!HU000007195T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 195
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 778915 2004. 02. 13.
(73) Jogosult: Micromet AG, 81477 München (DE)
US
(72) Feltalálók: PETERS, Malte, c/o Micromet AG, 81477 München (DE); LOCHER, Mathias, c/o Micromet AG, 81477 München (DE); PRANG, Nadja, c/o Micromet AG, 81477 München (DE); QUADT, Cornelia, c/o Micromet AG, 81477 München (DE) (54)
HU 007 195 T2
C07K 16/30
(21) Magyar ügyszám: E 05 707293 (22) A bejelentés napja: 2005. 02. 09. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050707293 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1713830 A1 2005. 09. 01. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1713830 B1 2009. 07. 22.
(2006.01) A61P 35/00 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05080428 PCT/EP 05/001307
(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest
EpCAM elleni immunglobulinok
A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül 8 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 195 T2
A. A találmány alkalmazási területe A találmány tárgyát képezik eljárások tumoros betegségek kezelésére, immunglobulin-molekulák alkalmazásával. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezik EpCAM elleni immunglobulin-molekulákat alkalmazó kezelési eljárások. A találmány tárgyát képezik továbbá ilyen immunglobulinok alkalmazásai gyógyszerek elõállítására. A találmány tárgyát képezik továbbá tumoros betegségek kezelésére alkalmas immunglobulin-molekulák, valamint ilyen immunglobulin-molekulákat tartalmazó készítmények. B. A technika állása Immunglobulinok beadását alkalmazó terápiás beadási rend megtervezésekor számos tényezõt kell mérlegelni. Egyrészt, a terápiás immunglobulint elegendõ mennyiségben kell beadni a betegnek ahhoz, hogy a kívánt terápiás hatást elérjük. A terápiás hatásnak meg kell valósulnia a kezdeti kezeléskor és a lehetõ legnagyobb mértékben folytatódnia kell akkor, amikor az immunglobulin két egymást követõ beadás között fokozatosan kiürül a páciens szervezetébõl. Másfelõl, a beadott immunglobulin mennyisége nem lehet olyan nagy, hogy a betegnek nem kívánt és/vagy toxikus mellékhatásokat okozzon. Ennek megfelelõen, probléma merül fel, amikor adott immunglobulin mellékhatások okozása nélkül tolerálható maximális dózisa (maximális tolerált dózis, „maximum tolerated dose”, MTD) az immunglobulin mennyiségét olyan egyszeri dózisszintre korlátozza, amely az idõben nem elég ahhoz, hogy az immunglobulin folyamatos hatékonyságot biztosítani kívánt, minimális szintjét fenntartsa. Ilyen elrendezésben, lehetetlenné válik olyan terápiás szérumszintminimum („szérumteknõszint”; „serum trough level”) fenntartása, amely az immunglobulin következõ beadásáig a terápiás hatás biztosításához szükséges. Adott gyógyszer „terápiás szérumszintminimuma” alatt általában azt a legalacsonyabb koncentrációt értjük, amelyet a gyógyszer a páciens vérében még elérhet, a terápiás hatás vesztése nélkül. Ennek megfelelõen, azt a minimális mennyiségû gyógyszert jelenti, amelynek mindig a páciens vérében kell lenni ahhoz, hogy bármely terápiás elõny realizálódjon. Adott terápiás immunglobulin kívánt terápiás szérumszintminimumának a fenntartására számos megközelítés létezik. Egyik megközelítés a betegnek beadott immunglobulin kezdõ adagjának a növelése. Ez a megközelítés azonban azzal a hátránnyal jár, hogy valószínûleg meghaladja a terápiás immunglobulinnak a páciens számára biztonságos szintjét, és a beteget valószínûleg nem kívánt és/vagy toxikus mellékhatások érik. Egy további megközelítés szerint növeljük a terápiás immunglobulin beadásának a gyakoriságát. A beadás gyakoriságának a növelése azonban súlyosan korlátozza a páciens életminõségét, mivel többszöri és gyakori megjelenést igényel a klinikán. Ez különösen érvényes, ha a kezelt betegség korai szakaszában van, és a páciens egyébként normál életet vezethet.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
Ezen túlmenõen, a megnövelt beadási gyakoriság a teljes terápiás beadási rendhez szükséges terápiás immunglobulin nagyobb összes mennyiségével jár. A megnövelt beadási gyakoriság mint olyan, a terápia adott rendjével összefüggõ magasabb összes költséggel jár, összehasonlítva olyan terápiás renddel, amely szerint a terápiás immunglobulint kevésbé gyakran adják be. Abban az esetben, ha a beadni kívánt terápiás immunglobulin olyan antigénre specifikus, amely egészséges és beteg szöveten egyaránt jelen van, az antigén gyakoribb lévén beteg szöveten, mint egészségesen, még fontosabbá válik olyan beadási rend kifejlesztése, amely a fenti szempontokat tekintetbe veszi. Ilyen esetben különösen nagy annak veszélye, hogy túl magas vagy túl gyakori dózisok nem kívánt kölcsönhatást váltanak ki a terápiás immunglobulin és azon antigén között, amelyhez a terápiás immunglobulin specifikusan kötõdik. Az immunglobulin és az egészséges szövetek közötti kölcsönhatások hajlamosak nem kívánt és/vagy toxikus mellékhatásokhoz vezetni, amelyek bonyolulttá tehetnek egy adott immunglobulint alkalmazó terápiás rendet. Ilyen antigén, amely egészséges és beteg emberi szövetben egyaránt jelen van, az epitheliális sejtadhéziós molekula („epithelial cell adhesion molecule”, EpCAM, más neveken 17–1A antigén, KSA, EGP40, GA733–2, ks 1–4 és esa). Az EpCAM felszíni glikoprotein, amelyet egyrétegû epitheliumsejtjei és azokból képzõdött tumorsejtek expresszálnak. Bár az EpCAMmolekula jelen van egészséges szövetbõl származó sejtek felszínén, expresszálódása malignus szövetben fokozott. Az EpCAM arra szolgál, hogy orientált és erõsen szervezett formában epithelsejtekhez tapadjon [Litvinov: J. Cell Biol. 139, 1337–1348 (1997)]. Epitheliumukon humáneredetû EpCAM-molekulát expresszáló, transzgenikus egereken és patkányokon végzett kísérletekbõl származó adatok azonban arra utalnak, hogy normál szöveteken jelen levõ EpCAM-hoz szisztémásan beadott ellenanyag nem fér hozzá [McLaughlin: Cancer Immunol. Immunther. 48, 303–311 (1999)]. Epithelsejtek malignus transzformációja során a gyorsan szaporodó tumorsejtek elhagyják az epithelium szigorú sejtes rendezettségét. Ennek következtében az EpCAM felszíni eloszlása kevésbé korlátozottá válik és a molekula jobban hozzáférhetõ a tumorsejteken. Epithelsejtes eredetûknek megfelelõen, a legtöbb karcinómából származó tumorsejt továbbra is expresszál EpCAM¹ot a felszínén. A múltban az EpCAM-ról kimutatták, hogy ígéretes célpontja rákok monoklonális ellenanyaggal történõ kezelésének, különösen minimális reziduális betegséget mutató betegekben, akik olyan szóródott tumorsejteket hordoznak, amelyek késõbb szolid metasztázisokat okozhatnak és így rontják a betegek prognózisát. Minimális reziduális kolorektális rákot hordozó betegekben az EpCAM-molekulára specifikus, egéreredetû monoklonális ellenanyag 30%-kal csökkentette az 5 éves halálozási arányt a kezeletlen betegekkel összehasonlítva, amikor szisztémásan, öt dózisban alkalmazták, a
1
HU 007 195 T2
primer tumor sebészeti ellátását követõ négy hónapon át [Riethmüller: Lancet 343, 1177–83 (1994)]. Újabban az EpCAM-molekula erõs expresszálódásáról számoltak be emlõrákos betegekben, ami rossz általános túléléssel és betegségtõl mentes túléléssel asszociált [Spizzo és mtsai.: Int. J. Cancer 98, 883–8 (2002)]. Legújabban EpCAM expresszálódását elemezték 3722 betegben. Azt tapasztalták, hogy az EpCAM expresszálódása nagyon gyakori epitheliális tumorokban, ilyen expresszálódást a tumorminták több mint 88%ában figyelték meg. Közelebbrõl, EpCAM expresszálódását figyelték meg petefészekrákok 94,1%-ában, kolonrákok 94%-ában, gyomorrákok 92,3%-ában, prosztatarákok 90,1%-ában és tüdõrákok 70,9%-ában. EpCAM-molekulát felismerõ (egéreredetû) monoklonális ellenanyagra példa az Edrecolomab (Panorex) [Koprowski: Somatic Cell Genet. 5, 957–971 (1979) és Herlyn: Cancer Res. 40, 717–721 (1980)]. Kolonrák adjuváns immunterápiája során azonban a Panorex elsõ beadása Wegener-féle granulomatózis kialakulásához és súlyosbodásához vezetett, ami arra utal, hogy a Panorexet óvatosan kell alkalmazni autoimmun betegségben szenvedõ betegben [Franz: Onkologie 23, 472–474 (2000)]. A Panorex korlátait a humáneredetû, egér elleni ellenanyagok („human anti-mouse antibodies”, HAMA) gyors képzõdése, az egéreredetû IgG2a Fcy receptorának korlátozott képessége kölcsönhatásba lépni humáneredetû effektormechanizmusokkal, valamint a keringésben mutatott rövid felezési idõ [Frodin: Cancer Res. 50, 4866–4871 (1990)] jelentik. Ezen túlmenõen, az egéreredetû ellenanyag ismételt injektáláskor a betegekben azonnali típusú allergiás reakciókat és anafilaxiát okozott [Riethmüller: Lancet 343, 1177–1183 (1994); Riethmüller: J. Clin. Oncol. 16, 1788–1794 (1998); és Mellstedt: Annals New York Academy of Sciences 910, 254–261 (2000)]. Az ING–1 egy másik ismert, EpCAM-ellenes immunglobulin [Lewis: Curr. Op. Mol. Ther. 5, 433–6 (2003)]. Az ING–1 egér-humán eredetû, kiméra IgG1 immunglobulin, amely jelenleg I/II. fázisú klinikai kipróbálás alatt áll, elõrehaladott epitheliális tumorokban szenvedõ betegekben. Míg az 1 mg/kg¹os immunglobulin-dózis biztosította a legnagyobb hatást humáneredetû tumorsejtekkel elõinjektált egerekben, ez a dózis két adenokarcinómás humán betegbõl kettõben hasnyálmirigy-gyulladáshoz vezetett (emelkedett amiláz- és lipázszintek, hasi fájdalom), ami eleve kizárta a dózis további kiterjesztését. ING–1 esetében az MTD mindössze 0,3 mg/testtömeg-kg-nak bizonyult, 3 hetenként intravénásan beadva. Figyelembe véve, hogy az ING–1 felezõdési ideje ennél a dózisnál körülbelül 31 óra volt, és feltételezve, hogy egy átlagos felnõtt testtömege 75 kg és vértérfogata 4,25 l, az ING–1 szérumszintje 21 nap (azaz 16,25 felezési idõ) elteltével 7×10–5 mg/ml vérszint alá csökkenne, amely több mint négy nagyságrenddel kevesebb mint a maximális citolitikus hatáshoz szükségesnek talált 1 mg/ml¹es szérumszint. Az ING–1 MTD-értéke tehát megakadályozza az anti-EpCAM immunglobulin szükséges terápiás plazmaszintminimum fenntartását.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
Ennek megfelelõen, igény mutatkozik EpCAM-molekula elleni ellenanyagokat tartalmazó kezelési rendre, amely alkalmazható rák kezelésére. Hasonlóan, a találmány célja EpCAM elleni immunglobulinokat alkalmazó olyan kezelési rend biztosítása, amely elhárítja a fent ismertetett problémákat. A találmány összefoglalása A fent említett igényt kielégít egy, a humáneredetû EpCAM antigénhez specifikusan kötõdõ, humáneredetû immunglobulin, amely immunglobulin emberbe történõ beadást követõen legalább 15 nap felezési idõt mutat a szérumban. Az immunglobulin nehéz lánca a SEQ ID NO 1 szerinti szekvenciát, könnyûlánca a SEQ ID NO 2 szerinti szekvenciát tartalmazza. Legalább 15 nap szérum felezési idejû, EpCAM elleni immunglobulin alkalmazásával számos elõnyös hatás realizálható. A legfontosabb, hogy ez a viszonylag hosszú felezési idõ a szérumban biztosítja, hogy a találmány szerinti eljárás részeként alkalmazott, EpCAM elleni immunglobulin nem ürül ki a vérbõl olyan gyorsan, mint egy rövidebb felezési idejû, más immunglobulin, mint például a fentebb ismertetett ING–1 immunglobulin. Feltételezve, hogy a találmány szerinti eljárásban alkalmazni kívánt immunglobulin követelményeinek megfelelõ, EpCAM elleni immunglobulint és ilyen követelményeknek meg nem felelõ, EpCAM elleni immunglobulint adunk be embernek egyidejûleg és azonos abszolút mennyiségben, adott idõ elteltével az elõbbi immunglobulinból több marad fenn a szérumban, mint az utóbbi immunglobulinból. Fordított értelemben, a fokozott fennmaradás a szérumban lehetõvé teszi egyszerre kevesebb EpCAM elleni immunglobulin beadását a találmány szerinti eljárásban, mint ami egy másik, rövidebb felezési idejû, EpCAM elleni immunglobulin esetében lehetséges volna, mégis fenntartva egy adott, elõre meghatározott terápiás szérumszintminimumot, azaz biztosítva, hogy két egymást követõ beadás között a terápiás ágens teljes szérumkoncentrációja soha ne essen a folyamatos hatékonysághoz szükségesnek ítélt minimális szint alá. Ez azzal az elõnyös hatással jár, hogy a találmány szerinti eljárásban alkalmazott EpCAM elleni immunglobulinból kevesebbet kell beadni, ami kizárja, vagy legalább mérsékli bármely nem kívánt és/vagy toxikus mellékhatás lehetõségét. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott, EpCAM elleni immunglobulin viszonylag hosszú felezési ideje azt is jelenti, hogy nem kell túl gyakran beadni, ezáltal javul a páciens életminõsége és csökken a terápia összes költsége. Az a tény, hogy a találmány szerinti eljárásban alkalmazott, EpCAM elleni immunglobulin humáneredetû immunglobulin, mérsékli vagy akár kizárja annak lehetõségét, hogy a páciens immunrendszere nem kívánt immunválaszt generál a beadott immunglobulin ellen. Számos egéreredetû vagy akár egér-humán eredetû kiméra immunglobulin-molekula esetében megfigyelt humáneredetû, egér elleni ellenanyagok (humán antiegér ellenanyagok, „human anti-mouse antibodies”,
1
HU 007 195 T2
HAMAs), mint olyanok nem jelentenek problémát a találmány szerinti eljárás során. Anélkül, hogy elméletekhez ragaszkodnánk, úgy gondoljuk, hogy a találmány ezen szempontja szerint alkalmazott, EpCAM elleni immunglobulin in vivo két különbözõ mechanizmus közül legalább egyen alapuló terápiás hatást vált ki. Az egyik mechanizmus antitestfüggõ, sejtközvetítette citotoxicitás („antibody-dependent cellular cytotoxicity”, ADCC) néven ismert. ADCC esetében, immunglobulinnal bevont sejtet („célsejtet”) a célsejtet bevonó immunglobulin Fc¹részét felismerõ Fc¹receptorokat hordozó sejtek („effektorsejtek”) megölik. Az ADCC-ben részt vevõ effektor sejtek a legtöbb esetben természetes ölõsejtek („natural killer cells”, NK), amelyek felszínükön Fc¹g-RIII és/vagy CD16 molekula Fc¹receptort hordoznak. Ilyen módon, kizárólag immunglobulinnal bevont sejteket ölnek meg, így a sejtölés specificitása közvetlenül az ilyen sejteket bevonó immunglobulin kötési specificitásával – ez esetben EpCAM – korrelál. Egy másik mechanizmus, amely révén a találmány ezen szempontja szerint alkalmazott EpCAM elleni immunglobulin terápiás hatást fejt ki, komplementfüggõ citotoxicitás („complement-dependent cytotoxicity”, CDC) néven ismert. CDC esetében, két identikus immunglobulin kötõdik két identikus antigénhez (ez esetben például EpCAM-hoz) a célsejt felszínén úgy, hogy megfelelõ Fc¹részük egymáshoz közeli szomszédságba kerül. Ez az elrendezés komplement proteineket vonz, köztük c1q és c3 és c9 proteineket, amely utóbbi pórust hoz létre a célsejten. A perforáció a célsejtet megöli. Ugyanakkor, a célsejt vagy célsejtek felszínük más helyén, opszonizálásnak nevezett folyamat során dekorálttá válik vagy válnak. Ez a dekorálás effektor sejteket vonz, amelyek azután megölik a célsejte(ke)t a fent ismertetett ADCC-mechanizmussal analóg módon. A találmány ezen szempontja szerint alkalmazott, EpCAM elleni immunglobulin hosszú felezési idejének köszönhetõen, a fenti mechanizmusok egyike, vagy mindkét mechanizmus hosszabb ideig kihasználható és nagyobb dózisban, mint az rövidebb felezési idejû, EpCAM elleni immunglobulin alkalmazásával lehetséges volna. A találmány ezen szempontja szerint, az EpCAM elleni immunglobulint a betegnek nem adjuk gyakrabban, mint hetente egyszer, elõnyösen nem gyakrabban, mint kéthetente egyszer. Ebbõl a szempontból, az EpCAM elleni immunglobulin elõnyösen hosszú szérum felezési ideje kihasználásra kerül. Abban az esetben, ha a beadásra hetente egyszer kerül sor, az immunglobulin mindössze kis adagjait kell alkalmanként beadni, mivel a korábban beadott immunglobulin több mint fele még perzisztál a páciens vérében. Ez azért van, mert egy hét rövidebb idõ, mint a korábban beadott immunglobulin körülbelül 15 nap felezési ideje. Abban az esetben, ha a beadásra körülbelül kéthetente egyszer kerül sor, a találmány szerinti eljárásban alkalmazott adagolási gyakoriság körülbelül megfelel az immunglobulin felezési idejének. Két egymást követõ beadás között eltelt idõ alatt az immunglobulin szé-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
rumszintje soha nem csökken nagyobb mértékben, mint az elõzõ beadást közvetlenül követõ mennyiség fele. Ez azt jelenti, hogy közvetlenül egy adott beadást követõen, a beadás dózisának nem kell nagyobbnak lenni, mint az a mennyiség, amely szükséges ahhoz, hogy a következõ beadás idõpontjában az elõre meghatározott terápiás szérumszintminimum körülbelül kétszeresét elérje. Általában, a beadás két fázisa határozható meg: az elsõ „terhelési fázis” („loading phase”), amely során egy vagy több terhelési dózist adunk be abból a célból, hogy az immunglobulin kívánt állandó plazmaszintjét elérjük, és az ezt követõ „fenntartó fázis” („maintenance phase”), amely során több fenntartó adagot adunk be abból a célból, hogy az immunglobulin kívánt plazmaszintjét fenntartsuk. A terhelési dózist vagy dózisokat jellemzõen nagyobb mennyiségben és/vagy nagyobb gyakorisággal adjuk be, mint a késõbbi fenntartó dózisokat, ezáltal a terhelési fázis idõtartamát a minimumra korlátozzuk. A találmány jelenlegi szempontjával összhangban nem levõ jelenlegi adagolási rendek szerint a gyakorló orvos két választási lehetõséggel néz szembe: az EpCAM elleni immunglobulint elég nagy kezdõ mennyiségben adja be, amely biztosítja, hogy a szervezetbõl való gyors kiürülés mellett a terápiás szérumszintminimum a következõ beadásig fennmaradjon (ez esetben a magas kezdõdózis nem kívánt és/vagy toxikus mellékhatásokat, például hasnyálmirigy-gyulladást okozhat); vagy az EpCAM elleni immunglobulint elég kis kezdõ mennyiségben adja be ahhoz, hogy elkerülje a nem kívánt és/vagy toxikus mellékhatásokat (ez esetben az EpCAM elleni immunglobulin szérumszintje a következõ beadás elõtt a terápiás szérumszintminimum alá esik, ami terápiás hatás vesztéséhez vezet). Kompromisszumot kis dózis gyakoribb beadása jelenti, amely viszont jelentõsen rontja a páciens életminõségét. Ezzel szemben, a találmány ezen szempontja szerinti eljárás olyan egyensúlyt biztosít, amelyben egyfelõl egyedi dózisok beadhatók olyan mennyiségben, amelyek nem vezetnek nem kívánt és/vagy toxikus mellékhatásokhoz, másfelõl a terápiás immunglobulin mennyisége a szérumban nem esik a folyamatos terápiás hatáshoz szükséges terápiás szérumszintminimum alá az egymást követõ beadások között. A ritmus, amely szerint két egymást követõ beadás között legalább körülbelül egy hét, elõnyösen két egymást követõ beadás közötti legalább körülbelül két hét telik el, lehetõvé tesz ilyen egyensúlyt, ugyanakkor nem rontja fölöslegesen a páciens életminõségét. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, ellenõrizzük az elõzõ beadásból még jelen levõ, EpCAM elleni ellenanyag szérumszintjét a páciens vérében, mielõtt a következõ beadást elvégezzük. Ezáltal az orvos elkerülheti az EpCAM elleni immunglobulin túl korai beadását, amely helyzet akkor adódik, ha az elõzõ beadásból még bõséges mennyiségû EpCAM elleni immunglobulin marad fenn a páciens vérében. Ezáltal EpCAM elleni olyan ellenanyag esetében, amelynek a felezési ideje még nem pontosan ismert, elkerülhetõ a vélet-
1
HU 007 195 T2
len túladagolás, amely nem kívánt és/vagy toxikus mellékhatásokhoz vezethet. Ugyanakkor, az ilyen idõközi mérés során, amely minden esetben legalább két héttel egy korábbi beadást követõen történik, az orvos értékes információt szerez az EpCAM elleni immunglobulin kiürülési (clearence) sebességét illetõen. Ez az információ értékes lehet a további beadási rend finom beállításához. Az ilyen finom beállítás azzal jár, hogy egymást követõ beadások között egy hétnél jelentõsen hosszabb, elõnyösen legalább két hétnél hosszabb ideig várunk, ezáltal tovább javítva a páciens életminõségét. Elõnyösen, az EpCAM elleni immunglobulin szérumszintjének a páciens vérében történõ ellenõrzése az alábbi módon végezhetõ el. Elõször, az orvos meghatározhatja a fenti immunglobulin szintjét legalább egy héttel a megfelelõ utolsó beadást követõen, de a fenti immunglobulin megfelelõ következõ beadását megelõzõen; a fenti immunglobulin még jelen van a fenti páciens vérében, ennek megfelelõen megkapja a fenti immunglobulin közbeesõ szérumszintje értékét. Ezt követõen, a fenti immunglobulin közbeesõ szérumszintje értékét összehasonlítja a fenti immunglobulinra vonatkozó, elõre meghatározott terápiás szérumszintminimum-értékkel. Amennyiben a fenti immunglobulin közbeesõ szérumszintje értéke jóval magasabb, mint a fenti immunglobulin terápiás szérumszintminimum-értéke, akkor az orvos elõnyösen dönthet úgy, hogy még tovább vár, amíg az EpCAM elleni immunglobulin szérumszintje tovább csökken. Ezalatt az idõ alatt, a fenti lépéseket ismételheti abból a célból, hogy a fenti immunglobulinra vonatkozó, új közbeesõ szérumszintet kapjon, amely már az elõre meghatározott terápiás szérumszintminimumhoz közelebbi értékre csökkent. Mindenesetre nem várhat olyan sokáig, hogy az immunglobulin meghatározott közbeesõ szérumszintje az elõre meghatározott terápiás szérumszintminimum alá süllyedjen. Amikor az orvos az ismételt várakozási ciklusok során, közbeesõ szérumszintek meghatározásával és a közbeesõ szérumszinteknek az adott EpCAM elleni immunglobulinra vonatkozó, elõre megadott terápiás szérumszintminimummal történõ összehasonlításával megállapítja, hogy az immunglobulin közbeesõ szérumszintje a terápiás szérumszintminimum bizonyos százalékos értéke közelébe süllyedt, elrendelheti az EpCAM elleni immunglobulin megfelelõ következõ adagjának a beadását abból a célból, hogy az EpCAM elleni immunglobulin szérumszintjét a kiürülés következõ ciklusára a megfelelõ szérumszintre emelje vissza. Elõnyösen, ez a bizonyos százalékos érték olyan szérumszintnek felel meg, amely 15%¹on belül, elõnyösen 10%¹on belül, elõnyösebben 5%¹on belül közelíti meg az alkalmazott adott anti-EpCAM immunglobulin elõre meghatározott terápiás szérumszintminimumát. Elõnyösen, a közbeesõ immunglobulin szérumszint mérése elvégezhetõ szakember számára ismert bármely eljárással, például immunvizsgálattal. Ebbõl a célból alkalmazható például immunfluoreszcencia vizsgálat, radioimmunvizsgálat, vagy enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálat (ELISA), amelyek közül ez utóbbi az elõnyös.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
A találmány ezen szempontjának egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a humáneredetû EpCAM elleni immunglobulint nem adjuk be gyakrabban, mint kéthetente egyszer. Egy különösen elõnyös megvalósítási mód szerint, a beadást kéthetes idõszakonként végezzük, ahol mindegyik egymást követõ dózis mennyiségét tekintve azonos az elsõ beadott dózissal, azaz minden dózis azonos mennyiségbõl áll. Az ilyen módon történõ beadás elegendõ az immunglobulin olyan szérumszintjének a fenntartásához, amely soha nem esik az immunglobulin elõnyös terápiás hatásához szükséges, elõre meghatározott terápiás szérumszintminimum alá, ugyanakkor elkerüli vagy lényegében elkerüli a nem kívánt és/vagy toxikus mellékhatásokat. Egy további megvalósítási mód szerint két hétnél ritkább vagy lényegesen ritkább beadási gyakoriság is lehetséges. Abban az esetben, ha az immunglobulint két hétnél hosszabb idõközönként adjuk be, a kezdõ dózist követõ bármely idõpontban beadott ellenanyag mennyiségének nagyobbnak kell lenni, mint az a kezdõ dózis, amelyet akkor alkalmaznánk, ha a következõ beadás két hét múlva történne. Az a mennyiség, amennyivel a két hétnél hosszabb idõ utáni beadás dózisa nagyobb kell legyen, mint a két hét után beadott dózis, eseti alapon határozható meg, például farmakokinetikai simulációk révén [például WinNonlin 4.0.1 (Pharsight Corporation, USA; 2001)], amelyeket a leíráshoz mellékelt példákban ismertetünk. Ilyen szimulációk létrehozása és/vagy alkalmazása szakember számára jól ismert. Az ilyen szimulációkat elõnyösen úgy állítjuk össze, hogy adott megfelelõ beadást követõen a páciens szérumában az EpCAM elleni immunglobulin szintje ne essen a terápiás hatáshoz szükséges terápiás szérumszintminimum alá. A humáneredetû, EpCAM elleni immunglobulin hosszú szérum felezési ideje biztosítja, hogy a beadások közötti hosszabb idõtartam, például három vagy akár négy hét, vagy 2–5 hét közötti bármely köztes idõtartam alatt a terápiás hatékonysághoz szükséges terápiás szérumszintminimum fennmaradjon. Más szavakkal, a humáneredetû, EpCAM elleni immunglobulin hosszú (azaz körülbelül 15 napos) szérum felezési ideje biztosítja, hogy a megfelelõ elõzõ beadásból származó immunglobulin jelentõs mennyisége jelen legyen még a szérumban. Ennek eredményeként, a körülbelül 15 nap felezési idejû, humáneredetû, EpCAM elleni immunglobulinból kevesebbet kell alkalmazni, mint amely szükséges volna nem ilyen hosszú felezési idejû ellenanyag alkalmazásával. Ez csökkenti nem kívánt és/vagy toxikus mellékhatások kockázatát. Megjegyezzük, hogy ilyen elnyújtott beadási rendek és a velük járó elõnyök (lásd fentebb) nem volnának lehetségesek rövid felezési idejû, EpCAM elleni immunglobulin alkalmazásával úgy, hogy terápiás hatásukat fenntartsuk (például ING–1 EpCAM elleni immunglobulin alkalmazásával, amelynek esetében az emberben mért felezési idõ 17–31 óra). Ahhoz, hogy ilyen EpCAM elleni immunglobulinnak legalább a terápiás szérumszintminimuma fennmaradását biztosítsuk a következõ beadásig, az EpCAM elleni immunglobulin olyan
1
HU 007 195 T2
mennyiségét kellene beadni, amely nagy valószínûséggel nem kívánt és/vagy toxikus mellékhatásokkal járna. Másrészt, az ilyen nem kívánt és/vagy toxikus mellékhatások elkerülése a rövid felezési idejû EpCAM elleni immunglobulin kisebb dózisban történõ beadásával, az adott két beadás között valamely ponton a terápiás hatás elvesztésével járna, amikor a vérben perzisztáló immunglobulin mennyisége a terápiás szérumszintminimum alá süllyed. Amennyiben klinikailag szükséges vagy elõnyös, egy további megvalósítási mód szerint a körülbelül 15 nap felezési idejû anti-EpCAM immunglobulin természetesen beadható két hétnél rövidebb idõközönként, például egy hetes idõközönként, vagy 1¹2 hét közötti bármely idõközben. Bár az ilyen elrendezés nem használja ki teljesen a 15 nap felezési idõ nyújtotta elõnyöket, ezzel együtt létezhetnek olyan klinikai helyzetek, amelyekben ilyen beadási rend elõnyösnek bizonyul. Abból a célból, hogy elkerüljük a humáneredetû, EpCAM elleni immunglobulin nem kívánt akkumulálódását a betegben az idõ elõrehaladásával, ez esetben elõnyös a rövidebb idõközökben beadott humáneredetû, EpCAM elleni immunglobulin mennyiségének a csökkentése ahhoz a mennyiséghez viszonyítva, amelyet kéthetenkénti beadási ritmus szerint adtunk volna. Az a mennyiség, amellyel a két hétnél rövidebb idõn belül elvégzett, következõ beadáskor kevesebbet kell beadnunk, mint a két hét elteltével beadott dózis, eseti alapon határozható meg, például farmakokinetikai szimulációkkal, amelyeket a leíráshoz mellékelt példákban ismertetünk. Ilyen szimulációk létrehozása és/vagy alkalmazása szakember számára jól ismert. Az ilyen szimulációkat elõnyösen úgy állítjuk össze, hogy adott megfelelõ beadást követõen a páciens szérumában az EpCAM elleni immunglobulin szintje ne essen a terápiás hatáshoz szükséges terápiás szérumszintminimum alá. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a beadás lehet intravénás, intraperitoneális, szubkután, intramuszkuláris, topikális vagy intradermális beadás. Más megoldás szerint, ezen beadási módok kombinációja alkalmazható, ahogy az helyénvaló. A találmány oltalmi körébe tartoznak további vegyületekkel történõ együttes beadási protokollok, például bispecifikus ellenanyag-konstrukciókkal, célzott toxinokkal vagy más vegyületekkel, amelyek T¹sejteken keresztül hatnak, vagy más vegyületekkel, mint például antineoplasztikus ágensekkel, amelyek más mechanizmusok révén hatnak. Az EpCAM elleni immunglobulin együttes klinikai beadási rendje tartalmazhatja a további komponens megelõzõ, egyidejû vagy azt követõ együttes beadását. Elõnyösen, a tumoros betegség emlõrák, epitheliális rák, hepatocelluláris karcinóma, cholangiocelluláris rák, gyomorrák, kolonrák, prosztatarák, fej és nyak rákja, bõrrák (melanoma), urogenitális traktus rákja, például petefészekrák, endometriumrák, méhnyakrák és veserák; tüdõrák, gyomorrák, vékonybél rákja, májrák, hasnyálmirigyrák, epehólyagrák, epevezeték rákja, nyelõcsõrák, nyálmirigyek rákja vagy pajzsmirigy rákja közül választott.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
Egy további megvalósítási mód szerint, a betegség lehet továbbá minimális reziduális betegség, elõnyösen szolid tumor, elõrehaladott szolid tumor vagy metasztatikus szolid tumor, amelyeket a tumor magányos tumorsejtek túlélése által okozott topikális vagy nem topikális ismételt kiújulása jellemez. A találmány ezen szempontja szerinti, különösen elõnyös megvalósítási módja szerint, a tumoros betegség prosztatarák vagy emlõrák. A beadott humáneredetû, EpCAM elleni immunglobulin olyan immunglobulin, amely tartalmazza a SEQ ID NO 1 szerinti aminosavszekvenciájú immunglobulin nehéz láncot és a SEQ ID NO 2 szerinti aminosavszekvenciájú immunglobulin könnyû láncot. Amikor ilyen humáneredetû, EpCAM elleni immunglobulint adunk be, azt elõnyösen 1–7 mg/testtömeg¹kg, elõnyösebben 2–6 mg/testtömeg¹kg megfelelõ dózis mennyiségben adjuk be. A találmány további szempontja szerint, a találmány tárgyát képezi humáneredetû immunglobulin alkalmazása, amely immunglobulin specifikusan kötõdik humáneredetû EpCAM antigénhez, és amely immunglobulin felezési ideje a szérumban legalább 15 nap és amely alkalmas tumoros betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására, amint azt az 1. igénypontban ismertetjük. Más megoldás szerint, ilyen immunglobulint tartalmazó készítményt alkalmazhatunk a fenti gyógyszer elõállítására. Ezt követõen a gyógyszert elõnyösen alkalmazhatjuk a fenti dozírozási rend szerint, tumoros betegség kezelési eljárásában. A találmány ezen szempontja szerinti egyik megvalósítási mód szerint, az elõállított gyógyszer elõnyösen beadható intravénás, intraperitoneális, szubkután, intramuszkuláris, topikális vagy intradermális úton. Más megoldás szerint, ezen beadási módok kombinációja alkalmazható, ahogy az helyénvaló. A találmány oltalmi körébe tartoznak további vegyületekkel történõ együttes beadási protokollok, például bispecifikus ellenanyag-konstrukciókkal, célzott toxinokkal vagy más vegyületekkel, amelyek T¹sejteken keresztül hatnak, vagy más vegyületekkel, mint például antineoplasztikus ágensekkel, amelyek más mechanizmusok révén hatnak. Az EpCAM elleni immunglobulin együttes klinikai beadási rendje tartalmazhatja a további komponens megelõzõ, egyidejû vagy azt követõ együttes beadását. Elõnyösen, a tumoros betegség emlõrák, epitheliális rák, hepatocelluláris karcinóma, cholangiocelluláris rák, gyomorrák, kolonrák, prosztatarák, fej és nyak rák, bõrrák (melanoma), urogenitális traktus rákja, például petefészekrák, endometriumrák, méhnyakrák és veserák; tüdõrák, gyomorrák, vékonybél rákja, májrák, hasnyálmirigyrák, epehólyagrák, epevezeték rákja, nyelõcsõrák, nyálmirigyek rákja vagy pajzsmirigy rákja közül választott. Egy további megvalósítási mód szerint, a betegség lehet továbbá minimális reziduális betegség, elõnyösen szolid tumor, elõrehaladott szolid tumor vagy metasztatikus szolid tumor, amelyeket a tumor magányos tumorsejtek túlélése által okozott topikális vagy nem topikális ismételt kiújulása jellemez.
1
HU 007 195 T2
A találmány további szempontja szerint, a találmány tárgyát képezi humáneredetû immunglobulin, amely immunglobulin specifikusan kötõdik humáneredetû EpCAM antigénhez, azzal jellemezve, hogy a fenti immunglobulin felezési ideje a szérumban embernek történõ beadást követõen legalább 15 nap. Az ilyen hosszú szérum felezési idõvel járó elõnyöket fentebb ismertettük, ilyen ellenanyag tumoros betegségek kezelési eljárásában történõ alkalmazásának a keretei között. Elõnyös, ha az immunglobulin felezési ideje a szérumban 20 nap, 19 nap, 18 nap, 17 nap, 16 nap vagy 15 nap. Különösen elõnyös, ha az immunglobulin felezési ideje a szérumban körülbelül 15 nap. A találmány szerint, a humáneredetû immunglobulin felezési ideje 15 nap és a humáneredetû immunglobulin tartalmazza a SEQ ID NO 1 szerinti aminosavszekvenciájú immunglobulin nehéz láncot, valamint a SEQ ID NO 2 szerinti aminosavszekvenciájú immunglobulin könnyû láncot. Egy további szempont szerint, a találmány tárgyát képezi a fent ismertetett humáneredetû, EpCAM elleni immunglobulint tartalmazó készítmény. Az ilyen készítmény elõnyösen beadható humán betegnek, betegség kezelésére alkalmas beadási rend részeként. Mivel az EpCAM-molekula többnyire expresszálódik tumoros betegségekben, különösen elõnyös, ha ilyen készítményt adunk be ilyen tumoros betegség kezelését célzó terápiás beadási rend részeként. A tumoros betegségek közé, amelyek elõnyösen kezelhetõk a találmány ezen szempontja szerinti készítménnyel, az alábbiak tartoznak: emlõrák, epitheliális rák, hepatocelluláris karcinóma, cholangiocelluláris rák, gyomorrák, kolonrák, prosztatarák, fej és nyak rák, bõrrák (melanoma), urogenitális traktus rákja, például petefészekrák, endometriumrák, méhnyakrák és veserák; tüdõrák, gyomorrák, vékonybél rákja, májrák, hasnyálmirigyrák, epehólyagrák, epevezeték rákja, nyelõcsõrák, nyálmirigyek rákja vagy pajzsmirigy rákja. Egy további megvalósítási mód szerint, a betegség lehet továbbá minimális reziduális betegség, elõnyösen szolid tumor, elõrehaladott szolid tumor vagy metasztatikus szolid tumor, amelyeket a tumor magányos tumorsejtek túlélése által okozott topikális vagy nem topikális ismételt kiújulása jellemez. A találmány oltalmi körébe tartozik, hogy ilyen betegségek kezelhetõk önmagukban vagy kombinációjukban, az ilyen kombinációk felléphetnek például primer tumorok metasztázisos terjedésével, ami egyszeres vagy többszörös szekunder tumoros betegséghez vezethet. A leírásban az „ellenanyag”, „ellenanyag-molekula”, „ING” és „ING-molekula” kifejezések azonos jelentéssel bírnak. Ahol a szövegkörnyezet szerint lehetséges, adott kifejezés többes számának bármely használata magában foglalja az egyes számot, és az egyes szám bármely használata magában foglalja a többes számot. Az ábrák rövid ismertetése Az alábbi ábrák a leírás részét képezik és azért lettek mellékelve, hogy a találmány bizonyos szempontjait demonstrálják. A találmány érthetõbbé válik egy
5
10
15
20
25
30
2
vagy több ábrára történõ utalással, a leírásban bemutatott specifikus megoldási módok részletes ismertetésével kombinálva. 1. ábra: dozírozási rend az I. fázisú klinikai kipróbálás koholtjai számára; 2. ábra: EpCAM elleni immunglobulin plazmakoncentrációja az idõ függvényében, kohortonként; 3. ábra: kohortok farmakokinetikai paraméterei egyetlen anti-EpCAM immunglobulin-dózis beadását követõen; 4. ábra: kohortok farmakokinetikai paraméterei több anti-EpCAM immunglobulin-dózis beadását követõen; 5. ábra: 3-kompartment modell vázlatos bemutatása; 6. ábra: EpCAM elleni immunglobulin csúcsplazmaszintje és terápiásan plazmaszint-minimuma („trough”), 30 mg/ml megcélzott terápiás minimumszint esetében; 7. ábra: EpCAM elleni immunglobulin csúcsplazmaszintje és terápiásan plazmaszint-minimuma, 10 mg/ml megcélzott terápiás minimumszint esetében; 8A–8F. ábrák: EpCAM-molekulát expresszáló szövetek immunhisztokémiai festõdése; 9. ábra: EpCAM szemikvantitatív hisztológiai pontszámainak a medián értékei különbözõ máj betegségben szenvedõ betegek esetében. A találmány részletes ismertetése
35
40
45
50
55
60 7
1. példa: Az I. fázisú vizsgálatban mért farmakokinetikai adatok gyûjtése Kohortok. A SEQ ID NO 1 és SEQ ID NO 2 által jellemzett, EpCAM elleni immunglobulin (a továbbiakban „Anti-EpCAM”) farmakokinetikáját vizsgáltuk hormonra refrakter prosztatarákban szenvedõ betegekben, 14 napos idõközzel beadott, két külön intravénás infundálást követõen. A beadott dózisok 10, 20, 40, 64, 102, 164 és 262 mg voltak, a testfelszín egy m2-ére vonatkoztatva. Az egyes dózisszinteken két vagy három beteget kezeltünk az 1. és a 15. napon. Vérmintákat vettünk 29–31 mintavételi idõpontban, az 1. naptól a 70. napig (56 nappal a második beadást követõen). Az Anti-EpCAM szérumkoncentrációját specifikus ELISA eljárással mértük. Az ELISA vizsgálatot szokásos szendvics ELISA formájában állítottuk össze, amelyben patkányban termelt anti-EpCAM elleni ellenanyagot alkalmaztunk befogó ellenanyagként és csirkében termelt anti-EpCAM elleni ellenanyag volt a detektáló ellenanyag (lásd Sambrook: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Az I fázisú páciens kohortok esetében alkalmazott dozírozási rendet az 1. ábra mutatja. A „~” szimbólum az 1. ábra 3. oszlopában azt jelöli, hogy a mg/kg mértékegységben megadott, dózisokra számított értékek a (megfelelõ kohort betegeinek beadott) dózisok átlagának és (szintén a megfelelõ kohort betegeinek) testtömegek átlagának a hányadosa.
1
HU 007 195 T2
A megfelelõ dozírozási érték tehát két átlagérték kvóciensét jelenti. Szérumkoncentrációk. Az anti-EpCAM-szinteket (átlag értékek ±SD, 2¹3 meghatározásból) betegek egyedi szérumából mértük, két külön anti-EpCAM intravénás infúziót követõen. Az egy adott kohorton belüli egyedi profilok összehasonlítását mutatja a 2. ábra. A hormonra refrakter prosztatarákban szenvedõ betegek minden dóziscsoportja esetében, a 14 napos idõközönként, két infúziót követõen kapott átlagos koncentráció/idõ profilokat (matematikai átlagok) mutatja a 2. ábra. Egyszerûsített dozírozási rend. A betegek személyre szabott dózist kaptak, amelyet mg anti-EpCAM/m2 testfelszín alapján számítottunk ki. Az azonos dóziscsoportba tartozó különbözõ betegek esetében megfigyelt szérumprofilok megegyezése miatt megvizsgáltuk, hogy lehetséges¹e egyszerûsíteni a dozírozási rendet. Ebbõl a célból az 5¹ös, 6¹os és 7¹es kohortokat közös 500 mg¹os azonos teljes dózisra normalizáltuk és az eredményeket a szérumszintek variabilitását illetõen összehasonlítottuk. A 9 páciens esetében az 500 mg¹os teljes dózisra történõ normalizálás ahhoz vezetett, hogy a szérumszintek 26,6% átlagos koefficienssel (% CV) változtak. A változás koefficiense 14,8–67,3% közé esett, a legnagyobb változás alacsonyabb szérumszinteknél volt megfigyelhetõ. Ezen eredmények alapján, lehetségesnek ítéltük a dozírozási rend teljes dózisra történõ egyszerûsítését. Farmakokinetika. Nem kompartmentális értékelés. Az anti-EpCAM elsõ intravénás infúzióját (egyetlen dózis) követõen, a hormonra refrakter prosztatarákban szenvedõ betegek mind a hét kohortja esetében kiszámított fõ farmakokinetikai paraméterek összefoglalását (számtani átlag) mutatja a 3. ábra. Az anti-EpCAM második intravénás beadását (több dózis) követõ fõ farmakokinetikai paramétereket (számtani átlag) mutatja a 4. ábra. A 3. és 4. ábrán alkalmazott kifejezések definíciója az alábbi. Cmax. jelentése a maximális (mért) koncentráció. AUC jelentése egyetlen dózisintervallumban (t=14 nap) kapott terület a koncentráció/idõ görbe alatt („area under the concentration/time curve”, AUC), a trapezoid szabály alapján a 14–29 napból (több dózis esetén) számolva. AUCINF jelentése 0 órától végtelenig alkalmazott, trapezoid szabály alkalmazásával számított AUC-érték, az AUC¥=AUCz+Cz/ke képlet szerint. t1/2 jelentése látszólagos terminális átlag felezési idõ (1n2/lz), ahol az „átlag” kifejezés jelentése a szérum felezési idõk esetében meghatározott több érték átlagolása; a „látszólagos” kifejezés kiválasztott farmakokinetikai értékekhez illesztett görbe extrapolálására utal egy végtelen idõpontra oly módon, hogy végtelen idõpontban a páciens szérumában a jelen levõ immunglobulin mennyisége aszimptotikusan nullára fogyatkozik; és a „terminális” kifejezés erre a végtelen idõpontra vonatkozik. A t paraméter szokásos farmakokinetikai paraméter, amelyet állandó szorzó faktorként alkalmazunk, és a z paraméter jelentése bármely z idõpont. ClSS jelentése teljes test clearence, amelyet a dó-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
zis/AUC képlet szerint számolunk ki. VSS jelentése az eloszlás látszólagos térfogata. Vz jelentése az eloszlási térfogat átlaga. CL jelentése a clearence térfogat átlaga. Az átlagos látszólagos terminális felezési idõ (t1/2) egyetlen dózis után (a 7–14 napokból számítva) 6,72 ±0,88 napnak és több dózis beadása után 14,74 ±4,23 napnak adódott (az utolsó három mintavételi pontból, azaz 28–42 napokból vagy 35–70 napokból számítva). A felezési idõk közötti eltérés a második dózist követõ, egyértelmûen hosszabb megfigyelési idõnek volt tulajdonítható, a mért felezési idõ értékek annál pontosabbak, minél hosszabb idõponthoz tartozó értékeket mérünk, a görbe illesztésének a javulása miatt. Valójában a 14,74 ±4,23 nap t1/2 érték jelenti a t1/2 pontosabb értékét, mivel azt hosszú idõn át mértük. Az elsõ beadást követõen 10,4 1 Vz értéket és 1,1 l/nap átlagos clearence térfogatot határoztunk meg. Ezek az adatok összhangban vannak a második dózis esetében számított 11,5 l Vz értékkel és az 1,0 l/nap átlag clearence térfogattal. Ezen túlmenõen, ezek az adatok jól egyeznek az összes dóziscsoportot figyelembe véve (8,2–14,8% variációs koefficiens). Ennek eredményeként, nem figyeltünk meg dózisfüggõséget sem a Vz paraméter, sem a CL paraméter esetében. Dózis linearitás. Meghatároztuk a C max. , AUClast(0–14)/AUCt(14–28) és AUCinf paraméterekre vonatkozó dózis-összefüggéseket. A vizsgált dózistartományban minden paraméter esetében [Cmax., AUClast(0–14)/AUCt(14–28) és AUCinf] dózisfüggõ lineáris emelkedést feltételezhetünk. Farmakokinetika: Kompartmentális analízis. A kompartmentális analízis a drog folyamatos infundálását igénylõ, két különbözõ modell alkalmazásán alapult. Abból a célból, hogy a legjobb kompartmentális modellt értékeljük, a 6¹os kohort átlag koncentráció vs. idõ összefüggésre vonatkozó adatait választottuk. Mindkét értékelés esetében a második dózis beadását követõ profilt alkalmaztuk, mivel ez volt a beadást követõ hosszabb megfigyelési idõtartam. Abból a célból, hogy a legjobb illeszkedést vizsgáljuk, az alábbi kompartmentális modelleket alkalmaztuk: – 2¹kompartment analízis, – 3¹kompartment analízis. Az analízis mindkét modell esetében lehetséges volt, azonban a 3¹kompartment analízist követõen egyértelmûen jobb illeszkedést kaptunk. A megfigyelt Y és várható Y közötti kongruencia észrevehetõen jobb volt 3¹kompartment analízist követõen. Ennek megfelelõen, minden további analízist a 3¹kompartmentális modell alapján végeztünk. Anti-EpCAM farmakokinetikáját vizsgáltuk betegekben, a testfelszín területének egy m2-ére számított 10, 20, 40, 102, 164 és 262 mg dózisú, rövid idõtartamú intravénás infúziót követõen. Kohortonként két vagy három beteget kezeltünk. Vérmintákat gyûjtöttünk 42 vagy 70 napon át. Az anti-EpCAM szérumkoncentrációit ELISA eljárással mértük. Minden páciens esetében 42 vagy 70 napon át teljes szérumprofilt tudtunk készíteni és értékelni.
1
HU 007 195 T2
A clearence térfogat és elosztási térfogat nem mutatott dózisfüggõséget és eltéréseket az elsõ és a második dózist követõen. A vizsgált dózistartományban a hét kohort adatai alapján, Cmax., AUCtl, AUClast és AUCinf dózisfüggõ linearitást feltételezhetünk. Kompartmentális analízis az anti-EpCAM szérumkoncentrációk harmadfokú csökkenését mutatták, 0,565 nap (t 12a), 3,78 nap (t 12b) és 13,3 nap (t 12l2) felezési idõkkel. Amint az a terminális felezési idõbõl (körülbelül két hét) várható volt, a különbözõ dozírozási rendek szimulációi a legjobb eredményeket kéthetenkénti elrendezés esetében mutatták. Az egyhetes dózis szimulációja akkumulálódáshoz vezetett, míg a 4 hetenkénti beadás az anti-EpCAM szérumszintek csökkenéséhez vezetett. Szem elõtt tartva a megcélzott terápiás minimumszint minél gyorsabb elérését, a fenntartó dózishoz viszonyítva kétszeres mennyiségû terhelési dózis beadása javasolt.
5
10
15
20 2. példa: Az I. fázisú klinikai kipróbálás során mért adatokon alapuló, anti-EpCAM dozírozási stratégia modellezése A jelen vizsgálathoz választott dozírozási rend és a kezelés idõtartama az anti-EpCAM immunglobulin prosztatarákos betegeken végzett I/II. fázisú klinikai kipróbálás eredményeinek a farmakokinetikai modellezésén alapult. A szimulációk célkitûzése az volt, hogy olyan dozírozási rendet találjunk az anti-EpCAM esetében, amellyel elérjük a rendre 10 és 30 mg/ml terápiás szérumszintminimumokat. Preklinikai vizsgálatok alapján a 10 mg/ml terápiás szérumszintminimumtól azt várjuk, hogy elegendõ az anti-EpCAM tumorellenes aktivitásához. Nem zárható ki azonban, hogy nagyobb dózisok hatékonyabbak. Ennek megfelelõen, klinikai kipróbálások során egy második dózist is értékelni kell, amelyet 30 mg/ml terápiás szérumszintminimum eléréséhez számítottunk ki. További toxicitásra nem kell számítani ezen szérumteknõ-koncentráció mellett, mivel a Cmax. és AUC-értékek nem haladják meg az I. fázisú klinikai kipróbálás során megfigyelt értékeket. A jobb illeszkedés miatt, minden szimulációt az 5–7¹es kohortok 3 kompartmentális analízis adataira alapoztunk. A szimulációk célkitûzése az optimális beadási rend és az igényelt dózis meghatározása, figyelembe véve a beadási gyakoriságot (hetente, kéthetente, négy hetenként), a különbözõ terápiás minimumszinteket (10 mg/ml, 30 mg/ml anti-EpCAM), valamint anti-EpCAM terhelési dózis elõnyének az értékelése. Amint az a körülbelül két hetes terminális felezési idõbõl várható volt, a kéthetenkénti dozírozási rend vezetett a legjobb eredményekhez. Hét naponkénti és 28 naponkénti beadási gyakoriság alkalmazásával, a szimuláció rendre akkumulációhoz vagy a szérumszintek enyhe csökkenéséhez vezetett. Terhelési dózisok („loading dose”, LD) alkalmazása a kívánt terápiás minimumszintek azonnali eléréséhez vezettek. Az alábbi dózisokat és a hozzájuk rendelt minimum- és maxi-
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
mum-szérumszinteket szimuláltuk anti-EpCAM intravénás beadásához. Beadás minden 14. napon. Amint az anti-EpCAM terminális felezési ideje alapján az várható volt, a kéthetente történõ beadás állandó Cmin.¹ és Cmax.-értékeket mutató szimulált profilokat eredményezett, és ennek megfelelõen az ajánlott dozírozási rendnek tekinthetõ. Ennek megfelelõen, a kéthetente modellt választottuk az anti-EpCAM 10 és 30 mg/ml megcélzott terápiás minimum szintjeit eredményezõ, szükséges dózisok kiszámításához. A számításokhoz a kezdeti paramétereket kompartmentális analízissel szereztük be. – Vizsgálati adatok: A Prosztatarák I/II. fázisú vizsgálatban kapott farmakokinetikai mérések. – Szoftver: WinNonlin 4.0.1 (Pharsight Corporation, USA; 2001). – Modell: PK Model 19 (3 kompartment, iv. infúzió, makroállandók, nincs késleltetési idõ, elsõrendû eliminálás, egységes tömegmérés). Az 5. ábra vázlatosan mutatja a 3 kompartment modellt, ahol ’1’ jelenti a központi kompartmentet és ’2’ és ’3’ két különbözõ perifériás kompartmentet jelent. A központi kompartment azonnali ekvilibriumban van a plazmával. A perifériás kompartment idõt igényel ahhoz, hogy adott drog beadását követõen ekvilibriumot érjen el a központi kompartmettel. K13, K31, K12, K21 és K10 jelentése sebesség állandók, ahol a számok sorrendje, például 13, 31 stb. az anti-EpCAM áramlásának az irányát jelenti. A szimulációkat 120 napos idõtartamra terjesztettük ki, bár az eredeti vizsgálati adatok 70 napos idõtartamra korlátozódtak. A szimulációk terhelési fázison (azaz a drog 1., 8. és 15. napon történõ beadásán) és fenntartó fázison (azaz a drog 29. napon, majd ezt követõen minden 14. napon történõ beadásán) alapultak. – A) csoport (alacsony dózis): Terhelési fázis 2 mg anti-EpCAM/testtömeg¹kg hetente történõ beadásával (az 1., 8. és 15. napokon), amelyet 23 adag, 2 mg anti-EpCAM/testtömeg¹kg fenntartó dózis követett minden második héten. – B) csoport (magas dózis): Terhelési fázis 6 mg Anti-EpCAM/testtömeg¹kg hetente történõ beadásával (az 1., 8. és 15. napokon), amelyet 23 adag, 6 mg Anti-EpCAM/testtömeg¹kg fenntartó dózis követett minden második héten. A vizsgálatban alkalmazott dózisok olyan farmakokinetikai paraméterekhez vezettek (azaz Cmax.¹ és AUC-értékekhez), amelyek nem haladták meg az I. fázisú vizsgálatban a betegeknek beadott legnagyobb dózisok esetében mért értékeket. A terhelési fázisokat és fenntartó fázisokat farmakokinetikai modellezés alkalmazásával számítottuk ki abból a célból, hogy a megcélzott terápiás szérumszintminimumot rövid idõn belül elérjük, és hogy elkerüljük olyan plazmakoncentráció maximumok kialakulását, amelyek meghaladják az I. fázisú vizsgálatban értékelteket. A 6. ábra anti-EpCAM fentebb ismertetett, kéthetente történõ beadásának szimulációját mutatja, bele-
1
HU 007 195 T2
értve egy terhelési fázist, 30 mg/ml megcélzott terápiás szérumszintminimummal. A 6. és 7. ábra a drog megfelelõ beadását mutatják 120 napos idõskálán. Látszik a csúcs-szérumkoncentráció és a minimális terápiás szérumkoncentráció, a csúcsszinteket a görbék felsõ részei, a terápiás minimumszinteket a görbék alsó részei képviselik. Az ábrák a fent ismertetett, rendre 10 és 30 mg/ml, eltérõ terápiás szérumszintminimum elérését célzó szimulációkat mutatják. Amint az ábrákon látható, a két szimuláció esetében a csúcs-szérumkoncentráció és a minimális terápiás szérumkoncentráció eltérõ. 3. példa: Anti-EpCAM toxicitási adatok, összehasonlítás ING–1 ellenanyaggal, extrapolálás Az alábbiakban a különbözõ páciens kohortokban megfigyelt, nem kívánt eseményeket („adverse events”, AE) ismertetjük. A továbbiak céljából az AE úgy definiálható, mint adott pácienst vagy klinikai kipróbálás alanyát valamely gyógyhatású termék beadását követõen ért bármely kedvezõtlen egészségügyi esemény, amely esemény nincs feltétlenül okozati összefüggésben a gyógyhatású termékkel. Ennek megfelelõen, nem kívánt esemény lehet adott vizsgálati termék alkalmazásával átmenetileg asszociált, bármely kedvezõtlen és nem szándékolt jel (például abnormális laboratóriumi lelet), szimptóma, vagy betegség, függetlenül attól, hogy a vizsgálati termékkel összefüggésben van¹e vagy sem. A nem kívánt drogreakciókat (azaz a vizsgálatvezetõ szerint a vizsgálati droggal legalább valószínûleg összefüggésbe hozható AE¹ket) a vizsgálatvezetõ besorolta az NCI Common Toxicity Criteria (CTC, 2.0 verzió) irányelvek szerint. Az NCI CTC táblázatokban fel nem sorolt, nem kívánt drog reakciók esetében, a nem kívánt események súlyossága besorolásának az általános definícióit kell követni. Ennek megfelelõen, „enyhe” AE olyan szimptómát jelöl, amely a páciens számára alig észrevehetõ. Nem zavarja a páciens szokásos aktivitásait vagy teljesítményét és/vagy nincs klinikai következménye. „Mérsékelt” AE zavarja a szokásos aktivitásokat és elegendõ ahhoz, hogy az alanynak rossz közérzetet okozzon. Némi klinikai következménye van és szükségessé válhat a szimptómák kezelése. „Súlyos” AE olyan esemény, amely súlyos rosszullétet okoz és olyan súlyos lehet, hogy a vizsgálati kezelést meg kell szakítani. Az alany képtelen szokásosan dolgozni vagy szokásos aktivitást kifejteni és/vagy az AE egyértelmû klinikai következményekkel jár. Szükség lehet a szimptómák kezelésére. „Súlyos nem kívánt” esemény („serious adverse event”, SAE) bármely kedvezõtlen egészségügyi esemény, amely bármely dózisnál halált okoz, életet veszélyeztet, kórházi kezelést igényel vagy folyamatban levõ kórházi tartózkodást meghosszabbít, maradandó vagy jelentõs rokkantságot/cselekvõképtelenséget eredményez, vagy kongenitális anomália vagy születési rendellenesség. A kezelés alatt és a 28 napos biztonsági utánkövetõ periódusban 19 páciens (95%) számolt be összesen 120 nem kívánt eseményrõl (AEs), függetlenül attól,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 10
2
hogy azok összefüggésben voltak¹e a vizsgálati droggal. Több nem kívánt eseményrõl számoltak be a 6¹os kohort (38 esemény) és a 7¹es kohort (35 esemény) betegei, mint az alacsonyabb dózist kapott kohortok betegei (1¹es kohort: 7 esemény; 2¹es kohort:9 esemény; 3¹as kohort: 12 esemény; 4¹es kohort: 7 esemény; és 5¹ös kohort: 12 esemény). A kohortok elrendezését az 1. ábra mutatja, amelyhez a fenti 1. példa ad magyarázatot. A kezelés során felmerült leggyakoribb klinikai AE¹k, függetlenül attól hogy a vizsgálatvezetõ miként értékelte a vizsgálati droggal való összefüggést, testhõmérséklet emelkedése (az összes páciens 30%¹a), hányinger (30%), pyrexia (20%), hasmenés (15%), fáradékonyság (15%), hidegrázás (15%) és hányás (15%) voltak. A nem kívánt eseményként jelentett, a kezelés során felmerült leggyakoribb laboratóriumi elváltozások, függetlenül attól hogy a vizsgálatvezetõ miként értékelte a vizsgálati droggal való összefüggést, emelkedett alkalikus foszfatáz szint (az összes páciens 30%-ában), limfopénia (30%), emelkedett LDH-szint (25%), PTT csökkenése (20%), hemoglobin csökkenése (20%), fehérvérsejt-rendellenességek (15%), cukorvizelés (15%) és emelkedett transzaminázok (15%) voltak. A nem kívánt események többsége enyhe (70%) vagy mérsékelt (25%) volt. Hat súlyos (3. fokú) nem kívánt eseményt jegyeztünk fel négy betegben az alábbiak szerint: emelkedett alkalikus foszfatázszintet olyan betegben, aki a kezelést megelõzõen mérsékelt (2. fokú) értéket mutatott; cukorvizelést olyan betegben, akirõl ismert volt, hogy cukorbetegségben szenvedett; egy betegben csökkent hemoglobint és vörösvértestszámot, valamint a testtömeg csökkenését; egy betegben csigolyaközi porckorongsérvet. A vizsgálatvezetõ értékelése szerint egyik esemény sem volt összefüggésben a vizsgálati droggal. Negyedik fokozatú eseményt nem jegyeztünk fel. Négy súlyos nem kívánt eseményt (SAE) jegyeztünk fel 4 betegben a vizsgálat idõtartama alatt. Ebbõl egyet a vizsgálatvezetõ úgy értékelt, hogy valószínûleg összefüggésben volt a vizsgálati droggal: kórházi tartózkodás meghosszabbítása 1. fokú lázas állapot miatt, anti-EpCAM 2. infúzióját követõen, a 3¹as kohort egyik betege esetében (a testfelszín egy m2-ére vonatkoztatott 40 mg¹os dózis mellett). Az ING–1 egér-humán eredetû, kiméra, nagy affinitású (KD: 2×10–9) EpCAM elleni ellenanyaggal végzett klinikai vizsgálatok 1 mg/kg dózisben hasnyálmirigygyulladást eredményeztek. Ezek a nem kívánt események dózisfüggõk voltak, egyértelmû MTD mellett. Lehetséges, hogy az ING–1 immunglobulinnak az EpCAM antigén iránti affinitása, amely két nagyságrenddel nagyobb, mint az anti-EpCAM¹é, összefügg az ING–1 esetében megfigyelt toxicitási profillal. Mivel az ING–1 MTD-értéke (1 mg/kg) és az anti-EpCAM protokollban alkalmazott legmagasabb dózisok (6 mg/kg) hasonlóak, várható, hogy az anti-EpCAM, a fentebb ismertetett vizsgálatok szerinti immunglobulin, jelentõsen szélesebb biztonsági sávot biztosít, valószínûleg sokkal kisebb affinitásának köszönhetõen.
1
HU 007 195 T2
4. példa: EpCAM expresszálódása betegségben Abból a célból, hogy a leírásban ismertetett kezelési eljárás alkalmazhatósági tartományát meghatározzuk, megvizsgáltuk a humáneredetû EpCAM antigén expresszálódását számos különbözõ betegségben. Arra számítunk, hogy a találmány szerinti eljárás hatékonyan alkalmazható bármely betegségben, ahol kóros állapotban az EpCAM expresszálódása fokozódott az adott szövet egészséges állapotához képest: adott esetben különös figyelmet szenteltünk az EpCAM antigén májszövetben történõ szintézisének. Betegek és szövetek. Összesen 254 különbözõ májszövetmintát jellemeztünk immunhisztológiai eljárással EpCAM¹ra és releváns morfológiai paraméterekre, amint azt alább ismertetjük. Különbözõ tumormintákat vizsgáltunk, beleértve 63 hepatocelluláris karcinómát (HCC¹t), 5 máj-epeérkarcinómát és 30 diszplasztikus csomót (premalignus hepatocelluláris prekurzorléziót), valamint megvizsgáltunk 5 egészséges májmintát. Harminchárom biopsziát vettünk le krónikus hepatitisz C betegekbõl, 27 mintát krónikus hepatitisz B betegekbõl, valamint 28 mintát krónikus alkoholos májbetegséget („alcoholic liver disease”, ALD) mutató betegekbõl; 9 páciens autoimmun hepatitiszt („autoimmune hepatitis”, AIH) mutatott. A májszöveteket biopsziával vettük le Meghini tû alkalmazásával, vagy HCC esetében reszekcióval vagy a májexplantációjával. A szöveteket azonnal 4%¹os neutrális formalinban fixáltuk és szokásos eljárással feldolgoztuk. Morfológiai értékelés. A morfológiai értékelést H&E festékkel festett metszetek alapján végeztük (karcinómák és krónikus hepatitiszek besorolása). A HCC¹k besorolását Nzeako és mtsai. [Cancer 76, 579–88 (1995)] szerint végeztük. A nem neoplasztikus májbetegségeket morfológiailag az alábbiak szerint értékeltük: a krónikus hepatitisz B és C esetek nekroinflammatorikus aktivitását Ishak módosított hepatikus aktivitási indexszének az alkalmazásával vizsgáltuk [Ishak: Mod. Pathol. 7, 690–713 (1994)]. Immunhisztológiai értékelés: Az immunhisztológiai értékelést korábban ismertetett eljárás szerint végeztük [Prange és mtsai.: J. Pathol. 201, 250–9 (2003)], az úgynevezett ABC eljárással, és kromogénként diaminobenzidint alkalmazva. Humáneredetû EpCAM elleni, egéreredetû monoklonális ellenanyagot (VU–1D9 klón; Novocastra, Newcastle, EK) ötvenszeresére hígítottunk, és 30 percen át tartó tripszin elõkezelést (0,1%, pH=7,8) követõen alkalmaztuk. Cyclin D1 (DCS¹6; 1:100; DAKO, Hamburg, Németország), p53 (FL–393; 1:50; Santa Cruz, Santa Cruz, USA) és ubikvitin (70458; 1:200; DAKO) imunhisztológiai vizsgálatát ugyanúgy végeztük. Negatív kontrollokat állítottunk be, beleértve a primer ellenanyag elhagyását. HCC¹k esetében az EpCAM-festõdés értékelésére kizárólag az intenzitást osztályoztuk, szemikvantitatív módon [0=negatív, +(1)=gyengén potitív, ++ (2)=mérsékelten pozitív, +++ (3)=erõsen pozitív (epevezeték festõdéssel legalább megegyezõ intenzitás)]. Nem neoplasztikus biopsziamintákban az EpCAM hepatocelluláris expresszálódását az alábbiak szerint osztá-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 11
2
lyoztuk: 0=nincs hepatocelluláris festõdés, +(0,5)=néhány elszórt pozitív hepatocita, +(1)=hepatociták kis csoportjai számos vagy a legtöbb szeptum vagy portális traktus mentén, ++ (2)=pozitív hepatociták nagy csoportjai számos vagy a legtöbb szeptum vagy portális traktus mentén és midacinus zónába benyúlva, +++ (3)=kiterjedt hepatocelluláris pozitivitás, amely jellemzõen az acinus legalább 50%¹át fedi. A statisztikai értékelést leíró statisztika (átlag, medián, maximális gyakoriság), valamint Spearman korrelációs koefficiense alkalmazásával végeztük. Szignifikánsnak a p<0,05 szintet tekintettük. EpCAM neoexpresszálódása HCC-ben. Egészséges májszövet a normál epevezeték hámjának erõs festõdését mutatta, míg a hepatociták teljesen negatívak voltak (nem mutatott adatok). EpCAM¹ra végzett immunhisztológiai vizsgálat specifikus membránfestõdést mutatott ki 63 vizsgált HCC-bõl 9 esetben (14,3%; 8A–F. ábrák), valamint a máj minden vizsgált kolangiokarcinómás esetében (n=5). HCC¹k esetében, az expresszálódás mértéke gyengétõl erõsig terjedt, és gyakoribbnak tûnt a mérsékelten és gyengén differenciálódott HCC-kben, míg mindössze egy jól differenciálódott HCC volt pozitív. Ezen túlmenõen, 30 diszplasztikus csomó közül, amelyek premalignus léziót képviselnek, mindössze 3 mutatott enyhe EpCAM expresszálódást. Néhány szövetet számos más, tumorreleváns antigénre nézve vizsgáltunk, és az expresszálódási adatokat korrelációs vizsgálatnak vetettük alá. A HCC-kben mutatott EpCAM expresszálódás mérsékelt, de szignifikáns pozitív korrelációt mutatott a p53 és ubikvitin nukleáris akkumulációjával (p<0,05), azonban a D1 ciklin feltételezett 5’¹irányú regulátor akkumulációjával nem. EpCAM hepatocelluláris neoexpresszálódása krónikus nekroinflammatorikus máj betegségben Hepatociták specifikus membrán-pozitivitását detektáltuk a vizsgált nem neoplasztikus májszöveteken (8C–E. ábrák). Markáns pozitivitást találtunk krónikus hepatitisz esetekben, és kisebb mértékben ALD esetekben. Ezen túlmenõen, az összes duktuláris proliferáció, valamint a periportális parenchimában elszórt egyedi kis sejtek (potenciális prekurzorsejtek) pozitivitását is megfigyeltük. A hepatocelluláris pozitivitás erõs periportális/periszeptális predominanciát mutatott és az esetek egy részében elérte az epevezeték festõdésének az intenzitását. Az EpCAM specifikus reaktivitása egyetlen esetben sem volt megfigyelhetõ nem parenchimális májsejteken. Amikor a szemikvantitatív immunhisztológiai pontozás átlagos és medián értékeit vizsgáltuk (az eljárást lásd fentebb), az EpCAM expresszálódása legmagasabb a HBV-fertõzött szövetek esetében [átlagos pontszám: 0,93; medián pontszám: 0,5; maximális pontszám: 3; pozitív EpCAM festõdés gyakorisága (+/++/+++): 55,6%], ALD esetében [átlagos pontszám: 0,88; medián pontszám: 0,75; maximális pontszám: 2,5; pozitív EpCAM festõdés gyakorisága (+/++/+++): 78,6%] és HCV esetében [átlagos pontszám: 0,86; medián pontszám: 0,5; maximális pontszám: 3; pozitív EpCAM festõdés gyakorisága (+/++/+++): 63,6%] volt.
1
HU 007 195 T2
AIH-betegek közbeesõ mértékû EpCAM festõdést mutattak [átlagos pontszám: 0,72; medián pontszám: 0,5; maximális pontszám: 3; pozitív EpCAM festõdés gyakorisága (+/++/+++): 55,6%]. Hepatocelluláris EpCAM expresszálódása szinte hiányzott PBC krónikus epeúti betegségben szenvedõ betegekben [átlagos pontszám: 0,13; medián pontszám: 0; maximális pontszám: 0,5; pozitív EpCAM festõdés gyakorisága (+/++/+++): 25,0%] és PSC betegekben [átlagos pontszám: 0,04; medián pontszám: 0; maximális pontszám: 0,5; pozitív EpCAM festõdés gyakorisága (+/++/+++): 7,7%] (9. ábra; a statisztikai változók jelölését lásd az ábrán, a jobb oldalon). Következtetés. Krónikus máj betegségben, például krónikus hepatitisz C vírus (HCV) és hepatitisz B vírus (HBV) fertõzésben, krónikus autoimmun hepatitiszben (AIH), krónikus alkoholos máj betegségben (ALD) és hepatocelluláris karcinómában (HCC) szenvedõ betegek szövetmintáit vizsgáltuk szemikvantitatív módon EpCAM expresszálódására nézve, korrelációban a májfibrózis stádiumával, valamint a nekroinflammatorikus aktivitás hisztológiai és biokémiai paramétereivel. A hepatociták, amelyek felnõtt májában EpCAM negatívak, az EpCAM de novo expresszálódását mutatták krónikus máj betegségben szenvedõ, számos páciens májszövetében. Hepatocelluláris EpCAM a legnagyobb mértékben nekroinflammatorikus elváltozásokat mutató betegekben (HCV és HBV hepatitisz, AIH, ALD) expresszálódott. A hepatocelluláris EpCAM expresszálódása szignifikáns mértékben korrelált a gyulladásos aktivitás hisztológiai és biokémiai paramétereivel, valamint a fibrózis mértékével, amely különösen feltûnõ volt HBV-vel fertõzött betegekben. Ezen túlmenõen, a HCC¹k 14,3%¹a mutatott EpCAM expresszálódást a tumorsejteken. Az eredmények azt mutatják, hogy EpCAM de novo expresszálódása a hepatocelluláris karcinómák mindössze töredékében fordul elõ, gyakran megfigyelhetõ azonban hepatocitákon krónikus nekroinflammatorikus májbetegségekben. Az expresszálódás pozitív korrelációt mutat a betegség aktivitásával és a fibrózissal. Közelebbrõl, kimutattuk, hogy hepatocelluláris EpCAM neo-expresszálódása krónikus nekroinflammatorikus májbetegségben korrelál a fibrózissal és a nekroinflammatorikus aktivitással. Ezek a felfedezések jelentõsek mint jövõbeli kezelési opciók, például malignus tumorokon EpCAM¹ot megcélzó monoklonális ellenanyagok alkalmazására, és ez vonatkozhat a HCC¹k egy részére is. Mint specifikus következmény, a HCC¹k egy része valós célpontja lehet EpCAM ellen irányuló ellenanyag-terápiának. 5. példa: Farmakokinetikai elõrejelzések megerõsítése az „Anti-EpCAM” II. fázisú vizsgálatban kapott páciens adatok alkalmazásával Meg kívántuk erõsíteni a farmakokinetikai modellezésen alapuló elõrejelzések pontosságát (amelyek maguk az anti-EpCAM I. fázisú klinikai kipróbálásból származó farmakokinetikai adatokon alapultak, lásd az 1. és 2. példát fentebb), egy ezt követõ, II. fázisú vizsgá-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 12
2
latban kapott, aktuális páciens adatok alkalmazásával, amely vizsgálatban anti-EpCAM¹ot a találmány szerint adtunk be. Ez a vizsgálat nemzetközi, nyílt, multicentrikus, véletlenszerû II. fázisú klinikai kipróbálás volt, két párhuzamos kezelt csoporttal. Az anti-EpCAM II. fázisú klinikai kipróbálásában részt vevõ betegeket véletlenszerûen két csoportba osztottuk, az egyik csoport alacsony dózisú anti-EpCAM¹ot kapott (2 mg/testtömeg¹kg), amint azt alább ismertetjük, a másik csoport magas dózisú anti-EpCAM¹ot kapott (6 mg/testtömeg¹kg), amint azt alább ismertetjük. Az anti-EpCAM II. fázisú vizsgálat során, kezdetben minden páciens kapott három anti-EpCAM terhelési dózist (2 mg/testtömeg¹kg, vagy 6 mg/testtömeg¹kg dózisokat, betegcsoporttól függõen), egy hét idõközzel a terhelési fázisban, amelyet legfeljebb 23 egymást követõ anti-EpCAM fenntartó dózis követett (ismét, 2 mg/testtömeg¹kg, vagy 6 mg/testtömeg¹kg dózisokat, betegcsoporttól függõen), ahol az egyes fenntartó dózisokat minden második héten adtuk be. Az anti-EpCAM I. fázisú vizsgálat adatain alapuló farmakokinetikai elõrejelzések szerint, az anti-EpCAM alacsony dózisával kezelt elsõ betegcsoport terápiás szérumszintminimuma várhatóan 10 mg/ml körül alakul (amely megfelel a 7. ábra szerinti szintnek), míg az anti-EpCAM magas dózisával kezelt második betegcsoport terápiás szérumszintminimuma várhatóan 30 mg/ml körül alakul (amely megfelel a 6. ábra szerinti szintnek). A vizsgálatot az alábbiak szerint végeztük. Kilencvenhat vályulatú lemezeket fedtünk HD4A4 ellenanyaggal (anti-EpCAM elleni antiidiotípus ellenanyaggal; 5 mg/ml, 100 ml térfogat), amelyet blokkolási és mosási lépés követett. Kalibrációs standardokat, minõségellenõrzési kontrollmintákat és anti-EpCAM-mintákat mértünk be (100 ml térfogatokat, megfelelõ hígításban), amelyet mosási lépés követett. A HD4A4 által kötött anti-EpCAM ellenanyagot biotinezett humán IgG elleni ellenanyaggal detektáltuk, amelyet ismét mosási lépés követett. Streptavidint adtunk a lemezekhez (0,5 mg/ml, 100 ml térfogatban) és azokat ismét mostuk, majd végsõ lépésként 180 ml pNPP-reagenst mértünk a vályulatokba. A reakciót 50 ml 3 mol/l NaOH-oldattal állítottuk le és az optikai denzitást ELISA leolvasóval határoztuk meg 405 és 490 nm hullámhosszon. Az alacsony dózishoz tartozó mintákat 1:100 arányban hígítottuk. A magas dózishoz tartozó mintákat 1:300 arányban hígítottuk. Az eredményeket a 10. ábra mutatja. A 10. ábra pontok formájában mutatja az alacsony dózisú csoportba tartozó egyik páciens esetében mért, egyedi terápiás szérumszintminimumokat (401001 számú beteg; a pontokat négyzetek jelölik), valamint a magas dózisú csoportba tartozó másik páciens esetében mért, egyedi terápiás szérumszintminimumokat (401002 számú beteg; a pontokat rombuszok jelölik). Adott páciens adatpontjait összekötõ vízszintes vonal átlagos függõleges szintje mutatja a páciens esetében megfigyelt terápiás szérumszintminimumot. Ennek megfelelõen, jól látható, hogy a 101002 számú, magas
1
HU 007 195 T2
dózisú csoportba tartozó páciens (rombuszpontok) esetében a vízszintes vonal az anti-EpCAM olyan terápiás szérumszintminimum koncentrációját mutatja, amely jó egyezésben van az adott dózishoz rendelt, 30 mg/ml elõre jelzett értékkel (hasonlítsuk össze a 6. ábra szerinti, elõre jelzett terápiás szérumszintminimumokat összekötõ, vízszintes vonalakkal). Hasonlóképpen, a 101001 számú, alacsony dózisú csoportba tartozó páciens (négyzet pontok) esetében a vízszintes vonal az Anti-EpCAM olyan terápiás szérumszintminimum koncentrációját mutatja, amely jó egyezésben van az adott dózishoz rendelt, 10 mg/ml elõre jelzett érték-
2
kel (hasonlítsuk össze a 7. ábra szerinti, elõre jelzett terápiás szérumszintminimumokat összekötõ, vízszintes vonalakkal). Ezek az adatok az anti-EpCAM II. fázisú vizsgálat 5 során kapott valóságos páciens adatokkal megerõsítik az anti-EpCAM I. fázisú vizsgálat alatt kapott adatokon alapuló farmakokinetikai modellezés nyújtotta terápiás minimumszint-elõrejelzések pontosságát. Arra következtethetünk, hogy a farmakokinetikai modellezés fel10 tételezései és eredményei helyesek voltak, és hogy a találmány szerinti kezelési rend a fent ismertetett hatásokkal és elõnyökkel járnak.
SZEKVENCIALISTA <110> Micromet AG <120> Anti-EpCAM Immunoglobulins <130> MIC-022 PCT <140> unknown <141> 2005–02–09 <150> US 10/778,915 <151> 2004–02–13 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 457 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> EpCAM elleni nehéz lánc <400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
13
HU 007 195 T2
Ala Lys Asp Met Gly Trp Gly Ser Gly Trp Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 235 240 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 245 250 255 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 260 265 270 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 275 280 285 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 320 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 325 330 335 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 340 345 350 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 355 360 365 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 370 375 380 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 385 390 395 400 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 405 410 415
14
HU 007 195 T2
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 420 425 430 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 435 440 445 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> EpCAM elleni könnyû lánc <400> 2
Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Ile Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 15
1
HU 007 195 T2
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Humáneredetû EpCAM-antigénhez specifikusan kötõdõ, humáneredetû immunglobulin, azzal jellemezve, hogy a humáneredetû immunglobulin humán páciensnek beadva legalább 15 nap felezési idõt mutat a szérumban és tartalmazza a SEQ ID NO 1 szerinti aminosavszekvenciájú immunglobulin nehéz láncot, valamint a SEQ ID NO 2 szerinti aminosavszekvenciájú immunglobulin könnyû láncot. 2. Az 1. igénypont szerinti humáneredetû immunglobulin, ahol a felezési idõ a szérumban 20 nap, 19 nap, 17 nap, 16 nap vagy 15 nap. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti humáneredetû immunglobulin, amelynek a felezési ideje 15 nap. 4. Gyógyászati készítmény, amely 1–3. igénypontok bármelyike szerinti humáneredetû immunglobulint tartalmaz. 5. Az 1. igénypont szerinti humáneredetû immunglobulin alkalmazása tumoros betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására, amely gyógyszer humán páciensnek, nem gyakrabban mint hetente egy alkalommal történõ beadás céljára van kiszerelve. 6. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer nem gyakrabban, mint kéthetente egy alkalommal történõ beadás céljára van kiszerelve. 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer kéthetente történõ beadás céljára van kiszerelve és a humáneredetû immunglobulin beadott adagja egyik beadásról a másikra változatlan marad. 8. Az 5–7. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer ritkábban mint kéthetente egy alkalommal történõ beadás céljára van kiszerelve, a beadott humáneredetû immunglobulin beadott dózisa úgy lett beállítva, hogy két egymást követõ beadás között eltelt idõ végén a szérumban perzisztáló humáneredetû immunglobulin mennyisége soha ne essen azon terápiás szérumszintminimum alá, amelyet a terápiás hatékonysághoz szükségesnek határoztak meg. 9. Az 5–8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer intravénás, intraperitoneális,
5
10
15
20
25
30
35
40
16
2
szubkután, intramuszkuláris, topikális vagy intradermális beadás céljára van kiszerelve. 10. Az 5–9. igénypontok bármelyike szerinti szerinti alkalmazás, ahol a tumoros betegség emlõrák, epitheliális rák, hepatocelluláris karcinóma, cholangiocelluláris rák, gyomorrák, kolonrák, prosztatarák, fej- és nyakrák, bõrrák (melanoma), urogenitális traktus rákja, például petefészekrák, endometriumrák, méhnyakrák vagy veserák; tüdõrák, gyomorrák, vékonybél rákja, májrák, hasnyálmirigyrák, epehólyagrák, epevezeték rákja, nyelõcsõrák, nyálmirigyek rákja vagy pajzsmirigy rákja. 11. Az 1. igénypont szerinti humáneredetû immunglobulin tumoros betegség kezelésére történõ alkalmazásra, ahol a kezelés a humáneredetû immunglobulin humán betegnek, nem gyakrabban mint hetente egy alkalommal történõ beadásával történik. 12. Humáneredetû immunglobulin 11. igénypont szerinti alkalmazásra, ahol a kezelés a humáneredetû immunglobulin humán betegnek, nem gyakrabban mint kéthetente egy alkalommal történõ beadásával történik. 13. Humáneredetû immunglobulin 11. vagy 12. igénypont szerinti alkalmazásra, ahol a kezelés a humáneredetû immunglobulin humán betegnek, kéthetente történõ beadásával történik, és a humáneredetû immunglobulin beadott adagja egyik beadásról a másikra változatlan marad. 14. Humáneredetû immunglobulin 11–13. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazásra, ahol a kezelés a humáneredetû immunglobulinnak kéthetente egy alkalomnál ritkábban történõ beadásával történik, és a beadott humáneredetû immunglobulin beadott dózisa úgy lett beállítva, hogy két egymást követõ beadás között eltelt idõtartam végén a szérumban perzisztáló humáneredetû immunglobulin mennyisége soha ne essen a terápiás hatékonysághoz szükséges szintként meghatározott terápiás szérumszintminimum alá. 15. Humáneredetû immunglobulin 11–14. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazásra, ahol a kezelés intravénás, intraperitoneális, szubkután, intramuszkuláris, topikális vagy intradermális beadással történik.
HU 007 195 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
17
HU 007 195 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
18
HU 007 195 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
19
HU 007 195 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
20
HU 007 195 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
21
HU 007 195 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
22
HU 007 195 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
23
HU 007 195 T2 Int. Cl.: C07K 16/30
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
