!HU000008379T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 379
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 06450176 2006. 12. 05. 567078 2006. 12. 05.
(73) Jogosult: Marinomed Biotechnologie GmbH, 1210 Vienna (AT)
EP US
(72) Feltalálók: GRASSAUER, Andreas, 1220 Vienna (AT); PRIESCHL-GRASSAUER, Eva, 1220 Vienna (AT); MEIER, Christiane, 2201 Seyring (AT); PRETSCH, Alexander, 2002 Roseldorf (AT) (54)
HU 008 379 T2
A61K 31/731
(21) Magyar ügyszám: E 07 856354 (22) A bejelentés napja: 2007. 12. 04. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20070856354 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 2101792 A2 2008. 06. 12. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 2101792 B1 2010. 03. 31.
(2006.01) A61K 31/737 (2006.01) A61P 31/16 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 08067982 PCT/EP 07/010512
(74) Képviselõ: dr. Török Ferenc, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
jóta-Karragenánt tartalmazó gyógyászati készítmény
A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 6 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.
1
HU 008 379 T2
A jelen találmány az immunológia és a vírusellenes hatóanyagok területére esik, és vírusellenes hatóanyagként jóta-karragenánt tartalmazó gyógyászati készítményre, valamint annak rhinovírusfertõzések megelõzésére vagy gyógyászati kezelésére történõ alkalmazásaira vonatkozik. A találmány háttere A pikornavírusok sok súlyos emberi és állati betegségért felelõs, ribonukleinsavat tartalmazó kis vírusok igen nagy víruscsaládját képviselik. A pikornavírusok négy fõ csoportot tartalmaznak: enterovírusok, rhinovírusok, kardiovírusok és aftovírusok. A humán rhinovírusok legalább 100 szerotípusból állnak, és a közönséges meghûlés elsõdleges okát képezõ anyagok. A szerotípusok nagy száma miatt a vakcina kifejlesztése nehézségekbe ütközik; ezért a vírusellenes anyagok a kezelés legjobb megközelítését képezhetik. A rhinovírusok egy õket körülvevõ kapszidból állnak, amely négy vírusos proteint: VP1¹et, VP2¹t, VP3¹at és VP4¹et tartalmaz. A VP1, VP2 és VP3 proteinek 60 ismétlõdõ protamer ikozahedrális egységbe szervezõdnek. Úgy gondolják, hogy ezek képezik az okát az ilyen vírusokkal társuló antigének sokféleségének. A rhinovírus (HRV)-fertõzések egyszerû meghûléshez vezetnek, amelynek a tünetei a láz, a köhögés és az orrdugulás. A HRV-fertõzés a második leggyakrabban felismert anyag, amely csecsemõkben és fiatal gyerekekben tüdõgyulladással és bronchiolitisszel társul, és rendszerint a korábban már meglevõ légúti betegség súlyosbodásait okozza az asztmában, krónikus elzáródásos tüdõbetegségben vagy cisztás fibrózisban szenvedõ betegeknél. A HRV-fertõzés az asztmasúlyosbodások egyharmadáért–feléért felelõs a kortól függõen, és mind felnõttek, mind gyermekek esetén az asztmás betegek kórházba utalását okozza. A kezelésmegközelítések magukban foglalják rhinovírusspecifikus RNS alkalmazását, amit a DE 19825395-ben ismertetnek, amely a kapszid kanyonrégiójához kötõdik, és szükséges a gazda–receptor (például ICAM-1, intracelluláris adhéziós molekula¹1) kötõdéséhez és sejtfertõzéséhez. Egy másik módszer abban áll, hogy az US 6,326,004-ben és az US 6,096,862-ben ismertetett oldható ICAM¹1 proteineket vagy ICAM¹1 származékokat (tICAM-1, csonkított ICAM¹1) adagolnak vírusos részecskék (virionok) semlegesítése céljából. Rhinovírusokkal szemben vírusellenes hatékonysággal rendelkezõ kémiai vegyületeket az EP 0523803ban nyilvánítottak ki. Rhinovírustüneteket az immunrendszer túlzott vagy nem specifikus reakciója okoz. Ezért a rhinovírusfertõzés általános kezelési formái magukban foglalják fájdalomcsillapítók, így aszpirin vagy acetaminofen/paracetamol, valamint (gyakran pasztilla alakban adagolva) nazális duguláscsökkentõk (amelyek csökkentik a gyulladást az orrjáratokban a helyi véredények szûkítésével), köhögés elleni szerek (amelyek elnyomják az agy köhögésreflexét, vagy hígítják a nyálkát a tüdõben)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
és elsõ generációs antihisztaminok, így bróm-feniramin, klór-feniramin és klemasztin adagolását (amelyek csökkentik a nyálmirigy-elválasztást, és így leküzdik az elzáródott/folyós orrokat, de egyúttal a felhasználót álmossá is teszik). A szakmában a karragenánokat tartalmazó szulfatált poliszacharidok ismertek vírusellenes hatékonyságukról. Egy rendkívül érdekes ismertetésben Gonzalez M. E. et al. (1987, Antimicrob. Agents Chemother. 31, 1388–1393) beszámolnak különbözõ szulfatált poliszacharidok, ideértve a jóta-karragenánt, vírusellenes hatékonyságáról számos állati vírus ellen. A jóta-karragenán vírusellenes hatékonyságot mutatott a beburkolt HSV¹1 és HSV¹2 vírus, a Semliki Forest vírus (SFV), a vakcíniavírus és az afrikai sertéslázvírus (ASF) ellen, valamint a meztelen encephalomyocarditis (EMC) vírus ellen. A jóta-karragenánnak nem volt hatása a beburkolt vezikuláris stomatitisz vírus (VSV) és kanyaróvírus ellen, valamint a meztelen 1¹es típusú poliovírus és 5¹ös típusú adenovírus ellen. Az US 2003/181415 A szulfatált poliszacharidok, így cellulóz-szulfát vírusellenes hatékonyságát ismerteti különbözõ burkolt vírusok és különösen herpes simplex vírus (HSV), Papilloma-vírusok és HIV ellen. A WO 2005/004882 A vírusos fertõzések gyógyászati kezelését ismerteti – kizárva a rhinovírusfertõzést – szulfatált poliszacharidokkal, így karragenánokkal. Az US 2005/171053 A1 ismerteti lambda-karragenán alkalmazását szexuálisan átvitt fertõzések – ideértve a HIV¹1 fertõzést is – terjedésének a meggátlására. Yamada et al. (1997, Carbohydrate Polymers, Appl. Scien. Publishers 32, 51–55) a lambda¹, kappa- és jóta-karragenán és azok szulfatált származékainak HIV1-ellenes hatékonyságát ismertetik. S. F. Tischer et al. (2006, Carbohydrate Polymers, Appl. Scien. Publishers 63, 459–465) a Meristiella gelidiumból elkülönített karragenán hatékonyságát ismertetik herpes simplex és kanyaróvírus ellen. Carlucci et al. (2004, Antiviral Research, Elsevier Science BV. 64, 137–141) a lambda-karragenán védõhatását írják le genitális herpes simplex vírus fertõzés ellen egerekben. Pujol et al. (2006, Planta Medica 72, 121–125) a Gigartina skottsbergiibõl elkülönített karragenán vírusellenes hatását írják le intraperitoneális egér herpes simplex vírus fertõzés ellen. A „karragenán” kifejezés egy gyakran használt gyûjtõszó olyan galaktózalapú, lineáris szulfatált poliszacharidokra, amelyeket tengeri moszatokból (rhodophyceae) extraháltak. Többnyire a sûrítõ¹, gélesítõanyagot stabilizátorként vagy emulgeálószerként használják gyógyászati és élelmiszer-ipari termékekben. 10¹nél több különbözõ karragenán létezik attól a tengerimoszat-fajtától függõen, amelybõl extrahálják. A három fõ típus a jóta¹, kappa- és lambda-karragenán, amelyek kismértékben különböznek szerkezetükben és a szulfatálás mértékében. A jóta-karragenán egy lágygél-képzõ szulfatált galaktán, amelyet fõleg a Gigartina stellata és a Chondrus crispus vörös tengeri moszatból extrahálnak. A kappa-karragenán erõs, me-
1
HU 008 379 T2
rev géleket szolgáltat, és fõleg Kappaphycus cottoniibõl állítják elõ. A legáltalánosabb formát képezõ lambda-karragenánt gyakran használják tejipari termékek sûrítésére. A karragenánok vírusokkal, így például HIV- vagy HSV-vírusokkal szemben mutatott, régóta ismert antivirális hatékonysága ellenére még tisztázásra szorul, hogy a karragenánok milyen mechanizmus útján fejtik ki vírusellenes hatékonyságukat. A fentiek fényében a jelen találmány most egy karragenánalapú vírusellenes készítményt szolgáltat, amely alkalmas rhinovírusfertõzések (orrüreggyulladás) megelõzõ vagy gyógyászati kezelésére. A jelen találmányhoz vezetõ kísérletek meglepõ módon azt mutatták, hogy a technika állásában meglévõ lehetséges fenntartások ellenére kiválasztott karragenánok a rhinovírusfertõzésekkel (orrüreggyulladás) szemben vírusellenes hatékonyságot mutatnak, ahol a jóta-karragenán nyújtja a legjobb eredményeket
5
10
15
20 A találmány leírása Ezért a jelen találmány a jóta-karragenánnak mint vírusellenes hatóanyagnak a felhasználására vonatkozik a rhinovírusfertõzés megelõzõ vagy gyógyászati kezelésére szolgáló gyógyászati készítmény elõállításában. Az így használt „vírusellenes hatóanyag” kifejezés egy olyan karragenánvegyületre vonatkozik, amely hatékony dózisban vagy mennyiségben alkalmazva közvetlenül vagy közvetve, vagy mind közvetlenül, mind közvetve gátolja egy eukarióta sejt rhinovírus által okozott fertõzési ciklusát, sajátosabban a rhinovírus infekciós ciklusának legalább egy részét, amely ki van választva az alábbiakat tartalmazó csoportból: a vírus behatolása egy eukarióta sejtbe, a vírus replikációja egy eukarióta sejtben, a vírus felszaporodása és a vírus felszabadulása a fertõzött eukarióta sejtbõl. Vonatkozik továbbá bármilyen hatásra egy vírustiter nem specifikus növelésében vagy egy vírustiterszint nem specifikus csökkentésében egy eukarióta vagy emlõs gazdarendszerben. A kifejezés vonatkozik továbbá egy olyan vegyületre, amely megelõzõ hatékonyságot fejt ki legalább bizonyos mértékben vírusfertõzés ellen, vagy csökkenti ilyen fertõzés kialakulásának a valószínûségét. Így a jelen gyógyászati készítményt egy vírusos fertõzés bekövetkezése elõtt vagy után lehet adagolni. A „megelõzés” vagy „megelõzõ kezelés” kifejezés, amelyeket itt használunk, a jelen gyógyászati készítmény adagolására vonatkozik annak érdekében, hogy legalább bizonyos mértékig védelmet nyújtsunk vírusos fertõzés ellen, vagy csökkentsük az ilyen fertõzés bekövetkezésének kockázatát. A „gyógyászat” vagy „gyógyászati kezelés” kifejezés, amelyet itt használunk, a jelen gyógyászati készítmény adagolására vonatkozik vírussal fertõzött személy számára annak érdekében, hogy könnyítsük a fertõzés patológiai hatását, ideértve a tünetek megjelenése súlyosságának és/vagy gyakoriságának a csökkentését vagy az ilyen tünetek kiküszöbölését, az ilyen
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
vírusos fertõzés által okozott vagy azzal társult lehetséges károsodások vírusos, baktériumos, gombás vagy bármilyen egyébfajta mikrobás fertõzés gátlását vagy megelõzését. A „karragenán” gyûjtõkifejezés, amelyet itt használunk, jóta- és adott esetben kappa- és lambda-karragenán homo- vagy heteropolimerek keverékeire vonatkozik, nevezetesen jóta- és lambda-karragenán keverékére, jóta- és kappa-karragenán keverékére vagy jóta¹, kappa- és lambda-karragenán homo- vagy heteropolimerek keverékére, hacsak kimondottan másképp nem említjük, vagy hacsak egy eltérõ jelentés nem vezethetõ le a megfelelõ kinyilvánítás szellemébõl. A jóta-karragenán homopolimer a jóta-karragenán egy molekulárisan tiszta karragenánvegyülete. A karragenán heteropolimer magában foglal legalább két eltérõ fajta karragenán-alegységet, amely elõnyösen az alábbi csoportból van kiválasztva: jóta¹, kappa- és lambda-karragenán-alegységek; amelyek közül az egyik a jóta-karragenán. Ahol az alábbiakban utalunk rá, a karragenánok „keveréke” kifejezés vonatkozhat egy anyagkompozícióra is, amely vírusellenes hatóanyagként legalább egyfajta karragenán heteropolimert foglal magában, így a „keverék” elsõsorban különbözõ karragenán-alegységek keveréke, amely része a készítményben jelen levõ legalább egy említett heteropolimer karragenánnak. A találmány egy további klinikai alakja egy ilyen rhinovírusellenes készítményre vonatkozik megelõzõ vagy gyógyászati felhasználásra, ahol az említett rhinovírusfertõzés akut vagy krónikus rhinovírusfertõzés. A jelen, karragenánalapú készítmény alkalmas helyi felhasználásra, bõr- vagy izomgyulladás kezelésére, azonban szisztemikus, például parenterális vagy orális alkalmazás is lehetséges, különösen, amikor elsõdlegesen kis molekulasúlyú karragenánfrakciókat tartalmaz. A jelen találmányban hasznos karragenán átlagos molekulasúlya körülbelül 15 000-tõl 5 000 000 Da¹ig terjed. A kis molekulasúlyú frakció körülbelül 15 000 Da¹tól körülbelül 50 000 Da¹ig terjedõ átlagos molekulasúlyú, a közepes molekulasúlyú frakció körülbelül 50 000 Da¹tól körülbelül 500 000 Da¹ig terjedõ átlagos molekulasúlyú és a nagy molekulasúlyú frakció körülbelül 500 000 Da¹tól körülbelül 5 000 000 Da¹ig terjedõ átlagos molekulasúlyú karragenánt tartalmaz. A gyógyászati kompozíció egy elõnyös kiviteli alakja alkalmas helyi vagy nyálkahártyán való felhasználásra. Az alkalmazásra kész készítmények megfelelõ galenikus formái a krémek, gélek, kenõcsök, porok (ideértve a belélegezhetõ porokat), permetek, habok vagy folyékony oldatok, így a kozmetikai oldatok, a toroköblítõ oldatok vagy az orrcseppek. A galenikus készítmények egyéb megfelelõ alakjai a szakemberek számára kézenfekvõk, ideértve például az US 6,391,452-ben kinyilvánított nazális gyógyszeradagoló rendszereket. Eltekintve a vírusellenes hatóanyagoktól, a jelen készítmény jellegzetesen tartalmaz legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozót és adott esetben további adalék anyagokat vagy alkotórészeket.
1
HU 008 379 T2
A megfelelõ hordozó lehet egy hígítószer, például víz vagy sóoldat, egy segédanyag vagy egy másik hordozóanyag, amely megfelelõ és hasznos a hatóanyagok adagolásához. Tetszõleges adalék anyagok választhatók az alábbi csoportból: SiO2, TiO2, egy kötõanyag, így mikrokristályos cellulóz, poli(vinil-pirrolidon), tragakantgumi, zselatin, keményítõ, laktóz, laktóz-monohidrát, alginsav vagy kukorica; egy kenõanyag vagy felületaktív anyag, így magnézium-sztearát vagy nátrium-lauril-szulfát; egy csúsztatóanyag, így kolloid szilícium-dioxid; egy édesítõszer, így szacharóz vagy szacharin. A készítményben további adalék anyagok lehetnek, amelyeket a korlátozás szándéka nélkül említünk, pufferek vagy pH¹beállító anyagok, például a következõk közül kiválasztottak: citromsav, ecetsav, fumársav, sósav, almasav, salétromsav, foszforsav, propionsav, kénsav, borkõsav vagy azok kombinációi. További alkotórészek lehetnek jelen, ideértve nem karragenán gyógyszereket vagy gyógyászatilag hatékony anyagokat. A karragenánt felhasználhatjuk bármilyen gyógyászatilag elfogadható só alakjában, például felhasználhatók a karragenán nátriumsói. Egyéb gyógyászatilag elfogadható sók lehetnek többek között a karragenán kálium¹, lítium- és ammóniumsói. A találmány egy elõnyös kiviteli alakja a helyi felhasználásra szolgáló készítmény, és magában foglal jóta-karragenánt 0,01 s/s% és 20 s/s% közötti, elõnyösen 0,1 s/s% és 10 s/s% közötti, legelõnyösebben 0,5 s/s% és 5 s/s% közötti mennyiségben a készítmény súlyára számítva. A készítményt rendszerint mint nem pirogén, steril készítményt szolgáltatjuk. A folyékony készítmény esetében a sterilitást például megfelelõ membránszûrõn keresztül végzett szûréssel érhetjük el. A steril vagy aszeptikus gyógyászati készítmények gyártási módszerei jól ismertek a szakmában, és nem képezik a jelen találmány részét. A jelen találmány szerinti gyógyászati készítmények azonban felvihetõk bevonatként higiéniai és egészségügyi cikkek szilárd felületére, például olyan arcápoló vagy egészségügyi cikkek felületére, amelyeket jellegzetesen használnak az orális és/vagy nazális területeken, amilyenek az orrkendõk vagy ¹papírok és a zsebkendõk. Közelebbrõl a gyógyászati készítmény alkalmazható, például rászórható – miként a fertõtlenítõszerek – kesztyûkre, higiéniai kendõkre vagy papírokra, ideértve az orrkendõket, annak érdekében, hogy legalább bizonyos mértékben vírusölõ hatást fejtsünk ki, ezáltal hozzájárulva ahhoz, hogy csökkentsük egy egyén ismételt önfertõzõdését szennyezett ujjhegyek által, és hogy csökkentsük a vírus terjedését különbözõ egyének között, akik a közelben vannak, például kéz a kézhez vagy egymással való érintkezés által. Egészségügyi vagy higiéniai jellegétõl függõen a cikk bevonható, nedvesíthetõ vagy más módon átitatható a gyógyászati készítménnyel. Az ilyen, karragenánnal kezelt cikkek lehetnek a korlátozás szándéka nélkül gyapottamponok, orrmaszkok vagy arcmaszkok. Még a szájrúzsok is készíthetõk
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
úgy, hogy tartalmazzanak egy vírusölõ szempontból hatásos mennyiségû jóta-karragenánt. Ezek a higiéniai vagy egészségügyi cikkek felhasználhatók profilaktikusan vagy gyógyászati kezelés során vírusos fertõzés ellen, és segíthetnek a fertõzés kockázatának megelõzésében vagy csökkentésében. Ennek megfelelõen egy kiviteli mód szerint a találmány egy ilyen felhasználásra vonatkozik, ahol a vírusellenes készítményt egy higiéniai vagy egészségügyi cikk, sajátosan egy orrkendõ vagy ¹papír szilárd felületén alkalmazzuk bevonással vagy impregnálással. A jelen találmány szerint hasznos jóta¹, kappa- és lambda-karragenánok kereskedelmileg hozzáférhetõk, de elõ is állíthatók tengeri moszat növényekbõl a szakmában ismert extrakciós eljárásokkal végzett kivonás útján. Egy elõnyös megvalósítási módja szerint a találmány a jóta-karragenán, adott esetben a kappaés/vagy lambda-karragenán homo- és heteropolimerjeinek a felhasználására vonatkozik. Egy sajátos kiviteli alak esetén a jelen találmány szerinti vírusellenes gyógyászati készítmény lényegileg mentes a jóta¹, kappa- és lambda-karragenántól eltérõ karragenánalakoktól, jóllehet az ilyen egyéb karragenánok nyomnyi mennyiségei jelen lehetnek. Különbözõ alkalmazások céljára lényegileg a jóta-karragenán lehet az egyetlen karragenánfajta, amely jelen van a készítményben. A találmány egy másik megvalósítási módja a jótakarragenán felhasználására vonatkozik vírusellenes készítmény gyártásában, ahol a készítmény tartalmaz továbbá vagy kappa- vagy lambda-karragenánt, vagy az említett karragenánok keverékét. A találmány egy másik megvalósítási módja olyan felhasználásra vonatkozik, ahol a készítmény száraz súlyban 50%-nál nem kevesebb, 70%-nál nem kevesebb, 80%-nál nem kevesebb és elõnyösen 95%-nál (s/s%) nem kevesebb jóta-karragenánt tartalmaz a készítményben jelen levõ összes karragenán teljes száraz súlyára vonatkoztatva. A százalékos értékeket súlyszázalékban (s/s%) adjuk meg a készítményben jelen levõ összes karragenán száraz súlyára vonatkoztatva. A fenti karragenánkoncentráció-értékek szintén homo- és heteropolimer karragenánokra vonatkoznak. Azt találtuk, hogy a karragenán nem toxikus orális vagy dermális alkalmazás esetén, vagy belélegzéskor, még akkor sem, ha rendkívül nagy dózisokban alkalmazzuk, és ezért az Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatal (FDA) „általánosan biztonságosnak elismerve” (GRAS) osztályozással minõsítette. Egy másik megvalósítási mód esetén a találmány jóta-karragenánnak vírusellenes készítmény gyártásában való felhasználására vonatkozik, ahol a készítmény tartalmaz legalább egy további gyógyászatilag hatékony vírusellenes vegyületet, elõnyösen cellulóz-szulfátot. Egy másik megvalósítási mód esetén a jelen találmány a jóta-karragenán felhasználására vonatkozik antirhinovirális adjuváns funkciót kifejtõ gyógyászati készítmény elõállításában. Az említett legalább egy további gyógyászati hatóanyag vagy gyógyszer kivá-
1
HU 008 379 T2
lasztható egy szteroidból, például kortizonból és egy antihisztaminból álló csoportból. Egy másik kiviteli alak esetén a vírusellenes gyógyászati készítmény egy olyan egyén kezelésére vagy megelõzésére szolgál, aki különösen hajlamos rhinovírus általi fertõzésre, vagy akinél megnövelt ennek a kockázata, amilyen a magas kockázatú páciens kiválasztva az alábbi csoportból: asztmás páciens, allergiás személy és gyulladásos betegségben szenvedõ személy. A rajzok rövid leírása Az 1. ábra HRV által indukált sejthalálgátlási próba (XTT-próba) eredményeit mutatja. Ordináta=OD 492 nm¹en mérve; abszcissza=különbözõ próbaminták; 1=fertõzetlen sejtek; 2=kezeletlen, fertõzött sejtek; 3=jóta-karragenánnal kezelt fertõzött sejtek; 4=kappa-karragenánnal kezelt fertõzött sejtek; 5=lambda-karragenánnal kezelt fertõzött sejtek; 1A. ábra=HRV-2-vel fertõzött sejtek; 1B. ábra=HRV14-gyel fertõzött sejtek.
5
2
vábbá érteni, hogy a jelen találmány a kimondottan kinyilvánított megvalósítási módok változatait is felöleli olyan mértékben, ami egy, a szakmában járatos átlagos szakember számára érthetõ lenne. A példákban a kappa- és lambda-karragenán csupán összehasonlító célokat szolgál.
1. példa: Különbözõ típusú karragenánok hatása 2¹es típusú (HRV¹2) és 14¹es típusú (HRV¹14) humán rhinovírus ellen 10 Szubkonfluens HeLa-sejteket inkubáltunk olyan vírusszuszpenzióval, amelyet 5 percen át elõinkubáltunk 125 mg/ml polimerekkel, miként az 1. ábrán mutatjuk. 48 órával késõbb meghatároztuk a sejtek életképessé15 gét TOX2 XTT próbával (Sigma). Miként az 1. ábrán látható, azt találtuk, hogy a leghatékonyabb polimer a jóta-karragenán volt (3. oszlop), amely hatékony volt mind a két rhinovírustípussal szemben, míg a lambda-karragenán (5. oszlop) és a 20 kappa-karragenán (4. oszlop) hatékonyságot mutatott HRV-2-vel szemben, de nem volt hatékony HRV-14gyel szemben. A hibahatárok mutatják a standard eltérést hat független lyuk között.
A 2. ábra fertõzött HeLa-sejtek felülúszóiból származó csúcs2. példa titerek meghatározását mutatja TCID50 próbákkal. 25 Az 1. táblázatban szereplõ polimereket vizsgáltuk Ordináta=TCID50 titer; abszcissza=a jóta-karragenán HRV¹2 és HRV¹14 által indukált sejthalálgátlási próbákoncentrációja mg/ml-ben; U=kezeletlen sejtek; T (kezeban (XTT-próba) 100 mg/ml koncentrációnál. lés)=a sejteket egy órán át fertõztük, és a kezelés után Miként az 1. táblázatban mutatjuk, a jóta-karrageegy órával hozzáadtuk a jóta-karragenán jelzett koncentrációját; P (profilaxis)=a vírusszuszpenziót a fertõzés 30 nán védelmet szolgáltatott mindkét rhinovírustípussal szemben (a „+” jel legalább 95%¹os védelmet jelez, elõtt egy órával elõinkubáltuk a jóta-karragenán jelzett összehasonlítva fertõzetlen kontroll sejtekkel). A kapkoncentrációjával. A további kezelés azonos volt T¹vel: a pa-karragenán és a lambda-karragenán aktív volt sejteket a 0,01¹os fertõzés többszörösével fertõztük. HRV-2-vel szemben, de nem mutatott aktivitást HRVA csúcstitereket a 3. napon figyeltük meg HRV-2-nél (2A. ábra) és a 4. napon HRV-14-nél (2B. ábra). 35 14-gyel szemben. A kitozán, karboxi-metil-cellulóz és karboxi-metil-kitozán polimerek egyáltalán nem mutatA 3. ábra tak gátlóhatást. a jóta-karragenán hatékonyságát mutatja a rhinoví1. táblázat rusreplikáció gátlásával szemben fertõzött humán nazáNéhány vizsgált polimer vírusellenes hatékonysága lis epiteliális sejteken, TCID50 próbákkal meghatározva. 40 Ordináta=TCID 50 , a titer logaritmikusan; abszPolimer HRV-2 HRV¹14 cissza=a jóta-karragenán koncentrációja mg/ml-ben; MOCK=kezeletlen kontroll sejtek; 3A. ábra=HRV-1A-val jóta-Karragenán + + fertõzött sejtek; 3B. ábra=HRV-2-vel fertõzött sejtek; kappa-Karragenán + – 3C. ábra=HRV-8-cal fertõzött sejtek; 3D. ábra=HRV-16- 45 lambda-Karragenán + – tal fertõzött sejtek; 3E. ábra=HRV-39-cel fertõzött sejtek; 3F. ábra=HRV-83-mal fertõzött sejtek. Kitozán – – Karboxi-metil-cellulóz
–
–
A 4. ábra Karboxi-metil-kitozán – – a jóta-karragenán hatékonyságát mutatja rhinoví- 50 russal szemben ismételt kezelés után, CPE redukciós 3. példa próbával meghatározva. A jóta-karragenán hatékony volt HRV-2-vel és Ordináta=CPE-redukció %¹ban; abszcissza=jótaHRV-14-gyel szemben kezelési és megelõzõ vírusos karragenán-koncentráció mg/ml-ben; HRV2P0 törzs=eredeti rhinovírustörzs (nem replikációs kör); 55 replikációs modellben. A csúcsvírustiter jelentõs csökkenését figyeltük meg 6,25 mg/ml-rel egyenlõ és annál HRV2P10 törzs=HRV2P0 rhinovírustörzs 10 szelekciós magasabb koncentrációk mellett. A jóta-karragenán replikációs kör után HeLa-sejteken. azonban leghatékonyabb a HRV-2-vel szembeni megAnnak érdekében, hogy az itt leírt találmány teljeelõzõ modellben volt, ahol 99,9%-nál nagyobb csökkesebben érthetõ legyen, az alábbi példákat adjuk meg. A példák csak szemléltetésre szolgálnak. Meg kell to- 60 nést figyeltünk meg a csúcsvírustiterben. 5
1
HU 008 379 T2
4. példa: A jóta-karragenán hatása humán rhinovírus-altípusok szelekciójával szemben 96 lyukú lemezeken inkubáltunk szubkonfluens HeLa-sejteket vírusszuszpenzióval 0,5 MOI-nál (fertõzési sokféleség). A fertõzés után 20 perccel
5
2
3¹szorosan hígított polimert tartalmazó tápközeget adtunk hozzá. 48–72 órával késõbb meghatároztuk a sejtek életképességét TOX2 XTT próbával (Sigma). Az EC50-értékeket az Excel-Fit szoftverrel számítottuk ki.
2. táblázat Vírus
HRV-1
HRV-2
HRV-8
HRV-14
HRV-16
HRV¹39
EC50
0,7 mg/ml
21 mg/ml
<0,5 mg/ml
400 mg/ml
381 mg/ml
117 mg/ml
A jóta-karragenán hatékony volt az összes vizsgált humán rhinovírussal szemben korábban fertõzött HeLa-sejteken. A karragenánkoncentrációknak gátolniuk 15 kellett a citopatikus hatás 50%¹át, amely széles határok között (<0,5 mg/ml HRV-8-nál és 400 mg/ml HRV14-nél) változott. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a jóta-karragenán a rhinovírus-altípusok széles spektru20 mának replikációját gátolja fertõzött HeLa-sejteken. 5. példa: A rhinovírusreplikáció gátlása jótakarragenán által humán nazális epiteliális sejteken Primer humán nazális epiteliális sejteket (Promocell) helyeztünk be 24 lyukú lemezekre (2,9*104 sejt per lyuk), és három napon át tenyésztettük azokat 37 °C¹on, 5% CO2 és 95% nedvesség mellett. A sejteket közel 60%¹os összefolyás mellett a következõ rhinovírustörzsekkel fertõztük: HRV¹1A, HRV-2, HRV-8, HRV¹14, HRV¹16, HRV¹39, HRV¹83 és HRV¹84. A HRV¹1A, HRV-2, HRV-8, HRV¹16, HRV¹39 és HRV¹83 rhinovírusok lízises replikációt mutattak humán nazális epiteliális sejteken. A HRV¹14 és HRV¹84 nem lizálta a sejteket, és ezért azokat nem vizsgáltuk tovább. A vírusokat jóta-karragenánnal elõinkubáltuk 4, 40 és 400 mg/ml koncentráció és MOCK ellenõrzés mellett. A MOI 0,34 volt. A felülúszókat a fertõzés után 48 és 72 órával begyûjtöttük és TCID50 titer meghatározására használtuk. Miként a 3. ábrán mutatjuk, a jóta-karragenánnal végzett kezelés a felülúszókban levõ összes vírus titerét legalább két logaritmikus lépcsõvel csökkentette 40 mg/ml koncentrációnál (>99%), ha összehasonlítjuk a kontrollsejtekkel kezelt MOCK-val (az Y tengely logaritmikusan mutatja a vírustitert). Ezek az adatok világosan bizonyítják, hogy a jóta-karragenán gátolja a vírusreplikációt primer humán epiteliális sejteken. Mivel úgy tûnik, hogy jelenleg nincs hozzáférhetõ állati modell humán rhinovírus in vivo vizsgálatához, az itt használt humán nazális epiteliális sejtek képviselik a jelenleg hozzáférhetõ legfontosabb in vitro modellt. A hibahatárok a standard eltérést mutatják a három független vizsgált minta között.
25
30
35
40
45
50
6. példa: A jóta-karragenán hatékonyságának 55 meghatározása rhinovírusfertõzéssel szemben ismételt kezelés után (ellenõrzés vírusrezisztencia lehetséges kifejlõdésére) A HeLa-sejtek 10 szelektív replikációs köre után kapott eredeti HRV2P0 vírust és a HRV2P10 vírust CPE 60 6
(citopatikus hatás) redukciós próbával vizsgáltuk. HeLa-sejteket (8*104 sejt per lyuk) hatlyukú lemezekre vittünk fel. A sejteket olyan megfelelõ tápközeggel fertõztük, amely ki volt egészítve 1,6, 5,3, 17, 50, 150 és 450 mg/ml végsõ karragenánkoncentrációjú karragenán polimerrel, és a tápközeg még 0,1 MOI vírust is tartalmazott. Kontrollként az egyik lyukban MOCK volt vírusmentes, karragenánnal kiegészített tápközeggel fertõzve, és a másik lyukat vírusszuszpenzióval kezelt MOCKval, vagyis tápközeget tartalmazó, de karragenánt nem tartalmazó vírusszuszpenzióval fertõztük. A fertõzést követõ 20 perc inkubációs idõ után a lemezeket kétszer mostuk, és kontrollközeget (vírusmentes, kiválasztott koncentrációjú karragenánnal kiegészítve) adtunk az összes lyukhoz, kivéve az MOCK-val kezelt negatív kontrollt (vagyis tiszta, nem gátolt fertõzés). Mintákat vettünk minden egyes kísérleti lyukból, mihelyt világos citopatikus hatás volt látható a nem védett negatív kontroll lyukban. A következõ szelekciós körben a HeLa-sejtek fertõzéséhez olyan vírustartalmú szupernatánst használtunk, amelyet azokból a karragenánnal kezelt lyukakból vettünk, amelyek világosan kimutatható CPE¹t mutattak a fertõzetlen kontrollhoz viszonyítva. CPE-válaszok rendszerint csak a két legalacsonyabb karragenánkoncentrációjú kísérleti mintában, vagyis az 1,6 és 5,3 mg per ml karragenántartalmú kísérleti mintákban voltak kimutathatók. Az eljárást 10¹szer megismételtük, és a kapott vírusmintákat CPE gátlási próbában összehasonlítottuk az eredeti vírustörzzsel. Röviden, fertõzés után 48 órával egy TOX2 reagenst (Sigma) adtunk hozzá, meghatároztuk az OD450nm értékeket, és meghatároztuk a fertõzetlen kontroll CPE-redukcióját %¹ban. Annak érdekében, hogy ellenõrizzük a karragenánkezeléssel szembeni vírusrezisztencia lehetséges kifejlõdését, az elsõ inokuláláshoz használt vírust (a 4. ábrán a 2_001 jelû vírus) és egy 10 szelektív replikációs kör után kapott vírust (a 4. ábrán a 20_001 jelû vírus) vizsgáltunk egy CPE redukciós próbában, HeLasejteket használva és egy olyan kísérleti protokollt követve, amely kismértékben különbözött a fentebb leírttól. Röviden, HeLa-sejteket fertõztünk a vonatkozó vírussal 0,1 MOI-nél, és a fertõzést követõ 20 perc elteltével az inokulumot eltávolítottuk, és hozzáadtunk olyan tápközeget, amely karragenán polimert tartalmazott 1,6, 5,3, 17, 50, 150 és 450 mg/ml végsõ koncentrációban (lásd a 4. ábra abszcisszáját). Fertõzés után
1
HU 008 379 T2
48 órával egy TOX2 reagenst (Sigma) adtunk hozzá, meghatároztuk az OD450nm értékeket, valamint a fertõzetlen kontroll CPE-redukcióját %¹ban (4. ábra, ordináta). A hibahatárok 6 független lyuk standard eltérését mutatják. Miként a 4. ábrán grafikusan bemutatjuk, nem mutattunk ki jelentõs különbséget a vírus karragenános kezeléssel szembeni érzékenységében azokon a mintákon, amelyeket az elsõ és a tizedik fertõzési ciklus felülúszójából kaptunk. A szelekciós eljárásban nem jelentkeztek elszökõ mutánsok. Ezek az adatok arra engednek következtetni, hogy jóta-karragenánnal végzett in vivo terápia alatt valószínûtlen rhinovírusok elszökése még olyan esetekben is, amikor hosszabb idõn keresztül folytonos vagy ismételt terápiát végzünk.
5
10
15
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. jóta-Karragenán alkalmazása antivirálisan hatékony mennyiségben vírusellenes hatóanyagként rhinovírusfertõzés megelõzõ vagy gyógyászati kezelésére szolgáló gyógyászati készítmény elõállításánál. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett rhinovírusfertõzés akut vagy krónikus rhinovírusfertõzés. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a készítmény alkalmas helyi vagy nyálkahártyán való használatra, elõnyösen orrpermetként, porként – ideértve a belélegezhetõ port –, gélként, kenõcsként, habként vagy folyékony oldatként, különösen testápoló oldatként, toroköblítõ oldatként vagy cseppekként. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény tartalmaz továbbá legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy adalék anyagot. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény alkalmas helyi felhasználásra, és a készítmény 0,01%¹a és 20%¹a közötti mennyiségben, elõnyösen 0,1%¹a és 10%¹a közötti mennyiségben, legelõnyösebben 0,5%¹a és 5%¹a (s/tf) közötti mennyiségben tartalmaz jóta-karragenánt. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény tartalmaz továbbá legalább egy másik karragenánt a kappa-karragenán és a lambdakarragenán közül kiválasztva.
20
25
30
35
40
45
7
2
7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény súly alapon 50%-nál nem kevesebb, adott esetben 80%-nál nem kevesebb és elõnyösen 95%-nál (s/s) nem kevesebb jóta-karragenánt tartalmaz a készítményben jelen levõ összes karragenánra vonatkoztatva. 8. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény tartalmaz továbbá legalább egy másik, gyógyászatilag hatékony vírusellenes komponenst. 9. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény egy higiéniai vagy egészségügyi cikk, különösen egy higiéniai vagy egészségügyi kesztyû, kendõ vagy papír, sajátosan egy orrkendõ vagy ¹papír szilárd felületére van bevonatként felvive. 10. Az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény tartalmaz továbbá legalább egy gyógyászatilag hatékony vegyületet, elõnyösen egy szteroidot vagy egy antihisztamint. 11. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az említett rhinovírusfertõzés egy olyan egyénben van, aki magas kockázatú páciens, kiválasztva egy asztmás pácienst, egy allergiától szenvedõ személyt és egy gyulladásos betegségtõl szenvedõ személyt tartalmazó csoportból. 12. Szilárd higiéniai vagy egészségügyi cikk, bevonva vagy impregnálva egy, az 1–8. igénypontok bármelyikében említett vírusellenes készítménnyel. 13. A 12. igénypont szerinti szilárd higiéniai vagy egészségügyi cikk, kiválasztva egy alábbi csoportból: kesztyûk, higiéniás kendõk, higiéniás papírok, arcápoló higiéniás cikkek és arcápoló egészségügyi cikkek, amelyeket a száj és/vagy az orr területén használunk, különösen orrkendõk vagy ¹papírok és zsebkendõk. 14. jóta-Karragenán vírusellenes hatékony mennyiségben való alkalmazása hatékony vírusellenes alkotórészként egy gyógyászati készítményben, amely rhinovírusfertõzés megelõzõ vagy gyógyászati kezelésére használatos. 15. jóta-Karragenán a 14. igénypont szerinti alkalmazásra, ahol a készítmény alkalmas helyi felhasználásra, és jóta-karragenánt tartalmaz a készítmény 0,01%¹a és 20%¹a közötti, elõnyösen 0,1%¹a és 10%¹a közötti, legelõnyösebben 0,5%¹a és 5%¹a (s/tf) közötti mennyiségben.
HU 008 379 T2 Int. Cl.: A61K 31/731
8
HU 008 379 T2 Int. Cl.: A61K 31/731
9
HU 008 379 T2 Int. Cl.: A61K 31/731
10
HU 008 379 T2 Int. Cl.: A61K 31/731
11
HU 008 379 T2 Int. Cl.: A61K 31/731
12
HU 008 379 T2 Int. Cl.: A61K 31/731
13
Kiadja a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
