!HU000008104T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 104
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 39/39
(21) Magyar ügyszám: E 05 745670 (22) A bejelentés napja: 2005. 05. 11. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050745670 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1748791 A1 2005. 11. 17. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1748791 B1 2010. 04. 14.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 04076401 2004. 05. 11.
(73) Jogosult: De Staat der Nederlanden, vert. door de minister van VWS, 2500 EJ The Hague (NL)
EP
(72) Feltalálók: STEEGHS, Liana, Juliana, Josephine, NL-3544 PP Utrecht (NL); VAN DE WINKEL, Johannes, Gerardus, Joseph, NL-3707 CK Zeist (NL); VAN DER LEY, Peter, André, NL-3572 DJ Utrecht (NL) (54)
(2006.01) A61K 39/095 (2006.01) A61P 31/00 (2006.01) C07H 3/06 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05107798 PCT/NL 05/000358
(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Neisseria meningitidis IgtB LOS, mint adjuváns
(57) Kivonat
HU 008 104 T2
A találmány megnövekedett immunstimuláló aktivitású, Neisseria-eredetû lipooligoszacharidokra (LOS) vonatkozik. A találmány szerinti Neisseria-eredetû LOS¹ok triszacharidból álló külsõ magot tartalmaznak, amely fokozott mértékben kötõdik egy dendritikus sejteken
lévõ receptorhoz. A Neisseria-eredetû LOS¹ok külsõ triszacharidmagja, csökkentett toxicitású lipid-A-egységgel kombinálva, vakcinakészítményekben adjuvánsként alkalmazható.
A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 11 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 008 104 T2
A találmány tárgyköre A találmány megnövekedett immunstimuláló aktivitású, Neisseria-eredetû lipooligoszacharidokra (LOS) vonatkozik. A találmány szerinti Neisseria-eredetû LOS¹ok triszacharidból álló külsõ magot tartalmaznak, amely fokozott mértékben kötõdik egy dendritikus sejteken lévõ receptorhoz. A Neisseria-eredetû LOS¹ok külsõ triszacharidmagja, csökkentett toxicitású lipid-Aegységgel kombinálva, vakcinakészítményekben adjuvánsként alkalmazható. A találmány technikai háttere A Neisseria meningitidis LPS potenciális vakcinajelöltként vonta magára a figyelmet, köszönhetõen LPSspecifikus immunreakciókat indukáló képességének, valamint annak, hogy hatékony adjuvánsnak bizonyult. Mindazonáltal, az LPS endotoxikus aktivitása mind ez idáig korlátozta vakcinákban történõ felhasználását. A Meningococcus-eredetû LPS – a molekulát a baktérium külsõ membránjához kihorgonyzó – hidrofób lipid¹A egységbõl és egy hidrofil oligoszacharidmagból áll, mely utóbbi a baktérium felületén helyezkedik el (1. ábra). A natív oligoszacharidlánc vakcinakészítményekben történõ alkalmazása a gazdaszervezet glikolipidantigénjeivel mutatott szerkezeti hasonlóságok miatt nem javasolható. Az LPS-oligoszacharid bioszintézises reakcióútjainak genetikai manipulációja rövidített oligoszacharidláncokat expresszáló N. meningitidis mutánsok sorozatának elõállítását tette lehetõvé (1. ábra). Úgy tûnik, hogy az LPS endotoxikus és adjuváns tulajdonságait a molekula lipid¹A részlete határozza meg. Korábban nagymértékben javított farmakológiai tulajdonságokkal bíró N. meningitidis lipid¹A mutánsok egyedi sorozatát hoztuk létre. Közelebbrõl, a lipid¹A acil-oxi-acilezésében szerepet játszó lpxL1- (htrB1¹)gén inaktiválása olyan lipid¹A mutáns izolálását eredményezte, amely hexaacilezett lipid¹A helyett – csökkentett endotoxicitású, de adjuvánsaktivitását megtartó – pentaacilezett lipid-A¹t expresszál. Ezen túlmenõen, izoláltunk egy N. meningitidis mutánst, amelybõl az LPS – a Meningococcus-eredetû lpxA-gén inaktiválása miatt – teljes egészében hiányzik. Ennek megfelelõen, a Meningococcus-eredetû LPS lipid¹A részletének, illetve oligoszacharid-részletének módosítása új lehetõségeket teremt a Meningogoccus-vakcinák fejlesztésében. A dendritikus sejtek (DC) nagy érdeklõdésre tarthatnak számot, mivel szerepet játszanak az immunreakció beindításában (természetes fertõzés, illetve vakcinázásra adott reakció esetén egyaránt). A baktériumok elleni immunreakciókat a dendritikus sejtek indítják be, amelyek fagocitálják és feldolgozzák a bakteriális antigéneket a T¹sejteknek történõ prezentáláshoz. A közelmúltban kimutattuk, hogy az N. meningitidis LPS a humán dendritikus sejtekkel bekövetkezõ interakciók során fontos szerepet tölt be. Ezenfelül, az LPS¹re szükség van a baktériumok internalizálásához és a dendritikus sejtek teljes aktiválásához is. A WO2004/14417 számú iratban Neisseria lgtB– törzsbõl származó Neisseria hólyagkészítményeket
5
2
tárnak fel. Az NL–A–9 101 359 számú iratban peptiddel konjugált Neisseria lgtB– LPS alkalmazását tárják fel. Ezen túlmenõen, módosított lipid¹A egységet tartalmazó – csökkentett toxicitású, de eredetivel megegyezõ adjuvánsaktivitású – Neisseria LPS-molekulákat tártak fel [ld. WO 00/26384 számú irat (van der Ley és mtsai.); van der Ley és mtsai.: Infect. Immun. 69, 5981–5990 (2001); és Steeghs és mtsai.: J. Endotoxin Res. 10, 113–119 (2004)].
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
A találmány leírása Definíciók A találmány ismertetése során használt értelemben az „adjuváns” olyan anyag vagy vegyület, amely egy emlõs (elõnyösen ember) immunizálása céljából antigénnel kombinálva történõ alkalmazás során stimulálja az immunrendszert, serkentve, erõsítve vagy elõsegítve ezáltal az antigén elleni immunreakciót (elõnyösen anélkül, hogy magával az adjuvánssal szemben specifikus immunreakció generálódna). Az elõnyös adjuvánsok egy adott antigén ellen legalább 1,5-szeres, 2¹szeres, 2,5-szeres, 5¹szörös, 10¹szeres vagy 20¹szoros mértékben serkentik az immunreakciót (az antigén ellen azonos feltételek mellett, de adjuváns nélkül generált immunreakcióhoz viszonyítva). A szakirodalomban hozzáférhetõk olyan tesztek, amelyekkel meghatározható egy adott antigén elleni immunreakció – adjuváns által egy állatokból vagy emberekbõl álló csoportban elõidézett, megfelelõ kontrollcsoporthoz viszonyított – statisztikai átlagos növekedése. Az adjuváns elõnyösen legalább két különbözõ antigén elleni immunreakció serkentésére képes. A találmány szerinti adjuváns rendszerint olyan vegyület, amely egy emlõs számára idegen, ami kizárja az olyan immunstimulátor-vegyületeket, amelyek emlõsök szempontjából endogének (mint pl. az interleukinek, interferonok és egyéb hormonok). A találmány részletes leírása A találmány szerinti megoldás azon a váratlan felismerésen alapul, hogy egy adott külsõ triszacharidmagstruktúrával bíró Neisseria-eredetû LPS megnövekedett humán dendritikus sejtek (DC) általi kötõdést és internalizációt mutat. A triszacharidtartalmú LPS – vagy még inkább a triszacharidtartalmú LOS (lipooligoszacharid) – megkötését és internalizációját a C¹típusú DC¹SIGN-lektin közvetíti, amely a humán dendritikus sejteken expresszálódik, és a dendritikus sejtek megnövekedett mértékû aktiválását és érését eredményezi. Ezen új Neisseria-eredetû triszacharidot tartalmazó LOS javított immunstimulátor aktivitása immunizálás és vakcinálás során lehetõvé teszi hatékony adjuvánsként történõ alkalmazását. Ilyenformán, a találmány elsõ szempontjának megfelelõen, a találmány tárgyát képezi egy eljárás egy emlõs antigénnel történõ immunizálására vagy vakcinálására, mely eljárás magában foglalja az antigén és egy Neisseria-eredetû lipooligoszacharid (LOS) emlõsnek történõ adagolását, mely LOS az (I) képlettel írható le:
1
HU 008 104 T2
2
KDO a2®4 GlcNAc b1®3 Gal b1®4 Glc b1®4 Hep a1®5 KDO – LA a1®3 Hep®PEA (3 vagy 6) a1®2 GlcNAc, ahol LA jelentése: vad típusú lipid¹A-egység, amely elõnyösen egy Neisseria törzsbõl származik, vagy még elõnyösebben, amely egy csökkentett toxicitású lipid¹A egység. Az (I) képletben GlcNAc jelentése: D¹glükózamin; Gal jelentése: D¹galaktóz; Glc jelentése: D¹glükóz; Hep jelentése: D¹heptóz; KDO jelentése: 3¹dezoxi-D-manno-oktulozonsav; PEA jelentése: foszfoetanol-amin; b1®4 jelentése: elsõ és negyedik helyzetû szénatom közötti b¹glikozidos kötés; b1®3 jelentése: elsõ és harmadik helyzetû szénatom közötti b¹glikozidos kötés; a1®5 jelentése: elsõ és ötödik helyzetû szénatom közötti a¹glikozidos kötés; a1®3 jelentése: elsõ és harmadik helyzetû szénatom közötti a¹glikozidos kötés; a1®2 jelentése: elsõ és második helyzetû szénatom közötti a¹glikozidos kötés; a2®4 jelentése: második és negyedik helyzetû szénatom közötti a¹glikozidos kötés; PEA (3 vagy 6) azt jelenti, hogy a foszfoetanol-amin a heptóz 3¹as vagy 6¹os helyzetû szénatomjához kapcsolódhat vagy teljes egészében hiányozhat. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyához tartozik egy fentebb megadott Neisseria-eredetû LOS alkalmazása emlõs immunizálására vagy vakcinálására alkalmas gyógyszer elõállítására. A találmány szerinti Neisseria-eredetû LOS¹t elõnyösen adjuvánsként alkalmazzuk. Még elõnyösebben, a Neisseria-eredetû LOS¹t egy antigénnel kombinálva az antigén elleni immunreakció kiváltására (vagy az antigénnel történõ vakcinálásra) alkalmas gyógyszer elõállítására alkalmazzuk. A találmány szerinti eljárásoknál és alkalmazásoknál az emlõs elõnyösen egy ember. Az antigén elõnyösen egy baktériumból, vírusból, gombából, parazitából, rákos sejtbõl vagy allergénbõl (meghatározást lásd késõbb) származó (vagy ezek által termelt) antigén. Az antigént és a Neisseria-eredetû LOS¹t elõnyösen baktérium, vírus, gomba vagy parazita okozta fertõzõ betegség, rákos sejt által okozott tumor vagy allergén által okozott allergia kezelésére és/vagy megelõzésére alkalmazzuk. A találmány elõnyös megvalósítási módjai szerint a találmány szerinti Neisseria-eredetû LOS módosított lipid¹A (LA) egységet tartalmaz, amely csökkentett toxicitású. A módosított lipid¹A toxicitása elõnyösen kisebb, mint egy megfelelõ, vad típusú LA toxicitása; még elõnyösebben, a módosított lipid¹A toxicitása kisebb, mint a vad típusú LA toxicitásának 90, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 vagy 0,2 százaléka. A vad típusú LA és a különféle módosított (csökkentett toxicitású) LA¹k toxicitása a szakirodalomból ismert, ilyen célra alkalmas vizsgálati eljárások bármelyikével meghatározható. A toxicitás (azaz a találmány szerinti lipid-A¹k vagy Neisseria-eredetû LOS¹ok biológiai aktivitása) megha-
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
tározásának egy elõnyös vizsgálati eljárása az MM6 makrofág sejtvonalban TNF-alfa indukálására végzett WEHI vizsgálati eljárás [Espevik és Niessen: J. Immunol. Methods 95, 99–105 (1986); Ziegler-Heitbrock és mtsai.: Int. J. Cancer 41, 456–461 (1988). Másrészrõl, a találmány szerinti – csökkentett toxicitású lipid-A¹t tartalmazó – Neisseria-eredetû LOS-nak elégséges mértékû immunstimuláló (azaz adjuváns) aktivitásúnak kell lennie. A találmány szerinti, csökkentett toxicitású Neisseria-eredetû LOS a megfelelõ – vad típusú lipid-A¹t tartalmazó – Neisseria-eredetû LOS immunstimuláló aktivitásának legalább 10, 20, 40, 80, 90 vagy 100%-ával bír (ahol az immunstimuláló aktivitás legalább egy citokin termelõdésének vagy legalább egy kostimulátor molekula expressziójának mérése alapján van meghatározva; lásd a 3. példát). A lipid-A-egység csökkentett toxicitásával bíró, de az adjuváns aktivitás (egy részét) megtartó Neisseriaeredetû LOS¹ok, például, genetikailag módosított Gram-negatív patogénekbõl és WO02/09746 számú iratban leírtak szerint nyerhetõk. Közelebbrõl, a csökkentett toxicitású lipid-A-egységet tartalmazó elõnyös Neisseria-eredetû LOS¹ok közé tartoznak a következõk: (a) az lpxL1- és lpxL2-gének (korábbi elnevezéssel htrB és msbB) vagy homológjaik közül egy vagy több expressziójának csökkenését vagy inaktiválását okozó mutációt hordozó Neisseria törzsbõl (lásd pl.: EP 1 127 137; US 5,997,881) kinyerhetõ lipid-A-egységet tartalmazó LOS¹ok; (b) a vad típusú lipid-A-egységbõl – acil-oxi-hidrolázzal végzett kezeléssel vagy lúgos hidrolízissel [US 5,103,661; Erwin és mtsai.: Infect. Immun. 59, 1881–87 (1991)] – egy vagy több szekunder O¹kötésû észterifikált zsírsav eltávolításával nyerhetõ lipid-A-egységet tartalmazó LOS¹ok; (c) vad típusú lipid-A-egység hidrazinos kezelésével [Gu és mtsai.: Infect. Immun. 64, 4047–53 (1996); Polotsky és mtsai.: Infect. Immun. 62, 210–14 (1994); Gu és mtsai.: Infect. Immun. 66, 1891–97 (1998)] nyerhetõ lipid-A-egységet tartalmazó LOS¹ok; (d) lipid-A-egység alkalikus foszfatázzal végzett defoszforilációjával (US 6,290,952) nyerhetõ lipid-A-egységet tartalmazó LOS¹ok; és (e) heterológ lpxE- vagy pagL-gént expresszáló Neisseria gazdasejt által termelt LOS enzimatikus defoszforilációjával vagy dezacilezésével nyerhetõ LOS¹ok. A találmány ismertetése során használt értelemben a „csökkentett expresszió” egy megfelelõ, vad típusú törzshöz viszonyítva megnövelt vagy csökkentett expressziót értünk, miáltal az expressziós szint a megfele-
1
HU 008 104 T2
lõ, vad törzsre jellemzõ szinthez viszonyítva legalább kétszeres, ötszörös vagy tízszeres eltérést mutat. A csökkentett toxicitású, elõnyös lipid-A-egységek közé tartoznak a következõk: szekunder C12-acilcsoportot csak a redukáló glükózaminon tartalmazó lipid¹A; szekunder C12-acilcsoportot csak a nem redukáló glükózaminon tartalmazó lipid¹A; lipid¹A, amelyrõl
5
2
mindkét szekunder C12-acilcsoport hiányzik; lipid-A¹k, amelyekrõl az 1¹es vagy 4’¹helyzetben egy vagy több foszfátcsoport hiányzik; valamint olyan lipid-A¹k, amelyekre a felsorolt dezacilezések és defoszforilációk kombinációi jellemzõk. Egy további szempontjának megfelelõen, a feltárás (I) képletû Neisseria-eredetû LOS¹ra vonatkozik
KDO a2®4 GlcNAc b1®3 Gal b1®4 Glc b1®4 Hep a1®5 KDO – LA a1®3 Hep®PEA (3 vagy 6) a1®2 GlcNAc, amelyben LA jelentése, elõnyösen, egy fentebb megadottak szerinti, csökkentett toxicitású lipid-A-egység. A találmány egy következõ szempontjának megfelelõen feltárunk egy készítményt, amely fentebb megadott Neisseria-eredetû LOS¹t, gyógyászatilag elfogadható hordozót és egy – baktériumból, vírusból, gombából, parazitából, rákos sejtbõl vagy allergénbõl származó (vagy ezek által termelt) – antigént tartalmaz. A gyógyászati készítmények tartalmazhatnak továbbá gyógyászatilag elfogadható stabilizátorokat, ozmotikumokat, puffereket, diszpergálószereket és hasonlókat. A gyógyászati készítmény elõnyös alakja a tervezett adagolási módtól és terápiás alkalmazástól függ. A gyógyászatilag elfogadható hordozó olyan tetszõleges, kompatibilis, nem toxikus anyag lehet, amely alkalmas az aktív összetevõk (azaz a Neisseria-eredetû LOS és az antigén) páciensbe történõ bejuttatására. Az intranazális adagoláshoz alkalmas, gyógyászatilag elfogadható hordozók példái közé tartozik a víz, pufferelt sóoldatok, glicerin, poliszorbát¹20, cremophor EL, valamint kapril/kaprin-glicerid vizes elegye, melyek semleges pH beállításához pufferelhetõk. A parenterális adagoláshoz alkalmas gyógyászatilag elfogadható hordozók példái közé tartozik a steril, pufferelt 0,9%¹os NaCl-oldat vagy 5%¹os glükózoldat, amely, adott esetben, 20% albuminnal lehet kiegészítve. A parenterálisan adagolható készítményeknek sterileknek kell lenni. Az aktív alkotórészek parenterális adagolása ismert eljárásokkal hajtható végre, pl. szubkután, intravénás, intraperitoneális, intramuszkuláris, intraarteriális vagy közvetlenül az elváltozás helyére történõ injektálással. A találmány szerinti készítmények elõnyösen bolus injekció formájában adhatók be. Egy jellemzõ, intramuszkuláris injektáláshoz való gyógyászati készítmény, például, 1–10 ml foszfátpufferelt sóoldatban 1–100 mg, elõnyösen 15–45 mg antigént és 1–100 mg, elõnyösen 15–45 mg találmány szerinti Neisseria-eredetû LOS¹t tartalmaz. Orális adagoláshoz az aktív alkotórész folyékony dózisalakban (pl. elixírek, szirupok és szuszpenziók alakjában) adagolható. A orális adagolásra alkalmas folyékony dózisalakok a páciens általi elfogadhatóság javítása céljából színezékeket és aromákat is tartalmazhatnak. A parenterálisan, orálisan vagy intranazálisan adagolható készítmények elõállítá-
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
si eljárásai a szakirodalomból jól ismertek, s részletes leírásuk számos forrásban megtalálható [ld. pl.: Remington’s Pharmaceutical Science, 15. kiadás, Mack Publishing, Easton, PA (1980)]. A találmány szerinti készítményben lévõ antigén elõnyösen baktériumból, vírusból, gombából, parazitából, rákos sejtbõl vagy allergénbõl származik (vagy ezek termelik). A találmány szerinti Neisseria-eredetû LOS-szal kombinálható virális antigének bármilyen típusú vírusból származhatnak; példaként említhetõ, többek között, a Retroviridae, pl. humán immundeficienciavírus (HIV); rubellavírus; Paramyxoviridae, pl. parainfluenzavírus, kanyaró, mumpsz, légúti óriássejtes vírus (RSV), humán metapneumovírus, Flaviviridae, pl. sárgalázvírus, dengue vírus, hepatitis C vírus (HCV), japán encephalitis vírus (JEV), kullancs-encephalitis, St. Louis-encephalitis vagy nyugat-nílusi vírus; Herpesviridae, pl. herpes simplex vírus, cytomegalovírus, Epstein–Barrvírus, Bunyaviridae; Arenaviridae; Hantaviridae, pl. Hantaan; Coronaviridae; Papovaviridae, pl. humán papillomavírus; Rhabdoviridae, pl. rabies vírus; Coronaviridae, pl. humán coronavírus; Alphaviridae, Arteriviridae, Filoviridae, pl. Ebola-vírus, Arenaviridae, Poxviridae, pl. himlõvírus és afrikai sertéspestis vírus. Hasonló módon, a találmány szerinti Neisseria-eredetû LOS¹ok patogén baktériumokból, gombákból (köztük élesztõkbõl) vagy parazitákból származó antigénekkel is kombinálhatók. Az ilyen antigének közé tartoznak, például, a következõ baktériumnemzetségekbõl származó antigének: Helicobacter (pl. H. pylori), Neisseria (pl. N. mengitidis), Haemophilus (pl. H. influenza), Bordetella (pl. B. pertussis), Chlamydia, Streptococcus (pl. Streptococcus sp. A¹szerotípus), Vibrio (pl. V. cholera), Gram-negatív bélpatogének, pl. Salmonella, Shigella, Campylobacter és Escherichia. Idetartoznak továbbá a lépfenét, leprát, tuberkulózist, diftériát, Lyme-kórt, szifiliszt, hastífuszt és gonorrheát okozó baktériumokból származó antigének. A parazitákból származó antigének közé tartoznak a protozoákból (pl. Babeosis bovis, Plasmodium, Leishmania spp., Toxoplasma gondii és Trypanosoma, pl. T. cruzi) származó antigének. A gombaeredetû antigének példáiként említhetõk az Aspergillus fajokból, Candida albicansból, Cryptococcusból (pl. C. neoformansból) és Histoplasma capsulatumból származó antigének.
1
HU 008 104 T2
Bár a vakcinázást általában patogénekkel szembeni megelõzésszerû védettség kialakítása vagy fertõzést követõen kialakult betegségek kezelése érdekében alkalmazzuk, szakember számára ismert a vakcinák tumorkezelésre történõ alkalmazása is. Ezen túlmenõen, egyre több tumorspecifikus protein bizonyul humán vagy humanizált antitestekkel megcélozható molekulának. Az ilyen tumorspecifikus proteinek szintén az igényelt oltalmi körbe tartoznak. A szakirodalomból számos tumorspecifikus antigén ismeretes. Ilyenformán, a találmány egyik elõnyös megvalósítási módjának megfelelõen, tumorspecifikus antigént és fentebb megadott Neisseria-eredetû LOS¹t tartalmazó készítményeket tárunk fel. A megfelelõ tumorantigének példái közé tartoznak a következõk: karcinoembrionális antigén, prosztataspecifikus membránantigén, prosztataspecifikus antigén, MZ2-E-protein, polimorf epithelialis mucin (PEM), LK26 folátkötõ protein, (csonkított) epidermális növekedési faktor receptor (EGFR), HER2, Thomsen–Friedenreich (T) antigén, GM–2- és GD–2gangliozid, Ep¹CAM, mucin-1, epithelialis glikoprotein¹2 és vastagbél-specifikus antigén. Ezen túlmenõen, az antigének – autoimmun betegség megelõzését elõsegítõ tolerancia indukálása érdekében – a dendritikus sejtekhez juttathatók célba. Az ilyen allergének szintén az igényelt oltalmi körbe tartoznak. Egy következõ szempontjának megfelelõen, a feltárás fentebb megadott Neisseria-eredetû LOS elõállítási eljárásaira vonatkozik. Az egyik elõnyös eljárás magában foglalja a következõ lépéseket: (a) N. meningitidis törzs tenyésztése, mely törzs L2, L3 vagy L4 immuntípusba tartozó Neisseria-eredetû LOS¹t expresszál, és nem tartalmaz aktív lgtB-gént, vagy L6 immuntípusba tartozó Neisseria-eredetû LOS¹t expresszál, és ahol a törzs az lpsL1- és lpxL2-gének közül egy vagy több expresszióját inaktiváló vagy mérséklõ mutációt hordoz; és (b) a Neisseria-eredetû LOS kinyerése. Alternatív módon, az eljárás magában foglalja a következõ lépéseket: (a) N. meningitidis törzs tenyésztése, mely törzs L2, L3 vagy L4 immuntípusba tartozó Neisseriaeredetû LOS¹t expresszál, és nem tartalmaz aktív lgtBgént, vagy L6 immuntípusba tartozó Neisseria-eredetû LOS¹t expresszál; (b) a Neisseria-eredetû LOS kinyerése; és (c) a Neisseria-eredetû LOS – lipid-A-egység toxicitásának csökkentése céljából végzett – kezelése a hidrazin, alkalikus foszfatáz és acil-oxi-hidroláz legalább egyikével. Az eljárás során a (b) és (c) lépés sorrendje felcserélhetõ. Az egyik elõnyös eljárás (c) lépésében a toxicitást a vad típusú Neisseria-eredetû LOS toxicitásának (a fentebb leírt WEHI vizsgálati eljárással végzett meghatározás alapján) 80%-ánál kisebb szintre csökkentjük. Egy további szempontjának megfelelõen, a feltárás Gram-negatív OMV-kre (külsõ membránvezikulákra) vagy hólyagokra vonatkozik, amelyek fentebb megadott Neisseria-eredetû LOS¹t tartalmaznak. A Gramnegatív OMV¹k vagy hólyagok elõállítási módszereit és eljárásait a WO 02/09746 számú nemzetközi közzétételi iratban tárták fel. Az így létrehozott Gram-negatív
5
2
hólyagok találmány szerinti Neisseria-eredetû LOSszal kombinálhatók, miáltal Neisseria-eredetû LOS¹t tartalmazó Gram-negatív hólyagok állíthatók elõ. Alternatív módon, a hólyagok – találmány szerinti Neisseriaeredetû LOS termelésére képes – fentebb megadott Neisseria törzsbõl állíthatók elõ. A tartalmazó Gramnegatív hólyagok fentebb megadott antigénnel és/vagy fentebb megadott, gyógyászatilag elfogadható hordozókkal is kombinálhatók.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
Az ábrák ismertetése 1. ábra: A N. meningitidis WT L3 LPS és annak – a glikozil-transzferázokat kódoló (dõlt betûvel szedett) gének inszerciós inaktiválásával létrehozott – oligoszacharidmutánsainak sematikus vázlata. 2. ábra: Dendritikus sejteket (DC) FITC-vel jelzett baktériumokkal 1:50 arányban, 24 óra hosszat tenyésztettünk. A baktériumok dendritikus sejtekhez történõ kötõdésének FACS-analízissel történõ meghatározása céljából, a megadott idõpontokban, mintákat vettünk. Az ábrán három különbözõ donorból három külön kísérlet eredményeit mutatjuk be. 3. ábra: Dendritikus sejteket (DC) FITC-vel jelzett baktériumokkal 1:50 arányban, 18 óra hosszat brefeldin¹A jelenlétében stimuláltuk, majd intracelluláris TNF-a¹ra és IL–12¹re festettük. A pontdiagramok az intracelluláris citokineket nem termelõ baktériumokhoz (jobb alsó kvadráns), illetve intracelluláris citokineket termelõ baktériumokhoz (jobb felsõ kvadráns) kötõdõ dendritikus sejtek százalékos arányát mutatják. 4. ábra: A dendritikus sejtek – N. meningitidis vad típusú (WT) és mutáns törzseinek hatására bekövetkezõ – TNF-a¹, IL–12¹, IL–1b¹, IL–10- és IL–6-termelését 18 órás együttes tenyésztést követõen a tenyészeti felülúszókban ELISA-analízissel mutattuk ki. Az ábrán három külön kísérlet átlag±szórás értékeit mutatjuk be. 5. ábra: CD40- és CD86-expresszió az N. meningitidis vad típusú (WT) és mutáns törzseinek dendritikus sejtekkel történõ 18 órás együttes tenyésztését követõen, átlagos fluoreszcenciaintenzitás (MFI) alapján. 6. ábra: A C¹típusú lektin¹Fc molekulák N. meningitidis vad típusú (WT) és mutáns törzseihez történõ kötõdésének kimutatása szolubilis adhéziós vizsgálati eljárással. 7. ábra: N. meningitidis vad típusú (WT) és lgtBmutáns törzsének kötõdése dendritikus sejtekhez 20 mg/ml anti-DC¹SIGN antitest (AZN¹D1) jelenlétében, illetve hiányában. 8. ábra: Dendritikus sejtek által irányított Th1/Th2sejtproliferáció: a dendritikus sejteket N. meningitidis H44/76 vad típusú törzzsel,
1
HU 008 104 T2
lgtB-mutánssal, E. coli LPS-sel, poli¹I:Cvel vagy PGE2-vel 48 óra hosszat inkubáltuk, mostuk, majd (A) érési markerekre vizsgáltuk (három független kísérlet átlag±szórás értékei); vagy (B) nagymértékben tisztított CD45RA+CD4+ T¹sejtekkel együtt tenyésztettük. A nyugvó T¹sejteket PMA-val és ionomicinnel újrastimuláltuk, és az intracelluláris IL–4¹et (szürke) és az IFN-g¹t (fekete) egyetlen sejt alapon, áramlási citometriával analizáltuk. Az ábrán három különbözõ donorból származó eredményeket mutatunk be. 9. ábra: Élõ baktériumok kapcsolódása a dendritikus sejtekhez és citokinindukáló aktivitásuk. A dendritikus sejteket FITC-vel jelölt N. meningitidis sejtekkel (vad típus és LPS-mutáns) 1:100 arányban tenyésztettük. A baktériumok dendritikus sejtekhez történõ kötõdésének FACS-analízissel történõ meghatározása céljából a megadott idõpontokban mintákat vettünk. Az ábrán két különbözõ donorból származó sejtekkel végzett kísérletek eredményeit mutatjuk be. Példák 1. Anyagok és módszerek 1.1 Baktériumtörzsek Az oligoszacharidmag- és lipid-A-mutánsok az N. meningitidis H44/76 törzs vad típusú (WT) B¹csoportjából származtak, s ezek leírását illetõen lásd a következõ forrásokat: Törzs vagy mutáns
Hivatkozás
H44/76
Holten: J. Clin. Microbiol. 9, 186–188 (1979)
galE
Jennings és mtsai.: Mol. Microbiol. 10, 361–369 (1993)
lgtB
Jennings és mtsai.: Mol. Microbiol. 18, 729–740 (1995)
lpxL1
van der Ley és mtsai.: InfectImmun. 69, 5981–5990 (2001)
Az e vizsgálat során alkalmazott oligoszacharidmag-mutánsok szerkezetét az 1. ábrán mutatjuk be. Valamennyi törzset Vitoxszal kiegészített gonococcal agaron (Difco, Basingstoke, Egyesült Királyság) 6% CO2¹ot tartalmazó levegõn, 36 °C¹on növesztettük. A baktériumokat 18 órás tenyésztést követõen stacionárius fázisban használtuk fel. A baktériumszuszpenziókat fenolvörös nélküli RPMI 1640 tápközegben (Gibco, Paisley, Egyesült Királyság) készítettük, és optikai denzitásukat 540 nm¹nél mértük. Az 1¹es optikai denzitás számításunk szerint 109 organizmus/ml-nek felelt meg. A baktériumokat 0,5% paraformaldehidet (PFA) tartalmazó foszfátpufferelt sóoldatban (PBS) 15 percig fixáltuk, majd RPMI-tápközegben alaposan leöblítettük. 0,5 mg/ml koncentrációjú FITC-vel (Sigma, Poole, UK)
2
37 °C¹on 20 percig végzett inkubálással FITC-vel jelölt baktériumokat készítettünk, majd a baktériumokat alaposan leöblítettük. 5
10
15
20
25
30
35
1.2 Sejtek Dendritikus sejteket korábbi leírás szerint [ld. F. Sallusto és A. Lanzavecchia: J. Exp. Med. 179, 1109–1118 (1994); H. Uronen-Hansson és mtsai.: Immunology 111, 173–178 (2004)] humán PBMC-sejtekbõl (perifériás vér mononukleáris sejtjei) hoztunk létre. Röviden összefoglalva: a PBMC-sejtekbõl többlépcsõs Percoll-gradiensen végzett centrifugálással monocitákat hoztunk létre. A monocitafrakció több mint 95%-ban CD14+/CD3–/CD19– volt. A dendritikus sejtek létrehozásához a monocitákat hét napig – 10% hõinaktivált FCS-sel, 2,5 mM L¹glutaminnal, 100 E/ml penicillinsztreptomicinnel (valamennyi a GIBCO-tól; Paisley, UK), 100 ng/ml humán rekombináns GM¹CSF-fel és 50 ng/ml humán rekombináns IL–4-gyel (ScheringPlough, Welwyn Garden City, Herts UK) kiegészített – RPMI-tápközegben inkubáltuk. Az így elõállított, éretlen dendritikus sejtek CD14low, CD83–ve, CD86low, CD25–ve voltak, továbbá expresszáltak HLA DR¹t, HLA DQ¹t, HLA I. osztályt, CD40¹et és CD1a¹t, és negatívak voltak a CD19¹re és CD3¹ra egyaránt. A dendritikus sejteket (5×105/ml) 10% FCS-sel kiegészített RPMI–1640-tápközegben, 1:50 és 1:200 dendritikus sejt/baktérium arányban (az ábrafeliratnak megfelelõen) N. meningitidis H44/76 baktériumokkal tenyésztettük. Ha az intracelluláris citokinek mérése volt a cél, a tenyészethez 10 mg/ml koncentrációban Brefeldin-A¹t (proteintranszport-inhibitor; Sigma, Poole, UK) adtunk. Az lgtB-mutáns dendritikus sejtekre vonatkozó kötési specifitásának meghatározásához éretlen dendritikus sejteket 37 °C¹on 30 percig 20 mg/ml anti-DC¹SIGN monoklonális antitesttel (AZN¹D1), majd 37 °C¹on 45 percig vad típusú és mutáns baktériumokkal inkubáltunk.
40
45
50
55
60 6
1.3 Dendritikus sejtek megkötése és internalizáció A baktériumok dendritikus sejtekhez történõ kötõdését és internalizációját áramlási citometria és konfokális mikroszkópos vizsgálat kombinálásával határoztuk meg. Az áramlási citometriás detektáláshoz a dendritikus sejteket – 30 perc és 24 óra közötti idõtartamokban – FITC-vel jelölt baktériumokkal inkubáltuk, FACSFix-ben (BD) fixáltuk, mostuk és FACSCalibur alkalmazásával analizáltuk. A baktériumokhoz kapcsolódó dendritikus sejteket fluoreszcencia alapján könnyen azonosítottuk a dendritikus sejtre kapuzott populáción belül. A konfokális mikroszkópos vizsgálathoz az FITCvel jelzett N. meningitidis sejtekkel stimulált dendritikus sejteket 10 percig adhéziós tárgylemezekhez (Bio-Rad Laboratories Ltd., Herts, UK) hagytuk letapadni. Az internalizáció leállítása céljából a dendritikus sejteket 4% PFA-val 10 percig fixáltuk. A dendritikus sejteket 5 mg/ml, II. osztályú MHC-molekulák elleni monoklonális antitestekkel (Dako, Glostrup, Dánia) festettük. Mosást követõen a megkötõdött antitestet 5 mg/ml, Texas-
1
HU 008 104 T2
vörössel konjugált kecske antiegér antitesttel (Molecular Probes) végzett egyórás inkubálással detektáltuk. A tárgylemezeket lemostuk és Citifluorban (Citifluor Ltd, UK) rögzítettük. Megfelelõ szûrõkkel ellátott Leica SP2 konfokális lézer pásztázómikroszkóp-rendszer (Leica, Milton Keynes, UK) alkalmazásával konfokális képeket készítettünk. Az intracelluláris baktériumok azonosítása céljából a teljes dendritikus sejtet átfogó 15–20 optikai metszetet (0,2–0,5 mm) vetítettünk ki és rétegeztünk egymásra (Leica konfokális képalkotó szoftverrel). 1.4 Citokinmérések Az intracelluláris citokintermelés meghatározása céljából a dendritikus sejteket PBS-ben 4% PFA-val 15 percig fixáltuk, 0,1% nátrium-azidot és 0,5% BSA¹t tartalmazó PBS-ben (valamennyi a Sigmától) mostuk, majd 25 ml permeabilizálóoldattal (Caltag) permeabilizáltuk. A sejteket ezután szobahõmérsékleten, sötétben 30 percig TNF¹a elleni (Becton Dickinson BD, Oxford, Egyesült Királyság) és IL–12 p40/70 elleni monoklonális antitestekkel (Pharmingen) vagy izotípusegyeztetett kontrollokkal inkubáltuk. Ezt követõen a sejteket PBS-ben kétszer mostuk, CellFix-ben (Becton Dickinson) fixáltuk, és FACScalibur készüléken végzett áramlási citometriával, Quest szoftver (Becton Dickinson) alkalmazásával analizáltuk. A dendritikus sejtek – elõre és jobbra irányuló szóródás alapján meghatározva – különálló populációt alkottak. E populációban a sejtek legalább 95%¹a dendritikus sejt volt, amit MHC II. molekulákat, CD1a¹t, CD25¹öt, CD80¹at, CD83¹at és CD86¹ot expresszáló sajátságuk alapján állapítottunk meg. Az analízishez a dendritikus sejtnek megfelelõ kapukon belül minimum 3000 eseményt gyûjtöttünk össze. A szolubilis citokinek ELISA-analíziséhez humán IL–12-höz, TNF-a-hoz és IL–10-hez, IL–6-hoz és IL–1b-hoz alkalmas CytoSets™ ELISA reagenskészleteket (Biosource Europe S.A, Nivelles, Belgium) alkalmaztunk (a gyártó útmutatásai szerint).
5
10
15
20
25
30
35
40 1.5 Szolubilis C¹típusú lektin¹Fc adhéziós teszt A C¹típusú lektin¹Fc molekulák a C¹típusú lektinreceptor (DC¹SIGN, MGL és Dectin¹1B) extracelluláris részletét a C¹terminálison humán IgG1-Fc-fragmenshez fuzionálva tartalmazó molekulák [T. Geijtenbeek és mtsai.: J. Exp. Med. 197, 7–17 (2003)]. A szolubilis C¹típusú lektin¹Fc adhéziós tesztet a következõk szerint hajtottuk végre. ELISA-tálcákat szobahõmérsékleten 18 óra hosszat inkubálva üregenként 100 ml teljes sejttel (OD540=0,1) vontunk be, majd 37 °C¹on 30 percig 1% BSA-val blokkoltuk. Az üregekhez hozzáadtuk a szolubilis C¹típusú lektin-Fc¹t tartalmazó felülúszót és szobahõmérsékleten két óra hosszat inkubáltuk. A nem kötõdött C¹típusú lektin-Fc¹t leöblítettük, és a kötõdést anti-IgG1 ELISA-analízissel határoztuk meg. 1.6 Dendritikus sejtek által irányított Th1/Th2 differenciáció 10% FCS-sel (BioWithaker, Verviers, Belgium), 500 E/ml IL–4-gyel (Schering-Plough) és 800 E/ml
45
50
55
60 7
2
GM¹CSF-fel (Schering-Plough) kiegészített Iscove-féle módosított Dulbecco-tápközegben egészséges donorokból származó monocitákból dendritikus sejteket tenyésztettünk. A tenyésztés hatodik napján a dendritikus sejtek érését vad típusú és lgtB-mutáns N. meningitidisszel (10¹es fertõzési multiplicitással) indukáltuk. A teszt során a következõ pozitív kontrollokat alkalmaztuk: (i) kevert Th1/Th2-reakció, 10 ng/ml E. coli LPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); (ii) Th1-differenciáció, 20 mg/ml poli I:C (Sigma-Aldrich); és (iii) Th2-differenciáció, 10 mg/ml PGE2, 10 ng/ml LPS (Sigma-Aldrich). A 2. napon a dendritikus sejteket áramlási citometriával érési markerekre (CD80, CD83, CD86 és HLA¹DR) analizáltuk. A T¹sejt-differenciáció értékeléséhez az érett dendritikus sejteket CD45RA+/CD4+ T¹sejtekkel (5×103 T¹sejt/20×103 dendritikus sejt) inkubáltuk. A 12–15. napon a nyugvó T¹sejteket 10 ng/ml PMA-val (Sigma-Aldrich) és 1 mg/ml ionomicinnel (Sigma-Aldrich) hat órán át újrastimuláltuk. Egy óra elteltével a T¹sejtekhez 10 mg/ml Brefeldin-A¹t (Sigma-Aldrich) adtunk. Az egyetlen sejt által termelt IL–4 és IFN¹g meghatározását intracelluláris áramlási citometriával végeztük. A sejteket 2% PFA-ban fixáltuk, 0,5% szaponinnal (Sigma-Aldrich) permeabilizáltuk és anti-humán IFN-g-FITC-vel és anti-humán IL–4-PE-vel (BD Pharmingen, San Diego, CA) festettük. 2. példa: Neisseria meningitidis oligoszacharidmag-mutánsainak dendritikus sejtek általi megkötése és internalizációja A vad típusú (WT) N. meningitidis, az oligoszacharidmutánsok és az LPS-deficiens mutáns humán dendritikus sejtek általi megkötésének és internalizációjának vizsgálatára áramlási citometriás technikát alkalmaztunk. Éretlen dendritikus sejteket a vad típusú N. meningitidis H44/76-törzsbõl származó, FITC-vel jelölt mutáns törzsekkel, 1:50 dendritikus sejt/baktérium arány mellett (2. ábra), illetve 1:200 dendritikus sejt/baktérium arány mellett (az eredményeket nem mutatjuk be) tenyésztettünk együtt, majd a tenyészeteket FACS-analízissel a dendritikus sejtekhez kapcsolódó (DC-asszociált), FITC-vel jelölt baktériumok jelenlétére vizsgáltuk. Mind a vad típus, mind az oligoszacharidmutánsok esetében a DC¹asszociáció idõ- és dózisfüggõ növekedését figyeltük meg. A kísérlet elsõ hat órájában a LPS-deficiens mutáns esetében alig tapasztaltunk DC¹asszociációt. Az lgtB-mutáns mindkét koncentrációban egyaránt nagyobb DC¹asszociációt mutatott, mint a vad típus vagy a galE-mutáns. A bakteriális kötõdés és internalizáció megkülönböztetése céljából vad típusú és mutáns N. meningitidis törzsek DC¹internalizációjának vizsgálatára konfokális mikroszkópiát alkalmaztunk (az eredményeket nem mutatjuk be). A FITC-baktériumok a tárgylemezeken kis zöld szemcsékként egyszerûen detektálhatók voltak. A dendritikus sejtek láthatóvá tételére MHC II. osztályú festést alkalmaztunk. A dendritikus sejtek többsége már egyórás inkubálást követõen több lgtBmutánst internalizált, mint vad típusú vagy galE-mutáns baktériumot. Az LPS-deficiens mutáns esetében
1
HU 008 104 T2
alig volt megfigyelhetõ internalizáció. Az lgtB-mutáns baktériumok esetében a felületi tapadás – a magas szintû internalizáció mellett – a kísérlet teljes ideje alatt jellemzõen szintén erõteljes volt. Ezek az eredmények igazolják a FACS-analízissel kapott eredményeket, azaz a baktériumok dendritikus sejtekkel történõ megnövekedett kapcsolódása a baktériumok fokozott internalizációját eredményezi. 3. példa: A dendritikus sejtek aktiválódása és érése Neisseria meningitidis mutáns törzsek hatására A baktériumok internalizációja és a citokintermelés közötti összefüggés tanulmányozása céljából intracellulárisan mértük a dendritikus sejtek által – vad típusú és mutáns N. meningitidisre reagálva – termelt IL–12 és TNF¹a mennyiségét, és ezzel egyidejûleg vizsgáltuk az internalizációt (3. ábra). A dendritikus sejteket 1:50 arányban FITC-jelzett baktériumokkal 18 órán át együtt tenyésztettük, majd a TNF¹a és az IL–12 intracelluláris termelõdésének kimutatása céljából megfestettük. A kvadránsokat úgy helyeztük el, hogy a FITC-jelzett baktériumokhoz kapcsolódó sejteket elválasszuk azoktól a sejtektõl, amelyekhez nem kapcsolódott FITC-jelzett baktérium. A százalékos értékeket a baktériumok internalizációját követõen intracelluláris citokineket termelõ (jobb felsõ kvadráns), illetve nem termelõ dendritikus sejtek (jobb alsó kvadráns) százalékaként adjuk meg. A vad típus, az lgtB-mutáns és a galE-mutáns mindegyike hatásos indukálója volt a dendritikus sejtek TNF-a- és IL–12-termelésének, az LPS-deficiens mutáns azonban nem. Gyakorlatilag valamennyi dendritikus sejt, amely internalizálta az N. meningitidis vad típusát, illetve lgtB- és galE-mutánsát, nagy mennyiségû TNF-a¹t termelt. Az IL–12 termelõdését a FITC-jelzett baktériumokat internalizáló dendritikus sejtek kb. 50%-ánál mutattuk ki. Az intracelluláris citokinmérések mellett meghatároztuk a dendritikus sejtek által N. meningitidis hatására szekretált citokin mennyiségét is (4. ábra). A dendritikus sejteket mutáns és vad típusú baktériumokkal 18 óra hosszat 1:200 arányban együttesen tenyésztettük, és a szekretált IL–12, IL–10, TNF¹a, IL–6 és IL–1b analíziséhez felülúszókat gyûjtöttünk. Az eredményeket a citokintermelés vad típuséhoz (WT=100%) viszonyított százalékaként mutatjuk be. Az lgtB- és galE-mutáns egyaránt némileg kevesebb IL–12¹t, TNF-a¹t és IL–1b¹t termelt, mint a vad típusú baktériumok. Ugyanakkor, az lgtB- és galE-mutáns IL–10- és IL–6-termelése hasonlónak bizonyult a vad típusú törzséhez. Az LPS-deficiens törzs esetében citokintermelést alig tapasztaltunk. Végül, a vad típusú és mutáns baktériumokkal stimulált dendritikus sejtek érését a CD40 és CD86 kostimulátor molekulák expressziójának mérése alapján vizsgáltuk (5. ábra). Ha a dendritikus sejteket az lgtBmutánssal stimuláltuk, a CD40 – és különösen a CD86 – expressziója nagyobb mértékû volt, mint a dendritikus sejtek vad típusú vagy galE-mutáns baktériumokkal végzett stimulálása esetén. A dendritikus sejtek
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
1pxA-mutánssal végzett stimulálásakor alig tapasztaltunk CD40- és CD86-expressziót. Összegzésül, ezek az adatok azt igazolják, hogy az lgtB-mutáns dendritikus sejtek általi megkötése és internalizációja a dendritikus sejtek hasonló mértékû aktiválását és érését eredményezi, mint a vad típusú baktériumok által indukált. 4. példa: Az lgtB-mutáns receptor közvetítette kötõdésének és internalizációjának azonosítása Az lgtB-mutáns dendritikus sejtek általi fokozott megkötése és felvétele annak vizsgálatára ösztönzött, hogy e kötõdést és internalizációt specifikus DC¹receptor közvetíti¹e. Ennek érdekében a vad típusú és mutáns baktériumok C¹típusú lektinreceptorokat megkötõ képességét vizsgáltuk, mely receptorok képesek az oligoszacharidok felismerésére és az éretlen dendritikus sejteken nagy mennyiségben expresszálódnak. A C¹típusú lektin-Fc-kimérák teljes sejtes vad típusú és mutáns baktériumokhoz történõ kötõdését szolubilis adhéziós tesztben tanulmányoztuk (6. ábra). Míg a vad típus, a galE-mutáns és az LPS-deficiens mutáns egyik C¹típusú lektin-Fc-kimérához sem kötõdött, az lgtB-mutáns esetében a DC¹SIGN¹Fc erõteljes megkötését tapasztaltuk. Az lgtB-mutáns DC¹SIGN-hez való kötõdését DC¹SIGN-nel átmenetileg transzfektált HEK293Tsejtekben, illetve DC¹SIGN¹et stabilan expresszáló K562-sejtekben is megfigyeltük (az eredményeket nem mutatjuk be). Ezen túlmenõen, az lgtB-mutáns dendritikus sejtek általi fagocitózisának anti-DC¹SIGN blokkoló antitest (AZN¹D1) jelenlétében vagy hiányában végzett vizsgálatával kimutattuk az lgtB-LPS DC¹SIGN¹re vonatkozó specifitását (7. ábra). AZN¹D1 jelenlétében az lgtB-mutáns dendritikus sejtek általi fagocitózisa a vad típusú baktérium esetében megfigyelhetõ szintre csökkent, ami egyértelmûen bizonyítja, hogy a DC¹SIGN megköti és internalizálja az lgtB-mutánst. 5. példa: Az lgtB-mutáns DC¹SIGN-hez történõ célbajuttatása TH1 immunreakciót indít be Az lgtB-mutánsból származó LPS DC¹SIGN-receptorral bekövetkezõ interakciójának funkcionális vonatkozásának (ha van egyáltalán) vizsgálata céljából – éretlen dendritikus sejtek PFA-val fixált vad típusú vagy lgtB-mutáns baktériumokkal impulzusszerûen végzett kezelésével – a dendritikus sejtek által irányított T¹sejtreakciókat tanulmányoztuk. A vad típusú, illetve az lgtB-mutáns baktériumokkal pulzuskezelt dendritikus sejtek érésében (kostimulátor molekulák és érési markerek expressziójának értékelése alapján) nem tapasztaltunk különbséget (8A. ábra). Mindazonáltal, az e törzsekkel indukált TH1/TH2-profilokban jelentõs különbségeket figyeltünk meg (8B. ábra). A vad típusú N. meningitidisszel pulzuskezelt dendritikus sejtek döntõen TH2-típusú immunreakciót generáltak, mivel a T¹sejtek többsége IL–4¹et termelt. Az lgtB-mutánssal pulzuskezelt dendritikus sejtek elsõsorban IFN-g-termelõ T¹sejtek kialakulását váltották ki, ezáltal a TH1/TH2 sejtegyensúlyt a TH1 irányába tolva el. A TH1/TH2 egyen-
1
HU 008 104 T2
súly ilyen eltolódását három független donor esetében figyeltük meg. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az lgtB-LPS DC¹SIGN-hez történõ specifikus célbajuttatása olyan DC¹szignálokat generál, amelyek az immunreakciót TH1 felé vezérlik, ami az adjuvánsok igen kívánatos tulajdonsága [ld. még: P. Moingeon és mtsai.: Vaccine 19, 4363–4372 ((2001)]. 6. példa: A Neisseria meningitidis oligoszacharid/lipid-A kettõs mutáns törzseinek dendritikus sejtek általi megkötése és internalizációja A vad típusú N. meningitidis, az lgtA és lgtB oligoszacharidmutánsok, valamint ezek lpxL1 kettõs mutánsai és az LPS-deficiens mutáns humán dendritikus sejtek általi megkötésének és internalizációjának ta-
5
10
15
2
nulmányozására áramlási citometriás technikát alkalmaztunk. Az éretlen dendritikus sejteket a vad típusú N. meningitidis H44/76-törzsbõl származó, FITC-vel jelölt mutáns törzsekkel (1:100 DC/baktérium arányban) tenyésztettük együtt, és a dendritikus sejtekhez kapcsolódó (DC-kapcsolt) FITC-jelölt baktériumok jelenlétét FACS-analízissel detektáltuk (9. ábra). Az lgtB egyszeres mutáns egyértelmûen nagyobb DC¹kapcsolódást mutatott, mint a vad típus vagy az lgtA egyszeres mutáns. Ezen túlmenõen, az lpxL1 mutáns háttérben az lgtB-mutáció nagyobb mértékû kapcsolódást eredményezett, mint a vad típusú vagy lgtA oligoszacharid-struktúrák, ami azt jelzi, hogy a DC¹SIGN-hez történõ megnövekedett lgtB-közvetítette kötõdés pentaacilezett lpxL1-lipid-A¹t tartalmazó LPS-sel is lehetséges.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Neisseria-eredetû LOS alkalmazása emlõs immunizálására való gyógyszer elõállítására, mely Neisseria-eredetû LOS¹t az (I) képlet ábrázolja:
25
KDO a2®4 GlcNAc b1®3 Gal b1®4 Glc b1®4 Hep a1®5 KDO – LA a1®3 Hep®PEA (3 vagy 6) a1®2 GlcNAc,
ahol LA jelentése: vad típusú lipid-A-egység vagy csökkentett toxicitású lipid-A-egység, és ahol a Neisseriaeredetû LOS adjuvánsként van alkalmazva. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a Neisseria-eredetû LOS antigénnel együtt van alkalmazva az antigén elleni immunreakció emlõsben történõ kiváltására való gyógyszer elõállítására. 3. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antigén baktériumból, vírusból, gombából, parazitából, rákos sejtbõl vagy allergénbõl származik, vagy ezek bármelyike termelte. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol LA jelentése olyan lipid-A-egység, amelynek toxicitása – WEHI vizsgálati eljárással meghatározva – kisebb, mint egy vad típusú lipid-A-egység toxicitásának 80%¹a. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a lipid-A-egység a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: (a) az lpxL1- vagy lpxL2-gén vagy homológjuk aktivitását csökkentõ vagy ezeket inaktiváló mutációt hordozó Neisseria törzsbõl kinyerhetõ lipid-A-egység;
40
45
50
55
60 9
(I)
(b) egy vad típusú lipid-A-egység egy vagy több szekunder O¹kötésû észterifikált zsírsavának acil-oxihidrolázos kezeléssel végzett eltávolításával nyerhetõ lipid-A-egység; (c) egy vad típusú lipid-A-egység hidrazinos kezelésével nyerhetõ lipid-A-egység; (d) alkalikus foszfatázzal végzett defoszforilációval nyerhetõ lipid-A-egység. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a lipid-A-egység a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: (a) szekunder C12-acilcsoportot csak a redukáló glükózaminon tartalmazó lipid-A-egység; (b) szekunder C12-acilcsoportot csak a nem redukáló glükózaminon tartalmazó lipid-A-egység; (c) lipid-A-egység, amelyrõl mindkét szekunder C12-acilcsoport hiányzik; (d) lipid-A-egység, amelyrõl az 1¹es vagy 4’¹helyzetben egy vagy több foszfátcsoport hiányzik; és (e) lipid-A-egység, amelyre az (a), (b) vagy (c) pontban megadott dezacilezések és a (d) pontban megadott defoszforilációk kombinációja jellemzõ.
1
HU 008 104 T2
2
7. Az (I) képletû Neisseria-eredetû LOS KDO a2®4 GlcNAc b1®3 Gal b1®4 Glc b1®4 Hep a1®5 KDO – LA a1®3 Hep®PEA (3 vagy 6) a1–2 GlcNAc, ahol LA jelentése: vad típusú lipid-A-egység vagy csökkentett toxicitású lipid-A-egység, adjuvánsként történõ alkalmazásra, emlõs immunizálása céljából végzett kezelésben. 8. A 7. igénypont szerinti Neisseria-eredetû LOS, 15 ahol a Neisseria-eredetû LOS¹t a kezelés során antigénnel kombinálva alkalmazzuk az antigén elleni immunreakció kiváltására az emlõsben.
9. A 8. igénypont szerinti Neisseria-eredetû LOS, ahol az antigén baktériumból, vírusból, gombából, parazitából, rákos sejtbõl vagy allergénbõl származik, vagy ezek bármelyike termelte. 10. A 7–9. igénypontok bármelyike szerinti Neisseria-eredetû LOS, ahol LA jelentése a 4–6. igénypontok bármelyikében megadott lipid-A-egység. 11. Készítmény, amely tartalmaz egy (I) képletû Neisseria-eredetû LOS¹t:
KDO a2®4 GlcNAc b1®3 Gal b1®4 Glc b1®4 Hep a1®5 KDO – LA a1®3 Hep®PEA (3 vagy 6) a1®2 GlcNAc, ahol LA jelentése: vad típusú lipid-A-egység vagy csökkentett toxicitású lipid-A-egység, és ahol a készítmény tartalmaz még olyan antigént is, amely vírusból, gombából, parazitából, rákos sejtbõl, allergénbõl vagy baktériumból származik, vagy ezek bármelyike termelte, ahol a baktérium a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: Helicobacter, Haemophilus, Bordetella, Chlamydia, Streptococcus, Vibrio, Gram-negatív bélpatogén, Salmonella, Shigella, Campylobacter, Escherichia, valamint a lépfenét, leprát, tuberkulózist, diftériát, Lyme-kórt, szifiliszt vagy hastífuszt okozó baktériumok; és ahol a készítmény gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz. 12. A 11. igénypont szerinti készítmény, ahol a lipid-A-egység toxicitása – WEHI vizsgálati eljárással meghatározva – kisebb, mint egy vad típusú lipid-Aegység toxicitásának 80%¹a. 13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti készítmény, ahol a lipid-A-egység a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: (a) az lpxL1- vagy lpxL2-gén vagy homológjuk aktivitását csökkentõ vagy ezeket inaktiváló mutációt hordozó Neisseria törzsbõl kinyerhetõ lipid-A-egység;
30
35
40
45
50
10
(I)
(I)
(b) egy vad típusú lipid-A-egység egy vagy több szekunder O¹kötésû észterifikált zsírsavának acil-oxihidrolázos kezeléssel végzett eltávolításával nyerhetõ lipid-A-egység; (c) egy vad típusú lipid-A-egység hidrazinos kezelésével nyerhetõ lipid-A-egység; (d) alkalikus foszfatázzal végzett defoszforilációval nyerhetõ lipid-A-egység. 14. A 11–13. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol a lipid-A-egység a következõk bármelyike: (a) szekunder C12-acilcsoportot csak a redukáló glükózaminon tartalmazó lipid-A-egység; (b) szekunder C12-acilcsoportot csak a nem redukáló glükózaminon tartalmazó lipid-A-egység; (c) lipid-A-egység, amelyrõl mindkét szekunder C12-acilcsoport hiányzik; (d) lipid-A-egység, amelyrõl az 1¹es vagy 4’¹helyzetben egy vagy több foszfátcsoport hiányzik; és (e) lipid-A-egység, amelyre az (a), (b) vagy (c) pontban megadott dezacilezések és a (d) pontban megadott defoszforilációk kombinációja jellemzõ.
HU 008 104 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
11
HU 008 104 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
12
HU 008 104 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
13
HU 008 104 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
14
HU 008 104 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
15
HU 008 104 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
16
HU 008 104 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
17
HU 008 104 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
18
HU 008 104 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
19
HU 008 104 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
20
HU 008 104 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
21
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
