!HU000008478T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 478
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: PCT/EP03/13030 2003. 11. 14.
(73) Jogosult: Consejo Superior De Investigaciones Científicas, 28006 Madrid (ES)
WO
(72) Feltalálók: GARCES, Rafael, E-41907 Valencia de la Concepción (ES); MARTINEZ-FORCE, Enrique, E-41012 Sevilla (ES) (54)
HU 008 478 T2
A01H 5/10
(21) Magyar ügyszám: E 03 782359 (22) A bejelentés napja: 2003. 12. 08. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030782359 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1689222 A1 2005. 05. 26. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1689222 B1 2010. 03. 03.
(2006.01) A23D 9/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05046315 PCT/EP 03/014026
(74) Képviselõ: Schläfer László, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
A triacil-glicerin-molekulában módosított zsírsaveloszlással rendelkezõ napraforgóolaj, -mag és -növény
A leírás terjedelme 16 oldal (ezen belül 3 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.
1
HU 008 478 T2
A találmány tárgya A jelen találmány tárgya napraforgóolaj, amely közvetlenül nyerhetõ a teljes zsírsavtartalomra vonatkoztatva 12–40,8% sztearinsav-tartalommal rendelkezõ napraforgómagokból, ahol az olajban módosított zsírsaveloszlás található a triacilglicerin (TAG) molekula sn¹1 és sn¹3 pozíciói között a vad típusú napraforgómagokból nyert olajhoz viszonyítva. A találmány kiterjed a fent említett jellemzõkkel rendelkezõ endogén olajat tartalmazó napraforgónövényre és ¹magokra. A találmány háttere Az olajokat és zsírokat fõként trigliceridekbõl állítják elõ, amelyek egy glicerinalapból álló molekulák, ahol a glicerin három hidroxilcsoportja három zsírsavval van észterezve (Gunstone és munkatársai, 1994). Az olajok kémiai és fizikai, valamint táplálkozási tulajdonságait az olaj zsírsavösszetétele, és ezen zsírsavaknak a különbözõ trigliceridfajtákban való eloszlása határozza meg. A zsírsavak három sztereokémiai pozícióját sn-1, sn¹2 és sn¹3 jellel azonosítják. Az a tény, hogy az olaj meghatározott hõmérsékleten szilárd, vagy jó stabilitással rendelkezik, összefüggésben van a zsírsavakban található kettõs kötések csökkentett számával. Az olajos magvakban található legfontosabb zsírsavak a linolsav (18:2), amely 18 szénatomot és 2 kettõs kötést tartalmaz, valamint az olajsav (18:1), amely csak 1 kettõs kötést tartalmaz, és amely miatt az olaj szobahõmérsékleten folyékony. Számos olaj, így a szójababból vagy repcébõl nyerhetõ olaj linolénsavat (18:3) is tartalmaz, amely 18 szénatomot és 3 kettõs kötést tartalmaz. Ezek a zsírsavak telítetlenek, mivel egy vagy több kettõs kötést tartalmaznak. A növényi olaj kis mennyiség telített zsírsavakat is tartalmaz, amelyek kettõs kötéstõl mentesek, és amelyekre példaként említhetõ a palmitinsav, amely 16 szénatomos (16:0), sztearinsav, amely 18 szénatomos (18:0), az arachidonsav, amely
2
20 szénatomos (20:0), és a behénsav (22:0), amely 22 szénatomos. A telítetlen zsírsavak kedvezõek az egészségre, míg a telített zsírsavak semlegesek vagy egészségtelenek a zsírsavtól és a trigliceridmolekulában betöltött pozíciótól függõen. Másrészrõl egyes trópusi növényi olajok és állati zsírok rövid és közepes lánchosszúságú telített zsírsavakat tartalmaznak, melyekre példaként említhetõ a laurinsav, amely 12 szénatomos (12:0) és a mirisztinsav, amely 14 szénatomos telített zsírsav (14:0), ahol a legutóbbi a legkárosabb az egészségre. A mérsékelt övi növényi olajokban található legáltalánosabb telített zsírsavak a palmitinsav és a sztearinsav (1. táblázat). A palmitinsavat az egészségre enyhén károsnak tekintik, míg a sztearinsavat semlegesnek minõsítik. Nagyon fontos azonban az, hogy figyelembe vegyünk egy második tulajdonságot, ami a zsírsavaknak a trigliceridmolekulában betöltött pozíciójától függ. Egy telített hosszú szénláncú zsírsav kevésbé ártalmas akkor, ha nem a glicerin középsõ pozíciójához (sn¹2) kötõdik. A zsír emésztése során a hasnyálmirigy lipázenzime hidrolizálja a glicerin sn¹1 és sn¹3 pozícióiban található zsírsavakat. Míg a középsõ pozícióban található zsírsav a glicerinhez kötve marad, és így egy monogliceridet képez, amely detergens tulajdonságokkal rendelkezik, és teljesen felszívódik, addig az sn¹1 és sn¹3 pozíciókból felszabadult zsírsavak kalciummal vagy magnéziummal reagálnak, és ezekkel a fémekkel oldhatatlan sókat képeznek, ami nagyon megnehezíti a bélben való felszívódást. Ennek eredményeként ezek kiválasztódnak. Mint az 1. táblázatból látható, a növényi olajokban található valamennyi telített zsírsav, a pálmaolaj kivételével, nem az sn¹2 pozícióban kötõdik, és ezért negatívan nem befolyásolják a koleszterinszintet, annak ellenére, hogy palmitinsav-tartalmuk nagy, mint a kakaóvaj esetén vagy palmitinsav-tartalmuk közepes, mint az olívaolaj esetén.
5
10
15
20
25
30
35
1. táblázat Ehetõ zsírok és olajok zsírsavösszetétele (Álvarez-Ortega és munkatársai, 1997; Chow, 1992; Gunstone és munkatársai, 1994) Zsír vagy olaj
Zsírsavösszetétel (%) £12:0
Sertészsír Vaj Pálmaolaj
12
14:0
16:0
16:1
18:0
18:1
18:2
transz
telített sn¹2 pozícióban
2
25
3
12
45
10
1
79
10
26
2
12
28
3
3
84
1
45
5
39
9
18
Olívaolaj
14
3
71
10
2
Kakaó
26
1
35
35
3
4
Napraforgóolaj
7
5
30
57
1
Nagy olajsavtartalmú (HO) napraforgóolaj
5
4
88
2
1
Az élelmiszeripar sok élelmiszer-készítményhez rugalmas vagy szilárd zsírt (így például állati zsírt) igényel, amely jó stabilitással rendelkezik. A péksütemé- 60 2
nyekhez, kekszekhez, süteményekhez, és természetesen a margarinokhoz és egyéb kenhetõ készítményekhez szilárd zsírra van szükség, míg a mélyfagyasztott
1
HU 008 478 T2
élelmiszerekhez a termooxidációval szemben rezisztens folyékony olajokra van szükség. A 80¹as években az élelmiszeripar a táplálkozástudományi szakemberek ajánlásait és a fogyasztók igényeit követve az állati zsírokról áttért a növényi olajokra. Ezek az olajok nem rendelkeznek az ilyen élelmiszer-készítményekben történõ felhasználáshoz szükséges tulajdonságokkal; ezeket kémiailag módosítani kell részleges hidrogénezéssel és/vagy átészterezéssel. A hidrogénezés redukálja a telítetlen zsírsavakban található kettõs kötéseket, amelyhez hidrogént és katalizátorként egy nehézfémet alkalmaznak. A folyamat alatt nõ a telített zsírsavak mennyisége, de ezzel egyidejûleg nõ a mesterséges zsírsavak cisz- és transz-izomerjeinek száma. A transz-izomerek, annak ellenére, hogy ezek telítetlen zsírsavak, a telített zsírsavakhoz hasonló fizikai tulajdonságokkal rendelkeznek. A fõ probléma az ilyen transz-zsírsavakkal az, hogy a koleszterinszint szempontjából még rosszabbak is, mint az állati eredetû telített zsírsavak, és részt vesznek néhány lényeges, zsírsavakkal kapcsolatos hiányon alapuló betegségben vagy egyes rákos megbetegedésekben, így a nõknél jelentkezõ mellrákban. A kémiai átészterezés valamennyi zsírsav újraelosztását eredményezi a trigliceridmolekulán belül; és ezután frakcionálással telített trigliceridekben dús adag
5
10
15
20
25
2
nyerhetõ. Ezzel a folyamattal egy egészséges növényi olaj sertészsírhoz hasonló egészségtelen zsírrá alakul, amely nagy mennyiségû telített zsírsavat tartalmaz az sn¹2 pozícióban. Ez az olaj növeli a kis sûrûségû (rossz) koleszterin szintjét. Levonható a következtetés, hogy a növényi olajok kémiai módosítására alkalmazott eljárások nem túlságosan egészségesek, az ilyen olajok tulajdonságait olyan módon változtatják meg, hogy az újak kevésbé egészségesek. A technológiai és élelmezési adatok figyelembe vételével a legjobb olaj olyan természetes növényi olaj lenne, amely telített zsírsavként megemelt sztearinsav-tartalommal rendelkezik, és ez a glicerinvázhoz az sn¹1 és sn¹3 pozíciókban kötõdik, és telítetlen zsírsavként olajsavat vagy linolsavat tartalmaz, amelyek a három sn pozícióhoz kötõdnek. Egy mutációs program keretén belül számos zsírsavas napraforgómutáns-vonalat szelektáltak (Osorio és munkatársai, 1995). Több ilyen mutáns nagy mennyiségû telített zsírsavat tartalmaz a mag olajában: a CAS¹3 legalább 26% sztearinsavat tartalmaz; a CAS¹4 és CAS¹8 legalább közepes mennyiségben tartalmaz sztearinsavat (12–16%). Ez az anyag és biokémiai vizsgálatok és további rekombinációk után szelektált hasonló vonalak, így a CAS¹29, 30 és 31 egy széles körû csíraplazma-gyûjteményt képez (2. táblázat).
2. táblázat Szelektált napraforgóanyag zsírsavösszetétele az Instituto de la Grasa, CSIC, Seville, Spanyolország napraforgó-gyûjteményébõl Olaj típusa
Vonal
Zsírsavösszetétel (mol%) 16:0
18:0
18:1
18:2
20:0
22:0
Közepes 18:0
CAS-4
5,9
11,9
27,8
53
0,6
0,7
Nagy 18:0
CAS-3
5,4
26,1
14,2
51,3
1,4
1,3
Nagy 18:0
CAS-14
8,4
37,3
12,4
37,9
2,2
1,8
Nagy 18:0
CAS-30
5,8
32,1
9,4
49,3
1,9
1,5
Nagy 18:0
CAS-29
6,7
31,9
21,2
36,2
1,8
2,2
Nagy 18:0
CAS-31
7,2
31,7
14,7
43,3
1,4
1,7
Nagy 18:0
CAS-15
5,2
26,3
57,8
7,2
1,2
1,9
Nagy 18:0
CAS-26
10,1
23,3
59,1
4,5
1,2
1,8
Nagy 18:0
CAS-24
7,2
24,5
60,6
4,4
1,4
1,9
A mutánsok genetikai jellemzése azt mutatja, hogy a megváltozott zsírsavszint öröklõdése gametofita jellegû, és csökkentett számú helyen megjelenõ allélek 50 szabályozzák, és így ezek átvitele célzott beltenyésztett vonalakba néhány visszakeresztezési ciklussal megvalósítható. Az ilyen mutáns jellemzõk idõbeli és térbeli expressziójának tanulmányozása azt mutatja, hogy a mutáns jellemzõk csak a mag kialakulása során 55 expresszálódnak, ezeket a jellemzõket csak kismértékben befolyásolja a termesztési hõmérséklet, és ezek nem expresszálódnak vegetatív szövetekben. Ezek a napraforgómutáns-vonalak nem váltanak ki semmilyen másodlagos negatív hatást, amint ez megfigyelhetõ a 60 3
nagy sztearinsav-tartalmú mutáns lúdfüvek (Arabidopsis) és repce esetén. A növényi trigliceridek a glicerin-3¹P útvonalon (Kennedy-útvonal) keresztül termelõdnek. Elõször (1. ábra) két acilezés történik a glicerin-3-foszfáton az sn¹1 és sn¹2 pozíciókban, amit acil-CoA észterekkel végeznek a glicerin-3-foszfát-acil-transzferáz (GPAT) és lizofoszfatidát-acil-transzferáz (LPAAT) enzimek, melynek során foszfatidátok keletkeznek. A foszfatidátokat ezután digliceriddé hidrolizálja a foszfatidát-foszfohidroláz, és ezután a digliceridet trigliceriddé tovább acilezi az acil-CoA (a reakciót diglicerid-acil-transzferáz, DAGAT) katalizálja. Ez a legutóbbi enzim csak a
1
HU 008 478 T2
triglicerid bioszintézisben vesz részt. Az ilyen aciltranszferázok szabályozzák a zsírsavak sztereokémiai eloszlását. A napraforgómutánsok triglicerideloszlását analizálva 38 különbözõ molekulatípust találtak (Fernández-Moya és munkatársai, 2000). De meglepõ módon a nagy sztearinsav-tartalmú vonalak által szintetizált trigliceridek nem mutatnak véletlenszerû eloszlást az sn¹1 és sn¹3 pozíciókban, ahogy ezt Vander Wal elmélete (1960) alapján várni lehetne, amelyrõl feltételezik, hogy valamennyi olajra érvényes. Az ilyen szokatlan eloszlásért felelõs enzimek az acil-transzferázok, amelyek triglicerideket szintetizálnak az acil-CoA készletbõl és glicerin-3¹P komponensbõl. Figyelembe véve, hogy növényi rendszerekben a trigliceridszintézis úgy játszódik le, hogy telített zsírsav nem kötõdik a glicerin sn¹2 pozíciójában (Álvarez-Ortega és munkatársai, 1997), a hatásért felelõs specifikus enzim feltehetõen a glicerin-3¹P acil-transzferáz és/vagy a diglicerid-aciltranszferáz. A találmányhoz vezetõ kutatások során egy matematikai koefficienst, melynek neve alfa S (aS), fejlesztettünk ki, amely a telített zsírsavak relatív eloszlását számolja a TAG sn¹1 és sn¹3 pozíciókban. Az aS értéke 0¹tól indul, ami azt jelenti, hogy a pozíciók egyike telített zsírsavtól mentes, és 0,5¹ig terjed, ami azt jelenti, hogy mindkét pozíció ugyanazt a telített zsírsavtartalmat mutatja. Ha egy triglicerideloszlást a Vander Wal-elmélet szerint határozunk meg, akkor a=0,5, és
5
10
15
20
25
2
a különbözõ zsírsavak egyenletesen oszlanak el a trigliceridben. Ez nagyon fontos a telített zsírsavaknak az sn¹1 és sn¹3 pozíciók között mutatott eloszlása esetében, mivel abban az esetben, ha több telített zsírsav van a pozíciók egyikében, akkor a¹értéke kisebb, mint 0,5, és a kétszeresen telített trigliceridek mennyisége kisebb, mint az elméletileg várt érték. Ez pontosan az, amit a feltalálók napraforgóolajokban találtak, elsõsorban azokban, ahol a sztearinsav mennyisége nagyobb, mint 12%. A kétszeresen telített trigliceridek maximális mennyisége, ami elõnyös a kenhetõ készítményekhez, margarinokhoz, fõzõmargarinokhoz, pékárukhoz, tésztafélékhez és hasonlókhoz szükséges rugalmas zsírok elõállításához, akkor nyerhetõ, ha a=0,5, minél kisebb az a¹értéke a trigliceridmolekula sn¹1 és sn¹3 pozícióiban mutatott telített zsírsaveloszlásban, annál rosszabb az adott olaj az említett speciális felhasználások szempontjából. Így adott alkalmazásokhoz a TAG sn¹1 és sn¹3 pozíciókban elõnyös relatív telített zsírsav-eloszlást mutató mutáns napraforgók szelektálhatók az a¹érték számítása alapján. Ez a koefficiens számolható a triglicerid teljes telített zsírsavösszetétele (S), az sn¹2 pozícióban mutatott telített zsírsavösszetétel (S2), mely kettõ számolható Álvarez-Ortega és munkatársai (1997) szerint, és a trigliceridmolekuláris fajta összetétele ismeretében, amely számolható Fernández-Moya és munkatársai (2000) szerint.
3. táblázat Telített és telítetlen zsírsavak százalékos mennyisége az egyes TAG pozíciókban (S1, S2 és S3) az S, S2 és aS függvényében: teljes telített zsírsavtartalom: S2: sn¹2 telített zsírsavtartalom; a: telített zsírsavak sn¹1 és sn¹3 pozíciók közötti eloszlásának koefficiense TAG pozíciók
Telített (S) Telítetlen (U)
1
2
3
(3S–S2) a (S1)
S2
(3S–S2)(1–a) (S3)
100–[(3S–S2)a] (U1)
100–S2 (U2)
100–[(3S–S2)(1–a)] (U3)
A különbözõ TAG alosztályok (háromszorosan telített: SSS; kétszeresen telített: SUS; egyszeresen telí- 45 tett: SUU; és háromszorosan telítetlen UUU) általában az alábbi egyenletekkel számoljuk:
a) Háromszorosan telített TAG esetében (SSS): SSS (%)=S1S2S3/10 000 (i) Az S1, S2 és S3 változók értékeit a 3. táblázatból behelyettesítve az alábbiakat kapjuk:
SSS (%)=S1S2S3/10 000 (i) 50 SUS (%)=(U1S2S3+S1U2S3+S1S2S3)/10 000 (ii) SUU (%)=(S1U2U3+U1S2U3+U1U2S3)/1000 (iii) UUU (%)=U1U2U3/10 000 (iv)
55
Az S1, S2, S3, U1, U2 és U3 változókra a 3. táblázatban megadott értékek alapján az a megoszlási koefficiens értéke különbözõ TAG esetekre az alábbi meg60 fontolások alapján számolható: 4
S1S2S3=[(2S¹S2)a]×S2×[(3S–S2)(1–a]= (3Sa–S2a)×S2×(3S–3Sa–S2–S2a)= 3SS2a–S22a)×(3S–3Sa–S2–S2a)= 2 9S S2a–9S2S2a2–3SS22a+3SS22a2–3SS22a+ 3SS22a2+S23a–S23a2= 2 (–9S S2+6SS22–S23)a2+(9S2S2–6SS22+S23)a (v) Az (i) egyenletet átrendezve: S1S2S3–10 000 SSS(%)=0
1
HU 008 478 T2
Az S1S2S3 értéket a (v) egyenletbõl behelyettesítve: (–9S2S2+6SS22–S23)a2+(9S2S2–6SS22+S23)a– 10 000 SSS (%)=0
a=
-b ± b2 - 4ac -b = ± 2a 2a
b2 - 4ac = 0,5 ± 2a
Az S1, S2, S3, U1, U2 és U3 változók értékeit a 3. táblázatból behelyettesítve az alábbiakat kapjuk:
5
a2 - 4ac 2a
a-értéke egy másodfokú egyenlettel (ax2+bx+c=0) számolható, amely egyszerûsíthetõ, mivel a=–b, ahol a=–9S 2 S 2 +6SS 2 2 –S 2 3 , b=9S 2 S 2 –6SS 2 2 +S 2 3 és c=10 000 SSS (%), SSS(%) a háromszorosan telített TAG teljes mennyisége a magban/olajban. b) Kétszeresen telített TAG esetében (SUS):
10
15
SUS (%)=U1S2S3+S1U2S3+S1S2U3)/10 000 (ii) Az S1, S2, S3, U1, U2 és U3 változók értékeit a 3. táblázatból behelyettesítve az alábbiakat kapjuk:
2
S1U2U3=30 000Sa–900S2a+900S2a2+300SS2a– 300SS2a2–10 000S2a+300SS2a–300SS2a2– 100S22a+100S22a2–300SS2a+9S2s2a–9S2s2a2– 3SS22a+3SS22a2+100S22a–3SS22a+3SS22a2+ S23a–S23a2 (ix) U1S2U3=10 000S2–300SS2+300SS2a+100S22– 100S22a-300SS2a+9S2S2a–9S2S2a2–3SS22a+ 3SS22a2+100S22a-3SS22a+3SS22a2+S23a–S23a2 (x) U1U2S3=30 000S–10 000S2–30 000Sa+ 10 000S2a–300SS2+100S22+300SS2a–100S22a– 900S2a+300SS2a+900S2a2–300SS2a2+9S2S2a– 3SS22a–9S2S2a2+3SS22a2+300SS2a100S22a–300SS2a2+100S22a2–3SS22a+S23a+ 3SS22a2–S23a2 (xi)
20 A (iii) egyenletet átrendezve:
U1S2S3={100–[3S–S2)a]}×S2×[(3S–S2)(1–a)]= 300SS2–300SS2a–100S22+100S22a–9S2S2a+ 9S2S2a2+3SS22a–3SS22a2+3SS22a– 3SS22a2–S23a+S23a2 (vi) S1U2S3=(3S–S2)a×(100–S2)×[(3S–Sa)(1–a)]= 900S2a–300SS2a–9S2S2a+3SS22a–900S2a2+ 300SS2a2+9S2S2a2–3SS22a2–300SS2a+ 100S22a+3SS22a–S23a+300SS2a2–100S22a2– 3SS22a2+S23a2 (vii) S1S2S3=[(3S–S2)a]×S2×{100–[(3S–S2)(1–a)]}= 300SS2a–9S2S2a+9S2S2a2+3SS22a– 2 2 3SS2 a –100S22a+3SS22a–3SS22a2–S23a+S23a2 (viii)
(S1U2U3+U1S2U3+U1U2S3)–10 000SUU(%)=0 25
Az S1U2U3, U1S2U3 és U1U2S3 értékeket a (ix), (x) és (xi) egyenletekbõl behelyettesítve, és a függvényében csoportosítva: (–1200SS2+18SS22–27S2S2+1800S2+200S22– 3S23)a2+(1200SS2–18SS22+27S2S2–1800S2– 200S22+3S23)a-600SS2+200S22+ 30 000S–10 000SUU(%)=0
30
a-értéke egy másodfokú egyenlettel számolható, 35 amely egyszerûsíthetõ, mivel a=–b
A (ii) egyenletet átrendezve:
a=
-b ± b2 - 4ac -b = ± 2a 2a
b2 - 4ac = 0,5 ± 2a
a2 - 4ac 2a
(U1S2S3+S1U2S3+S1S2U3)–10 000SUS (%)=0 Az U1S2S3, S1U2S3 és S1S2U3 értékeket a (vi), (vii) és (viii) egyenletekbõl behelyettesítve, és az a függvényében csoportosítva: (600SS2–18SS22+27S2S2–900S2–100S22+ 3S23)a2+(–600SS2+18SS22–27S2S2+900S2+ 100S22–3S23)a+300SS2–100S22–10 000SUS(%)=0 a-értéke másodfokú egyenlettel számolható, amely egyszerûsíthetõ, mivel a=–b -b ± b2 - 4ac -b a= = ± 2a 2a
b2 - 4ac = 0,5 ± 2a
40 ahol a=–1200SS2+18SS22–27S2S2+1800S2+200S22– 3 S 2 3 é s c =– 6 0 0 S S 2 + 2 0 0 S 2 2 + 3 0 0 0 0 S – 10 000SUU(%), SUU(%) az egyszeresen telítetlen TAG teljes mennyisége a magban/olajban. d) Háromszorosan telítetlen TAG esetében: 45 UUU(%)=U1U2U3/10 000 (iv) Az U1, U2 és U3 változók értékeit a 3. táblázatból behelyettesítve az alábbiakat kapjuk: 50 U1U2U3=(600SS2–6SS22+9S2S2–900S2– 100S22+S23)a2+ (–600SS2+6SS22–9S2S2+900S2+ 100S22–S23)a+300SS2–100S22–30 000S+100 000 (xii)
a2 - 4ac 2a
ahol a=600SS2–18SS22+27S2S2–900S2–100S22+3S23 és c=300SS2–100S22–10 000SUS(%), SUS(%) a kétszeresen telített TAG teljes mennyisége a magban/olajban. c) Egyszeresen telítetlen TAG esetében (SUU): SUU (%)=(S1U2U3+U1S2S3+U1U2S3)/10 000 (iii)
55
A (iv) egyenletet átrendezve: U1U2U3–10 000UUU(%)=0
Az U1U2U3 értéket az (xii) egyenletbõl behelyette60 sítve, és a függvényében csoportosítva: 5
1
HU 008 478 T2
(600SS2–6SS22+9S2S2–900S2–100S22+S23)a2+ (–600SS2+6SS22–9S2S2+900S2+100S22–S23)a+ 300SS2–100S22 –30 000S+1 000 000– 10 000UUU(%)=0 5 a-értéke egy másodfokú egyenlettel számolható, amely egyszerûsíthetõ, mivel a=–b a=
-b ± b2 - 4ac -b = ± 2a 2a
b2 - 4ac = 0,5 ± 2a
a2 - 4ac 2a
10
2
ahol a=600SS2–6SS22+9S2S2–900S2–100S22+S23, és c=300SS2–100S22–30 000S+1 000 000–10 000UUU( %), UUU(%) a háromszorosan telítetlen TAG teljes mennyisége a magban/olajban. Annak érdekében, hogy a TAG esetekre vonatkozó GLC-értékek meghatározásában elkerüljük a kísérleti hibák okozta eltéréseket, aS-értéket számolunk az SSS (aSSS), SUS (aSUS), SUU (aSUU) és UUU (aUUU) esetekre számolt a¹értékek súlyozott átlagaként.
(aSSS×SSS(%)+(aSUS×SUS(%))+(aSUU×SUU(%))+(aUUU×UUU(%)) aS=–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– (SSS(%)+SUS(%)+SUU(%)+UUU(%)) Ha a telített zsírsavak véletlenszerû eloszlást mutatnak a trigliceridmolekula sn¹1 és sn¹3 pozíciói között, akkor minden egyes zsírsav 50%-ban fordulhat elõ az egyes pozíciókban, ahol az optimum a maximális SUS trigliceridmolekula, ahol S a telített, és U a telítetlen zsírsavat jelenti. A 2. ábra a különbözõ TAG fajták arányát mutatja a napraforgóolajban növekvõ telített zsírsavtartalom mellett, és abban az esetben, amikor véletlenszerû eloszlás található az sn¹1 és sn¹3 pozíciók között. A görbék felvételéhez az a¹változót 0,5 értékre állítottuk, felhasználtuk a napraforgó telített zsírsavtartalmát az sn¹2 pozícióban (ÁlvarezOrtega és munkatársai, 1997) és növeltük a teljes telített zsírsavtartalmat az (i), (ii), (iii) és (iv) egyenletekben. Az olajra vonatkozó a¹koefficiens számolható úgy is, hogy kémiailag analizáljuk a TAG molekula három sn pozíciójában található zsírsavösszetételt. Ez az analízis megvalósítható például Laakso és Christie módszerével (1990) vagy Takagi és Ando módszerével (1991). Ezek a módszerek lehetõvé teszik a három sn pozíció zsírsavtartalmának megismerését, de nagy mennyiségû mintát igényel, és nem valósítható megy olyan kis mennyiségû mintán, mint például egy fél mag a találmány szerinti eljárás szerint. Ebben az esetben az egyenlet a következõ, ahol as jelentése a két érték közül a legkisebb érték, azzal a megszorítással, hogy ha mindkét érték 0,5, akkor a=0,5. æ S1 S3 ö ÷÷ aS = Minçç ; S + S S è 1 3 2 + S3 ø
20
25
30
35
40
45
Tanulmányoztuk ezt az eloszlást a TAG molekulában a létezõ napraforgóolajoknál. Az adatok a várakozásnak megfelelõen azt mutatják, hogy a telített zsírsavak (S) fõként a glicerinmolekula sn¹1 és sn¹3 pozí- 50 cióiban lokalizálódnak a normál és nagy telített zsírsavtartalmú napraforgóolajoknál, és nagyon kis mennyiségben fordulnak elõ az sn¹2 pozícióban. Ebben a pozícióban a várakozásoknak megfelelõen a fõ zsírsav olajsav és linolsav, ami összhangban van Ál- 55 varez-Ortega és munkatársai (1997) adataival is. Az acilcsoportok azonban nem az 1,3-véletlenszerû, 2¹véletlenszerû elmélet (Vander Wal, 1960) szerint oszlanak meg. A telített zsírsavak, a palmitinsav és sztearinsav nem egyenletesen oszlanak meg. Ezek 60 6
az eredmények megegyeznek a korábbi adatokkal (Reske és munkatársai, 1997), amelyek szerint az sn¹3 pozíció elõnyben részesül az sn¹1 pozícióhoz viszonyítva telített zsírsavaknál fõként akkor, ha a sztearinsav-tartalom nagyobb (11%), mint a forgalmazott napraforgónál, ahol ez az érték 4,8%. A sztearinsav-tartalomban és az olajsav/linolsav arányban eltérõ napraforgóolajok TAG eloszlását a nagy olajsavtartalomtól a nagy linolsavtartalom felé haladva a 3. ábra mutatja. Azt találtuk, hogy a napraforgó TAG fajták csoportjai esetén (SSS, SUS, SUU és UUU) különbözõ telített zsírsavtartalomnál az sn¹2 pozícióban érvényes összetételre és a teljes zsírsavtartalomra az 1,3véletlenszerû, 2¹véletlenszerû elmélet alapján kapott adatok alapján várt elméleti értékek eltérnek az analizált magokban talált TAG összetételektõl. A TAG összetételt GLC eljárással határozzuk meg, és ezekre a TAG fajtákra kapott adatokat a telítetlenség szintjére csoportosítjuk (Fernández-Moya és munkatársai, 2000). Mint a 3. ábra mutatja, a napraforgó telített zsírsavak egy aszimmetrikus eloszlást követnek a TAG molekulában, az SUU esetre kapott értékek mindig nagyobbak, mint a várt értékek, és az SUS és UUU esetekre kapott értékek alacsonyabbak, mint az sn¹1 és sn¹3 pozíciókban mutatott nemspecifikus eloszlás alapján várt értékek. Ezek az eredmények egyezést mutatnak továbbá a két molekula linolsavat és egy telített zsírsavat tartalmazó TAG fajtákat tartalmazó nagy sztearinsav-tartalmú napraforgómutánsokkal kapott korábbi eredményekkel, ahol nagyobb abundancia jelentkezett, mint ez az 1,3-véletlenszerû, 2¹véletlenszerû elmélet alapján várható (Fernández-Moya és munkatársai, 2000). Az SUU TAG fajták növekedése és az UUU TAG fajták csökkenése közvetlenül összefügg az olaj teljes sztearinsav-tartalmával. Számoltuk az sn¹1 és sn¹3 pozíciók közötti telített zsírsaveloszlás koefficiensét (a) a kontroll és nagy sztearinsav-tartalmú mutáns vonalaknál (4. táblázat). A koefficiens értéke mindig 0,19 és 0,37 közé esik akkor, ha a linolsavtartalom nagyobb, mint az olajsavtartalom, és 0,15 és 0,27 közé esik akkor, ha az olajsavtartalom nagyobb, mint a linolsavtartalom.
1
HU 008 478 T2
2
4. táblázat Sztearinsav-tartalom (18:0), teljes telített zsírsavtartalom (S), különbözõ TAG csoportok (SUS, SUU és UUU), és az a megoszlási koefficiens értéke különbözõ normál és mutáns napraforgóvonalaknál. Az RHA-274 vonal tulajdonosa az USDA–ARS, Northerm Crop Science Lab, Fargo, ND. A többi vonal tulajdonosa a Sunflower Collection of Instituto de la Grasa, CSIC, Seville, Spanyolország. A különbözõ zsírsavak mennyiségét a vonalakban az alábbiak szerint jelöljük: HS=nagy sztearinsav-tartalom; MS=közepes sztearinsav-tartalom; HL=nagy linolsavtartalom; HO=nagy olajsavtartalom. Vonal
Típus
18:0
S
11,7
SUS
SUU
UUU
a
RHA-274
normál
5
2,9
29,5
67,7
0,31
CAS-3
HSHL
25,6
37
28,6
48,9
21,6
0,33
CAS-29
HSHL
33,2
42
28,9
55,8
14,7
0,37
CAS-4
MSHL
12,9
20,3
8,3
44,5
47,3
0,29
HO
4,9
9,4
1,1
22,7
76,2
0,19
G-8 CAS-15
HSHO
23,4
33,5
19,3
61,9
18,8
0,23
DG-9
MSHO
19,1
29,8
16,8
55,6
27,5
0,27
Ennek megfelelõen továbbra is szükség van olyan napraforgóolajra, ahol a megoszlási koefficiens értéke 0,38 fölötti. A találmány összefoglalása A jelen találmány feladata olyan napraforgóolaj kidolgozása, amely közvetlenül nyerhetõ a teljes zsírsavtartalomra vonatkoztatva 12–40,8%, elõnyösen legalább 20% sztearinsav-tartalommal rendelkezõ napraforgómagokból, ahol az olajban a telített zsírsavakra vonatkozó a eloszlási koefficiens értéke a TAG molekula sn¹1 és sn¹3 pozíciói között legalább 0,28, elõnyösen legalább 0,32, és különösen elõnyösen 0,36, ahol az olajban az olajsavtartalom nagyobb, mint a linolsavtartalom, és a sztearinsav-tartalom legalább 12%, elõnyösen legalább 20% a teljes zsírsavtartalomra vonatkoztatva. A jelen találmány tárgya továbbá napraforgónövény, amely a fenti jellemzõkkel rendelkezõ endogén olajat tartalmazó magokat terem, és az ilyen napraforgónövények által termelt napraforgómagok. A jelen találmány további feladata olyan hibrid növények és ezek utódai kidolgozása, amelyek a fent említett telített zsírsaveloszlást mutatják az sn¹1 és sn¹3 pozíciók között, és további elõnyös jellemzõkkel rendelkeznek.
25
30
35
40
45
A találmány részletes ismertetése A találmány tárgya tehát napraforgóolaj, amely közvetlenül nyerhetõ a teljes zsírsavtartalomra vonatkoz- 50 tatva 12–40,8% sztearinsav-tartalommal rendelkezõ napraforgómagokból, ahol az olajban az olajsavtartalom nagyobb, mint a linolsavtartalom, azzal jellemezve, hogy a telített zsírsavakra vonatkozó a eloszlási koefficiens értéke az sn¹1 és sn¹3 pozíciók között legalább 55 0,28, amely magok nyerhetõk úgy, hogy olyan napraforgónövényeket termesztünk, amelyek „nagy olaj, nagy sztearin” vonalú napraforgómagokból származnak, olyan napraforgónövényeket termesztünk, amelyek PTA-5041 ATCC deponálási számú CAS¹36 nap- 60 7
raforgómagokból származnak, a vonalakat keresztezzük, és így F1 magokat állítunk elõ, és a magokat betakarítjuk, F2 magokat állítunk elõ, és szelektáljuk a több mint 0,28 a¹értékkel rendelkezõ, nagy sztearinsav-tartalmú, és a linolsavtartalomnál nagyobb olajsavtartalommal rendelkezõ magokat, ahol az a koefficienst az alábbi képlettel számoljuk: æ S1 S3 ö ÷÷, aS = Minçç ; S + S S è 1 3 1 + S3 ø
ahol S, jelentése a telített zsírsavtartalom a TAG sn¹1 pozícióban, S3 jelentése a telített zsírsavtartalom a TAG sn¹3 pozícióban, és aS jelentése a két érték közül a legkisebb érték, azzal a megszorítással, hogy ha mindkét érték 0,5, akkor a=0,5. A telített zsírsavakra vonatkozó a eloszlási koefficiens értéke az sn¹1 és sn¹3 pozíciók között elõnyösen legalább 0,32, különösen elõnyösen legalább 0,36. A találmány tárgya továbbá napraforgónövény, amely fent definiált endogén olajat tartalmazó magokat terem, valamint az ilyen növények által termelt magok. Ismertetésre kerül továbbá egy eljárás egy növény elõállítására, amely olyan magokat termel, amelyek a teljes zsírsavtartalomra vonatkoztatva legalább 12% sztearinsav-tartalommal rendelkezik, és ahol az olajsavtartalom nagyobb, mint a linolsavtartalom, és ahol a telített zsírsavakra vonatkozó a eloszlási koefficiens értéke az sn¹1 és sn¹3 pozíciók között legalább 0,28, mely eljárás tartalmazza a következõ lépéseket: a) gondoskodunk olyan magokról, amelyek olyan olajat tartalmaznak, amelyben a teljes zsírsavtartalomra vonatkoztatott sztearinsav-tartalom legalább 12%, ahol az olajsavtartalom nagyobb, mint a linolsavtartalom; b) gondoskodunk olyan magokról, amelyek olyan olajat tartalmaznak, ahol az olajban az a eloszlási koefficiens értéke nagyobb, mint 0,28; c) az a) és b) lépés szerinti magokból származó növényeket keresztezzük; d) betakarítjuk az F1 utódmagokat;
1
HU 008 478 T2
e) az F1 utódmagokat elültetve növényeket termesztünk; f) a növényeken önbeporzást végzünk, és így F2 magokat állítunk elõ; g) a magokat ellenõrizzük a következõ jellemzõkre: a sztearinsav-tartalom legalább 12%, az olajsavtartalom nagyobb, mint a linolsavtartalom, és az a eloszlási koefficiens értéke legalább 0,28; h) a megfelelõ szintû sztearinsav¹, olajsav- és linolsavtartalommal és a eloszlási koefficienssel rendelkezõ magokat elültetve növényeket termesztünk; i) a növényeken önbeporzást végzünk, és így F3 magokat állítunk elõ; és g) adott esetben a g), h) és i) lépéseket megismételjük a kívánt szintû sztearinsav¹, olajsav- és linolsavtartalom és a eloszlási koefficiens állandósulásáig. Azokról a magokról, amelyek az olajban legalább 12% sztearinsav-tartalommal rendelkeznek, az alábbiak szerint gondoskodunk: a) napraforgómagokat, amelyek kevesebb mint 12% sztearinsav-tartalommal rendelkeznek, mutagén ágenssel, elõnyösen nátrium-aziddal vagy egy alkilezõszerrel, különösen elõnyösen etil-metánszulfonáttal kezelünk; b) ezekbõl növényeket termesztünk, és ezek beporzásával magokat állítunk elõ; c) a magokat a kívánt sztearinsav-tartalomra analizáljuk; d) gondoskodunk olyan magokról, amelyek olyan olajat tartalmaznak, ahol az olajsavtartalom nagyobb, mint a linolsavtartalom; e) a c) lépés szerinti magokból és a d) lépés szerinti magokból származó növényeket keresztezzük; f) betakarítjuk az F1 utódmagokat; g) az így termesztett növényeken önbeporzást végzünk, és így F2 magokat állítunk elõ; h) a magokon vizsgáljuk a következõ jellemzõket: a sztearinsav-tartalom legalább 12%, és az olajsavtartalom nagyobb, mint a linolsavtartalom; i) a kívánt szintû sztearinsav¹, olajsav- és linolsavtartalommal rendelkezõ magokat elültetjük; j) az így termesztett növényeken önbeporzást végzünk, és így F3 magokat állítunk elõ; és
5
10
15
20
25
30
35
40
2
k) adott esetben a h), i) és j) lépéseket megismételjük a kívánt szintû sztearinsav¹, olajsav- és linolsavtartalom állandósulásáig. Az olyan magokról, amelyek olyan olajat tartalmaznak, ahol a telített zsírsavakra vonatkozó a eloszlási koefficiens értéke az sn¹1 és sn¹3 pozíciók között legalább 0,38, az alábbiak szerint gondoskodunk: a) napraforgómagokat, ahol az a eloszlási koefficiens értéke kisebb mint 0,38, mutagén szerrel, elõnyösen nátrium-aziddal vagy egy alkilezõszerrel, különösen elõnyösen etil-metánszulfonáttal kezelünk; b) ezekbõl növényeket termesztünk, amelyekbõl beporzás után magokat állítunk elõ; c) a magokat a kívánt a eloszlási koefficiens értékre analizáljuk; d) adott esetben a b) és c) lépéseket megismételjük. A találmány további tárgyát képezik az olyan hibrid növények, amelyek elõállíthatók a fent ismertetett eljárásokból származó elsõ szülõnövény és kívánt tulajdonságokkal rendelkezõ második szülõnövény keresztezésével, és kiterjed továbbá a hibrid növény utódaira. Második szülõnövényként alkalmazható a fenti eljárásokkal elõállított növény is. A találmány további tárgyát képezi az olaj alkalmazása élelmiszerek elõállítására, valamint az olajjal elõállított vagy az olajat tartalmazó élelmiszerek. Ismertetésre kerül továbbá egy új típusú napraforgómutáns, amely jobb a eloszlást mutat, mint a korábbi napraforgóvonalak. Ezért ez a mutáns jobb tulajdonságokkal rendelkezik margarin, kenhetõ termékek és hasonlók elõállítása szempontjából, mint a jelenleg hozzáférhetõ vonalak (3. ábra). Margarinhoz a legjobb trigliceridek a „telített, telítetlen, telített” típusú (SUS) trigliceridek, elsõsorban a „telített, olajsav, telített” (SOS) típusú triglicerid. Ezt az új mutáns vonalat, melynek neve CAS¹36, technológiai módszerekkel állítottuk elõ, és az ATCC gyûjteményben deponáltuk, ahol a PTA-5041 számot kapta. Ez a mutáns a véletlenszerû elmélet alapján a legjobb TAG eloszlást mutatja. Néhány CAS¹36 növénybõl származó magok mintájából nyert olaj adatait az 5. táblázatban foglaljuk össze.
5. táblázat Sztearinsav-tartalom, teljes telített zsírsavtartalom (S), olajsav/linolsav arány (O/L), különbözõ TAG csoportok és az a eloszlási koefficiens értéke néhány mutáns CAS¹36 növénynél Növény
18:0
S
O/L
a
TAG csoport SUS
SUU
UUU
CAS-36-A
28,5
37,7
0,95
32,4
41,8
23,7
0,5
CAS-36-B
28,4
38,8
0,15
35,1
46,2
18,7
0,5
CAS-36-D
31,2
39,7
0,93
35,8
44,8
18,4
0,5
CAS-36-E
38,2
47,7
0,06
49,3
44,7
6,1
0,45
Az US 6,475,548 számú irat egy összehasonlítást ismertet a WO 95/20313 szerinti kezeletlen olajjal elõ- 60 8
állított referencia kenhetõ termék és a WO 95/20313 szerinti olaj sztearinfrakciójával elõállított margarin kö-
1
HU 008 478 T2
zött. A sztearinfrakcióval elõállított termék láthatóan jól kenhetõ a hûtõszekrény hõmérsékletéhez közeli hõmérsékleteken, megfelelõen olvad a szájban és jó stabilitással rendelkezik. Egy ilyen zsírkeverék teljesítménye láthatóan az ismert jó minõségû zsírkészítmények teljesítményéhez hasonló anélkül, hogy mesterséges komponenseket, így például hidrogénezett zsírt tartalmazna. Általánosan ismert, hogy a zsírok sztearinfrakciói alkalmazhatók kenhetõ termékek zsírfázisában a kenhetõ termék elõállításával kapcsolatos problémák megoldására. Így például az US 4,438,149 legfeljebb 70% vajzsírt tartalmazó zsírfázissal elõállított kenhetõ terméket ismertet. Ez a termék konzisztenciájában túl lágy. Ha azonban a zsír sztearinfrakcióját alkalmazzuk, akkor kevésbé költséges és jobban kenhetõ termék állítható elõ. Az US 6,475,548 eljárást ismertet folyékony növényi olaj vagy kenhetõ termékek strukturálására alkalmas triglicerid elõállítására. A triglicerid elõállításához egy nagy sztearinsav-tartalmú és nagy olajsavtartalmú napraforgóolajat (HSHOSF) alkalmaznak, amely legalább 12 tömeg% sztearinsav-maradékot és legalább 40 tömeg% olajsavmaradékot tartalmaz, és amit nedves frakcionálásnak vagy száraz frakcionálásnak vetnek alá, és összegyûjtik a sztearinfrakciót. Az irat leírja továbbá, hogy a zsírkeverék sztearinfrakciója úgy állítható elõ, hogy a kiinduló HSHOSF olajat standard körülmények között frakcionálják nedves vagy száraz frakcionálással. A >30 tömeg% SUS és <40 tömeg% SUU triglicerideket tartalmazó frakciót összegyûjtik, és a frakcionálást leállítják, amikor az elsõ 25 tömeg% szilárd zsír kristályosodik. A jelen találmány ugyanígy felhasználható trigliceridzsír elõállítási eljárásában nagy sztearinsav-tartalmú és nagy olajsavtartalmú napraforgóolaj (HSHOSF) nedves frakcionálásával vagy száraz frakcionálásával, majd a sztearinfrakció összegyûjtésével. A trigliceridzsír elõállítását elõnyösen olyan nagy sztearinsav-tartalmú, nagy olajsavtartalmú napraforgóolajjal (HSHOSF) végezzük, ahol a teljes zsírsavtartalomra vonatkoztatott sztearinsav-tartalom legalább 12%, és a telített zsírsavakra vonatkozó a eloszlási koefficiens értéke az sn¹1 és sn¹3 pozíciók között legalább 0,28, amit nedves frakcionálásnak vagy száraz frakcionálásnak vetünk alá, majd a sztearinfrakciót összegyûjtjük. Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra a triglicerid bioszintézisének útvonalát mutatja. A 2. ábra napraforgó TAG típusok elméleti eloszlását mutatja növekvõ telített zsírsavtartalom mellett, ahol az a koefficiens értéke 0,5. A TAG nómenklatúrára lásd az ábra magyarázatát. A 3. ábra a trigliceridek (TAG) eloszlását mutatja nagy olajsavtartalomra és nagy sztearinsav-tartalomra szelektált magokban a telített zsírsavtartalom függvényében. A kontrollként szolgáló elméleti eloszlást
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
jelzik a vonalak, és a különbözõ olajminták eloszlását a szimbólumok ábrázolják a TAG nómenklatúrára megadott magyarázat szerint. A találmányt közelebbrõl az alábbi példákkal mutatjuk be, amelyek nem jelentik a találmány korlátozását. Példák Bevezetés A találmány tárgya eljárás olyan napraforgómagok elõállítására, amelyek a telített zsírsavakra vonatkozóan a különbözõ triglicerid molekulatípusokban jobb eloszlással rendelkeznek, mint a vad típusú magok. Az eljárás egyik lépésében szülõmagokat egy mutagén szerrel kezelünk meghatározott ideig és a triglicerid bioszintézisben részt vevõ génekben egy vagy több mutáció kiváltásához szükséges koncentrációban. Ennek eredménye az SUS típusú trigliceridtípusok megnövelt termelése és az SUU típus alacsonyabb tartalma. Az ilyen mutagén szerekre példaként említhetõk az olyan szerek, mint a nátrium-azid vagy egy alkilezõszer, így például etil-metánszulfonát, de alkalmazható minden olyan más mutagén szer, amely azonos vagy hasonló hatást vált ki. A kezelt magok öröklõdõ genetikai elváltozást tartalmaznak. Az ilyen mutált magokat ezután csíráztatjuk, és ezekbõl utódnövényeket termesztünk. A tulajdonságnak a vonalon belül történõ kifejlesztéséhez az utódokon keresztezés vagy önbeporzás végezhetõ. Az utódmagokat összegyûjtjük és analizáljuk. A közel véletlenszerû vagy véletlenszerû triglicerid jellemzõvel rendelkezõ magokat ezután tetszõleges más vonalakkal keresztezzük, és a jellemzõt továbbvisszük. Adott esetben a csíráztatás, termesztés és önbeporzás további ciklusait végezzük, és így állandósítjuk a jellemzõk homozigóta jellegét a vonalakban és ezután keresztezést végzünk, és a magokat összegyûjtjük. Az etil-metánszulfonátot mutagén szerként alkalmazzuk az 1. példában. Így olyan napraforgóvonalat kapunk, ahol az a¹érték nagyobb mint 0,4. A mutációhoz használt eredeti napraforgó-szülõvonal a CAS¹10 (Sun-flower Collection of Instituto de la Grasa, CSIC, Seville, Spanyolország). A vonal olajának a¹értéke kisebb, mint 0,38. Az alkalmazott nagy olajsavtartalmú anyag Oroszországban kifejlesztett olajsavtartalmú vonalakból (Soldatov, 1976) származik, ahol az a¹érték 0,15 és 0,27 közötti. Az alkalmazott nagy olajsavtartalmú és nagy sztearinsav-tartalmú anyag a nagy olajsavtartalmú vonal mutáns CAS¹3 vonal, az ATCC gyûjteményben 75968 szám alatt deponálva, keresztezésébõl és nagy olajsavtartalmú és nagy sztearinsav-tartalmú magok szelektálásából származik a WO 0074470 „High oleic high stearic plants, seeds and oils” számú irat szerint. A következõ példákban bemutatjuk az olyan, nagy a¹értékkel rendelkezõ növények elõállítására alkalmas eljárást, ahol nagyobb a linolsavtartalom, mint az olajsavtartalom, és fordítva.
1
HU 008 478 T2
1. példa Magokban 70 mmol/l, vízben felvett etil-metánszulfonát- (EMS) oldattal mutációt váltunk ki. A kezelést szobahõmérsékleten végezzük 2 órán keresztül rázás (60 fordulat/perc) mellett. A mutagenezis után az EMS 5 oldatot eltávolítjuk, és a magokat 16 órán keresztül vezetékes vízzel mossuk. A kezelt magokat szabadföldön csíráztatjuk, és a növényeken önbeporzást végzünk. A növényekrõl begyûjtött magokat alkalmazzuk módosított triglicerideloszlás- 10 sal rendelkezõ új napraforgóvonalak szelektálásához. Gáz-folyadék kromatográfiásan Garcés, R. és Mancha, M. módszerével (1993) meghatározzuk a magok zsírsav-
2
összetételét és Fernández-Moya és munkatársai módszerével (2000) meghatározzuk a triglicerid-összetételt. Szelektálunk egy elsõ növényt, ahol az a¹érték 0,42. Az utódot öt generáción keresztül termesztjük, ahol az a¹érték növekszik, és az új genetikai jellemzõ stabilan állandósul a mag genetikai anyagában. A vonal jele CAS¹36, és linolsav-tartalma nagyobb, mint az olajsavtartalom. A vonal minimális és maximális a¹értéke rendre 0,38 és 0,5. A 6. táblázat különbözõ CAS¹36 növények magjának néhány analitikai adatát tartalmazza az a¹érték megadott egyenlettel történõ kiszámításához szükséges adatokkal együtt.
6. táblázat Zsírsav, teljes telített (S) és telített összetétel a TAG sn¹2 pozícióban (S2) és TAG összetétel és az egyenlet alapján számolt a¹érték néhány CAS¹36 olajban CAS¹36 növény Vonal
Zsírsav (mol%) 16:0
18:0
18:1
18:2
20:0
BU-59
8,32
28,49
30,42
31,9
0,88
CB-71
6,09
28,94
28,14
34,57
1,3
CB-88
6,3
25,03
41,5
25,73
CB-79
7,63
23,88
32,15
34,02
TAG (mol%) SUS
SUU
UUU
aSat
2,17
32,38
41,79
23,66
0,5
0,85
32,61
44,1
22,44
0,5
3,65
0
24,41
49,47 126,12
0,45
3,76
0
26,1
49,28
0,46
S
S2
0
37,69
4,16
0,96
37,29
4,12
0,9
0,54
32,77
1,3
1,01
33,83
2. példa Napraforgónövényeket termesztünk a 2. táblázatban megadott vonalakhoz hasonló nagy olajsavtartalmú és nagy sztearinsav-tartalmú napraforgóvonalak magjaiból. Ugyancsak napraforgónövényeket termesztünk CAS¹36 napraforgóvonal magjaiból. A vonalakat keresztezzük. A növényeken mesterséges beporzást végzünk a megfelelõ magtermelés biztosításához. A nagy olajsavtartalmú és nagy sztearinsav-tartalmú vonalakon, vagy fordítva kapott F1 magokat betakarítjuk. Olyan F2 magokat szelektálunk, ahol az a¹érték nagyobb mint 0,28, és nagy a sztearinsav-tartalom, és nagyobb az olajsavtartalom, mint a linolsavtartalom. Így jelen találmány szerinti olajat kapunk, de a kitermelés korlátozott. Ezért ilyen a¹értékkel rendelkezõ magokat biztosító beltenyésztett vonalakat kell állandósítani. Az ilyen, homozigóta jelleggel állandósított, nagy olajsavtartalmú, nagy sztearinsav-tartalmú beltenyésztett vonalak ezután keresztezhetõk a jelen találmány
22:0
30
35
40
45
SSS
24,62
szerinti kívánt olajat tartalmazó F2 magok elõállítására alkalmas hibrid mag kialakításához. Ehhez az F1 magokat elültetjük, és a kapott növényeken önbeporzást végzünk, izolált körülmények között, és így F2 magokat állítunk elõ. Az F2 magokon vizsgáljuk az a¹értéket. A kívánt jellemzõvel rendelkezõ magok megmaradó részébõl növényeket termesztve F3 magokat állítunk elõ. Az önbeporzás és analizálás és szelektálás mûveletét ismételve állandósult homozigótavonalat fejlesztünk ki, ahol az a¹érték nagyobb mint 0,28, és mindegyiknél az a¹érték 0,5 vagy közel 0,5. A jellemzõk állandósulása után hasonló nagy olajsavtartalmú vonalakat keresztezünk a 7. táblázatban megadott jellemzõkkel rendelkezõ hibrid mag elõállításához. A találmány értelmében biotechnológiai eljárással olyan napraforgónövényeket és ¹magokat állítunk elõ, amelyekbõl a kívánt olaj extrahálható. Az a¹értéktartalom egy öröklõdõ jellemzõ, és messzemenõen független a termesztési körülményektõl.
7. táblázat Sztearinsav-tartalom (18:0), teljes telített zsírsavtartalom (S), olajsav/linolsav arány (O/L), egyes TAG típusú és a eloszlási koefficiens értéke CAS¹36 mutáns vonal és CAS¹15 vagy CAS¹24 nagy sztearinsav-tartalmú vonalak (2. táblázat) keresztezésével kapott vonalaknál. Az O/L által megadott olajsav/linolsavtartalom arány >1, mert a szelektált vonalaknál az olajsavtartalom nagyobb, mint a linolsavtartalom Napraforgóvonal
18:0
S
HO1
33,5
HO2 HO3
aSat
O/L
SUS
SUU
UUU
45,8
2,48
47,5
42,3
10,2
0,49
25,4
35
1,45
28,5
47,8
23,6
0,5
22,8
33,8
1,05
26,7
47,8
25,5
0,5
10
1
HU 008 478 T2
2
7. táblázat (folytatás) 18:0
S
O/L
SUS
SUU
UUU
aSat
HO4
20,2
28,2
10,91
18,8
47
34,2
0,5
HO5
29,8
38,9
1,48
36,4
44
19,6
0,5
HO6
40,8
51
1,7
54,3
38,6
5,1
0,47
HO7
31
42,3
6,19
37,8
51,3
10,9
0,41
HO8
28,6
36,6
1,8
27,8
54,2
18
0,35
Napraforgóvonal
Irodalmi hivatkozások 1. Álvarez-Ortega. R., Cantisán, S., Martínez-Force, E. és Garcés, R.: „Characterization of polar and nonpolar seed lipid classes from highly saturated fatty acid sunflower mutants”, Lipids 32, 833–837 (1997). 2. Chow, C. K.: „Fatty acids in foods and their health implications”, Marcel Dekker, New York (1992). 3. Fernández-Moya, V., Martínez-Force, E. és Garcés, R.: „Identification of triacylglycerol species from high-saturated sunflower (Helianthus annuus) mutants”, Agric. Food Chem. 48, 764–769 (2000). 4. Garcés, R. és Mancha, M.: „One-step lipid extraction and fatty acid methyl esters preparation from fresh plant tissues”, Anal. Biochem. 211, 139–143 (1993). 5. Gunstone, F. D. Harwood, J. L. és Padley, F. B.: „The Lipid Handbook”, Chapman and Hall, London (1994). 6. Laakso, P. és Christie, W. W.: „Chromatographic resolution of chiral diacylglycerol derivatives: potential in the stereo-specific analysis of triacyl-sn-glycerols”, Lipids 25, 349–353 (1990). 7. Osorio, J., Fernández-Martínez, J., Mancha, M. és Garcés, R.: „Mutant sunflowers with high concentration of saturated fatty acids in the oil”, Crop Sci. 35, 739–742 (1995). 8. Reske, J., Siebrecht, J. és Hazebroed, J.: „Triacylglycerol composition and structure in genetically modified sunflower and soybean oils”, J. Am. Oil Chem. Soc. 74, 989–998 (1997). 9. Takagi, T. és Ando, Y.: „Stereospecific analysis of triacyl-sn-glycerols by chiral HPLC”, Lipids 26, 542–547 (1991). 10. Vander Wal, R. J.: „Calculation of the distribution of the saturated and unsaturated acyl groups in fats, from pancreatic lipase hydrolysis data”, J. Am. Oil Chem. Soc. 37, 18–20 (1960). 11. Soldatov, K. I.: „Chemical mutagenesis in sunflower breeding”, 352–357, Proc. 7., Int. Sunflower Association, Vlaardingen, Hollandia (1976).
15
20
25
30
35
40
45
50
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 55 1. Napraforgóolaj, amely közvetlenül nyerhetõ a teljes zsírsavtartalomra vonatkoztatva 12–40,8% sztearinsav-tartalommal rendelkezõ napraforgómagokból, ahol az olajban az olajsavtartalom nagyobb, mint a linolsavtartalom, azzal jellemezve, hogy a telített zsírsavakra 60 11
vonatkozó a eloszlási koefficiens értéke az sn¹1 és sn¹3 pozíciók között legalább 0,28, amely magok nyerhetõk úgy, hogy olyan napraforgónövényeket termesztünk, amelyek „nagy olaj, nagy sztearin” vonalú napraforgómagokból származnak, olyan napraforgónövényeket termesztünk, amelyek PTA-5041 ATCC deponálási számú CAS¹36 napraforgómagokból származnak, a vonalakat keresztezzük, és így F1 magokat állítunk elõ, és a magokat betakarítjuk, F2 magokat állítunk elõ, és szelektáljuk a több mint 0,28 a¹értékkel rendelkezõ, nagy sztearinsav-tartalmú, és a linolsavtartalomnál nagyobb olajsavtartalommal rendelkezõ magokat, ahol az a koefficienst az alábbi képlettel számoljuk: æ S1 S3 ö ÷÷ aS = Minçç ; S + S S è 1 3 1 + S3 ø
ahol S1 jelentése a telített zsírsavtartalom a TAG sn¹1 pozícióban, S3 jelentése a telített zsírsavtartalom a TAG sn¹3 pozícióban, és aS jelentése a két érték közül a legkisebb érték, azzal a megszorítással, hogy ha mindkét érték 0,5, akkor a=0,5. 2. Az 1. igénypont szerinti napraforgóolaj, azzal jellemezve, hogy a telített zsírsavakra vonatkozó a eloszlási koefficiens értéke az sn¹1 és sn¹3 pozíciók között legalább 0,32. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti napraforgóolaj, azzal jellemezve, hogy a telített zsírsavakra vonatkozó a eloszlási koefficiens értéke az sn¹1 és sn¹3 pozíciók között legalább 0,36. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti napraforgóolaj, azzal jellemezve, hogy a teljes zsírsavtartalomra vonatkoztatott sztearinsav-tartalom legalább 20%. 5. Napraforgónövény, amely az 1–4. igénypontok szerinti endogén olajat tartalmazó magokat terem. 6. Napraforgómagok, amelyeket az 5. igénypont szerinti napraforgónövények termelnek. 7. Hibrid napraforgónövény, melynek magjai olyan endogén olajat tartalmaznak, amelyben a sztearinsavtartalom 12–40,8% a teljes zsírsavtartalomra vonatkoztatva, és ahol az olajban az olajsavtartalom nagyobb, mint a linolsavtartalom, és a telített zsírsavakra vonatkozó a eloszlási koefficiens értéke az sn¹1 és sn¹3 pozíciók között legalább 0,28, ahol a növény elõállítható egy 5. igénypont szerinti elsõ szülõnövény és egy, a kívánt tulajdonságokkal rendelkezõ második szülõnövény keresztezésével. 8. A 7. igénypont szerinti hibrid napraforgónövény, amely elõállítható egy elsõ szülõnövény, amely 5. igénypont szerinti növény, és egy második szülõnö-
1
HU 008 478 T2
vény, amely eltérõ kívánt tulajdonságokkal rendelkezõ 5. igénypont szerinti növény, keresztezésével. 9. Az 5. és 7–8. igénypontok bármelyike szerinti napraforgónövény utóda, melynek magjai olyan endogén olajat tartalmaznak, amelyben a sztearinsav-tartalom 12–40,8% a teljes zsírsavtartalomra vonatkoztatva, és ahol az olajban az olajsavtartalom nagyobb,
5
12
2
mint a linolsavtartalom, és a telített zsírsavakra vonatkozó a eloszlási koefficiens értéke az sn¹1 és sn¹3 pozíciók között legalább 0,28. 10. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti napraforgóolaj élelmiszerek elõállítására. 11. Élelmiszer, amely az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti napraforgóolajat tartalmaz.
HU 008 478 T2 Int. Cl.: A01H 5/10
13
HU 008 478 T2 Int. Cl.: A01H 5/10
14
HU 008 478 T2 Int. Cl.: A01H 5/10
15
Kiadja a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
