(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000006471T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 006 471

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 0400214 2004. 01. 12.

(73) Jogosult: Metabolic Explorer, 63360 Saint Beauzire (FR)

FR

(72) Feltalálók: MEYNIAL-SALLES, Isabelle, F-31450 Fourquevaux (FR); GONZALEZ, Benjamin, F-63200 Riom (FR); SOUCAILLE, Philippe, F-31450 Deyme (FR) (54)

HU 006 471 T2

C12N 15/01

(21) Magyar ügyszám: E 05 717405 (22) A bejelentés napja: 2005. 01. 12. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050717405 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1704230 A1 2005. 08. 11. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1704230 B1 2009. 08. 19.

(2006.01) C12P 7/18 (2006.01) C12N 9/02 (2006.01) C12P 7/28 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05073364 PCT/FR 05/000070

(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest

1,2-Propándiolt elõállító, evolvált mikroorganizmus

A leírás terjedelme 26 oldal (ezen belül 2 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 006 471 T2

A találmány tárgyát képezi új eljárás 1,2-propándiolt termelõ, evolvált mikroorganizmus elõállítására, az így elõállított, evolvált mikroorganizmus, valamint annak alkalmazása 1,2-propándiol elõállítására. Az 1,2-propándiol vagy más néven propilénglikol egy C3¹dialkohol, egy vegyi termék, amelyet számos területen alkalmaznak. Telítetlen poliésztergyanták, folyékony detergensek, hûtõ- és fagyálló ágensek, valamint repülõgépek jégmentesítõ folyadékának az összetevõje. A propilénglikol alkalmazása az 1993–1994 évek óta terjedt el etilénszármazékok helyettesítésére, amelyekrõl felismerték, hogy toxikusabbak, mint a propilénszármazékok. Az 1,2-propándiolt jelenleg vegyi úton állítják elõ, propilén-oxid hidratálási eljárással, amely nagy mennyiségû víz alkalmazásával jár. A propilén-oxid elõállítása két eljárással végezhetõ, az egyik epiklórhidrint, a másik hidroperoxidot alkalmaz. Mindkét eljárás erõsen toxikus termékeket alkalmaz. Ezen túlmenõen, a hidroperoxid-eljárás olyan melléktermékek képzõdésével jár, mint a terc-butanol vagy az 1¹feniletanol, amelyek számára alkalmazási területet kell találni ahhoz, hogy a propilén-oxid elõállítása rentábilis legyen. A vegyi eljárás általában racém 1,2-propándiolt állít elõ, ahol az (R)-1,2-propándiol és az (S)-1,2-propándiol-sztereoizomerek különbözõ célokra alkalmazhatók. Az 1,2-propándiol vegyi eljárással történõ elõállításának a hátrányai ígéretes alternatívává teszik biológiai elõállítását. Számos mikroorganizmus képes természetes úton (S)¹ vagy (R)-1,2-propándiolt elõállítani cukrokból, például glükózból vagy xilózból, amelyek glikolízis útján metabolizálódnak, vagy dezoxihexózokból, ami (S)-1,2-propándiol képzõdéséhez vezet [Cameron D. C. és mtsai.: Biotechnol. Prog. (1998)]. A legjobban teljesítõ baktériumok közé tartoznak a Clostridium sphenoides [Tran Din K. és mtsai. (1986)] és a Thermoanaerobium thermosaccharolyticum [Altaras N. E. és Cameron D. C. (2001)]. Ez utóbbi több típusú cukrot képes (R) 1,2-propándiollá fermentálni, a felhasznált glükóz egy grammjára vonatkoztatva 0,13–0,28 g 1,2-propándiolhozam mellett. E két mikroorganizmus esetében az 1,2propándiol-szintézisért felelõs enzimeket nem azonosították, és teljesítményük javítását korlátozza, hogy nem állnak rendelkezésre megfelelõ genetikai eszközök. Egyébként bár az E. coli az 1,2-propándiol elõállításához szükséges minden gént hordoz, a természetben nem termel 1,2-propándiolt. Ugyanis az 1,2-propándiolt metil-glioxálból kell elõállítani, amely sejtek számára már kis koncentrációban erõsen mérgezõ vegyület. Továbbá, az US 6 303 352 és US 6 087 140 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások, valamint a WO 98/37204 számú nemzetközi közzétételi irat olyan E. coli-törzseket alkalmazó eljárásokat ismertetnek, amely E. coli-törzseket genetikailag úgy módosítottak, hogy 1,2-propándiolt állítsanak elõ. Ezek az eljárások elsõsorban az 1,2-propándiol elõállításának a metabolikus útjában részt vevõ, egy vagy több enzimnek a fokozott expresszióját alkalmazzák úgy, hogy azok génjét plazmidokba klónozzák, és ezért antibiotikum alkalma-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

zásával végzett szelekciós nyomást igényelnek. A törzsek teljesítményének a javítása érdekében bizonyos endogén géneket deletáltak is [lásd például Alteras N. E. és Cameron D. C: Biotechnol. Prog. 16, 940–946 (2000); Alteras N. E. és Cameron D. C: Appl. Env. Microb. 65, 1180–1185 (1999)]. Napjainkig nem ismertettek még 1,2-propándiolt és acetont, két elõnyös terméket együtt elõállító, evolvált mikroorganizmust alkalmazó eljárást. A találmány tárgyát képezi tehát eljárás egyszerû cukorforrás metabolizmusa révén 1,2-propándiolt elõállító, evolvált mikroorganizmustörzs elõállítására, tpiA gén delécióját, valamint metil-glioxált (propanalt) laktáttá konvertáló egyik enzimet kódoló legalább egy gén delécióját hordozó kiindulási törzsbõl, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: – a kiindulási törzs tenyésztését egyszerû cukorforrást tartalmazó, megfelelõ tápközegben, olyan szaporodási-hígítási arányok alkalmazásával, amelyek mellett a tápközegben csak azok a mikroorganizmusok maradnak fenn, amelyek szaporodási rátája azonos, vagy jobb, mint az elõírt hígítási arány, abból a célból, hogy a kiindulási törzsben egy vagy több, DHAP-nak metilglioxállá, majd 1,2-propándiollá történõ bioszintézisének az anyagcsereútjában részt vevõ gént evolúciónak vessünk alá javított „1,2-propándiolszintetáz”-aktivitást mutató, evolvált gének irányába, és – a javított „1,2-propándiol-szintetáz”-aktivitást mutató mikroorganizmustörzs vagy törzsek szelektálását és izolálását. A tpiA gén a triózfoszfát-izomerázt kódolja, amely a DHAP-nak gliceraldehid-3-foszfáttá történõ konverzióját katalizálja. E gén deletálásának a célja elegendõ mennyiségû metil-glioxál szintézisének a biztosítása. Elméletileg, a tpiA gén deletálásának biztosítania kell, hogy a sejtek által metabolizált glükóz szénatomjainak 50%¹a dihidroxi-aceton-foszfátnak metil-glioxállá történõ átalakulása céljára hasznosuljon. A metil-glioxálnak (propanalnak) laktáttá történõ konverziójában részt vevõ legalább egy gén deletálásának a célja a metil-glioxálnak laktáttá történõ konverziójának a gátlása oly módon, hogy úgy a kiindulási törzsben, mint az elõállított, evolvált törzsben jelen levõ és termelt metil-glioxált a sejt gépezete lényegében 1,2-propándiol elõállítására fordítsa. A metil-glioxálnak (propanalnak) laktáttá történõ konverziójában részt vevõ gének a glioxiláz I enzimet kódoló gloA gén (amely laktoil-glutation szintézisét katalizálja metil-glioxálból) és laktaldehid-dehidrogenázt [amely (S)-laktát szintézisét katalizálja (S)-laktaldehidbõl] kódoló aldA és aldB gének közül választott. Elõnyösen, a kiindulási törzs mindhárom, azaz a gloA, aldA és aldB gének delécióját hordozza. Elõnyösen, a kiindulási törzsön további kiegészítõ módosítást végzünk, amely tartalmazza a glükóz természetes, NADH formájában redukáló ekvivalenseket fogyasztó fermentálási útjainak a szuppresszálását abból a célból, hogy elimináljunk olyan anyagcsereutakat,

1

HU 006 471 T2

amelyek az 1,2-propándiol termelõdésével versengenek. Különösen elõnyös a piruvátból laktát szintézisét katalizáló laktát-dehidrogenázt kódoló ldhA gén deletálása, valamint az acetil-CoA-ból etanol szintézisét katalizáló alkohol-aldehid-dehidrogenázt kódoló adhE gén deletálása. Hasonlóképpen, elérhetõ, hogy a mikroorganizmus anaerob körülmények mellett piruvát-dehidrogenáz komplexet alkalmazzon acetil-CoA és NADH elõállítására piruvátból. Ez úgy érhetõ el, hogy a piruvát-formát-liázt kódoló pflA és pflB géneket deletáljuk. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a kiindulási törzsbõl az ldhA, pflA, pflB és adhE gének közül választott legalább egy gént deletáljuk, elõnyösen ldhA, pflA, pflB és adhE gének mindegyikét deletáljuk. Még elõnyösebben, a találmány szerinti kiindulási törzs tartalmaz továbbá legalább egy gént, amely olyan enzimet kódol, amely kedvez piruvátnak acetáttá történõ anaerob metabolizálódásának. Elõnyösen, az enzim a piruvát anaerob metabolizmusának acetil-CoA és NADH elõállítása irányába kedvez. Elõnyösebben, ez az enzim piruvát-dehidrogenáz komplex. Elõnyösen, a piruvát acetáttá történõ anaerob metabolizálódásának kedvezõ enzimet kódoló fenti gén kevéssé érzékeny NADH általi gátlásra. Ez a gén lehet endogén proteint kódoló endogén gén, vagy endogén vagy exogén enzimet kódoló exogén gén vagy heterológ gén. NADH általi gátlásra érzékeny, endogén proteint kódoló endogén gén esetében, a találmány szerinti evolúciós eljárás lehetõvé teszi javított „1,2-propándiolszintetáz”-aktivitású törzsek szelektálását, amelyekben a fenti, piruvátnak acetáttá történõ anaerob metabolizálódásának kedvezõ enzimet kódoló gén evolvált enzimet kódol, amely csökkent NADH általi gátlást mutat. A találmány további megvalósítási módja szerint, a kiindulási törzsbe heterológ gént vihetünk be, amely NADH általi gátlásra csökkent érzékenységet mutató enzimet kódol, vagy érzékeny enzimet kódol, amelyet azonban a találmány szerinti evolúciós eljárással csökkentett érzékenységûvé tettünk. Ezen túlmenõen, elõnyös továbbá deletálni az Entner–Doudoroff-anyagcsereútban részt vevõ elsõ enzimet, a 6¹foszfoglukonát-dehidratázt kódoló edd gént, abból a célból, hogy elkerüljük a glükóz közvetlen metabolizálódását gliceraldehid-3-foszfáttá és piruváttá, és ezáltal kényszerítsük a glükóz konvertálódását 1,2propándiollá és acetáttá. Elõnyösen, az elõzõleg izolált, a találmány szerinti evolúciós eljárással kapott, evolvált törzsbe acetil-CoAnak és acetátnak acetonná történõ konvertálásában részt vevõ egy vagy több enzimet kódoló, heterológ gént viszünk be abból a célból, hogy módosított evolvált törzset kapjunk. Ez az új módosítás lehetõvé teszi 1,2-propándiol mellett aceton elõállítását, amely értékes melléktermék. A módosítás elõnye ezenkívül, hogy javítja az

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

1,2-propándiol elõállításának a teljesítményét. Valójában az acetát már kis koncentrációban (15 g/l) gátolja baktériumok szaporodását és kemosztátban gyorsan blokkolja az anaerob körülmények mellett tenyésztett törzs teljesítményének a fejlõdését. Az acetátnak acetonná transzformálását katalizáló enzimeket kódoló gének bevitele az evolvált törzsbe csökkenti a kemosztát tenyészetben a reziduális acetát koncentrációját. Aceton termelõdik, amely vegyület sokkal kevésbé gátolja a szaporodást, mint az acetát, így a körülmények kedveznek a törzs szaporodásának és 1,2-propándiol termelõdésének. Az acetil-CoA és acetát konverziójában részt vevõ egy vagy több enzimet kódoló heterológ gén vagy gének elõnyösen a C. acetobutylicumból származnak. Az acetil-CoA¹t és acetátot acetonná konvertáló egy vagy több enzimet kódoló gének expresszáltathatók kromoszomálisan vagy extrakromoszomálisan. Kromoszomálisan, egy vagy több kópiát vihetünk be a genomba szakember számára jól ismert rekombinációs eljárásokkal. Extrakromoszomálisan, a géneket különbözõ típusú plazmidok hordozhatják, amelyek replikációs origó, kópiaszám és sejten belüli stabilitás tekintetében eltérnek egymástól. Jelen lehetnek 1–5 kópiaszámban, 20 kópiaszámban vagy több mint 500 kópiaszámban, amelyek alacsony kópiaszámú, egyetlen replikációs eredetû, „strict” típusú plazmidoknak (pSC101, RK2), alacsony kópiaszámú plazmidoknak (pACYC, pRSF1010) vagy nagy kópiaszámú plazmidoknak (pSK bluescript II) felelnek meg. A gének expresszáltathatók különbözõ erõsségû, indukálható vagy nem indukálható promoterek alkalmazásával. Ilyenek például a szakember számára jól ismert Ptrc, Ptac, Plac vagy más promoterek. A célgének mûködése mRNS¹t [Carrier és Keasling Biotechnol. Prog. 15, 58–64 (1998)] vagy proteineket (például GSTtags, Amersham Biosciences) stabilizáló vagy destabilizáló elemek által fokozható vagy csökkenthetõ. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a korábban kapott, módosított, evolvált törzset szelekciós nyomás mellett, egyszerû szénforrást tartalmazó, megfelelõ tápközegben tenyésztjük abból a célból, hogy a módosított, evolvált törzsben egy vagy több olyan gént evolváljunk, amely részt vesz acetil-CoA és acetát konverziójában javított „aceton-szintetáz”-aktivitás irányába, majd ezt követõen olyan, második generációs, evolvált mikroorganizmusokat szelektálunk és izolálunk, amelyek javított „1,2-propándiol-szintetáz” és javított „aceton-szintetáz”-aktivitást mutatnak. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti kiindulási törzs, amelyet fentebb, alább és a példákban ismertetünk, és amely hordozza továbbá az aldA és/vagy aldB gének delécióját, és/vagy amelyben a NADH¹t fogyasztó, glükózt fermentáló természetes utakat szuppresszáltuk, és/vagy amely hordozza továbbá az adhE és ldhA gének delécióját, és/vagy amelyben a piruvát-dehidrogenáz komplex lipoamiddehidrogenázát kódoló lpd génben pontmutációt hordoz, amely az 55. pozícióban levõ alaninnak valinnal történõ helyettesítését jelenti, és/vagy hordozza továbbá a pflA és pflB és/vagy az edd gének delécióját.

1

HU 006 471 T2

A találmány tárgyát képezi továbbá evolvált törzs, amely javított „1,2-propándiol-szintetáz”-aktivitást mutat és amelyben az lpd gén pontmutációt hordoz, amely az 55. pozícióban levõ alaninnak valinnal történõ helyettesítését jelenti, ebbe a definícióba tartoznak olyan második generációs evolvált törzsek, amelyek ezen túlmenõen javított „aceton-szintetáz”-aktivitást mutatnak. Végül, a találmány tárgyát képezi eljárás 1,2-propándiol elõállítására, amely szerint egyszerû cukorforrást tartalmazó, megfelelõ tápközegben olyan evolvált törzset tenyésztünk, amelyben az lpd gén az 55. pozícióban levõ alaninnak valinnal történõ helyettesítésével pontmutációt hordoz, majd ezt követõen kinyerjük a termelt 1,2-propándiolt és adott esetben az acetont, amelyeket ezt követõen megtisztítunk. A találmány szerinti módosított, kiindulási és evolvált mikroorganizmusok lehetnek prokarióták vagy eukarióták, amelyek alkalmasak transzformálásra és tenyésztésre, abból a célból, hogy 1,2-propándiolt és adott esetben acetont állítsanak elõ. Szakember sejtbiológiai és molekuláris biológiai általános ismeretei alapján képes a fenti mikroorganizmusok kiválasztására, valamint adott esetben ezen mikroorganizmusoknak a fent ismertetett E. coli géneknek megfelelõ génjeinek az azonosítására. A leírásban „mikroorganizmustörzs” kifejezés alatt egyetlen azonos fajba tartozó mikroorganizmusok összességét értjük, amely az adott faj legalább egy mikroorganizmusát tartalmazza. Ennek megfelelõen, a törzsrõl megállapított jellemzõk érvényesek az adott törzs minden mikroorganizmusára. Megfordítva, az adott törzs mikroorganizmusainak bármelyikérõl megállapított jellemzõk érvényesek a mikroorganizmusok azon összességére, amelybe tartozik. A találmány szerinti módosított mikroorganizmusok lehetnek baktériumok, élesztõk és gombák, és elõnyösen az alábbi fajok közül választottak: Aspergillus, Bacillus, Brevibacterium, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Gluconobacter, Pseudomonas, Rhodococcus, Saccharomyces, Streptomyces, Xanthomonas és Candida. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a baktériumtörzs Escherichia-törzs, elõnyösen E. coli-törzs. Más megvalósítási mód szerint a baktériumtörzs Corinebacterium-törzs, elõnyösen C. glutamicum-törzs. Egy további megvalósítási mód szerint az élesztõtörzs Saccharomyces-törzs, elõnyösen S. cerevisiae. A találmányt fentebb, az alábbiakban és a példákban E. colira, vonatkoztatva ismertetjük. Ennek megfelelõen a géneket, amelyek a találmány szerint evolvált törzsekben deletálhatók vagy erõsen expresszáltathatók, alapjaiban az E. coli-gének elnevezései alkalmazásával definiáltuk. Az elnevezések alkalmazása azonban általánosabb jelentésû és tartalmazza más mikroorganizmusok megfelelõ génjeit. Valójában, az E. coli GenBank referenciái alkalmazásával, szakember képes meghatározni az E. colitól eltérõ mikroorganizmustörzsekben ekvivalens géneket. Homológ szekvenciák azonosításának és a homológia százalékos meghatározásának a módjai szakem-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 4

2

ber számára jól ismertek, ide sorolva például a http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ webhelyen található BLAST programokat, amelyek a honlapon megadott, alapértelmezett paraméterekkel alkalmazhatók. A kapott szekvenciák felhasználhatók (egymáshoz illeszthetõk) például a CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) vagy a MULTALIN (http://prodes.toulouse.infra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl) programok alkalmazásával, a honlapokon megadott, alapértelmezett paraméterekkel. Ismert génekrõl a GenBank adatbázisban megadott referenciák alkalmazásával szakember képes ekvivalens géneket azonosítani más organizmusokban, baktériumtörzsekben, élesztõben, gombában, emlõsökben, növényekben és másokban. Ez a rutinmunka elõnyösen konszenzusszekvenciák alkalmazásával végezhetõ el, amelyek úgy határozhatók meg, hogy szekvencia-összerendezést végzünk más organizmusokból származó génekkel, majd degenerált próbákat tervezünk, amelyek lehetõvé teszik a megfelelõ gén klónozását egy másik organizmusban. Ezek a molekuláris biológiai eljárások szakember számára jól ismertek, és azokat például Sambrook és mtsai. ismertetik [Sambrook és mtsai.: „Molecular cloning: a laboratory manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1989)]. A leírásban „deléció” alatt a „deletált” gén aktivitásának szuppresszálását értjük. A szuppresszió lehet az érintett gén expressziós termékének arra megfelelõ eljárással történõ inaktiválása, vagy az érintett gén expresszálódásának a gátlása, vagy az érintett gén legalább egy részének a deletálása oly módon, hogy vagy az expresszálódása nem történik meg (például az expresszálódáshoz szükséges promoterrégió egy részének vagy egészének a deletálása révén), vagy az expressziós termék elveszti aktivitását (például az érintett gén kódolórészében történt deléció révén). Elõnyösen, adott gén deletálása tartalmazza a gén lényeges szuppresszálását, valamint adott esetben markergénnel történõ helyettesítését, amely lehetõvé teszi a találmány szerinti evolvált törzsek azonosítását, izolálását és tisztítását. Adott gén inaktiválása elõnyösen homológ rekombinációval végezhetõ [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L.: „One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K–12 using PCR products”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640–6645 (2000)]. Ilyen eljárás elvét röviden az alábbiakban ismertetjük: a sejtbe in vitro elõállított, lineáris DNS-fragmenst viszünk be, amely fragmens tartalmazza a gén két határoló régióját, valamint a két határolórégió között legalább egy szelekciós gént (általában egy antibiotikumrezisztencia-gént), a lineáris fragmens ezáltal egy inaktív gént képez. Rekombinációs eseményen átesett és a bevitt fragmenst integráló sejteket szelektív tápközegre szélesztéssel szelektáljuk. Ezt követõen kettõs rekombinációs eseményen átesett sejteket szelektálunk, amelyekben a natív gént inaktivált gén helyettesíti. A protokoll javítható pozitív és negatív szelekciós rendszerek alkalmazásával abból a célból, hogy gyorsítsuk a kettõs rekombinációs események detektálását.

1

HU 006 471 T2

Az ilyen géneknek a törzsbe való bevitelére elõnyösen alkalmazott eljárás az elektroporálás, amely szakember számára jól ismert. Az eljárás az alábbiak szerint ismertethetõ röviden: az adott heterológ géneket expressziós vektorba klónozzuk, promoter- és terminátorszekvenciák közé. A vektor tartalmaz továbbá antibiotikumrezisztencia-gént abból a célból, hogy az azt tartalmazó sejtek szelektálhatók legyenek, valamint a gazdatörzsben funkcionálisan mûködõ replikációs origót, hogy a vektor fenn tudja tartani magát. A protokollhoz elektrokompetens gazdasejteket kell elõállítani, amelyeket ezt követõen a vektorral elektroporálással transzformálunk. A találmány szerint, az elektroporálással bevitt gének elõnyösen az adc, ctfA és B, valamint a thl gének, amelyek rendre a Clostridium acetobutylicum acetont természetes úton elõállító anyagcsereútjának acetoacetát-karboxiláz, koenzim-A-transzferáz és tioláz enzimeit kódolják, amely mikroorganizmusról jól ismert, hogy kitûnõ teljesítménnyel állít elõ biológiai úton acetont. A találmány szerinti evolúciós eljárás evolvált mikroorganizmusok elõállítását szolgáló eljárás, amely lehetõvé teszi anyagcsereutak módosítását, és amely eljárás elõnyösen az alábbi lépéseket tartalmazza: a) mikroorganizmus módosítását abból a célból, hogy kiindulási mikroorganizmust kapjunk, oly módon, hogy a kiindulási mikroorganizmust meghatározott tápközegen tenyésztve, gátoljuk olyan metabolit termelõdését vagy fogyasztását, amely egyébként fogyasztásra vagy termelõdésre került volna, b) a fenti, meghatározott tápközegen elõzõleg kapott, módosított mikroorganizmusok tenyésztését abból a célból, hogy evolúciót idézzünk elõ, a meghatározott tápközeg tartalmazhat a evolúcióhoz szükséges koszubsztrátot, c) a módosított mikroorganizmusok azon sejtjeinek szelektálását, amelyek szaporodni képesek a meghatározott tápközegen, adott esetben koszubsztrát hozzáadása mellett. Ilyen evolúciós eljárást ismertet a WO 04/076659 számú nemzetközi közzétételi irat. Az evolúciónak alávetett anyagcsereút elõnyösen az 1,2-propándiol-bioszintézisút, és adott esetben az acetonbioszintézis¹út. A leírásban „meghatározott tápközeg” kifejezés alatt ismert molekuláris összetételû tápközeget értünk, amelyet az adott mikroorganizmus szaporodásához adaptáltak. A meghatározott tápközegbõl lényegében hiányzik a metabolit, amelynek a termelõdését vagy fogyasztását a módosítás realizálása szuppresszálja. A leírásban „koszubsztrát” kifejezés alatt a szubsztráttól eltérõ, szerves vagy szervetlen molekulát értünk, amely részt vesz olyan reakcióban, amely során egy vagy több atomot átad a szubsztrátnak a termék elõállításához. A koszubsztrátnak nincs ismert mutagén tulajdonsága. A leírásban „szelekció” alatt olyan tenyésztési eljárást értünk, amely adott esetben folyamatos, és amelyet növekvõ mértékû hígítás alkalmazásával végzünk

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

abból a célból, hogy a tápközegben csak olyan organizmusok maradjanak fenn, amelyek szaporodási üteme azonos vagy nagyobb, mint az alkalmazott hígítás mértéke. Ezt végezve, olyan mikroorganizmusokat tartunk meg, amelyek oly módon fejlõdtek, hogy a véghez vitt módosítás már nem érinti a szaporodásukat. A leírásban „evolvált gén” kifejezés alatt nukleinsavak egymást követõ sorát értjük, amelyet fázisban lévõ startkodon és stopkodon határol, és amely szelekció után legalább egy nukleinsavban eltér a kiindulási szekvenciától. A leírásban „evolvált protein” alatt aminosavak egymást követõ sorát (proteinszekvenciát) értünk, amely szelekciót követõen legalább egy aminosavban eltér a kiindulási proteinszekvenciától. A gének és proteinek azonosíthatók primer szekvenciájuk alapján, továbbá szekvenciahomológia vagy szekvencia-összerendezés révén is, amely proteinek csoportját definiálja. A PFAM („Protein families databasa of alignements and hidden Markov Models”; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) modellek proteinek szekvencia-összerendezésének nagy gyûjteményét képviselik. Minden egyes PFAM lehetõvé teszi számos összerendezés és proteindomén láttatását, az organizmusok közötti elterjedések értékelését, hozzáférést más adatbázisokhoz, valamint proteinek ismert szerkezetének a láttatását. COG („Clusters of Orthologous Groups of proteins”; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) klasztereket úgy kapnak, hogy 30 fõ filogenetikai vonalat képviselõ, teljesen megszekvenált 43 genomból származó proteinszekvenciát hasonlítanak össze. Minden egyes COG¹ot legalább három vonalból határoznak meg, ami ezáltal lehetõvé teszi õsi, konzervált domének azonosítását. A leírásban „tenyésztés” és „fermentálás” kifejezéseket egyaránt alkalmazzuk baktériumok egyszerû szénforrást tartalmazó, megfelelõ tápközegen történõ szaporodásának a jelölésére. A leírásban „egyszerû szénforrás” kifejezés alatt szakember által, adott mikroorganizmus, közelebbrõl, adott baktérium szokásos szaporítására alkalmazható szénforrásokat értünk, amelyek lehetnek például arabinóz, fruktóz, galaktóz, laktóz, maltóz, szacharóz és xilóz. Az egyik leginkább elõnyös, egyszerû szénforrás a glikóz. A találmány szerinti mikroorganizmusok tenyésztési körülményei (fermentálás) szakember számára jól ismertek. Közelebbrõl, a baktériumokat 20–55 °C, elõnyösen 25–40 °C, elõnyösebben 20–55 °C hõmérsékleten fermentáljuk, még közelebbrõl, a C. glutamicum és S. cerevisiae organizmusokat körülbelül 30 °C¹on és az E. coli baktériumot körülbelül 20–55 °C¹on fermentáljuk. A tenyésztést általában fermentorokban végezzük, ismert, meghatározott, ásványi összetételû tápközegben, amelyet az alkalmazott baktériumra adaptáltunk, és amely legalább egy egyszerû szénforrást, és adott esetben a metabolit elõállításához szükséges kofaktort tartalmaz.

1

HU 006 471 T2

Közelebbrõl, E. coli tenyésztésére a tápközeg lehet például az M9 tápközeggel azonos vagy ahhoz hasonló, ásványi tápközeg [Anderson: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32, 120–128 (1946)], M63 tápközeg [Miller: A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992)], vagy Schaefer és mtsai. által ismertetett tápközeg [Anal. Biochem. 270, 88–96 (1999)], és különösen az alábbi tápközeg: K2HPO4 N.T.A.

5

10

1,g/l 0,2 g/l

Nyomelemoldat*

10,ml/l

(NH4)2SO4

1,g/l

NaCl

0,2 g/l

NaHCO3

0,2 g/l

MgSO4

0,2 g/l

Glükóz

20–100 g/l

Nátrium-nitrát

0,424 g/l

Tiamin

10,mg/l

FeSO4

50,mg/l

Élesztõkivonat

4,g/l

Spektinomicin

100,mg/l

A közeg pH¹ját nátronlúggal 7,4 értékre állítjuk. *nyomelemoldat: citromsav (4 g/l), MnSO4 (3 g/l), NaCl (1 g/l), CoCl2 (0,1 g/l), ZnSO4 (0,10 g/l), CuSO4 (10 mg/l), H3BO3 (10 mg/l) és NaMoO4 (10 mg/l). Hasonlóképpen, a C. glutamicum esetében az ásványi tápközeg lehet például a BMCG tápközeggel azonos vagy hasonló összetételû tápközeg [Liebl és mtsai.: Appl. Microbiol. Biotechnol. 32, 205–210 (1989)], vagy Riedel és mtsai. által ismertetett tápközeggel azonos vagy hasonló összetételû tápközeg [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 573–583 (2001)]. A fermentálást elõnyösen anaerob körülmények mellett végeztük és kemosztátban, azaz folyamatos táplálás és állandó hígítási ráta mellett, a fenti minimáltápközegben a szénforrás koncentrációját állandó értéken tartottuk és a kemosztátot nitrogénnel gáztalanítottuk. A fermentációs tápközegben a szénforrás koncentrációját csak addig emeltük, amíg a reziduális szénforrás koncentrációja által limitált folyamatos üzemmódot elértük, és az több napon át stabil maradt. A kemosztátban végzett tenyésztési eljárás bizonyult elõnyös eljárásnak, mivel az kedvez a módosított törzs szaporodási és 1,2-propándiolt elõállító teljesítménye javításának, valamint lehetõvé teszi az evolvált mikroorganizmusok izolálását. A leírásban javított „1,2-propándiol-szintetáz”-aktivitás alatt DHAP-nak 1,2-propándiollá történõ konvertálásának anyagcsereútjában részt vevõ, javított enzimaktivitások összességét értjük. Az evolvált mikroorganizmusban a javított enzimaktivitás az evolvált mikroorganizmus által elõállított 1,2-propándiol mennyiségének a növelését eredményezi, szemben a megfelelõ,

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 6

2

kiindulási mikroorganizmus által termelt mennyiséggel, azonos tenyésztési körülmények mellett. A leírásban javított „aceton-szintetáz”-aktivitás alatt acetátnak és acetil-CoA-nak acetonná történõ konvertálási anyagcsereútjában részt vevõ, javított enzimaktivitások összességét értjük. A második generációs evolvált mikroorganizmusban a javított enzimaktivitás a második generációs evolvált mikroorganizmus által elõállított aceton mennyiségének a növelését eredményezi, szemben a megfelelõ, transzformált, evolvált kiindulási mikroorganizmus által termelt mennyiséggel, azonos tenyésztési körülmények mellett. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti eljárással elõállított, evolvált törzsekben evolvált gének, valamint ezen evolvált gének által kódolt, evolvált proteinek izolálása és karakterizálása. A evolvált gének ezt követõen megfelelõ regulálóelemek szabályozása alatt bevihetõk gazdaorganizmusba abból a célból, hogy a gazdaorganizmusban expresszálódjanak és lehetõvé váljon a megfelelõ evolvált protein elõállítása. A módosított mikroorganizmusok, közelebbrõl az E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB teljesítményének a javulása a kemosztátban történõ tenyésztés során arra utal, hogy ezek a tenyésztési körülmények lehetõvé teszik funkcionális endogén piruvát-dehidrogenáz komplex szelektálását anaerob körülmények mellett, amely körülmények NADH bõséges termelõdésének kedveznek. Valójában ismert, hogy a piruvát-dehidrogenáz komplex, amely piruvát átalakulását katalizálja acetil-CoA¹vá, NADH felszabadulása mellett, csak aerob körülmények mellett funkcionál, míg anaerob körülmények mellett a piruvát-formát-liáz funkcionál és katalizálja piruvát átalakulását acetil-CoA¹vá és formáttá [Snoep J. L., De Graef M. R., Westphal A. H., De Kok A., Teixeira de Mattos M. J. és Neijssel O. M. (1993)]. Tehát az 1,2propándiol termelése céljából konstruált, módosított E. coli-törzsön végzett módosítások egyike a piruvát-formát-liáz-aktivitást kódoló pflA és pflB gének deletálása. A módosított sejt számára egyetlen lehetõség a piruvátnak acetil-CoA¹vá történõ metabolizálása piruvátdehidrogenáz által, egy NADH elõállítása mellett. Jellemeztük a módosított, evolvált törzs piruvát-dehidrogenáz komplexét, és az kevésbé érzékenynek bizonyult NADH¹ra, mint a vad törzs piruvát-dehidrogenáz komplexe. A találmány anaerob körülmények mellett mûködõképes piruvát-dehidrogenáz komplexre történõ szelektálást eredményez, amely lehetõvé teszi két NADH elõállítását gliceraldehid-3-foszfátnak acetáttá történõ oxidálása révén, a NADH nem reoxidálódhat másképp, mint dihidroxi-aceton-foszfátnak 1,2-propándiollá történõ redukálása révén. NADH¹ra kevésbé érzékeny enzimkomplexre történõ szelektálás kedvezõ hatással van az 1,2-propándiol elõállításának a sebességére. A találmány elõnyösen a piruvát-dehidrogenáz komplexbe tartozó lipoamid-dehidrogenázt kódoló lpd gén [amelynek a vad típusú szekvenciája ismert (http://genolist.pasteur.fr/Colibri)] mutációinak a szelek-

1

HU 006 471 T2

tálásához vezet. Közelebbrõl, azonosítottuk egy pontmutáció jelenlétét, amely az 55. pozícióban levõ alaninnak valinnal történõ helyettesítését tartalmazta. Errõl az enzimrõl ismert, hogy a piruvát-dehidrogenáz NADH általi gátlásáért felelõs. Ez a módosított enzim szintén a találmány tárgyát képezi. A találmány lehetõvé teszi módosított mikroorganizmusok, közelebbrõl az E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB teljesítményének a javítását, kemosztátban, anaerob körülmények mellett végzett tenyésztés során, DHAP-nak 1,2-propándiollá konvertálásának az anyagcsereútjában részt vevõ enzimek evolúciója révén. Az enzimek evolúciójának a következménye a szaporodási ráta fokozódása és 1,2-propándiol végkoncentrációjának az emelkedése. A találmány elõnyös megvalósítási módja szerint, az evolvált törzs nem tartalmazza a gldA gén evolúcióját. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint, az evolvált törzs agldA gén delécióját hordozza. Az ábrák ismertetése 1. ábra: A találmány szerinti, 1,2-propándiol és aceton elõállítása céljára módosított E. colitörzs anyagcseréjének a vázlata. Jelmagyarázat: LDH: laktát-dehidrogenáz ADH: aldehid-alkohol-dehidrogenáz PFL: piruvát-formát-liáz PDHc: piruvát-dehidrogenáz komplex 2. ábra: Az E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzs evolúciója glükózon, kemosztátban tenyésztve: glükóz (2A. ábra) és más termékek (2B. ábra) koncentrációja. 3. ábra: A vad törzs és a találmány szerinti evolvált törzs piruvát-dehidrogenáz komplexe enzimaktivitásának az összehasonlítása, növekvõ NADH-koncentrációk mellett. A találmány megvalósításának az alábbiakban ismertetett példái a találmányt a korlátozás szándéka nélkül illusztrálják. 1. példa: Glükóz fermentálásával kizárólag 1,2propándiol és acetát elõállítására képes, módosított E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzs elõállítása a) E. coli MG1655 DtpiA :: cm módosított törzs elõállítása A tpiA gén inaktiválását úgy végeztük, hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát inszertáltunk és az érintett gén nagyobb részét deletáltuk. Az alkalmazott eljárást Datsenko K. A. és Wanner B. L. ismertették [„One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K12 using PCR products” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640–6645 (2000)]. A tpiA gén helyettesítéséhez két oligonukleotidot alkalmaztunk: DtpiAr oligonukleotidot, amely 100 bázist tartalmaz (SEQ ID NO 1.):

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

2

a t g c g a c a t c c t t t a g t g a t g g g t a a c t g g aaactgaacggcagccgccacatggttcacgagctggtttctaacctgcgt aCATATGAATATCCTCCTTAG ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ a tpiA gén (4108320–4109087 koordináták), a http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 4109007–4109087 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmid kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko K. A. és Wanner B. L.: „One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K12 using PCR products” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640–6645 (2000)]. DtpiAf oligonukleotidot, amely 100 bázist tartalmaz (SEQ ID NO 2): c t t a a g c c t g t t t a g c c g c t t c t g c a g c t ttaacgattactgcgaaggcgtcagctttcagagaagcaccaccaaccag cTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ a tpiA gén 4108320–4108400 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3 plazmid által hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazettát amplifikálja. A DtpiAr és DtpiAf oligonukleotidokat alkalmaztuk a kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására a pKD3 plazmidból. Ezt követõen, a kapott PCR-terméket elektroporálással vittük be az MG1655 (pKD46) törzsbe, amelyben az expresszált l Red (g, b, exo) rendszer nagymértékben kedvez a homológ rekombinációnak. Ezt követõen, az antibiotikumrezisztens transzformánsokat szelektáltuk, és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-eljárással, cdh és YIIQ oligonukleotidok alkalmazásával ellenõriztük. cdh oligonukleotid (SEQ ID NO 3): ggtgatgatagttatcgccg (homológ a 4107536–4107555 szekvenciával), YllQ oligonukleotid (SEQ ID NO 4): cgtgccatcgacagcagtcc (homológ a 4109599–4109580 szekvenciával). Ezt követõen, a kloramfenikolrezisztencia-kazettát eltávolítottuk. Ezt követõen, a kloramfenikolrezisztencia-kazetta FRT-helyein ható FLP rekombinázt hordozó pCP20-plazmidot vittünk be elektroporálással a rekombináns törzsekbe [Cheperanov P. P. és Wackernagel W,: „Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant”, Gene 158, 9–14 (1995)]. Sorozatos, 42 °C¹on történõ tenyésztést követõen, az antibiotikumrezisztencia-kazetta elvesztését PCR-eljárással ellenõriztük, ugyanazon oligonukleotidokkal, mint amelyeket elõzõleg alkalmaztunk.

b) E. coli MG1655 DplfAB :: cm módosított törzs elõállítása A plfA és plfB gének inaktiválását úgy végeztük, 60 hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát 7

1

HU 006 471 T2

inszertáltunk és az érintett gének nagyobb részét deletáltuk. Az alkalmazott eljárást Datsenko K. A. és Wanner B. L. ismertették (2000). A plfA és plfB gének helyettesítéséhez két oligonukleotidot alkalmaztunk: DplfB r oligonukleotidot, amely 100 bázist tartalmazott (SEQ ID NO 5): ccggacatcctgcgttgccgtaaatctggtgttctgaccggtctgccagatgcatatggccgtg ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ a plfB gén (950495–952777 koordináták), a http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 952235–952315 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmid kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko K. A. és Wanner B. L.: „One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K12 using PCR products” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640–6645 (2000)]. DplfAf oligonukleotidot, amely 100 bázist tartalmazott (SEQ ID NO 6): g a t g c a c t a t a a g a t g t g t t a a a a a c g c t g tagcagaatgaagcgcggaataaaaaagcggcaactcaataaagttgc cgCTGGAGCTGCTTCG ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ a pflA gén (949563–950303 szekvencia) fölött elhelyezkedõ (949470–949550 koordinátájú) szekvenciával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmid által hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazettát amplifikálja. A pflAB1 és pflAB2 oligonukleotidokat alkalmaztuk a kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására a pKD3 plazmidból. Ezt követõen, a kapott PCR-terméket elektroporálással vittük be az MG1655 (pKD46) törzsbe, amelyben az expresszált Red rekombináz lehetõvé teszi a homológ rekombinációt. Ezt követõen, az antibiotikumrezisztens transzformánsokat szelektáltuk, és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-eljárással, pflAB1 és pflAB2 oligonukleotidok alkalmazásával ellenõriztük. pflAB1 oligonukleotid (SEQ ID NO 7): agacattaaaaatatacgtgcagctacccg (homológ a 948462–948491 szekvenciával), pflAB2 oligonukleotid (SEQ ID NO 8): gtgaaagctgacaacccttttgatctttta (homológ a 953660–983689 szekvenciával). c) E. coli MG1655 DtpiA, DplfAB módosított törzs elõállítása A pflA és pflB gének deletálását és kloramfenikolrezisztencia-kazettával történõ helyettesítését P1 fággal végzett transzdukciós eljárással végeztük. A protokoll két lépésbõl állt, elõször fáglizátumot állítottunk elõ az MG1655 DplfAB:: cm törzsbõl, majd az MG1655 DtpiA törzset transzdukáltuk a fáglizátummal.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

2

Fáglizátum elõállítása – MG1655 (DplfAB:: cm) törzs éjszakán át tenyésztett kultúrájának 100 ml-ének leoltása 10 ml LB¹tápközegbe, amely 30 mg/ml kloramfenikolt, 0,2% glükózt és 5 mmol/l CaCl2¹ot tartalmazott. – Inkubálás 30 percen át, 37 °C¹on, rázatás mellett. – Vad MG1655 törzsön elõállított P1 lizátum 100 mlének a hozzáadása (körülbelül 109 fág/ml). – Rázatás 3 órán át, 37 °C¹on, a sejtek teljes líziséig. – 200 ml kloroform hozzáadása és vortexelés. – Centrifugálás 10 percen át, 4500 g mellett, a sejttörmelék eliminálása céljából. – Felülúszó átmérése steril csõbe és 200 ml kloroform hozzáadása. – A lizátum tárolása 4 °c¹on. Transzdukció – MG1655 (DtpiA) törzs LB¹tápközegben, éjszakán át tenyésztett kultúrája 5 ml¹ének centrifugálása 10 percen át, 1500 g mellett. – A sejtüledék szuszpendálása 10 mmol/l MgSO4 és 5 mmol/l CaCl2 oldatának 2,5 ml¹ében. – Kontrollcsövek: 100 ml sejt és MG1655 (DplfAB:: cm) törzsbõl származó P1 fág 100 ml¹e. – Tesztcsõ: 100 ml sejt és MG1655 (DplfAB:: cm) törzsbõl származó P1 fágból 100 ml. – Inkubálás 30 percen át, 30 °C¹on, rázatás nélkül. – 1 mol/l nátrium-citrát 100 ml-ének a hozzáadása, majd vortexelés. – 1 ml LB hozzáadása. – Inkubálás 1 órán át, 37 °C¹on, rázatás mellett. – 3 percen át, 7000 rpm mellett történõ centrifugálást követõen, szélesztés 30 mg kloramfenikolt tartalmazó LB¹lemezekre. – Inkubálás 37 °C¹on, éjszakán át. A törzs ellenõrzése Ezt követõen, az antibiotikumra rezisztens transzformánsokat szelektáltuk, és a pflAB:: cm szekvenciát tartalmazó régió inszertálódását PCR-eljárással erõsítettük meg, egyrészt pflAB1 és pflAB2 oligonukleotidokat alkalmazva, másrészt cdh és YllQ oligonukleotidokat alkalmazva abból a célból, hogy ellenõrizzük a tpiA gén delécióját a DplfAB:: cm törzsben. Az elõállított törzset MG1655 D(plfAB:: cm, DtpiA) törzsnek neveztük el. Ezt követõen, a kloramfenikolrezisztencia-kazettát a fent ismertetettek szerint eltávolítottuk. A kloramfenikolrezisztencia-kazetta FRT-helyeinél ható FLP rekombinázt hordozó pCP20-plazmidot ezután elektroporálással bejuttattuk a rekombináns törzsekbe. Ezt követõen, 42 °C¹on végzett, sorozatos tenyésztés után, PCR-eljárással ellenõriztük az antibiotikumrezisztencia-kazetta elvesztését, a fentiek szerinti oligonukleotidok alkalmazásával. Az elõállított törzset MG1655 DtpiA, DplfAB törzsnek neveztük el.

d) E. coli MG1655 DadhE:: cm módosított törzs elõállítása Az adhE gén inaktiválását ezúttal is úgy végeztük, 60 hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát 8

1

HU 006 471 T2

inszertáltunk és az érintett gének nagyobb részét deletáltuk, Datsenko K. A. és Wanner B. L. által ismertetett eljárással (2000). A deletáláshoz két oligonukleotidot alkalmaztunk: DadhE r oligonukleotidot, amely 100 bázist tartalmazott (SEQ ID NO 9): atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtaaaa aaagcccagcgtgaatatgccagtttcactCATATGAATATCCT CCTTAG ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az adhE gén (1294669–1297344 koordináták), a http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 1297263–1297343 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmid kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (2000)]. DadhEf oligonukleotidot, amely 100 bázist tartalmazott (SEQ ID NO 10): caataacgaatgatagcaattttaagtagttaggaggtgaaaaatgctgtc aaaaggcgtattgtcagcgcgtcttttcaTGTAGGCTGGAGCTG CTTCG ahol: az egyik régió homológ az adhE gén 1294694–1294774 koordinátájú szekvenciájával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmid kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja. A DadhEr és DadhEf oligonukleotidokat alkalmaztuk a kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására a pKD3 plazmidból. Ezt követõen, a kapott PCR-terméket elektroporálással vittük be az MG1655- (pKD46) törzsbe, amelyben az expresszált Red rekombináz lehetõvé teszi a homológ rekombinációt. Ezt követõen, az antibiotikumrezisztens transzformánsokat szelektáltuk, és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-eljárással, ychGf és adhECr oligonukleotidok alkalmazásával ellenõriztük. ychGf oligonukleotid (SEQ ID NO 11): ggctcattgcaccaccatccag (homológ a 1294357–1294378 szekvenciával), adhECr oligonukleotid (SEQ ID NO 121) gaaaagacgcgctgacaatacgcc (homológ a 1297772–1297749 szekvenciával).

A fentebb ismertetettek szerint, ezután eltávolítottuk kloramfenikolrezisztencia-kazettát. Ezt követõen, a kloramfenikolrezisztencia-kazetta FRT-helyein ható FLP rekombinázt hordozó pCP20-plazmidot vittünk be 5 elektroporálással a rekombináns törzsekbe. Sorozatos, 42 °C¹on történõ tenyésztést követõen, az antibiotikumrezisztencia-kazetta elvesztését PCReljárással ellenõriztük, a fentebb ismertetett, ugyanazon oligonukleotidok alkalmazásával. Az elõállított 10 törzset MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE törzsnek neveztük el.

15

20

25

30

35

40

45 e) E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE törzs elõállítása Az MG1655 DtpiA, DpflAB törzsben az adhE gén deletálását a fentiek szerinti P1 fág transzdukciós eljárással végeztük [lásd a protokoll c) pontját]. A P1 fáglizátumot MG1655 DadhE:: cm törzsön állítottuk elõ, majd az MG1655 DtpiA, DpflAB törzs transzdukcióját ezzel a lizátummal végeztük. A kloramfenikolra rezisztens transzduktánsokat ychCf és adhECr oligonukleotidokkal ellenõriztük abból a célból, hogy megerõsítsük az adhE gén mutációját, továbbá egyrészt a pflAB1 és pflAB2 oligonukleotidokkal, másrészt a cdh és YllQ oligonukleotidokkal abból a célból, hogy megerõsítsük mind a pflA és pflB, mind a tpiA gének delécióját a DadhE:: cm törzsben.

2

50

55

60 9

f) E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana módosított törzs elõállítása Az MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE törzsben az ldhA gén (1439878–1440867 koordináták) inaktiválását a fentiek szerinti P1 fág transzdukciós eljárással végeztük [lásd a protokoll c) pontját]. A P1 fág lizátumát E. coli K12 NZN11 Dplf:: cam, ldhA:: kana törzsön állítottuk elõ, amelyet Clark D. P. szolgáltatott [Bunch P. K., MatJan F. és Clark D. P.: „The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli” Microbiology 143, 187–195 (1997)]. Az MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE törzs transzdukcióját az E. coli K12 NZN11 Dplf:: cam, ldhA:: kana törzs lizátumával végeztük. A transzduktánsokat kanamicinnel szelektáltuk és a kanamicinkazetta inszertálódását az ldhA génbe hslJC és ldhAC2 oligonukleotidokkal ellenõriztük. hslJC oligonukleotid (SEQ ID NO 13): gccatcagcaggcttagccg (homológ a 1439345–1439767 szekvenciával), ldhAC2 oligonukleotid (SEQ ID NO 14): gggtattgtggcatgtttaaccg (homológ a 1441007–1441029 szekvenciával). Az elõállított törzset E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana törzsnek neveztük el. g) E. coli MG1655 DgloA:: cm módosított törzs elõállítása A gloA gén inaktiválását a fentebb ismertetettek szerint végeztük úgy, hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát inszertáltunk és az érintett gén nagyobb részét deletáltuk, Datsenko K. A. és Wanner B. L. által ismertetett eljárás szerint (2000). A deletáláshoz két oligonukleotidot alkalmaztunk: 1. GLOADf oligonukleotidot, amely 100 bázist tartalmazott (SEQ ID NO 15): atgcgtcttcttcataccatgctgcgcgttggcgatttgcaacgctccatcga tttttataccaaagtgctgggcatgaaGTGTAGGCTGGAGCTG CTTCG ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ a gloA gén (1725861–1726268 koordináták), a http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 1725861–1725941 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmid kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (2000)].

1

HU 006 471 T2

GLOADr oligonukleotidot (16. SEQ ID NO) ttagttgcccagaccgcgaccggcgtctttctcttcgattaactcaattttgta accgtccggatcttccacaaacgcgaCATATGAATATCCTCCT TAG ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az gloA gén (1725861–1726268 koordináták) 1726188–1726268 koordinátájú szekvenciájával és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmid kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja. A GLOADr és GLOADf oligonukleotidokat alkalmaztuk a pKD3 plazmidon hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására. Az elõállított PCRterméket ezt követõen elektroporálással bevittük az MG1655 (pKD46) törzsbe, amelyben a Red rekombináz enzim lehetõvé tette a homológ rekombinációt. Az antibiotikumra rezisztens transzformánsokat szelektáltuk és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-vizsgálattal ellenõriztük, NemAQd és Rnt Cr oligonukleotidok alkalmazásával. NemAQd oligonukleotid (SEQ ID NO 17): gaagtggtcgatgccgggattgaagaatggg (homológ a 1725331–1725361 szekvenciával), Rnt Cr oligonukleotid (SEQ ID NO 18): gggttacgtttcagtgaggcgcgttctgcgg (homológ a 1726765–1726795 szekvenciával). h) E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA módosított törzs elõállítása Az MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana törzsben a gloA gén deletálását a fentiek szerinti P1 fág transzdukciós eljárással végeztük [lásd a protokoll c) pontját]. A P1 fág lizátumot MG1655 DgloA:: cm törzsön állítottuk elõ, majd az MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana törzs transzdukcióját ezzel a lizátummal végeztük. A kloramfenikolra rezisztens transzduktánsokat NemAQd és Rnt Cr oligonukleotidokkal ellenõriztük abból a célból, hogy ellenõrizzük a gloA gén mutációját, továbbá a pflAB1 és pflAB2, cdh és YllQ, ychCf és adhECr, valamint a hslJC és ldhAC2 oligonukleotidokkal, abból a célból, hogy rendre ellenõrizzük a pflA és pflB, tpiA, adhE, valamint az ldhA gének delécióját a DgloA:: cm törzsben. A korábbiak szerint, a kloramfenikolrezisztenciakazettát eltávolítottuk. Ezt követõen, a kloramfenikolrezisztencia-kazetta FRT-helyein ható FLP rekombinázt hordozó pCP20-plazmidot vittünk be elektroporálással a rekombináns törzsekbe. Sorozatos, 42 °C¹on történõ tenyésztést követõen, az antibiotikumrezisztencia-kazetta elvesztését PCR-eljárással ellenõriztük, a fentebb ismertetett, ugyanazon oligonukleotidok alkalmazásával. Az elõállított törzset MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA törzsnek neveztük el. i) E. coli MG1655 DaldA:: cm módosított törzs elõállítása Az aldA gén inaktiválását a fentebb ismertetettek szerint végeztük úgy, hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát inszertáltunk és az érintett gén

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2

nagyobb részét deletáltuk, Datsenko K. A. és Wanner B. L. által ismertetett eljárás szerint (2000). A deletáláshoz két oligonukleotidot alkalmaztunk: 1. AldA D f oligonukleotidot, amely 100 bázist tartalmazott (SEQ ID NO 19): atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctg gcgtggagacgcatggattgatgtggtaGTGTAGGCTGGAGCT GCTTCG ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az aldA gén (1486256–1487695 koordináták), a http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 1486256–1486336 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmid kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (2000)]. 2. aldAD r oligonukleotidot, amely 100 bázist tartalmazott (SEQ ID NO 20): ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatg tttaccatctgcgccgccaataccggatttCATATGAATATCCTC CTTAG ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az aldA gén (1486256–1487695 koordináták) 1487615–1487695 koordinátájú szekvenciájával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmid kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (2000)]. Az AldA D r és aldAD f oligonukleotidokat alkalmaztuk a pKD3-plazmidon hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására. Az elõállított PCR-terméket ezt követõen elektroporálással bevittük az MG1655 (pKD46) törzsbe, amelyben a Red rekombináz enzim lehetõvé tette a homológ rekombinációt. Az antibiotikumra rezisztens transzformánsokat szelektáltuk és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-vizsgálattal ellenõriztük, Ydc F Cf és gapCCr oligonukleotidok alkalmazásával. Ydc F Cf oligonukleotid (SEQ ID NO 21): tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg (homológ a 1485722–1485752 koordinátájú szekvenciával), gapCCr oligonukleotid (SEQ ID NO 22): cacgatgacgaccattcatgcctatactggc (homológ a 1488195–1488225 koordinátájú szekvenciával).

j) E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA módosított törzs elõállítása Az MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, 50 DgloA törzsben az aldA gén deletálását a fentiek szerinti P1 fág transzdukciós eljárással végeztük [lásd a protokoll c) pontját]. A P1 fág lizátumát MG1655 DaldA:: cm törzsön állítottuk elõ, és az MG1655 DtpiA, 55 DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA törzs transzdukcióját ezzel a lizátummal végeztük. A kloramfenikolra rezisztens transzduktánsokat Ydc F Cf és gapCCr oligonukleotidokkal ellenõriztük abból a célból, hogy ellenõrizzük az aldA gén mutációját, továbbá a NemAQd és 60 Rnt Cr, pflAB1 és pflAB2, cdh és YllQ, ychCf és 10

1

HU 006 471 T2

adhECr, valamint a hslJC és ldhAC2 oligonukleotidokkal abból a célból, hogy rendre ellenõrizzük a gloA, pflA és B, tpiA és adhE gének delécióját a DaldA:: cm törzsben. A korábbiak szerint, a kloramfenikolrezisztenciakazettát eltávolítottuk. Ezt követõen, a kloramfenikolrezisztencia-kazetta FRT-helyein ható FLP rekombinázt hordozó pCP20-plazmidot vittünk be elektroporálással a rekombináns törzsekbe. Sorozatos, 42 °C¹on történõ tenyésztést követõen, az antibiotikumrezisztencia-kazetta elvesztését PCR-eljárással ellenõriztük, a fentebb ismertetett, ugyanazon oligonukleotidok alkalmazásával. Az elõállított törzset MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA törzsnek neveztük el. k) E. coli MG1655 DaldB:: cm módosított törzs elõállítása Az aldA gén inaktiválását a fentebb ismertetettek szerint végeztük úgy, hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát inszertáltunk és az érintett gén nagyobb részét deletáltuk, Datsenko K. A. és Wanner B. L. által ismertetett eljárás szerint (2000). A deletáláshoz két oligonukleotidot alkalmaztunk: 1. AldB D f oligonukleotidot, amely 100 bázist tartalmazott (SEQ ID NO 23): tcagaacagccccaacggtttatccgagtagctcaccagcaggcacttg gtttgctggtaatgctccagcatcatcttgtGTGTAGGCTGGAGCT GCTTCG ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az aldB gén (3752603–3754141 koordináták), a http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 3752603–3752683 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmid kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (2000)]. 2. AldBD r oligonukleotidot, amely 100 bázist tartalmazott (SEQ ID NO 24): atgaccaataatcccccttcagcacagattaagcccggcgagtatggtttc cccctcaagttaaaagcccgctatgacaaCATATGAATATCCTC CTTAG ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az aldB gén (3752603–3754141 koordináták) 3754061–3754141 koordinátájú szekvenciájával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmid kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (2000)]. Az AldB D r és aldB D f oligonukleotidokat alkalmaztuk a pKD3-plazmidon hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására. Az elõállított PCRterméket ezt követõen elektroporálással bevittük az MG1655 (pKD46) törzsbe, amelyben a Red rekombináz enzim lehetõvé tette a homológ rekombinációt. Az antibiotikumra rezisztens transzformánsokat szelektáltuk és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-vizsgálattal ellenõriztük, aldB C f és YiaYCr oligonukleotidok alkalmazásával.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 11

2

aldB C f oligonukleotid (SEQ ID NO 25): catatttccctcaaagaatataaaaaagaacaattaacgc (homológ a 3752057–3752095 szekvenciával), YiaYCr oligonukleotid (SEQ ID NO 26): tatgttcatgcgatggcgcaccagctgggcg (homológ a 3754644–3754674 szekvenciával) 1) E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB módosított törzs elõállítása Az MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA törzsben az aldB gén deletálását a fentiek szerinti P1 fág transzdukciós eljárással végeztük [lásd a protokoll c) pontját]. A P1 fág lizátumot MG1655 DaldB:: cm törzsön állítottuk elõ, és az MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA törzs transzdukcióját ezzel a lizátummal végeztük. A kloramfenikolra rezisztens transzduktánsokat aldB C f és YiaYCr oligonukleotidokkal ellenõriztük abból a célból, hogy megerõsítsük az aldB gén mutációját, továbbá a NemAQd és Rnt Cr, pflAB1 és pflAB2, cdh és YllQ, ychCf és adhECr, hslJC és ldhAC2, valamint Ydc F Cf és gapCCr oligonukleotidokkal abból a célból, hogy rendre ellenõrizzük a gloA, pflA és B, tpiA, adhE és aldA gének delécióját a DaldB:: cm törzsben. A korábbiak szerint, a kloramfenikolrezisztencia-kazettát eltávolítottuk. Ezt követõen, a kloramfenikolrezisztencia-kazetta FRT-helyein ható FLP rekombinázt hordozó pCP20-plazmidot vittünk be elektroporálással a rekombináns törzsekbe. Sorozatos, 42 °C¹on történõ tenyésztést követõen, az antibiotikumrezisztencia-kazetta elvesztését PCR-eljárással ellenõriztük, a fentebb ismertetett, ugyanazon oligonukleotidok alkalmazásával. Az elõállított törzset MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzsnek neveztük el. 2. példa: E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB módosított törzs tenyésztése és evolúciója kemosztátban Abból a célból, hogy optimalizáljuk az E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzs glükózból történõ 1,2-propándiol termelését, a törzset kemosztátban, nátrium-nitráttal és élesztõkivonattal kiegészített minimáltápközegben tenyésztettük több héten át, anaerob körülmények mellett. A tenyésztés elején a glükóz kiindulási koncentrációja a tenyészet táplálótankjában 20 g/l volt, a hígítás mértéke 0,04 óra–1 volt, és nitrogén folyamatos áramoltatásával anaerob körülményeket biztosítottunk. A sejtek száma alacsony, és az 1,2-propándiol és acetát termelõdése gyenge volt. Több hetes tenyésztést követõen, a sejtek szaporodása fokozódott, a termékek koncentrációja emelkedett, folyamatos üzemmódot értünk el, amelyet reziduális glükóz adott koncentrációja és a termékek állandó koncentrációi jellemeztek (2. ábra).

1

HU 006 471 T2

3. példa: NADH¹ra kevésbé érzékeny, evolvált piruvát-dehidrogenáz komplex jellemzése Piruvát-dehidrogenáz komplex (PDHc) fejlõdését mutattuk ki NADH¹ra kevésbé érzékeny PDHc irányába, az evolvált enzim aktivitásának in vitro mérésével, valamint az evolvált PDHc lipoamid-dehidrogenázát kódoló egyik gén (lpd) szekvenciájának a natív PDHc génjével történõ összehasonlításával. a) Piruvát-dehidrogenáz enzim aktivitásának mérése: Az E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzsben a PDHc enzim aktivitásának in vitro mérését Schwartz és Reed által ismertetett eljárással végeztük [Schwartz E. R. és Reed L. J.: „Regulation of the activity of the pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli” Biochemistry 6, 1434–1439 (1970)]. A kemosztátból 100 ml térfogatnyi sejtkultúrát helyeztünk át anaerob fülkében tartott, elõzõleg gáztalanított csövekbe. A sejteket 10 percen át, 6000 rpm mellett centrifugáltuk. A sejtüledéket 50 mmol/l káliumfoszfátot (pH=7,9) és 0,5 mmol/l tiamin-pirofoszfátot tartalmazó oldat körülbelül 100 ml¹ében szuszpendáltuk, majd ismét centrifugáltuk 10 percen át, 6000 rpm mellett. A mosást még egyszer elvégeztük, azonos körülmények mellett. A sejtüledéket 800 ml pufferben szuszpendáltuk. A sejtszuszpenziót ultrahang-berendezéssel roncsoltuk, 4 kezelési ciklus alatt (30 mp idõtartam és 30% energia mellett), 2 perces, jeges fürdõben töltött szünetekkel megszakítva. A sejttörmeléket 5 percen át, 13400 rpm mellett végzett centrifugálással távolítottuk el, a felülúszó volt a kiindulási sejtmentes kivonat. A sejtmentes kivonatban jelen levõ sókat, amelyek zavarhatják az enzimaktivitás mérését, úgy távolítottuk el, hogy a kivonatot 0,5 mmol/l tiamin-pirofoszfátot és kálium-foszfátot tartalmazó pufferrel (pH=7,9) ekvilibrált PD10 oszlopon engedtük át. A kivonatot ugyanezen puffer 3,5 ml¹ével eluáltuk. Az összegyûjtött eluátum volt a kiindulási sejtmentes kivonat. Az enzimaktivitást elõször NADH jelenléte nélkül, majd NADH 0,14–2,7 mmol/l emelkedõ koncentrációi jelenlétében mértük. A kapott eredményeket a vad típusú E. colira vonatkozó, szakirodalomban ismertetett értékekhez hasonlítottuk (3. ábra) [Snoep J. L., De Graef M. R., Westphal A. H., De Kok A., Teixeira de Mattos M. J. és Neijssel O. M.: „Differences in sensitivity to NADH of purified piruvate dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis, Azetobacter vinelandii and Escherichia coli: implications for their activity in vivo” FEMS Microbiology Letters 114, 279–284 (1993)]. A kapott eredmények arra utaltak, hogy az evolvált, módosított E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzs kevésbé érzékeny NADH¹ra, mint a vad típusú E. coli. [NAD+]/[NADH] » 33 arány mellett a vad törzs a PHDc-aktivitás teljes gátlását észleltük, míg az evolvált PDHc aktivitásának a 80%¹át mértük.

5

10

15

20

25

2

b) Az evolvált MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzs piruvátdehidrogenáz komplexének lipoamiddehidrogenázát kódoló lpd gén szekvenciájának a meghatározása: Az E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzs kromoszomális DNS¹ét LB¹tápközegben, éjszakán át tenyésztett kultúrájának 1 ml¹ébõl vontuk ki. Centrifugálást követõen, a sejteket steril vízzel mostuk, majd 94 °C¹on, 5 percen át alkalmazott hõsokkal roncsoltuk. Centrifugálást követõen a kromoszomális DNS¹t összegyûjtöttük a felülúszóból. A piruvát-dehidrogenáz komplex lipoamid-dehidrogenázát (E3) kódoló lpd gént (127912–129336 szekvencia) PCR-eljárással amplifikáltuk, az alábbi két oligonukleotid alkalmazásával: AceEf oligonukleotid (SEQ ID NO 27) cgcgtgatcgacggtgctgatggtgcccg (homológ a 127504–127532 szekvenciával), YacH r oligonukleotid (SEQ ID NO 28) Aagttcaggagagccgccc (homológ a 127513–129531 szekvenciával). Az lpd génnek megfelelõ, 2000 bázispárból álló terméket kaptunk, amelyet szekvenáltunk. A kapott eredmények pontmutáció jelenlétét mutatták ki, ahol az 55. pozícióban levõ alanint valin helyettesíti.

4. példa: A módosított, evolvált E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzs metil-glioxált 1,2-propándiollá 30 konvertáló anyagcsereútjában nem vesz részt glicerol-dehidrogenáz Annak kimutatása céljából, hogy a módosított, evolvált E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: 35 kana, DgloA, DaldA, DaldB teljesítményének a javulása nem a gldA gén által kódolt glicerol-dehidrogenáz fejlõdésének tulajdonítható, olyan evolvált E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzset állítottunk elõ, amelybõl agldA 40 gént deletáltuk.

45

50

55

60 12

a) MG1655 DgldA:: cm módosított törzs elõállítása A gldA gén inaktiválását az 1. példában ismertetettek szerint végeztük úgy, hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát inszertáltunk, és az érintett gén nagyobb részét Datsenko K. A. és Wanner B. L. (2000) által ismertetett eljárással deletáltuk. A deletáláshoz két oligonukleotidot alkalmaztunk: gldA D f oligonukleotidot, amely 100 bázisból állt (SEQ ID NO 29) gttattcccactcttgcaggaaacgctgaccgtactggtcggctaccagca gagcggcgtaaacctgatctggcgtcgcgGTGTAGGCTGGAG CTGCTTCG ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ a gldA gén (4135512–4136615 koordináták), a http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 4135512–4135592 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és

1

HU 006 471 T2

a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmid kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (2000)]. gldA D r oligonukleotidot, amely 100 bázisból állt (30. SEQ ID NO): atggaccgcattattcaatcaccgggtaaatacatccagggcgctgatgt gattaatcgtctgggcgaatacctgaagccCATATGAATATCCT CCTTAG ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ a gldA gén (4135512–4136615 koordináták) 4136535–4136615 koordinátájú szekvenciájával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmid kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (2000)]. Az gldA D r és gldA D f oligonukleotidokat alkalmaztuk a pKD3-plazmidban hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására. Az elõállított PCRterméket ezt követõen elektroporálással bevittük az MG1655 (pKD46) törzsbe, amelyben a Red rekombináz enzim lehetõvé tette a homológ rekombinációt. Az antibiotikumra rezisztens transzformánsokat szelektáltuk és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-vizsgálattal ellenõriztük, YijF D és TalCr oligonukleotidok alkalmazásával. YijF D oligonukleotid (SEQ ID NO 31): gcctggatttgtaccacggttggtggaacggcggg (homológ a 4135140–4135174 szekvenciával), TalCr oligonukleotid (SEQ ID NO 32): cacgcatattccccattgccgggg (homológ a 4137216–4137239 szekvenciával). Egy 2100 bp méretû terméket kaptunk mind a vad gén esetében, mind a kloramfenikolrezisztencia-génnel deletált és helyettesített gén esetében. Ráadásul, a kapott PCR-termékeket ezt követõen SalI restrikciós en-

2

zimmel emésztettük. A vad PCR-termék esetében két, körülbelül 1000 bp méretû fragmenst kaptunk, míg a kloramfenikolrezisztencia-gént tartalmazó PCR-termék nem volt hasítható. 5 b) Módosított, evolvált MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, DgldA:: cm törzs elõállítása Az evolvált MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: 10 kana, DgloA, DaldA, DaldB törzsben a gldA gén deletálását az 1. példa szerinti P1 fág transzdukciós eljárással végeztük [lásd a protokoll c) pontját]. A P1 fáglizátumot MG1655 DgldA:: cm törzsön állítottuk elõ, majd az MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, 15 DaldA törzs transzdukcióját ezzel a lizátummal végeztük. A kloramfenikolra rezisztens transzduktánsokat YijF D és TalCr oligonukleotidokkal ellenõriztük abból a célból, hogy meggyõzõdjünk a gldA gén mutációjáról. c) Módosított, evolvált E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, DgldA:: cm és E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzsek tenyésztése 25 A módosított, evolvált E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, DgldA:: cm és E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzseket nem szabályozott pH mellett, nátrium-nitráttal és élesztõkivonattal 30 kiegészített, minimál tápközegben tenyésztettük, 10 napon át, 20 g/l kiindulási glükózkoncentráció és anaerob körülmények mellett. A kapott fermentációs termékek profilja azt mutatta, hogy a gldA gén deletálása nem okozza az 1,2-propándiol termelésének a csök35 kenését (1. táblázat). 20

1. táblázat Szubsztrát és fermentációs termékek koncentrációinak az összehasonlítása módosított, evolvált E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, DgldA:: cm és E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzsek 10 napon át tartó tenyésztése után Törzs

Optikai denzitás

Glükózfogyasztás (g/l)

Metil-glioxál (g/l)

Ecetsav (g/l)

1,2-Propándiol (g/l)

E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, DgldA:: cm

1,5

7,3

1,2

2,1

1,7

E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB

1,9

9,6

1,4

1,9

1,2

5. példa: Glükóznak 1,2-propándiollá konvertálódása hatásfokának a javítása a 6¹foszfo-glukonát-dehidratázt kódoló edd gén deletálásával az E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzsben a) Módosított MG1655 Dedd:: cm törzs elõállítása Az edd gén inaktiválását az 1. példában ismertetettek szerint végeztük úgy, hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát inszertáltunk, és az érintett

50 gén nagyobb részét Datsenko K. A. és Wanner B. L. (2000) által ismertetett eljárással deletáltuk. A deletáláshoz két oligonukleotidot alkalmaztunk: 1. edd D f oligonukleotidot, amely 100 bázisból állt (SEQ ID NO 33) 55 ttaaaaagtgatacaggttgcgccctgttcggcaccggacagtttttcacgc aaggcgctgaataattcacgtcctgttcGTGTAGGCTGGAGCT GCTTCG ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az edd 60 gén (1930817–1932628 koordináták), a http://geno13

1

HU 006 471 T2

list.pasteur.fr/Colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 1930817–1930897 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmid kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (2000)]. 2. edd D r oligonukleotidot, amely 100 bázisból állt (SEQ ID NO 34): atgaatccacaattgttacgcgtaacaaatcgaatcattgaacgttcgcgc gagactcgctctgcttatctcgcccggatCATATGAATATCCTCC TTAG ahol: az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az edd gén (1930817–1932628 koordináták) 1932548–1932628 koordinátájú szekvenciájával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pKD3-plazmidon hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazettát amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (2000)]. Az edd D R és edd D f oligonukleotidokat alkalmaztuk a pKD3-plazmidban hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására. Az elõállított PCR-terméket ezt követõen elektroporálással bevittük az MG1655- (pKD46) törzsbe, amelyben a Red rekombináz enzim lehetõvé tette a homológ rekombinációt. Az antibiotikumra rezisztens transzformánsokat szelektáltuk és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-vizsgálattal ellenõriztük, eda d és zwf r oligonukleotidok alkalmazásával: eda d oligonukleotid (SEQ ID NO 35): CCCCGGMTCAGAGGMTAGTCCC (homológ a 1930439–1930462 szekvenciával), zwf r oligonukleotid (SEQ ID NO 36): GGGTAGACTCCATTACTGAGGCGTGGGCG (homológ a 1932968–1932996 szekvenciával).

2

b) Módosított, evolvált E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, Dedd elõállítása Az evolvált E. coli MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, 5 ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzsben az edd gén inaktiválását az 1. példa szerinti P1 fág transzdukciós eljárással végeztük [lásd a protokoll c) pontját]. A P1 fág lizátumát MG1655 DgldA:: cm törzsön állítottuk elõ, és az MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: 10 kana, DgloA, DaldA, DaldB törzs transzdukcióját ezzel a lizátummal végeztük. A kloramfenikolra rezisztens transzduktánsokat eda d és zwf r oligonukleotidokkal ellenõriztük abból a célból, hogy meggyõzõdjünk az edd gén mutációjáról. 15 c) A módosított, evolvált E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, Dedd:: cm és az evolvált E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB 20 törzsek tenyésztése A módosított, evolvált E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, Dedd:: cm és E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzseket nem szabályozott 25 pH mellett, nátrium-nitráttal és élesztõkivonattal kiegészített, minimál tápközegben tenyésztettük, 10 napon át, 20 g/l kiindulási glükózkoncentráció és anaerob körülmények mellett. A kapott fermentációs termékek profilja azt mutatta, hogy a edd gén deletálása 0,13 g/g¹ról 30 0,35 g/g¹ra emelte glükóznak 1,2-propándiollá konvertálódásának a hatásfokát (2. táblázat). Az edd gén deletálása az evolvált E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzsben tehát lehetõvé teszi a törzs teljesítményének a javítását.

2. táblázat Szubsztrát és fermentációs termékek koncentrációinak az összehasonlítása módosított, evolvált E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, Dedd:: cm és E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB törzsek 10 napon át tartó tenyésztését követõen Törzs

Optikai denzitás



Ecetsav (g/l)


Y 1,2 Pdiol/ glükóz (g/g)

E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, Dedd:: cm

1,2

5

0,2

1,5

1,8

0,35

E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB

1,9

9,6

1,4

1,9

1,2

0,13

6. példa: 1,2-Propándiol és aceton elõállítására képes, módosított E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, Dedd:: cm (pSOS95T) törzs elõállítása A pSOS95T plazmid ingázó expressziós vektor az Escherichia coli/Clostridium acetobutylicum organizmusokban, amely a Clostridium acetobutylicum aceton operonját alkotó négy gént hordozza, az adc, ctfAB és thl géneket, amelyek rendre az acetoacetát-karboxiláz, koenzim-A-transzferáz és tioláz enzimeket kódolják, a

tioláz promoter szabályozása alatt. Ez a három enzim katalizálja az acetil-CoA és acetát átalakulását acetonná és szén-dioxiddá. A pSOS95T plazmidot úgy állítottuk elõ, hogy a pSOS95 plazmidba (Gene bank nyil55 vántartási száma AY187686) a C. acetobutilicum tiolázt kódoló thl génjét inszertáltuk, a tioláz promoter és a ctfA gén között elhelyezkedõ BamHI hasítási helynél. A pSOS95T plazmidot elektroporálással bevittük az evolvált E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: 60 kana, DgloA, DaldA, DaldB, Dedd:: cm törzsbe. 14

1

HU 006 471 T2

E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, Dedd:: cm törzs éjszakán át, LB¹tápközegben tenyésztett kultúrájából elektrokompetens sejteket állítottunk elõ. Az éjszakán át tenyésztett kultúrából Erlenmeyer-lombikban 1:100 hígítású, 10 ml¹es kultúrát oltottunk le LB¹tápközegbe, amelyet 37 °C¹on inkubáltunk. Amint az 550 nm hullámhosszon mért optikai denzitás elérte a 0,4–0,6 értéket, a tenyészet 1 ml¹ét lecentrifugáltuk. A sejteket vízzel, majd 10%¹os glicerinoldattal mostuk, majd 0,05 ml 10%¹os glicerinoldatban szuszpendáltuk. A sejteket azonnal elektroporáltuk 5 ml (25 mF, 200 W, 2,5 kV; Gene pulser, Biorad) pSOS95T (Qiagen, Hilden, Németország) plazmidkészítménnyel. SOC tápközegben, 1 órán át tartó, 37 °C¹on lezajló fenotípusos expresszálódást követõen [Sambrook J., Fristch E. F. és maniatis T.: „Molecular cloning: a laboratory manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.], a transzformánsokat gél (agar) tápközegen szelektáltuk, 37 °C¹on, 100 mg/ml karbenicillin alkalmazásával. A transzformánsokat egy éjszakára folyadék tápközegbe helyeztük karbenicillin jelenlétében abból a célból, hogy plazmid-DNS¹t vonjunk ki (Qiagen, Hilden,

2

Németország) és ellenõrizzük a pSOS95T plazmid jelenlétét és enzimatikus hasítással meggyõzõdjünk helyességérõl. 7. példa: A módosított, evolvált, 1,2-propándiol és aceton elõállítására képes E. coli * MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, Dedd:: cm (pSOS95T) törzs tenyésztése A módosított, evolvált E. coli *MG1655 DtpiA, 10 DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, Dedd:: cm és E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB Dedd:: cm (pSOS95T) törzset nem szabályozott pH mellett, nátrium-nitráttal és élesztõkivonattal kiegészített, minimál 15 tápközegben tenyésztettük 10 napon át, 20 g/l kiindulási glükózkoncentráció és anaerob körülmények mellett (3. táblázat) A fermentációs termékek mérése azt mutatta, hogy az evolvált E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, 20 Dedd:: cm és E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB Dedd:: cm (pSOS95T) törzs 1,2-propándiol, acetát és aceton elegyét állítja elõ. 5

3. táblázat Szubsztrát és fermentációs termékek koncentrációinak az összehasonlítása módosított, evolvált E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, Dedd:: cm (pSOS95T) és E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, Dedd:: cm törzsek 10 napon át tartó tenyésztését követõen Törzs

Optikai denzitás

E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, Dedd:: cm (pSOS95T)

1,4

E. coli *MG1655 DtpiA, DpflAB, DadhE, ldhA:: kana, DgloA, DaldA, DaldB, Dedd:: cm

1,2



Ecetsav (g/l)


Aceton (g/l)

4,8

0,3

1,3

1,6

0,1

5

0,2

1,5

1,8

–

Szekvencialista <110> Metabolic Explorer <120> Evolved micro-organism for the Production of 1,2-propanediol <130> 347276 <150> FR 0400214 <151> 2004–01–12 <160> 36 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 102 <212> DNA <213> artificial sequence 15

HU 006 471 T2

<220> <223> Egyéb információ: szintetikus oligonukleotid <400> 1

atgcgacatc ctttagtgat gggtaactgg aaactgaacg gcagccgcca catggttcac gagctggttt ctaacctgcg tacatatgaa tatcctcctt ag

60 102

<210> 2 <211> 100 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Egyéb információ: szintetikus oligonukleotid <400> 2

cttaagcctg tttagccgct tctgcagctt taacgattac tgcgaaggcg tcagctttca gagaagcacc accaaccagc tgtaggctgg agctgcttcg

60 100


ggtgatgata gttatcgccg

20


cgtgccatcg acagcagtcc

20


ccggacatcc tgcgttgccg taaatctggt gttctgaccg gtctgccaga tgcatatggc cgtggccgta tcatcggtga catatgaata tcctccttag <210> 6 <211> 94 16

60 100

HU 006 471 T2

<212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Egyéb információ: szintetikus oligonukleotid <400> 6

gatgcactat aagatgtgtt aaaaacgctg tagcagaatg aagcgcggaa taaaaaagcg gcaactcaat aaagttgccg ctggagctgc ttcg

60 94


agacattaaa aatatacgtg cagctacccg

30


gtgaaagctg acaacccttt tgatctttta

30


atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa aaaagcccag cgtgaatatg ccagtttcac tcatatgaat atcctcctta g

60 101


caataacgaa tgatagcaat tttaagtagt taggaggtga aaaatgctgt caaaaggcgt attgtcagcg cgtcttttca tgtaggctgg agctgcttcg 17

60 100

HU 006 471 T2


ggctcattgc accaccatcc ag

22


gaaaagacgc gctgacaata cgcc

24


gccatcagca ggcttagccg

20


gggtattgtg gcatgtttaa ccg

23


atgcgtcttc ttcataccat gctgcgcgtt ggcgatttgc aacgctccat cgatttttat accaaagtgc tgggcatgaa gtgtaggctg gagctgcttc g 18

60 101

HU 006 471 T2


ttagttgccc agaccgcgac cggcgtcttt ctcttcgatt aactcaattt tgtaaccgtc cggatcttcc acaaacgcga catatgaata tcctccttag

60 100


gaagtggtcg atgccgggat tgaagaatgg g

31


gggttacgtt tcagtgaggc gcgttctgcg g

31


atgtcagtac ccgttcaaca tcctatgtat atcgatggac agtttgttac ctggcgtgga gacgcatgga ttgatgtggt agtgtaggct ggagctgctt cg <210> 20 <211> 101 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Egyéb információ: szintetikus oligonukleotid

19

60 102

HU 006 471 T2

<400> 20

ttaagactgt aaataaacca cctgggtctg cagatattca tgcaagccat gtttaccatc tgcgccgcca ataccggatt tcatatgaat atcctcctta g

60 101


tgcagcggcg cacgatggcg acgttccgcc g

31


cacgatgacg accattcatg cctatactgg c

31


tcagaacagc cccaacggtt tatccgagta gctcaccagc aggcacttgg tttgctggta atgctccagc atcatcttgt gtgtaggctg gagctgcttc g

60 101


atgaccaata atcccccttc agcacagatt aagcccggcg agtatggttt ccccctcaag ttaaaagccc gctatgacaa catatgaata tcctccttag <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence

20

60 100

HU 006 471 T2


catatttccc tcaaagaata taaaaaagaa caattaacgc

40


tatgttcatg cgatggcgca ccagctgggc g

31


cgcgtgatcg acggtgctga tggtgcccg

29


aagttcagga gagccgccc

19


gttattccca ctcttgcagg aaacgctgac cgtactggtc ggctaccagc agagcggcgt aaacctgatc tggcgtcgcg gtgtaggctg gagctgcttc g <210> 30 <211> 100 <212> DNA <213> artificial sequence 21

60 101

HU 006 471 T2


atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt ctgggcgaat acctgaagcc catatgaata tcctccttag

60 100


gcctggattt gtaccacggt tggtggaacg gcggg

35


cacgcatatt ccccattgcc gggg

24


ttaaaaagtg atacaggttg cgccctgttc ggcaccggac agtttttcac gcaaggcgct gaataattca cgtcctgttc gtgtaggctg gagctgcttc g

60 101


atgaatccac aattgttacg cgtaacaaat cgaatcattg aacgttcgcg cgagactcgc tctgcttatc tcgcccggat catatgaata tcctccttag <210> 35 <211> 24 22

60 100

1

HU 006 471 T2

2

<212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Egyéb információ: szintetikus oligonukleotid <400> 35

ccccggaatc agaggaatag tccc

24


gggtagactc cattactgag gcgtgggcg

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás 1,2-propándiolnak egyszerû szénforrás metabolizálásával történõ elõállítására evolvált mikroorganizmustörzs elõállítására olyan kiindulási törzsbõl, amely a tpiA gén delécióját, valamint metil-glioxálnak (propanalnak) laktáttá konvertálásában részt vevõ enzimet kódoló legalább egy gén delécióját hordozza, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: – a kiindulási törzs tenyésztése egyszerû szénforrást tartalmazó, megfelelõ tápközegben, olyan növekvõ hígítási arányok alkalmazásával, amelyek mellett a tápközegben csak azok a mikroorganizmusok maradnak fenn, amelyek szaporodási rátája azonos, vagy magasabb, mint az alkalmazott hígítási arány, abból a célból, hogy a kiindulási törzsben DHAP-nak metil-glioxállá, majd 1,2-propándiollá történõ bioszintézisének az útjában részt vevõ egy vagy több gén javított „1,2-propándiolszintetáz”-aktivitást mutató, evolvált gének irányába történõ evolúcióját váltsuk ki, valamint – a javított „1,2-propándiol-szintetáz”-aktivitást mutató törzs vagy törzsek szelektálása és izolálása. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metil-glioxálnak laktáttá konvertálásában részt vevõ gén a gloA, aldA és aldB gének közül választott. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiindulási törzs az aldA és/vagy aldB gének delécióját hordozza. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiindulási törzs hordozza a gloA, aldA, aldB és tpiA gének delécióját. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiindulási törzsben a glükóz fermentálásának természetes útjai, amelyek NADH¹t fogyasztanak, szuppresszáltak.

29

25

30

35

40

45

50

55

60 23

6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiindulási törzs az adhE és ldhA gének delécióját hordozza. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiindulási törzs tartalmaz továbbá piruvát-dehidrogenáz komplexet kódoló, legalább egy gént. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a piruvát-dehidrogenáz komplex lipoamid-dehidrogenázát kódoló lpd gén pontmutációt hordoz, miáltal az 55¹ös pozíciójú alanint valin helyettesíti. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a piruvát-dehidrogenáz komplex endogén eredetû. 10. Az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiindulási törzs a pflA és pflB gének delécióját hordozza. 11. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiindulási törzs hordozza továbbá az edd gén delécióját. 12. Az 1–11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiindulási törzs a gloA, aldA, aldB, tpiA, adhE, ldhA, pflA és pflB és edd gének delécióját hordozza. 13. Az 1–12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az evolvált törzsbe acetilCoA-nak és acetátnak acetonná történõ konverziójában részt vevõ egy vagy több enzimet kódoló, egy vagy több heterológ gént viszünk be, amely enzimek acetoacetát-karboxiláz, koenzim-A-transzferáz és tioláz közül választottak. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acetil-CoA és acetát acetonná történõ konverziójában részt vevõ, egy vagy több enzimet kódoló, egy vagy több heterológ gén a Clostridium acetobutylicum organizmusból származik.

1

HU 006 471 T2

15. A 13. vagy 14. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 13. vagy 14. igénypont bármelyike szerint elõállított, módosított, evolvált törzset szelekciós nyomás alatt, egyszerû szénforrást tartalmazó, megfelelõ tápközegben kerül tenyésztünk abból a célból, hogy a módosított, evolvált törzsben acetil-CoA és acetát acetonná történõ konverziójában részt vevõ, egy vagy több gén javított „aceton-szintetáz”-aktivitás irányába evolváljon, majd a javított „1,2propándiol-szintetáz” és javított „aceton-szintetáz”-aktivitást mutató második generációs, evolvált mikroorganizmusokat szelektáljuk és izoláljuk. 16. Az 1–15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a törzs baktériumok, élesztõk és gombák közül választott. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a törzs Escherichia, elõnyösen E. coli, és Corynebacterium, elõnyösen C. glutamicum-törzsek közül választott. 18. A 3–6., 8., 10., 11. vagy 12. igénypontok bármelyike szerint meghatározott kiindulási törzs.

2

19. A 18. igénypont szerinti kiindulási törzs, azzal jellemezve, hogy a törzs baktériumok, élesztõk és gombák közül választott. 20. A 19. igénypont szerinti kiindulási törzs, azzal 5 jellemezve, hogy a törzs Escherichia, elõnyösen E. coli, és Corynebacterium, elõnyösen C. glutamicumtörzsek közül választott. 21. Az 1–17. igénypontok bármelyike szerinti eljárással elõállított, evolvált törzs, amelyben az lpd gén 10 pontmutációt hordoz, miáltal az 55¹ös pozíciójú alanint valin helyettesíti. 22. Eljárás 1,2-propándiol elõállítására, amely szerint a 21. igénypont szerinti, evolvált törzset egyszerû szénforrást tartalmazó, megfelelõ tápközegben 15 tenyésztjük, majd az 1,2-propándiol-terméket kinyerjük. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1,2-propándiolt és az acetont kinyerjük. 24. A 22. vagy 23. igénypontok bármelyike szerinti 20 eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1,2-propándiolt és/vagy az acetont megtisztítjuk.

24

HU 006 471 T2 Int. Cl.: C12N 15/01

25

HU 006 471 T2 Int. Cl.: C12N 15/01

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest

(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Recommend Documents