!HU000003759T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 003 759
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 05 728073 (22) A bejelentés napja: 2005. 03. 24. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050728073 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1727890 A1 2005. 10. 06. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1727890 B1 2008. 05. 14.
(51) Int. Cl.: C12N 1/19 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05093041 PCT/SE 05/000453
(30) Elsõbbségi adatok: 0400816 2004. 03. 26.
(73) Jogosult: Scandinavian Technology Group AB, Ideon 223 70 Lund (SE)
SE
(72) Feltalálók: GORWA-GRAUSLUND, Marie-Françoise, SE-218 53 Klagshamn (SE); JEPPSON, Marie, S-245 32 Staffanstorp (SE) (54)
(74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Mutált xilóz-reduktáz S. Cerevisiae által végzett xilózfermentációban
(57) Kivonat
HU 003 759 T2
Új xilózhasznosító Saccharomyces cerevisiae mutáns törzs, amely xilózt fermentál etanollá, és amely törzs expresszálja a K270M mutált P. stipitis XYL1 gént (a
mutáns gén 1 vagy 2 kópiáját) együttesen a natív P. stipitis XYL2 génnel és túltermeli az endogén XKS1 gént.
A leírás terjedelme 10 oldal (ezen belül 1 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 003 759 T2
Mûszaki terület A találmány tárgya xilózt etanollá fermentáló javított tulajdonságú Saccharomyces cerevisiae törzs. A találmány háttere A Saccharomyces cerevisiae hatékonyan termel etanolt hexózokból, de a xilózfelhasználásra képes rekombináns S. cerevisiae törzseknek szükséges növelni a szubsztráttartományukat a lignocellulóz-hidrolizátumokra. A Pichia stipitis XYL1 és XYL2 génjeinek, amelyek a xilóz-reduktázt (XR) és a xilitol-dehidrogenázt (XDH) kódolják és az endogén XKS1 xilulokináz (XK) kódoló génnek az integrációjával, stabil xilózt fermentáló S. cerevisiae törzseket kaptunk. Azonban a különbözõ kofaktor, NAD(P)H-függõ XR és szigorúan NAD+-függõ XDH alkalmazás eredményeként xilitol választódik ki. A kettõs kofaktor felhasználása miatt a P. stipitis eredetû XR¹t részesítettük elõnyben a xilózfermetáló rekombináns S. cerevisiae törzsek konstrukciója során. Jelenleg semelyik ismert XR sem képes a xilózt xilitollá redukálni NADH, mint egyedüli kofaktor alkalmazásával. A természetes xilózhasznosító élesztõk közül a Candida utilis kizárólag NADPH¹t alkalmaz, míg a C. shehatae, P. segobiensis, P. stipitis és Pachysolen tannophilus XR¹ek NADPH¹t és NADH¹t is alkalmaznak a xilóz xilitollá történõ redukciójában. A C. parapsilosis XR szintén alkalmazza a NADPH¹t és a NADH¹t is a xilóz redukciójára, de a többi élesztõvel szemben ez a NADH¹t részesíti elõnyben. Csak azok az élesztõk mutatnak szignifikáns alkoholos fermentációt, amelyek NADH-kapcsolt xilóz-reduktáz-aktivitással bírnak. A rekombináns xilózfermentáló S. cerevisiae törzsek etanolhozama messze van a 0,51 g g–1 elméleti maximumtól, részben azért mert az elfogyasztott xilóz szignifikáns része xilitolként kiválasztódik. A xilitoltermelést a P. tannophilusban csökkentették hidrogénakceptorok hozzáadásával. Ezek a vegyületek visszaoxidálták a NAD+¹t, amely szükséges az XDH reakcióban. Rekombináns S. cerevisiae törzsben már lecsökkentették a xilitolkialakulást acetoin, furfurol és acetaldehid hozzáadásával. A xilitoltermelés szintén csökkenthetõ a kofaktor NADPH-ról NADP¹re történõ váltásával az XR lépésben. Ezt úgy érték el, hogy az intracelluláris NADPH készletet lecserélték az oxidatív pentóz-foszfát-útvonal („pentose phosphate pathway, PPP) fluxus blokkolásával vagy csökkentésével a glükóz-6-foszfátdehidrogenáz-aktivitás módosítása révén. Ez javított etanolhozamot eredményezett a lecsökkent glükózon történõ növekedési sebesség és a lecsökkent xilózfelhasználási sebesség árán. AZ XR NADPH felé mutatott affinitásának csökkentésére az XYL1 génen helyspecifikus mutagenezist vé-
5
10
15
20
25
30
2
geztek (Zhang és Lee, 1997, Site-directed mutagenesis of the cystein residues in the Pichia stipitis xylose reductase. FEMS Microbiol Lett 147: 227–232, és Kostrzynska és munkatársai 1998, Mutational analysis of the role of the conserved lysine270 in the Pichia stipitis xylose reductase, FEMS Microbiol Lett. 159: 107–112). Az XR¹en végzett kémiai módosítási vizsgálatok azt mutatták, hogy a cisztein és hisztidin aminosavak érintettek lehetnek a NADPH kötésben. Azonban a három cisztein aminosav (Cys19, Cys27 és Cys130) szerinre történõ mutációja kevesebb mint négyszeresére növelte a látszólagos Km¹értéket a NADPH¹ra, amely azt jelezte, hogy ezen cisztein aminosavak egyike sem volt érintett közvetlenül a NADPH kötésben. 17¹szer kisebb affinitást értek el a NADPH¹ra, amikor a XYL1 gén a K270M (lizin metionin) mutációt hordozta, miközben az affinitás a NADHhoz nem változott. Az egyetlen különbség a NADPH és a NADH között a foszfátcsoport jelenléte a NADPHban, és azt sugallták, hogy a Lys270 a NADPH foszfátcsoportjához kötõdik. Próbálkoztak az XDH kofaktor specifikusságának NADP+ irányába történõ változtatásával is. Thermoanaerobium brockii eredetû NADP+-felismerési szekvenciát vittek be a XYL2 génbe, amely azonos látszólagos Km¹értéket eredményezett a NAD+ és a NADP+ esetében. Azonban ezt a lecsökkent NAD+-specifikusság árán érték el, miközben a NADP+-specifikusság nem változott. Nem számoltak még be a mutált XYL2 gén által irányított xilózos növekedésrõl, ha együtt expresszálódott a XYL1 génnel S. cerevisiaeben xilóz etanolos fermentációja során.
A találmány összefoglalása A találmány tárgyát képezik új Saccharomyces cerevisiae törzsek, amelyek K270M mutált P. stipitis XYL1 gént (Kostrzynska és munkatársai, 1998) expresszálnak két különbözõ szinten a natív P. stipitis XYL2 génnel és a túltermelt endogén XKS1 génnel 40 együtt. A törzseket összehasonlítottuk olyan törzsekkel, amelyek a natív P. stipitis XYL1 gént XYL2 és XKS1 génekkel együtt expresszálták a xilózfogyasztás és az etanolfermentáció szempontjából. 35
Anyagok és módszerek Törzsek Alklónozásra Escherichia coli DH5a (Life Technologies, Rockville, MD, USA) törzset alkalmaztunk. Az összes törzset 20%¹os glicerinben tároltuk –80 °C¹on. 50 Frissen szélesztett YPD lemezekrõl származó élesztõsejteket alkalmaztunk az innokulációra. Az élesztõ törzseket az 1. táblázatban soroljuk fel. 45
1. táblázat A kutatás során alkalmazott élesztõtörzsek Törzsek
TMB3001
Releváns genotípus
CEN.PK 113–7A (MATa his3-D1 MAL2–8c SUC2) his3::Yip XR/XDH/XK
2
Releváns fenotípus
Hivatkozás
XR, XDH és XK fehérjét termel
(1)
1
HU 003 759 T2
2
1. táblázat (folytatás) Törzsek
Releváns genotípus
Releváns fenotípus
Hivatkozás
TMB3260
TMB3001 XYL1:: pB3 PGK XYL1
XR túltermelõ
(2)
TMB3265
CEN.PK 113–11C (MATa his3-D1 ura3–52 MAL2–8c SUC2) his3:: YIpXDH/XK
XDH és XK fehérjét termel
(3)
TMB3270
TMB3265 ura3::YIplac211 PGK XYL1 (K270M)
Mutált XR¹t termel
Ez a munka.
TMB3271
TMB3270 XYL1:: pB3 PGK XYL1 (K270M)
Mutált XR túltermelõ
Ez a munka.
Nukleinsav manipuláció A plazmid DNS¹t a BioRad Plasmid Miniprep Kit (Hercules, CA, USA) készlettel állítottuk elõ. A restrikciós és módosító enzimeket a Fermentas (Vilnius, Litvánia) cégtõl szereztük be. A QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Németország) készletet alkalmaztuk az agarózból történõ DNS-extrakciókhoz. Transzformáció Kompetens E. coli DH5a sejteket transzformáltunk Inoue-eljárásával. Az élesztõ transzformációt a lítiumacetát eljárás alkalmazásával végeztük. Élesztõsejteket inkubáltunk éjszakán át YPD tápközegben, mielõtt szelektív tápközegre szélesztettük õket. Az E. coli transzformánsokat Luria-Bertani (LB) lemezeken szelektáltuk 100 mg ampicillinnel (IBI Shelton Scientific Inc., Shelton, CT, USA). Az S. cerevisiae transzformánsokat aminosav nélküli Yeast Nitrogén Base (Difco, Sparks, MD, USA) táptalajjal szelektáltuk, amely 20 g l–1 glükózt és 50 mg l–1 uracilt tartalmazott vagy YPD lemezeken 100 mg ml–1 zeocinnel (Invitrogen, Groningen, Hollandia). Az új TMB3270 törzs konstrukciója Kivágtuk a PGK1 promotert és terminátort NarI és SacI alkalmazásával a pB3 PGK-ból, és ugyanezen helyek alkalmazásával inzertáltuk YIplac211¹be, amelynek eredményéül kaptuk az YIplac211 PGK¹t. Mutált XYL1¹et (K270M) amplifikáltunk pSX-rõl (K270M) korábban ismertetett primerek alkalmazásával és a végekre BamHI helyeket tettünk. A XYL1 PCRterméket elvágtuk BamHI alkalmazásával és az YIplac211 PGK Bg/II helyénél levõ PGK1 promoter mögé inzertáltuk, amelynek eredményeként kaptuk a YIplac211 PGK XYL1 (K270M)¹et. A megfelelõ irányultságot PCR-rel ellenõriztük és a vektor helyességét restrikciós vizsgálattal igazoltuk. Az YIplac211 PGK XYL1 (K270M)¹et Bpu10I-vel hasítottuk az URA3 génen belül. A hasítási terméket alkalmaztuk a TMB3265=XDH–XK) transzformációjára, ami a TMB3270¹et eredményezte. A megfelelõ helyre történõ integrációt a TMB 3270-ben PCR-rel ellenõriztük, a következõ primer alkalmazásával: 5’CAC GGA AAT GTT GAA TAC TCA TAC TC 3’, amely az YIplac211 PGK XYLI (K270M) vektorhoz annellált és
15 az 5’GTT ACT TGG TTC TGG CGA GGT A 3’, amely az URA3 génhez képest downstream annellált az élesztõgenomba. A K270M mutációt szekvenálással igazoltuk. 20
Az új TMB3271 törzs konstrukciója Kivágtuk a PGK1 promotert és terminátort a XYL1 (K270M) génnel együtt a YIplac211 PGK XYL1 (K270M) törzs genomjából NarI és SacI alkalmazásával. A fragmenst pB3 PGK¹ba inzertáltuk a PGK1 pro25 moter és terminátor NarI és SacI alkalmazásával történõ eltávolítását követõen, amelynek eredménye a pB3 PGK XYL1 (K270M) lett. A vektor helyességét restrikciós vizsgálattal ellenõriztük és a K270M mutációt szekvenálással igazoltuk. A plazmidot BshTI-vel 30 vágtuk a XYL1 génen belül. A hasított plazmidot a TMB3270 XYL1 K270M génjébe történõ integrációra alkalmaztuk. A TMB3271 transzformánst YPD-lemezeken szelektáltuk zeocinnal. 35
Szakaszos fermentáció Oxigénkorlátolt xilóz szakaszos fermentációt végeztünk, a korábban ismertetettek szerint (Jeppsson, M., B. Johansson, B. Hahn-Hägerdal és M. Gorwa Grauslund. 2002. Reduced oxidative pentose phos40 phate pathway flux in recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae strains improves the ethanol yield from xylose. Appl. Environ. Microbiol. 68: 1604–1609). 45
Folytonos tenyésztés Egy éjszakás tenyészetbõl származó sejteket alkalmaztunk a következõ innokulálására: 1,5 l meghatározott ásványi tápközeg (30) 10 g l–1 glükózzal és 10 g l–1 xilózzal; egy Bioflo-III fermentorban (New Brunswick 50 Scientific, Edison, NJ, USA). Habzásgátlót adtunk hozzá 0,05% (v/v) koncentrációban (Dow Corning® Antifoam RD Emulsion, BDH Laboratory Supplies, Poole, Nagy-Britannia). A cukor elfogyasztása után folytonos szaporítást állítottunk be 10 g l–1 glükózzal és 10 g l–1 55 xilózzal 0,06 h–1 hígítási sebességgel 30 °C¹on és and pH=5,5¹en, amelyet 3 M KOH-val szabályoztunk. Anaerob körülményeket hoztunk létre a fermentorba történõ 0,2 l min–1 sebességû nitrogén (amely kevesebb mint 5 ppm O2¹t tartalmazott) áramoltatással, 60 amelyet gáztömegáram-mérõvel mértünk (Bronkhorst, 3
1
HU 003 759 T2
Ruurlo, Hollandia) és 200 fordulat/perc keverési sebességet alkalmaztunk. Vizsgálatok Szubsztrát- és termékkoncentrációkat, sejt szárazanyagot, RNS¹t, fehérjetartalmat és szénhidráttartalmat mértünk a korábban ismertetett eljárásokkal (Jeppsson, fent). A korábban kifejlesztett sztöchiometrikus áram modellt (3) alkalmaztuk az XR általi kofaktor alkalmazás értékelésére. Enzimaktivitások Az enzimaktivitásokat rázatott flaska tenyészetekbõl származó sejtekben határoztuk meg, amelyek exponenciálisan növekedtek definiált ásványi tápközegben (Verduyn, C., Postma, E., Scheffers, W. A. és VanDijken, J. P. 1992. Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts: a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation. Yeast. 8: 501–517), amelyben 20 g l–1 glükóz volt szénforrásként. Az elõtenyészeteket azonos körülmények között készítettük el. Nyers extraktokat kaptunk az YPER reagens alkalmazásával (Pierce, Rockford, IL, USA). A fehérjekoncentrációt a Coomassie fehérjevizsgálati reagenssel (Pierce) határoztuk meg és borjúszérumalbumin szolgált standardként. Az XR¹aktivitást a korábban ismertetett módon határoztuk meg (Eliasson, A., C. Christensson, C. F. Wahlbom, és B. HahnHägerdal, 2000, Anaerobic xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae carrying XYL1, XYL2, and XKS1 in mineral medium chemostat cultures Appl. Environ. Microbiol. 66: 3381–3386.) kivéve azon törzseket, amelyek a mutált XR¹t hordozták, ahol 1,05 M xilózt és 0,3 mM NADPH¹t alkalmaztunk.
5
10
15
20
25
30
35 Eredmények A XYL1 K270M mutáció hatása a xilózfermentációra Kostrzynska és munkatársai, (1998) a P. stipitis XR¹t helyspecifikus mutagenezisnek tették ki annak érdekében, hogy módosítsák a NADPH-hoz mutatott affinitását. A 270¹es aminosavpozícióban történõ mutáció 185 mM látszólagos KM¹értéket eredményezett a NADPH¹ra, ami 17¹szer nagyobb, mint a látszólagos Km a NADPH¹ra a natív XR esetében (11 mM). Azonban a K270M mutáció az XR¹ben szintén javította a látszólagos Km¹értéket a xilózra, 15¹szörösére (625 mM szemben a 43 mM¹lal), miközben a NADH látszólagos Km¹értéke nem változott (31 mM szemben a 27 mM-lal). A XYL1 K270M gént bevittük a TMB 3265 S. cerevisiae törzsbe, amely már hordozta a P. stipitis XYL2 gént és az endogén túltermelt XKS1 géneket, ami a TMB3270 törzset adta. A NADPH- és NADH-függõ XR aktivitások rendre 0,74 and 0,63 U mg–1 voltak a TMB3270 törzsben (2. táblázat). A TMB3001 kontrolltörzs, amely a natív XYL1 gént a XYL2 és XKS1 génekkel együtt hordozza, esetében a NADPH- és NADH-függõ aktivitások rendre 0,48 és 0,31 U mg–1 voltak.
40
45
50
55
60 4
2
2. táblázat Specifikus XR¹aktivitás (U mg protein–1) a TMB3001, TMB3260, TMB3270 és TMB3271 esetén. A mutatott adatok két mérésbõl származó átlagok, 10% alatti variációval. Törzsek
XR (U/mg) NADPH
NADH
TMB3001 (1 kópia XYL1)
0,48
0,31
TMB3260(2 kópia XYL1)
3,11
1,63
TMB3270 [1 kópia XYL1 (K270M)]
0,74
0,63
TMB3271 [2 kópia XYL1 (K270M)]
4,04
1,50
A xilózból történõ terméktermelést szakaszos fermentáció során vizsgáltuk glükózon növesztett nyugvósejtekkel, amelyek xilózhasznosítók, oxigénkorlátozott körülmények között (3. táblázat). Nagyon kevés biomassza termelõdött ezen körülmények között. A TMB3270 (XYL1 K270M) hasonló xilóz fogyasztási sebességgel bírt (0,155 g biomassza–1 h–1), mint a TMB3001 (0,145 g biomass–1 h–1). Az etanol hozam (0,36 g g–1) javult és a xilitolhozam csökkent (0,17 g g–1) a TMB3270-ben a kontrolltörzshöz, TMB3001, képest (0,31 g etanol g xilóz–1, 0,29 g xilitol g xilóz–1). Az acetát- és glicerinhozam alacsony volt, de magasabb a TMB3270-ben (0,035 g g–1, 0,072 g g–1), mint a TMB3001-ben (0,025 g g–1, 0,052 g g–1). Az XR mutációt hordozó TMB3270 hasonló mennyiségû xilózt fogyasztott, mint a TMB3001 kontrolltörzs a szakaszos tenyészetben 50 g/l xilóz esetén. Azonban a mutált XR alacsonyabb xilózaffinitása csökkenteni tudta a xilóz fogyasztási sebességet alacsony xilózkoncentrációk esetén. A mutáció befolyásolhatja a termék kialakulását is a glükóz és xilóz együttes fermentáció során. Ezért anaerob folytonos tenyésztést végeztünk a TMB3001 és a TMB3270 törzzsel 10 g l–1 glükóz és 10 g l–1 xilóz jelenlétében (4. táblázat). A TMB3270 (XYL1 K270M) 58%-kal alacsonyabb xilózfogyasztási sebességgel bírt, mint a TMB3001 kontrolltörzs. Az etanol- és CO2hozamok körülbelül 10%-kal voltak magasabbak a TMB3270-ben (0,40 és 0,48 g g szubsztrát–1), mint a TMB3001-ben (0,37 és 0,43 g g szubsztrát –1 ). A TMB3270-nek lecsökkent xilitolhozama volt a fogyasztott xilózra (0,31 g g xilóz–1) a TMB3001-hez képest (0,52 g g xilóz–1), amely megfelel a szakaszos fermentáció során kapott eredményeknek (3. táblázat). A TMB3270-nek a glicerin hozama is kisebb volt (0,084 g g szubsztrát –1 ), mint a TMB3001-nek (0,095 g g szubsztrát–1), miközben az acetáthozam egy kicsit magasabb volt a TMB3270-ben (0,002 g g szubsztrát –1 ) a TMB3001-hez képest (0,001 g g szubsztrát–1). A biomassza hozamok hasonlóak voltak a két törzs esetében (0,094 és 0,095 g g szubsztrát–1). A biomasszatermelés rendre 1,1 és 1,0 g l–1 volt a TMB3001-ben és a TMB3270-ben.
1
HU 003 759 T2
3. táblázat: A lecsökkent XR¹affinitás a NADPH¹ra xilózfermentáció esetén rekombináns S. cerevisiaevel oxigénkorlátozott szakaszokban 50 g l–1 xilózzal, mint egyetlen szénforrással. A specifikus xilóz fogyasztási sebességet (g×g biomassza–1×h–1) és az etanol¹, xilitol¹, acetát- és glicerinhozamot (g×g felhasznált xilóz–1)
5
2
és a szénvisszanyerést [cmol ki (cmol be)–1] határoztuk meg 60–70 óra eltelte után. A bemutatott értékek két független fermentációs kísérlet eredményeinek átlagai plusz/mínusz az átlagtól való eltérés. A szénvisszanyerés számítása során, 0,5 mol CO2-termelést feltételezünk minden egyes cmol termelt etanolra vagy acetátra.
3. táblázat Az XYL1 K270M megnövelt expressziójának hatása a xilózfermentációra Törzsek
Xilózfogyasztási sebesség
Y etanol
Y xilitol
Y acetát
Y glicerin
C-visszanyerés
TMB3001 (1 kópia XYL1)
0,145±0,002
0,31±0,01
0,29±0,01
0,025±0,001
0,052±0,004
0,98
TMB3260 (2 kópia XYL1)
0,245±0,005
0,30±0,01
0,13±0,01
0,046±0,007
0,161±0,001
0,95
TMB3270 [1 kópia XYL1 (K270M)]
0,155±0,005
0,36±0,01
0,17±0,01
0,035±0,001
0,072±0,005
0,99
TMB3271 [2 kópia XYL1 (K270M)]
0,226±0,020
0,31±0,01
0,09±0,01
0,060±0,008
0,181±0,014
0,97
A TMB3001-rõl bemutatták, hogy mind a NADPH¹t, mind a NADH¹t alkalmazza az XR reakcióban. A terméktermelés a szakaszos (3. táblázat) és a folytonos (4. táblázat) tenyésztés során azt mutatta, hogy a TMB3270 mutált XR¹jének megemelkedett Km¹értéke lecsökkent NADPH-felhasználást eredményezett az
XR lépés során. Mivel a NADH-függõ aktivitás hasonló 25 volt a két törzs esetében (2. táblázat), ezért egy túl alacsony XR¹aktivitás magyarázhatja az alacsonyabb xilózfogyasztást a TMB3270-ben. Korábban bemutatták, hogy az XR¹aktivitás korlátozta a xilózfogyasztási sebességet a TMB3001-ben.
4. táblázat A TMB3001, TMB3270, TMB3260 és TMB3271 folytonos tenyésztése anaerob körülmények között 0,06 h–1 hígítási sebességgel, szénforrásként 10 g l–1 glükózzal és 10 g l–1 xilózzal. A fogyasztási sebességeket (g g biomassza–1 h–1), hozamokat (g g elfogyasztott szubsztrát–1) és a C¹visszanyerést mutatjuk. Az állandósult állapotot azután feltételeztük, miután legalább 6 fermentornyi térfogat haladt át a fermentoron. Törzsek
Glukózfogyasztási sebesség
Xilózfogyasztási sebesség
Y etanol
Y xilitol
Y xilitol*
Y acetát
Y glicerin
Y CO2
Biomassza
Cvisszanyerés
TMB3001 (1 kópia XYL1)
0,52
0,12
0,37
0,10
0,52
0,001
0,095
0,43
0,094
1,08
TMB3260 (2 kópia XYL1)
0,51
0,19
0,36
0,16
0,58
0,004
0,107
0,39
0,085
1,09
TMB3270 [1 kópia XYL1 (K270M)]
0,58
0,05
0,40
0,02
0,31
0,002
0,084
0,48
0,095
1,07
TMB3271 [2 kópia XYL1 (K270M)]
0,45
0,16
0,40
0,12
0,44
0,003
0,053
0,40
0,098
1,07
* Xilózon alapuló xilitolhozam.
A mutált XYL1 (K270M) gén egy további kópiáját integráltuk a TMB3270¹be, aminek eredménye a TMB3271 lett. A NADPH- és NADH-függõ XR¹aktivitás
TMB3271-ben rendre 4,04 és 1,50 U mg–1 volt, ami 2–5-ször nagyobb, mint a TMB3270-ben (2. táblázat). 60 A magas XR¹aktivitású TMB3260 törzset kontrollként 5
1
HU 003 759 T2
alkalmaztuk a TMB3271¹re ebben a vizsgálatban. A TMB3260 két kópiában hordozza a natív XYL1 gént a XYL2 és XKS1 génekkel, és a NADPH- és NADHfüggõ aktivitása rendre 3,11 és 1,63 U mg–1 volt (2. táblázat). A TMB3271 [2 kópia XYL1 (K270M)] xilóz fogyasztását és termék termelését összehasonlítottuk a TMB3270 [1 kópia XYL1 (K270M)], a TMB3001 (1 kópia XYL1) és a TMB3260 (2 kópia XYL1) törzsekével oxigénnel korlátozott szakaszos fermentációban nyugalmi állapotban lévõ sejtek alkalmazásával (3. táblázat). A XYL1¹et és a XYL1 (K270M)¹et nagy mennyiségben expresszáló TMB3260 és TMB3271 között nem volt jelentõs különbség. Mindkettõnek nagyobb xilózfogyasztási sebessége, lecsökkent xilitolhozama, megemelkedett glicerin- és acetáthozama és a TMB3001-hez hasonló etanolhozama volt. A terméktermelést szintén meghatároztuk anaerob folytonos tenyészetben 10 g l¹l glükózzal és 10 g l¹l xilózzal, mint szénforrással a TMB3260 és TMB3271 törzsekkel, amelyek rendre két kópiát tartalmaztak a XYL1 és XYL1 (K270M) génbõl (4. táblázat). A megnövelt XR¹aktivitás 58%-kal és 220%-kal nagyobb xilózfelvételt eredményezett a TMB3260 és TMB3271 XYL1 (K270M) törzsekben, a megfelelõ alacsony XR aktivitású TMB3001 és TMB3270 XYL1 (K270M) törzseikhez képest. A TMB3271 törzsben a K270M mutáció nagyobb etanol- és CO2-hozamot eredményezett (0,40 g g–1 és 0,39 g g–1), mint a TMB3260 kontrolltörzs (0,36 g g–1 és 0,39 g g–1), amely megfelel a TMB3270-ben található alacsony XR¹aktivitás megnövekedett etanol- és CO2-hozamának (4. táblázat). A xilitolhozam alacsonyabb volt a TMB3271-ben (0,44 g xilitol g xilóz –1 ), mint a TMB3260-ban (0,58 g xilitol g xilóz–1). A biomasszahozam nagyobb volt a TMB3271-ben (0,098 g, g szubsztrát–1), mint a TMB3260-ban (0,85 g, g szubsztrát–1). A biomasszatermelés rendre 1,1 és 1,2 g l–1 volt a TMB3260-ban és a TMB3271-ben. A TMB3271nek kétszeresen lecsökkent a glicerinhozama és enyhén csökkent az acetáthozama a TMB3260-hoz képest. Áram (fluxus) vizsgálat. Sztöchiometrikus áram modellt (3) alkalmaztunk a kofaktor alkalmazás felderítésére a natív XYL1¹et (TMB3001 és TMB3260) és a mutált XYL1 K270M¹et (TMB3270 és TMB3271) hordozó törzseknél. A modell azt mutatta, hogy a mutált XR¹t expresszáló törzsek nagyobb részét használták a NADH-nak az XR reakció során, mint a natív XR¹t expresszáló törzsek (1. ábra). A modell szerint az XR reakció a TMB3001-ben 47% NADH¹t használt, miközben az XR reakció a TMB3270-ben (K270M) a NADH¹t csak redukálásra használta. A nagyobb XR¹aktivitású törzsek, TMB3260 és TMB3271 (XYL1 K270M), rendre 36 és 86% NADH¹t használtak az XR lépésben. Az oxidatív pentóz-foszfát-útvonal egy fontos NADPH-forrás az élesztõben, és több glükóz áramlik ezen az útvonalon a TMB3001 (15%) és TMB3260 (22%) törzsekben, mint a mutációt hordozó TMB3270 (7%) és TMB3271 (12%) törzsekben. Ennek eredményeként kevesebb
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
szén-dioxid termelõdött a mutációt hordozó törzsekben. Korábban be lett mutatva, hogy az XR¹redukálta a dihidroxi-aceton-foszfátot (DHAP) NADPH-val. Az áramlási modell, azonban szigorúan NADH-függõ DHAP-redukciót feltételezett. Amennyiben a reakciót úgy változtattuk a modellben, hogy 50% NADH¹t és 50% NADPH¹t alkalmazott a DHAP redukciójára, akkor a NADH-felhasználás az XR reakcióban növekedett minden törzs esetén és magasabb volt azon törzsekben, amelyek a mutált XR¹t hordozták. A mutált XR¹t hordozó törzsek (TMB3270 és TMB3270) továbbá alacsonyabb oxidatív PPP árammal bírtak a változtatott modellben. Az volt a célunk a csökkentett NADPH-affinitású mutált XR alkalmazásával, hogy rekombináns S. cerevisiaeben eltoljuk a termék termelést a xilitoltól az etanol irányába. A mutált XR¹t hordozó TMB3270 és TMB3271 alacsonyabb xilitol- és glicerinhozamokat mutatott, amelyhez nagyobb etanol- és CO2-hozam társult a natív XR¹t hordozó törzsekkel összevetve. A jelentõsen lecsökkent anaerob glicerinhozam a TMB3271 esetén valószínûleg a lecsökkent NAD+ reoxidációs igény eredménye, ha az XR reakció leginkább NADH¹t alkalmaz. Metabolikus áram modell bemutatta, hogy a mutált XR¹t hordozó törzsek a NADH nagyobb részét használták a xilóz redukciójára. A megnövekedett biomasszahozam összecseng a lecsökkent glicerinhozammal a TMB3271 esetén, mivel a NAD+ felhasználódik a biomasszatermelés során és regenerálódik a glicerintermelés során. Számos megközelítést alkalmaztunk az etanolhozam és a termelékenység javítására rekombináns törzsekben xilózfermentáció során a redoxmetabolizmus megváltoztatásával (5. táblázat). Megemelkedett etanol- és lecsökkent xilitolhozamokat (rendre 30 és 70%) figyeltünk meg TMB3255-ben, amelyben az oxidatív PPP ZWF1 génje meg volt zavarva az XR reakcióra elérhetõ kevesebb NADPH eredményeként (4). Feltehetõen csökkentette a sejten belüli NADH-koncentrációt az Azotobacter vinelandii eredetû transzhidrogenáztúltermelés, amely transzhidrogenáz a NAD + ¹t és NADPH¹t NADH¹vá és NADP+-szá alakítja S. cerevisiaeben és valószínûleg ez is csökkentette a sejten belüli NADPH-koncentrációt. A TH túltermelõ törzs enyhe xilitolhozam-csökkenést mutatott, miközben nem tapasztaltunk csökkenést az etanolhozamban (5). A NADP+-függõ glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) expressziója az S. cerevisiaeben 25%-kal javította az etanolhozamot xilózból (Verho és munkatársai, 2003. Engineering of redox cofactor metabolism for improved pentose fermentation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ Microbiol. 69: 5892–7). A módosításról azt sugallták, hogy kisebb oxidatív PPP áramot eredményez és emiatt kisebb CO2termelést. Az etanolhozam 127%-kal javult, ha ZWF1 oxidatív PPP gént megzavarták a GAPDH túltermeléssel kombináltan. Azonban az etanolhozam nem volt magasabb, mint a többi vizsgálatban a kontrolltörzs kezdeti alacsony hozama miatt.
1
HU 003 759 T2
2
5. táblázat Xilózfogyasztási sebesség (g g biomassza–1 h–1), etanolhozam (g g cukor–1) és xilitolhozam (g g xilóz–1) rekombináns S. cerevisiae törzzsel végzett fermentáció során, amely törzset a xilózból történõ etanolhozam növelésére terveztek. Közöljük a releváns genotípust és fenotípust, valamint az oxigénezést, O2 [Anaerob (–), Oxigén-korlátozott (+/¹/)], Fermentációs mód [Folytonos tenyésztés (C), Szakaszos tenyésztés (B)] és glükóz- (Glu) és xilóz- (Xyl) koncentrációk g l–1-ben. Törzsek
Releváns genotípus/fenotípus
O2
Mód
D
Glu
Xyl
Xilózfogyasztási sebesség
Yetanol (növekedés %)
Yxilitol (növekedés %)
Referenciatörzs
Referencia ferm.adat
TMB3001
1 kópia XYL1
–
C
0,06
10
10
0,12
0,36
0,52
(1)
Ez a munka.
TMB3260
2 kópia XYL1
–
C
0,06
10
10
0,19
0,36
0,58
(2)
Ez a munka.
TMB3270
1 kópia XYL1 (K270M)
–
C
0,06
10
10
0,05
0,40 (8%)
0,31
Ez a munka.
Ez a munka.
TMB3271
2 kópia XYL1 (K270M)
–
C
0,06
10
10
0,16
0,40 (1%)
0,44
Ez a munka.
Ez a munka.
–
C
0,06
20
20
0,23
0,30
0,43
(1)
(4)
Dzwf1
–
C
0,06
20
20
0,12
0,39 (30%)
0,13
(4)
(4)
±
B
–
–
50
0,15
0,31
0,29
(1)
(4)
TMB3253
Kontroll
±
B
–
–
50
0,16
0,28
0,34
(5)
(5)
TMB3254
TH
±
B
–
–
50
0,16
0,28
0,30
(5)
(5)
TMB3001 TMB3255 TMB3001
H2674
Kontroll
–
B
–
–
50
0,07*
0,14
0,56
(6)
(6)
H2673
GDP1
–
B
–
–
50
0,06*
0,17 (25%)
0,49
(6)
(6)
H2684
GDP1 Dzwf1
–
B
–
–
50
0,06*
0,31 (127%)
0,35
(6)
(6)
–
C
0,05
20
50
0,31
0,28
0,56
(1)
(7)
TMB3001 CBP.CR4
Dgdh1 GDH2
–
C
0,05
20
50
0,31
0,34 (19%)
0,47
(7)
(7)
CBP.CR5
Dgdh1 GS–GOGAT
–
C
0,05
20
50
0,34
0,33 (16%)
0,44
(7)
(7)
* 120 órás feltételezett tenyésztési idõ [a (31)-ben csak körülbelüli tenyésztési idõt közöltek].
Xilózon megemelkedett etanolhozamot adott az ammóniaasszimiláció metabolikus tervezése (7). Az etanolhozam 19%-kal növekedett, és a xilitolhozam 16%-kal csökkent a GDH1 gén deléciójától, amely gén NADPH-függõ glutamát-dehidrogenázt kódol és a GDH2 gén túltermelésével, amely gén NADH-függõ glutamát-dehidrogenázt kódol. Egy további stratégia volt a GLT1 és GLN1 gének túltermelése, amelyek a NADH¹t és ATP¹t igénylõ GS¹GOGAT komplexet kódolják, a GDH1-deléciós törzsben, amely 16%-kal nagyobb etanolhozamot eredményezett. Ez a vizsgálat azt mutatja, hogy lehetséges az etanolhozam javítása (11%-kal nagyobb a TMB3271-ben, mint a TMB3260-ban) fenntartott xilóz fogyasztási sebesség esetén a XYL1 K270M mutáns magas szintû expressziója révén. A tenyésztési körülmények nem voltak azonosak a különbözõ vizsgálatok során, de mivel a GDP1-túltermelõ törzsek kivételével, a TMB3001 szerepelt az összes esetben, ezért egyértelmû, hogy a TMB3260 (2 kópia XYL1), a TMB3271 [2 kópia XYL1 (K270M)] és a CBP.CR5 (Dgdh1 GS¹GOGAT), összehasonlíthatóan nagy xilóz fogyasztási sebességgel bírnak (5. táblázat). A CBP.CR5 (Dgdh1 GS¹GOGAT) és a
TMB3271 [2 kópia XYL1 (K270M)] törzsek is nagy etanolhozammal bírtak a TMB3001 törzshöz képest. A kü40 lönbözõ vizsgálatok metabolikus tervezési eredményei azt mutatják, hogy milyen nehéz az etanolhozam növelése a redoxmetabolizmusba történõ beavatkozás révén, és felvetik a központi metabolikus útvonalak rugalmasságának a kérdését S. cerevisiaeben. 45 Ábra ismertetése 1. ábra: Fluxusok a xilózútvonalon (mmol * g biomassza–1 * h–1) a TMB3001 esetén (felsõ érték, nem vastag), a TMB3270 esetén 50 (alsó érték, nem vastag), a TMB3260 esetén (felsõ érték, vastag) és a TMB3271 esetén (alsó érték, vastag), amelyet folytonos tenyészetben szaporítottunk 10 g l–1 glükózzal és 10 g l–1 xilózzal. A cukorfelvételt 55 (glükóz+xilóz) 100 mmol * g biomassza–1 * h–1 értékre normalizáltuk. Hivatkozások 1. Eliasson, A., C. Christensson, C. F. Wahlbom, és 60 B. Hahn-Hägerdal. 2000. Anaerobic xylose fermenta7
1
HU 003 759 T2
tion by recombinant Saccharomyces cerevisiae carryingXYL1, XYL2, and XKS1 in mineral medium chemostat cultures. Appl. Environ. Microbiol. 66: 3381–3386. 2. Jeppsson, M., K. Traff, B. Johansson, B. HahnHägerdal, és M.¹F. Gorwa-Grauslund. 2003. Effect of enhanced xylose reductase activity on xylose consumption and product distribution in xylose-fermenting recombinant Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 3: 167–175. 3. Traff-Bjerre, K. L., M. Jeppsson, B. Hahn-Hägerdal, és M.¹F. Gorwa-Grauslund. 2004. Endogeneous NADPH-dependent aldose reductase activity influences product formation during xylose consumption in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Yeast 21: 141–150. 4. Jeppsson, M., B. Johansson, B. Hahn-Hägerdal, és M. Gorwa-Grauslund. 2002. Reduced oxidative pentose phosphate pathway flux in recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae strains improves the ethanol yield from xylose. Appl. Environ. Microbiol. 68: 1604–1609. 5. Jeppsson, M., B. Johansson, P. Ruhdal-Jensen, B. Hahn-Hägerdal, és M. Gorwa-Grauslund. 2003. The
2
level ofglucose-6-phosphate dehydrogenase activity strongly influences xylose fermentation and inhibitor sensitivity in recombinant Saccharomyces cerevisiae strains. Yeast 20: 1263–1272. 6. Zhang, Y., és H. Lee. 1997. Site-directed muta5 genesis of the cysteine residues in the Pichia stipitis xylose reductase. FEMS Microbiol. Lett. 147: 227–232. 7. Roca, C., J. Nielsen, és L. Olsson. 2003. Metabolic engineering of ammonium assimilation in xylose10 fermenting Saccharomyces cerevisiae improves ethanol production. Appl. Environ. Microbiol. 69: 4732–4736.
15
SZABADALMI IGÉNYPONT
Xilózt etanollá fermentáló xilózhasznosító Saccharomyces cerevisiae mutáns törzs, amely törzs expresszál: 20 a) K270M mutált P. stipitis XYL1 gént két kópiában, b) natív P. stipitis XYL2 gént, és c) túltermeli a Saccharomyces cerevisiae endogén XKS1 gént.
8
HU 003 759 T2 Int. Cl.: C12N 1/19
9
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
