!HU000004765T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 004 765
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 31/5415 (2006.01)
(21) Magyar ügyszám: E 05 744629 (22) A bejelentés napja: 2005. 03. 25. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050744629 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1732567 A1 2005. 10. 06. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1732567 B1 2008. 10. 08.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 20040003203 2004. 03. 29. 20040006404 2004. 06. 14.
(73) Jogosult: Societe de Conseils de Recherches et d’Applications Scientifiques (S.C.R.A.S) SAS, 75016 Paris (FR)
FR FR
(72) Feltalálók: PIGNOL, Bernadette, F- 75012 Paris (FR); PUEL, Jean-Luc, F-34660 Cournonterral (FR); AUVIN, Serge, F-91120 Palaiseau (FR); CHABRIER de LASSAUNIERE, Pierre-Etienne, F-75016 Paris (FR); WANG, Jing, F-34400 Lunel (FR) (54)
A61P 27/16 (2006.01) A61K 45/06 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05092345 PCT/FR 05/000713
(74) Képviselõ: Baranyi Éva, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Egy fenotiazinszármazék alkalmazása hallásvesztés megelõzésére és/vagy kezelésére
(57) Kivonat Egy (I) általános képletû heterociklusos származék
HU 004 765 T2
(I) alkalmazása diasztereoizomerek vagy ezen formák kombinációja formájában, ahol R jelentése hidrogénatom, 1–6 szénatomos alkil¹, aralkilcsoport vagy –C(O)R’ általános képletû csoport, ahol
R’ jelentése heterocikloalkil¹, 1–6 szénatomos alkil¹, aril- vagy aralkilcsoport; az alkil¹, aril- vagy heterocikloalkilcsoportok adott esetben szubsztituálva vannak egy vagy több azonos vagy különbözõ, következõk közül választott szubsztituenssel: 1–6 szénatomos alkil¹, hidroxil¹, 1–6 szénatomos alkoxi¹, nitro¹, cianocsoport, halogénatom vagy NR1R2 csoport; R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1–6 szénatomos alkilcsoport, vagy R1 és R2 a kapcsolódó nitrogénatommal együtt adott esetben szubsztituált heterociklusos csoportot alkot, hallásvesztés megelõzésére és/vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására.
A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 4 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 004 765 T2
A találmány tárgya egy olyan fenotiazinszármazék alkalmazása hallásvesztés megelõzésére és/vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására, amelynek kalpaingátló hatása és oxigén reaktív formáit befogó hatása van (ezek az ROS¹ek, vagyis „reactive oxygen species”). A találmány vonatkozik egy olyan termékre is, amely tartalmaz legalább egy ilyen vegyületet, valamint az ezt tartalmazó gyógyszerkészítményre is. A hallásvesztés számos oka közül megemlíthetjük a betegségeket, például az agyhártyagyulladást, a fülgyulladást, a genetikai jellegû okokat, a sérüléseket, daganatokat, kábítószereket, gyógyszerek, például bizonyos antibiotikumok, rákellenes szerek, nem szteroid gyulladásgátló szerek, diuretikumok, fekélyellenes vagy görcsoldó szerek adagolását, aromás szerves oldószerekkel, például toluollal vagy xilollal történõ, hosszú ideig tartó érintkezést, az öregedést és a zajártalmat. A presbycusis (az idõskorral kapcsolatos süketség), a hosszú ideig tartó zajbehatás és bizonyos gyógyszerek adagolása a hallásvesztés fõ oka. Ismert, hogy bizonyos antibiotikumok, amelyek az aminoglikozidok családjába tartoznak, így a gentamicin és a tobramicin, amelyeket súlyos fertõzések kezelésénél használnak, a belsõ fülbõl származó süketséget okoznak. Az aminozidok okozta toxicitás (aminoglikozidok, például amikacin, dibekacin, gentamicin, izepamicin, netilmicin, szpektinomicin, tobramicin) mindenekelõtt a nagy frekvenciák hallásában okozott csökkenésben nyilvánul meg, és ezt a beteg nem ismeri fel azonnal. Csak fokozatosan érzi magát kellemetlenül. Ez a csökkenés sajnos gyakran irreverzíbilis. A minket körülvevõ zaj csökkenti hallásunkat. A zaj miatt bekövetkezõ hallásvesztés olyankor következik be, amikor a csillósejtek, amelyek a hangot a belsõ fül felé továbbítják, károsodnak, és nem képesek a hallóideg számára olyan parancsot adni, hogy az elektromos impulzusokat küldjön az agy felé. A hang intenzitása és a hangnak kitettség idõtartama a két fõ tényezõ, amelyek a hallásvesztést befolyásolják. Bár a hangbehatásra adott reakció egyénenként változó, néhány tényt bizonyossággal állíthatunk. A kutatások kimutatták, hogy a 85 decibelnek (dB) vagy ennél nagyobb decibelnek való hosszú ideig tartó kitettség idõvel állandó hallásvesztést okoz. Az európai és észak-amerikai statisztikák szerint a népesség 8–10%¹a érintett a cochlea betegségeiben (süketség, fülzúgás). Tekintettel arra a zajszintre, amelyet a diszkók, a techno koncertek, a walkman¹ek kibocsátanak, keletkezõben van egy, a süketek és fülzúgók teljes generációja. Az életkorral kapcsolatos problémák (presbycusis), amelyek ma 60 év körül keletkeznek, ennél korábbra, vagyis 35–40 körüli életkorra tolódhatnak. A hallásbetegségekkel kapcsolatban az a probléma, hogy ezek legnagyobb részben a belsõ fül (vagy cochlea) érzõ- és idegsejtjei csökkenésébõl erednek. És ezek a sejtek egy, a lényegében méhen belül törté-
2
nõ fejlõdési fázis után már nem képesek megújulni az utolsó differenciálódási stádiumok elmúltával. A fül érzõ- és idegképességének a belsõ fül különbözõ betegségeivel kapcsolatos fokozatos elvesztése 5 úgy tûnik, még ma is kívül áll mindenféle kezelésen. A WO 02/40016 sz. szabadalmi bejelentésben kalpain inhibitorok és oxigén reakcióképes formáinak befogói kombinációját írják le olyan betegségek kezelésére, amelyekben ezek az enzimek és/vagy ezek a gyö10 kös részecskék szerepet játszanak így a hallásvesztésben. A találmány tárgya egy (1) általános képletû heterociklusos származék alkalmazása 15
20 (I) diasztereoizomerek vagy ezek ezen formák bármely 25 kombinációjának formájában, ahol R jelentése hidrogénatom, 1–6 szénatomos alkil¹, aralkil- vagy –C(O)R’ általános képletû csoport, ahol R’ jelentése heterocikloalkil¹, 1–6 szénatomos alkil¹, aril- vagy aralkilcsoport; 30 ahol az alkil¹, aril- vagy heterocikloalkilcsoportok adott esetben szubsztituálva vannak egy vagy több, azonos vagy különbözõ, következõk közül választott szubsztituenssel: 1–6 szénatomos alkil¹, hidroxil¹, 1–6 szénatomos alkoxi¹, nitro¹, cianocsoport, 35 halogénatom vagy –NR1R2 általános képletû csoport; R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1–6 szénatomos alkilcsoport, vagy R1 és R2 a kapcsolódó nitrogénatommal együtt 40 egy adott esetben szubsztituált heterociklusos csoportot alkot, hallásvesztés megelõzésére és/vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. A leírásban „sérülésen” olyan helyi sérülések együt45 tesét értjük, amelyek a szöveteket és szerveket érintik, és amelyeket egy külsõ szer vált ki. Akusztikus sérülés esetében ez a külsõ szer vagy behatás fõleg a zaj. 1–6 szénatomos alkilcsoporton egyenes vagy el50 ágazó láncú alkilcsoportot értünk, amelyben 1–6 szénatom van, ilyenek például a metil¹, etil¹, propil¹, izopropil¹, butil¹, izobutil¹, szek-butil- és terc-butil¹, pentil¹, neopentil¹, izopentil¹, hexil¹, izohexilcsoport. Az 1–6 szénatomos alkoxicsoportok a fentiekben említett 55 alkilcsoportoknak felelhetnek meg, ilyenek például a következõk: metoxi¹, etoxi¹, propoxi- vagy izopropoxicsoport, de idetartoznak a lineáris, szekunder vagy tercier butoxicsoportok is. Az alkil-karbonil-csoportok a fentebb említett alkilcsoportoknak felelnek meg, ilyenek 60 például a metil-karbonil¹, etil-karbonil¹, propil-karbonil2
1
HU 004 765 T2
csoport. Halogénatomon fluor¹, klór¹, bróm- vagy jódatomot értünk. Arilcsoporton karbociklusos vagy heterociklusos rendszert értünk, amely tartalmaz legalább egy aromás gyûrût, a rendszert akkor nevezzük heterociklusosnak, amikor legalább egy ezt alkotó gyûrû tartalmaz egy heteroatomot (oxigén¹, nitrogén- vagy kénatomot). A karbociklusos arilcsoportok közül példaként a fenil- vagy naftilcsoportot említhetjük. Heterociklusos arilcsoportok vagy heteroarilcsoportok közül a következõket említhetjük: tienil¹, furil¹, pirrolil¹, imidazolil¹, pirazolil¹, izotiazolil¹, tiazolil¹, izoxazolil¹, oxazolil¹, piridil¹, pirazinil¹, pirimidil¹, benzo-tienil¹, benzo-furil- és indolilcsoport. A heterociklusos (vagy heterocikloalkil) csoport kifejezés elõnyösen mono- vagy biciklusos, telített vagy telítetlen, 1–5, az oxigén¹, kén- és nitrogénatom közül választott heteroatomot tartalmazó heterociklusos csoportot jelent. A nitrogénatom adott esetben szubsztituálva van alkil¹, aril¹, aralkil- vagy alkil-karbonilcsoporttal. Telített heterociklusos csoportok közül a következõket említhetjük: tetrahidrofurán¹, tetrahidropirán¹, oxetán¹, oxepán¹, tetrahidrotiofén¹, tetrahidrotiopirán¹, tietán¹, pirrolidin¹, piperidin¹, azetidin¹, 1,3-dioxán¹, 1‚3-dioxolán¹, 1,3-ditiolán¹, 1,3-ditián¹, 1,3-oxatiolán¹, 1,3-oxazolidin¹, 1,3-imidazolidin- vagy 1,3-tiazolidincsoport. Telített heterociklusos csoportok közül például a következõket említhetjük: dihidrotiofén¹, dihidrofurán¹, dihidropirrol¹, dihidroimidazol¹, dihidropirazol¹, dihidropiridin¹, indolincsoport. Az aril-alkil- (vagy aralkil¹) csoport olyan csoportot jelöl, ahol az aril¹, illetve alkilcsoportok jelentése a fenti, ilyenek például a benzil¹, fenetil- vagy naftil-metilcsoport. Az –NR1R2 képletû csoport esetében, amikor R1 és R2 a közbezárt nitrogénatommal együtt adott esetben szubsztituált heterociklusos csoportot alkot, a heterociklusos csoport elõnyösen telített, és 4–7 tagot, valamint 1–3 heteroatomot tartalmaz, beleértve a már jelen levõ nitrogénatomot is, ahol a további heteroatomot egymástól függetlenül választjuk az oxigén¹, nitrogénés kénatom közül. Az említett heterociklusos csoport lehet például a következõ: azetidin¹, pirrolidin¹, piperidin¹, piperazin¹, morfolin- vagy tiomorfolincsoport. Az említett heterociklusos csoport szubsztituálva is lehet egy vagy több azonos vagy különbözõ, következõk közül választott szubsztituenssel: hidroxil¹, alkil¹, aril¹, aralkil- vagy alkoxicsoport vagy halogénatom. A találmány tárgya különösen a fent említett alkalmazás, amelyre jellemzõ, hogy R jelentése –C(O)R’ csoport, és R’ jelentése elõnyösen alkilcsoport. Különösen elõnyösen az (I) képletû vegyületre jellemzõ, hogy R jelentése –C(O)–CH3 csoport. A következõkben ezt az utóbbi vegyületet (1) vegyületnek nevezzük. A találmány tárgya különösen az olyan fent meghatározott alkalmazás is, amelyre jellemzõ, hogy R jelentése hidrogénatom. Különösen elõnyösen a fent meghatározott (I) képletû vegyület az (IA) képlettel jellemezhetõ:
2
5
(IA) 10 és különösen az alábbi képletek egyike:
15
20 (IA1)
25
30
(IA2) 35
Ugyancsak különösen elõnyösen, a fent meghatározott (I) képletû vegyület az (IB) képlettel jellemezhetõ:
40
45
(IB) 50 és különösen valamely alábbi képlettel:
55
60 3
(IB1)
1
HU 004 765 T2
5
(IB2) 10 A fent meghatározott vegyületek új védõhatású szerek, amelyekben kombinálva van a WO 01/32654 sz. szabadalmi bejelentésben ismertetett antioxidáns és kalpainellenes hatás. A találmány további tárgya tehát egy fent meghatározott (I) képletû vegyület alkalmazása hallásvesztés eredete elõtti vagy utáni kezelésre. A találmány további tárgya egy fent meghatározott (I) képletû vegyület alkalmazása olyan gyógyszer elõállítására, amely egy másik gyógyszer adagolása miatti hallásvesztés megelõzésére és/vagy kezelésére szolgál. Elõnyösen ez a másik gyógyszer valamely antibiotikum, pl. a gentamicin, vagy rákellenes szer, pl. ciszplatin, nem szteroid gyulladásgátló szer, pl. szalicilsavszármazék vagy ibuprofén, diuretikum, pl. furoszemid, fekélyellenes szer, pl. cimetidin vagy omeprazol, görcsoldószer, pl. karbamazepin vagy valproesav. Különösen elõnyösen, ez a másik gyógyszer egy antibiotikum, különösen a gentamicin. A találmány további tárgya egy fent definiált (1) képletû vegyület alkalmazása olyan gyógyszer elõállítására, amely a presbycusis következtében fellépõ hallásvesztés megelõzésére és/vagy kezelésére szolgál. A találmány további tárgya a fent meghatározott (I) képletû vegyület alkalmazása olyan gyógyszer elõállítására, amely egy akusztikus sérülés következtében fellépõ hallásvesztés megelõzésére és/vagy kezelésére szolgál. A találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók önmagukban vagy egy vagy több más olyan anyaggal kombinálva, amely képes a hallásvesztés megelõzésére és/vagy kezelésére, vagy képes a hallásvesztéssel kapcsolatos betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére, ilyenek az antioxidánsok, a kalpaininhibitorok, pl. a leupeptin vagy neurodur, a perifériás értágítók, pl. az EGb 761®, az NMDA-receptor agonistái vagy antagonistái, a c¹Jun N¹terminális kináz-peptid-inhibitorok, mint amilyen a D¹JNK-1. A találmány további tárgya a fent meghatározott alkalmazás, amelyre jellemzõ, hogy kombinálva van legalább egy másik gyógyhatású anyaggal a következõk közül: antioxidánsok, kalpaininhibitorok, perifériás értágítók, NMDA-receptor-agonisták vagy antagonisták, c¹Jun N¹terminális kináz peptides inhibitorai. Egy (I) képletû vegyületet, elõnyösen (1) képletû vegyületet, ahol a szubsztituensek jelentése a fenti, helyileg alkalmazva 50 és 500 mmol közötti dózisban adagolhatunk. Belsõ fülbe történõ lokális kezelés esetében
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
az adagolt dózis 50 és 200 mmol közötti lehet. Belsõ fülön kívüli lokális kezelésnél a dózis 200 és 500 mmol közötti lehet. Azokat az anyagokat, amelyeket adott esetben kombinációban adagolunk, és amelyek a farmakológiában ismertek, a szokásosan tanácsolt dózisban adagoljuk. A fent meghatározott vegyületeket, valamint az adott esetben ezekkel kombinálva adott gyógyhatású anyagokat szokásos adagolási úton adagolhatjuk, ilyenek az orális, intraperitoneális, szubkután vagy intravénás adagolás. Ezeket adagolhatjuk egyidejûleg vagy külön-külön, azonos vagy különbözõ adagolási módon. Elõnyösen a fent meghatározott (I) képletû vegyületet lokálisan adagoljuk a belsõ fül kezelésénél szokásosan alkalmazott eljárásokkal, például mikrokatéterekkel, fecskendõvel dobhártyán keresztül történõ injekcióhoz vagy Silverstein Microwick™ típusú, gézcsíkkal ellátott csõvel. Ismertetünk egy olyan terméket is, amely tartalmazza a fent meghatározott (I) képletû heterociklusos származékot diasztereoizomer vagy diasztereoizomer formák kombinációja formájában, és tartalmaz legalább egy gyógyhatású anyagot, kombinációs termékként hallásvesztés megelõzésére és/vagy kezelésére történõ szimultán, külön-külön vagy idõben elnyújtott alkalmazásra. Elõnyösen egy olyan fent meghatározott termékrõl van szó hallásvesztés megelõzésére és/vagy kezelésére történõ alkalmazásra, ahol a hallásvesztés egy gyógyszer adagolása miatt, különösen antibiotikum adagolása miatt, vagy presbycusis vagy hangbehatás miatt következett be. Végül, a találmány vonatkozik egy fent meghatározott termékre, mint gyógyszerre. Abban az esetben, amikor a hallásvesztés egy gyógyszer adagolása miatt következik be, ez elõnyösen egy antibiotikum, különösen elõnyösen a gentamicin. Az ezzel adott esetben kombinációban adott gyógyhatású anyagot az adott gyógyászati területen ezen anyagokra szokásosan javasolt adagolási módon adagoljuk. Abban az esetben, amikor a hallásvesztés hangbehatásra következik be, a fent meghatározott (I) képletû vegyületet néhány nappal, elõnyösen 2¹3 nappal a hangbehatás elõtt, és 24 órával utána adagolhatjuk. Elõnyösen ez az adagolás az erõteljes hangbehatás utáni elsõ 7 órában történik. Ugyancsak elõnyösen, ez az adagolás a hangbehatás utáni elsõ 2 órában történik. A találmány tárgya tehát a fent említett alkalmazás, amelyre jellemzõ, hogy az (1) képletû vegyületet diasztereoizomer formában vagy ezen formák valamely kombinációja formájában a hangbehatást követõ elsõ 7 órában, elõnyösen az elsõ órában adagoljuk. A kísérleti részben bemutatjuk azokat az eredményeket, amelyek az (1) képletû vegyület gyógyászati hatékonyságát igazolják a hangbehatás utáni funkcionális hallásvisszanyerésre. A következõ példákban illusztráljuk a fent említett eljárásokat.
1
HU 004 765 T2
Kísérleti rész Farmakológiai vizsgálat 1) Gentamicinkezelés után kiváltott fülkárosodás – Az együttes kezeléssel adagolt (1) képletû vegyület védõhatásának igazolása a gentamicin által kiváltott csillósejtveszteséggel kapcsolatban Igazoljuk, hogy a gentamicin és egyéb aminoglikozidok károsítják a csillósejteket, és hallásvesztést váltanak ki embernél. A zebrahalak a testük felületén érzõszervekkel, úgynevezett neuromasztokkal rendelkeznek. A halaknál a neuromaszt csillósejtek jelezhetõk DASPEI-vel, és ez a jelzés azt mutatja, hogy hány csillósejt van. Ezek a csillósejtek szerkezetileg és mûködés szempontjából is hasonlóak az ember fülében levõ belsõ csillósejtekhez. Gentamicinnel kiváltjuk a zebrahalaknál a belsõ csillósejtek károsodását. Abból a célból, hogy vizsgáljuk az (1) képletû vegyületek hatását a gentamicin miatt károsodott csillósejtek védelmére, az (1) képletû vegyületet gentamicinnel együtt adagoljuk. Ezután jelezzük a belsõ csillósejteket, és meghatározzuk a mennyiségüket. A vizsgálatot 5 napos halakon végezzük, amelyeket 1 mg/ml gentamicinnel együtt inkubáltunk 24 órán keresztül az (1) képletû vegyület jelenlétében vagy anélkül. Párhuzamosan kontrollvizsgálatot végzünk; csak vivõanyag (1% DMSO; pozitív kontroll). A gentamicinnel kezelt halak a negatív kontrollok. A DASPEI (2,4-dimetil-amino-sztiril-N-etilpiridinium-jodid) festést azért végezzük, hogy láthatóvá tegyük in vivo a csillósejteket (csoportonként n=5). A csillósejtek jelzésének jelét mennyiségileg morfometriás analízissel határozzuk meg. A pozitív kontrollok DASPEI színezõdésének jelét 100%-nak definiáljuk. Az eredményeket az 1. ábrán mutatjuk be (DASPEI-vel jelzett csillósejtek százaléka: pozitív kontroll (zebra – 1% DMSO); negatív kontroll (zebra – 1% DMSO – gentamicin 1 mg/ml), és a termék hatása [zebra 1% DMSO – gentamicin – (1) számú vegyület]). A kísérletet csoportonként 5 állaton végezzük. Az eredményekbõl látható, hogy: – a negatív kontroll elszínezõdési jele a kontroll jelének 31,5±4,2%¹át teszi ki, vagyis a gentamicinkezelés következtében a csillósejtek 68,5±4,9%¹a elveszett; – a gentamicinnel és az (1)¹es vegyülettel kezelt állatoknál a színezõdési jel a kontrolljel 65,2±4,4%¹át teszi ki, vagyis igen jelentõs mértékben, 48,7±2,63%-ban védve vannak a gentamicinkezelés által károsodott csillósejtek.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
meg egy funkcionális teszttel, amely az állatok audiogramjának a mérése. Ezt az audiogramot a hallóideg összetett hatáspotenciáljának az aktivitásával rögzítettük. Az audiogramokat az akusztikus trauma elõtt és után vettük fel. Ezeket a funkcionális adatokat kiegészíti egy pásztázó elektronmikroszkóppal végzett analízis, amellyel a cochlea spirál mentén vizsgáljuk a sejtveszteséget, valamint az (1) képletû vegyület védõhatását. Valamennyi említett kísérletet tengerimalacon végeztük; az egyes kísérleteket hasonló módon végeztük. Egy kísérleti fázis általános módszere az alábbi: – Az állatokat elaltatjuk úgy, hogy intramuszkulárisan injektálunk 2%¹os Rompun® (3 mg/kg) és Zolutil® (40 mg/kg) keveréket. Ennek az altatásnak az elõnye, hogy gyorsan eloszlik, és több órán keresztül fenntartható, szabályos idõközökben (2 óránként) az eredeti dózis egyharmadának injektálásával. – Elhelyezzük az elektródákat és a miniszivattyút a 2. ábra szerint. A cochleát a hátoldalról közelítve érjük el. A fejbõrt borotváljuk és megtisztítjuk, majd 2 cm¹es bevágást végzünk a fülkagyló mögött. A fültõmirigyet és a dobüreget fedõ izomsíkokat félrehajtjuk. A csontot szárítás és tisztítás után átlyukasztjuk a felsõ falánál az arcideg kezdete alatt. Ezután az üregbe bevezetjük az aktív elektródát (0,13 mm átmérõjû platinaszál, Teflonnal bevonva), és érintkezésbe hozzuk egy mûveleti mikroszkóp (WILD M650) alatt a kerek ablak membránjával. Az audiometrikus küszöbök regisztrálása után kézzel egy kis, 0,2 mm átmérõjû lyukat fúrunk közvetlenül a kerek ablak alatt, a dobhártya peremének alsó körébe. Egy második mikromanipulátorral üvegpipettát vezetünk be a belsõ fülbe (0,1 mm átmérõjû a végén), amely egy katéterrel a mikroszivattyúhoz van kapcsolva. A dobüreget, amely magába zárja a regisztrálóelektródát és a perfúziós pipettát, fogászati gyantával zárjuk le. A mikroszivattyút az állat bõre alá csúsztatjuk, az izmokat és bõrt betadinnel ecseteljük, felszívódó szállal összevarrjuk és antibiotikus oldattal fedjük (Rifocin 5P 100®). Ezután a koponya tetején egy második, kb. 1,5 cm¹es bevágást végzünk, hogy rögzíteni tudjunk egy konnektort az állat koponyájára (connectral, ref: 8/45–05.050.000). A csontról lekaparjuk a csonthártyát, ezt a területet gondosan megszárítjuk, ezüstnitráttal ecseteljük, majd cianolit filmmel fedjük. Az elektródákat (az aktív és a referenciaelektródát) a bõr alá csúsztatjuk, egészen a konnektorig, amelyhez hozzáhegesztjük. Ezután a konnektort a koponyához rögzítjük fogászati gyantával.
50 2) Akusztikus trauma utáni hallásvesztés Tengerimalacnál vizsgáltuk az (1) képletû vegyülettel történõ elõ- és utókezelés védõhatását egyrészt a belsõ fül csillósejtjeinek védelmére, másrészt a funkcionális hallásvisszanyerésre, akusztikus trauma által kivál- 55 Stimulációs technikák tott hallásvesztés után. Az (1) képletû vegyületet lokáliA hangstimulációt két Hewlett–Packard szintetizásan adagoltuk „intra és extra cochleába”, így közelítettorral végezzük (HP 3314 A és HP 8904 A), és ezeket a tünk a humán klinikai sebészeti alkalmazásához. fültõl 10 cm¹re elhelyezett hangszóró (JBL 075) segítséEnnek az új védõanyagnak köszönhetõ elért funkgével juttatjuk a szabadba. Az akusztikus rendszer kacionális hallásvisszanyerést mennyiségileg határoztuk 60 librálását mesterséges fülben végezzük egy fél collos 5
1
HU 004 765 T2
mikrofon felhasználásával (4134 típus, Bruel és Kjaer), és egy mérõerõsítõvel (2606¹os típus), amely lehetõvé teszi a hangerõsséget közvetlenül SPL decibelben leolvasni (dB SPL, referencia: 2×10–5 Pa). Az akusztikus jelek vizualizálására a mérõerõsítõ kimenetét oszcilloszkóphoz kapcsoljuk. Az állatokat 6 kHz¹es, 120 SPL decibeles hangnak tesszük ki 30 percen keresztül. Felvételi technikák Az állat fejéhez rögzített konnektoron keresztül a belsõ fülbe implantált elektródából felvett belsõ fül potenciált erõsítjük (ezerszeresre) és szûrjük (32 Hz–3200 Hz) egy elõerõsítõvel és egy GRASS P 511 K típusú differenciál erõsítõvel. A direkt nyomot oszcilloszkópon tesszük láthatóvá (Tektronix 513). Ezt a jelet átlagoljuk (256 passzázs) az alapzaj csökkentése céljából, és egy PC 486, 66 MHz¹es számítógépen (Hewlett–Packard–Vectra 05/65) tároljuk. A küszöb kritériumot úgy határozzuk meg, hogy az az érték SPL dB¹ben, amely egy mérhetõ reakció kiváltásához szükséges (> 2 mV). Két elektródát helyezünk a belsõ füllel érintkezésbe (kerek ablak), amelyekkel rögzíteni tudjuk a belsõ fül reakcióját, és fel tudjuk venni minden fülre az audiogramokat. Az audiometriai küszöböket a hangtrauma után 20 perccel és naponta, egy hónapon keresztül rögzítjük. Kalpain aktiválása akusztikus trauma után A kalpain egyik specifikus szubsztrátumának, a fodrinnak a hasítását mennyiségileg meghatározzuk, hogy meghatározzuk a kalpain enzim aktiválódását. A kalpain a 200 KD¹s fodrint hasítja, és egy 150 KD¹s bomlástermék keletkezik. Kettõs jelzést végzünk egy, a 150 KD¹s fragmensre specifikus poliklonális antitesttel és egy antikalbindin-antitesttel, amely lehetõvé teszi a csillósejtek azonosítását. A fluoreszcenciát konfokális mikroszkóppal tesszük láthatóvá. Csillósejtek akusztikus trauma utáni halálának molekuláris mechanizmusa A sejthalál természetének meghatározására a cochlea-sejtek DNS-fragmentációját TUNEL eljárással határozzuk meg mennyiségileg. Csillósejtek integritásának meghatározása akusztikus trauma után A cochlea-sejtek integritását immunocitokémiai módszerekkel határozzuk meg egy anticitochrom C antitest felhasználásával. Az egészséges sejtekben a citochrom C a mitochondriumokban lokalizálódik. Akusztikus trauma után a citochrom C diffúzzá válik, és a citoplazmában oszlik el. 1. fázis: (1)¹es vegyület védõhatásának kimutatása a behatás elõtt adagolva, trauma által kiváltott, a cochlea spirál mentén bekövetkezõ sejtvesztés és halláscsökkenés esetén A vizsgálat leírása – 1. fázis: (1)¹es számú vegyület adagolása elõre Egy, a bõr alá helyezett mini ozmotikus szivattyú adagolja az (1)¹es számú vegyületet.
2
Két nappal a mini szivattyú beültetése után szenvednek az állatok hang által okozott sérülést a cochleában katéter útján (intracochleáris infúzió). Ezt a kísérletet 7 állaton végezzük, majd 30 állaton 5 a dózis-reakció meghatározására. Az (1)¹es vegyületet közvetlenül alkalmazzuk a cochleában (intracochleáris infúzióval) mini ozmotikus szivattyú útján (áramlási sebesség 1 ml/óra, térfogat 200 ml, diffúzió idõtartama 7 nap). Ezt tartósan implantáljuk a cochleába a trauma 10 kiváltása elõtt 2 nappal. Ezzel az eljárással meg lehet határozni az (1)¹es vegyület védõhatását 100 mmol dózisban a trauma által kiváltott sejtcsökkenésre a cochlea spirál mentén, valamint a hallás funkcionális visszanyerésére. Ezután a termékbõl dózishatás-vizsgálattal 15 meghatározzuk azt a hatékony dózist, amellyel a hallás 50%¹a megõrizhetõ. 1. fázis eredményei (1)¹es vegyület 100 mmol koncentrációban. Audiogrammal mért funkcionális teszt. 20 Hallásvesztés akusztikus trauma után, és az (1)¹es vegyület által nyújtott védelem meghatározása 5 nappal egy 30 percig tartó, 120 dB¹es trauma után az audiogramok mérésével kimutatható az (1)¹es vegyü25 let hatékonysága. Ez a termék lehetõvé teszi a hallás 100%¹os visszanyerését, amikor azt a trauma elõtt 2 nappal 100 mmol-lal infúzióval beadjuk (lásd a 3. ábrát).
30
35
40
45
50
Morfológiai vizsgálat: sejtek hisztológiája a cochlea spirál mentén akusztikus trauma után. (1)¹es vegyület által nyújtott védelem Az elektrofiziológiai mérések végén (audiogram), 30 nappal az akusztikus trauma után, az állatok cochleáját kivesszük és elektronmikroszkópos vizsgálat számára elõkészítjük. A sejtveszteséget úgy határozzuk meg, hogy megszámláljuk pásztázómikroszkóppal a csillósejtek csomóit. Kvalitatív adatokat kívánunk nyerni úgy, hogy a Corti-szervek felületét nagyon nagy nagyításban figyeljük meg. 30 percig tartó, 120 dB¹es trauma után a belsõ csillósejtek tönkrementek, ugyanígy a külsõ csillósejtek három sorának is egy része. Ezen sejtek hisztológiai vizsgálatával kimutatható az (1)¹es vegyület hatékonysága. Ez a termék lehetõvé teszik a belsõ csillósejtek 100%¹os védelmét, valamint a külsõ csillósejtek egy nagy részének a védelmét, ha a trauma elõtt 2 nappal a vegyületet 100 mmol-ban infúzióban beadjuk (4. ábra: hisztológiai adatok; A fotó: akusztikus trauma; B fotó: (1)¹es vegyület + akusztikus trauma; I=belsõ csillósejtek; O=külsõ csillósejtek).
Akusztikus trauma után a kalpainaktiválódás következményei, (1)¹es vegyülettel történõ gátlás A kalpain enzim aktiválását úgy határozzuk meg, 55 hogy mennyiségileg meghatározzuk az enzim egyik specifikus szubsztrátumának, a fodrinnak a lebomlását 150 KD¹s fragmenssé. A fodrin ezen hasítását összehasonlító vizsgálat60 ban a cochlea-sejtjeiben eddig még nem mutatták ki. 6
1
HU 004 765 T2
Akusztikus trauma után a 150 KD¹s fragmens, amely a kalpain enzim aktiválódása miatt a fodrin hasításából származik, immun jelezhetõ, és ez látható a cochlea külsõ sejtjein, a jelzés anti-FBDP antitesttel történik („Fodrine Breakdown products”, zöld fluoreszcencia; 5A. ábra: 48 órával az akusztikus trauma után). Akusztikus trauma után a kalpainaktivitás ezen aktiválása együtt jár a cochlea-sejtek csökkenésével, amelyet az antikalbindin antitestekkel történõ jelzés hiánya tesz láthatóvá, ez lehetõvé teszi az intakt csillósejtek azonosítását. Az (1)¹es vegyület 100 mmol¹os lokális alkalmazásával, mivel a vegyület a kalpainaktiválás inhibitora és antioxidáns, megakadályozzuk a fodrinnak a kalpain enzimmel történõ hasítását az akusztikus traumának kitett cochlea-sejtekben. A zöld fluoreszcencia jelzés ezen hiánya, tehát a kalpain specifikus szubsztrátumának lebontásának hiánya, a cochlea-sejtek védelmével együtt jár (antikalbindin-antitestekkel történõ jelzés; lásd az 5B. ábrát). Csillósejtek akusztikus trauma utáni halálának molekuláris mechanizmusa. Az (1)¹es vegyület által nyújtott védelem. Az akusztikus trauma által a cochleában kiváltott sejthalál természetének meghatározásához a DNSfragmentációt (a TUNEL eljárással lehet mennyiségileg meghatározni) olyan állatokon végezzük, amelyek akusztikus traumát szenvedtek. Az (1)¹es vegyület hatását teszteljük erre a paraméterre, hogy meghatározzuk a vegyület hatását erre az apoptózis útján bekövetkezõ sejthalál mechanizmusra. A zajnak nem kitett kontroll állatokból nyert cochleákban nem figyelhetõ meg „TUNEL-pozitív” sejt. Az akusztikus traumának kitett cochleában TUNELpozitív sejtmagok vannak a Corti-szerv területén (lásd 6A. ábra: 48 órával az akusztikus trauma után). A jelzett sejtmagok a Corti-szerv felsõ részében lokalizálódnak. Valószínû tehát, hogy ezek a jelzett sejtmagok inkább a csillósejtekhez tartoznak, mint a hordozósejtekhez. Számos jelzett sejtmag látható már 1 órával az akusztikus trauma után, és ez a jelzés még az akusztikus trauma után 4 nappal is látható. Tehát az akusztikus trauma után a csillósejtek bekövetkezõ sejthalála egy DNS-fragmentációval együtt járó apoptózis mechanizmusa útján következik be. Ha helyileg (1)¹es vegyületet alkalmazunk 100 mmol-ban, amely vegyület kalpainaktiváció inhibitor és antioxidáns, akkor megakadályozzuk a csillósejtmagok jelzését [TUNEL módszer, 6B. ábra: (1)¹es vegyület – 48 órával az akusztikus trauma után]. Az (1)¹es vegyület megakadályozza az akusztikus trauma által kiváltott apoptózis révén bekövetkezõ sejthalált.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55 Csillósejtek integritásának csökkenése akusztikus trauma után. (1)¹es vegyület által nyújtott védõhatás. Az akusztikus trauma után a csillósejtek integritásában bekövetkezõ veszteség meghatározására a ci-
60 7
2
tochrom C diffúziót mérjük anti citochrom C antitest alkalmazásával, akusztikus traumán átesett állatokon. Az (1)¹es vegyületet teszteljük citochrom C¹nek a mitochondrium fülkébõl a citoplazma fülkébe történõ leadására, hogy meghatározzuk ennek hatását a csillósejtek akusztikus trauma után bekövetkezõ integritás csökkenésére. Az olyan állatokból vett cochleában, amelyeket nem tettünk ki zajhatásnak, a citochrom C a mitochondriumokban lokalizálódik. Az akusztikus traumának kitett cochleákban diffúz citochrom C jelzés található, a citochrom C a citoplazmában oszlik el (7A. ábra). Ha lokálisan alkalmazunk 100 mmol (1)¹es vegyületet, amely kalpainaktivizáció inhibitor és antioxidáns, akkor megakadályozzuk a citochrom C¹nek a mitochondriumokból az akusztikus traumának kitett csillósejtek citoplazmájába történõ diszperzióját, tehát megmarad a sejtek integritása (lásd 7B. ábra), (1)¹es vegyület dózis-reakció görbéje Az (1)¹es vegyület védõhatását úgy határoztuk meg, hogy változtattuk a dózist, és így meghatároztuk azt a hatékony dózist, amely lehetõvé teszi az elvesztett hallás 50%-ának visszanyerését (DE50). Nyolc, egyenként 5 állatból álló csoportot használunk, beleértve azokat is, amelyek csak mesterséges perilimfet kapnak, és azokat, amelyek 1, 3, 10, 33, 100 mmol (1)¹es vegyületet kapnak, összesen tehát 30 állatot használunk. 5 nappal egy 30 percig tartó, 120 dB¹es trauma után az audiogramok mérése lehetõvé teszi az (1)¹es vegyület hatékony dózisának meghatározását (DE50=3,61 mmol), amely lehetõvé teszi a trauma után elvesztett hallás 50%-ban történõ visszanyerését (lásd 8. ábra). 2. fázis: Az (1)¹es vegyület védõhatásának kimutatása, amelyet extracochleárisan a hatás után infúzióval adagolunk, a cochlea spirál mentén bekövetkezõ sejtvesztés és a hallásvesztés szempontjából. Annak az idõnek a meghatározása, amelynek elteltével az (1)¹es vegyület lehetõvé teszi a hallás 50%-ának visszanyerését. (1)¹es vegyület adagolása a hatás után Elõzetes vizsgálatok kimutatták, hogy a behatás után a cochleosztómia súlyosbítja a hang traumatikus hatásait. Ezért az implantált állatok a trauma behatás után kevésbé nyerték vissza a hallásukat, mint a nem implantált állatok. A cochleosztómiával kapcsolatos trauma kiküszöbölésére kidolgoztunk egy nem sérüléses eljárást úgy, hogy a vegyületet közvetlenül a kerek ablakra vittük be (extracochleárisan). Egy mini ozmotikus szivattyút ültetünk be a bõr alá, ez szállítja az (1)¹es vegyületet a cochleába katéteren keresztül (extracochleáris infúzió), az állat által elszenvedett hang-trauma után 30 perccel vagy 1, 3, 6, 12 vagy 24 órával. Ezt a kísérletet 30 állaton végezzük. Az (1)¹es vegyületet a középfülbe adagoljuk (extracochleáris infúzió) mini ozmotikus szivattyúval (áramlá-
1
HU 004 765 T2
si sebesség 1 ml/óra, térfogat 200 ml, diffúziós idõtartam 7 nap), a trauma elõtt 48 órával, vagy utána 1, 3, 6, 12 vagy 24 órával. Ezt a miniszivattyút tartósan implantáljuk a középfülbe, és ez a terméket közvetlenül a kerek ablakra juttatja. Ezekkel a kísérletekkel meg lehet határozni az (1)¹es vegyület terápiás ablakát (FT), vagyis azt a maximális idõtartamot, amely alatt az (1)¹es vegyület a trauma elszenvedése után adható úgy, hogy még kifejti védõhatását. Ugyancsak meghatározható a hatékony idõ, amely lehetõvé teszi a trauma után elvesztett hallás 50%-ának visszanyerését (TE50). Ezzel az eljárással ugyancsak meghatározható az akusztikus trauma után 1 hónappal az (1)¹es vegyület védõhatása 300 mmol dózisban, a trauma által kiváltott, cochlea spirál mentén található sejtveszteségre. A 2. fázis eredményei (1)¹es vegyület 300 mmol koncentrációban Funkcionális teszt: audiogram A trauma után 1 órával az (1)¹es vegyület a hallás 90%¹át megõrzi. Azt az idõtartamot, amely alatt a trauma elszenvedése után úgy adagolható az (1)¹es vegyület, hogy a hallás 50%¹át megõrzi, 6¹7 óra közötti idõtartamként határoztuk meg. Az (1)¹es vegyület terápiás ablaka egy 30 percig tartó, 120 dB¹es akusztikus trauma után 24 óra. Ez azt jelenti, hogy ebben a kísérletben az (1)¹es vegyület hatékony az akusztikus trauma utáni elsõ 24 órában (lásd 9. ábra: az audiogramokat hang-trauma után 10 nappal vettük fel). Morfológiai vizsgálat: a cochlea spirál mentén található sejtek hisztológiája 1 hónappal az akusztikus trauma elszenvedése után 300 mmol (1)¹es vegyület extracochleáris infúziója, amelyet az akusztikus trauma után 6 órával kezdtünk meg, a csillósejtek nagy részét még 1 hónappal az akusztikus trauma után is védi. Tulajdonképpen a belsõ csillósejteknek csak 32%¹a, és a külsõ csillósejteknek 18%¹a hiányzik az akusztikus trauma által megsértett területen, szemben a zajnak kitett, de az (1)¹es vegyülettel nem kezelt ellenkezõ oldallal, ahol a belsõ csillósejtek 86%¹a, és a külsõ csillósejtek 62%¹a hiányzik az akusztikus trauma által megsértett területen.
5
10
15
20
25
30
2
ahol R jelentése hidrogénatom, 1–6 szénatomos alkil¹, aralkilcsoport vagy –C(O)R’ általános képletû csoport, ahol R’ jelentése heterocikloalkil¹, 1–6 szénatomos alkil¹, aril- vagy aralkilcsoport; az alkil¹, aril- vagy heterocikloalkilcsoportok adott esetben szubsztituálva vannak egy vagy több azonos vagy különbözõ, következõk közül választott szubsztituenssel: 1–6 szénatomos alkil¹, hidroxil¹, 1–6 szénatomos alkoxi¹, nitro¹, cianocsoport, halogénatom vagy NR1R2 csoport; R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1–6 szénatomos alkilcsoport, vagy R1 és R2 a kapcsolódó nitrogénatommal együtt adott esetben szubsztituált heterociklusos csoportot alkot, hallásvesztés megelõzésére és/vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy R jelentése –C(O)R’. 3. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy R’ jelentése alkilcsoport. 4. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy R jelentése –C(O)–CH3 csoport. 5. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy R jelentése hidrogénatom. 6. Egy bármely elõzõ igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az (I) képletû vegyület az (IA) képlettel ábrázolható:
35
40 (IA) 7. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az (I) képletû vegyület az (IA1) képlettel 45 ábrázolható:
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Egy (I) általános képletû heterociklusos származék 50
55 (IA1) (I) alkalmazása diasztereoizomerek vagy ezen formák kombinációja formájában,
8. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az (I) képletû vegyület az (IA2) képlettel 60 ábrázolható: 8
1
HU 004 765 T2
2
5
(IB2) (IA2)
10
9. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az (I) vegyület az (IB) képlettel ábrázolható: 15
20
25 (IB) 10. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az (I) vegyület az (IB1) képlettel ábrázolható:
30
35
40
(IB1) 11. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az (I) vegyület az (IB2) képlettel ábrázolható:
45
9
12. Egy bármely elõzõ igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az (I) származékot elõzetes kezelésként kell adagolni. 13. Az 1–11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az (I) származékot utókezelésként kell adagolni. 14. Egy bármely elõzõ igénypont szerinti alkalmazás olyan gyógyszer elõállítására, amely egy gyógyszer adagolása következtében fellépõ hallásvesztés megelõzésére és/vagy kezelésére szolgál. 15. A 14. igénypont szerinti alkalmazás egy másik gyógyszer adagolása következtében, ahol a másik gyógyszer antibiotikum, rákellenes gyógyszer, nem szteroid gyulladásgátló szer, diuretikum, fekélyellenes szer, görcsoldó szer. 16. A 15. igénypont szerinti alkalmazás egy antibiotikum adagolásának következtében. 17. A 16. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az antibiotikum a gentamicin. 18. Az 1–13. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás olyan gyógyszer elõállítására, amely a presbycusis következtében fellépõ hallásvesztés megelõzésére és/vagy kezelésére szolgál. 19. Az 1–13. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás olyan gyógyszer elõállítására, amely akusztikus trauma következtében fellépõ hallásvesztés megelõzésére és/vagy kezelésére szolgál. 20. A 19. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az (I) vegyületet az akusztikus trauma utáni elsõ 7 órában, elõnyösen az elsõ órában kell adagolni. 21. Egy bármely elõzõ igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az (I) vegyületet legalább egy másik gyógyszerészeti hatású anyaggal kombináljuk, ahol az anyagot a következõk közül választjuk: antioxidánsok, kalpaininhibitorok, perifériás értágítók, NMDA-receptor-agonisták vagy antagonisták és c¹Jun N¹terminális kináz peptides inhibitorai.
HU 004 765 T2 Int. Cl.: A61K 31/5415
10
HU 004 765 T2 Int. Cl.: A61K 31/5415
11
HU 004 765 T2 Int. Cl.: A61K 31/5415
12
HU 004 765 T2 Int. Cl.: A61K 31/5415
13
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
