk. 15 órás melegí-
30
35
40
45
50
tést követõen az oldószert szobahõmérsékletre hûtöttük és vákuumban töményítettük. A nyers maradékot kétszer dietil-éterrel kezeltük a bromid feleslegének eltávolítására, majd vákuumban szárítottuk. A nyers 22 vegyületet további tisztítás nélkül alkalmaztuk a következõ lépésben. MS (ESI): m/z: 424,56 [M–Br]+ 2-[terc-Butoxi-karbonil-metil-(9H-fluorén-9-ilmetoxi-karbonil)-amino]-3-(1¹terc-butoxi-karbonilmetil-1H-imidazol-4¹il)-propionsav-metil-észter (23 vegyület) A nyers 22 vegyületet acetonitrilben (10 ml) oldottuk szobahõmérsékleten. Fm¹OH¹t (181 mg, 0,921 mmol) és DIPEA¹t (0,08 ml, 0,461 mmol) adagoltunk. 24 órán át, szobahõmérsékleten végzett keverést követõen a reakcióelegyet 1 N HCl-oldat adagolásával semlegesítettük és csökkentett nyomáson töményítettük. A maradékot CH2Cl2-ben oldottuk, és egyszer vízzel és egyszer 1 N HCl-oldattal extraháltuk. A szerves réteget Na2SO4 fölött szárítottuk és vákuumban töményítettük és flash-oszlopkromatográfiásan tiszítottuk, és így kaptuk a 23 vegyületet. (Kitermelés: 40–50% a 3 vegyületre számítva.)
6. reakcióvázlat
22
23
13
1
HU 007 711 T2
10. példa Aktivált hisztidinszármazékok elõállítása 2-(9H-Fluoren-9-il-metoxi-karbonil-amino)-3(1¹pentafluor-fenil-oxi-karbonil-metil-1H-imidazol-4¹il)propionsav-metil-észter (24 vegyület): 9 vegyületet (0,198 mmol) THF-ben (3 ml) oldottunk, és piridint adagoltunk a pH¹nak 6¹7 értékre való semlegesítése céljából. Piridint (0,03 ml, 0,396 mmol) adagoltunk. Ezt követõen trifluor-ecetsav-pentafluor-fenil-észter (TFAPfp) (111 mg, 0,396 mmol) THF-ben (2 ml) készült oldatát adagoltunk csepegtetve, nagyon lassan, szobahõmérsékleten. A reakcióelegy 19 órán át, szobahõmérsékleten végzett keverését követõen az oldatot vákuumban töményítettük. A nyers maradékot diklór-metánban oldottuk, és egyszer 0,5 N HCl-oldattal és egyszer 0,5 N Na2CO3-oldattal és egyszer sóoldattal extraháltuk. A szerves réteget Na2SO4 fölött szárítottuk és vákuumban töményítjük és flash-oszlopkromatográfiásan tisztítottuk, és így kaptuk a 24 vegyületet. (Kitermelés: 55%); MS (ESI): m/z: 615,78 [M+H]+
5
10
15
20
25 (24) 11. példa Általános kapcsolási eljárás, amelyben egy hisztidinszármazékot peptidhez kapcsolunk Kapcsolás: 9 vagy 24 vegyületet alkalmazunk a kapcsolási reakciókban. A ligandumok egyikét (általában 0,02–0,08 mmol) dimetil-formamidban oldottuk és Et3N¹t vagy DIPEA¹t (0,03–0,1 mmol) adagoltunk bázisként. A 9 vegyület esetében BOP¹t vagy TBTU¹t (általában 0,025–0,09 mmol) adagoltunk kapcsolószerként, így a ligandum karbonsavcsoportját 30 perc alatt, szobahõmérsékleten aktiváltuk. Ezt követõen a peptidnek (általában 0,01–0,02 mmol) DMF-ben készült oldatát adagoltuk csepegtetve egy fecskendõvel, ahol a peptid lehet (béta)-„hajtûkanyar” (hairpin loop) peptid, RGD vagy bombezin. A 24 vegyület esetében a peptidoldatot kapcsolóreagens nélkül, közvetlenül a bázis adagolása után adagoltuk. A 24 vegyület jobban alkal-
30
2
mazható, amennyiben a peptid rendelkezik egy szabad karbonsavcsoporttal, mint például a Phe-Gly¹OH, GlyPro¹OH, Gastrin (7 szabad COOH van a szerkezetben) vagy TOCA¹OH. A peptidtõl függõen a reakciókeveréket 2–18 órán át kevertük. A reakciót HPLC módszerrel követtük. Amikor a peptid már nem volt detektálható a HPLC módszerrel, a reakcióelegyet vákuumban töményítettük. A nyersterméket preparatív HPLC módszerrel tisztítottuk, és a terméket MS módszerrel azonosítottuk. Védésmentesítés: A hisztidin konjugált peptidet (általában 0,003–0,005 mmol) piperidinben oldottuk (1 ml) szobahõmérsékleten. 30–40 perces keverést követõen a reakciókeveréket jéghideg vízre (3 ml) öntöttük. A fehér szilárd anyagot, fulvin, szûrtük és vízzel öblítettük (1 ml). A vizes oldatot vákuumban töményítve egy fehér szilárd anyagot kaptunk egyben, ami Fmoc- és metil-észter, a védésmentesített terméket további tisztítás nélkül alkalmaztuk címkézési célra. Címkézés: A konjugát oldatát [vízben vagy foszfátpufferben (pH=7,4) készült 10–3 vagy 10–4 M oldat (100 ml)] egy fiolába adagoltuk. Ezután az oldathoz [99mTc(CO)3(H2O)3]+¹t (900 ml) adagoltunk a fiolába (összkoncentráció: 10–4 vagy 10–5 M). Az oldatot 90 °C¹on 30 perc–1 órán át melegítettük. Általában a címkézés 30 perc alatt és 10–4 M koncentráció mellett kvantitatív volt, és 30 perc alatt 20–50%¹os volt 10–5 M koncentráció mellett. A (béta)-„hajtûkanyar” (hairpin loop) peptid konjugátuma kvantitatív címkézést mutatott 30 perc alatt 10–5 M koncentrációnál is.
12. példa Általános címkézési eljárás A ligandum oldatát (vízben készült, 10–3 vagy 10–4 35 M, 100 ml), amit egy szerves szintézissel kaptunk vagy a rénium oxidálásos úton, egy fiolába adagoltuk, amit ezt követõen lezártunk és nitrogéngázáram segítségével 10 perc alatt gázmentesítettünk. A [99mTc(CO)3(H2O)3]+ (900 ml) oldatát adagoltuk a fiolába egy fecskendõvel, 40 és a fiolát 70–90 °C¹on 30 percen át melegítettük, és így kaptuk a [ 99 Tc(CO) 3 ] + komplexeket, [(5) 99mTc(CO) ] és [(11)99mTc(CO) ] magas kitermeléssel 3 3 a HPLC szerint, ahol radioaktív detektálást alkalmaztunk. Az összes eredményt megadjuk a 4. táblázatban.
4. táblázat Módszer
A ligandum száma
Koncentráció (M)
Hõmérséklet (°C)
Idõ (perc)
Kitermelés (%)
Kétlépéses címkézés
5
10–4
70
30
kvantitatív
5
10–5
70
30
91[a]
5
10–6
70
30
20[b]
11
10–4
90
30
kvantitatív[c]
11
5×10–5
90
30
kvantitatív
11
10–5
90
30
kvantitatív[d]
11
10–6
90
30
41[e]
14
1
HU 007 711 T2
2
4. táblázat (folytatás) Módszer
A ligandum száma
Koncentráció (M)
Hõmérséklet (°C)
Idõ (perc)
Kitermelés (%)
Egyedényes címkézés
11
10–4
90
20
94
11
5×10–5
90
20
96
11
10–5
90
20
34[e]
[a]: A címkézés 1 óra alatt kvantitatívvá vált. Az 5 ligandum oxidálásos módszerrel 75 °C¹on 30 perc alatt 85%¹os kitermeléssel képzõdött. [b]: A címkézés 64%¹os kitermelést ért el 1,5 óra alatt. [c]: A 11 ligandum oxidálása 88%¹os kitermelést eredményezett 90 °C¹on, 30 perc alatt. [d]: A 11 ligandum oxidálása 73%¹os kitermelést eredményezett 90 °C¹on, 30 perc alatt. [e]: A címkézés 65%-nál jobb kitermelést ért el 1,5 óra alatt.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Hisztidinszármazék, amely az N e atomján –(CH2)n–R-csoporttal származékoltatott hisztidint tartalmaz, ahol n=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10; R jelentése –NH2, –COOR1, –OH, –X és –X’-biomolekula csoport közül választott; R1 jelentése H, t¹butil vagy pentafluor-fenil; X jelentése a halogenidek, azidok, pszeudohalogenidek, foszfát¹, tiol- és szililcsoport közül választott; X’ jelentése egy kapcsolóblokk, amely egy kötéssel kapcsolódik a biomolekulához, amely COOH és NH2, NH2 és COOH, OH és Ph¹OH vagy X és a biomolekulában lévõ elektrofil funkciós csoport közötti reakcióból származik, ahol Ph jelentése a biomolekula egy foszforsavcsoportja; és a biomolekula a polipeptidek, peptidek, aminosavak, cukrok és vitaminok közül választott, és ahol a hisztidinszármazék Na, Nd és karboxilcsoportja fém-trikarbonillal védett. 2. Az 1. igénypont szerinti hisztidinszármazék, ahol a hisztidinszármazék az Na atomon származékoltatott. 3. A 2. igénypont szerinti hisztidinszármazék, ahol a hisztidinszármazék az Na helyen származékoltatott egy –(CH2)n–R-csoporttal, ahol n=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10; R az –NH2, –COOR1, –OH, –X és –X’-biomolekula közül választott; R1 jelentése H, t¹butil vagy pentafluor-fenil; X jelentése halogenidek, azidok, pszeudohalogenidek, foszfát¹, tiol- és szililcsoport közül választott; X’ jelentése egy kapcsolóblokk, amely egy kötéssel kapcsolódik a biomolekulához, amely COOH és NH2, NH2 és COOH, OH és Ph¹OH vagy X és a biomolekulában lévõ elektrofil funkciós csoport közötti reakcióból származik, ahol Ph jelentése a biomolekula egy foszforsavcsoportja; és a biomolekula a polipeptidek, peptidek, aminosavak, cukrok és vitaminok közül választott. 4. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti hisztidinszármazék, ahol a biomolekulán lévõ elektrofil funkciós csoport S, OH és amin közül választott.
20
25
30
35
40
45
50
55
60 15
5. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti hisztidinszármazék, ahol n=1, 2, 3, 4 vagy 5. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti hisztidinszármazék, ahol a fém-trikarbonil egy radioaktívan jelzett fém-trikarbonil. 7. A 6. igénypont szerinti hisztidinszármazék, ahol a radioaktívan jelzett trikarbonil [99mTc(OH2)3(CO)3]+, [188Re(OH2)3(CO)3]+ és [97Ru(OH2)3(CO)3]2+ közül választott. 8. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti hisztidinszármazék, ahol a biomolekula a bombezin, (alfa)MSH-peptidek, oktreotát, szomatosztatin, interleukin–8 (IL8), CCK, (béta)-„hajtûkanyar” peptidek, neurotenzin, biotin és monoklonális antitestek közül választott. 9. Eljárás hisztidinszármazékok elõállítására, amely módszer tartalmazza a következõket: a hisztidinmolekula Na atomjának védése; a hisztidinmolekula Ne atomjának származékoltatása; a származékoltatott hisztidinmolekula Na atomjának védésmentesítése; és tartalmazza továbbá a származékoltatott hisztidinmolekula címkézését a védés, származékoltatás és védésmentesítést követõen, ahol a címkézés során a hisztidinmolekulát radioaktívan jelzett fém-trikarbonillal címkézzük. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, ahol a védés magában foglalja a hisztidinmolekulának az Na és Nd atomjain való védését. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, ahol a védés az N a és N d atom karbonilcsoporttal való védésébõl áll, és így egy hattagú karbamidgyûrû alakul ki. 12. A 9. igénypont szerinti eljárás, ahol a védés a hisztidinmolekula karboxilcsoportjának észterezéssel történõ védésébõl áll, és az Na atomot egy aminvédõ csoporttal védjük. 13. A 9. igénypont szerinti eljárás, ahol az Ne atomot –(CH 2 ) n –R-csoporttal származékoltatjuk, ahol n=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10; R jelentése –NH2, –COOR1, –OH, –X és –X’-biomolekula csoport közül választott; R1 jelentése H, t¹butil vagy pentafluor-fenil; X jelentése a halogenidek, azidok, pszeudohalogenidek, foszfát¹, tiol- és szililcsoport közül választott; és
1
HU 007 711 T2
X’ jelentése egy kapcsolóblokk, amely egy kötéssel kapcsolódik a biomolekulához, amely COOH és NH2, NH2 és COOH, OH és Ph¹OH vagy X és a biomolekulában lévõ elektrofil funkciós csoport közötti reakcióból származik, ahol Ph jelentése a biomolekula egy foszforsavcsoportja; és ahol a biomolekula a polipeptidek, peptidek, aminosavak, cukrok és vitaminok közül választott. 14. Hisztidinszármazék alkalmazása, amely az Ne atomján –(CH2)n–R-csoporttal származékoltatott hisztidint tartalmaz, ahol n=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10; R jelentése –NH2, –COOR1, –OH, –X és –X’-biomolekula csoport közül választott; R1 jelentése H, t¹butil vagy pentafluor-fenil;
2
X jelentése a halogenidek, azidok, pszeudohalogenidek, foszfát¹, tiol- és szililcsoport közül választott; X’ jelentése egy kapcsolóblokk, amely egy kötéssel kapcsolódik a biomolekulához, amely COOH és NH2, 5 NH2 és COOH, OH és Ph¹OH vagy X és a biomolekulában lévõ elektrofil funkciós csoport közötti reakcióból származik, ahol Ph jelentése a biomolekula egy foszforsavcsoportja; és a biomolekula a polipeptidek, peptidek, aminosa10 vak, cukrok és vitaminok közül választott, fém-trikarbonilhoz való koordinálásra a hisztidin karboxilcsoportján, Na és Nd atomján keresztül. 15. A 14. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a fémtrikarbonil [99mTc(OH2)3(CO)3]+, [188Re(OH2)3(CO)3]+ 15 és [97Ru(OH2)3(CO)3)2+ közül választott.
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
